CZ289772B6

CZ289772B6 - Biologický materiál na bázi kolagenu

Info

Publication number: CZ289772B6
Application number: CZ1997730A
Authority: CZ
Inventors: Milan Prof. Mudr. Drsc. Adam
Original assignee: Revmatologický Ústav
Priority date: 1997-03-10
Filing date: 1997-03-10
Publication date: 2002-04-17
Also published as: CZ73097A3

Abstract

Popisuje se biologick² materi l vhodn² k l en defekt kloubn chrupavky v hum nn i veterin rn medic n , kter² je tvo°en sm s chrupavkov²ch kolagen typ II, IX nebo/a XI a agrekan v hmotnostn m pom ru 2 a 5:1, a d le autologn ch chondrocyt v mno stv 2 a 4.10.sup.5 .n.bun k/mg sm si dvou v² e uveden²ch komponent. Zm n n² materi l m e d le obsahovat i tk ov r stov² peptid v mno stv od 0,1 do 10 mg vzta eno na 1 g chrupavkov²ch kolagen .\

Description

Oblast techniky

Vynález se týká biologického materiálu na bázi kolagenu, vhodného pro regeneraci hyalinní chrupavky. Tento biologický materiál je určen převážně k aplikacím v humánním a veterinárním lékařství.

Dosavadní stav techniky

Při léčbě některých patologických stavů se jeví jako výhodné požití biomateriálů, resp. tkáňových náhrad vlastních tělu příjemce. V poslední době se k tomuto účelu začínají používat tělu vlastní buňky. V tomto směru se jeví jako velmi perspektivní příprava chrupavkové náhrady pro léčbu traumatických chrupavkových lesí na bázi kultivace tělu vlastních chondrocytů v prostředí kolagenu a hyaluronové kyseliny, resp. agrekanů (proteoglykanů chrupavkového původu) tak, aby nedošlo ke změně fenotypu chondrocytů a při tom se vytvořil implantát s dostatečnými mechanickými vlastnostmi, aby jej bylo možno fixovat v místě defektu.

Pokroky v operační technice vyžadují nové materiály, které jsou organismem dobře snášeny a které jsou schopny se přizpůsobit požadavkům organismu. Kovové a keramické materiály mohou nahradit jen tvrdé tkáně (kost, chrupavka) a proto jsou hledány materiály, které mohou nahradit tkáně měkké. V tomto směru stojí v popředí polymery - původně syntetické, v poslední době pak přirozeného původu.

Z přirozených polymerů se jedná hlavně o kolagen, vzhledem k jeho vlastnostem mechanickým i biologickým (vliv na proliferaci a diferenciaci buněk, nízká antigenicita, dobrá buněčná adherence a biokompatibilita; Hogervorst a spol., 1992). Kolagen je vláknitá bílkovina a jeho různé typy (v současné době je jich známo 18) jsou přítomny prakticky ve všech tkáních. Jedná se o jednu z nejstarších a také nejrozšířenějších bílkovin - tvoří asi třetinu všech bílkovin organismu obratlovců. O jeho významu svědčí jeho raný výskyt jak ve íylogenesi tak ontogenesi. Kolagen je v podstatě konservativní bílkovinou podléhající ve fylogenesi jen nepatrným změnám. Záměna některých jeho aminokyselin v kritických místech jeho molekuly (hlavně glycinu) může vést k patologickým stavům (například osteogenesis imperfecta; Adam a Deyl, v tisku).

Kolagen jako substrát pro buněčné kultury je používán již řadu let a to buď ve formě filmu kryjícího dno kultivační nádoby nebo jako přísada do kultivačního média, kde činností fibroblastů vznikne trojrozměrná síť, s níž buňky vytvářejí v průběhu doby velice kompaktní substanci, jejíž konzistence je ekvivalentní kůži (Bell a spol., 1979, Coulomb a spol., 1984).

Trvalým problémem ortopedické praxe zůstává obnovení poškozeného povrchu kloubních chrupavek (Rosenberg, 1984). Povrchové defekty hyalinní chrupavky i defekty hlubší, nedosahující však až do subchondriální kosti, se většinou nehojí. Defekty dosahující až do subchondriální kosti se hojí méně hodnotnou tkání vyrůstající z dřeně kostní. Z experimentálních prací vyplývá, že osud chrupavkových defektů nezávisí ani na velikosti či lokalizaci, ani na stáří organismu. Pokud defekt byl ponechán bez výplně, došlo k hojení vazivovou chrupavkou (Campbell, 1969, Ghadially, 1983, Mitchell a Shepard, 1976, Furukawa a spol., 1980). Snahy obnovit kontinuitu kloubní chrupavky pomocí izolovaných chondrocytů selhaly buď proto, že implantované buňky neadherovaly k povrchu defektu (Bentley a Greci, 1971) nebo proto, že během hojení vznikaly ostrůvky chrupavky zavzaté do fibrosní tkáně nebo vznikala vazivová chrupavka (Bentley a Greci, 1971, Bentley a spol., 1978, Aston a Bentley, 1986). Itay a spol. (1987) vyplnili defekt zasahující celou tloušťku chrupavky u čtyřměsíčního kuřete směsí embiyonálních kuřecích chondrocytů zavzatých do směsi fibrinogenu a thrombinu. Vytvořená tkáň bylo podobná chrupavce. Robinson a spol. (1990) použili embryonální kuřecí chondrocyty spolu s kyselinou hyalu-1 CZ 289772 B6 ronovou, implantát však nebyl dostatečně mechanicky odolný. Hogervorst a spol. (1992) použili při pokusu na králících k vyplnění osteochondrálního defektu směsi granulí trikalciumfosfátu s20% hydroxyapatitem s prasečím nebo ovčím kolagenem. Vzniklá tkáň se podle autorů podobala chrupavce.

Podstata vynálezu

Shora uvedené obtíže a nevýhody řeší popisovaný vynález, jehož předmětem je biologický materiál na bázi kolagenu, vhodný zejména pro regeneraci hyalinní chrupavky, sestávající z kombinace chrupavkových kolagenů typu II, IX a XI, proteoglykanu chrupavkového původu, autologních chondrocytů a popřípadě tkáňově růstového peptidu. Jak již bylo řečeno výše, je biologický materiál podle vynálezu vhodný zejména pro léčení defektů kloubní chrupavky.

Biologický materiál podle vynálezu se účelně získává tak, že se autologní (tělu vlastní) chrupavkové buňky (chondrocyty) pomnoží z bioptického materiálu a vnesou se do kompozitního materiálu složeného ze směsi chrupavkových kolagenů typu II, IX a XI, proteoglykanu chrupavkového původu a popřípadě tkáňově růstového peptidu.

Hlavní složkou shora zmíněného kompozitního materiálu jsou chrupavkové kolageny (typy Π, IX a XI) obohacené chrupavkovým proteoglykanem v hmotnostním poměru 2:1a obsahující popřípadě 0,1 až 10 mg tkáňově růstového peptidu vztaženo na 1 g kolagenu. Autologní chondrocyty se do tohoto kompozitního materiálu vnášejí v množství 2 až 4.10⁵ buněk/mg kompozitního materiálu.

K vysvětlení výrazů „chrupavkové kolageny typů Π, IX a XI“ uvádíme, že kolageny typů Π a XI jsou tvořeny trojnásobnými šroubovicemi o molekulové hmotnosti cca 3000 a liší se od sebe pouze nevýznamnými záměnami aminokyselin. Kolagen typu IX se liší od typů II a XI kratšími řetězci, které jsou v jednom místě zahnuté a dále má na jednom polypeptidovém řetězci ještě připojený jeden glykosaminoglykanový řetězec, kteiý vytváří další vazby s oněmi dvěma kolagenními typy II a XI. Všechny tři řetězce jsou navzájem spojeny příčnými vazbami typu pyridinolinu, které jsou odvozeny od lysylových resp. hydroxylysylových zbytků, jež jsou součástí třech různých kolagenních molekul shora uvedených typů.

Uvedený kompozitní materiál má řadu výhod. Především je biokompatibilní, dále je výhodný pro udržení fenotypu chondrocytů a konečně pak případná přítomnost tkáňově růstového peptidu podporuje pozitivní vliv kolagenu a proteoglykanu na proliferaci buněk.

Významnou roli hraje i vodné prostředí, v němž je kompozitní materiál rozpuštěn. Pro chondrocyty je tak vytvořeno přirozené prostředí. Při pokusech prováděných v souvislosti s vynálezem bylo zjištěno, že výraznou úlohu hraje kolagenní složka sestávající z typů II, IX a XI izolovaných z kloubní chrupavky pepsinovou digescí.

Chrupavkový proteoglykan, jímž je kolagenní složka obohacena, hraje významnou úlohu při udržení fenotypu chondrocytů.

Podle výhodného provedení obsahuje výše zmíněný kompozitní materiál, a tedy i výsledný biologický materiál podle vynálezu, jako tkáňově růstový peptid tkáňově stimulační peptid (gly— his-lys)₂Cu.2H₂O.2NaCl.l,8AcOH (kde Ac = acetyl).

Podle dalšího výhodného provedení se směs chrupavkových kolagenů používá ve formě kolagenního gelu tvořeného roztokem kolagenů v Eaglově minimálním esenciálním médiu.

Hlavní výhoda biologického materiálu podle vynálezu spočívá vtom, že obsahuje autologní chondrocyty pocházející z hyalinní (kloubní) chrupavky, které se nacházejí ve svém přirozeném

-2CZ 289772 B6

I prostředí (chrupavkové kolageny a proteoglykan), v němž si uchovají svůj fenotyp a nediferencují. Hyalinní chrupavka (obsahující jen chrupavkové kolageny), vznikající při použití biologického materiálu podle vynálezu, je oproti fibrilámí chrupavce (obsahující vazivové kolageny typu I a eventuálně III) vzhledem k většímu solvátovému obalu typu II vhodnější pro frikční pohyby, k jakým v kloubech dochází.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Složení a příprava biologického materiálu podle vynálezu.

2,0 ml kultivačního média tvořeného Eaglovým minimálním esenciálním médiem obsahujícím 10 % fetální telecí sérum,

3,0 mg chrupavkového kolagenu tvořeného převážně typy Π, IX a XI,

1,5 mg agrekanu (proteoglykanová podjednotka) izolovaného z telecí nebo vepřové chrupavky, streptomycin (100 pg.mr¹), penicilín (200 jedn.ml^_I), autologní chondrocyty (pocházející z kloubní chrupavky daného pacienta) (4 až 10.10⁵ buněk).

Jednotlivé složky se smísí a nechá se probíhat kultivace. Po několikadenní kultivaci se vytvoří solidní implant, který lze použít k vyplnění chrupavkového defektu.

Příklad 2

Složení a příprava biologického materiálu podle vynálezu.

2,0 ml kultivačního média tvořeného Eaglovým minimálním esenciálním médiem obsahujícím 10 % fetální telecí sérum, 3,0 mg chrupavkového kolagenu tvořeného převážně typy Π, IX a XI,

1,5 mg agrekanu izolovaného z telecí nebo prasečí chrupavky,

0,3 mg tkáňově růstového peptidů [(gly-his-lys)₂Cu.2H₂O.2NaCl.l,8AcOH], streptomycin (100 pg.ml”¹), penicilín (200 jedn.ml’¹), autologní chondrocyty (4 až 12.10⁵ buněk).

-3CZ 289772 B6

Příklad 3

Složení a příprava biologického materiálu podle vynálezu.

Chrupavkové kolageny obsahující převážně typy Π, IX a XI v množství podle velikosti defektu, a agrekan izolovaný z telecí nebo prasečí chrupavky, v hmotnostním poměru kolagen : agrekan 2 : 1, se smísí s následujícími složkami tak, aby vznikla hustá pasta:

io Eaglovo minimální esenciální médium,

0,3 mg tkáňově růstového peptidů [(gly-his-lys)₂Cu.2H₂O.2NaCl.l,8AcOH], streptomycin (100 pg.ml^-1), penicilín (200 jedn.mf¹), autologní chondrocyty (4 až 12.10⁵ buněk).

Získaná pasta se použije k vyplnění chrupavkového defektu.

Příklad 4

Příprava a složení biologického materiálu podle vynálezu a jeho použití k hojení chrupavkového defektu.

3,0 mg chrupavkového kolagenu extrahovaného z prasečí nebo telecí kloubní chrupavky pomocí enzymové digesce (poměr enzym : substrát 1:10, teplota 22 °C, 24 hodiny) a 1,5 mg proteo30 glykanu izolovaného z vepřové nebo telecí chrupavky pomocí extrakce 4M GuHCl se vnese do

2,0 ml kultivačního prostředí tvořeného Eaglovým minimálním esenciálním médiem do něhož byl přidán tripeptid (gly-his-lys)₂Cu.2H₂O.2NaCl, dále streptomycin (100 pg.mf¹), penicilín (200 jedn.ml'¹) a 10 % fetální telecí sérum. Do tohoto prostředí se v množství 4 až 12.10⁵ buněk vnesou autologní chondrocyty získané odběrem z kloubní chrupavky a následně izolované 35 pomocí kolagenasové digesce (0,25 %) trvající 18 hodin. Po několikadenním pěstování se vytvoří solidní implant, který se použije k vyplnění defektu v kloubní chrupavce. Po asi 8 až 10 týdnech je implant přihojen.

Příklad 5

Hojení chrupavkového defektu za použití biologického materiálu podle vynálezu.

Chrupavkové kolageny získané jako v příkladu 1 pepsinovou digescí prasečí nebo telecí chrupav45 ky se v hmotnostním poměru 2 : 1 smísí s chrupavkovým proteoglykanem izolovaným obdobně jako v příkladu 4 extrakcí 4M GuHCl, načež se přidá Eaglovo minimální esenciální médium obsahující růstový peptid, penicilín a streptomycin jako v příkladu 4, a autologní chondrocyty tak, aby vznikla solidní pasta použitá k vyplnění defektu v kloubní chrupavce. Po 8 až 10 týdnech je implant přihojen.

Průmyslová využitelnost

Biologický materiál podle vynálezu se používá zejména v ortopedii pro léčení defektů kloubní 55 chrupavky.

Claims

1. Biologický materiál na bázi kolagenu vhodný zejména pro regeneraci hyalinní chrupavky, vyznačující se tím, že obsahuje směs

a) chrupavkových kolagenů typů II, IX nebo/a XI a

b) agrekanů v hmotnostním poměru a : b 2 až 5 : 1, a

c) autologních chondrocytů v množství 2 až 4.10⁵ buněk/mg směsi a + b.

2. Biologický materiál podle nároku 1,vyznačující se tím, že dále obsahuje tkáňově růstový peptid v množství 0,1 až 10 mg vztaženo na 1 g chrupavkových kolagenů.

3. Biologický materiál podle nároků 1 a 2, vyznačující se tím, že jako tkáňově růstový peptid obsahuje (gly-his-lys)₂Cu.2H₂O.2NaCl.