JP2008507971A - 新軟骨構造体を用いて損傷若しくは傷害を受け又は病変若しくは老化した関節軟骨を生体位で修復する方法、及び新軟骨構造体の調整方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、損傷若しくは傷害を受け又は病変若しくは老化した軟骨を、関節軟骨の病変部位に埋め込んだ新軟骨構造体を用いて治療する方法に関するものである。この方法は、特に損傷若しくは傷害を受け又は病変若しくは老化した軟骨の機能を修理及び回復させるのに有用である。特に、本発明は、新軟骨構造体を埋め込むことにより、周囲に元からある軟骨への新軟骨の組み込みが始まり達成され、また関節軟骨の病変部位上に成長しこれを封止する新たな表層性軟骨層が形成される方法に関するものである。本発明の新軟骨構造体は、少なくとも、本発明のアルゴリズム従って処理して支持基質内に組み込まれた軟骨細胞を有する。この構造体は、1層の生物学的に許容されるシーラント下で、或いは代表的には2層のシーラント間にある関節軟骨の病変部位内に埋め込まれる。関節軟骨の治療のための方法は、自己由来又は異種の軟骨細胞から生体外で新軟骨構造体を調製する処理と、任意のステップであるが、病変部位の底部に第1シーラント化合物を沈着させ、関節軟骨の病変部位を封止し血液由来物質の影響から構造体を保護防止する前記構造体を埋め込むための病変部位を調製する処理と、この第1シーラント上に本発明の構造体を埋め込む処理と、この構造体の上に第2シーラント化合物を沈着させる処理とを有する。
また、本発明は、新軟骨の生成方法及び新軟骨構造体に関するものである。
活動的な人や老人に起こる関節軟骨への損害は、急性又は反復性の外傷や老化により、極めて頻繁に起こるものである。このような損傷した軟骨は疼痛を伴い、移動に影響を与え、衰弱性の障害を引き起こす。
a)スポンジ、多孔性スキャフォルド又は温度可逆性ゲル化ヒドロゲル(TRGH)基質支持体に組み込み、本発明による所定のアルゴリズム条件にさらした自己由来又は異種の軟骨細胞を有する新軟骨構造体を調製するステップと、
b)随意的に、病変部位内に生物学的に許容されうる第1シーラント層を導入するステップと、
c)この第1シーラント層上の病変腔又は病変部位に、前記軟骨構造体を埋め込むステップと、
d)この構造体上に、生物学的に許容されうる第2シーラント層を導入するステップであって、この第2シーラント層は、前記第1シーラント層と同じものでも異なるものでもよく、前記構造体とこの第2シーラント層とを組合せることにより、軟骨病変部位を生体位で封止する表層性軟骨層の形成及び成長がなされるようにする当該ステップと
を有する方法である。
a)自己由来又は異種の軟骨細胞を得るステップと、
b)前記軟骨細胞を生体外で培養して新軟骨にするステップであって、前記新軟骨が、本発明のアルゴリズムにさらされたスポンジ又はTRGH基質支持体内に組み込まれた自己由来又は異種の軟骨細胞を含むようにする当該ステップと、
c)任意的に、生物学的に許容される第1シーラント層を軟骨病変部位に導入するステップと、
d)空間保持温度可逆性ゲル(SHTG)又はTRGHを、病変部位に又は第1シーラント層上に形成された病変腔内に沈着させ、このことにより、生体外で培養される新軟骨が成長し分化するのに充分な時間が得られるようにするステップであって、前記空間保持温度可逆性ゲル(SHTG)は、約5〜約25℃の間の温度でゾルとして前記病変腔に沈着させ、前記SHTGは、前記病変腔内で体温において流体ゾルから固体ゲルに変わり、SHTGはこの形態で、生体外で培養された新軟骨をその後導入するための空間を保持すると共に、肋軟骨下の空間及び滑液被膜から前記病変腔に細胞及び血液由来物質が移動するのを防止し、更に、このSHTGの存在により、軟骨病変部位を覆う新たな表層性軟骨層の形成に対する基板を提供してその形成を促進させる当該ステップと、
e)軟骨病変部位上に生物学的に許容されうる第2シーラント層を沈着させるステップと、
f)前記病変部位を冷却してSHTGをゾルに変えることにより、前記SHTGを除去するステップと、
f)2層のシーラント間に形成された病変腔内及び新たに形成された表層性軟骨層の下に、生体外で培養した前記新軟骨を沈着させるステップと、
g)新軟骨が、形成された表層性軟骨層の下にある元からある軟骨と一体化した後、約5〜約15℃に前記病変部位を冷却して固体ゲルを流体ゾルに変換して前記ゾルを除去することにより、腔から前記SHTG又はTRGHを除去するか、又は前記SHTG又はTRGHを放置して分解させ自然に除去するステップと
を有する。
a)自己由来又は異種の軟骨細胞を生体外で培養することにより新軟骨の完全な独立片を調製し、前記培養された軟骨細胞を温度可逆性ゲル化ヒドロゲル(TRGH)中に懸濁し、この軟骨細胞の懸濁液を30℃より高い温度に暖め、TRGHを固体ゲルに変換し、この固体ゲルを本発明のアルゴリズムにさらすステップと、
b)軟骨病変部位に、生物学的に許容されうる第1及び第2シーラント層を導入するステップと、
c)前記TRGH/新軟骨を5〜15℃に冷却してゾル状態にするステップと、
d)TRGHに懸濁させた新軟骨を、2層のシーラント間に形成された病変腔に、約5〜約25℃の温度でゾルとして沈着させ、前記TRGHは、前記病変腔内で体温において流体ゾルから固体ゲルに変わり、TRGHはこの形態で、堆積された新軟骨を保護し、この新軟骨が周囲の元からある軟骨と一体化しうるようにし、更に、このTRGHの存在により、軟骨病変部位を覆う新たな表層性軟骨層の形成に対する基板を提供してその形成を促進させるステップと、
e)このTRGHを分解するまで放置しておくか、或いは新軟骨が一体化し表層性軟骨層が形成された後、前記病変部位を約5〜約15℃に冷却して前記TRGHをゾルとして病変腔から取り除くステップと、
f)周囲の元からある軟骨への新軟骨の組み込みを評価するステップと
を有する。
a)ゲル又は温度可逆性ゲルマトリックス支持体に生体外で組み込んだ自己由来の培養軟骨細胞を含み、本発明のアルゴリズムにさらされた構造体を有する新軟骨又は新軟骨を調製するステップと、
b)軟骨病変部位に、生物学的に許容されうる第1シーラント層を導入するステップと、
c)この第1シーラント層上に前記構造体又は前記新軟骨を埋め込むステップと、
d)軟骨病変部位に沈着した新軟骨構造体又は新軟骨上に、生物学的に許容されうる第2シーラント層を沈着させ、この第2シーラントで病変部位を被覆し、前記新軟骨は、経時的に元からある軟骨と一体化されるようになっており、これら新軟骨構造体及び第2シーラント層の存在により、軟骨病変部位を覆う新たな表層性軟骨層の形成及び成長を促進するステップと
を有する。
a)支持基質構造体を調製するステップと、
b)軟骨細胞を分離するためにドナーから一片の軟骨を採取するステップと、
c)軟骨細胞を培養し増殖させるステップと、
d)増殖させた軟骨細胞を懸濁させて懸濁液とするステップと、
e)前記懸濁させた軟骨細胞を基質に組み込むステップと、
f)本発明のアルゴリズムを用いて前記軟骨細胞を2次元又は3次元の新軟骨構造体内に伝播させるステップと
を有する新軟骨構造体の製造方法である。
本願明細書において用いられる用語は以下のように定義されるものである。
「同原軟骨細胞」は、1つの細胞が分裂して得られる軟骨細胞のクローンを意味する。同原軟骨細胞は、同質のゲノム巣と称されるクラスタで発生する。
「自己由来の軟骨細胞」は、ドナー自身の健康な関節軟骨から分離した軟骨細胞を意味する。
「異種軟骨細胞」とは、異なる種のドナーから得られる軟骨細胞、同種のドナーであるがレシピエント個体ではないドナーから得られる軟骨細胞、レシピエント個体から得られるものであるが関節でない軟骨のドナー組織、異なる種の軟骨細胞から分離させたドナー組織がある。
「成熟ガラス軟骨」とは、コラーゲン基質全体に分散している小腔内に位置する同原軟骨細胞の群からなる軟骨を意味する。
「新軟骨構造体」、「NEOCART(登録商標)」又は「NeoCart(登録商標)」とは、本発明のアルゴリズムを受けた又はそれにより処理した基質支持体内に組み込んだ軟骨細胞を含む三次元構造組成物を意味する。すなわち、新軟骨構造体とは、傷害を受け又は老化若しくは病変した軟骨内に埋め込むための、培養軟骨細胞から形成される独立したヒアリン新軟骨片であって、埋め込み後に、病変部位内の元からある軟骨と一体化するものを意味する。NeoCart(登録商標)は、米国マサチューセッツ州のイーストハンプトンにあるHistogenics社の独自開発品であり、同社により製造されている。
シーラントは、接着性及び粘着性の双方又はいずれか一方を有する生物学的に許容されうるゲル化合成化合物であり、一般には、代表的にアルキル化コラーゲンであるコラーゲン化合物により架橋されているのが好ましい誘導ポリエチレングリコール(PEG)のようなヒドロゲルである。好適なシーラントの例としては、テトラヒドロスクシニミジル若しくはテトラチオール誘導PEG又はこれらの組合わせであって、文献J. Biomed Mater. Res Appl. Biomater.(2001年)58の第545〜555頁に記載されており、米国カリフォルニア州のパロアルトにあるCohesion Technologies社からCoSealの登録商標名で市販されているもので、米国特許第6,312,725号明細書に記載されているように、急速に基質を形成する2部分の高分子組成物であり、これら化合物のうち少なくとも1つが、ポリアミノ酸、多糖類、ポリアルキレンオキサイド又はポリエチレングリコールのような高分子で、これら2部分が共有結合により結合されているものや、メチルコラーゲンにより架橋したポリエチレングリコールヒドロゲルのようなメチルコラーゲンにより架橋したPEGがある。本発明のシーラントは、代表的には、組織、特にはコラーゲンを含有する組織と接触するとゲル化及び結合の双方又はいずれか一方を生ずるものである。
「第2シーラント」とは、病変部位内に埋め込まれた新軟骨構造体上に沈着させる生物学的に許容されうるシーラントを意味する。この第2シーラントは、第1シーラントと同じものちすても異なるものとしてもよいが、メチルコラーゲンで架橋したポリエチレングリコールヒドロゲルとするのが好ましい。
「周期的な静水圧」又は「Cy−HP」とは、サイン波形の測定圧を発生させる所定の負荷間隔の静水圧を繰返しの2又は複数の周期で加えることを意味する。
「一定の静水圧」、「一定のHP」又は「CHP」とは、非変動性又は非周期性の圧力負荷を所定の周期に亘って加えることを意味する。
「休止期間」とは、細胞を周期的な静水圧に曝した後又はこの静水圧下で培養した後に当該細胞を大気圧の培地中に保持する可変時間を意味する。
「SHTG」とは、空間保持性の温度可逆性ゲルを意味する。
「S−GAG」とは、硫酸グリコサミノグリカンを意味する。
「MMP」とは、基質メタロプロテイナーゼ、すなわち傷害を受けた又は病変した関節における軟骨の分解に関連する酵素を意味する。
「DMB」とは、軟骨細胞の染色に用いるジメチレンブルーを意味する。
「MPa」とは、メガパスカルを意味する。1MPaは、145psiに等しい。
本発明は、新軟骨又は新軟骨構造体を、傷害若しくは外傷を受け又は老化若しくは病変した軟骨の病変部位内、すなわち頂部シーラント下又は第1(底部)及び第2(頂部)シーラント層の間に沈着させれば、この新軟骨が、所定時間内に周囲の元からある軟骨内に組み込まれ、また、このような環境下では、上記第2頂部シーラントにより、新軟骨を埋め込んだ軟骨病変部位上における新たな表層性軟骨層の生体位形成が促進されるという知見に基づくものである。
軟骨の病変部位内に埋め込む新軟骨構造体の調製には、軟骨細胞を採取し培養させる処理と、これらを支持基質内に播種しこれを調製する処理と、これら軟骨細胞を、生体外、管内又は生体内のいずれかで増殖させる処理とが伴われる。
軟骨は、関節及び骨を被覆する結合組織である。新軟骨は、未成熟な軟骨であり、本発明により病変部位内に沈着させると最終的に成熟した軟骨と一体化しその特性を得るようになる。これら2種類の軟骨の差は、その成熟性にある。軟骨は、代謝的に活性だが被分裂性の軟骨細胞を有する成熟組織であり、新軟骨は、分裂及び増殖しうる代謝的及び遺伝的に活性な軟骨細胞を有する未成熟の軟骨である。本発明は、新軟骨の特性を利用して、新軟骨が病変部位の周囲にある成熟した軟骨と一体化しそれにより欠損を修復しうるようにすることで、外傷を受けた軟骨に健康な軟骨の完全な機能を回復させ修復するものである。
軟骨は、血管分布が少なく堅い稠性を有することを特徴とする結合組織である。軟骨は、成熟した非分裂性の軟骨細胞(セル)と、コラーゲン(線維からなる間隙性基質)と、粉砕したプロテオグリカン基質(グリコアミノグリカン又はムコ多糖類)とから構成されるものである。後者の2つは、細胞外基質として次第に知られてきたものである。
新軟骨は、軟骨細胞に対する細胞外基質の割合が、成熟したガラス軟骨よりも低い未成熟なガラス軟骨である。成熟したガラス軟骨における細胞外基質と軟骨細胞との割合は、約95:5である。新軟骨では、成熟した軟骨よりも軟骨細胞に対する細胞外基質の比率が低く、5%より多くの軟骨細胞を有する。
本発明により調製する新軟骨は、ほ乳類のドナーソースから分離した軟骨細胞から細胞外で成長されるものである。代案として、新軟骨を、後述する条件下で本来の位置すなわち生体内で成長させることもできる。
ブタの軟骨を使用してほ乳類の軟骨細胞を分離する具体的の手法を例として実施例1に記載する。本発明による人間の軟骨細胞の分離及び自己由来の人間の新軟骨の調製については、実施例2に記載する。
その後、分離された軟骨細胞を、上述した目的に適した任意の方法、例えば好適な成長培地において約37℃で代表的には約3日〜30日、好ましくは14日に亘って培養することにより増殖させる。軟骨細胞を増殖させるのに、いかなる種類の培養又はインキュベーション装置又はチャンバを用いてもよい。軟骨細胞を増殖させるに際しては、培養及び増殖させる軟骨細胞を選択する前に、死んだ軟骨細胞や残留している生来の細胞外基質や他の細胞残屑を取り除いておくのが好ましい。選択した軟骨細胞は、トリプシン処理又は他の適切な方法を用いて収集し分離する。
軟骨細胞を増殖させるのに続いて、これら軟骨細胞を、任意の好適な溶液、好ましくはコラーゲン含有溶液中に懸濁させる。本発明の目的のために、このような溶液は、代表的にはゲルとし、好ましくは、室温より高い温度で液体ゾルから固体ゲルに溶液の状態が転移するゾル−ゲル転移溶液とする。最も好ましい溶液は、温度可逆性ゲル化ヒドロゲル又は温度可逆性ゲル高分子ゲルである。温度可逆特性は、支持基質内への軟骨細胞の固定と、軟骨の病変部位内への新軟骨構造体の埋め込みとの双方に関して重要となる。
増殖させた軟骨細胞を播種する支持基質は、軟骨細胞を成長させ2次元又は3次元に伝播させるのを構造的に支持する。一般的に支持基質は、生物学的に分解可能で親水性であり、好ましくは中性の電荷を有する。
本発明の一例において、支持基質は、本明細書において新軟骨と記載される活性軟骨細胞を細胞的に支持するハニカム様の格子基質である。このハニカム様の基質は、新軟骨のための成長プラットフォームを支持し、新軟骨が3次元に伝播しうるようにする。
他の例において、支持基質は、温度を変化させることにより、ゾルからゲルへ及びその逆に変化し得るゾル−ゲル材料から形成する。ゾル−ゲル転移は、これらの材料に関して、寒天及びゼラチンゲルの逆の温度サイクルで生じることになる。したがって、これらの材料では、より高い温度で、ゾルが固体ゲルに変化する。ゾル−ゲル材料は、15℃より低い温度で粘性のゾルであり、37℃周辺かそれより高い温度で固体ゲルとなる材料である。一般に、これらの材料は、約15℃〜37℃の温度において転移によってゾルからゲルへ形態を変化し、15℃〜37℃の温度では転移状態にある。最も好ましい材料は、ゲルを含有するI型コラーゲンと、急速なゲル化点を有する温度可逆性ゲル化ヒドロゲル(TRGH)である。
軟骨細胞及び新軟骨の双方又はいずれか一方の3次元的な成長及び伝播を促進するためには、これらの成長条件を変更することにより、このような成長及び伝播を促進するのが有利であり、また場合によっては必要となる。このような促進処理は、生体外、管内又は生体内でで開始させることができる。
一般的な設計の組織プロセッサは、軟骨細胞を培養する装置であって、培地を具える培養チャンバを有する培養ユニット及び培地を連続的及び断続的に搬送するための供給ユニットと、大気圧又は大気圧より上の一定の若しくは周期的な静水圧を組織チャンバに加えるための圧力発生器であって、圧力を変化させ、大気圧又は一定の若しくは周期的な静水圧のタイミングを調整し、或いはこのような圧力を所定の周期で加える手段を有する当該圧力発生器と、随意的には、窒素、二酸化炭素及び酸素のようなガスを搬送したり、吸収したり或いはこれらの双方を行うことができる手段とを有している。さらに、代表的には、プロセッサは、加熱、冷却及び加湿手段を具えるハーメチック封止された空間を有する。
新軟骨構造体の代謝活性、遺伝子活性及び組織外観を試験する。
本明細書において使用される新軟骨構造体とは、軟骨細胞を播種し本発明により処理した基質を意味する。新軟骨構造体は、これら構造体を沈着させる病変部位の寸法に近い、新軟骨を有する3次元パッチとして製造することもできるし、又は広範囲な軟骨損傷部位の修復に用いる三次元シートとして製造することもできる。新軟骨構造体の寸法及び形状は、支持基質の形状及び寸法により定まる。新軟骨構造体の機能は、構造体を処理する条件(アルゴリズム)により決定される。
本発明の一観点は、軟骨細胞を播種した支持基質を、媒体流速を変化させて潅流させれば、細胞外基質の蓄積量の増加により評価される細胞増殖を有利に増減されうるという知見にある。一般に、媒体の流速を遅くするほど、細胞外基質の蓄積が大きくなる。
灌流速度を低減させるのに関連して、播種した支持基質を静水圧に曝すことは、本発明による培養処理システムにおける不可欠な部分である。異なる種類の静水圧を用いることは、大気圧のみを用いる場合と比べて、グリコサミノグリカンの生成、すなわち細胞外基質の蓄積に顕著な影響を与える。静水圧、特に本発明により加えられる周期的な静水圧により、軟骨細胞の増殖や細胞外基質の蓄積に寄与する代謝が刺激される。
播種された支持基質の処理における他の可変条件は、酸素、二酸化炭素及び窒素の濃度である。
上述した軟骨細胞を播種した支持基質は更に、TESSプロセッサにおける新軟骨の形成処理中に、酸素濃度を低減させて(すなわち20%未満の飽和度)培養させることができる。軟骨における酸素濃度の減少は生体内で観察されるが、このような酸素濃度の減少は、軟骨に血管が通常存在しないため隣接組織と比べて酸素分圧が低くなることによりに生じる。本発明における研究では、支持基質内に播種した軟骨細胞又は新軟骨を、約0%〜約20%の飽和度の酸素濃度で、又は5%の二酸化炭素濃度で培養した。
本発明の最終的な目的は、軟骨病変部位内に埋め込むための新軟骨構造体であって、1層以上のシーラント層を堆積させるのと連携して、a)埋め込まれた新軟骨構造体を保護し病変部位上に成長してこれを完全に被覆する表層性軟骨層を成長させるステップと、b)新軟骨構造体として病変部位内に埋め込まれた新軟骨を一体化させるステップと、c)その後新軟骨構造体及びシーラント材料を分解させるステップとにより、損傷若しくは障害を受け又は病変若しくは老化した軟骨を治療するための当該新軟骨構造体を調製する条件(アルゴリズム)を見出し確かめることにある。
a)ドナーの組織から軟骨細胞を分離するステップと、
b)これら軟骨細胞を約3〜28日間に亘り増殖させるステップと、
c)これら軟骨細胞を温度可逆性若しくはコラーゲンゲル又はコラーゲンスポンジの支持基質に播種するステップと、
d)軟骨細胞を播種したゲル又はスポンジに対し、5μl/分の潅流速度で数日(5〜10日)間に亘り、大気圧より高い一定の又は周期的な静水圧(0.5Hzにおいて約0.5〜3.0MPa)を加えるステップと、
e)播種されたゲル又はスポンジに、一定の(大気)圧で10〜14日間の静止期間を付与するステップと
を有する。
新軟骨構造体の製造における支持基質内での軟骨細胞の伝播に対する種々の条件の影響を試験するために、本発明の開発時に、前述した条件を組合わせて処理を最適化させる研究を行った。この結果を、図3〜図9、及び表1〜3に示す。
圧力及び媒体潅流速度の双方又はいずれか一方の影響を評価するために、TESSプロセッサにおいて、細胞を播種したスポンジに対して、0.5Hzで0.5MPaの周期的な静水圧(Cy−HP)又は一定の静水圧(constant−HP)で6日間にわたり、5μl/分(0.005ml/分)又は50μl/分(0.05ml/分)の媒体潅流を行った。その後、大気圧下で12日間の静止期間を設けた。播種したスポンジの一部を対照群として用いた。これらのスポンジは、大気圧下で全18日間に亘り37℃で培養し、潅流はさせなかった。細胞を播種した後24時間の時点(0日目)で採取したスポンジを、初期対照群として用いた。より詳細な条件については、実施例に後述してある。
TESS培養において、媒体流速は0.05ml/分とした。各群から2つの細胞基質を収集し、組織学的分析を行った。
第2の研究は、軟骨細胞の増殖(DNA含量)及び細胞外基質の蓄積(S−GAGの蓄積)に対する潅流の影響を調べるために実施した。これらの結果を、表3並びに図7A及び図7Bに示す。
第3番目の研究は、軟骨細胞の増殖(DNA含量)及び細胞外基質の生成(S−GAG蓄積)に対する低酸素圧の影響を判断するために行ったものである。この結果を、表4及び図9A及び9Bに示す。
軟骨細胞に用いる上述のアルゴリズムは、異なる種類の細胞及び組織、例えば分裂可能な幹細胞、線維芽細胞、線維軟骨細胞、腱細胞及び骨芽細胞や、軟骨結合組織、線維軟骨、腱及び骨のような組織にも同様に適用できる。アルゴリズムの条件は、同じものでも異なるものでもよいが、通常は、上述した範囲内にある。
新軟骨組成物構造体は、細胞支持基質に組み込まれた生軟骨細胞を少なくとも含む多層三次元構造をしている。支持基質には、生きている軟骨細胞が播種されている。
本発明の主要な観点は、上述した手順及び条件に従って形成した新軟骨、新軟骨構造体又は播種された支持基質を、軟骨病変部位内に埋め込み、生体適合性の接着シーラントによりこれを被覆すれば、これらの組み合わせにより、この病変部位上を完全に覆う表層性軟骨層が形成されるという知見にある。
このステップは、新軟骨、構造体を有する新軟骨、及び自己由来若しくは異種の軟骨細胞を内部に組み込んだ支持基質を調製する処理を伴う。上に挙げたこれら3つの物質については、セクションI.B〜Dに詳細に記載してある。
このステップは、生物学的に許容されうる第1及び第2シーラントの第1及び第2層を軟骨病変部位に導入する処理を伴う。これら第1及び第2のシーラントは、同じものとしてもよいし、異なるものとしてもよい。第1底部層の使用は任意であり、第1底部層なしでも表層性軟骨層を形成しうることを理解されたい。
任意的に沈着させる第1シーラントは、導入される新軟骨構造体と、元からある軟骨との間の界面をなす。病変部位の底部に沈着させる第1シーラントは、肋軟骨下の空間に軟骨細胞が移動するのを防止するとともに、これから新軟骨構造体を保護しうるものでなければならない。さらに、第1シーラントは、血管及び不所望な細胞及び細胞片が新軟骨構造体に浸潤するのを防止し、線維軟骨の形成も防止する。
第2シーラントは、新軟骨構造体又は病変腔の外側の保護体として作用するもので、代表的には新軟骨を病変腔内に埋め込む前又は後に病変部位上の沈着させる。このようにして、第2シーラントは、細胞浸潤又は分解性の物質のような外部環境のいかなる不所望な影響からも病変腔の統合性を保護し、新軟骨を埋め込む前では空間保持ゲルを適所に封止するものとなる。第2シーラントは、2つのシーラント間に形成された病変腔内に埋め込まれた新軟骨構造体の保護体としても作用する。このように、第2シーラントは、第1シーラント上に新軟骨を埋め込んだ後に沈着させることができる。或いは、第2シーラントは、空間保持ゲル上に沈着させることもできる。第2のシーラントの第3の機能は、表層性軟骨層を形成するための開始剤又は基板としてのものである。本発明の開発中に実施した研究により、第2シーラントを軟骨病変部位上の沈着させると、元からある表層性軟骨層の延長として表層性軟骨層が成長することを確かめた。この表層性軟骨層は、病変腔を空間保持ゲル又は温度可逆性ゲルで充填した場合に特によく発達した。このことにより、このようなゲルが、このような表層性軟骨層を形成するための基板となりうるという結論が導かれる。
本発明の第1又は第2シーラントは、以下の特性を有する必要がある。
シーラントは、生物学的に許容されうるもので、使いやすく、必要な接着特性及び凝集特性を具える必要がある。
シーラントは、生物学的に組織と適合性があり、非毒性で、過度に膨張するものでなく、過度に強固又は剛固でないものとする。その理由は、これによりシーラントが摩耗したり、組織部位からシーラントが突出するおそれがあるためである。また、シーラントは、新たな軟骨の形成に干渉したり、又は骨若しくは血管のような他の干渉性の若しくは不所望な組織の形成を促進するものであってはならず、許容されうる経路で再吸収又は分解されるものとするか、又は組織に組み込まれるものとする必要がある。
本発明の目的に好適なシーラントは、ゼラチン及びジアルデヒドデンプンから調製されるシーラントであって、ゼラチン及びジアルデヒドデンプンの水溶液を混合させることにより自然に反応してゲル化する反応が引き起こされるものである。ゲルは、デンプン分子上アルデヒド基と、組織のタンパク質上のアミノ基とが反応することにより組織に結合し、比較的堅固で強固な材料の特徴とされる8×106 Paの弾性率及び最大100N/mの接着強度を有する。生理流体中で膨張した後では、この接着強度が低減してしまう。ゲル化されたシーラントは、ゼラチンのペプチド結合及びデンプンのグリコシド結合を切断する酵素により分解される。
シアノアクリル酸すなわちSuperglueは極めて強固であるが、組織中で毒性反応を呈するおそれがある。
本発明の第1又は第2シーラントは、生物学的に許容されうるものでなければならず、代表的には接着性、結合性及び粘着性のいずれか又はこれらの任意の組み合わせを有する急速にゲル化する合成化合物である必要があり、代表的には、コラーゲン化合物、典型的にはアルキル化コラーゲンにより架橋されてあるのが好ましい誘導ポリエチレングリコール(PEG)のようなヒドロゲルである。シーラントは少なくとも0.3MPaの抗張力を有する必要がある。好適なシーラントの例は、テトラヒドロスクシンイミジル若しくはテトラチオール誘導PEG又はこれらの組合わせであり、米国カリフォルニア州のパロアルトにあるCohesion Technologies社からCoSealの登録商標名で市販されており、また文献J. Biomed Mater. Res (Appl. Biomater.)(2001年)58の第545〜555頁に記載されているものである。その他の好適な化合物は、本明細書に参考として組み込んだ米国特許第6312725号明細書に記載されている急速にゲル化する生物適合性高分子組成物である。加えて、シーラントは、急速に基質を形成する2部分以上の高分子組成物であって、少なくとも1つの化合物が、例えば、ポリアミノ酸、多糖類、ポリアルキレンオキサイド若しくはポリエチレングリコールといった高分子であり、これら2つの部分が共有結合により架橋されたものや、市販のコラーゲンにより架橋されたPEGとすることができる。
本発明の方法における次のステップは、第2シーラント層下又は2層のシーラント層間に形成された病変腔内に新軟骨を埋め込む処理であって、この病変腔の内部を埋め込んだ新軟骨構造体により充填する処理を有する、或いは任意的に、当該病変腔内に、約5℃〜約25℃の温度でゾルとして埋め込んだ空間保持温度可逆性ゲル(SHTG)により充填し、このSHTGを、病変腔内において体温でゾルからゲルに転換させ、SHTGは、この形態で新軟骨構造体の導入のための空間を保持すると共に新軟骨を保護し、その存在により更に、軟骨病変部位を覆う新たな表層性軟骨層の形成を促進するようにする処理を有する。
新軟骨は、自己由来又は異種のものとすることができ、セクションI.B.a〜cに前述したようにして調製する。
新軟骨は、表層性軟骨層の形成前又は形成後に病変腔内に埋め込む。いかなる場合でも、第1シーラントを使用するならば、最初に第1シーラントを埋め込む。実施例においては、代表的には異種の新軟骨を含む新軟骨構造体を、第1シーラント層上に沈着させ、直ちに第2シーラント層により被覆することができる。このような場合、新軟骨は、表層性軟骨層が形成され、新軟骨が周囲の軟骨と一体化するまで病変腔内に残る。この際、新軟骨構造体に使用する材料に応じて、スポンジゲル又は温度可逆性ゲル化ヒドロゲルが病変腔に残り分解される。
温度可逆性ゲルに懸濁させた新軟骨又は軟骨細胞を播種した支持基質を含む新軟骨構造体を、接着性の高分子第2シーラントと組合わせることにより、病変腔上に表層性軟骨層が成長し病変腔が完全に若しくはほぼ完全に封止されるようになる。
本発明による方法を、生体内での研究において試験し確認した。この研究では、ブタのモデルで実施した3ヵ月の研究において表層性軟骨層の生成を確かめ、豚の新軟骨構造体の周囲の軟骨への一体化を評価した。
関節軟骨は、血管、神経、リンパの供給がない唯一の組織である。血管及びリンパの循環の欠如は、繊維性又は線維軟骨性の組織を形成することなく、関節軟骨を回復する能力が本来的に乏しい又はほぼ存在しない理由のひとつである。重度の傷害又は病変、例えば変形性関節症(OA)の後では、関節軟骨の固有の機械的機能は決して自然に回復しない。
これらの結果を、表5及び図13〜15に示す。
a)関節軟骨病変部位を清拭すると共に、清拭中に非骨関節炎のガラス軟骨を少量(50〜4000mg)を採取するるステップと、
b)前述した手順により新軟骨構造体を形成し処理するステップと、
c)1又は2層のシーラント層を沈着させることにより新軟骨構造体を埋め込むための病変部位を準備するステップであって、前述した多種の変型例を用いて、(任意の)第1シーラント層を病変部位の底部に沈着させ、第2シーラント層を病変部位の上部に沈着させ、頂部シーラント層の下若しくはこれら2層のシーラント層の間に形成された病変腔内に新軟骨構造体を埋め込むか、又は新軟骨構造体を調製する際に一時的に病変腔の一体性を保持するために2層のシーラント層間の病変腔内に空間保持温度可逆性高分子ゲルを沈着させる当該ステップと、
d)2層のシーラント層間に形成された前記病変腔内に新軟骨構造体を埋め込んみ、新軟骨を周囲の元からある傷のない軟骨と一体化させ、且つ表層性軟骨層を形成させるステップと、
e)任意的に、新軟骨の埋め込み前に病変腔から空間保持高分子ゲルを取り除くステップと
を有する。
ソース組織からの軟骨細胞の分離
この実施例は、ブタの軟骨から軟骨細胞を分離するのに使用する手法を説明する。
軟骨細胞は、6ヵ月のブタの後肢から無菌条件下で採取した軟骨から酵素処理により分離した。露出した脛骨及び気管頭部から大腿骨を分離した。外科刃を用いて気管から軟骨細条を取り除いた。
これら軟骨細胞を、37℃で約5日間にわたり増殖させた。
人間の新軟骨構造体の生成
この実施例は、人間に使用する新軟骨の生成条件を説明するものである。
患者に対し、同側の膝からの健康な軟骨小片(200〜500mg)の関節鏡生検を行う。生検は、大腿顆の非重量支持部位から、又は患者にとって最も適当であると判断される大腿切痕から行う。生検サンプルは、無菌性、非細胞毒性及び非発熱性の標本容器内に配置し、これをパッケージして研究室に運び込む。
支持基質の調製
この実施例は、TESS基質とも称する細胞支持基質の形成を説明する。
pH3.0に保持した1%水性アテロコラーゲン溶液(VITROGEN(登録商標))300グラムを10×20cmのトレイに注ぐ。次に、このトレイを5リットルの容器内に設置する。次に、3%アンモニア水溶液30mlをいれた50mlのふたの開いた容器を、上述した1%水性アテロコラーゲン溶液300グラムが入った5リットル容器内に設置する。そして、アンモニア及びアテロコラーゲンの入ったふたの開いたトレイをいれたこの5リットルの容器を密封して、室温に12時間そのままにしておく。この間に、アンモニア水をいれたふたの開いた容器からアンモニアガスが放出され、このガスは密封した5リットルの容器に閉じこめられた水性アテロコラーゲンと反応して水性アテロコラーゲン溶液をゲル化する。
約4mm〜10mmの厚みを有する多孔性コラーゲン基質を、湿度を調整したチャンバを用いて、相対湿度80%、温度25℃で60分間水和する。コラーゲン材料を、2枚のテフロン(登録商標)シート間で0.2mm未満の厚さに圧縮する。この圧縮したコラーゲン材料を次に、0.5%ホルムアルデヒド、1%炭酸水素ナトリウム溶液中で、pH8で60分間架橋させる。この架橋させた膜を完全に水ですすぎ、約48時間凍結乾燥する。高密度のコラーゲンバリアは、絡み合って多層構造体となっている高密度充填線維の内側埋め込体を有する。
TESS基質への細胞の播種
この実施例は、TESS基質に細胞を播種するのに使用する手法を説明する。
分離した軟骨細胞を、標準のインキュベータ内で37℃で5日間にわたり培養した。その後、軟骨細胞を、トリプシン処理により収集した。
約19μlの容積の基質につき、18μlのVITROGEN溶液中に30000の細胞を有する細胞懸濁液を播種し、1群あたり8つの基質を用意した。
周期的な静水圧の影響
この実施例は、軟骨細胞を播種した支持基質を生体外形成する際の周期的な静水圧の影響を決定するのに使用する手法を説明するものである。
ブタ骨関節軟骨細胞(sACs)を、I型コラゲナーゼにより軟骨から酵素的に分離した。これらの細胞を、上述したようにコラーゲン(VITROGEN)中に懸濁させ、細胞支持基質のハニカムスポンジ素子に加えた。支持基質中に播種した細胞を、37℃で、5%二酸化炭素及び20%酸素中で培養した。これらの細胞基質を、24時間後にTESS(商標名)プロセッサに搬送し、前述したようにして媒体灌流(0.05ml/分)を用いると共に周期的な又は一定の0.5又は3.0MPaの静水圧を加えて7日間に亘り培養し、その後12日又は14日の休止期間を設けた。基質に播種された軟骨細胞を有する対照群は、5%二酸化炭素及び20%若しくは2%酸素中で、大気圧において37℃で、18又は21日間に亘り培養した。
組織学的分析のために各群からの2つの基質を採取した。
コラーゲンスポンジにおける軟骨細胞の細胞外基質の蓄積に対する媒体流速の影響
この実施例は、コラーゲンスポンジに播種された軟骨細胞による細胞外基質の生成及び蓄積に対する媒体流速の影響を決定するために使用する条件を説明するものである。
ブタの脚を、現地の畜殺場から得た。虐殺後4〜6時間以内に、ブタ後肢の滑車から無菌条件下で軟骨を採取した。この軟骨を、細かく切り刻んで、1%のペニシリンストレプトマイシン(P/S)を含むDMEM/F−12の0.15%I型コラゲナーゼ溶液中で37℃で18時間に亘りで消化させた。分離したブタの関節軟骨細胞(sACs)を収集してリンスし、10%のウシ胎仔血清(FBS)及び1%のP/Sを追加したDMEM/F−12中に再懸濁させた。その後、このsACsを、37℃で5日間に亘り増殖させた。
このsACsを、トリプシンEDTAにより収集し、細胞生存力をトリパンブルー除外法で測定した。300000のsACsを、中和した30μlの0.25%コラーゲン溶液(VITROGEN(登録商標)、カリフォルニア州のパロアルトにあるCohesion社)中に懸濁させた。この懸濁液を、日本の高研社から市販されている直径4mm及び厚さ2mmのコラーゲンスポンジに吸収させた。播種されたスポンジを、37℃で1時間に亘り予培養してコラーゲンをゲル化し、続いて培地において5%二酸化炭素中で37℃で培養した。
培養後、播種したスポンジを、Tissue Engineering Support System(TESS(商標名))プロセッサに移しそこで培養処理を行った。媒体潅流速度の影響を評価するために、スポンジを、5μl/分又は50μl/分の媒体灌流にさらした。0〜0.5MPAの周期的な静水圧(Cy−HP)を、0.5Hzで6日間に亘り加えた。幾つかのスポンジは、大気圧の一定条件下で灌流なしで合計18日間に亘り37℃で培養した。細胞を播種してから24時間後に採取したスポンジ(0日)を初期対照群として使用した。
培養してから6日後及び18日後に細胞構造体を採取した。組織学的評価のために、4%パラホルムアルデヒドに固定したパラフィン切片を、サフラニンO(Saf−0)及びII型コラーゲン抗体により染色した。
生化学的及び組織学的検定法
この実施例は、生化学的及び組織学的研究(DMB分析)のために使用した検定法を説明するものである。
培養物終了後、各群から6つの基質を生化学分析のために使用した。
基質を、マイクロ遠心管へ移し300μlのパパイン(0.1Mリン酸ナトリウム、5mMの二ナトリウムEDTA及び5mMのL−システイン−HCl中に125μg/ml)中で60℃で18時間に亘り消化させた。基質におけるS−GAGの生成量を、文献Connective Tissue Research(1982年)9:第247〜248頁の記載に従い、サメのコンドロイチン硫酸を対照として、変性ジメチルメチレンブルー(DMB)微量検定法を用いて測定した。
各群からの残りの基質を4%パラホルムアルデヒドに固定した。基質を処理してパラフィンに包埋した。10μmの切片をミクロトーム上に切り出し、サフラニン−O(Saf−O)にて染色した。
この実施例は、ブタモデルにおけるブタ新軟骨の一体性を評価するために行った研究の手法及び結果を説明するものである。
軟骨細胞を、軟骨生検材料から分離し、Tissue Engineering Support System(TESS(商標名))のコラーゲン基質中で培養し、以降の埋め込み処理に用いるporcine−Neocart(商標名)を得た。
生体内、生体外又は管内でブタの新軟骨を成長させるためのプロトコル
自己由来のブタの軟骨細胞を、細胞支持基質に播種し、周期的な静水圧の下において5%二酸化炭素中で37℃で培養する。周期的な静水圧は、0.5Hzにおいて0.5MPa又は3.0MPaである。この周期的な圧力を加える期間は、約6日であり、その後、37℃に維持したインキュベータ内で大気圧で12日間に亘り休止期間を設ける。この休止期間終了後、生化学的及び組織学的分析のために基質を採取した。
人間の軟骨細胞の再生
この実施例は、人間の軟骨細胞を再生させるのに使用する手法を説明するものである。
骨関節炎(OA)の患者(40歳)からの軟骨細胞を、37℃で単層培地において18日間に亘り増殖させ、VITROGEN(登録商標)中に懸濁させた(300000細胞/30μl)。細胞懸濁液を、支持基質、通常はコラーゲンハニカムスポンジ(日本の高研社製の直径4mm及び厚さ2mmのもの)に吸収させた。細胞構造体は、TESS(商標名)プロセッサ中で、10%のFBS及び1%のITS(Sigma社製のインシュリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム)を追加した培地において、二酸化炭素を5%とし及び酸素を20%として、7日間又は14日間に亘り37℃で、0.5MPa周期的な静水圧(Cy-HP)で、又は0.5MPaの一定の静水圧(一定のHP)で培養した。その後、37℃としたCO2 インキュベータ内で7日間又は14日間に亘り大気圧で培養した。対照群を含んでいる残りの細胞構造体を、5%二酸化炭素及び20%酸素中において大気圧で37℃で21日間に亘り培養した。
Claims (61)
- 損傷若しくは傷害を受け又は病変若しくは老化した軟骨を機能性の軟骨に修復し回復させる方法であって、
a)スポンジ、多孔性スキャフォルド又はヒドロゲル基質支持体に組み込まれ、所定のアルゴリズム条件で処理した自己由来又は異種の軟骨細胞を有する新軟骨構造体を調製するステップと、
b)この構造体を軟骨病変部位に埋め込むステップと
を有する方法。 - 請求項1に記載の方法において、
この方法がさらに、前記病変部位に埋め込まれた前記構造体上に、生物学的に許容されうる頂部シーラント層を沈着させるステップを有する方法。 - 請求項2に記載の方法において、
この方法がさらに、前記病変部位の底部に、生物学的に許容されうる底部シーラント層を沈着させるステップを有する方法。 - 請求項3に記載の方法において、
前記頂部及び前記底部シーラント層が、同じものであるか又は異なるものである方法。 - 請求項4に記載の方法において、
前記構造体及び前記頂部シーラントを組合せることにより、前記軟骨病変部位を生体位で封止する表層性軟骨層の形成及び成長がなされるようにする方法。 - 請求項5に記載の方法において、
病変腔に埋め込む前記新軟骨構造体を、その埋め込み処理前に本発明のアルゴリズムで処理する方法であって、
前記アルゴリズムが、軟骨細胞を処理する条件として、可変の静水圧若しくは大気圧又は無圧力の条件と、可変の灌流速度条件と、可変の培地組成条件と、可変の酸素若しくは窒素若しくは二酸化炭素の濃度条件と、可変の温度条件と、可変の細胞密度条件と、可変の時間条件とを有する方法。 - 請求項6に記載の方法において、
前記新軟骨構造体の支持基質を、I型コラーゲン、II型コラーゲン、IV型コラーゲン、グリコサミノグリカン若しくは糖蛋白質若しくはプロテオグリカンを含む細胞収縮コラーゲン、ゼラチン、アガロース、フィブロネクチン、ラミニン、生理活性ペプチド成長因子、ヒアルロン酸、サイトカイン、エラスチン、ポリ乳若しくはポリグリコール若しくはポリアミノ酸から形成される合成高分子繊維、ポリカプロラクトン、ポリアミノ酸、ポリペプチドゲル、高分子温度可逆性ゲル化ヒドロゲル(TRGH)及びこれらの共重合体並びにこれらの組合せからなる群から選択された材料から調製する方法。 - 請求項7の方法において、
前記静水圧を、約0.01〜約1Hzにおいて大気圧より上で約0MPa〜約10MPaの圧力とし、
前記静水圧を加える前記時間を、約90日〜約1日に亘り1日あたり0〜約24時間とし、
静大気圧を約90日〜約1日に亘り1日あたり0〜約24時間加える処理の前又は後に、前記静水圧を加える処理を行い、
前記流速を、約1μL/分〜約500μL/分とし、
前記細胞密度を、1mLあたり約3000000〜60000000とし、
前記酸素濃度を、約1%〜約20%とする方法。 - 請求項8の方法において、
前記新軟骨構造体が、1mLあたり約12000000〜約15000000の密度でTRGH中に懸濁された軟骨細胞を含むようにし、
前記0.1〜約0.5Hzにおいて約0.05MPa〜約3MPaの圧力とした周期的な静水圧を加えるか、大気圧より上で約0〜約3MPaの一定圧を加えるかし、
このような圧力を、約7日〜約28日間に亘り加え、
前記灌流流速を、約50μL〜約5μLとし、
前記灌流処理を、約2%〜約5%の酸素の存在下で行う方法。 - 損傷若しくは傷害を受け又は病変若しくは老化した関節軟骨を治療し再生させる関節軟骨の治療及び再生方法であって、
a)関節軟骨病変部位を清拭するステップと、
b)清拭中に、約50〜4000mgのガラス軟骨を採取するステップと、
c)これら軟骨細胞を分離するステップと、
d)前記軟骨細胞を培地で増殖させるステップと、
e)前記軟骨細胞を、1mlあたり約3000000〜約60000000の細胞密度で支持基質に懸濁させ、新軟骨構造体を生成するステップと、
f)前記構造体に対し、約2%〜約20%の酸素の存在下で約1〜約500μLの灌流流速において、約12日〜約20日の静大気圧を加える処理期間の後に、約5日〜約10日間の期間に亘り周期的な又は一定の静水圧を加えるアルゴリズムを行うステップと、
g)前記ステップf)により得られた前記構造体を、ステップa)の病変部位に埋め込むステップと、
h)前記病変部位に埋め込まれた前記構造体を、生物学的に許容されうる頂部シーラントにより被覆し、前記病変部位の外面を被覆するステップと
を有する関節軟骨の治療及び再生方法。 - 請求項10に記載の関節軟骨の治療及び再生方法において、
この方法がさらに、前記病変部位の底部に生物学的に許容されうる底部シーラントを沈着させるステップを有する関節軟骨の治療及び再生方法。 - 請求項11に記載の関節軟骨の治療及び再生方法において、
前記頂部又は前記底部シーラントを、ゼラチン、ポリエチレングリコール及びポリ乳酸若しくはポリグリコリドの共重合体、過ヨウ素酸酸化ゼラチン、4腕のペンタエリスリトールチオール及びポリエチレングリコールジアクリレート、4腕のテトラスクシンイミジルエステル若しくはテトラチオール誘導体化PEG、光重合性ポリエチレングリコール共重合(a−ヒドロキシ酸)ジアクリレートマクロマー、メチル化コラーゲンを加えたスクシンイミジルエステル及びチオールにより誘導体化した4腕のポリエチレングリコール、ヒドロゲル、誘導体化ポリエチレングリコール(PEG)、アルキル化コラーゲンにより架橋した誘導体化ポリエチレングリコール(PEG)、テトラヒドロスクシンイミジル若しくはテトラチオール誘導体化PEG、メチル化コラーゲンで架橋したPEG並びにこれらの組合せからなる群から選択し、これら頂部及び底部シーラントが、同じものであるか又は異なるものとする関節軟骨の治療及び再生方法。 - 請求項13に記載の関節軟骨の治療及び再生方法において、
前記シーラントを、メチル化コラーゲンで架橋したPEGとする関節軟骨の治療及び再生方法。 - 請求項11に記載の関節軟骨の治療及び再生方法において、
採取する軟骨細胞を、関節鏡検査中に患者から得られる非骨関節炎又は骨関節炎の軟骨細胞とし、
プロテアーゼ及びリアーゼの双方を順次に又は混合して使用することにより、前記軟骨細胞を分離させ、
これら軟骨細胞を、培地にて培養して増殖させてゾル−ゲル溶液又は温度可逆性ゲル化ヒドロゲル中に懸濁させ、支持基質に播種する関節軟骨の治療及び再生方法。 - 請求項14に記載の関節軟骨の治療及び再生方法において、
前記支持基質を、I型コラーゲン、II型コラーゲン、IV型コラーゲン、グリコサミノグリカン若しくは糖蛋白質若しくはプロテオグリカンを含む細胞収縮コラーゲン、ゼラチン、アガロース、フィブロネクチン、ラミニン、ヒアルロン酸、生理活性ペプチド成長因子、サイトカイン、エラスチン、ポリ乳若しくはポリグリコール若しくはポリアミノ酸から形成される合成高分子繊維、ポリカプロラクトン、ポリアミノ酸、ポリペプチドゲル、高分子温度可逆性ゲル化ヒドロゲル(TRGH)及びこれらの共重合体並びにこれらの組合せからなる群から選択された材料から調製されたスポンジ、多孔性スキャフォルド若しくはヒドロゲルとする関節軟骨の治療及び再生方法。 - 請求項15の関節軟骨の治療及び再生方法において、
前記基質を、ゾル−ゲル懸濁液を静水圧を加える前に導入したスポンジとするか、又は前記基質を、液体ゾルの形態となる約30℃より低い温度で軟骨細胞を懸濁させたTRGHであって、その後約30℃〜約37℃より高い温度まで上昇させることにより固体ゲルの形態に転換させた当該TRGHとし、前記固体ゲルを前記ステップf)のアルゴリズムにより処理し、新軟骨構造体を形成する関節軟骨の治療及び再生方法。 - 請求項16に記載の関節軟骨の治療及び再生方法において、
前記構造体を、前記頂部シーラント層及び前記底部シーラント層の間に形成された病変部位の病変腔内に埋め込む関節軟骨の治療及び再生方法。 - 請求項17に記載の関節軟骨の治療及び再生方法において、
前記構造体を、軟骨細胞を組み込んだ前記TRGHとし、この構造体を30℃より低い温度まで冷却して液体ゾルに転換してゾルとして埋め込み処理を行い、このゾルを体温まで加温し前記ゾルを前記病変腔を充填する固体ゲルに転換させる関節軟骨の治療及び再生方法。 - 請求項18の関節軟骨の治療及び再生方法において、
前記新軟骨構造体が、TRGH中に懸濁させた軟骨細胞を含むようにし、
約12日間に亘り静的大気圧を加える処理の後又は前において、0.1Hzにおいて約3MPaとした周期的な静水圧又は約0〜約3MPaとした一定の静水圧を加え、
前記灌流流速を約5μLとし、
前記灌流処理を、約2%〜約5%の酸素の存在下で行う方法。 - 請求項16に記載の関節軟骨の治療及び再生方法において、
前記構造体を、軟骨細胞を組み込んだスポンジとし、この構造体を、底部シーラントを沈着させた後で且つ頂部シーラントを沈着させる前に、前記病変部位の底部シーラント上方に埋め込む関節軟骨の治療及び再生方法。 - 軟骨病変部位に埋め込むための新軟骨構造体であって、
前記構造体は、培養して分化させた自己由来若しくは異種の軟骨細胞又は分化して軟骨細胞になりうる細胞であって、支持基質に組み込まれたものを含み、軟骨細胞に対する可変の静水圧若しくは大気圧又は無圧力の条件と、可変の灌流速度条件と、可変の培地組成条件と、可変の酸素若しくは窒素若しくは二酸化炭素の濃度条件と、可変の温度条件と、可変の細胞密度条件と、可変の時間条件とを含む本発明のアルゴリズムで処理したものである新軟骨構造体。 - 請求項21に記載の構造体において、
前記支持基質が、I型コラーゲン、II型コラーゲン、IV型コラーゲン、グリコサミノグリカン若しくは糖蛋白質若しくはプロテオグリカンを含む細胞収縮コラーゲン、ゼラチン、アガロース、フィブロネクチン、ラミニン、生理活性ペプチド成長因子、サイトカイン、エラスチン、ヒアルロン酸、ポリ乳若しくはポリグリコール若しくはポリアミノ酸から形成される合成高分子繊維、ポリカプロラクトン、ポリアミノ酸、ポリペプチドゲル、高分子温度可逆性ゲル化ヒドロゲル(TRGH)及びこれらの共重合体並びにこれらの組合せからなる群から選択された材料から調製されたスポンジ若しくは多孔性スキャフォルド若しくはヒドロゲルである構造体。 - 請求項22に記載の構造体において、
前記支持基質がTRGHである構造体。 - 請求項23に記載の構造体において、
前記静水圧を周期的な又は一定の圧力とした構造体。 - 請求項24の構造体において、
前記静水圧は、約0.01〜約1Hzにおいて大気圧より上で約0MPa〜約10MPaの圧力とされ、
前記静水圧を加える前記時間は、約90日〜約1日にわたり1日あたり0〜約24時間とされ、
約90日〜約1日に亘る1日あたり0〜約24時間の静大気圧を加える処理の前又は後に、前記静水圧を加える処理が行われ、
前記流速が、約1μL/分〜約500μL/分とされ、
前記細胞密度は、1mLあたり約3000000〜60000000とされ、
前記酸素濃度が、約1%〜約20%とされた構造体。 - 請求項25に記載の構造体において、
0.1〜約0.5Hzにおいて約0.05MPa〜約3MPaの圧力とした周期的な静水圧か、又は大気圧より上で約0〜約3MPaとした一定圧が、約7日〜約28日間に亘り加えられた構造体。 - 請求項26に記載の構造体において、
約0〜約28日の大気圧に曝す期間の後又は前に、前記静水圧を加える処理を行う構造体。 - 請求項27に記載の構造体において、
前記軟骨細胞が自己由来のものである構造体。 - 請求項27に記載の構造体において、
前記軟骨細胞が異種のものである構造体。 - 軟骨病変部位内に埋め込むのための3次元新軟骨構造体の製造方法であって、
a)支持基質構造体を調製するステップと、
b)ドナーから一片の軟骨を採取して軟骨細胞を分離するステップと、
c)軟骨細胞を培養し増殖させるステップと、
d)増殖させた軟骨細胞を懸濁させて懸濁液とするステップと、
e)前記懸濁させた軟骨細胞を基質に組み込むステップと、
f)本発明のアルゴリズムを用いて、前記軟骨細胞を2次元又は3次元の新軟骨構造体内で伝播させるステップと
を有する新軟骨構造体の製造方法。 - 請求項30に記載の新軟骨構造体の製造方法において、
前記支持基質構造体を、コラーゲン、I型コラーゲン、II型コラーゲン、IV型コラーゲン、グリコサミノグリカン若しくは糖蛋白質若しくはプロテオグリカンを含む細胞収縮コラーゲン、ゼラチン、アガロース、フィブロネクチン、ラミニン、ヒアルロン酸、生理活性ペプチド成長因子、サイトカイン、エラスチン、ポリ乳酸若しくはポリグリコール若しくはポリアミノ酸から形成される合成高分子繊維、ポリカプロラクトン、ポリアミノ酸、ポリペプチドゲル、ヒドロゲル及びこれらの共重合体並びにこれらの組合せからなる群から選択された材料から調製する新軟骨構造体の製造方法。 - 請求項31に記載の新軟骨構造体の製造方法において、
前記支持基質を、コラーゲン、I型コラーゲン、II型コラーゲン又はIV型コラーゲンから調製する新軟骨構造体の製造方法。 - 請求項32に記載の新軟骨構造体の製造方法において、
前記コラーゲン、前記I型コラーゲン、前記II型コラーゲン又は前記IV型コラーゲンを凍結乾燥させるか、又はスポンジ又はスポンジ様構造体に凍結乾燥させる新軟骨構造体の製造方法。 - 請求項31に記載の新軟骨構造体の製造方法において、
前記支持基質を、高分子温度可逆性ゲル化ヒドロゲル(TRGH)又は高分子ゾル−ゲルヒドロゲルとする新軟骨構造体の製造方法。 - 請求項31に記載の新軟骨構造体の製造方法において、
培養し増殖させた軟骨細胞を、ゲル溶液中で懸濁させて前記支持基質に組み込む新軟骨構造体の製造方法。 - 請求項35に記載の新軟骨構造体の製造方法において、
支持基質を、コラーゲンスポンジ又はスポンジ様構造体とし、軟骨細胞を、TRGH又はゾル−ゲルヒドロゲルとして前記スポンジに組み込む新軟骨構造体の製造方法。 - 請求項36に記載の新軟骨構造体の製造方法において、
軟骨細胞を、約3000000〜約60000000細胞/mlの密度で前記スポンジに組み込む新軟骨構造体の製造方法。 - 請求項37の新軟骨構造体の製造方法において、
前記静水圧を、約0.01〜約1Hzにおいて大気圧より上で約0MPa〜約10MPaの圧力とし、
前記静水圧を加える前記時間を、約90日〜約1日にわたり1日あたり0〜約24時間とし、
約90日〜約1日に亘り1日あたり0〜約24時間の静的大気圧を加える処理の前又は後に、前記静水圧を加える処理を行い、
前記流速を、約1μL/分〜約500μL/分とし、
前記細胞密度を、1mLあたり約12000000〜15000000とし、
前記酸素濃度を、約1%〜約20%とする新軟骨構造体の製造方法。 - 請求項38に記載の新軟骨構造体の製造方法において、
0.1〜約0.5Hzにおいて約0.05MPa〜約3MPaの圧力とした周期的な静水圧か、又は大気圧より上で約0〜約3MPaとした一定圧を、約7日〜約28日間に亘り加える新軟骨構造体の製造方法。 - 請求項39に記載の新軟骨構造体の製造方法において、
前記静水圧を加える処理を、約0〜約28日に亘り大気圧に曝す期間の後又は前に行う新軟骨構造体の製造方法。 - 関節軟骨の病変部位上に表層性軟骨層を形成させる表層性軟骨層の形成方法であって、
a)自己由来又は異種の軟骨片を得るステップと、
b)軟骨細胞を分離して培養し新軟骨内で増殖させるステップと、
c)新軟骨構造体を調製するステップと、
d)前記新軟骨構造体を前記病変部位に埋め込むステップと、
e)前記新軟骨構造体上に生体適合性で接着性の頂部シーラントを沈着させるステップと
を有する表層性軟骨層の形成方法。 - 請求項41に記載の表層性軟骨層の形成方法であって、
この方法が更に、前記病変部位の底部に生体適合性で接着性の底部シーラントを沈着させるステップを有し、前記頂部及び前記底部シーラントは、同じものとしても又は異なるものとしてもよい表層性軟骨層の形成方法。 - 請求項42に記載の表層性軟骨層の形成方法であって、
前記新軟骨構造体が支持基質に埋め込まれた新軟骨軟骨細胞を含むようにする表層性軟骨層の形成方法。 - 請求項42に記載の表層性軟骨層の形成方法であって、
前記支持基質を、高分子温度可逆性ゲル化ヒドロゲル、コラーゲンゲル、I型コラーゲン、II型コラーゲン、IV型コラーゲン、ゼラチン、アガロース、プロテオグリカンを含む細胞収縮コラーゲン、グリコサミノグリカンを含む細胞収縮コラーゲン、糖蛋白質を含む細胞収縮コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、成長因子、サイトカイン、エラスチン、ヒアルロン酸、フィブリン、ポリ乳から形成される合成高分子繊維、ポリグリコールから形成される合成高分子繊維、ポリアミノ酸から形成される合成高分子繊維、ポリカプロラクトン、ポリアミノ酸、ポリペプチドゲル、これらの共重合体並びにこれらの組合せからなる群から選択された化合物から調製した2次元又は3次元の構造体とする表層性軟骨層の形成方法。 - 請求項44の表層性軟骨層の形成方法において、
前記基質を、温度可逆性ゲル化ヒドロゲル(TRGH)とし、このTRGHを、約30℃より低い温度で液体ゾル状態とし、前記温度可逆性ヒドロゲル高分子を、約30℃より高い温度で固体のゾル状態とし、前記温度可逆性ゲル化ヒドロゲルを、頂部シーラントの下又は底部及び頂部シーラント間に形成された病変腔内に、軟骨細胞を内部に含む新軟骨構造体として埋め込むか、或いは前記TRGHを、いかなる新軟骨軟骨細胞も用いずに空間保持ゲルとして前記病変腔に埋め込む表層性軟骨層の形成方法。 - 請求項45の表層性軟骨層の形成方法において、
前記新軟骨構造体は、培養して分化させた自己由来若しくは異種の軟骨細胞又は分化して軟骨細胞になりうる細胞を含み、これら軟骨細胞又は細胞が前記支持基質内に組み込まれたものであって、軟骨細胞に対する一定の又は周期的な静水圧の条件と、大気圧若しくは無圧力の条件と、灌流速度条件と、培地組成条件と、温度条件と、細胞密度条件と、酸素濃度条件と、時間条件とを含む本発明のアルゴリズムにより処理されたものとする表層性軟骨層の形成方法。 - 請求項45に記載の表層性軟骨層の形成方法において、
前記頂部又は前記底部のシーラントが、ゼラチン、ポリエチレングリコール及びポリ乳酸若しくはポリグリコリドの共重合体、過ヨウ素酸酸化ゼラチン、4腕のペンタエリスリトールチオール及びポリエチレングリコールジアクリレート、4腕のテトラスクシンイミジルエステル若しくはテトラチオール誘導体化PEG、光重合性ポリエチレングリコール共重合(a−ヒドロキシ酸)ジアクリレートマクロマー、メチル化コラーゲンを加えたスクシンイミジルエステル及びチオールにより誘導体化した4腕のポリエチレングリコール、ヒドロゲル、誘導体化ポリエチレングリコール(PEG)、アルキル化コラーゲンにより架橋した誘導体化ポリエチレングリコール(PEG)、テトラヒドロスクシンイミジル若しくはテトラチオール誘導体化PEG、メチル化コラーゲンで架橋したPEG並びにこれらの組合せからなる群から選択したものであり、これら頂部及び底部シーラントが、同じものであるか又は異なるものである表層性軟骨層の形成方法。 - 請求項47に記載の表層性軟骨層の形成方法において、
前記シーラントを、メチル化コラーゲンで架橋したPEGとする表層性軟骨層の形成方法。 - 請求項48に記載の表層性軟骨層の形成方法において、
前記新軟骨構造体を、管内、生体外又は生体内で調製する表層性軟骨層の形成方法。 - 請求項49に記載の表層性軟骨層の形成方法において、
前記新軟骨構造体を、生体外で調製し本発明のアルゴリズムで処理する表層性軟骨層の形成方法。 - 請求項50に記載の表層性軟骨層の形成方法において、
前記アルゴリズムは、周期的な又は一定の静水圧の条件と、静圧の条件と、流速の条件と、温度の条件と、時間の条件と、細胞密度の条件と、酸素及び二酸化炭素含量の条件とを含む表層性軟骨層の形成方法。 - 請求項51の表層性軟骨層の形成方法において、
前記静水圧を、約0.01〜約1Hzにおいて大気圧より上で約0MPa〜約10MPaの圧力とし、
前記静水圧を加える前記時間を、約90日〜約1日にわたり1日あたり0〜約24時間とし、
約90日〜約1日に亘り1日あたり0〜約24時間の静的大気圧を加える処理の前又は後に、前記静水圧を加える処理を行い、
前記流速を、約1μL/分〜約500μL/分とし、
前記細胞密度を、約3000000〜60000000とし、
前記酸素濃度を、約1%〜約20%とする表層性軟骨層の形成方法。 - 請求項52に記載の表層性軟骨層の形成方法において、
0.1〜約0.5Hzにおいて約0.05MPa〜約3MPaの圧力とした周期的な静水圧か、又は大気圧より上で約0〜約3MPaとした一定圧を、約7日〜約28日間に亘り加える表層性軟骨層の形成方法。 - 請求項53に記載の表層性軟骨層の形成方法において、
前記静水圧を加える処理を、約0〜約28日に亘り大気圧に曝す期間の後又は前に行う表層性軟骨層の形成方法。 - 請求項54に記載の表層性軟骨層の形成方法において、
前記灌流流速を、約50μL/分〜約5μL/分とする表層性軟骨層の形成方法。 - 請求項55に記載の表層性軟骨層の形成方法において、
前記灌流流速を、約5μL/分とする表層性軟骨層の形成方法。 - 請求項56に記載の表層性軟骨層の形成方法において、
前記灌流処理及び加圧処理を、約2%〜約5%の酸素の存在下で行う表層性軟骨層の形成方法。 - 請求項57に記載の表層性軟骨層の形成方法において、
前記新軟骨構造体を、前記2層のシーラント層間の前記病変部位に埋め込む表層性軟骨層の形成方法。 - 請求項58に記載の表層性軟骨層の形成方法において、
前記新軟骨が、前記表層性軟骨層により覆われるようにする表層性軟骨層の形成方法。 - 請求項59に記載の表層性軟骨層の形成方法において、
前記新軟骨と、周囲に元からある軟骨とが、互いに一体化する表層性軟骨層の形成方法。 - 請求項60に記載の表層性軟骨層の形成方法において、
前記新軟骨構造体が、温度可逆性ゲル化ヒドロゲルを有するものとし、当該新軟骨構造体を液体ゾルとして病変部位に埋め込み、この構造体を体温まで暖めて液体ゾルを固体ゲルに転換させるが、このプロセスは、30℃より低い温度まで前記病変部位を冷却することにより逆転可能なプロセスであり、それにより前記ゲルをゾルとして取り除くことができる表層性軟骨層の形成方法。
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