CN1912127B - 一种大肠杆菌表达载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体，以及使用该表达载体在大肠杆菌中稳定、高效表达所需目的蛋白的方法。其中，该表达载体由载体pRSET-A构建而来，所述载体pRSET-A中的氨苄青霉素抗性基因被卡那霉素抗性基因代替。该表达载体可用于高效表达在制备7-氨基头孢霉烷酸时所需的酶而又不产生降低7-氨基头孢霉烷酸产率的β-内酰胺酶。本发明还具体提供了两个表达载体，即基因产物为D-氨基酸氧化酶突变体GHA的表达载体pHS-GHA和基因产物为假单孢菌(Pseudomonas sp.)SE83戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶的表达载体pT7-kan-ACY。

Description

一种大肠杆菌表达载体及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体地说，本发明涉及一种大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体，其不产生β-内酰胺酶，该表达载体可用于高效表达在制备7-氨基头孢霉烷酸时所需的酶。

背景技术

酶法制备7-氨基头孢霉烷酸包括两个步骤：(1)D-氨基酸氧化酶氧化头孢菌素C生成戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸；(2)戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶水解戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸产生7-氨基头孢霉烷酸。目前，上述两种酶的表达载体大多用氨苄青霉素抗性基因作为筛选标记。但其基因产物β-内酰胺酶，除降解氨苄青霉素外，对β-内酰胺类化合物头孢菌素C、戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸和7-氨基头孢霉烷酸均有降解。所以，使用含氨苄青霉素抗性基因的表达载体，其发酵产物因含大量β-内酰胺酶，会大大降低7-氨基头孢霉烷酸的产率。而且，目前上述表达载体在大肠杆菌中的稳定性不高，在发酵过程中容易丢失，从而影响了目的蛋白的表达。

具体而言，目前报导的D-氨基酸氧化酶表达水平较低，约为2,300酶单位每升发酵液(Pollegioni，L.et al.，1997，J.Biotechnol.58，115-123：800酶单位每升发酵液；Molla，G.et al.，1998，Protein Exp.Purif.14，289-294)；目前报导的戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶表达水平也较低，约为129酶单位每升发酵液-2,500酶单位每升发酵液(Ishiye，M.和Niwa，M.，1992，BioChim.Biophys.Acta 1132，233-239；杨蕴刘等，2001，中国专利申请公开号CN 1301813A；许岗和朱敏，2003，中国专利申请公开号CN1428424A)。因而目前酶法制备7-氨基头孢霉烷酸具有成本高、产率低的缺点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种稳定、高效的大肠杆菌表达载体，其不产生β-内酰胺酶。它可用于高效表达在制备7-氨基头孢霉烷酸时所需的酶，从而既能提高酶法制备7-氨基头孢霉烷酸的产率，又能降低其成本。本发明的目的还在于提供一种使用所述表达载体在大肠杆菌中高效表达所需目的蛋白的方法。

为实现上述目的，本发明的一个技术方案提供了一种大肠杆菌表达载体，所述表达载体含有在启动子控制下的目的蛋白基因，其特征在于，所述表达载体由载体pRSET-A构建而来，其中所述载体pRSET-A中的氨苄青霉素抗性基因被卡那霉素抗性基因代替。

在所述技术方案的表达载体中，所述启动子优选为lac启动子，所述表达载体优选含有可表达的hok/sok基因，更优选含有有助于蛋白质转译的核蛋白体结合位点AGAAGGA。所述目的蛋白基因优选为D-氨基酸氧化酶基因，更优选为三角酵母(Trigonopsis variabilis)D-氨基酸氧化酶突变体基因，本发明提供的表达载体进一步优选为pHS-GHA(见图1)，具有序列号1所示的序列。

上面所述hok/sok基因编码hok RNA(靶RNA)和sok RNA(反义RNA)。hok基因产物破坏细胞膜，引起细胞死亡。但sok RNA抑制hok RNA的转译，防止hok基因产物产生。在含有hok/sok基因片段的质粒存在下，大肠杆菌能正常生长；反之，由于hok RNA比sokRNA更稳定，因此，载体一经缺失，缺失载体的大肠杆菌便无法生存(Pecota，D.C.et al.，1997，Appl.Environ.Microbiol.63，1917-1924)。

在本发明的另一个技术方案的表达载体中，所述目的蛋白基因优选为戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶基因，所述戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶基因优选来自假单孢菌(Pseudomonas sp.)SE83，本发明提供的表达载体进一步优选为pT7-kan-ACY(见图2)，具有序列号2所示的序列。

本发明的又一个技术方案提供了一种在大肠杆菌中表达目的蛋白的方法，所述大肠杆菌是由含有所述目的蛋白的基因的表达载体转化的，并且所述目的蛋白基因在启动子控制之下，其特征在于，该表达载体由载体pRSET-A构建而来，其中所述载体pRSET-A中的氨苄青霉素抗性基因被卡那霉素抗性基因代替。其中所述目的蛋白基因优选为D-氨基酸氧化酶基因或戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶基因，所述大肠杆菌优选在含有浓度为50-100微克/毫升的卡那霉素的培养基中培养。

附图说明

图1为表达载体pHS-GHA。

图2为表达载体pT7-kan-ACY。

图3为表达载体pRSET-lac-GI-hok/sok-kan。

图4为来自BL-HS-GHA的D-氨基酸氧化酶GHA对头孢菌素C/戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸降解的HPLC图谱。

图5为来自BL-T7K-GHA的D-氨基酸氧化酶GHA对头孢菌素C/戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸降解的HPLC图谱。

图6为来自BL-T7A-GHA的D-氨基酸氧化酶GHA对头孢菌素C/戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸降解的HPLC图谱。

图7为来自BL-T7K-ACY的假单孢菌SE83戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶对戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸/7-氨基头孢霉烷酸降解的HPLC图谱。

图8为来自BL-T7A-ACY的假单孢菌SE83戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶对戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸/7-氨基头孢霉烷酸降解的HPLC图谱。

具体实施方式

实施例1：表达载体pRSET-kan的构建

根据pRSET-A的序列设计PCR引物，具体为：

上游引物VET-F：5’-CTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAG-3’；

下游引物VET-R：5’-ACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGC-3’。

根据pET28b的序列设计PCR引物，具体为上游引物KAN-F：5’-ATGAGCCATATTCAACGGGAAAC-3’；下游引物KAN-R：5’-TTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATG-3’。

扩增去除氨苄青霉素抗性基因的pRSET-A片段的PCR条件为：50ng pRSET-A(Invitrogen)，0.4μM VET-F，0.4μM VET-R，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，20mM Tris-HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM (NH₄)₂SO₄，2mM MgSO₄，0.1％Triton X-100，2.5U Pfu DNA聚合酶(Promega)，用无菌水调反应体积至50μL。PCR扩增反应程序为：94℃，5分钟；94℃，1分钟，50℃，1分钟，72℃，4分钟，循环35次；72℃，10分钟。

扩增卡那霉素抗性基因的PCR条件为：50ng pET28b(Novagen)，0.4μM KAN-F，0.4μM KAN-R，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，20mM Tris-HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM (NH₄)₂SO₄，2mM MgSO₄，0.1％Triton X-100，2.5U Pfu DNA聚合酶(Promega)，用无菌水调反应体积至50μL。PCR扩增反应程序为：94℃，5分钟；94℃，1分钟，50℃，1分钟，72℃，4分钟，循环35次；72℃，10分钟。

用0.8％琼脂糖电泳提纯PCR产物(去除氨苄青霉素抗性基因的pRSET-A片段的PCR产物长2,036bp；卡那霉素抗性基因的PCR产物长816bp)，连接该两片段得pRSET-kan。将pRSET-kan转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(Novagen)，在卡那霉素(50μg/mL)LB(1％氯化钠，1％蛋白胨，0.5％酵母浸膏)平板上于37℃培养过夜。按照Molecular Cloning-A Laboratory Manual(Sambrook，J.et al.，1989，CSHL Press)描述的方法提取质粒。

实施例2：载体pRSET-lac-kan的构建

根据pGEMT-Easy(Promega)的序列设计PCR引物，具体为：上游引物RBS-NdeI：5’-CATATGTATATCTGTGTGAAATTG-3’(NdeI酶切位点以下划线表示，外加的核蛋白体结合位点以下间虚线表示)；下游引物RBS-AlwNI：5’-CAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTC-3’(AlwNI酶切位点以下划线表示)。

以pGEMT-Easy(Promega)为模板，用上述引物进行PCR，扩增得到一755bp产物。PCR条件为：50ng pGEMT-Easy(Promega)，0.4μMRBS-NdeI，0.4μM RBS-AlwNI，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，20mM Tris-HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM (NH₄)₂SO₄，2mM MgSO₄，0.1％Triton X-100，2.5U Pfu DNA聚合酶(Promega)，用无菌水调反应体积至50μL。PCR扩增反应程序为：94℃，5分钟；94℃，1分钟，50℃，1分钟，72℃，4分钟，循环35次；72℃，10分钟。

该PCR产物(755bp)在5’端含有NdeI酶切位点和核蛋白体结合位点及在3’端含有AlwNI酶切位点。用0.8％琼脂糖电泳提纯，NdeI和AlwNI酶切后，与经NdeI和AlwNI酶切的pRSETA(Invitrogen)连接，得pRSET-lac。将pRSET-lac转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(Novagen)，在氨苄青霉素(100μg/mL)LB(1％氯化钠，1％蛋白胨，0.5％酵母浸膏)平板上于37℃培养过夜。按照MolecularCloning-A Laboratory Manual(Sambrook，J.et al.，1989，CSHLPress)描述的方法提取质粒。

用AlwNI和EcoRI酶切pRSET-lac和pRSET-kan，用0.8％琼脂糖电泳提纯各DNA片段并连接，得pRSET-lac-kan。将pRSET-lac-kan转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(Novagen)，在卡那霉素(50μg/mL)LB琼脂平板上于37℃培养过夜。按照Molecular Cloning-A LaboratoryManual(Sambrook，J.et al.，1989，CSHL Press)描述的方法提取质粒。

实施例3：载体pGEMT-Easy-GI的构建

根据已知的Thermoanaerobacterium saccharolyticum glucoseisomerase DNA序列(GenBank L09699)，设计PCR引物，具体为：上游引物(GI-NdeI)：

5’-CATATGAATAAATATTTTGAGAACGTATCTAAAATA-3’(NdeI酶切位点以下划线表示)；

下游引物(GI-EcoRI)：5’-GATATCTTAATTATTCTGCAAAC-3’(EcoRI酶切位点以下划线表示，AscI酶切位点以双下划线表示)。

以Thermoanaerobacterium saccharolyticum(购自ATCC，USA)DNA为模板，用上述引物进行PCR，扩增得到一1,336bp产物。PCR条件为：50ng T.saccharolyticum DNA，0.4μM GI-NdeI，0.4μM GI-EcoRI，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，20mM Tris-HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM (NH₄)₂SO₄，2mM MgSO₄，0.1％Triton X-100，2.5U Platinum Taq High Fidelity DNA聚合酶(Invitrogen)，用无菌水调反应体积至50μL。PCR扩增反应程序为：95℃，5分钟；94℃，1分钟，50℃，1分钟，72℃，3分钟，循环35次；72℃，10分钟。

该PCR产物(1,336bp)在5’和3’端分别含有NdeI和EcoRI酶切位点。PCR产物经0.8％琼脂糖电泳提纯，利用TA克隆方法，与pGEMT-Easy(Promega)连接，得pGEMT-Easy-GI。将pGEMT-Easy-GI转化感受态大肠杆菌DH5α(Invitrogen)，在氨苄青霉素(100μg/mL)LB琼脂平板上于37℃培养过夜。按照Molecular Cloning-A LaboratoryManual(Sambrook，J.et al.，1989，CSHL Press)描述的方法提取质粒。

实施例4：载体pRSET-lac-GI-hok/sok-kan(见图3)的构建

用NdeI和EcoRI酶切pGEMT-Easy-GI，经0.8％琼脂糖电泳提纯，与经NdeI和EcoRI酶切的pRSET-lac-kan连接，得pRSET-lac-GI-kan。将pRSET-lac-GI-kan转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(Novagen)，在卡那霉素(50μg/mL)LB琼脂平板上于37℃培养过夜。按照MolecularCloning-A Laboratory Manual(Sambrook，J.et al.，1989，CSHLPress)描述的方法提取质粒。

根据已知hok/sok基因片段序列(GenBank X05813)设计10条引物(见表1)。PCR基因构造根据Kikuchi，M.et al.，1999，Gene236：159-167所述，唯具体步骤有变更。PCR条件为：20ng各个引物，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，20mM Tris-HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM (NH₄)₂SO₄，2mM MgSO₄，0.1％Triton X-100，2.5U Pfu DNA聚合酶(Promega)，用无菌水调反应体积至50μL。

PCR扩增反应程序为：95℃，4分钟；94℃，1.5分钟；50℃，1.5分钟；72℃，5分钟；循环30次；72℃，10分钟，得一PCR产物长580bp，在其5’和3’端分别含有AscI及EcoRI酶切位点。PCR产物经0.8％琼脂糖电泳提纯，AscI及EcoRI酶切后，与经AscI及EcoRI酶切的pRSET-lac-GI-kan连接，得pRSET-lac-GI-hok/sok-kan。将pRSET-lac-GI-hok/sok-kan转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(Novagen)，在卡那霉素(50μg/mL)LB琼脂平板上于37℃培养过夜。按照Molecular Cloning-A Laboratory Manual(Sambrook，J.et al.，1989，CSHL Press)描述的方法提取质粒，测定其DNA序列如序列3所示。其中数个核苷酸有变异：1368(C->G)；1513(缺失了T)；1804(A->T)；1826(C->T)；2479(G->T)；2555(T->A)；3860(C->T)。

表1

序号	引物序列
		1	5’-ttggcgcgccttaagatatcaacaaactccgggaggcagcgtgatgcggcaacaatcacacggatttcccgtgaa-3’
2	5’-catatacctgcacgctgaccacactcactttccctgaaaataatccgctcattcagaccgttcacgggaaatccgtgtga-3’
		3	5’-ggtcagcgtgcaggtatatgggctatgatgtgcccggcgcttgaggctttctgcctcatgacgtgaaggtggtttgttgc-3’
4	5’-cgtggtggttaatgaaaattaacttactacggggctatcttctttctgccacacaacacggcaacaaaccaccttcacgt-3’
		5	5’-aattttcattaaccaccacgaggcatccctatgtctagtccacatcaggatagcctcttaccgcgctttgcgcaaggaga-3’
6	5’-tgagacacacgatcaacacacaccagacaagggaacttcgtggtagtttcatggccttcttctccttgcgcaaagcgcgg-3’
		7	5’-tgtgttgatcgtgtgtctcacactgttgatattcacttat

	ctgacacgaaaatcgctgtgcgagattcgttacagagacg-3’
		8	5’-cgcctccaggttgctacttaccggattcgtaagccatgaaagccgccacctccctgtgtccgtctctgtaacgaatctcg-3’
9	5’-taagtagcaacctggaggcgggcgcaggcccgccttttcaggactgatgctggtctgactactgaagcgcctttataaag-3’
		10	5’-cggaattcacaacatcagcaaggagaaaggggctaccggcgaaccagcagcccctttataaaggcgcttcagt-3’

实施例5：含有D-氨基酸氧化酶基因重组质粒pRSET-A-DAO的构建

根据已知三角酵母D-氨基酸氧化酶基因5’和3’端序列(Gonzalez，F.J.，Montes，J.，Martin，F.，Lopez，M.C.，Ferminan，E.，Catalan，J.，Galan，M.A.Dominguez，A.Molecular cloningof TvDAO1，a gene encoding a D-amino acid oxidase fromTrigonopsis variabilis and its expression in Saccharomycescerevisiae and Kluyveromyces lactis.Yeast 13：1399-1408；1997)设计引物如下：

5’-NdeI(引入NdeI酶切位点)：

5’-TAGGGCTGACATATGGCTAAAATCGTTGTTATTGGTGC-3’；

3’-BglII(引入BglII酶切位点)：

5’-TAGGGCTGAAGATCTCTAAAGGTTTGGACGAGTAAGAGC-3’。

以质粒pJL(杨藴刘等，中国专利申请公开号：CN 1371999A)为模板，用以上两个引物，在Pfu DNA聚合酶(Promega)的作用下，合成三角酵母D-氨基酸氧化酶基因。pJL携带有三角酵母FA10 D-氨基酸氧化酶基因(Li，W.et al.，Acta Microbiologica Sinica31：251-253，1991)。PCR反应条件为：40ng pJL，0.4μM 5’-NdeI，0.4μM 3’-BglII，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，20mM Tris-HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM (NH₄)₂SO₄，2mM MgSO₄，0.1％Triton X-100，2.5U Pfu DNA聚合酶，用无菌水调反应体积至50μl。PCR扩增反应程序为：94℃，5分钟；94℃，1分钟，50℃，1分钟，72℃，2分钟，循环10次；94℃，1分钟，60℃，1分钟，72℃，2分钟，循环25次；72℃，10分钟。

得1,098bp长PCR产物，其5’和3’端分别具有NdeI和BglII限制性酶切位点。PCR产物经1％琼脂糖电泳提纯，NdeI及BglII酶切后，与经NdeI及BglII酶切质粒pRSET-A(Invitrogen)得到的2.9Kb的片段连接，得连接产物pRSET-A-DAO。将pRSET-A-DAO转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(Novagen)，在氨苄青霉素LB平板上37℃培养，按照Molecular Cloning-A Laboratory Manual，ed.By J.Sambrook，et.al.，1989，CSHL Press)描述的方法提取质粒，经DNA测序，确定三角酵母D-氨基酸氧化酶基因核苷酸序列如序列号4所示。

实施例6：含有D-氨基酸氧化酶突变体GHA的表达载体的构建

D-氨基酸氧化酶突变体GHA由定点突变构建。定点突变技术主要参考PCR Protocols(编者：John M.S.Bartlett and DavidStirling.Totowa，N.J.：Humana Press，2003.)一书的描述。

根据实施例5克隆的三角酵母D-氨基酸氧化酶基因之序列(序列号4)，设计引物如下：

引物A：5’-TAGGGCTGACATATGGCTAAAATCGTTGTTATTG-3’；

引物B：5’-TAGGGCTGAAGATCTCTAAAGGTTTGGACGAG-3’；

引物C1：5’-GCAGGTGCCAACTGGCTCCCGTTTTACGATGGAGGCAAG-3’；

引物D：5’-GAGCCAGTTGGCACCTGCCCAAGG-3’。

引物A和B是一对外引物。引物A包含NdeI酶切位点，并有部份碱基与D-氨基酸氧化酶基因5’端序列交迭；引物B包含BglII酶切位点，并有部份碱基与D-氨基酸氧化酶基因3’端序列交迭。引物C1和D是内引物。引物C1将亲本D-氨基酸氧化酶基因53位之苏氨酸转变成脯氨酸。引物D部分碱基与引物C1的序列交迭。

利用聚合酶链式反应，以pRSET-A-DAO为模板，用引物对A和D扩增模板片段1；用引物对B和C1扩增模板片段2。扩增反应条件为：20ng pRSET-A-DAO，20mM Tris-HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM (NH₄)₂SO₄，2mM MgSO₄，0.1％Triton X-100，0.4μM引物A和0.4μM引物D(扩增模板片段1)或0.4μM引物B和0.4μM引物C1(扩增模板片段2)，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，1.5U Pfu DNA聚合酶，用无菌水调反应体积至50μl。聚合酶链式反应扩增程序为：94℃，2分钟；94℃，1分钟，53℃，1分钟，72℃，1分钟，循环30次；72℃，10分钟。

扩增得到的模板片段1和模板片段2，经1％琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，用以扩增全长基因。扩增全长基因的反应条件为：20ng模板片段1，20ng模板片段2，20mM Tris-HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM (NH₄)₂SO₄，2mM MgSO₄，0.1％Triton X-100，0.4μM引物A和0.4μM引物B，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，1.5U Pfu DNA聚合酶，用无菌水调反应体积至50μl。聚合酶链式反应扩增程序为：94℃，2分钟；94℃，1分钟，53℃，1分钟，72℃，2分钟，循环35次；72℃，10分钟。

全长扩增反应得到D-氨基酸氧化酶突变体GHA基因，经NdeI及BglII酶切后连接到pRSET-kan得连接产物pRSET-kan-DAOGHA，将pRSET-kan-DAOGHA转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，卡那霉素LB平板37℃培养，提取质粒，经DNA测序确定引入的突变无误，确定D-氨基酸氧化酶突变体GHA核苷酸序列如序列号5所示。

实施例7：载体pHS-GHA(见图1)的构建

用NdeI和BglII酶切质粒pRSET-kan-DAOGHA，得一1,074bp基因片段(内含D-氨基酸氧化酶突变体GHA基因)，经0.8％琼脂糖电泳提纯，与经NdeI和BglII酶切的pRSET-lac-GI-hok/sok-kan得到的长片断连接，得pHS-GHA。将pHS-GHA转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(Novagen)，得菌株BL-HS-GHA，在卡那霉素(50μg/mL)LB琼脂平板上于37℃培养过夜。按照Molecular Cloning-ALaboratory Manual(Sambrook，J.et al.，1989，CSHL Press)描述的方法提取质粒，测定其DNA序列如序列号1所示。其中数个核苷酸有变异：1390(C->G)；1535(缺失了T)；1826(A->T)；1848(C->T)；2501(G->T)；2577(T->A)；3882(C->T)。

实施例8：载体pT7-kan-GHA的构建

用NdeI和BglII酶切质粒pRSET-kan-DAOGHA得一1,074bp基因片段(内含D-氨基酸氧化酶突变体GHA基因)，经0.8％琼脂糖电泳提纯，与经NdeI和BglII酶切的pRSET-kan连接，得pT7-kan-GHA。将pT7-kan-GHA转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(Novagen)，得菌株BL-T7K-GHA，在卡那霉素(50μg/mL)LB琼脂平板上于37℃培养过夜。

实施例9：载体pT7-amp-GHA的构建

用NdeI和BglII酶切质粒pRSET-kan-DAOGHA。得一1,074bp基因片段(内含D-氨基酸氧化酶突变体GHA基因)，经0.8％琼脂糖电泳提纯，与经NdeI和BglII酶切的pRSET-A连接，得pT7-amp-GHA。将pT7-amp-GHA转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(Novagen)，得菌株BL-T7A-GHA，在氨苄青霉素(100μg/mL)LB琼脂平板上于37℃培养过夜。

实施例10：载体pT7-kan-ACY(见图2)的构建

根据已知的假单孢菌SE83戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶DNA序列(Matsuda，A.et al.，1987，J.Bacteriol.169，5821-5826)，设计PCR引物如下：

上游引物(NdeI-ACY)：5’-CATATGAACGCTCCCGTCCCCGTCCC-3’，NdeI酶切位点以下划线表示；

下游引物(Bgl II-ACY)：5’-AGATCTTCAGATGGTGAAGCGGGCAC-3’，BglII酶切位点以下划线表示。

以假单孢菌SE83DNA为模板，用上述引物进行PCR，扩增得到一1,676bp产物。PCR条件为：50ng假单孢菌SE83DNA，0.4μMNdeI-ACY，0.4μM BglII-ACY，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，20mM Tris-HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM (NH₄)₂SO₄，2mM MgSO₄，0.1％Triton X-100，2.5U Pfu DNA聚合酶(Promega)，用无菌水调反应体积至50μL。

PCR扩增反应程序为：95℃，5分钟；94℃，1分钟，50℃，1分钟，72℃，3分钟，循环35次；72℃，10分钟。

该PCR产物(1,676bp)在5’和3’端分别含有NdeI和BglII酶切位点。PCR产物经0.8％琼脂糖电泳提纯，NdeI和BglII酶切后，与经NdeI和BglII酶切的pRSET-kan连接，得pT7-kan-ACY。将pT7-kan-ACY转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(Novagen)，得菌株BL-T7K-ACY，在卡那霉素(50μg/mL)LB琼脂平板上于37℃培养过夜。按照Molecular Cloning-A Laboratory Manual(Sambrook，J.et al.，1989，CSHL Press)描述的方法提取质粒，测定其DNA序列如序列号2所示。其中四个核苷酸有变异：2260(G->T)；2336(T->A)；3641(C->T)；4117(G->C。

实施例11：载体pT7-amp-ACY的构建

根据实施例10扩增含假单孢菌SE83戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶基因的PCR产物，PCR产物经0.8％琼脂糖电泳提纯，NdeI和BglII酶切后，与经NdeI和BglII酶切的pRSET-A连接，得pT7-amp-ACY。将pT7-amp-ACY转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(Novagen)，得菌株BL-T7A-ACY，在氨苄青霉素(100μg/mL)LB琼脂平板上于37℃培养过夜。

实施例12：载体pHS-GHA稳定性的检测

从卡那霉素(50μg/mL)LB琼脂平板上挑取BL-HS-GHA(见实施例7)单菌落，接种到5mL含卡那霉素(50μg/mL)的液体LB培养基，在37℃培养12小时(摇床转速为200转每分钟)。取500μL接种至50mL玉米浆培养基，在35℃培养24小时(摇床转速为200转每分钟)。

玉米浆1的制备：

将300g玉米浆(购自华北制药康欣有限公司)溶于300mL蒸馏水，搅拌后离心(5,000g，8分钟)，上清液即为玉米浆1。沉淀物留用。

玉米浆2的制备：

将上述沉淀物再溶于600mL蒸馏水，搅拌后离心(5,000g，8分钟)，上清液即为玉米浆2。

50mL玉米浆培养基中各成分如下：

玉米浆                    14mL

玉米浆                    24mL

酵母浸膏                  0.2g

硫酸铵                    0.075g

磷酸氢二钠                0.25g

磷酸二氢钾                0.04g

氯化钠                    0.075g

将各成分溶于50mL蒸馏水，以10N氢氧化钠调pH值至7.15，高温消毒，加入0.0025g卡那霉素。

在24小时抽取样本，经稀释108倍后，将试样涂布在LB琼脂平板上，37℃培养过夜。用消毒木牙签把单菌落复印在LB琼脂平板和含卡那霉素(50μg/mL)LB琼脂平板上，37℃培养过夜，点算在各平板上的单菌落数目，见表2。

实施例13：载体pT7-kan-GHA稳定性的检测

从卡那霉素(50μg/mL)LB琼脂平板上挑取BL-T7K-GHA(见实施例8)单菌落，接种到5mL含卡那霉素(50μg/mL)的液体LB培养基，在37℃培养12小时(摇床转速为200转每分钟)。取500μL接种至50mL玉米浆种子培养基，在35℃培养24小时(摇床转速为200转每分钟)。

玉米浆1的制备：

将300g玉米浆(购自华北制药康欣有限公司)溶于300mL蒸馏水，搅拌后离心(5,000g，8分钟)，上清液即为玉米浆1。沉淀物留用。

玉米浆2的制备：

将上述沉淀物再溶于600mL蒸馏水，搅拌后离心(5,000g，8分钟)，上清液即为玉米浆2。

50mL玉米浆培养基中各成分如下：

玉米浆1                   4mL

玉米浆2                   4mL

酵母浸膏                  0.2g

硫酸铵                    0.075g

磷酸氢二钠                0.25g

磷酸二氢钾                0.04g

氯化钠                    0.075g

将各成分溶于50mL蒸馏水，以10N氢氧化钠调pH值至7.15，高温消毒，加入0.0025g卡那霉素。

在24小时抽取样本，经稀释108倍后，将试样涂布在LB琼脂平板上，37℃培养过夜。用消毒木牙签把单菌落复印在LB琼脂平板和含卡那霉素(50μg/mL)LB琼脂平板上，37℃培养过夜，点算在各平板上的单菌落数目，见表2。

实施例14：载体pT7-amp-GHA稳定性的检测

从氨苄青霉素(100μg/mL)LB琼脂平板上挑取BL-T7A-GHA(见实施例9)单菌落，接种到5mL含氨苄青霉素(100μg/mL)的液体LB培养基，在37℃培养12小时(摇床转速为200转每分钟)。取500μL接种至50mL玉米浆培养基，在35℃培养24小时(摇床转速为200转每分钟)。

50mL玉米浆培养基中各成分如下：

玉米浆1                    4mL

玉米浆2                    4mL

酵母浸膏                   0.2g

硫酸铵                     0.075g

磷酸氢二钠                 0.25g

磷酸二氢钾                 0.04g

氯化钠                    0.075g

将各成分溶于50mL蒸馏水，以10N氢氧化钠调pH值至7.15，高温消毒，加入0.0025g氨苄青霉素。

在24小时抽取样本，经稀释108倍后，将试样涂布在LB琼脂平板上，37℃培养过夜。用消毒木牙签把单菌落复印在LB琼脂平板和含氨苄青氨素(100μg/mL)LB琼脂平板上，37℃培养过夜，点算在各平板上的单菌落数目，见表2。

如表2所示，含卡那霉素抗性基因的载体(pHS-GHA和pT7-kan-GHA)比含氨苄青霉素抗性基因的载体(pT7-amp-GHA)有较高的稳定性。在24小时后，菌株BL-T7A-GHA内的载体(pT7-amp-GHA)几乎全部缺失。这可能和该两种抗性基因的不同抗性机理有关：氨苄青霉素抗性基因的基因产物β-内酰胺酶，可分泌到胞质间间隙(细胞膜和细胞壁之间的空间)，水解培养液中的氨苄青霉素。因此培养液中氨苄青霉素浓度迅速下降。氨苄青霉素选择压力的消失导致含氨苄青霉素抗性基因载体的大肠杆菌在培养液中逐渐消失。卡那霉素抗性基因的基因产物氨基糖苷磷酸转移酶，则并不破坏选择压力。同时，含hok/sok基因片段的pHS-GHA更进一步提高该载体在大肠杆菌中的稳定性，高达85.59％的大肠杆菌含有该表达载体。

表2：D-氨基酸氧化酶表达载体之稳定性检测。

菌株	含表达载体	LB琼脂平板	含卡那霉素/氨苄青霉素琼脂平板	百分比
					BL-HS-GHA	pHS-GHA	576	493	85.59
BL-T7K-GHA	pT7-kan-GHA	576	5	0.87
					BL-T7A-GHA	pT7-amp-GHA	576	1	0.17

实施例15：BL-T7K-ACY的发酵

从卡那霉素(50μg/mL)LB琼脂平板上挑取BL-T7K-ACY(见实施例10)单菌落，接种到5mL含卡那霉素(50μg/mL)的液体LB培养基，在37℃培养12小时(摇床转速为200转每分钟)。取500μL接种至50mL培养基，在30℃培养24小时(摇床转速为200转每分钟)。

50mL培养基中各成分如下：

酵母浸膏                        0.35g

磷酸氢二纳                      0.35g

磷酸二氢钾                      0.35g

磷酸氢二钾                      0.48g

硫酸铵                          0.06g

氯化铵                          0.01g

甘油                            0.5mL

氯化钙                          0.00055g

将各成分溶于50mL蒸馏水，高温消毒。加入0.0025g卡那霉素。

实施例16：BL-T7A-ACY的发酵

从氨苄青霉素(100μg/mL)LB琼脂平板上挑取BL-T7A-ACY(见实施例11)单菌落，接种到5mL含氨苄青霉素(100μg/mL)的液体LB培养基，在37℃培养12小时(摇床转速为200转每分钟)。取500μL接种至50mL培养基，在30℃培养24小时(摇床转速为200转每分钟)。

50mL培养基中各成分如下：

酵母浸膏                  0.35g

磷酸氢二纳                0.35g

磷酸二氢钾                0.35g

磷酸氢二钾                0.48g

硫酸铵                    0.06g

氯化铵                    0.01g

甘油                    0.5mL

氯化钙                  0.00055g

将各成分溶于50mL蒸馏水，高温消毒。加入0.0025g氨苄青霉素。

实施例17：D-氨基酸氧化酶突变体GHA及假单孢菌SE83戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶的粗酶提取

按实施例12-16发酵后，取50mL发酵液，在4℃经离心机分离(8,000g，8分钟)。收集细菌，弃上清液，将细菌重悬于磷酸钠缓冲液：将BL-HS-GHA，BL-T7K-GHA和BL-T7A-GHA重悬于50mL磷酸钠缓冲液(50mM，pH 7.5)；将BL-T7K-ACY和BL-T7A-ACY重悬于10mL磷酸钠缓冲液(50mM，pH8)。用冻融法裂解细菌：用液态氮冷冻细菌重悬液至固体状，转到50℃暖水浴溶化，如此重复4次，此为粗酶提取液。

实施例18：比较BL-HS-GHA，BL-T7K-GHA和BL-T7A-GHA的D-氨基酸氧化酶突变体GHA对头孢菌素C/戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸的降解

检测基本参照Isogai，T.et al.，1990，J.Biochem.[Tokyo]108，1063-1069所述，只是具体步骤有变更。取2mL按实施例17提取的D-氨基酸氧化酶突变体GHA与相同体积的150mM头孢菌素C钠盐混合，在37℃下反应，反应中保持搅拌(搅拌速度为450转每分钟)，并用5N氢氧化钠将pH值保持在7.5。在不同时间(0、15、30、45、60分钟，见图4、5和6)抽取20μL样本，与2μL 3％过氧化氢混匀。将反应液离心(10,000g，10秒钟)，取10μL上清液和990μL HPLC流动相(50mM磷酸钾，pH 7；5％乙腈)混合，上HPLC柱检测。

HPLC色谱柱：Diamonsil^TM C18，250×4.6mm(迪马公司，北京)

柱温度：30℃

流速：1mL每分钟

检测：260nm

比较图4、5和6，BL-HS-GHA，BL-T7K-GHA的D-氨基酸氧化酶突变体GHA并没有降解头孢菌素C/戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸；反之，由BL-T7A-GHA的D-氨基酸氧化酶突变体GHA严重降解头孢菌素C/戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸，大大降低戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸的生成。

实施例19：比较BL-T7K-ACY和BL-T7A-ACY的假单孢菌SE83戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶对戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸/7-氨基头孢霉烷酸的降解

检测基本参照Binder，R.et al.，1994，Appl.Environ.Microbiol.60，1805-1809所述的方法，只是具体步骤有变更。取10mL按实施例17提取的假单孢菌SE83戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶与相同体积的150mM戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸(制备方法参见Shibuya，Y.et al.，1981，Agric.Biol.Chem.45，1561-1567)混合，在37℃下反应，反应中保持搅拌(搅拌速度为450转每分钟)，并用5N氢氧化钠将pH值保持在8。在不同时间(0、15、30、45、60分钟，见图7和8)抽取20μL样本，离心(10,000g，10秒钟)，取10μL上清液和990μL HPLC流动相(50mM磷酸钾，pH 7；5％乙腈)混合，上HPLC柱检测。其他HPLC条件和实施例18相同。

比较图7和8，BL-T7K-ACY的假单孢菌SE83戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶并没有降解戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸/7-氨基头孢霉烷酸(60分钟样本，生成的7-氨基头孢霉烷酸为0.178mg/mL)；反之，BL-T7A-ACY的假单孢菌SE83戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶则对戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸/7-氨基头孢霉烷酸有降解作用(60分钟样本，生成的7-氨基头孢霉烷酸为0.145mg/mL)，令7-氨基头孢霉烷酸的生成减少约19％。

本发明不受上述具体文字描述的限制。本发明可在权利要求书所概括的范围内做各种改变，这些改变均在本发明的范围之内。

                      序列表

<110>百瑞全球有限公司

<120>一种大肠杆菌表达载体及其应用

<130>FI-050350-59

<160>5

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>4723

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>表达载体pHS-GHA

<400>1

catatggcta aaatcgttgt tattggtgcc ggtgttgccg gtttaactac agctcttcaa     60

cttcttcgta aaggacatga ggttacaatt gtgtccgagt ttacgcccgg tgatcttagt    120

atcggatata cctcgccttg ggcaggtgcc aactggctcc cgttttacga tggaggcaag    180

ttagccgact acgatgccgt ctcttatcct atcttgcgag agctggctcg aagcagcccc    240

gaggctggaa ttcgactcat caaccaacgc tcccatgttc tcaagcgtga tcttcctaaa    300

ctggaaggtg ccatgtcggc catctgtcaa cgcaacccct ggttcaaaaa cacagtcgat    360

tctttcgaga ttatcgagga caggtccagg attgtccacg atgatgtggc ttatctagtc    420

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ttatcgctcg gcgccacggt ggttaaacgt cgagtgaacc atatcaagga tgccaatttt    540

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ttcttgggag gcgtcgagga caagaagatg taccctattc gaggacaagt cgtccttgtt    660

cgaaactctc ttccttttat ggcctccttt tccagcactc ctgaaaaaga aaatgaagac    720

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aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg  3840

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ggaattgtga gcggataaca atttcacaca agaaggagat ata                      4723

<210>2

<211>4414

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>表达载体pT7-kan-ACY

<400>2

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gcgagcggct cgcgcggcat ggtcgtcacc aaccacccgc tcgcctcggc agccggcgcg    120

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acggtggccg agccgatgat ggtcggcatc ctcggcgggg gcctgagcca tatccggctc    240

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ctcgcccgct tcggcacgct gccgctcgcc gaggttctcc agccggcgat cgggctggcg    480

gagcgcggct tcgtggtcac gccctatctc tcgaactgca tcaccgacaa cgcgggcgat    540

ctcgcccgcg accccggcct cgcggcgatg ctgctgccgg gcggaaagcc gctccagccg    600

ggcatgcggc tcgtccagtc cgactatgcc gcgagcctca aactgatcgc ggctgagggg    660

ccggacgcgc tctatggcgg caagctcggc cgggcgctga ccgattacat ggcggccaat    720

ggcggcctga tcgatcaggc cgacctcgcc aattaccgca tcgaactgcg cgagccgatt    780

cgcggctcct atcgcggcta cgagatcatc ggcccgccgc cgccctcgtc atcgggcgtg    840

catatcacgc agatgctcaa cattctcgaa ggctatgata tcggctcgct cggcttcggc    900

tcgacggacg ctgtgcatct gctcgccgaa gccctgaaga tcgccttcgc cgaccgcgcc    960

gtggcgacag ccgatccggc cttcgtcaag gttccggtcg cgcgattgat cgacaaggcc   1020

tatgccgacg agcgccgcgc gctcattgag atggagcagg cgaagagctg gacggccggg   1080

ctctctggcg gcgaatccgc cgacaccact catgtcaccg tcgctgacgc catggggaat   1140

gtcgtcagcg cgacgcagac gatcaacggg ctgttcggcg cctgcgtgca gattccgggc   1200

accggcatga tcgccaacaa ctacatgtac aacttcgatc cgcatcccgg ccgggcgctc   1260

tcgatcgcgc cgggaaagag ggtcttcacc tcgatggcgc cgatgatggc gttgaaggag   1320

ggacggatcg cctttgcgct cggcttgcct ggcgcgctcc gcatcttccc ctcggcgctg  1380

caggcgatcg tcaacctgat cgaccaccgc atgagcctgc aggaggcggt cgaggcgcca  1440

cgcgtctgga cggagggcgg cgtgctcgaa ctcgaggaag cgatccccga ggccgtggca  1500

caagcgctga tcgcgcgcgg ccataaggtg gtgcgctcgc cccgcgtggc cggtggcatg  1560

aacgccatcg ccttcaatcc ggacggtacc ttgaccggtg ccgcctgctg gcgcgccgac  1620

ggcacacccg tcgccatctc cggcgggctc gcccgtgccg gtgcccgctt caccatctga  1680

agatctgcag ctggtaccat ggaattcgaa gcttgatccg gctgctaaca aagcccgaaa  1740

ggaagctgag ttggctgctg ccaccgctga gcaataacta gcataacccc ttggggcctc  1800

taaacgggtc ttgaggggtt ttttgctgaa aggaggaact atatccggat ctggcgtaat  1860

agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg  1920

gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc  1980

gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc  2040

acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt  2100

agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg  2160

ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt  2220

ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta  2280

taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt  2340

aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgctt acaatttagg tggcactttt cggggaaatg  2400

tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga  2460

gacaataacc ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg agtcatattc  2520

aacgggaaac gtcttgctct aggccgcgat taaattccaa catggatgct gatttatatg  2580

ggtataaatg ggctcgcgat aatgtcgggc aatcaggtgc gacaatctat cgattgtatg  2640

ggaagcccga tgcgccagag ttgtttctga aacatggcaa aggtagcgtt gccaatgatg  2700

ttacagatga gatggtcaga ctaaactggc tgacggaatt tatgcctctt ccgaccatca  2760

agcattttat ccgtactcct gatgatgcat ggttactcac cactgcgatc cccgggaaaa  2820

cagcattcca ggtattagaa gaatatcctg attcaggtga aaatattgtt gatgcgctgg  2880

cagtgttcct gcgccggttg cattcgattc ctgtttgtaa ttgtcctttt aacagcgatc  2940

gcgtatttcg tctcgctcag gcgcaatcac gaatgaataa cggtttggtt gatgcgagtg  3000

attttgatga cgagcgtaat ggctggcctg ttgaacaagt ctggaaagaa atgcataaac  3060

ttttgccatt ctcaccggat tcagtcgtca ctcatggtga tttctcactt gataacctta    3120

tttttgacga ggggaaatta ataggttgta ttgatgttgg acgagtcgga atcgcagacc    3180

gataccagga tcttgccatc ctatggaact gcctcggtga gttttctcct tcattacaga    3240

aacggctttt tcaaaaatat ggtattgata atcctgatat gaataaattg cagtttcatt    3300

tgatgctcga tgagtttttc taactgtcag accaagttta ctcatatata ctttagattg    3360

atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca    3420

tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga    3480

tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa    3540

aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga    3600

aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt tcttctagtg tagccgtagt    3660

taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt    3720

taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat    3780

agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct    3840

tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca    3900

cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag    3960

agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc    4020

gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga    4080

aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca    4140

tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag    4200

ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg    4260

aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagga    4320

tctcgatccc gcgaaattaa tacgactcac tatagggaga ccacaacggt ttccctctag    4380

aaataatttt gtttaacttt aagaaggaga tata                                4414

<210>3

<211>4701

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>载体pRSET-lac-GI-hok/sok-kan

<400>3

catatgaata aatattttga gaacgtatct aaaataaaat atgaaggacc aaaatcaaat    60

aatccttatt cctttaaatt ttacaatcca gaggaagtaa tcgatggcaa gacgatggag     120

gagcatctcc gcttttctat agcttattgg cacactttta ctgctgatgg aacagatcaa     180

tttggcaagg ctactatgca aagaccatgg aaccactaca cagatcctat ggatatagcg     240

aaagcaaggg tagaagcagc atttgagttt tttgataaga taaatgcacc tttcttctgc     300

ttccatgata gggatattgc ccctgaagga gatactctta gagagacaaa caaaaactta     360

gatacaatag ttgctatgat aaaggattac ttaaagacca gcaagacaaa agttttgttt     420

ggtaccgcaa atcttttctc caatccgaga tttgtacatg gtgcatcaac atcctgcaat     480

gctgacgttt ttgcatattc tgcagcgcaa gtcaaaaaag cccttgagat tactaaggag     540

cttggcccgg aaaactacgt attttggggt ggaagagaag ggtacgagac gcttctcaat     600

acagatatgg agttagagct tgataacttt gcaagatttt tgcacatggc tgttgactat     660

gcaaaggaaa tcggctttga aggtcagttc ttgattgagc cgaagccaaa ggagcctaca     720

aaacatcaat acgactttga cgtggcaaat gtattggcat tcttgagaaa atacgacctt     780

gacaaatatt tcaaagtaaa tatcgaagca aaccatgcga cattggcatt ccacgacttc     840

caacatgagc taagatacgc cagaataaac ggtgtattag gatcaattga cgcaaatcaa     900

ggcgacatgc ttttgggatg ggatacggac cagttcccta cagatatacg catgacaacg     960

cttgctatgt atgaagtcat aaagatgggt ggatttgaca aaggtggcct taactttgat    1020

gcaaaagtaa gacgtgcttc atttgagcca gaagatcttt tcttaggtca catagcagga    1080

atggatgctt ttgcaaaagg ctttaaagtt gcttacaagc ttgtgaaaga tggcgtattt    1140

gacaagttca tcgaagaaag atacgcaagc tacaaagaag gcattggcgc tgatattgta    1200

agcggtaaag ctgacttcaa gagccttgaa aagtatgcat tagagcacag ccagattgta    1260

aacaaatcag gcagacaaga gctattagaa tcaatcctaa atcagtattt gtttgcagaa    1320

taaggcgcgc cttaagatat caacaaactc cgggaggcag cgtgatgggg caacaatcac    1380

acggatttcc cgtgaacggt ctgaatgagc ggattatttt cagggaaagt gagtgtggtc    1440

agcgtgcagg tatatgggct atgatgtgcc cggcgcttga ggctttctgc ctcatgacgt    1500

gaaggtggtt tgtgccgtgt tgtgtggcag aaagaagata gccccgtagt aagttaattt    1560

tcattaacca ccacgaggca tccctatgtc tagtccacat caggatagcc tcttaccgcg    1620

ctttgcgcaa ggagaagaag gccatgaaac taccacgaag ttcccttgtc tggtgtgtgt    1680

tgatcgtgtg tctcacactg ttgatattca cttatctgac acgaaaatcg ctgtgcgaga    1740

ttcgttacag agacggacac agggaggtgg cggctttcat ggcttacgaa tccggtaagt    1800

agctacctgg aggcgggcgc aggcctgcct tttcaggact gatgctggtc tgactactga    1860

agcgccttta taaaggggct gctggttcgc cggtagcccc tttctccttg ctgatgttgt    1920

gaattcgaag cttgatccgg ctgctaacaa agcccgaaag gaagctgagt tggctgctgc    1980

caccgctgag caataactag cataacccct tggggcctct aaacgggtct tgaggggttt    2040

tttgctgaaa ggaggaacta tatccggatc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat    2100

cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggg acgcgccctg tagcggcgca    2160

ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta    2220

gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt    2280

caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac    2340

cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt    2400

tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga    2460

acaacactca accctatctc ggtctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg    2520

gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt taacaaaata    2580

ttaacgctta caatttaggt ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt    2640

tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc    2700

ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtcatattca acgggaaacg tcttgctcta    2760

ggccgcgatt aaattccaac atggatgctg atttatatgg gtataaatgg gctcgcgata    2820

atgtcgggca atcaggtgcg acaatctatc gattgtatgg gaagcccgat gcgccagagt    2880

tgtttctgaa acatggcaaa ggtagcgttg ccaatgatgt tacagatgag atggtcagac    2940

taaactggct gacggaattt atgcctcttc cgaccatcaa gcattttatc cgtactcctg    3000

atgatgcatg gttactcacc actgcgatcc ccgggaaaac agcattccag gtattagaag    3060

aatatcctga ttcaggtgaa aatattgttg atgcgctggc agtgttcctg cgccggttgc    3120

attcgattcc tgtttgtaat tgtcctttta acagcgatcg cgtatttcgt ctcgctcagg    3180

cgcaatcacg aatgaataac ggtttggttg atgcgagtga ttttgatgac gagcgtaatg    3240

gctggcctgt tgaacaagtc tggaaagaaa tgcataaact tttgccattc tcaccggatt    3300

cagtcgtcac tcatggtgat ttctcacttg ataaccttat ttttgacgag gggaaattaa    3360

taggttgtat tgatgttgga cgagtcggaa tcgcagaccg ataccaggat cttgccatcc    3420

tatggaactg cctcggtgag ttttctcctt cattacagaa acggcttttt caaaaatatg    3480

gtattgataa tcctgatatg aataaattgc agtttcattt gatgctcgat gagtttttct    3540

aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt catttttaat    3600

ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg    3660

agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc    3720

ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg    3780

tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag    3840

cgcagatacc aaatactgtt cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact    3900

ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg    3960

gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc    4020

ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg    4080

aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg    4140

cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag    4200

ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc    4260

gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct    4320

ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc    4380

ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc    4440

gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga agagcgccca atacgcaaac    4500

cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact    4560

ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta atgtgagtta gctcactcat taggcacccc    4620

aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat    4680

ttcacacaag aaggagatat a                                              4701

<210>4

<211>1071

<212>DNA

<213>Trigonopsis variabilis

<400>4

atggctaaaa tcgttgttat tggtgccggt gttgccggtt taactacagc tcttcaactt    60

cttcgtaaag gacatgaggt tacaattgtg tccgagttta cgcccggtga tcttagtatc   120

ggatatacct cgccttgggc aggtgccaac tggctcacat tttacgatgg aggcaagtta   180

gccgactacg atgccgtctc ttatcctatc ttgcgagagc tggctcgaag cagccccgag   240

gctggaattc gactcatcaa ccaacgctcc catgttctca agcgtgatct tcctaaactg   300

gaaggtgcca tgtcggccat ctgtcaacgc aacccctggt tcaaaaacac agtcgattct    360

ttcgagatta tcgaggacag gtccaggatt gtccacgatg atgtggctta tctagtcgaa    420

tttgcttccg tttgtatcca caccggagtc tacttgaact ggctgatgtc ccaatgctta    480

tcgctcggcg ccacggtggt taaacgtcga gtgaaccata tcaaggatgc caattttcta    540

cactcctcag gatcacgccc cgacgtgatt gtcaactgta gtggtctctt tgcccggttc    600

ttgggaggcg tcgaggacaa gaagatgtac cctattcgag gacaagtcgt ccttgttcga    660

aactctcttc cttttatggc ctccttttcc agcactcctg aaaaagaaaa tgaagacgaa    720

gctctatata tcatgacccg attcgatggt acttctatca ttggcggttg tttccaatcc    780

aacaactggt catccgaacc cgatccttct ctcacccatc gaatcctgtc tagagccctc    840

gaccgattcc cggaactgac caaagatggc cctcttgaca ttgtgcgcga atgcgttggc    900

caccgtcctg gtagagaggg cggtccccga gtagaattag agaagatccc cggcgttggc    960

tttgttgtcc ataactatgg tgccgccggt gctggttacc agtcctctta cggcatggct   1020

gatgaagctg tttcttacgt cgaaagagct cttactcgtc caaaccttta g            1071

<210>5

<211>1071

<212>DNA

<213>Trigonopsis variabilis

<400>5

atggctaaaa tcgttgttat tggtgccggt gttgccggtt taactacagc tcttcaactt   60

cttcgtaaag gacatgaggt tacaattgtg tccgagttta cgcccggtga tcttagtatc  120

ggatatacct cgccttgggc aggtgccaac tggctcccgt tttacgatgg aggcaagtta  180

gccgactacg atgccgtctc ttatcctatc ttgcgagagc tggctcgaag cagccccgag  240

gctggaattc gactcatcaa ccaacgctcc catgttctca agcgtgatct tcctaaactg  300

gaaggtgcca tgtcggccat ctgtcaacgc aacccctggt tcaaaaacac agtcgattct  360

ttcgagatta tcgaggacag gtccaggatt gtccacgatg atgtggctta tctagtcgaa  420

tttgcttccg tttgtatcca caccggagtc tacttgaact ggctgatgtc ccaatgctta  480

tcgctcggcg ccacggtggt taaacgtcga gtgaaccata tcaaggatgc caattttcta  540

cactcctcag gatcacgccc cgacgtgatt gtcaactgta gtggtctctt tgcccggttc  600

ttgggaggcg tcgaggacaa gaagatgtac cctattcgag gacaagtcgt ccttgttcga  660

aactctcttc cttttatggc ctccttttcc agcactcctg aaaaagaaaa tgaagacgaa  720

gctctatata tcatgacccg attcgatggt acttctatca ttggcggttg tttccaatcc  780

aacaactggt catccgaacc cgatccttct ctcacccatc gaatcctgtc tagagccctc    840

gaccgattcc cggaactgac caaagatggc cctcttgaca ttgtgcgcga atgcgttggc    900

caccgtcctg gtagagaggg cggtccccga gtagaattag agaagatccc cggcgttggc    960

tttgttgtcc ataactatgg tgccgccggt gctggttacc agtcctctta cggcatggct   1020

gatgaagctg tttcttacgt cgaaagagct cttactcgtc caaaccttta g            1071

Claims (3)

1.一种大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体，所述表达载体含有在启动子控制下的目的蛋白基因，其特征在于，所述表达载体由载体pRSET-A构建而来，其中所述载体pRSET-A中的氨苄青霉素抗性基因被卡那霉素抗性基因代替，并且其中所述表达载体为pHS-GHA，其序列为序列号1所示的序列。

2.一种用大肠杆菌表达目的蛋白的方法，所述大肠杆菌是由含有所述目的蛋白基因的表达载体转化的，所述目的蛋白基因在启动子控制之下，该方法包括使所述大肠杆菌在培养基中生长并表达所述的目的蛋白，其特征在于，所述表达载体由载体pRSET-A构建而来，其中所述载体pRSET-A中的氨苄青霉素抗性基因被卡那霉素抗性基因代替，并且其中所述表达载体为pHS-GHA，其序列为序列号1所示的序列。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述大肠杆菌在含有浓度为50-100微克/毫升的卡那霉素的培养基中培养。

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