CN111304260A - 重组代谢微生物及其用途 - Google Patents

重组代谢微生物及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN111304260A
CN111304260A CN202010130561.9A CN202010130561A CN111304260A CN 111304260 A CN111304260 A CN 111304260A CN 202010130561 A CN202010130561 A CN 202010130561A CN 111304260 A CN111304260 A CN 111304260A
Authority
CN
China
Prior art keywords
clostridium
ile
lys
leu
gly
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010130561.9A
Other languages
English (en)
Inventor
陈铱婷
F·刘
M·科普克
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lanzatech NZ Inc
Original Assignee
Lanzatech New Zealand Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=49670710&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN111304260(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Lanzatech New Zealand Ltd filed Critical Lanzatech New Zealand Ltd
Publication of CN111304260A publication Critical patent/CN111304260A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
    • C12P5/007—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons containing one or more isoprene units, i.e. terpenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1022—Transferases (2.) transferring aldehyde or ketonic groups (2.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1229—Phosphotransferases with a phosphate group as acceptor (2.7.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P9/00—Preparation of organic compounds containing a metal or atom other than H, N, C, O, S or halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01088—Hydroxymethylglutaryl-CoA reductase (1.1.1.88)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01267—1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase (1.1.1.267)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y117/00—Oxidoreductases acting on CH or CH2 groups (1.17)
    • C12Y117/07—Oxidoreductases acting on CH or CH2 groups (1.17) with an iron-sulfur protein as acceptor (1.17.7)
    • C12Y117/07001—(E)-4-Hydroxy-3-methylbut-2-enyl-diphosphate synthase (1.17.7.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y202/00—Transferases transferring aldehyde or ketonic groups (2.2)
    • C12Y202/01—Transketolases and transaldolases (2.2.1)
    • C12Y202/01007—1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase (2.2.1.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01009—Acetyl-CoA C-acetyltransferase (2.3.1.9)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/03—Acyl groups converted into alkyl on transfer (2.3.3)
    • C12Y203/0301—Hydroxymethylglutaryl-CoA synthase (2.3.3.10)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
    • C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
    • C12Y205/0101—(2E,6E)-Farnesyl diphosphate synthase (2.5.1.10), i.e. geranyltranstransferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
    • C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
    • C12Y205/0109—All-trans-octaprenyl-diphosphate synthase (2.5.1.90)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
    • C12Y207/01036—Mevalonate kinase (2.7.1.36)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
    • C12Y207/01148—4-(Cytidine 5'-diphospho)-2-C-methyl-D-erythritol kinase (2.7.1.148)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/04—Phosphotransferases with a phosphate group as acceptor (2.7.4)
    • C12Y207/04002—Phosphomevalonate kinase (2.7.4.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/0706—2-C-Methyl-D-erythritol 4-phosphate cytidylyltransferase (2.7.7.60)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01033—Diphosphomevalonate decarboxylase (4.1.1.33), i.e. mevalonate-pyrophosphate decarboxylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/03—Carbon-oxygen lyases (4.2) acting on phosphates (4.2.3)
    • C12Y402/03027—Isoprene synthase (4.2.3.27)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/03—Carbon-oxygen lyases (4.2) acting on phosphates (4.2.3)
    • C12Y402/03046—Alpha-farnesene synthase (4.2.3.46)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y406/00—Phosphorus-oxygen lyases (4.6)
    • C12Y406/01—Phosphorus-oxygen lyases (4.6.1)
    • C12Y406/01012—2-C-Methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate synthase (4.6.1.12)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y503/00—Intramolecular oxidoreductases (5.3)
    • C12Y503/03—Intramolecular oxidoreductases (5.3) transposing C=C bonds (5.3.3)
    • C12Y503/03002—Isopentenyl-diphosphate DELTA-isomerase (5.3.3.2)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/30—Fuel from waste, e.g. synthetic alcohol or diesel

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

萜烯是在多种产业中使用的有价值的商业产品。萜烯可以由石油化学来源和诸如松节油的萜烯原料产生。然而，这些生产方法昂贵，不可持续且常导致环境问题，包括促成气候变化。微生物发酵为萜烯生产提供了一种替代性的选择。可以通过对包含CO的底物的微生物发酵而产生一种或多种萜烯和/或前体。重组微生物可用于此类方法中。一氧化碳营养型产乙酸的重组微生物可用于所述方法中。例如，所述重组微生物可含有外源性甲羟戊酸(MVA)途径的酶和/或DXS途径的酶。

Description

重组代谢微生物及其用途
本申请为分案申请，其原申请的申请日为2013年6月4日，申请号为201380041086.6，名称为“重组代谢微生物及其用途”。
技术领域
本发明涉及重组微生物以及通过对包含CO的底物的微生物发酵产生萜烯和/或其前体的方法。
背景技术
萜烯是包含五碳异戊二烯单元的天然存在的化合物的多样化类别。萜烯衍生物包括萜类化合物(也称为类异戊二烯)，其可由碳主链的氧化或重排或者大量官能团加成或重排来形成。
萜烯的例子包括：异戊二烯(C5半萜烯)、法呢烯(C15倍半萜烯)、青蒿素(C15倍半萜烯)、柠檬醛(C10单萜烯)、类胡萝卜素(C40四萜烯)、薄荷醇(C10单萜烯)、樟脑(C10单萜烯)和大麻素。
萜烯是在多种行业中使用的有价值的商业产品。萜烯的最重要用途是作为树脂、溶剂、香料和维生素。举例来说，异戊二烯用于生产例如用于轮胎工业中的合成橡胶(顺-1,4-聚异戊二烯)；法呢烯用作用于运输的能源密集即用燃料(drop-in fuel)或用作喷气燃料；青蒿素用作疟疾药物；且柠檬醛、类胡萝卜素、薄荷醇、樟脑和大麻素用于制造药物丁二烯且作为芳族成分。
萜烯可以由石油化学来源和萜烯原料(诸如松节油)产生。举例来说，异戊二烯在石油化学上作为乙烯生产中的石脑油或油裂解的副产品而产生。许多萜烯也以相对小的量从自然来源中提取。然而，这些生产方法代价昂贵，不可持续且常导致环境问题，包括引起气候变化。
由于异戊二烯的极易燃性质，已知的生产方法需要广泛的保护来限制着火和爆炸的可能性。
本发明的目标在于克服现有技术的一种或多种不足，或至少向公众提供用于生产萜烯和其它相关产品的替代方式。
发明内容
微生物发酵提供了一种用于生产萜烯的替代选择。萜烯在自然界中普遍存在，例如涉及细菌细胞壁生物合成，且它们由一些树(例如白杨)产生用于保护叶片免受UV光暴露。然而，并非所有细菌都包含必要的细胞机制来产生萜烯和/或其前体作为代谢产物。举例来说，尚不知道能够将包含一氧化碳的底物发酵产生诸如乙醇的产物的一氧化碳营养型产乙酸菌(诸如自产乙醇梭菌(C.autoethanogenum)或杨氏梭菌(C.ljungdahlii))会产生且释放任何萜烯和/或其前体作为代谢产物。另外，尚不知道大多数细菌会产生具有商业价值的任何萜烯。
本发明一般尤其提供通过将包含CO的底物微生物发酵来产生一种或多种萜烯和/或其前体的方法以及用于所述方法中的重组微生物。
在第一方面，本发明提供能够通过将包含CO的底物发酵产生一种或多种萜烯和/或其前体和任选的一种或多种其它产物的一氧化碳营养型产乙酸的重组微生物。
在一个具体实施方案中，将所述微生物改造为适合于表达甲羟戊酸(MVA)途径中的一种或多种在用于产生重组微生物的亲本微生物中不存在的酶(本文中可称为外源性酶)。在另一个实施方案中，将所述微生物改造为适合于过度表达甲羟戊酸(MVA)途径中的一种或多种在用于产生重组微生物的亲本微生物中存在的酶(本文中可称为内源性酶)。
在另一个实施方案中，将所述微生物改造为适合于：
a)表达甲羟戊酸(MVA)途径中的一种或多种外源性酶和/或过度表达甲羟戊酸(MVA)途径中的一种或多种内源性酶；和
b)表达DXS途径中的一种或多种外源性酶和/或过度表达DXS途径中的一种或多种内源性酶。
在一个实施方案中，所述来自甲羟戊酸(MVA)途径的一种或多种酶选自：
a)硫解酶(EC 2.3.1.9)、
b)HMG-CoA合酶(EC 2.3.3.10)、
c)HMG-CoA还原酶(EC 1.1.1.88)、
d)甲羟戊酸激酶(EC 2.7.1.36)、
e)磷酸甲羟戊酸激酶(EC 2.7.4.2)、
f)二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(EC 4.1.1.33)，和
g)它们的任一种的功能等效变体。
在另一个实施方案中，所述来自DXS途径的一种或多种酶选自：
a)1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶DXS(EC:2.2.1.7)、
b)1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶DXR(EC:1.1.1.267)、
c)2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸胞苷酰基转移酶IspD(EC:2.7.7.60)、
d)4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藻糖醇激酶IspE(EC:2.7.1.148)、
e)2-C-甲基-D-赤藻糖醇2,4-环二磷酸合酶IspF(EC:4.6.1.12)、
f)4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合酶IspG(EC:1.17.7.1)、
g)4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶(EC:1.17.1.2)，和
h)它们的任一种的功能等效变体。
在另一个实施方案中，一种或多种其它外源性或内源性酶被表达或过度表达而导致产生萜烯化合物或其前体，其中经表达的外源性酶或经过度表达的内源性酶选自：
a)香叶基转移酶(geranyltransferase)Fps(EC:2.5.1.10)、
b)七异戊烯基二磷酸合酶(heptaprenyl diphosphate synthase)(EC:2.5.1.10)、
c)八异戊烯基二磷酸合酶(octaprenyl diphosphate synthase)(EC:2.5.1.90)、
d)异戊二烯合酶(isoprene synthase)(EC 4.2.3.27)、
e)异戊烯基二磷酸δ-异构酶(isopentenyl diphosphate delta-isomerase)(EC5.3.3.2)、
f)法呢烯合酶(EC 4.2.3.46/EC 4.2.3.47)，和
g)它们的任一种的功能等效变体。
在一个实施方案中，亲本微生物能够将包含CO的底物发酵以产生乙酰基CoA，但不能将乙酰基CoA转化成甲羟戊酸或异戊烯基焦磷酸(IPP)，且将重组微生物改造为适合于表达一种或多种在甲羟戊酸途径中所涉及的酶。
在一个实施方案中，一种或多种萜烯和/或其前体选自甲羟戊酸、IPP、二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)、异戊二烯、香叶基焦磷酸(GPP)、法呢基焦磷酸(FPP)和法呢烯。
在一个实施方案中，微生物包含一种或多种被改造为适合于增加一种或多种内源性核酸的表达的外源性核酸且所述一种或多种内源性核酸编码一种或多种前文提到的酶。
在一个实施方案中，被改造为适合于增加表达的一种或多种外源性核酸是调节元件。在一个实施方案中，调节元件是启动子。在一个实施方案中，启动子是组成型启动子。在一个实施方案中，启动子选自Wood-Ljungdahl基因簇或磷酸转乙酰酶/乙酸激酶操纵子启动子。
在一个实施方案中，微生物包含一种或多种编码且被改造为适合于表达一种或多种前文提到的酶的外源性核酸。在一个实施方案中，微生物包含一种或多种编码且被改造为适合于表达所述酶中至少两种的外源性核酸。在其它实施方案中，微生物包含一种或多种编码且被改造为适合于表达所述酶中至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或九种以上的外源性核酸。
在一个实施方案中，一种或多种外源性核酸是核酸构建体或载体，在一个具体实施方案中是编码以任何组合形式的前文提到的一种或多种酶的质粒。
在一个实施方案中，外源性核酸是表达质粒。
在一个具体实施方案中，亲本微生物选自一氧化碳营养型产乙酸的细菌。在某些实施方案中，微生物选自：自产乙醇梭菌(Clostridium autoethan ogenum)、杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)、食一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)、德雷克氏梭菌(Clostridium drakei)、粪味梭菌(Clostridium scatologenes)、醋酸梭菌(Clostridium aceticum)、蚁酸醋酸梭菌(Clostridium formicoaceticum)、大梭菌(Clostridium magnum)、食甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)、巴氏嗜碱菌(Alkalibaculum bacchii)、延长布劳特氏菌(Blautia producta)、粘液真杆菌(Eubacterium limosum)、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、热自养穆尔氏菌(Moorella thermautotrophica)、卵形鼠孢菌(Sporomusa ovata)、森林乙酸香蕉孢菌(Sporomusa silvacetica)、类球鼠孢菌(Sporomusa sphaeroides)、普氏产醋杆菌(Oxobacter pfennigii)和凯伍热厌氧杆状菌(Thermoanaerobacter kiuvi)。
在一个实施方案中，亲本微生物是自产乙醇梭菌或杨氏梭菌。在一个具体实施方案中，微生物是自产乙醇梭菌DSM23693。在另一个具体实施方案中，微生物是杨氏梭菌DSM13528(或ATCC55383)。
在一个实施方案中，亲本微生物缺少DXS途径和/或甲羟戊酸(MVA)途径中的一个或多个基因。在一个实施方案中，亲本微生物缺少一个或多个编码选自以下的酶的基因：
a)硫解酶(EC 2.3.1.9)、
b)HMG-CoA合酶(EC 2.3.3.10)、
c)HMG-CoA还原酶(EC 1.1.1.88)、
d)甲羟戊酸激酶(EC 2.7.1.36)、
e)磷酸甲羟戊酸激酶(EC 2.7.4.2)、
f)二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(EC 4.1.1.33)、
g)1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶DXS(EC:2.2.1.7)、
h)1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶DXR(EC:1.1.1.267)、
i)2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸胞苷酰基转移酶IspD(EC:2.7.7.60)、
j)4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藻糖醇激酶IspE(EC:2.7.1.148)、
k)2-C-甲基-D-赤藻糖醇2,4-环二磷酸合酶IspF(EC:4.6.1.12)、
l)4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合酶IspG(EC:1.17.7.1)、
m)4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶(EC:1.17.1.2)，和
n)它们的任一种的功能等效变体。
在第二方面，本发明提供编码一种或多种酶的核酸，所述酶在微生物中表达时使得所述微生物可以通过将包含CO的底物发酵而产生一种或多种萜烯和/或其前体。
在一个实施方案中，核酸编码两种或两种以上酶，所述酶在微生物中表达时使得所述微生物可以通过将包含CO的底物发酵而产生一种或多种萜烯和/或其前体。在一个实施方案中，本发明的核酸编码所述酶中的至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或九种以上。
在一个实施方案中，核酸编码甲羟戊酸(MVA)途径中的一种或多种酶。在一个实施方案中，一种或多种酶选自：
a)硫解酶(EC 2.3.1.9)、
b)HMG-CoA合酶(EC 2.3.3.10)、
c)HMG-CoA还原酶(EC 1.1.1.88)、
d)甲羟戊酸激酶(EC 2.7.1.36)、
e)磷酸甲羟戊酸激酶(EC 2.7.4.2)、
f)二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(EC 4.1.1.33)，和
g)它们的任一种的功能等效变体。
在一个具体实施方案中，核酸编码硫解酶(可以是乙酰基CoAc-乙酰基转移酶)、HMG-CoA合酶和HMG-CoA还原酶。
在另一个实施方案中，核酸编码甲羟戊酸(MVA)途径中的一种或多种酶和DXS途径中的一种或多种其它核酸。在一个实施方案中，来自DXS途径的一种或多种酶选自：
a)1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶DXS(EC:2.2.1.7)、
b)1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶DXR(EC:1.1.1.267)、
c)2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸胞苷酰基转移酶IspD(EC:2.7.7.60)、
d)4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藻糖醇激酶IspE(EC:2.7.1.148)、
e)2-C-甲基-D-赤藻糖醇2,4-环二磷酸合酶IspF(EC:4.6.1.12)、
f)4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合酶IspG(EC:1.17.7.1)、
g)4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶(EC:1.17.1.2)，和
h)它们的任一种的功能等效变体。
在另一个实施方案中，编码一种或多种其它外源性或内源性酶的核酸被表达或过度表达而导致产生萜烯化合物或其前体，其中经表达的外源性核酸或经过度表达的内源性酶编码选自以下的酶：
a)香叶基转移酶Fps(EC:2.5.1.10)、
b)七异戊烯基二磷酸合酶(EC:2.5.1.10)、
c)八异戊烯基二磷酸合酶(EC:2.5.1.90)、
d)异戊二烯合酶(EC 4.2.3.27)、
e)异戊烯基二磷酸δ-异构酶(EC 5.3.3.2)、
f)法呢烯合酶(EC 4.2.3.46/EC 4.2.3.47)，和
g)它们的任一种的功能等效变体。
在一个实施方案中，编码硫解酶(EC 2.3.1.9)的核酸具有序列SEQ ID NO:40或是其功能等效变体。
在一个实施方案中，编码硫解酶(EC 2.3.1.9)的核酸是具有序列SEQ ID NO:41的乙酰基CoAc-乙酰基转移酶或是其功能等效变体。
在一个实施方案中，编码HMG-CoA合酶(EC 2.3.3.10)的核酸具有序列SEQ ID NO:42或是其功能等效变体。
在一个实施方案中，编码HMG-CoA还原酶(EC 1.1.1.88)的核酸具有序列SEQ IDNO:43或是其功能等效变体。
在一个实施方案中，编码甲羟戊酸激酶(EC 2.7.1.36)的核酸具有序列SEQ IDNO:51或是其功能等效变体。
在一个实施方案中，编码磷酸甲羟戊酸激酶(EC 2.7.4.2)的核酸具有序列SEQ IDNO:52或是其功能等效变体。
在一个实施方案中，编码二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(EC 4.1.1.33)的核酸具有序列SEQ ID NO:53或是其功能等效变体。
在一个实施方案中，编码1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶DXS(EC:2.2.1.7)的核酸具有序列SEQ ID NO:1或是其功能等效变体。
在一个实施方案中，编码1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶DXR(EC:1.1.1.267)的核酸具有序列SEQ ID NO:3或是其功能等效变体。
在一个实施方案中，编码2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸胞苷酰基转移酶IspD(EC:2.7.7.60)的核酸具有序列SEQ ID NO:5或是其功能等效变体。
在一个实施方案中，编码4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藻糖醇激酶IspE(EC:2.7.1.148)的核酸具有序列SEQ ID NO:7或是其功能等效变体。
在一个实施方案中，编码2-C-甲基-D-赤藻糖醇2,4-环二磷酸合酶IspF(EC:4.6.1.12)的核酸具有序列SEQ ID NO:9或是其功能等效变体。
在一个实施方案中，编码4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合酶IspG(EC:1.17.7.1)的核酸具有序列SEQ ID NO:11或是其功能等效变体。
在一个实施方案中，编码4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶(EC:1.17.1.2)的核酸具有序列SEQ ID NO:13或是其功能等效变体。
在一个实施方案中，编码香叶基转移酶Fps的核酸具有序列SEQ ID NO:15或是其功能等效变体。
在一个实施方案中，编码七异戊烯基二磷酸合酶的核酸具有序列SEQ ID NO:17或是其功能等效变体。
在一个实施方案中，编码八异戊烯基二磷酸合酶(EC:2.5.1.90)的核酸(其中所述八异戊烯基二磷酸合酶是聚异戊烯基合成酶)由序列SEQ ID NO:19来编码或是其功能等效变体。
在一个实施方案中，编码异戊二烯合酶(ispS)的核酸具有序列SEQ ID NO:21或是其功能等效变体。
在一个实施方案中，编码异戊烯基二磷酸δ-异构酶(idi)的核酸具有序列SEQ IDNO:54或是其功能等效变体。
在一个实施方案中，编码法呢烯合酶的核酸具有序列SEQ ID NO:57或是其功能等效变体。
在一个实施方案中，核酸编码以下酶：
a)异戊二烯合酶；
b)异戊烯基二磷酸δ-异构酶(idi)；和
c)1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶DXS；
或其功能等效变体。
在一个实施方案中，核酸编码以下酶：
a)硫解酶；
b)HMG-CoA合酶；
c)HMG-CoA还原酶；
d)甲羟戊酸激酶；
e)磷酸甲羟戊酸激酶；
f)二磷酸甲羟戊酸脱羧酶；
g)异戊烯基二磷酸δ-异构酶(idi)；和
h)异戊二烯合酶；
或其功能等效变体。
在一个实施方案中，核酸编码以下酶：
a)香叶基转移酶Fps；和
b)法呢烯合酶
或其功能等效变体。
在一个实施方案中，本发明的核酸还包含启动子。在一个实施方案中，启动子允许在其控制下所述基因的组成型表达。在一个具体实施方案中，使用Wood-Ljungdahl簇启动子。在另一个具体实施方案中，使用磷酸转乙酰酶/乙酸激酶操纵子启动子。在一个具体实施方案中，启动子来自自产乙醇梭菌。
在第三方面，本发明提供包含第二方面的一种或多种核酸的核酸构建体或载体。
在一个具体实施方案中，核酸构建体或载体是表达构建体或载体。在一个具体实施方案中，表达构建体或载体是质粒。
在第四方面，本发明提供包含第二方面的任一种或多种核酸或者第三方面的载体或构建体的宿主生物体。
在第五方面，本发明提供包含如本发明第三方面中提到的表达构建体或载体和甲基化构建体或载体的组合物。
所述组合物优选地能够产生根据本发明第一方面的重组微生物。
在一个具体实施方案中，所述表达构建体/载体和/或所述甲基化构建体/载体是质粒。
在第六方面，本发明提供通过微生物发酵产生一种或多种萜烯和/或其前体和任选的一种或多种其它产物的方法，其包括使用本发明第一方面的重组微生物发酵包含CO的底物。
在一个实施方案中，此方法包括以下步骤：
(a)向含有本发明第一方面的一种或多种微生物的培养物的生物反应器中提供包含CO的底物；和
(b)厌氧发酵生物反应器中的培养物以产生至少一种萜烯和/或其前体。
在一个实施方案中，此方法包括以下步骤：
(a)捕获由工业过程产生的含CO的气体；
(b)通过含有本发明第一方面的一种或多种微生物的培养物厌氧发酵含CO的气体以产生至少一种萜烯和/或其前体。
在所述方法方面的特别实施方案中，微生物维持在水性培养基中。
在所述方法方面的特别实施方案中，在生物反应器中发生底物的发酵。
在一个实施方案中，所述一种或多种萜烯和/或其前体选自甲羟戊酸、IPP、二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)、异戊二烯、香叶基焦磷酸(GPP)、法呢基焦磷酸(FPP)和法呢烯。
包含CO的底物优选地是包含CO的气态底物。在一个实施方案中，底物包含工业废气。在某些实施方案中，气体是钢铁厂废气或合成气。
在一个实施方案中，底物将通常含有较大比例的CO，诸如至少约20体积％至约100体积％的CO、20体积％至70体积％的CO、30体积％至60体积％的CO和40体积％至55体积％的CO。在具体实施方案中，底物包含约25体积％、或约30体积％、或约35体积％、或约40体积％、或约45体积％、或约50体积％的CO、或约55体积％的CO或约60体积％的CO。
在某些实施方案中，所述方法另外包括自发酵液中回收萜烯和/或其前体以及任选的一种或多种其它产物的步骤。
在第七方面，本发明提供由第六方面的方法产生的一种或多种萜烯和/或其前体。在一个实施方案中，所述一种或多种萜烯和/或其前体选自甲羟戊酸、IPP、二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)、异戊二烯、香叶基焦磷酸(GPP)、法呢基焦磷酸(FPP)和法呢烯。
在另一方面，本发明提供产生本发明第一方面的微生物的方法，其包括通过引入一种或多种核酸转化一氧化碳营养型产乙酸的亲本微生物以使得所述微生物能够通过发酵包含CO的底物来产生一种或多种萜烯和/或其前体以及任选的一种或多种其它产物或增加其产量，其中所述亲本微生物无法通过发酵包含CO的底物来产生一种或多种萜烯和/或其前体或产生其的水平较低。
在一个具体实施方案中，通过引入被改造为适合于表达甲羟戊酸(MVA)途径和任选的DXS途径中的一种或多种酶的一种或多种外源性核酸来转化亲本微生物。在另一个实施方案中，用被改造为适合于过度表达在亲本微生物中天然存在的甲羟戊酸(MVA)途径和任选的DXS途径中的一种或多种酶的一种或多种核酸来转化亲本微生物。
在某些实施方案中，所述一种或多种酶为如前文中所描述。
在一个实施方案中，提供经分离的遗传改造的一氧化碳营养型产乙酸的细菌，其包含编码甲羟戊酸途径或DXS途径或萜烯生物合成途径中的酶的外源性核酸，由此细菌表达所述酶。此酶选自：
a)硫解酶(EC 2.3.1.9)；
b)HMG-CoA合酶(EC 2.3.3.10)；
c)HMG-CoA还原酶(EC 1.1.1.88)；
d)甲羟戊酸激酶(EC 2.7.1.36)；
e)磷酸甲羟戊酸激酶(EC 2.7.4.2)；
f)二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(EC 4.1.1.33)；1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶DXS(EC:2.2.1.7)；
g)1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶DXR(EC:1.1.1.267)；
h)2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸胞苷酰基转移酶IspD(EC:2.7.7.60)；
i)4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藻糖醇激酶IspE(EC:2.7.1.148)；
j)2-C-甲基-D-赤藻糖醇2；4-环二磷酸合酶IspF(EC:4.6.1.12)；
k)4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合酶IspG(EC:1.17.7.1)；
l)4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶(EC:1.17.1.2)；香叶基转移酶Fps(EC:2.5.1.10)；
m)七异戊烯基二磷酸合酶(EC:2.5.1.10)；
n)八异戊烯基二磷酸合酶(EC:2.5.1.90)；
o)异戊二烯合酶(EC 4.2.3.27)；
p)异戊烯基二磷酸δ-异构酶(EC 5.3.3.2)；和
q)法呢烯合酶(EC 4.2.3.46/EC 4.2.3.47)。
在一些方面，在不存在所述核酸时，所述细菌不表达所述酶。在一些方面，所述细菌在厌氧条件下表达所述酶。
一个实施方案提供可在一氧化碳营养型产乙酸的细菌中复制的质粒。质粒包含编码甲羟戊酸途径或DXS途径或萜烯生物合成途径中的酶的核酸，由此当质粒处于所述细菌中时，由所述细菌表达所述酶。此酶选自：
a)硫解酶(EC 2.3.1.9)；
b)HMG-CoA合酶(EC 2.3.3.10)；
c)HMG-CoA还原酶(EC 1.1.1.88)；
d)甲羟戊酸激酶(EC 2.7.1.36)；
e)磷酸甲羟戊酸激酶(EC 2.7.4.2)；
f)二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(EC 4.1.1.33)；1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶DXS(EC:2.2.1.7)；
g)1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶DXR(EC:1.1.1.267)；
h)2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸胞苷酰基转移酶IspD(EC:2.7.7.60)；
i)4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藻糖醇激酶IspE(EC:2.7.1.148)；
j)2-C-甲基-D-赤藻糖醇2；4-环二磷酸合酶IspF(EC:4.6.1.12)；
k)4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合酶IspG(EC:1.17.7.1)；
l)4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶(EC:1.17.1.2)；香叶基转移酶Fps(EC:2.5.1.10)；
m)七异戊烯基二磷酸合酶(EC:2.5.1.10)；
n)八异戊烯基二磷酸合酶(EC:2.5.1.90)；
o)异戊二烯合酶(EC 4.2.3.27)；
p)异戊烯基二磷酸δ-异构酶(EC 5.3.3.2)；和
q)法呢烯合酶(EC 4.2.3.46/EC 4.2.3.47)。
在另一实施方案中提供用于将CO和/或CO2转化成异戊二烯的方法。此方法包括：将含CO和/或含CO2的气态底物传递到容纳有在培养基中的一氧化碳营养型产乙酸的细菌的培养物的生物反应器中以使得细菌将CO和/或CO2转化成异戊二烯，且自生物反应器回收异戊二烯。一氧化碳营养型产乙酸的细菌是经过遗传改造的来表达异戊二烯合酶。
另一实施方案提供经分离的遗传改造的一氧化碳营养型产乙酸的细菌，其包含编码异戊二烯合酶的核酸。细菌表达异戊二烯合酶且细菌能够将二甲基烯丙基二磷酸转化成异戊二烯。在一方面，异戊二烯合酶是美洲山杨(Populus tremuloides)酶。在另一方面，核酸是经过密码子优化。在又一方面，异戊二烯合酶的表达是在来自自产乙醇梭菌的丙酮酸:铁氧化还原蛋白氧化还原酶基因的启动子的转录控制下。
另一实施方案提供用于将CO和/或CO2转化成异戊烯基二磷酸(IPP)的方法。此方法包括：将含CO和/或含CO2的气态底物传递到容纳有在培养基中的一氧化碳营养型产乙酸的细菌的培养物的生物反应器中以使得细菌将CO和/或CO2转化成异戊烯基二磷酸(IPP)，且自生物反应器回收IPP。一氧化碳营养型产乙酸的细菌是经过遗传改造的来表达异戊烯基二磷酸δ异构酶。
又一实施方案提供经分离的遗传改造的一氧化碳营养型产乙酸的细菌，其包含编码异戊烯基二磷酸δ异构酶的核酸。细菌表达异戊烯基二磷酸δ异构酶且细菌能够将二甲基烯丙基二磷酸转化成异戊烯基二磷酸。在一些方面，核酸编码拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)异戊烯基二磷酸δ异构酶。在其它方面，核酸是在来自自产乙醇梭菌的丙酮酸:铁氧化还原蛋白氧化还原酶基因的启动子的转录控制下。又在其它方面，核酸是在来自自产乙醇梭菌的丙酮酸:铁氧化还原蛋白氧化还原酶基因的启动子的转录控制下且位于编码异戊二烯合酶的第二核酸的下游。
又一实施方案提供一种用于将CO和/或CO2转化成异戊烯基二磷酸(IPP)和/或异戊二烯的方法。此方法包括：将含CO和/或含CO2的气态底物传递到容纳有在培养基中的一氧化碳营养型产乙酸的细菌的培养物的生物反应器中以使得细菌将CO和/或CO2转化成异戊烯基二磷酸(IPP)和/或异戊二烯，且自生物反应器回收IPP和/或异戊二烯。一氧化碳营养型产乙酸的细菌是经过遗传改造的以具有拷贝数增加的编码脱氧木酮糖5-磷酸合酶(DXS)酶的核酸，其中所述增加的拷贝数为大于1/基因组。
又一实施方案提供经分离的遗传改造的一氧化碳营养型产乙酸的细菌，其包含拷贝数大于1/基因组的编码脱氧木酮糖5-磷酸合酶(DXS)酶的核酸。在一些方面，经分离的遗传改造的一氧化碳营养型产乙酸的细菌可还包含编码异戊二烯合酶的核酸。在其它方面，经分离的遗传改造的一氧化碳营养型产乙酸的细菌可还包含编码异戊烯基二磷酸δ异构酶的核酸。又在其它方面，经分离的遗传改造的一氧化碳营养型产乙酸的细菌可还包含编码异戊烯基二磷酸δ异构酶的核酸和编码异戊二烯合酶的核酸。
另一实施方案提供经分离的遗传改造的一氧化碳营养型产乙酸的细菌，其包含编码磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)的核酸。细菌表达所编码的酶且所述酶并非此细菌天然具有的。在一些方面，所述酶是金黄色葡萄球菌(Staphyloco ccus aureus)酶。在一些方面，所述酶是在一个或多个自产乙醇梭菌启动子的控制下进行表达。在一些方面，所述细菌还包含编码硫解酶(thlA/vraB)的核酸、编码HMG-CoA合酶(HMGS)的核酸和编码HMG-CoA还原酶(HMGR)的核酸。在一些方面，硫解酶是丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)硫解酶。在一些方面，细菌还包含编码二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMD)的核酸。
又一实施方案提供经分离的遗传改造的一氧化碳营养型产乙酸的细菌，其包含编码α-法呢烯合酶的外源性核酸。在一些方面，核酸是经过密码子优化以供在自产乙醇梭菌中表达。在一些方面，α-法呢烯合酶是苹果(Malus×domestica)α-法呢烯合酶。在一些方面，细菌还包含编码香叶基转移酶的核酸区段。在一些方面，香叶基转移酶是大肠杆菌(E.coli)香叶基转移酶。
用于本发明的任何方面或实施方案的合适的经分离的遗传改造的一氧化碳营养型产乙酸的细菌可选自自产乙醇梭菌、杨氏梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌、德雷克氏梭菌、粪味梭菌、醋酸梭菌、蚁酸醋酸梭菌、大梭菌、食甲基丁酸杆菌、伍氏醋酸杆菌、巴氏嗜碱菌、延长布劳特氏菌、粘液真杆菌、热醋穆尔氏菌、热自养穆尔氏菌、卵形鼠孢菌、森林乙酸香蕉孢菌、类球鼠孢菌、普氏产醋杆菌和凯伍热厌氧杆状菌。
本发明也可以在广义上被陈述成在于本申请的说明书中个别地或共同地提及或指出的部分、元素或特征，以及在于所述部分、元素和特征的两个或多个的任意或所有组合，且其中本文提到具有本发明所属领域中的已知等效物的具体整数时，所述已知等效物被认为如同单独陈述般纳入本文中。
附图说明
在所有新颖方面应该考虑的本发明的这些和其它方面将通过以下参考附图的描述而变得显而易见，以下描述仅作为示例给出。
图1：用于产生萜烯的途径图，本申请中描述的基因靶标是以粗体箭头突出显示。
图2：质粒pMTL 85146-ispS的遗传图谱。
图3：质粒pMTL 85246-ispS-idi的遗传图谱。
图4：质粒pMTL 85246-ispS-idi-dxs的遗传图谱。
图5：质粒pMTL 85246-ispS-idi-dxs的测序结果。
图6：通过DXS和甲羟戊酸途径自CO产生萜烯的能量学比较。
图7：甲羟戊酸途径。
图8：确认在自产乙醇梭菌转化体中存在异戊二烯表达质粒pMTL 85246-ispS-idi的琼脂糖凝胶电泳图像。泳道1和20示出了100bp Plus DNA Ladder。泳道3至6、9至12、15至18示出了以来自4种不同克隆的分离质粒作为模板的PCR，各自按照以下次序：colE1、ermB和idi。泳道2、8和14示出了无模板的PCR作为阴性对照，各自按照以下次序：colE1、ermB和idi。泳道7、13和19示出了具有来自大肠杆菌的pMTL 85246-ispS-idi的PCR作为阳性对照，各自按照以下次序：colE1、ermB和idi。
图9-甲羟戊酸表达质粒pMTL8215-Pptaack-thlA-HMGS-Patp-HMGR。
图10-异戊二烯表达质粒pMTL 8314-Pptaack-thlA-HMGS-Patp-HMGR-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispS。
图11-法呢烯表达质粒pMTL8314-Pptaack-thlA-HMGS-Patp-HMGR-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS。
图12-质粒pMTL 85246-ispS-idi-dxs的遗传图谱。
图13-用携带质粒pMTL 85146-ispS的自产乙醇梭菌进行基因表达实验的扩增图。
图14-用携带质粒pMTL 85246-ispS-idi的自产乙醇梭菌进行基因表达实验的扩增图。
图15-用携带质粒pMTL 85246-ispS-idi-dxs的自产乙醇梭菌进行基因表达实验的扩增图。
图16-PCR检查质粒pMTL8314Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS的存在。预期条带大小1584bp。DNA标记物Fermentas 1kb DNALadder。
图17-携带质粒pMTL8314Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS的转化自产乙醇梭菌的生长曲线。
图18-示出基因甲羟戊酸激酶(MK SEQ ID NO:51)、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK SEQID NO:52)、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMD SEQ ID NO:53)、异戊烯基二磷酸δ-异构酶(idiSEQ ID NO:54)、香叶基转移酶(ispASEQ ID NO:56)和法呢烯合酶(FS SEQ ID NO:57)的表达的RT-PRC数据。
图19-GC-MS检测和证实在携带pMTL8314Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS的1mM甲羟戊酸加料(spiked)培养物中法呢烯的存在。对含有质量为93的离子的峰的扫描的GC-MS色谱图。色谱图1和2是转化的自产乙醇梭菌，3是与自产乙醇梭菌样品同时运行的β-法呢烯标准物。4是在M9葡萄糖上生长的携带质粒pMTL8314Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS的大肠杆菌，显示α-法呢烯产量，且5是在大肠杆菌样品时运行的β-法呢烯标准物。大肠杆菌与自产乙醇梭菌样品的滞留时间之间的差异是由于仪器的微小变化。然而，β-法呢烯标准物和所产生的α-法呢烯的滞留时间之间的差异在两种情形下完全相同，这与质谱中的匹配一起证实在自产乙醇梭菌中产生α-法呢烯。
图20-在图19中标记为1A和2A的峰的MS图谱。MS图谱与证实此峰是α-法呢烯的NIST数据库图谱(图21)匹配。
图21-来自NIST质谱数据库的α-法呢烯的MS图谱。
具体实施方式
下文是以广义上给出的关于本发明的描述，包括其优选的实施方案。由下文标题“实施例”下给出的公开内容进一步阐明本发明，提供了证实本发明的实验数据、本发明各个方面的具体实施例和进行本发明的方式。
本发明人令人惊讶地能够通过发酵包含CO的底物来工程化一氧化碳营养型产乙酸的微生物从而产生萜烯及其前体，包括异戊二烯和法呢烯。这为生产这些产品提供了一种替代方式，可具有优于其目前生产方法的优势。另外，提供了使用来自工业过程的一氧化碳的方式，否则一氧化碳将释放到大气中且污染环境。
如本文提到的“发酵液”是至少包含营养培养基和细菌细胞的培养基。
如本文提到的“穿梭微生物”是在其中表达甲基转移酶且不同于目标微生物的微生物。
如本文提到的“目标微生物”是在其中表达在表达构建体/载体上所包括的基因且不同于穿梭微生物的微生物。
术语“主要发酵产物”打算意指以最高浓度和/或产率产生的一种发酵产物。
与发酵过程相关使用的术语“增加效率”、“增加的效率”等包括(但不限于)增加以下中的一种或多种：催化发酵的微生物的生长速率、在产物浓度增加时的生长和/或产物生产速率、由每体积消耗的底物产生的所需产物的体积、所需产物的生产速率或产量水平以及所产生的所需产物与发酵的其它副产物相比的相对比例。
短语“包含一氧化碳的底物”及类似术语应理解为包括其中一氧化碳例如可被一种或多种细菌菌株利用用于生长和/或发酵的任何底物。
短语“包含一氧化碳的气态底物”及其类似短语和术语包括含有一定水平的一氧化碳的任何气体。在某些实施方案中，底物含有至少约20体积％至约100体积％的CO、20体积％至70体积％的CO、30体积％至60体积％的CO和40体积％至55体积％的CO。在具体实施方案中，底物包含约25体积％、或约30体积％、或约35体积％、或约40体积％、或约45体积％、或约50体积％的CO，或约55体积％的CO，或约60体积％的CO。
尽管底物不必要含有任何氢，但H2的存在不会对根据本发明的方法的产物形成不利。在具体实施方案中，氢的存在导致醇产生的总体效率改善。举例来说，在具体实施方案中，底物可包含大约2:1、或1:1、或1:2比率的H2:CO。在一个实施方案中，底物包含约30体积％或30体积％以下的H2、20体积％或20体积％以下的H2、约15体积％或15体积％以下的H2或，约10体积％或10体积％以下的H2。在其它实施方案中，底物流包含低浓度的H2，例如小于5％、或小于4％、或小于3％、或小于2％、或小于1％、或基本上不含氢。底物也可例如含有一些CO2，诸如约1体积％至约80体积％的CO2，或1体积％至约30体积％的CO2。在一个实施方案中，底物包含小于或等于约20体积％的CO2。在具体实施方案中，底物包含小于或等于约15体积％的CO2、小于或等于约10体积％的CO2、小于或等于约5体积％的CO2，或基本上不含CO2。
在下文的描述中，在递送和发酵“含有CO的气态底物”方面描述本发明的实施方案。然而应了解，可以替代形式提供气态底物。举例来说，含有C O的气态底物可溶解在液体中来提供。液体基本上是由含有一氧化碳的气体饱和且然后将此液体加入生物反应器中。这可以使用标准方法来实现。举例来说，可以使用微泡分散液产生器(Hensirisak等人，Scale-up of microbubbl e dispersion generator for aerobic fermentation；Applied Biochemistry and Biotechnology第101卷，第3期/2002年10月)。进一步举例来说，含有C O的气态底物可被吸收到固体支撑物上。这些替代方法是通过使用术语“含有CO的底物”等所涵盖。
在本发明的特别实施方案中，含有CO的气态底物是工业尾气或废气。“工业废气或尾气”应被广泛地认为包括由工业过程产生的包含CO的任何气体且包括由以下产生的气体：铁金属产品制造、非铁产品制造、石油提炼过程、煤的气化、生物质的气化、电力生产、碳黑生产和焦炭制造。其它例子可在本文其它处提供。
除非上下文中另外要求，否则如本文所用的短语“发酵”、“发酵过程”或“发酵反应”等打算涵盖此过程的生长阶段和产物的生物合成阶段。如本文中将进一步描述，在一些实施方案中，生物反应器可包含第一生长反应器和第二发酵反应器。因此，向发酵反应中加入金属或组合物应理解为包括加入到这些反应器的任一者或两者中。
术语“生物反应器”包括由一个或多个容器和/或塔或管路布置组成的发酵装置，包括连续搅拌槽式反应器(Continuous Stirred Tank Reactor，CSTR)、固定化细胞反应器(Immobilized Cell Reactor，ICR)、滴流床反应器(Trickle Bed Reactor，TBR)、鼓泡塔(Bubble Column)、气体提升发酵器(Gas Lift Fermenter)、静态混合器(Static Mixer)或适合气液接触的其它容器或其它装置。在一些实施方案中，生物反应器可包含第一生长反应器和第二发酵反应器。因此，当提到向生物反应器或发酵反应中加入底物时，应理解为包括适当时加入到这些反应器的任一者或两者中。
“外源性核酸”是来自引入其的微生物外部的核酸。外源性核酸可源自任何适当的来源，包括(但不限于)将引入其的微生物(例如，在产生重组微生物的亲本微生物中)、与将引入其的生物体不同的微生物的菌株或物种，或其可通过人为或重组方法产生。在一个实施方案中，外源性核酸代表在将引入其的微生物中天然存在的核酸序列，且引入其以增加特定基因的表达或过度表达特定基因(例如，通过增加序列(例如基因)的拷贝数或引入强的或组成型的启动子来增加表达)。在另一个实施方案中，外源性核酸代表并非在将引入其的微生物中天然存在的核酸序列，且允许表达并非在所述微生物中天然存在的产物或增加所述微生物天然包含的基因的表达(例如，在引入诸如启动子的调节元件的情形下)。外源性核酸可被改造为适合于整合入将引入其的微生物的基因组中或保持染色体外的状态。
“外源性”也可以用来指蛋白。这是指产生重组微生物的亲本微生物中不存在的蛋白。
如本文中与重组微生物和核酸或蛋白关联使用的术语“内源性”是指在产生重组微生物的亲本微生物中存在的任何核酸或蛋白。
应了解，可使用序列与本文特别例示的序列不同、但只要其功能基本相同的核酸来实施本发明。对于编码蛋白或肽的核酸序列来说，这意味着所编码的蛋白或肽具有基本上相同的功能。对于代表启动子序列的核酸序列来说，变体序列将具有促进一种或多种基因的表达的能力。所述核酸在本文中可称为“功能等效变体”。举例来说，核酸的功能等效变体包括等位基因变体、基因片段、包括突变(缺失、插入、核苷酸取代等等)和/或多态性的基因等等。来自其它微生物的同源基因也可以被认为是本文中特别例示的序列的功能等效变体的例子。这些同源基因包括诸如以下种中的同源基因：丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、糖丁酸梭菌(C.saccharobutylicum)和糖乙酸多丁醇梭菌(C.saccharoperbutylacetonicum)，其详情在诸如Genbank或NCBI的网站上公开可得。短语“功能等效变体”也应被认为包括由于针对特别的生物体的密码子优化而发生序列变化的核酸。本文的核酸的“功能等效变体”将优选地与所识别的核酸具有至少约70％、优选约80％、更优选约85％、优选约90％、优选约95％或95％以上的核酸序列同一性。
还应了解，可使用序列与本文特别例示的氨基酸序列不同的多肽来实践本发明。这些变体在本文中可称为“功能等效变体”。蛋白或肽的功能等效变体包括这样的蛋白或肽：即其与所识别的蛋白或肽共享至少40％、优选50％、优选60％、优选70％、优选75％、优选80％、优选85％、优选90％、优选95％或95％以上的氨基酸同一性，且与目的肽或蛋白具有基本上相同的功能。所述变体在其范畴内包括蛋白或肽的片段，其中所述片段包含以下截短形式的多肽：其中可缺失1至5个、至10个、至15个、至20个、至25个氨基酸且可在多肽的任一末端自残基1延伸至25，以及其中可在此区内缺失任意长度；或可位于内部位置。本文所述特定多肽的功能等效变体也应该认为包括由例如前一段落中所例示的其它细菌种中的同源基因表达的多肽。
如本文所用的“基本上相同功能”打算意指作为核酸或多肽变体的核酸或多肽能执行所述核酸或多肽的功能。举例来说，本发明的酶的变体将能够与此酶催化相同的反应。然而，不应认为意指变体与产生所述变体的多肽或核酸具有相同水平的活性。
人们能够使用任意数量的已知方法来估计功能等效变体是否与产生所述变体的核酸或多肽具有基本上相同的功能。然而，举例来说，Silver等人(1991,PlantPhysiol.97:1588-1591)或Zhao等人(2011,Appl Microbiol Biotechnol,90:1915-1922)描述了关于异戊二烯合酶的方法、Green等人(2007,Phytochemistry；68:176-188)描述了关于法呢烯合酶的方法、Kuzuyama等人(2000,J.Bacteriol.182,891-897)描述了关于1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶Dxs的方法、Berndt和Schlegel(1975,Arch.Microbiol.103,21-30)或Stim-Herndon等人(1995,Gene 154:81-85)描述了关于硫解酶的方法、Cabano等人(1997,Insect Biochem.Mol.Biol.27:499-505)描述了关于HMG-CoA合酶的方法、Ma等人(2011,Metab.Engin.,13:588-597)描述了关于HMG-CoA还原酶和甲羟戊酸激酶的方法、Herdendorf和Miziorko(2007,Biochemistry,46:11780-8)描述了关于磷酸甲羟戊酸激酶的方法以及Krepkiy等人(2004,Protein Sci.13:1875-1881)描述了关于二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的方法。也可能如Trutko等人(2005,Microbiology 74:153-158)所述使用如膦胺霉素(fosmidomycin)或美舒林(mevinoline)的抑制剂来识别DXS和甲羟戊酸途径的基因。
“过度表达(Over-express)”、“过度的表达(over expression)”等术语和短语在用于本发明时应被广义地认为包括与亲本微生物的蛋白(包括核酸)在相同条件下的表达水平相比，一种或多种蛋白的表达(包括一种或多种编码所述蛋白的核酸的表达)的任意增加。不应认为意指以任何特定水平表达所述蛋白(或核酸)。
“亲本微生物”是用于产生本发明的重组微生物的微生物。亲本微生物可为天然存在的微生物(即，野生型微生物)或先前经过修饰但不表达或不过度表达作为本发明主题的一种或多种酶的微生物。因此，本发明的重组微生物可经修饰来表达或过度表达一种或多种未在亲本微生物中表达或过度表达的酶。
术语核酸“构建体”或“载体”等术语应被广义地认为包括适合用作用于将遗传物质转移至细胞中的载体的任何核酸(包括DNA和RNA)。术语应被认为包括质粒、病毒(包括噬菌体)、粘粒和人工染色体。构建体或载体可包括一种或多种调节元件、复制起点、多克隆位点和/或选择标记。在一个具体实施方案中，构建体或载体被改造为适合于允许表达一种或多种由所述构建体或载体编码的基因。核酸构建体或载体包括裸核酸以及与一种或多种试剂一起配制以有利于递送至细胞的核酸(例如，脂质体缀合的核酸，含有所述核酸的生物体)。
如本文提到的“萜烯”应被广义地认为包括由连接在一起的C5异戊二烯单元组成的任何化合物，包括简单和复杂萜烯以及含氧萜烯化合物，诸如醇类、醛类和酮类。简单萜烯可在植物(诸如，针叶树)的精油和树脂中发现。更复杂的萜烯包括萜类化合物和维生素A、类胡萝卜素色素(诸如番茄红素)、角鲨烯和橡胶。单萜烯的例子包括(但不限于)异戊二烯、蒎烯、橙花醇、柠檬醛、樟脑、薄荷醇、柠檬烯。倍半萜烯的例子包括(但不限于)橙花叔醇、法尼醇。二萜烯的例子包括(但不限于)植醇、维生素A1。角鲨烯是三萜烯的例子且胡萝卜素(原维生素A1)是四萜烯。
“萜烯前体”是在由乙酰基CoA和任选的丙酮酸开始形成萜烯的反应期间产生的化合物或中间体。此术语是指在甲羟戊酸(MVA)途径和任选的DXS途径中发现的前体化合物或中间体以及较长链萜烯的下游前体，诸如FPP和GPP。在具体实施方案中，包括(但不限于)甲羟戊酸、IPP、二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)、香叶基焦磷酸(GPP)和法呢基焦磷酸(FPP)。
“DXS途径”是由丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸至DMAPP或IPP的酶促途径。也称为脱氧木酮糖5-磷酸(DXP/DXPS/DOXP或DXS)/甲基赤藻糖醇磷酸(MEP)途径。
“甲羟戊酸(MVA)途径”是由乙酰基-CoA至IPP的酶促途径。
微生物
已知两种产生萜烯的途径，由丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸(G3P)(这是糖酵解中的两种重要中间体)开始的脱氧木酮糖5-磷酸(DXP/DXPS/DOXP或DXS)/甲基赤藻糖醇磷酸(MEP)途径(Hunter等人,2007,J.Biol.chem.282:21573-77)，和由乙酰基-CoA开始的甲羟戊酸(MVA)途径(Miziorko,2011,Arch Biochem Biophys,505:131-143)。已研究许多不同种类的微生物中是否存在任一所述途径(Lange等人,2000,PNAS,97:13172-77；Trutko等人,2005,Microbiology,74:153-158；Julsing等人,2007,Appl Microbiol Biotechnol,75:1377-84)，但并非一氧化碳营养型产乙酸菌。例如发现在大肠杆菌、芽孢杆菌(Bacillus)或分枝杆菌(Mycobacterium)中存在DXS途径，而在酵母酵母菌(Saccharomyces)、绿曲挠菌(Cloroflexus)或粘球菌(Myxococcus)中存在甲羟戊酸途径。
本发明人分析一氧化碳营养型产乙酸菌自产乙醇梭菌、杨氏梭菌的基因组是否存在两种途径中的任一种。在自产乙醇梭菌和杨氏梭菌中识别到DXS途径的所有基因(表1)，而不存在甲羟戊酸途径。另外，尚不知诸如自产乙醇梭菌或杨氏梭菌的一氧化碳营养型产乙酸菌产生任何萜烯作为代谢最终产物。
表1：在自产乙醇梭菌和杨氏梭菌中识别的DXS途径的萜烯生物合成基因：
Figure BDA0002395653970000261
在两种生物体中也识别到自异戊二烯单元下游合成萜烯的基因(表2)。
Figure BDA0002395653970000271
萜烯是能量密集型化合物，且其合成需要细胞以三磷酸核苷(诸如ATP)的形式投入能量。使用糖作为底物需要由糖酵解供应足够的能量以产生几个分子的ATP。通过使用糖作为底物的DXS途径进行的萜烯和/或其前体生产是由于丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸(G3P)的可用性而以相对直接的方式进行，G3P来源于C5戊糖和C6己糖。这些C5和C6分子因此被相对容易地转化成构成萜烯的C5异戊二烯单元。
对于使用如CO或CO2的C1底物的厌氧产乙酸菌来说，更难由C1单元合成诸如半萜类化合物的长分子。对于如C10单萜烯、C15倍半萜烯或C40四萜烯的较长链萜烯来说尤其如此。迄今为止，在产乙酸菌(天然和重组生物体)中报道的具有最多碳原子的产物是C4化合物丁醇(
Figure BDA0002395653970000272
等人,2011,Curr.Opin.Biotechnol.22:320-325；Schiel-Bengelsdorf和Dürre,2012,F EBS Letters:10.1016/j.febslet.2012.04.043；
Figure BDA0002395653970000274
等人,2011,Proc.Nat.Sc i.U.S.A.107:13087-92；美国专利2011/0236941)和2,3-丁二醇(
Figure BDA0002395653970000273
等人,2011,Appl.Environ.Microbiol.77:5467-75)。本发明人已证实，可能令人惊讶地使用C1原料CO通过乙酰基CoA中间体以厌氧方法产生这些较长链得萜烯分子。
厌氧产乙酸菌的Wood-Ljungdahl途径的能量学是刚刚兴起的，但与在需氧生长条件下或糖发酵生物体的糖酵解不同，在Wood-Ljungdahl途径中通过底物水平的磷酸化作用未获得ATP，实际上，将CO2活化为甲酸盐实际上需要一分子的ATP且需要膜梯度。本发明人注意到，重要的是用于形成产物的途径是节能的。本发明人注意到，在产乙酸菌中，底物CO或CO2被直接引入乙酰基-CoA中，这代表了产生萜烯和/或其前体的最直接途径，尤其在与糖基系统比较时，只需要六次反应(图1)。尽管在一氧化碳营养型产乙酸菌中可用较少的ATP，但本发明人相信这种更直接的途径可维持更高的代谢通量(由于中间体反应的较高化学动力)。高度有效的代谢通量是重要的，因为萜烯生物合成途径中的几种中间体(诸如重要中间体甲羟戊酸和FPP)在未被有效代谢回转时对大多数细菌有毒。
尽管具有较高的ATP可用性，但此中间体毒性问题可成为由糖生产萜烯的瓶颈。
在比较通过甲羟戊酸途径和DXS途径由CO生产萜烯前体IPP和DMAPP的能量学时(图6)，本发明人注意到甲羟戊酸途径与DXS途径相比需要较少的三磷酸核苷作为ATP、较少的还原当量而且也更直接，由乙酰基-CoA开始只有六个必要的反应步骤。这在反应速度和代谢通量方面提供了优势且增加了总体能量效率。另外，所需酶的较少数量简化了产生重组微生物所需的重组方法。
未识别到具有甲羟戊酸途径的产乙酸菌，但本发明人已证实，可能向诸如自产乙醇梭菌或杨氏梭菌的一氧化碳营养型产乙酸菌中引入甲羟戊酸途径和任选的DXS途径以由C1碳底物CO有效产生萜烯和/或其前体。预期此可适用于所有一氧化碳营养型产乙酸的微生物。
另外，尚未证实可能使用重组微生物在厌氧条件下产生萜烯和/或其前体。厌氧产生异戊二烯具有提供更安全的操作环境的优势，因为异戊二烯在氧气存在下极易燃且在室温和大气压力下具有1.5-2.0％的可燃下限(LFL)和2.0-12％的可燃上限(UFL)。由于在不存在氧气时无法发生燃烧，因此本发明人相信厌氧发酵方法是合乎需要的，因为它在所有产物浓度、气体组成、温度和压力范围内将更安全。
如前文论述，本发明提供能够通过发酵包含CO的底物产生一种或多种萜烯和/或其前体以及任选的一种或多种其它产物的重组微生物。
在另一个实施方案中，将微生物改造为适合于：
表达来自甲羟戊酸(MVA)途径的一种或多种外源性酶和/或过度表达来自甲羟戊酸(MVA)途径的一种或多种内源性酶；和
a)表达来自DXS途径的一种或多种外源性酶和/或过度表达来自DXS途径的一种或多种内源性酶。
在一个实施方案中，产生重组微生物的亲本微生物能够发酵包含CO的底物而产生乙酰基CoA，但无法使乙酰基CoA转化成甲羟戊酸或异戊烯基焦磷酸(IPP)，且将重组微生物改造为适合于表达在甲羟戊酸途径中所涉及的一种或多种酶。
微生物可被改造为适合于通过任意数量重组方法来表达或过度表达一种或多种酶，所述重组方法包括例如增加所述微生物中天然基因的表达(例如，通过引入更强或组成型的启动子来驱动基因的表达)、通过引入编码特定酶且被改造为适合于表达此酶的外源性核酸来增加编码此酶的基因的拷贝数、引入编码并非在亲本微生物中天然存在的酶且被改造为适合于表达此酶的外源性核酸。
在一个实施方案中，所述一种或多种酶来自甲羟戊酸(MVA)途径且选自：
a)硫解酶(EC 2.3.1.9)、
b)HMG-CoA合酶(EC 2.3.3.10)、
c)HMG-CoA还原酶(EC 1.1.1.88)、
d)甲羟戊酸激酶(EC 2.7.1.36)、
e)磷酸甲羟戊酸激酶(EC 2.7.4.2)、
f)二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(EC 4.1.1.33)，和
g)它们的任一种的功能等效变体。
在另一个实施方案中，任选的一种或多种酶来自DXS途径且选自：
a)1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶DXS(EC:2.2.1.7)、
b)1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶DXR(EC:1.1.1.267)、
c)2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸胞苷酰基转移酶IspD(EC:2.7.7.60)、
d)4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藻糖醇激酶IspE(EC:2.7.1.148)、
e)2-C-甲基-D-赤藻糖醇2,4-环二磷酸合酶IspF(EC:4.6.1.12)、
f)4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合酶IspG(EC:1.17.7.1)、
g)4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶(EC:1.17.1.2)，和
h)它们的任一种的功能等效变体。
在另一个实施方案中，一种或多种外源性或内源性的其它酶被表达或过度表达以导致产生萜烯化合物和/或其前体，其中所表达的外源性酶或过度表达的内源性酶选自：
a)香叶基转移酶Fps(EC:2.5.1.10)、
b)七异戊烯基二磷酸合酶(EC:2.5.1.10)、
c)八异戊烯基二磷酸合酶(EC:2.5.1.90)、
d)异戊二烯合酶(EC 4.2.3.27)、
e)异戊烯基二磷酸δ-异构酶(EC EC 5.3.3.2)、
f)法呢烯合酶(EC 4.2.3.46/EC 4.2.3.47)，和
g)它们的任一种的功能等效变体。
只举例来说，每种酶的序列信息列在本文的图中。
在本发明的微生物中使用的酶可来源于任何适当来源，包括不同的细菌属和物种或其它生物体。然而，在一个实施方案中，所述酶源自金黄色葡萄球菌。
在一个实施方案中，酶异戊二烯合酶(ispS)来源于山杨(Poplar tremuloides)。在另一个实施方案中，其具有下文SEQ ID NO:21中例示的核酸序列或是其功能等效变体。
在一个实施方案中，酶脱氧木酮糖5-磷酸合酶来源于自产乙醇梭菌，由下文SEQID NO:1中例示的核酸序列编码和/或具有下文SEQ ID NO:2中例示的氨基酸序列，或是其功能等效变体。
在一个实施方案中，酶1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶DXR来源于自产乙醇梭菌且由SEQ ID NO:3中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
在一个实施方案中，酶2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸胞苷酰基转移酶IspD来源于自产乙醇梭菌且由SEQ ID NO:5中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
在一个实施方案中，酶4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藻糖醇激酶IspE来源于自产乙醇梭菌且由SEQ ID NO:7中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
在一个实施方案中，酶2-C-甲基-D-赤藻糖醇2,4-环二磷酸合酶IspF来源于自产乙醇梭菌且由SEQ ID NO:9中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
在一个实施方案中，酶4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合酶IspG来源于自产乙醇梭菌且由SEQ ID NO:11中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
在一个实施方案中，酶4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶来源于自产乙醇梭菌且由SEQ ID NO:13中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
在一个实施方案中，酶甲羟戊酸激酶(MK)来源于金黄色葡萄球菌亚种金色类群Mu50且由下文SEQ ID NO:51中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
在一个实施方案中，酶磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)来源于金黄色葡萄球菌亚种金色类群Mu50且由下文SEQ ID NO:52中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
在一个实施方案中，酶二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMD)来源于金黄色葡萄球菌亚种金色类群Mu50且由下文SEQ ID NO:53中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
在一个实施方案中，酶异戊烯基二磷酸δ-异构酶(idi)来源于拜氏梭菌且由下文SEQ ID NO:54中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
在一个实施方案中，酶硫解酶(thIA)来源于丙酮丁醇梭菌ATCC824且由下文SEQID NO:40中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
在一个实施方案中，酶是硫解酶，且是来源于金黄色葡萄球菌亚种金黄色类群Mu50的乙酰基-CoAc-乙酰基转移酶(vraB)且由下文SEQ ID NO:41中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
在一个实施方案中，酶3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA合酶(HMGS)来源于金黄色葡萄球菌亚种金色类群Mu50且由下文SEQ ID NO:42中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
在一个实施方案中，酶羟基甲基戊二酰-CoA还原酶(HMGR)来源于金黄色葡萄球菌亚种金色类群Mu50且由下文SEQ ID NO:43中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
在一个实施方案中，酶香叶基转移酶(ispA)来源于大肠杆菌菌株(Escherichiacoli str.)K-12亚菌株(substr)MG1655，由下文SEQ ID NO:56中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
在一个实施方案中，酶七异戊烯基二磷酸合酶来源于自产乙醇梭菌且由SEQ IDNO:17中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
在一个实施方案中，酶聚异戊烯基合酶来源于自产乙醇梭菌且由SEQ ID NO:19中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
在一个实施方案中，酶α-法呢烯合酶(FS)来源于苹果且由下文SEQ ID NO:57中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
可通过本领域技术人员已知的测定法来识别在微生物中使用的酶和功能变体。在具体实施方案中，可通过Silver等人(1991,Plant Physiol.97:1588-1591)或Zhao等人(2011,Appl Microbiol Biotechnol,90:1915-1922)概述的方法来识别酶异戊二烯合酶。在另一具体实施方案中，可通过Green等人,2007,Phytochemistry；68:176-188中概述的方法来识别酶法呢烯合酶。在其它具体实施方案中，可通过Cabano等人(1997,InsectBiochem.Mol.Biol.27:499-505)关于HMG-CoA合酶、Ma等人(2011,Metab.Engin.,13:588-597)关于HMG-CoA还原酶和甲羟戊酸激酶、Herdendorf和Miziorko(2007,Biochemistry,46:11780-8)关于磷酸甲羟戊酸激酶以及Krepkiy等人(2004,Protein Sci.13:1875-1881)关于二磷酸甲羟戊酸脱羧酶所概述的方法来识别来自甲羟戊酸途径的酶。Ma等人,2011,Metab.Engin.,13:588-597。可使用Kuzuyama等人(2000,J.Bacteriol.182,891-897)中概述的方法来测定DXS途径的1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶。也可能如Trutko等人(2005,Microbiology74:153-158)所述使用如膦胺霉素或美舒林的抑制剂来识别DXS和甲羟戊酸途径的基因。
在一个实施方案中，微生物包含被改造为适合于增加一种或多种内源性核酸的表达的一种或多种外源性核酸，且所述一种或多种内源性核酸编码前文提到的一种或多种酶。在一个实施方案中，被改造为适合于增加表达的一种或多种外源性核酸是调节元件。在一个实施方案中，调节元件是启动子。在一个实施方案中，启动子是优选地在适当发酵条件下具有高度活性的组成型启动子。也可以使用诱导型启动子。在优选的实施方案中，启动子选自Wood-Ljungdahl基因簇或磷酸转乙酰酶/乙酸激酶操纵子启动子。本领域技术人员将了解，可指导表达，优选地是在适当发酵条件下的高水平表达的其它启动子将有效作为所例示实施方案的替代方案。
在一个实施方案中，微生物包含编码前文提到的一种或多种所述酶且被改造为适合于表达所述酶的一种或多种外源性核酸。在一个实施方案中，微生物包含编码至少两种所述酶且被改造为适合于表达所述酶的一种或多种外源性核酸。在其它实施方案中，微生物包含编码至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或九种以上所述酶且被改造为适合于表达所述酶的一种或多种外源性核酸。
在一个具体实施方案中，微生物包含编码本发明的酶或其功能等效变体的一种或多种外源性核酸。
微生物可包含一种或多种外源性核酸。当需要用两个或两个以上遗传元件(诸如基因或调节元件(例如启动子))转化亲本微生物时，它们可被包含在一种或多种外源性核酸上。
在一个实施方案中，所述一种或多种外源性核酸是核酸构建体或载体，在一个具体实施方案中是编码任何组合形式的一种或多种前文提到的酶的质粒。
外源性核酸在亲本微生物转化时可保持在染色体外，或可整合到亲本微生物的基因组中。因此，其可包括被改造为适合于辅助整合的额外核苷酸序列(例如，允许同源重组和靶向整合到宿主基因组中的区域)或被改造为适合于表达以及复制染色体外构建体的额外核苷酸序列(例如，复制起点、启动子和其它调节元件或序列)。
在一个实施方案中，编码如前文提到的一种或多种酶的外源性核酸将还包含被改造为适合于促进由外源性核酸编码的一种或多种酶的表达的启动子。在一个实施方案中，启动子是优选地在适当发酵条件下具有高度活性的组成型启动子。也可以使用诱导型启动子。在优选的实施方案中，启动子选自Wood-Ljungdahl基因簇和磷酸转乙酰酶/乙酸激酶启动子。本领域技术人员将了解，可指导表达，优选是在适当发酵条件下的高水平表达的其它启动子将有效作为所例示实施方案的替代方案。
在一个实施方案中，外源性核酸是表达质粒。
在一个具体实施方案中，亲本微生物选自一氧化碳营养型产乙酸的细菌。在某些实施方案中，微生物选自：自产乙醇梭菌、杨氏梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌、德雷克氏梭菌、粪味梭菌、醋酸梭菌、蚁酸醋酸梭菌、大梭菌、食甲基丁酸杆菌、伍氏醋酸杆菌、巴氏嗜碱菌、延长布劳特氏菌、粘液真杆菌、热醋穆尔氏菌、热自养穆尔氏菌、卵形鼠孢菌、森林乙酸香蕉孢菌、类球鼠孢菌、普氏产醋杆菌和凯伍热厌氧杆状菌。
在一个具体实施方案中，亲本微生物选自产乙醇、产乙酸的梭菌属的簇，包含种自产乙醇梭菌、杨氏梭菌和拉氏梭菌以及相关分离株。这些包括(但不限于)菌株自产乙醇梭菌JAI-1T(DSM10061)[Abrini J,Naveau H,Nyns E-J:Clostridium autoethanogenum,sp.nov.,an anaerobic bacterium that produces ethanol from carbonmonoxide.Arch Microbiol 1994,4:345-351]、自产乙醇梭菌LBS1560(DSM19630)[SimpsonSD,Forster RL,Tran PT,Rowe MJ,Warner IL:Novel bacteria and methods thereof.国际专利2009,WO/2009/064200]、自产乙醇梭菌LBS1561(DSM23693)、杨氏梭菌PETCT(DSM13528＝ATCC 55383)[Tanner RS,Miller LM,Yang D:Clostridium ljungdahliisp.nov.,an Acetogenic Species in Clostridial rRNAHomology Group I.Int J SystBacteriol 1993,43:232-236]、杨氏梭菌ERI-2(ATCC 55380)[Gaddy JL:Clostridiumstain which produces acetic acid from waste gases.美国专利1997,5,593,886]、杨氏梭菌C-01(ATCC 55988)[Gaddy JL,Clausen EC,Ko C-W:Microbial process for thepreparation of acetic acid as well as solvent for its extraction from thefermentation broth.美国专利,2002,6,368,819]、杨氏梭菌O-52(ATCC 55989)[GaddyJL,Clausen EC,Ko C-W:Microbial process for the preparation of acetic acid aswell as solvent for its extraction from the fermentation broth.美国专利,2002,6,368,819]、拉氏梭菌P11T(ATCC BAA-622)[Huhnke RL,Lewis RS,Tanner RS:Isolationand Characterization of novel Clostridial Species.国际专利2008,WO 2008/028055]、相关分离株(诸如“C.coskatii”[Zahn等人-Novel ethanologenic speciesClostridium coskatii(美国专利申请号US20110229947)]和“梭菌属种(Clostridiumsp.)”(Tyurin等人,2012,J.Biotech Res.4:1-12))，或突变菌株(诸如杨氏梭菌OTA-1(Tirado-Acevedo O.Production of Bioethanol from Synthesis Gas UsingClostridium ljungdahlii.PhD论文，北卡罗莱纳州立大学(North Carolina StateUniversity),2010))。这些菌株形成梭菌属rRNA簇I中的亚簇，且其16S rRNA基因具有99％以上的同一性，及类似的约30％的低GC含量。然而，DNA-DNA重新缔合和DNA指纹实验证实这些菌株属于不同的种[Huhnke RL,Lewis RS,Tanner RS:Isolation andCharacterization of novel Clostridial Species.国际专利2008,WO 2008/028055]。
此簇的所有种具有类似的形态和大小(对数生长细胞在0.5-0.7x 3-5μm之间)，是嗜温性的(最佳生长温度在30至37℃之间)且严格的厌氧菌[Tanner RS,Miller LM,YangD:Clostridium ljungdahlii sp.nov.,an Acetogenic Species in ClostridialrRNAHomology Group I.Int J Syst Bacteriol 1993,43:232-236；Abrini J,Naveau H,Nyns E-J:Clostridium autoethanogenum,sp.nov.,an anaerobic bacterium thatproduces ethanol from carbon monoxide.Arch Microbiol 1994,4:345-351；HuhnkeRL,Lewis RS,Tanner RS:Isolation and Characterization of novel ClostridialSpecies.国际专利2008,WO 2008/028055]。此外，其全部共有相同的主要系统发育特征，诸如相同的pH范围(pH 4-7.5，最佳的初始pH为5.5至6)，以含CO气体的强烈自养生长(具有类似的生长速率)，以及类似的代谢分布，以乙醇和乙酸作为主要的发酵最终产物且在某些条件下形成小量2,3-丁二醇和乳酸[Tanner RS,Miller LM,Yang D:Clostridiumljungdahlii sp.nov.,an Acetogenic Species in Clostridial rRNAHomology GroupI.Int J Syst Bacteriol 1993,43:232-236；Abrini J,Naveau H,Nyns E-J:Clostridiumautoethanogenum,sp.nov.,an anaerobic bacterium that produces ethanol fromcarbon monoxide.Arch Microbiol 1994,4:345-351；Huhnke RL,Lewis RS,Tanner RS:Isolation and Characterization of novel Clostridial Species.国际专利2008,WO2008/028055]。对于所有三种物种也观察到产生吲哚。然而，所述物种的不同在于各种糖(例如，鼠李糖、阿拉伯糖)、酸(例如，葡糖酸盐、柠檬酸盐)、氨基酸(例如，精氨酸、组氨酸)或其它底物(例如，甜菜碱、丁醇)的底物使用。此外，发现一些物种对某些维生素(例如，硫胺素、生物素)存在营养缺陷，而其它物种则不存在营养缺陷。
在一个实施方案中，亲本一氧化碳营养型产乙酸的微生物选自自产乙醇梭菌、杨氏梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌、德雷克氏梭菌、粪味梭菌、粘液丁酸杆菌(Butyribacterium limosum)、食甲基丁酸杆菌、伍氏醋酸杆菌、巴氏嗜碱菌、延长布劳特氏菌、粘液真杆菌、热醋穆尔氏菌、热自养穆尔氏菌、普氏产醋杆菌和凯伍热厌氧杆状菌。
在第一或第二方面的一个特别实施方案中，亲本微生物选自包含以下的一氧化碳营养型梭菌属：自产乙醇梭菌、杨氏梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌、德雷克氏梭菌、粪味梭菌、醋酸梭菌、蚁酸醋酸梭菌、大梭菌。
在一个实施方案中，微生物选自包含以下种的一氧化碳营养型梭菌属的簇：自产乙醇梭菌、杨氏梭菌和“拉氏梭菌”以及相关分离株。这些梭菌包括(但不限于)菌株自产乙醇梭菌JAI-1T(DSM10061)(Abrini,Naveau,&Nyns,1994)、自产乙醇梭菌LBS1560(DSM19630)(WO/2009/064200)、自产乙醇梭菌LBS1561(DSM23693)、杨氏梭菌PETCT(DSM13528＝ATCC 55383)(Tanner,Miller,&Yang,1993)、杨氏梭菌ERI-2(ATCC 55380)(美国专利5,593,886)、杨氏梭菌C-01(ATCC 55988)(美国专利6,368,819)、杨氏梭菌O-52(ATCC 55989)(美国专利6,368,819)或“拉氏梭菌P11T“(ATCC BAA-622)(WO 2008/028055)，以及相关分离株(诸如“C.coskatii”(美国专利2011/0229947)、“梭菌属种MT351”(Michael Tyurin&Kiriukhin,2012))及其突变菌株(诸如杨氏梭菌OTA-1(Tirado-AcevedoO.Production of Bioethanol from Synthesis Gas Using Clostridiumljungdahlii.PhD论文，北卡罗莱纳州立大学，2010))。
这些菌株形成梭菌属rRNA簇I中的亚簇(Collins等人，1994)，其在16S rRNA基因水平上具有至少99％的同一性，但是如由DNA-DNA重新缔合和DNA指纹实验所确定是不同的物种(WO 2008/028055，美国专利2011/0229947)。
此簇的菌株是由共同特征来定义，具有类似的基因型和表型，且其全部共有相同的能量守恒和发酵性代谢模式。此簇的菌株缺少细胞色素且通过Rnf复合物保存能量。
此簇的所有菌株都具有约4.2MBp的基因组大小(
Figure BDA0002395653970000381
等人,2010)和约32％mol的GC组成(Abrini等人,1994；
Figure BDA0002395653970000382
等人,2010；Tanner等人,1993)(WO 2008/028055；美国专利2011/0229947)，以及编码以下酶的保守性的必需关键基因操纵子：Wood-Ljungdahl途径的酶(一氧化碳脱氢酶、甲酰基-四氢叶酸合成酶、亚甲基-四氢叶酸脱氢酶、甲酰基-四氢叶酸环化水解酶、亚甲基-四氢叶酸还原酶和一氧化碳脱氢酶/乙酰基-CoA合酶)、氢化酶、甲酸脱氢酶、Rnf复合物(rnfCDGEAB)、丙酮酸:铁氧化还原蛋白氧化还原酶、醛:铁氧化还原蛋白氧化还原酶(
Figure BDA0002395653970000383
等人,2010,2011)。已发现负责气体吸收的Wood-Ljungdahl途径基因的组成和数量在所有物种中都相同，但核酸和氨基酸序列不同(
Figure BDA0002395653970000384
等人,2011)。
菌株全部具有类似的形态和大小(对数生长细胞在0.5-0.7x3-5μm之间)，是嗜温性的(最佳生长温度在30至37℃之间)且严格的厌氧菌(Abrini等人,1994；Tanner等人,1993)(WO 2008/028055)。此外，其全部共有相同的主要系统发育特征，诸如相同的pH范围(pH 4-7.5，最佳的初始pH为5.5至6)，以含CO气体的强烈自养生长(具有类似的生长速率)，和代谢分布，以乙醇和乙酸作为主要的发酵最终产物且在某些条件下形成小量2,3-丁二醇和乳酸(Abrini等人,1994；
Figure BDA0002395653970000385
等人,20121；Tanner等人,1993)。然而，所述物种的不同在于各种糖(例如，鼠李糖、阿拉伯糖)、酸(例如，葡糖酸盐、柠檬酸盐)、氨基酸(例如，精氨酸、组氨酸)或其它底物(例如，甜菜碱、丁醇)的底物使用。发现一些物种对某些维生素(例如，硫胺素、生物素)存在营养缺陷，而其它物种则不存在营养缺陷。已证实在许多这些生物体中羧酸被还原成其相应的醇(Perez,Richter,Loftus,&Angenent,2012)。
因此，所述特征并非是如自产乙醇梭菌或杨氏梭菌的一种生物体所特有，而是一氧化碳营养型乙醇合成的梭菌属的共同特征。因此，可预期本发明适用于所有这些菌株，尽管在性能方面可能存在差异。
可使用本领域中已知的用于产生重组微生物的任意数量的技术，由亲本一氧化碳营养型产乙酸的微生物和一种或多种外源性核酸来制备本发明的重组的一氧化碳营养型产乙酸的微生物。仅举例来说，可通过电穿孔、电融合、超声波处理、聚乙二醇介导的转化、接合或化学和天然感受态来实现转化(包括转导或转染)。合适的转化技术例如在SambrookJ,Fritsch EF,Maniatis T:Molecular Cloning:A laboratory Manual,Cold SpringHarbour Labrotary Press,Cold Spring Harbour,1989中描述。
电穿孔已被记载用于以下数种一氧化碳营养型产乙酸菌：如杨氏梭菌(
Figure BDA0002395653970000392
等人,2010；Leang,Ueki,Nevin,&Lovley,2012)(PCT/NZ2011/000203；WO2012/053905)、自产乙醇梭菌(PCT/NZ2011/000203；WO2012/053905)、伍氏醋酸杆菌(
Figure BDA0002395653970000391
Sauer,Kuhn,&Dürre,1994)或热醋穆尔氏菌(Kita等人,2012)，且其是在诸如丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)(Mermelstein,Welker,Bennett,&Papoutsakis,1992)、解纤维梭菌(C.cellulolyticum)(Jennert,Tardif,Young,&Young,2000)或热纤梭菌(C.thermocellum)(MV Tyurin,Desai,&Lynd,2004)的多种梭菌属(Clostridia)中使用的标准方法。
电融合已被记载用于产乙酸梭菌属种MT351(Tyurin和Kiriukhin,2012)。
原噬菌体诱导已被记载用于一氧化碳营养型产乙酸菌以及在粪味梭菌(C.scatologenes)的情形下(Prasanna Tamarapu Parthasarathy,2010,Development ofa Genetic Modification System in Clostridium scatologenes ATCC 25775forGeneration of Mutants,西肯塔基大学硕士项目(Masters Project Western KentuckyUniversity))。
接合已被记载作为选择用于产乙酸菌艰难梭菌(Clostridium difficile)(Herbert,O’Keeffe,Purdy,Elmore,&Minton,2003)和多种其它梭菌属(包括丙酮丁醇梭菌(C.acetobuylicum))(Williams,Young,&Young,1990)的方法。
在一个实施方案中，亲本菌株使用CO作为其唯一的碳和能量来源。
在一个实施方案中，亲本微生物是自产乙醇梭菌或杨氏梭菌。在一个具体实施方案中，微生物是自产乙醇梭菌DSM23693。在另一个具体实施方案中，微生物是杨氏梭菌DSM13528(或ATCC55383)。
核酸
本发明还提供用于产生本发明的重组微生物的一种或多种核酸或核酸构建体。
在一个实施方案中，核酸包含编码甲羟戊酸(MVA)途径和任选的DXS途径中的一种或多种酶的序列，所述酶在微生物中表达时使得所述微生物可通过发酵包含CO的底物来产生一种或多种萜烯和/或其前体。在一个具体实施方案中，本发明提供编码两种或两种以上酶的核酸，所述酶在微生物中表达时使得所述微生物可通过发酵包含CO的底物来产生一种或多种萜烯和/或其前体。在一个实施方案中，本发明的核酸编码三种、四种、五种或五种以上所述酶。
在一个实施方案中，核酸编码的一种或多种酶是来自甲羟戊酸(MVA)途径且选自：
a)硫解酶(EC 2.3.1.9)、
b)HMG-CoA合酶(EC 2.3.3.10)、
c)HMG-CoA还原酶(EC 1.1.1.88)、
d)甲羟戊酸激酶(EC 2.7.1.36)、
e)磷酸甲羟戊酸激酶(EC 2.7.4.2)、
f)二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(EC 4.1.1.33)，和
g)它们的任一种的功能等效变体。
在另一个实施方案中，核酸编码的一种或多种任选的酶是来自DXS途径且选自：
a)1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶DXS(EC:2.2.1.7)、
b)1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶DXR(EC:1.1.1.267)、
c)2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸胞苷酰基转移酶IspD(EC:2.7.7.60)、
d)4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藻糖醇激酶IspE(EC:2.7.1.148)、
e)2-C-甲基-D-赤藻糖醇2,4-环二磷酸合酶IspF(EC:4.6.1.12)、
f)4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合酶IspG(EC:1.17.7.1)、
g)4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶(EC:1.17.1.2)，和
h)它们的任一种的功能等效变体。
在另一个实施方案中，核酸编码被表达或过度表达的一种或多种其它酶以导致产生萜烯化合物和/或其前体，其中被表达的外源性酶或被过度表达的内源性酶选自：
a)香叶基转移酶Fps(EC:2.5.1.10)、
b)七异戊烯基二磷酸合酶(EC:2.5.1.10)、
c)八异戊烯基二磷酸合酶(EC:2.5.1.90)、
d)异戊二烯合酶(EC 4.2.3.27)、
e)异戊烯基二磷酸δ-异构酶(EC EC 5.3.3.2)、
f)法呢烯合酶(EC 4.2.3.46/EC 4.2.3.47)，和
g)它们的任一种的功能等效变体。
编码上述每一种酶的例示性氨基酸序列和核酸序列在本文中被提供或可由如前文提到的GenBank获得。然而，考虑本文中所含的信息，本领域技术人员将易于了解GenBank和其它数据库中编码酶或其功能等效变体的替代核酸序列以及遗传密码。
在另一个实施方案中，编码来源于丙酮丁醇梭菌ATCC824的硫解酶(thIA)的核酸由下文SEQ ID NO:40中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
在另一个实施方案中，编码硫解酶的核酸(其中硫解酶是来源于金黄色葡萄球菌亚种金色类群Mu50的乙酰基-CoA c-乙酰基转移酶(vraB))由下文SEQ ID NO:41中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
在另一个实施方案中，编码来源于金黄色葡萄球菌亚种金色类群Mu50的3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA合酶(HMGS)的核酸由下文SEQ ID NO:42中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
在另一个实施方案中，编码来源于金黄色葡萄球菌亚种金色类群Mu50的羟基甲基戊二酰-CoA还原酶(HMGR)的核酸由下文SEQ ID NO:43中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
在另一个实施方案中，编码来源于金黄色葡萄球菌亚种金色类群Mu50的甲羟戊酸激酶(MK)的核酸由下文SEQ ID NO:51中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
在另一个实施方案中，编码来源于金黄色葡萄球菌亚种金色类群Mu50的磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)的核酸由下文SEQ ID NO:52中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
在另一个实施方案中，编码来源于金黄色葡萄球菌亚种金色类群Mu50的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMD)的核酸由下文SEQ ID NO:53中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
在另一个实施方案中，编码来源于自产乙醇梭菌的脱氧木酮糖5-磷酸合酶的核酸由下文SEQ ID NO:1中例示的核酸序列编码和/或具有下文SEQ ID NO:2中例示的氨基酸序列或是其功能等效变体。
在一个实施方案中，编码1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶DXR(EC:1.1.1.267)的核酸具有序列SEQ ID NO:3或是其功能等效变体。
在一个实施方案中，编码2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸胞苷酰基转移酶IspD(EC:2.7.7.60)的核酸具有序列SEQ ID NO:5或是其功能等效变体。
在一个实施方案中，编码4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藻糖醇激酶IspE(EC:2.7.1.148)的核酸具有序列SEQ ID NO:7或是其功能等效变体。
在一个实施方案中，编码2-C-甲基-D-赤藻糖醇2,4-环二磷酸合酶IspF(EC:4.6.1.12)的核酸具有序列SEQ ID NO:9或是其功能等效变体。
在一个实施方案中，编码4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合酶IspG(EC:1.17.7.1)的核酸具有序列SEQ ID NO:11或是其功能等效变体。
在一个实施方案中，编码4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶(EC:1.17.1.2)的核酸具有序列SEQ ID NO:13或是其功能等效变体。
在另一个实施方案中，编码来源于大肠杆菌菌株K-12亚菌株MG1655的香叶基转移酶(ispA)的核酸由下文SEQ ID NO:56中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
在一个实施方案中，编码七异戊烯基二磷酸合酶的核酸具有序列SEQ ID NO:17或是其功能等效变体。
在一个实施方案中，编码八异戊烯基二磷酸合酶(EC:2.5.1.90)的核酸(其中八异戊烯基二磷酸合酶是聚异戊烯基合成酶)由序列SEQ ID NO:19编码或是其功能等效变体。
在一个实施方案中，编码来源于山杨的异戊二烯合酶(ispS)的核酸在下文SEQ IDNO:21中例示或是其功能等效变体。
在另一个实施方案中，编码来源于拜氏梭菌的异戊烯基二磷酸δ-异构酶(idi)的核酸由下文SEQ ID NO:54中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
在另一个实施方案中，编码来源于苹果的α-法呢烯合酶(FS)的核酸由下文SEQ IDNO:57中例示的核酸序列编码或是其功能等效变体。
在一个实施方案中，本发明的核酸将还包含启动子。在一个实施方案中，启动子允许在其控制下的基因的组成型表达。然而，也可以采用诱导型启动子。本领域技术人员将易于了解在本发明中使用的启动子。启动子优选地可在适当发酵条件下指导高水平的表达。在一个具体实施方案中，使用Wood-Ljungdahl簇启动子。在另一个实施方案中，使用磷酸转乙酰酶/乙酸激酶启动子。在另一个实施方案中，丙酮酸:铁氧化还原蛋白氧化还原酶启动子、Rnf复合物操纵子启动子或ATP合酶操纵子启动子。在一个具体实施方案中，启动子来自自产乙醇梭菌。
本发明的核酸在亲本微生物转化时可保持在染色体外，或可被改造为适合整合到微生物的基因组中。因此，本发明的核酸可包括被改造为适合于辅助整合的额外核苷酸序列(例如，允许同源重组和定点整合到宿主基因组中的区域)或被改造为适合于稳定表达和复制染色体外构建体的额外核苷酸序列(例如，复制起点、启动子和其它调节序列)。
在一个实施方案中，核酸是核酸构建体或载体。在一个具体实施方案中，核酸构建体或载体是表达构建体或载体，然而本发明也涵盖其它构建体和载体，诸如用于克隆的那些。在一个具体实施方案中，表达构建体或载体是质粒。
应了解，如果需要，本发明的表达构建体/载体除启动子以及适合表达其它蛋白的其它基因以外，还可含有任意数量的调节元件。在一个实施方案中，表达构建体/载体包括一个启动子。在另一个实施方案中，表达构建体/载体包括两个或两个以上启动子。在一个具体实施方案中，表达构建体/载体对于每个将要表达的基因包括一个启动子。在一个实施方案中，表达构建体/载体包括一个或多个核糖体结合位点，优选对于每个将要表达的基因包括一个核糖体结合位点。
本领域技术人员应了解，本文所述的核酸序列和构建体/载体序列可含有标准接头核苷酸，诸如核糖体结合位点和/或限制位点需要的那些。所述接头序列不应被解释为是所需要的且不对所定义的序列施加限制。
可使用本领域中标准的任意数量的技术来构建核酸和核酸构建体，包括本发明的表达构建体/载体。举例来说，可使用化学合成或重组技术。所述技术例如记载于Sambrook等人(Molecular Cloning:A laboratory manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,NY,1989)中。其它例示技术在下文实施例部分中描述。个别基因和调节元件基本上将可操作性地彼此连接以使得所述基因可被表达以形成所需蛋白。本领域技术人员将了解用于本发明的合适载体。然而，举例来说，以下载体可以是合适的：pMTL80000载体、pIMP1、pJIR750和下文实施例部分中例示的质粒。
应了解，本发明的核酸可以是任何适当的形式，包括RNA、DNA或cDNA。
本发明还提供包含本文所述的任一种或多种核酸的宿主生物体，尤其是微生物且包括病毒、细菌和酵母。
产生生物体的方法
所述一种或多种外源性核酸可以裸核酸的形式递送至亲本微生物或可与一种或多种试剂一起配制以有利于转化过程(例如，脂质体缀合的核酸，其中含有核酸的生物体)。如果适当的话，一种或多种核酸可以是DNA、RNA或其组合。在某些实施方案中可使用限制性抑制剂；参考例如Murray,N.E.等人(2000)Microbial.Molec.Biol.Rev.64,412)。
可使用本领域中已知的用于产生重组微生物的任意数量技术，由亲本微生物和一种或多种外源性核酸来制备本发明的微生物。仅举例来说，可通过电穿孔、超声波处理、聚乙二醇介导的转化、化学或天然感受态或接合来实现转化(包括转导或转染)。合适的转化技术记载于例如Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T:Molecular Cloning:A laboratoryManual,Cold Spring Harbour Labrotary Press,Cold Spring Harbour,1989中。
在某些实施方案中，由于在将要转化的微生物中具有活性的限制性系统，有必要将待引入微生物中的核酸甲基化。这可以使用各种技术来进行，包括下文描述以及下文实施例部分中进一步例示的那些技术。
举例来说，在一个实施方案中，本发明的重组微生物是由包括以下步骤的方法产生：
b)向穿梭微生物中引入(i)如本文所述的表达构建体/载体和(ii)包含甲基转移酶基因的甲基化构建体/载体；
c)表达甲基转移酶基因；
d)自穿梭微生物分离一种或多种构建体/载体；和，
e)将一种或多种构建体/载体引入目标微生物中。
在一个实施方案中，组成型地表达步骤B的甲基转移酶基因。在另一个实施方案中，诱导步骤B的甲基转移酶基因的表达。
穿梭微生物是微生物，优选地是限制性阴性微生物，其有利于构成表达构建体/载体的核酸序列的甲基化作用。在一个具体实施方案中，穿梭微生物是限制性阴性大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)或乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。
甲基化构建体/载体包含编码甲基转移酶的核酸序列。
在将表达构建体/载体和甲基化构建体/载体引入穿梭微生物后，诱导甲基化构建体/载体上存在的甲基转移酶基因。诱导可以通过任何合适的启动子系统进行，但在本发明的一个具体实施方案中，甲基化构建体/载体包含诱导型lac启动子且是通过加入乳糖或其类似物(更优选地是异丙基-β-D-硫基-半乳糖苷(IPTG))来诱导。其它合适的启动子包括ara、tet或T7系统。在本发明的另一个实施方案中，甲基化构建体/载体启动子是组成型启动子。
在一个具体实施方案中，甲基化构建体/载体具有对所述穿梭微生物的种类具有特异性的复制起点以使得在穿梭微生物中表达在甲基化构建体/载体上存在的任何基因。表达构建体/载体优选地具有对所述目标微生物的种类具有特异性的复制起点以使得在所述目标微生物中表达在表达构建体/载体上存在的任何基因。
甲基转移酶的表达致使所述表达构建体/载体上存在的基因甲基化。然后可根据多种已知方法中的任一种自穿梭微生物分离表达构建体/载体。仅举例来说，下文所述实施例部分中所述的方法可用于分离表达构建体/载体。
在一个具体实施方案中，构建体/载体被同时分离。
可使用任意数量的已知方法将表达构建体/载体引入目标微生物中。然而，举例来说，可使用下文实施例部分中所述的方法。由于表达构建体/载体被甲基化，因此所述表达构建体/载体上存在的核酸序列能够被纳入至所述目标微生物中并被成功表达。
应想到甲基转移酶基因可被引入穿梭微生物中且过度表达。因此，在一个实施方案中，可使用已知方法收集所得到的甲基转移酶并在体外用于将表达质粒甲基化。然后可将所述表达构建体/载体引入所述目标微生物中用于进行表达。在另一个实施方案中，将甲基转移酶基因引入所述穿梭微生物的基因组中、接着将所述表达构建体/载体引入所述穿梭微生物中、自所述穿梭微生物分离一种或多种构建体/载体且然后将所述表达构建体/载体引入所述目标微生物中。
应想到如上文定义的表达构建体/载体和甲基化构建体/载体可被合并来提供物质组合物。所述组合物在回避限制性障碍机制中特别有用以产生本发明的重组微生物。
在一个具体实施方案中，所述表达构建体/载体和/或甲基化构建体/载体是质粒。
本领域技术人员将了解用于产生本发明的微生物的多种合适的甲基转移酶。然而，举例来说，可使用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)噬菌体ΦT1甲基转移酶和下文实施例中所述的甲基转移酶。在一个实施方案中，甲基转移酶具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列或是其功能等效变体。考虑所需甲基转移酶的序列和遗传密码，将易于了解编码合适甲基转移酶的核酸。在一个实施方案中，编码甲基转移酶的核酸是如下文实施例中所述(例如，SEQ ID NO:63的核酸或是其功能等效变体)。
可使用被改造为适合于允许表达甲基转移酶基因的任意数量的构建体/载体来产生甲基化构建体/载体。然而，举例来说，可使用下文实施例部分中所述的质粒。
产生方法
本发明提供一种通过微生物发酵产生一种或多种萜烯和/或其前体以及任选的一种或多种其它产物的方法，其包括使用本发明的重组微生物发酵包含CO的底物。一种或多种萜烯和/或其前体优选地是主要的发酵产物。本发明的方法可用于减少来自工业过程的总体大气碳排放。
所述发酵优选地包括使用本发明的重组微生物使底物在生物反应器中厌氧发酵以产生至少一种或多种萜烯和/或其前体的步骤。
在一个实施方案中，一种或多种萜烯和/或其前体选自甲羟戊酸、IPP、二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)、异戊二烯、香叶基焦磷酸(GPP)、法呢基焦磷酸(FPP)和法呢烯。
与由萜类化合物关键中间体IPP和DMAPP直接产生异戊二烯，然后使用其来合成较长链的萜烯不同，也可能直接通过香叶基转移酶来合成较长链的萜烯，诸如C10单萜类化合物或C15倍半萜类化合物(参见表6)。由C15倍半萜类化合物构建单元法呢基-PP，可能产生法呢烯，它与乙醇类似可用作运输燃料。
在一个实施方案中，此方法包括以下步骤：
(a)向含有本发明的一种或多种微生物的培养物的生物反应器中提供包含CO的底物；和
(b)使所述培养物在生物反应器中厌氧发酵以产生至少一种或多种萜烯和/或其前体。
在一个实施方案中，此方法包括以下步骤：
a)捕获由工业过程产生的含CO的气体；
b)通过含有本发明的一种或多种微生物的培养物厌氧发酵含CO气体以产生至少一种或多种萜烯和/或其前体。
在本发明的一个实施方案中，由所述微生物发酵的气态底物是含有CO的气态底物。所述气态底物可以是作为工业过程的副产物获得的或来自一些其它来源(诸如来自汽车废气)的含CO的废气。在某些实施方案中，所述工业过程选自铁金属产品制造(诸如钢铁厂)、非铁产品制造、石油精炼过程、煤炭气化、电力生产、碳黑生产、氨生产、甲醇生产和焦炭制造。在这些实施方案中，含CO的气体可在被排入大气之前使用任何便利方法从所述工业过程捕获。CO可以是合成气(包含一氧化碳和氢的气体)的组分。由工业过程产生的CO通常被燃烧掉以产生CO2且因此本发明在减少CO2温室气体排放和产生用作生物燃料的萜烯方面具有特别有用。视含CO的气态底物的组成而定，也可能需要对其进行处理以在将其引入所述发酵之前除去任何不需要的杂质，诸如尘粒。举例来说，气态底物可使用已知方法过滤或提纯。
应了解，为了使细菌和CO至至少一种或多种萜烯和/或其前体的生长得以发生，除了含CO的底物气体以外，还将需要向生物反应器中进料合适的液体营养培养基。底物和培养基可以连续、分批或分批补料的方式给料至生物反应器中。营养培养基将含有足以允许所用微生物生长的维生素和矿物质。本领域中已知适合使用CO发酵产生萜烯和/或其前体的厌氧培养基。举例来说，Biebel(2001)描述合适的培养基。在本发明的一个实施方案中，培养基如下文实施例部分中所述。
发酵应有利地在适合发生CO至至少一种或多种萜烯和/或其前体的发酵的条件下进行。应考虑的反应条件包括压力、温度、气体流速、液体流速、培养基pH、培养基氧化还原电势、搅动速率(如果使用连续搅拌槽反应器)、接种物水平、确保液相中的CO不成为限制性的最大气体底物浓度以及避免产物抑制作用的最大产物浓度。
另外，常需要增加底物流的CO浓度(或气态底物中的CO分压)且因此增加其中CO是底物的发酵反应的效率。在加压下的操作使得CO从气相转移至液相的速率显著增加，CO在液相中可被微生物作为碳源吸收用于产生至少一种或多种萜烯和/或其前体。这又意味着当生物反应器保持在高压而非大气压下时，滞留时间(定义为生物反应器中的液体体积除以注入气体流速)可被减少。最佳反应条件将部分取决于本发明所用的特定微生物。然而一般来说，发酵优选在高于大气压力的压力下进行。因为给定的CO至至少一种或多种萜烯和/或其前体的转化的速率也部分地随底物滞留时间而变化，且实现所需的滞留时间又决定所需的生物反应器体积，因此使用加压系统可极大减少所需生物反应器的体积，且因此减少发酵设备的资金成本。根据美国专利号5,593,886给出的实施例，反应器体积的减小与反应器操作压力的增加成正比，即在10个大气压力下操作的生物反应器只需要是在1个大气压力下操作的生物反应器体积的十分之一。
举例来说，已描述了在高压下进行气体至乙醇的发酵的益处。举例来说，WO 02/08438描述在30psig和75psig的压力下进行的气体至乙醇的发酵，分别产生150克/升/天和369克/升/天的乙醇生产率。然而，发现在大气压力下使用类似培养基和注入气体组成进行的示例性发酵产生1/10-1/20的乙醇/升/天。
也需要含CO的气态底物的引入速率为例如确保液相中的CO浓度不成为限制性的。这是因为CO受限的条件的后果可能是所述培养物消耗一种或多种产物。
用于进料给发酵反应的气流的组成可对该反应的效率和/或成本具有显著影响。举例来说，O2可降低厌氧发酵过程的效率。在发酵之前或之后发酵过程的各阶段中处理不想要或不必要的气体可增加这些阶段的负担(例如，当气流在进入生物反应器之前被压缩时，可能会使用不必要的能量来压缩发酵中不需要的气体)。因此，可能需要处理底物流(尤其是来自工业来源的底物流)以除去不想要的组分并增加所需组分的浓度。
在某些实施方案中，使本发明的细菌培养物保持在水性培养基中。所述水性培养基优选地是最低厌氧微生物生长培养基。合适的培养基在本领域中是已知的且记载于例如美国专利No.5,173,429和5,593,886以及WO 02/08438中，且如下文实施例部分中所述。
萜烯和/或其前体，或含有一种或多种萜烯、其前体和/或一种或多种其它产物的混合流可通过本领域中已知的方法从发酵液中回收，诸如分馏或蒸发、渗透蒸发、气提和提取发酵(例如包括液液提取)。
在本发明的某些优选实施方案中，通过自生物反应器连续除去一部分发酵液、自发酵液分离微生物细胞(便利地通过过滤)且自发酵液回收一种或多种产物来从所述发酵液回收一种或多种萜烯和/或其前体以及一种或多种产物。可便利地例如通过蒸馏回收醇类。可例如通过蒸馏回收丙酮。所产生的任何酸例如可通过吸附至活性炭上来回收。分离的微生物细胞优选地被返回至发酵生物反应器中。在除去任何醇和酸后留下的无细胞渗透物也优选地被返回至发酵生物反应器中。可以向无细胞渗透物中加入其它营养素(诸如维生素B)来在将其返回至生物反应器之前对营养培养基进行补充。
如果如上文所述调整发酵液的pH来增强乙酸至活性炭的吸附，那么也应在返回至生物反应器之前将pH重新调整至与发酵生物反应器中的发酵液的pH类似的pH。
实施例
现将参考以下非限制性实施例更详细地描述本发明。
实施例1—在自产乙醇梭菌中表达异戊二烯合酶以用于自CO产生异戊二烯
本发明人已识别诸如自产乙醇梭菌和杨氏梭菌的一氧化碳营养型产乙酸菌中的萜烯生物合成基因。重组生物体是经工程化以产生异戊二烯。异戊二烯是由诸如白杨的一些植物天然排出以保护其叶片免受UV辐射。白杨的异戊二烯合酶(EC 4.2.3.27)基因是经过密码子优化并被引入一氧化碳营养型产乙酸菌自产乙醇梭菌中以由CO产生异戊二烯。酶通过不可逆反应使萜类化合物生物合成的关键中间体DMAPP(二甲基烯丙基二磷酸)转化成异戊二烯(图1)。
菌株和生长条件：
如早前所述，使用标准菌株和生长条件在大肠杆菌中进行所有亚克隆步骤(Sambrook等人,Molecular Cloning:A laboratory Manual,Cold Spring HarbourLabrotary Press,Cold Spring Harbour,1989；Ausubel等人,Current protocols inmolecular biology,John Wiley&Sons,Ltd.,Hoboken,1987)。
自产乙醇梭菌DSM10061和DSM23693(DSM10061的一种衍生物)是由DSMZ获得(TheGerman Collection of Microorganisms and Cell Cultures,Inhoffenstraβe 7B,38124Braunschweig,Germany)。在37℃下使用严格的厌氧条件和技术进行生长(Hungate,1969,Methods in Microbiology,第3B卷。Academic Press,New York:117-132；Wolfe,1971,Adv.Microb.Physiol.,6:107-146)。使用化学上定义的无酵母提取物的PETC培养基(表1)和30psi含有一氧化碳的钢铁厂废气(由位于Glenbrook,NZ的新西兰钢厂(NewZealand Steel site)收集；组成：44％CO、32％N2、22％CO2、2％H2)作为唯一的碳和能量来源。
表1
Figure BDA0002395653970000521
Figure BDA0002395653970000531
沃尔夫维生素溶液 每L储备液
生物素 2mg
叶酸 2mg
盐酸吡哆醇 10mg
核黄素 5mg
烟酸 5mg
D-(+)-泛酸钙 5mg
维生素B<sub>12</sub> 0.1mg
对氨基苯甲酸 5mg
硫辛酸 5mg
硫胺素 5mg
蒸馏水 至1L
微量金属溶液 每L储备液
次氮基三乙酸 2g
MnSO<sub>4</sub>.H<sub>2</sub>O 1g
Fe(SO<sub>4</sub>)<sub>2</sub>(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>.6H<sub>2</sub>O 0.8g
CoCl<sub>2</sub>.6H<sub>2</sub>O 0.2g
ZnSO<sub>4</sub>.7H<sub>2</sub>O 0.2mg
CuCl<sub>2</sub>.2H<sub>2</sub>O 0.02g
NaMoO<sub>4</sub>.2H<sub>2</sub>O 0.02g
Na<sub>2</sub>SeO<sub>3</sub> 0.02g
NiCl<sub>2</sub>.6H<sub>2</sub>O 0.02g
Na<sub>2</sub>WO<sub>4</sub>.2H<sub>2</sub>O 0.02g
蒸馏水 至1L
还原剂储备液 每100mL储备液
NaOH 0.9g
半胱氨酸.HCl 4g
Na<sub>2</sub>S 4g
蒸馏水 至100mL
构建表达质粒：
在本发明中使用标准重组DNA和分子克隆技术(Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T:Molecular Cloning:A laboratory Manual,Cold Spring HarbourLaboratory Press,Cold Spring Harbour,1989；Ausubel FM,Brent R,Kingston RE,Moore DD,Seidman JG,Smith JA,Struhl K:Current protocols in molecularbiology.John Wiley&Sons,Ltd.,Hoboken,1987)。山杨的异戊二烯合酶(AAQ16588.1；GI:33358229)是经过密码子优化(SEQ ID NO:21)和合成的。使用自产乙醇梭菌的丙酮酸:铁氧化还原蛋白氧化还原酶的启动子区(SEQ ID NO:22)来表达所述基因。
使用Bertram和Dürre(1989)的改进方法从自产乙醇梭菌DSM23693分离基因组DNA。收获100-ml过夜培养物(6,000×g,15min,4℃)、用磷酸钾缓冲液(10mM，pH 7.5)洗涤并悬浮在1.9ml STE缓冲液(50mM Tris-HCl、1mM EDTA、200mM蔗糖；pH 8.0)中。加入300μl溶菌酶(约100,000U)且将所得混合物在37℃下孵育30min，接着加入280μl 10％(w/v)SDS溶液且再孵育10min。在室温下通过加入240μl EDTA溶液(0.5M，pH 8)、20μl Tris-HCl(1M，pH 7.5)和10μl RNase A(Fermentas Life Sciences)消化RNA。然后加入100μl蛋白酶K(0.5U)且在37℃下发生蛋白水解，持续1至3h。最后加入600μl高氯酸钠(5M)，接着进行苯酚-氯仿提取和异丙醇沉淀。通过分光光度计检验DNA的数量和质量。通过使用寡核苷酸Ppfor-NotI-F(SEQ ID NO:23:AAGCGGCCGCAAAATAGTTGATAATAAT GC)和Ppfor-NdeI-R(SEQID NO:24:TACGCATATGAATTCCTCTCCTTT TCAAGC)和使用iProof高保真DNA聚合酶(Bio-RadLaboratories)的PCR，和以下程式来扩增丙酮酸:铁氧化还原蛋白氧化还原酶启动子序列：初始在98℃下变性30秒钟、接着进行32个循环：变性(98℃下持续10秒钟)、退火(50至62℃下持续30至120秒钟)和伸长(72℃下持续30至90秒钟)，之后是最后的延伸步骤(72℃下持续10分钟)。
构建异戊二烯合酶表达质粒：
在大肠杆菌DH5α-T1R(Invitrogen)和XL1-Blue MRF’Kan(Stratagene)中进行表达质粒的构建。在第一步骤中，使用NotI和NdeI限制性位点将扩增的Ppfor启动子区克隆到大肠杆菌-梭菌穿梭载体pMTL85141(FJ797651.1；Nigel Minton,诺丁汉大学(Universityof Nottingham)；Heap等人,2009)中，产生质粒pMTL85146。作为第二步骤，使用限制性位点NdeI和EcoRI将ispS克隆到pMTL85146中，产生质粒pMTL 85146-ispS(图2，SEQ ID NO:25)。
自产乙醇梭菌中的转化和表达
如美国专利2011/0236941中所述，在转化之前，使用在由来自自产乙醇梭菌、拉氏梭菌和杨氏梭菌的甲基转移酶基因设计的甲基化质粒(SEQ ID NO:64)上共表达的合成混合II型甲基转移酶(SEQ ID NO:63)，在大肠杆菌中体内将DNA甲基化。
将表达质粒和甲基化质粒转化到限制性阴性大肠杆菌XL1-Blue MRF’Kan(Stratagene)的相同细胞中，这因为它们的相容性革兰氏-(-)复制起点而成为可能(表达质粒中的高拷贝ColE1和甲基化质粒中的低拷贝p15A)。通过加入1mM IPTG诱导体内甲基化，且使用QIAGEN Plasmid Midi试剂盒(QIAGEN)分离甲基化质粒。所得到的混合物用于自产乙醇梭菌DSM23693的转化实验，但只有大量(高拷贝)表达质粒具有革兰氏-(+)复制起点(repL)，允许其可在梭菌属中复制。
转化至自产乙醇梭菌中：
在完整转化实验期间，使自产乙醇梭菌DSM23693在补充有1g/L酵母提取物和10g/l果糖的培养基(表1)以及作为碳源的30psi钢铁厂废气(由位于Glenbrook,NZ的新西兰钢厂收集；组成：44％CO、32％N2、22％CO2、2％H2)中生长。
为制造感受态细胞，将50ml自产乙醇梭菌DSM23693培养物在新鲜培养基中继代培养连续3天。这些细胞用于以0.05的OD600nm接种含有40mM DL-苏氨酸的50ml PETC培养基。当培养物达到0.4的OD600nm时，将细胞转移至厌氧室中且在4,700×g和4℃下收获。将培养物用冰冷却的电穿孔缓冲液(270mM蔗糖、1mM MgCl2、7mM磷酸钠，pH 7.4)洗涤两次，且最后悬浮在体积为600μl的新鲜电穿孔缓冲液中。将此混合物转移到含有1μg甲基化质粒混合物的具有0.4cm电极间隙的预冷却电穿孔杯中且立即使用具有以下设定的Gene脉冲发生器Xcell电穿孔系统(Bio-Rad)进行冲击：2.5kV，600Ω和25μF。达到3.7至4.0ms的时间常数。将培养物转移到5ml的新鲜培养基中。在600nm波长下使用装配有管架的Spectronic HeliosEpsilon分光光度计(Thermo)监测细胞再生。生物量初始下降后，细胞再次开始生长。生物量由此点开始加倍后，收获细胞、悬浮于200μl新鲜培养基中且铺板于具有适当的抗生素4μg/ml克拉霉素(Clarithromycin)或15μg/ml甲砜霉素(thiamphenicol)的选择性的PETC板(含有1.2％BactoTMAgar(BD))上。在37℃下用30psi钢铁厂气体接种4至5天后，可见到菌落。
使用菌落来接种具有抗生素的2ml PETC培养基。当发生生长时，使培养物按比例增加至5ml体积，且随后增加至50ml，以30psi钢铁厂气体作为唯一的碳源。
证明成功转化：
为证实DNA转移，使用Zyppy质粒小量提取试剂盒(Zymo)由10ml培养物体积进行质粒小量提取。由于分离的质粒的质量因梭菌属核酸外切酶活性而不足以用于限制性酶切消化[Burchhardt和Dürre,1990]，因此用寡核苷酸对colE1-F(SEQ ID NO:65:CGTCAGACCCCGTAGAAA)加上colE1-R(SEQ ID NO:66:CTCTCCTGTTCCGACCCT)对分离的质粒进行PCR。在以下条件下使用iNtRON Maximise Premix PCR试剂盒(Intron Bio Technologies)来进行PCR：初始在94℃下变性2分钟，接着进行35个循环：变性(94℃下持续20秒钟)、退火(55℃下持续20秒钟)和延伸(72℃下持续60秒钟)，之后是最后的延伸步骤(72℃下持续5分钟)。
为证明克隆的种类，从50ml自产乙醇梭菌DSM23693培养物中分离基因组DNA(参考上文)。在以下条件下使用寡核苷酸fD1(SEQ ID NO:67:CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和rP2(SEQ ID NO:68:CCCGGGATCCAAGCTTACGGCTACCTTGTTACGACTT)[Weisbe rg等人,1991]和iNtRON Maximise Premix PCR试剂盒(Intron Bio Technol ogies)针对16srRNA基因进行PCR：初始在94℃下变性2分钟，接着进行35个循环：变性(94℃下持续20秒钟)、退火(55℃下持续20秒钟)和延伸(72℃下持续60秒钟)，之后是最后的延伸步骤(72℃下持续5分钟)。测序结果为与自产乙醇梭菌(Y18178，GI:7271109)的16s rRNA基因(rrsA)具有至少99.9％的同一性。
异戊二烯合酶基因的表达
进行qRT-PCR实验来确认引入的异戊二烯合酶基因在自产乙醇梭菌中的成功表达。
使具有异戊二烯合酶质粒pMTL 85146-ispS的培养物和不含质粒的对照培养物在50mL血清瓶和PETC培养基(表1)中生长，以30psi钢铁厂废气(由位于Glenbrook,NZ的新西兰钢厂收集；组成：44％CO、32％N2、22％CO2、2％H2)作为唯一的能量和碳来源。在对数生长期期间以约0.5的OD600nm取样0.8mL样本并与1.6mL RNA保护试剂(Qiagen)混合。使混合物离心(6,000×g，5min，4℃)，且将细胞沉积物在液氮中速冻并储存在-80℃下直到RNA提取。根据手册的实验方案5，使用RNeasy小量提取试剂盒(Qiagen)分离总RNA。通过使混合物穿过注射器10次对细胞进行破坏，并以50μL无RNase/DNase的水中洗脱。在使用DNA-freeTM试剂盒(Ambion)进行DNase I处理后，然后使用SuperScript III逆转录酶试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)进行逆转录步骤。使用Agilent生物分析仪2100(AgilentTechnologies,Santa Clara,CA,USA)、Qubit荧光计(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)并通过凝胶电泳检查RNA。对每一对寡核苷酸进行非RT对照。所有qRT-PCR反应都使用MyiQTM单色检测系统(Bio-Rad Labratories,Carlsbad,CA,USA)一式两份进行，总反应体积为15μL，具有25ng cDNA模板、67nM每种寡核苷酸(表2)和1×iQTM
Figure BDA0002395653970000582
Green Supermix(Bio-RadLabratories,Carlsbad,CA,USA)。反应条件是95℃下持续3min，接着40个循环：95℃持续15s、55℃持续15s和72℃持续30s。为检测寡核苷酸二聚化或扩增的其它伪像(artifact)，在qPCR完成后立刻进行熔融曲线分析(以1℃/s自58℃至95℃循环38次)。每种cDNA样本包括两个看家基因(鸟苷酸激酶和甲酸四氢叶酸连接酶)用于标准化。使用相对表达软件工具
Figure BDA0002395653970000583
2008 2.0.7版(38)进行相对基因表达的确定。使用横跨4个log单位连续稀释的cDNA产生标准曲线且所得到的扩增效率用来计算mRNA的浓度。
表2：用于qRT-PCR的寡核苷酸
Figure BDA0002395653970000581
尽管对使用寡核苷酸对ispS的野生型菌株未观察到扩增，但对带有质粒pMTL85146-ispS的菌株测量到具有ispS寡核苷酸对的信号，确认ispS基因的成功表达。
实施例2—表达异戊烯基二磷酸δ-异构酶以在关键的萜烯前体DMAPP(二甲基烯丙基二磷酸)和IPP(异戊烯基二磷酸)之间转化
前体DMAPP(二甲基烯丙基二磷酸)和IPP(异戊烯基二磷酸)的可用性和平衡对萜烯生产至关重要。尽管DXS途径同等地合成IPP和DMAPP，但在甲羟戊酸途径中，唯一的产物是IPP。异戊二烯生产只需要存在前体DMAPP与异戊二烯合酶，而对于高级萜烯和萜类化合物生产而言，则需要具有等量的IPP和DMAPP可用于通过香叶基转移酶产生香叶基-PP。
构建异戊烯基二磷酸δ-异构酶表达质粒：
编码异戊烯基二磷酸δ-异构酶(YP_001310174.1)的来自拜氏梭菌(C.beijerinckii)的异戊烯基二磷酸δ-异构酶基因idi(基因ID:5294264)在ispS的下游被克隆。使用与如上文关于自产乙醇梭菌所述的相同方法获得，寡核苷酸Idi-Cbei-SacI-F(SEQ ID NO:26:GTGAGCTCGAAAGGGGAAATTAAATG)和Idi-Cbei-KpnI-R(SEQ ID NO:27:ATGGTACCCCAAATCTTTATTTAGACG)从拜氏梭菌NCIMB8052的基因组DNA来扩增基因。使用SacI和KpnI限制性位点将PCR产物克隆到载体pMTL 85146-ispS中以产生质粒pM TL85146-ispS-idi(SEQ ID NO:28)。使用限制性酶PmeI和FseI将抗生素抗性标记物从catP交换到ermB(由载体pMTL82254(FJ797646.1)释放；Nigel Minton,诺丁汉大学；Heap等人,2009)以形成质粒pMTL85246-ispS-idi(图3)。
如关于质粒pMTL 85146-ispS所述在自产乙醇梭菌中进行转化和表达。成功转化后，在50mL(50mL)血清瓶和PETC培养基(表1)中进行生长实验，以30psi钢铁厂废气(由位于Glenbrook,NZ的新西兰钢厂收集；组成：44％CO、32％N2、22％CO2、2％H2)作为唯一的能量和碳来源。为确认已成功引入质粒，如前文所述由转化体进行质粒小量提取DNA。使用靶向colE1(colE1-F:SEQ ID NO:65:CGTCAGACCCCGTAGAAA和colE1-R:SEQ ID NO:66:CTCTCCTGTTCCGACCCT)、ermB(ermB-F:SEQ ID NO:106:TTTGTAATTAAGAAGGAG和ermB-R:SEQID NO:107:GTAGAATCCTTCTTCAAC)和idi(Idi-Cbei-SacI-F:SEQ ID NO:26:GTGAGCTCGAAAGGGGAAATTAAATG和Idi-Cbei-KpnI-R:SEQ ID NO:27:ATGGTACCCCAAATCTTTATTTAGACG)的寡核苷酸对针对分离的质粒进行的PCR确认转化成功(图8)。类似地，提取了这些转化体的基因组DNA，且得到的使用寡核苷酸fD1和rP2(参考上文)的16s rRNA扩增子确认与自产乙醇梭菌(Y18178，GI:7271109)的16S rRNA基因99.9％的同一性。
使用针对异戊烯基二磷酸δ-异构酶基因idi的寡核苷酸对(idi-F,SEQ ID NO:71:ATA CGT GCT GTA GTC ATC CAA GAT A和idiR,SEQ ID NO:72:TCT TCA AGT TCA CAT GTAAAA CCC A)和来自用带有质粒pMTL 85146-ispS-idi的自产乙醇梭菌进行的血清瓶生长实验的样本来如上文所述进行基因表达的成功确认。也观察到异戊二烯合酶基因ispS的信号(图14)。
实施例3—DXS途径的过度表达
为改善通过DXS途径的流，过度表达此途径的基因。由脱氧木酮糖5-磷酸合酶(DXS)来催化此途径的初始步骤，将丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸(G3P)转化成脱氧木酮糖5-磷酸(DXP/DXPS/DOXP)。
构建DXS过度表达表达质粒：
如上文关于其它基因所述，使用寡核苷酸Dxs-SalI-F(SEQ ID NO:29:GCAGTCGACTTTATTAAAGGGATAGATAA)和Dxs-XhoI-R(SEQ ID NO:30:TGCTCGAGTTAAAATATATGACTTACCTCTG)从基因组DNA扩增自产乙醇梭菌的dxs基因。然后用SalI和XhoI将扩增的基因克隆到质粒pMT L85246-ispS-idi中以产生质粒pMTL85246-ispS-idi-dxs(SEQ ID NO:31和图4)。使用表3中给出的寡核苷酸进行的DNA测序确认了ispS、idi和dxs的成功克隆，无突变(图5)。ispS和idi基因分别如实施例1和2中所述。
表3：用于测序的寡核苷酸
寡核苷酸名称 DNA序列(5`至3`) SEQ ID NO:
M13R CAGGAAACAGCTATGAC 32
异戊二烯-seq1 GTTATTCAAGCTACACCTTT 33
异戊二烯-seq2 GATTGGTAAAGAATTAGCTG 34
异戊二烯-seq3 TCAAGAAGCTAAGTGGCT 35
异戊二烯-seq4 CTCACCGTAAAGGAACA 36
异戊二烯-seq5 GCTAGCTAGAGAAATTAGAA 37
异戊二烯-seq6 GGAATGGCAAAATATCTTGA 38
异戊二烯-seq7 GAAACACATCAGGGAATATT 39
自产乙醇梭菌中的转化和表达
如关于质粒pMTL 85146-ispS所述的在自产乙醇梭菌中进行转化和表达。成功转化后，在50mL(50mL)血清瓶和PETC培养基(表1)中进行生长实验，以30psi钢铁厂废气(由位于Glenbrook,NZ的新西兰钢厂收集；组成：44％CO、32％N2、22％CO2、2％H2)作为唯一的能量和碳来源。如上文所述，由在OD600nm＝0.75下收集的样本进行基因表达的确认。使用寡核苷酸对dxs-F(SEQ ID NO:73:ACAAAGTATCTAAGACAGGAGGTCA)和dxs-R(SEQ ID NO:74:GATGTCCCACATCCCATATAAGTTT)来测量基因dxs在野生型菌株和带有质粒pMTL 85146-ispS-idi-dxs的菌株中的表达。发现带有所述质粒的菌株中的mRNA水平与野生型相比增加3倍以上(图15)。在RNA提取之前使生物量标准化。
实施例4-甲羟戊酸途径的引入和表达
由使两分子的乙酰基-CoA转化成乙酰乙酰基-CoA(和HS-CoA)的硫解酶催化甲羟戊酸途径的第一步骤(图7)。此酶由相同的发明人(美国专利2011/0236941)在一氧化碳营养型产乙酸菌自产乙醇梭菌和杨氏梭菌中成功表达。已设计用于甲羟戊酸途径的剩余基因的构建体。
构建甲羟戊酸表达质粒：
使用标准重组DNA和分子克隆技术(Sambrook,J.和Russell,D.,Molecularcloning:A Laboratory Manual第3版,Cold Spring Harbour Lab Press,Cold SpringHarbour,NY,2001)。经由甲羟戊酸途径上部进行甲羟戊酸合成所需的三种基因(即硫解酶(thlA/vraB)、HMG-CoA合酶(HMGS)和HMG-CoA还原酶(HMGR))是经过密码子优化作为操纵子(Pptaack-thlA/vraB-HMGS-Patp-HMGR)。
使用自产乙醇梭菌的磷酸转乙酰酶/乙酸激酶操纵子启动子(Ppta-ack)(SEQ IDNO:61)来表达硫解酶和HMG-CoA合酶，同时使用自产乙醇梭菌的ATP合酶(Patp)的启动子区来表达HMG-CoA还原酶。合成硫解酶的两种变体(来自丙酮丁醇梭菌的thlA和来自金黄色葡萄球菌的vraB)并将其侧接NdeI和EcoRI限制性位点以用于进一步亚克隆。HMG-CoA合酶(HMGS)和HMG-CoA还原酶(HMGR)都是由金黄色葡萄球菌合成并分别将其侧接EcoRI-SacI和KpnI-XbaI限制性位点以用于进一步亚克隆。所用的所有优化DNA序列在表4中给出。
表4：甲羟戊酸表达质粒的序列
Figure BDA0002395653970000621
使用寡核苷酸pUC57-F(SEQ ID NO:46:AGCAGATTGTACTGAGA GTGC)和pUC57-R(SEQID NO:47:ACAGCTATGACCATGATTACG)和以pUC57-Patp-HMGR作为模板扩增ATP合酶启动子(Patp)和羟基甲基戊二酰-CoA还原酶(HMGR)。用SacI和XbaI消化2033bp扩增片段且连接到大肠杆菌-梭菌属穿梭载体pMTL 82151(FJ7976；Nigel Minton,英国诺丁汉大学(University of Nottingham,UK)；Heap等人,2009,J Microbiol Method s.78:79-85)中，产生质粒pMTL 82151-Patp-HMGR(SEQ ID NO:76)。
使用寡核苷酸EcoRI-HMGS_F(SEQ ID NO:77:AGCCGTGAATTCGAGGCTTTTACTAAAAACA)和EcoRI-HMGS_R(SEQ ID NO:78:AGGCGTCTAGATGTTCGTCTCTACAAATAATT)，由密码子合成的质粒pGH-seq3.2来扩增3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA合酶(HMGS)。用SacI和EcoRI消化1391bp扩增片段且将其连接到先前产生的质粒pMTL 82151-Patp-HMGR中以产生pMTL 82151-HMGS-Patp-HMGR(SEQ ID NO:79)。所产生的质粒pMTL 82151-HMGS-Patp-HMGR(SEQ ID NO:79)和Pptaack-thlA/vraB的1768bp经过密码子优化的操纵子都用NotI和EcoRI切割。进行连接且接着转化到大肠杆菌XL1-Blue MRF’Kan中，产生质粒pMTL8215-Pptaack-thlA/vra B-HMGS-Patp-HMGR(SEQ ID NO:50)。
经由甲羟戊酸途径下部的从甲羟戊酸合成萜类化合物关键中间体所需的五种基因(即，甲羟戊酸激酶(MK)、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMD)、异戊烯基二磷酸δ-异构酶(idi)和异戊二烯合酶(ispS))是通过ATG:Biosynthetics GmbH(Merzhausen,Germany)进行密码子优化。甲羟戊酸激酶(MK)、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)和二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMD)都是由金黄色葡萄球菌获得。
使用自产乙醇梭菌的RNF复合物(Prnf)的启动子区(SEQ ID NO:62)来表达甲羟戊酸激酶(MK)、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)和二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMD)，同时使用自产乙醇梭菌的丙酮酸:铁氧化还原蛋白氧化还原酶(Pfor)的启动子区(SEQ ID NO:22)来表达异戊烯基二磷酸δ-异构酶(idi)和异戊二烯合酶(ispS)。所用的所有DNA序列都在表5中给出。使用寡核苷酸NotI-XbaI-Prnf-MK_F(SEQ ID NO:80:ATGCGCGGCCGCTAGGTCTAGAATATCGATACAGATAAAAAAATATATAATACAG)和SalI-Prnf-MK_R(SEQ ID NO:81:TGGTTCTGTAACAGCGTATTCACCTGC)从合成质粒pGH-Prnf-MK-PMK-PMD扩增经过密码子优化的Prnf-MK。然后用NotI和SalI将所扩增的基因克隆到质粒pMTL83145(SEQ ID NO:49)中以产生质粒pMTL8314-Prnf-MK(SEQ ID NO:82)。接着用SalI和HindIII消化所得到的质粒和2165bp经过密码子优化的片段PMK-PMD。进行连接，产生质粒pMTL 8314-Prnf-MK-PMK-PMD(SEQ ID NO:83)。
通过将侧接限制性位点AgeI和NheI的异戊二烯合酶(ispS)与先前产生的法呢烯质粒pMTL 8314-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS(SEQ ID NO:91)连接以产生质粒pMTL8314-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispS(SEQ ID NO:84)来制造无甲羟戊酸途径的异戊二烯表达质粒。通过使用限制性位点NotI和XbaI使来自pMTL8215-Pptaack-thlA-HMGS-Patp-HMGR(SEQ ID NO:50)的4630bp Pptaack-thlA-HMGS-Patp-HMGR片段与pMTL 8314-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispS(SEQ ID NO:84)连接来制造最终的异戊二烯表达质粒pMTL 8314-Pptaack-thlA-HMGS-Patp-HMGR-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispS(SEQ IDNO:58，图10)。
表5：来自甲羟戊酸途径的异戊二烯表达质粒的序列
Figure BDA0002395653970000641
实施例5-在自产乙醇梭菌中引入法呢烯合酶以用于通过甲羟戊酸途径自CO产生法呢烯
除了直接由萜类化合物关键中间体IPP和DMAPP产生异戊二烯，然后使用此异戊二烯合成较长链的萜烯以外，也可能直接通过香叶基转移酶(参见表6)来合成较长链的萜烯，诸如C10单萜类化合物或C15倍半萜类化合物。由C15倍半萜类化合物构建单元法呢基-PP可能产生法呢烯，其与乙醇类似可用作运输燃料。
构建法呢烯表达质粒
通过甲羟戊酸途径自IPP和DMAPP合成法呢烯所需的两种基因(即，香叶基转移酶(ispA)和α-法呢烯合酶(FS))是经过密码子优化的。香叶基转移酶(ispA)是由大肠杆菌菌株K-12亚菌株MG1655获得且α-法呢烯合酶(FS)是由苹果获得。所用的所有DNA序列在表6中给出。使用通过甲羟戊酸途径idi_F(SEQ ID NO:86:AGGCACTCGAGATGGCAGAGTATATAATAGCAGTAG)和idi_R2(SEQ ID NO:87:AGGCGCAAGCTTGGCGCACCGGTTTATTTAAATATCTTATTTTCAGC)从合成质粒pMTL83245-Pfor-FS-idi(SEQ ID NO:85)来扩增经过密码子优化的idi。然后将用XhoI和HindIII扩增的基因克隆到质粒pMTL83245-Pfor中以产生质粒pMTL83245-Pfor-idi(SEQ ID NO:88)。接着用HindIII和NheI消化此得到的质粒和法呢烯合酶(FS)的1754bp经过密码子优化的片段。进行连接产生质粒pMTL83245-Pfor-idi-FS(SEQ ID NO:89)。接着用AgeI和HindIII消化ispA的946bp片段和pMTL83245-Pfor-idi-FS且将其连接以产生得到的质粒pMTL83245-Pfor-idi-ispA-FS(SEQ ID NO:90)。通过将来自pMTL83245-Pfor-idi-ispA-FS的2516bp Pfor-idi-ispA-FS片段与pMTL 8314-Prnf-MK-PMK-PMD连接产生质粒pMTL 8314-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS(SEQ ID NO:91)来制造无上部甲羟戊酸途径的法呢烯表达质粒。通过使用限制性位点NotI和XbaI将来自pMTL8215-Pptaack-thlA-HMGS-Patp-HMGR的4630bp Pptaack-thlA-HMGS-Patp-HMGR片段(SEQ ID NO:50)与pMTL8314-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-isp A-FS(SEQ ID NO:91)连接来制造最终的法呢烯表达质粒pMTL83145-thlA-HMGS-Patp-HMGR-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS(SEQ IDNO:59和图18)。
表6：来自甲羟戊酸途径的法呢烯表达质粒的序列
Figure BDA0002395653970000661
转化到自产乙醇梭菌中
如实施例1中所述的在自产乙醇梭菌中进行转化和表达。
确认成功转化：
通过使用寡核苷酸repHF(SEQ ID NO:92:AAGAAGGGCGTATATGAAAACTTGT)和catR(SEQ ID NO:93:TTCGTTTACAAAACGGCAAATGTGA)选择性地扩增pMTL831xxx系列质粒上的一部分garm+ve perplicon和大部分cat基因的菌落PCR确认存在pMTL8314-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS(SEQ ID NO:59)。产生1584bp的条带(图16)。
在自产乙醇梭菌中表达下部甲羟戊酸途径
如实施例1中所述的对下部甲羟戊酸途径基因甲羟戊酸激酶(MK SEQ ID NO:51)、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK SEQ ID NO:52)、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMD SEQ ID NO:53)、异戊烯基二磷酸δ-异构酶(idi；SEQ ID NO:54)、香叶基转移酶(ispA；SEQ ID NO:56)和法呢烯合酶(FS SEQ ID NO:57)的表达进行确认。使用表7中列举的寡核苷酸。
表7：用于检测在质粒pMTL8314Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS(SEQ ID NO:91)上所携带的下部甲羟戊酸途径中基因的表达的寡核苷酸清单
Figure BDA0002395653970000662
Figure BDA0002395653970000671
确认下部甲羟戊酸途径中的所有基因表达的Rt-PCR数据在图18中示出，此数据也概括在表8中。
表8：基因甲羟戊酸激酶(MK SEQ ID NO:51)、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK SEQ ID NO:52)、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMD SEQ ID NO:53)、异戊烯基二磷酸δ-异构酶(idi SEQ IDNO:54)、香叶基转移酶(ispASEQ ID NO:56)和法呢烯合酶(FS SEQ ID NO:57)的平均CT值，对于从甲羟戊酸供给实验的两种起子培养物(starter cultures)取样的两种独立样本而言(参见下文)
基因 样本1(Ct平均值) 样本2(Ct平均值)
MK 21.9 20.82
PMK 23.64 22.81
PMD 24 22.83
Idi 24.23 27.54
ispA 23.92 23.22
FS 21.28(单独Ct) 21.95(单独Ct)
HK(rho) 31.5 28.88
由甲羟戊酸产生α-法呢烯
在确认质粒pMTL8314-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS成功转化之后，在250ml血清瓶中的50ml PETC培养基(表1)中进行生长实验，以30psi Real Mill气体(由位于Glenbrook,NZ的新西兰钢厂收集；组成：44％CO、32％N2、22％CO2、2％H2)作为唯一的能量和碳来源。在37℃下在被改造为适合固定血清瓶的定轨振荡器(orbital shaker)中孵育所有培养物。首先使转化体生长至约0.4的OD600，然后在补充有1mM甲羟戊酸的新鲜培养基中继代培养。同时由同一培养物建立无甲羟戊酸的对照。在每个时间点取样用于GC-MS(气相色谱-质谱法)的样品。图17示出了2种对照培养物和供给有1mM甲羟戊酸的两种培养物的代表性生长曲线。在实验开始后66h和90h获取的样本中检测到法呢烯(图19至21)。
通过气相色谱-质谱法检测α-法呢烯
为对α-法呢烯进行GC-MS检测，通过加入2ml己烷并剧烈振荡以在密封的鲍尔奇玻璃管(glass balch tube)中混合而对5ml培养物进行己烷提取。然后将所述管在超声波水浴中孵育5min以促进相分离。将400μl己烷提取物转移到GC小瓶中并上样到自动上样器上。在具有EC-1000柱0.25μm膜厚度(Grace Davidson,OR,USA)、Varian MS工作台(VarianInc,Ca.Now Agilent Technologies,CA,USA)和NIST MS Search 2.0(AgilentTechnologies,CA,USA)的VARIAN GC3800 MS4000离子捕集器GC/MS(Varian Inc,CA,USA.Now Agilent Technologies)上分析所述样本。注射体积为1μl，氦运载气体流速为1ml/min。
本文已参考某些优选实施方案描述本发明以使得阅读者无需过度实验即可实施本发明。然而，本领域技术人员将易于意识到，许多组分和参数可在不偏离本发明范围的情况下可在一定程度上被变化或修改或者被置换为已知的等效物。应了解，所述修改和等效物如同单独提出一样被纳入本文中。提供标题、题目等以增强阅读者对此文本的理解，且其不应理解为限制本发明的范围。
上下文中引用的所有申请、专利和公布的全部公开内容，如果存在，都以引用方式纳入本文中。然而，本说明书中对任何申请、专利和公布的参考并非且不应理解为承认或以任何形式建议其构成有效的现有技术或在世界上任何国家形成公知常识的一部分。
在本说明书通篇和下文的任何权利要求中，除非文中另外要求，否则词汇“包含(comprise)”、“包含(comprising)”等应以与排除含义相反的包涵含义理解，也就是说其含义是“包括(但不限于)”。
序列表
<110> LANZATECH NEW ZEALAND LIMITED
<120> 重组代谢微生物及其用途
<130> LT79
<160> 111
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 1875
<212> DNA
<213> 自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)
<400> 1
atgagtaatt tattagataa ttataaagat ataaatgacg taaagaagat gtcgttaaat 60
gataaaaaaa agctagctag agaaattaga aaatttttaa tagacaaagt atctaagaca 120
ggaggtcatt tggcgtctaa cttaggggtt gtggagctca ctttgagttt atttagtgta 180
tttgatctaa attatgataa acttatatgg gatgtgggac atcaggctta tgtgcataaa 240
atcctcacgg gaagaaagga taaatttgat actttaaggc aatttggagg attaagtgga 300
tttcctaaaa ggtgcgaaag tatatatgat tttttcgaaa cagggcatag tagtacttca 360
atatctgcag cacttggaat ggctagggct agagatttaa agcatgagaa atataatgtt 420
gttgcagtta taggagatgg agcacttact ggaggtatgg cactagaggc cctaaatgat 480
gtaggttata gaaaaactaa gcttataata atattaaatg ataatcaaat gtctatagga 540
aaaaatgtag gtggagtatc taaatattta aataaactta gagtggaccc taagtataat 600
aaatttaaag cggatgtaga agctaaatta aaaaagatac ctaatatagg aaaaggaatg 660
gcaaaatatc ttgaaaaggt aaaaaatgga ataaaacaaa tggtagttcc tggaatgttt 720
tttgaagata tgggaattaa atatttagga ccaatagatg gtcataatat aaaagaactt 780
acagacgtac tcgcttctgc aaaagacata caaggtccag ttattataca tataataact 840
aagaaaggaa aaggatatga atttgcagaa aaaaatccag gtaaattcca tggaataggg 900
ccttttaatt gcgccaatgg tgaactggat gctggatctt caaatactta ttccaaggcc 960
tttggaaatg aaatggtaaa gctagcagaa aaagacgata gaatagtggc tataactgca 1020
gccatgaggg atggaacagg tcttaaaagt ttttctcaaa agtttcctga aaggtttttt 1080
gatgtgggaa tagcagaaca gcatgctgta accctggcag ctggaatggc acaggcaaat 1140
ttaaaacctg tatttgcagt ttactctact tttcttcaaa gagcttatga tcaacttatt 1200
catgatgtat gtatgcaaaa acttccagta gtttttgctg tagatagggc cggcattgta 1260
ggagaagatg gtgaaacaca tcagggaata tttgatttat cttacttaac ggaaatgcca 1320
catatgacgc ttatgtctcc taaatgtata gatgaacttc catatatgtt aaaatgggca 1380
ttaggccaga gttttcctgt agctataagg tatccaaggg gaggagatag tgtatgtctc 1440
aatcccgtag aaaattttaa acttggaaag tgggactgta tttcaaatga aggcagtgta 1500
gcaataattg ctcagggtaa aatggtacaa aatgcagtgt tagcaggaaa aaaacttaaa 1560
gaaaagggta tagatgtaag gattataagt gcatgtttta ttaagccgct ggacaaggaa 1620
atgttaaaca ggttagttga agaaagtgta actatcgtta ctgttgaaga caatgtaata 1680
agaggaggat taggatccta tatattagaa tatgtaaata aattaaataa aaaagtaaaa 1740
ataataaact tagggtttga tgataagttt gtacagcatg gaaaatccga tattttgtat 1800
aagctgtatg gtttggatcc taaaggtatc gtaaatagtg tacttgaagc agcagaggta 1860
agtcatatat tttaa 1875
<210> 2
<211> 627
<212> PRT
<213> 自产乙醇梭菌
<400> 2
Met Ser Asn Leu Leu Asp Asn Tyr Lys Asp Ile Asn Asp Val Lys Lys
1 5 10 15
Met Ser Leu Asn Asp Lys Lys Lys Leu Ala Arg Glu Ile Arg Lys Phe
20 25 30
Leu Ile Asp Lys Val Ser Lys Thr Gly Gly His Leu Ala Ser Asn Leu
35 40 45
Gly Val Val Glu Leu Thr Leu Ser Leu Phe Ser Val Phe Asp Leu Asn
50 55 60
Tyr Asp Lys Leu Ile Trp Asp Val Gly His Gln Ala Tyr Val His Lys
65 70 75 80
Ile Leu Thr Gly Arg Lys Asp Lys Phe Asp Thr Leu Arg Gln Phe Gly
85 90 95
Gly Leu Ser Gly Phe Pro Lys Arg Cys Glu Ser Ile Tyr Asp Phe Phe
100 105 110
Glu Thr Gly His Ser Ser Thr Ser Ile Ser Ala Ala Leu Gly Met Ala
115 120 125
Arg Ala Arg Asp Leu Lys His Glu Lys Tyr Asn Val Val Ala Val Ile
130 135 140
Gly Asp Gly Ala Leu Thr Gly Gly Met Ala Leu Glu Ala Leu Asn Asp
145 150 155 160
Val Gly Tyr Arg Lys Thr Lys Leu Ile Ile Ile Leu Asn Asp Asn Gln
165 170 175
Met Ser Ile Gly Lys Asn Val Gly Gly Val Ser Lys Tyr Leu Asn Lys
180 185 190
Leu Arg Val Asp Pro Lys Tyr Asn Lys Phe Lys Ala Asp Val Glu Ala
195 200 205
Lys Leu Lys Lys Ile Pro Asn Ile Gly Lys Gly Met Ala Lys Tyr Leu
210 215 220
Glu Lys Val Lys Asn Gly Ile Lys Gln Met Val Val Pro Gly Met Phe
225 230 235 240
Phe Glu Asp Met Gly Ile Lys Tyr Leu Gly Pro Ile Asp Gly His Asn
245 250 255
Ile Lys Glu Leu Thr Asp Val Leu Ala Ser Ala Lys Asp Ile Gln Gly
260 265 270
Pro Val Ile Ile His Ile Ile Thr Lys Lys Gly Lys Gly Tyr Glu Phe
275 280 285
Ala Glu Lys Asn Pro Gly Lys Phe His Gly Ile Gly Pro Phe Asn Cys
290 295 300
Ala Asn Gly Glu Leu Asp Ala Gly Ser Ser Asn Thr Tyr Ser Lys Ala
305 310 315 320
Phe Gly Asn Glu Met Val Lys Leu Ala Glu Lys Asp Asp Arg Ile Val
325 330 335
Ala Ile Thr Ala Ala Met Arg Asp Gly Thr Gly Leu Lys Ser Phe Ser
340 345 350
Gln Lys Phe Pro Glu Arg Phe Phe Asp Val Gly Ile Ala Glu Gln His
355 360 365
Ala Val Thr Leu Ala Ala Gly Met Ala Gln Ala Asn Leu Lys Pro Val
370 375 380
Phe Ala Val Tyr Ser Thr Phe Leu Gln Arg Ala Tyr Asp Gln Leu Ile
385 390 395 400
His Asp Val Cys Met Gln Lys Leu Pro Val Val Phe Ala Val Asp Arg
405 410 415
Ala Gly Ile Val Gly Glu Asp Gly Glu Thr His Gln Gly Ile Phe Asp
420 425 430
Leu Ser Tyr Leu Thr Glu Met Pro His Met Thr Leu Met Ser Pro Lys
435 440 445
Cys Ile Asp Glu Leu Pro Tyr Met Leu Lys Trp Ala Leu Gly Gln Ser
450 455 460
Phe Pro Val Ala Ile Arg Tyr Pro Arg Gly Gly Asp Ser Val Cys Leu
465 470 475 480
Asn Pro Val Glu Asn Phe Lys Leu Gly Lys Trp Asp Cys Ile Ser Asn
485 490 495
Glu Gly Ser Val Ala Ile Ile Ala Gln Gly Lys Met Val Gln Asn Ala
500 505 510
Val Leu Ala Gly Lys Lys Leu Lys Glu Lys Gly Ile Asp Val Arg Ile
515 520 525
Ile Ser Ala Cys Phe Ile Lys Pro Leu Asp Lys Glu Met Leu Asn Arg
530 535 540
Leu Val Glu Glu Ser Val Thr Ile Val Thr Val Glu Asp Asn Val Ile
545 550 555 560
Arg Gly Gly Leu Gly Ser Tyr Ile Leu Glu Tyr Val Asn Lys Leu Asn
565 570 575
Lys Lys Val Lys Ile Ile Asn Leu Gly Phe Asp Asp Lys Phe Val Gln
580 585 590
His Gly Lys Ser Asp Ile Leu Tyr Lys Leu Tyr Gly Leu Asp Pro Lys
595 600 605
Gly Ile Val Asn Ser Val Leu Glu Ala Ala Glu Val Ser His Ile Phe
610 615 620
Arg Glu Phe
625
<210> 3
<211> 1158
<212> DNA
<213> 自产乙醇梭菌
<400> 3
atgaagagaa tttcaataat tggagccaca ggttctatag gaacccaaac tcttgatgta 60
cttagaaaac aaaaaggaga ttttcagctt ataggtgtat ctgcaaatag tagtgtagat 120
aaacttttac atataataga tgaatttaac cccaaatatg cggtgctaac cgaaaaagaa 180
tcttatttaa agataaaaga tatttttagt aataaaaaat caaatacaaa aatattattt 240
ggagtagatg gattaaatac tatagctagt cttcctgaag ttgatatggt tgtaacatct 300
gtagttggaa tgatagggct tgtaccaact ataaaagcaa ttaaagcgaa gaaagacata 360
gctttagcta ataaggagac attagttgta ggaggagaac tggttacaaa attatcgaaa 420
gaaaataata taaaaatatt tcctgtagat tcagagcata gtgctgtttt tcaatgcctt 480
cagggaaata attttgacga agttgctaat ttgattttaa ccgcttcagg tggacctttt 540
aggggaaaaa caaaagatca actctcaaaa gtaactgtaa aagaggcgtt gaatcatcca 600
aattggagta tgggaaaaaa gctcacaata gattctgcta ctcttatgaa taagggactt 660
gaagttatag aagctcactt cttatttaac ttaccttatg aaaatataaa ggttgtagtt 720
catccacaaa gtatagtaca ttctatggtg gaatataggg atggaagtgt tatggcacag 780
cttgccactg cagatatgag attacctata caatatgcac tgaattatcc gaaaagaaag 840
gaagctgtaa tagataaatt ggacttctat agcgtaggaa atttaagttt tgaaaagcct 900
gatacagata cattcagacc acttaaatta gcttatgaag cagggaggat aggaggcaca 960
atgccagcta tactaaattg tgcaaatgag gaagcagtaa gtttattcct tgctaataaa 1020
ataaattttt tggatatagg caacatatta gaagagtgta tgaataaatt tacttcacaa 1080
agtacgtata ctctggatga tttacttgac ctagaaataa aagttaagaa atatgtaaaa 1140
gataaattta tcaaataa 1158
<210> 4
<211> 385
<212> PRT
<213> 自产乙醇梭菌
<400> 4
Met Lys Arg Ile Ser Ile Ile Gly Ala Thr Gly Ser Ile Gly Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Asp Val Leu Arg Lys Gln Lys Gly Asp Phe Gln Leu Ile Gly
20 25 30
Val Ser Ala Asn Ser Ser Val Asp Lys Leu Leu His Ile Ile Asp Glu
35 40 45
Phe Asn Pro Lys Tyr Ala Val Leu Thr Glu Lys Glu Ser Tyr Leu Lys
50 55 60
Ile Lys Asp Ile Phe Ser Asn Lys Lys Ser Asn Thr Lys Ile Leu Phe
65 70 75 80
Gly Val Asp Gly Leu Asn Thr Ile Ala Ser Leu Pro Glu Val Asp Met
85 90 95
Val Val Thr Ser Val Val Gly Met Ile Gly Leu Val Pro Thr Ile Lys
100 105 110
Ala Ile Lys Ala Lys Lys Asp Ile Ala Leu Ala Asn Lys Glu Thr Leu
115 120 125
Val Val Gly Gly Glu Leu Val Thr Lys Leu Ser Lys Glu Asn Asn Ile
130 135 140
Lys Ile Phe Pro Val Asp Ser Glu His Ser Ala Val Phe Gln Cys Leu
145 150 155 160
Gln Gly Asn Asn Phe Asp Glu Val Ala Asn Leu Ile Leu Thr Ala Ser
165 170 175
Gly Gly Pro Phe Arg Gly Lys Thr Lys Asp Gln Leu Ser Lys Val Thr
180 185 190
Val Lys Glu Ala Leu Asn His Pro Asn Trp Ser Met Gly Lys Lys Leu
195 200 205
Thr Ile Asp Ser Ala Thr Leu Met Asn Lys Gly Leu Glu Val Ile Glu
210 215 220
Ala His Phe Leu Phe Asn Leu Pro Tyr Glu Asn Ile Lys Val Val Val
225 230 235 240
His Pro Gln Ser Ile Val His Ser Met Val Glu Tyr Arg Asp Gly Ser
245 250 255
Val Met Ala Gln Leu Ala Thr Ala Asp Met Arg Leu Pro Ile Gln Tyr
260 265 270
Ala Leu Asn Tyr Pro Lys Arg Lys Glu Ala Val Ile Asp Lys Leu Asp
275 280 285
Phe Tyr Ser Val Gly Asn Leu Ser Phe Glu Lys Pro Asp Thr Asp Thr
290 295 300
Phe Arg Pro Leu Lys Leu Ala Tyr Glu Ala Gly Arg Ile Gly Gly Thr
305 310 315 320
Met Pro Ala Ile Leu Asn Cys Ala Asn Glu Glu Ala Val Ser Leu Phe
325 330 335
Leu Ala Asn Lys Ile Asn Phe Leu Asp Ile Gly Asn Ile Leu Glu Glu
340 345 350
Cys Met Asn Lys Phe Thr Ser Gln Ser Thr Tyr Thr Leu Asp Asp Leu
355 360 365
Leu Asp Leu Glu Ile Lys Val Lys Lys Tyr Val Lys Asp Lys Phe Ile
370 375 380
Lys
385
<210> 5
<211> 693
<212> DNA
<213> 自产乙醇梭菌
<400> 5
atgaatggta attatgctat tattgtagct gccggcaagg gaaaaagaat gggaactact 60
attaataagc aatttattaa aattaagggt aagcctatat tatattattc cataagggca 120
ttttccataa atcctcttat agatggaatt atactggtat gtgcagaaac tgagatagaa 180
tattgtaaaa gagaagtagt agataaatat gggcttcaga aggtaattaa attagttgct 240
gggggtaaag aacgtcagga ttcggtattt aatggactag gagttttaga aaaagaaaac 300
tgtagtgttg ttctaattca cgatggggct agaccttttg tcactagtaa aattattgat 360
gatggaataa aatattctaa taggtatggg gcttgtgctt gtggagttag gcctaaggat 420
acactaaaag ttagggaaga aagtggattt tcttcttcta cattagagag aaaaagttta 480
tttgcagttc aaactccgca gtgttttaaa tatgatttaa tttatgactg tcataaaaaa 540
ttaatgaatg aaaaaatgtg tgttactgat gatactatgg tagtagagcg ttatggaaat 600
aaggtttatt tgtatgaagg taactatgaa aacataaaag tgaccacacc agaagattta 660
aatatagctg aaagtatagt tgaaaaatat taa 693
<210> 6
<211> 230
<212> PRT
<213> 自产乙醇梭菌
<400> 6
Met Asn Gly Asn Tyr Ala Ile Ile Val Ala Ala Gly Lys Gly Lys Arg
1 5 10 15
Met Gly Thr Thr Ile Asn Lys Gln Phe Ile Lys Ile Lys Gly Lys Pro
20 25 30
Ile Leu Tyr Tyr Ser Ile Arg Ala Phe Ser Ile Asn Pro Leu Ile Asp
35 40 45
Gly Ile Ile Leu Val Cys Ala Glu Thr Glu Ile Glu Tyr Cys Lys Arg
50 55 60
Glu Val Val Asp Lys Tyr Gly Leu Gln Lys Val Ile Lys Leu Val Ala
65 70 75 80
Gly Gly Lys Glu Arg Gln Asp Ser Val Phe Asn Gly Leu Gly Val Leu
85 90 95
Glu Lys Glu Asn Cys Ser Val Val Leu Ile His Asp Gly Ala Arg Pro
100 105 110
Phe Val Thr Ser Lys Ile Ile Asp Asp Gly Ile Lys Tyr Ser Asn Arg
115 120 125
Tyr Gly Ala Cys Ala Cys Gly Val Arg Pro Lys Asp Thr Leu Lys Val
130 135 140
Arg Glu Glu Ser Gly Phe Ser Ser Ser Thr Leu Glu Arg Lys Ser Leu
145 150 155 160
Phe Ala Val Gln Thr Pro Gln Cys Phe Lys Tyr Asp Leu Ile Tyr Asp
165 170 175
Cys His Lys Lys Leu Met Asn Glu Lys Met Cys Val Thr Asp Asp Thr
180 185 190
Met Val Val Glu Arg Tyr Gly Asn Lys Val Tyr Leu Tyr Glu Gly Asn
195 200 205
Tyr Glu Asn Ile Lys Val Thr Thr Pro Glu Asp Leu Asn Ile Ala Glu
210 215 220
Ser Ile Val Glu Lys Tyr
225 230
<210> 7
<211> 798
<212> DNA
<213> 自产乙醇梭菌
<400> 7
gtgggaaaaa gaaaagatgg gtatcatctt ttgaaaatga taatgcagaa tatagactta 60
tatgatgttt taaaaataga tgagatcaaa actggaatac agatatgctc taataataga 120
tatattccct gtgacaggag aaatttggtt tacagagcag caaaattatt tattgataaa 180
tataatataa agaatggaat tagtataaac ataggtaaaa atatacctgt atcagctgga 240
cttgctggtg gaagtgcgga tgctgcagct atactaaaga ctatgagaaa tatttatact 300
cctgaagtaa gtgataaaga attgagcgaa ttaggcttaa atataggggc agatgttcct 360
tattgtataa taggaggtac agccttgtgc gaggggatag gagagaaggt tacaccactc 420
atgccgttta gaaaccatat actcatatta attaaaccac cttttggagt gagcacagca 480
gaggtatata agagtttaga cataagtaaa ataaaaaggc atcctaatac agaaatttta 540
atagatgcgg ttaatgaatc aaaattggag atgctgagta aaaacatgaa aaatgttttg 600
gaaaatgtaa ctttaaaaaa atatcccgtg cttagaaaaa taaaaactga tttgatagat 660
tttggagcag ttggttcact tatgagtgga agcggtccaa gcatttttgc tttttttgat 720
gatatgctaa aagcacagaa atgttatgat aatatgaaaa ctaggtatag agaggtgttt 780
attacaagaa ccatttaa 798
<210> 8
<211> 265
<212> PRT
<213> 自产乙醇梭菌
<400> 8
Met Gly Lys Arg Lys Asp Gly Tyr His Leu Leu Lys Met Ile Met Gln
1 5 10 15
Asn Ile Asp Leu Tyr Asp Val Leu Lys Ile Asp Glu Ile Lys Thr Gly
20 25 30
Ile Gln Ile Cys Ser Asn Asn Arg Tyr Ile Pro Cys Asp Arg Arg Asn
35 40 45
Leu Val Tyr Arg Ala Ala Lys Leu Phe Ile Asp Lys Tyr Asn Ile Lys
50 55 60
Asn Gly Ile Ser Ile Asn Ile Gly Lys Asn Ile Pro Val Ser Ala Gly
65 70 75 80
Leu Ala Gly Gly Ser Ala Asp Ala Ala Ala Ile Leu Lys Thr Met Arg
85 90 95
Asn Ile Tyr Thr Pro Glu Val Ser Asp Lys Glu Leu Ser Glu Leu Gly
100 105 110
Leu Asn Ile Gly Ala Asp Val Pro Tyr Cys Ile Ile Gly Gly Thr Ala
115 120 125
Leu Cys Glu Gly Ile Gly Glu Lys Val Thr Pro Leu Met Pro Phe Arg
130 135 140
Asn His Ile Leu Ile Leu Ile Lys Pro Pro Phe Gly Val Ser Thr Ala
145 150 155 160
Glu Val Tyr Lys Ser Leu Asp Ile Ser Lys Ile Lys Arg His Pro Asn
165 170 175
Thr Glu Ile Leu Ile Asp Ala Val Asn Glu Ser Lys Leu Glu Met Leu
180 185 190
Ser Lys Asn Met Lys Asn Val Leu Glu Asn Val Thr Leu Lys Lys Tyr
195 200 205
Pro Val Leu Arg Lys Ile Lys Thr Asp Leu Ile Asp Phe Gly Ala Val
210 215 220
Gly Ser Leu Met Ser Gly Ser Gly Pro Ser Ile Phe Ala Phe Phe Asp
225 230 235 240
Asp Met Leu Lys Ala Gln Lys Cys Tyr Asp Asn Met Lys Thr Arg Tyr
245 250 255
Arg Glu Val Phe Ile Thr Arg Thr Ile
260 265
<210> 9
<211> 480
<212> DNA
<213> 自产乙醇梭菌
<400> 9
gtgaaaatcg ggcttggtta tgatgtccat aaattagttt ataatagacc tcttatttta 60
ggaggcgtaa atatcccttt tgaaaaaggt cttatgggac attcagatgc agatgtactt 120
cttcatgcaa taatggatag tctccttgga gccttgtgtc taggtgatat cggcaagcat 180
ttccctgata atgataataa atataagaac atatgtagtc ttaaattgct gtcacatgta 240
tcagctttga ttaatgaaaa aggatatact atagggaaca tagattctat tataatagcc 300
gaaaagccta aactttcttc atacatacaa gatatgaggg taaatatagc taaaactcta 360
aatgtaacta cagccgtaat aagtgtaaaa gccactacag aggaaggtct tggctttacc 420
ggcaaaggag aaggcatagc cgctcaaagc atctgtttgt taacagctaa ttcaaaataa 480
<210> 10
<211> 159
<212> PRT
<213> 自产乙醇梭菌
<400> 10
Met Lys Ile Gly Leu Gly Tyr Asp Val His Lys Leu Val Tyr Asn Arg
1 5 10 15
Pro Leu Ile Leu Gly Gly Val Asn Ile Pro Phe Glu Lys Gly Leu Met
20 25 30
Gly His Ser Asp Ala Asp Val Leu Leu His Ala Ile Met Asp Ser Leu
35 40 45
Leu Gly Ala Leu Cys Leu Gly Asp Ile Gly Lys His Phe Pro Asp Asn
50 55 60
Asp Asn Lys Tyr Lys Asn Ile Cys Ser Leu Lys Leu Leu Ser His Val
65 70 75 80
Ser Ala Leu Ile Asn Glu Lys Gly Tyr Thr Ile Gly Asn Ile Asp Ser
85 90 95
Ile Ile Ile Ala Glu Lys Pro Lys Leu Ser Ser Tyr Ile Gln Asp Met
100 105 110
Arg Val Asn Ile Ala Lys Thr Leu Asn Val Thr Thr Ala Val Ile Ser
115 120 125
Val Lys Ala Thr Thr Glu Glu Gly Leu Gly Phe Thr Gly Lys Gly Glu
130 135 140
Gly Ile Ala Ala Gln Ser Ile Cys Leu Leu Thr Ala Asn Ser Lys
145 150 155
<210> 11
<211> 1051
<212> DNA
<213> 自产乙醇梭菌
<400> 11
ttgaatagag taaaaaagaa aacagtaaag gtaggcaata tatttttagg tggagatttt 60
ccagtagccg tacaatctat gacaaatacg gatactaggg atgtagaagc cactacagct 120
cagatatttc agctaaaaga agcaggttgt gatatcgtca gatgtgcggt gcctgatgat 180
atagcttgca attccatgaa aaaaatcata gaaagagtag atattccact tgtagcagat 240
atacattttg attataagtt ggcgcttaaa tctatagaaa atgggatatc tgcacttaga 300
ataaatcctg gaaatattgg aagcatagaa agagtacgag aagtggcaag agcagcaaaa 360
gaagctaata ttccaattag aataggggta aactctggat cattaaaaaa agatatttta 420
aataaatatg gtagagtttg ttcggatgca ctagtagaga gtgctctaga acatgtaaaa 480
attttggaaa acgtaggatt ttatgatata gttatatcca taaaatcttc aaatgtaaat 540
cagatgatag aaagttatag aaaaatatct gaaattgtag attatccact tcaccttgga 600
gtaacagaag caggaactat ttggcgagga actataaaat caagcatagg cataggtact 660
cttttgatgg aaggtatagg agacactata agagtatctc ttacaggaaa tccagtggaa 720
gaagtaagag tgggaaaaga aatattaaaa tcctgtggaa ttataaaaga aggtgtggaa 780
tttatatcat gtcccacctg tggtagaact gaaattgatt taattaaaat agctgagcaa 840
gtggaaaaaa gacttttaaa tatgcataaa aacataaagg ttgctgttat gggatgtgta 900
gtaaatggac caggtgaggc tcgggaagca gatattggta tagcaggcgg caaaggtgaa 960
ggcattatat ttaaaaaagg aaaaatagta aaaaaggtaa gtgaagaaag tttagtagaa 1020
tcacttatag aagaaataga aaacatttga r 1051
<210> 12
<211> 349
<212> PRT
<213> 自产乙醇梭菌
<400> 12
Met Asn Arg Val Lys Lys Lys Thr Val Lys Val Gly Asn Ile Phe Leu
1 5 10 15
Gly Gly Asp Phe Pro Val Ala Val Gln Ser Met Thr Asn Thr Asp Thr
20 25 30
Arg Asp Val Glu Ala Thr Thr Ala Gln Ile Phe Gln Leu Lys Glu Ala
35 40 45
Gly Cys Asp Ile Val Arg Cys Ala Val Pro Asp Asp Ile Ala Cys Asn
50 55 60
Ser Met Lys Lys Ile Ile Glu Arg Val Asp Ile Pro Leu Val Ala Asp
65 70 75 80
Ile His Phe Asp Tyr Lys Leu Ala Leu Lys Ser Ile Glu Asn Gly Ile
85 90 95
Ser Ala Leu Arg Ile Asn Pro Gly Asn Ile Gly Ser Ile Glu Arg Val
100 105 110
Arg Glu Val Ala Arg Ala Ala Lys Glu Ala Asn Ile Pro Ile Arg Ile
115 120 125
Gly Val Asn Ser Gly Ser Leu Lys Lys Asp Ile Leu Asn Lys Tyr Gly
130 135 140
Arg Val Cys Ser Asp Ala Leu Val Glu Ser Ala Leu Glu His Val Lys
145 150 155 160
Ile Leu Glu Asn Val Gly Phe Tyr Asp Ile Val Ile Ser Ile Lys Ser
165 170 175
Ser Asn Val Asn Gln Met Ile Glu Ser Tyr Arg Lys Ile Ser Glu Ile
180 185 190
Val Asp Tyr Pro Leu His Leu Gly Val Thr Glu Ala Gly Thr Ile Trp
195 200 205
Arg Gly Thr Ile Lys Ser Ser Ile Gly Ile Gly Thr Leu Leu Met Glu
210 215 220
Gly Ile Gly Asp Thr Ile Arg Val Ser Leu Thr Gly Asn Pro Val Glu
225 230 235 240
Glu Val Arg Val Gly Lys Glu Ile Leu Lys Ser Cys Gly Ile Ile Lys
245 250 255
Glu Gly Val Glu Phe Ile Ser Cys Pro Thr Cys Gly Arg Thr Glu Ile
260 265 270
Asp Leu Ile Lys Ile Ala Glu Gln Val Glu Lys Arg Leu Leu Asn Met
275 280 285
His Lys Asn Ile Lys Val Ala Val Met Gly Cys Val Val Asn Gly Pro
290 295 300
Gly Glu Ala Arg Glu Ala Asp Ile Gly Ile Ala Gly Gly Lys Gly Glu
305 310 315 320
Gly Ile Ile Phe Lys Lys Gly Lys Ile Val Lys Lys Val Ser Glu Glu
325 330 335
Ser Leu Val Glu Ser Leu Ile Glu Glu Ile Glu Asn Ile
340 345
<210> 13
<211> 1923
<212> DNA
<213> 自产乙醇梭菌
<400> 13
gtgataaaat tgaacattat tttagcagac aaatccggat tttgctttgg agtaaaaaga 60
gctgtagacg aatctttaaa ggttcaaaaa aaatttaata aaaaaatata tactttaggt 120
cctttgattc ataatagtga tgtagtaaat aaattaaagg aaaaaggtat atatcctata 180
gaaatagata atatagataa tctaagggaa gatgatgtgg ttataatacg ttctcatggt 240
gttcccgaaa aaatattttt tactttaaaa aataaaaaaa taaacatagt aaatgcaact 300
tgcccatatg ttttaaatat acaaagaaaa gtacaagaat attataaatt agggtattct 360
atattaatag taggagataa aaatcatcct gaagtaattg gaataaatgg atggtgtgaa 420
aataaagctt taatatctaa agatggcacc aatttagaaa agttaccatc aaaactgtgt 480
atagtttctc aaactacaga aaaacaatct aactgggaaa aagtgcttag tatagtggct 540
aaaaattgta aagaatttat tgcttttaat actatatgca gtgccacaga atttcgtcag 600
aaggcagcag cagatatttc taaagaagta gatatgatgg tagtaatagg tggtaaaaac 660
agctctaata ctactaaact ttatgaaata tgtaaagata actgcaataa tactatttat 720
gttgaaaatt caggagaaat acctgatgat ataagtaatt gtaataaaat taaaactata 780
ggtgttacag caggagcttc aacaccagat tggataataa aggaggcaat tttaaaaatg 840
agtgatgaca aaaatttaga actaaatgag caactatctt atatggacaa aaatgatacc 900
caaataatat taggtgaaaa aattaagggt acagtaatat ctgtaaatcc aaaagaggtt 960
tttttaaata taggatataa atcagaaggt gtacttccaa aacgtgaaat aacaaaaaat 1020
gaaagtgaca acttagaaga attaattcat tgtggagatg aattatatgt taaagtaata 1080
agaagacaaa atgaagatgg atatgtggta ttatctaaga tagaattaga aagagaaaat 1140
gcttataaag aattaaagga agctaatgga aatagtcagg tattaaaggt tattgtaaaa 1200
gaagctgtaa atggaggtct tgttgccaat tacaaaggtg ctagggtatt tatacctgct 1260
tctcatgtag aattatatca tgtagatgat ctttcacaat atgtagataa agagcttgat 1320
gtaactataa ttgaatttaa agaagaaaag aaaggtacca gaatagtagc ttcaagaaga 1380
gaccttttga gaatggaaag agaaaaaatg gaagaacaga cttggaatgt gcttgaaaaa 1440
gatactgtag tagatggtga agttagaaga ttgactgatt ttggcgcatt tgttgatgta 1500
caaggagttg acgggcttct acatgtatct gaactttcct ggggaagagt tggaaaacca 1560
agtgatgttt taaaaatcgg agatacgatt aaggtttata tcttagacat tgataaagaa 1620
aaaaagaagt tatctttatc tttaaaaaag ctcatggaag atccatggat caacgtagac 1680
ataaaatatc ctgttggcaa tgtagttctt ggtaaagtag ttaggtttgc aaattttggt 1740
gcatttgttg aattagagcc aggtgtagat gcattagttc atatatcaca aataagccat 1800
aagagaatag ataaaccaga agatgtactt aaaataggtc aggaaataaa ggctaagatc 1860
cttgaagtaa acaaagatag cgaaaaaata gctttaagta taaaagaagt agatgaaatc 1920
taa 1923
<210> 14
<211> 640
<212> PRT
<213> 自产乙醇梭菌
<400> 14
Met Ile Lys Leu Asn Ile Ile Leu Ala Asp Lys Ser Gly Phe Cys Phe
1 5 10 15
Gly Val Lys Arg Ala Val Asp Glu Ser Leu Lys Val Gln Lys Lys Phe
20 25 30
Asn Lys Lys Ile Tyr Thr Leu Gly Pro Leu Ile His Asn Ser Asp Val
35 40 45
Val Asn Lys Leu Lys Glu Lys Gly Ile Tyr Pro Ile Glu Ile Asp Asn
50 55 60
Ile Asp Asn Leu Arg Glu Asp Asp Val Val Ile Ile Arg Ser His Gly
65 70 75 80
Val Pro Glu Lys Ile Phe Phe Thr Leu Lys Asn Lys Lys Ile Asn Ile
85 90 95
Val Asn Ala Thr Cys Pro Tyr Val Leu Asn Ile Gln Arg Lys Val Gln
100 105 110
Glu Tyr Tyr Lys Leu Gly Tyr Ser Ile Leu Ile Val Gly Asp Lys Asn
115 120 125
His Pro Glu Val Ile Gly Ile Asn Gly Trp Cys Glu Asn Lys Ala Leu
130 135 140
Ile Ser Lys Asp Gly Thr Asn Leu Glu Lys Leu Pro Ser Lys Leu Cys
145 150 155 160
Ile Val Ser Gln Thr Thr Glu Lys Gln Ser Asn Trp Glu Lys Val Leu
165 170 175
Ser Ile Val Ala Lys Asn Cys Lys Glu Phe Ile Ala Phe Asn Thr Ile
180 185 190
Cys Ser Ala Thr Glu Phe Arg Gln Lys Ala Ala Ala Asp Ile Ser Lys
195 200 205
Glu Val Asp Met Met Val Val Ile Gly Gly Lys Asn Ser Ser Asn Thr
210 215 220
Thr Lys Leu Tyr Glu Ile Cys Lys Asp Asn Cys Asn Asn Thr Ile Tyr
225 230 235 240
Val Glu Asn Ser Gly Glu Ile Pro Asp Asp Ile Ser Asn Cys Asn Lys
245 250 255
Ile Lys Thr Ile Gly Val Thr Ala Gly Ala Ser Thr Pro Asp Trp Ile
260 265 270
Ile Lys Glu Ala Ile Leu Lys Met Ser Asp Asp Lys Asn Leu Glu Leu
275 280 285
Asn Glu Gln Leu Ser Tyr Met Asp Lys Asn Asp Thr Gln Ile Ile Leu
290 295 300
Gly Glu Lys Ile Lys Gly Thr Val Ile Ser Val Asn Pro Lys Glu Val
305 310 315 320
Phe Leu Asn Ile Gly Tyr Lys Ser Glu Gly Val Leu Pro Lys Arg Glu
325 330 335
Ile Thr Lys Asn Glu Ser Asp Asn Leu Glu Glu Leu Ile His Cys Gly
340 345 350
Asp Glu Leu Tyr Val Lys Val Ile Arg Arg Gln Asn Glu Asp Gly Tyr
355 360 365
Val Val Leu Ser Lys Ile Glu Leu Glu Arg Glu Asn Ala Tyr Lys Glu
370 375 380
Leu Lys Glu Ala Asn Gly Asn Ser Gln Val Leu Lys Val Ile Val Lys
385 390 395 400
Glu Ala Val Asn Gly Gly Leu Val Ala Asn Tyr Lys Gly Ala Arg Val
405 410 415
Phe Ile Pro Ala Ser His Val Glu Leu Tyr His Val Asp Asp Leu Ser
420 425 430
Gln Tyr Val Asp Lys Glu Leu Asp Val Thr Ile Ile Glu Phe Lys Glu
435 440 445
Glu Lys Lys Gly Thr Arg Ile Val Ala Ser Arg Arg Asp Leu Leu Arg
450 455 460
Met Glu Arg Glu Lys Met Glu Glu Gln Thr Trp Asn Val Leu Glu Lys
465 470 475 480
Asp Thr Val Val Asp Gly Glu Val Arg Arg Leu Thr Asp Phe Gly Ala
485 490 495
Phe Val Asp Val Gln Gly Val Asp Gly Leu Leu His Val Ser Glu Leu
500 505 510
Ser Trp Gly Arg Val Gly Lys Pro Ser Asp Val Leu Lys Ile Gly Asp
515 520 525
Thr Ile Lys Val Tyr Ile Leu Asp Ile Asp Lys Glu Lys Lys Lys Leu
530 535 540
Ser Leu Ser Leu Lys Lys Leu Met Glu Asp Pro Trp Ile Asn Val Asp
545 550 555 560
Ile Lys Tyr Pro Val Gly Asn Val Val Leu Gly Lys Val Val Arg Phe
565 570 575
Ala Asn Phe Gly Ala Phe Val Glu Leu Glu Pro Gly Val Asp Ala Leu
580 585 590
Val His Ile Ser Gln Ile Ser His Lys Arg Ile Asp Lys Pro Glu Asp
595 600 605
Val Leu Lys Ile Gly Gln Glu Ile Lys Ala Lys Ile Leu Glu Val Asn
610 615 620
Lys Asp Ser Glu Lys Ile Ala Leu Ser Ile Lys Glu Val Asp Glu Ile
625 630 635 640
<210> 15
<211> 882
<212> DNA
<213> 自产乙醇梭菌
<400> 15
atggaaatta aaggtgtaat tgaaacatta agagaggaat tgaataaata cctctatgac 60
tatatggagg gaaaaggatc ttataataag agagtatatg aagctatgca gtatagctta 120
gatgcaggag gaaagagaat aagacctcta ctatttcttt tgacatataa actttataag 180
acagattgca atgaggttat ggatatagca gcagctatag aaatgataca cacttattcc 240
ttaattcatg atgatttacc tgctatggac aatgatgatt taagaagggg caaacctaca 300
aatcataagg tatttggaga agctattgct gtacttgcgg gagatggact tttaaatgaa 360
gcaatgagtc tgatgtttag acactgtatt gggaaaaagg ataacgctat aagggcttgt 420
agcattattt ctgaaagtgc aggagctgat gggatggttg gcggacagac agtggatatt 480
ttaagtgaaa acactaagat acctatagat cagctctatt acatgcacag taaaaaaacg 540
ggagcgctca taaaaggatc tataatatct gcagcagtat atgcgggagc aagtaaagct 600
gaaatagata aattaagcta ttatggagaa aagttaggat tggcatttca aataaaggat 660
gatatattgg atttaacagg agatactgct cttttaggta aaaagataaa aagtgatcta 720
aataataaca aaactacatt tataagtact tatggaataa ataaatgcaa agaaatgtgc 780
aattcaatta caagtgaatg tataggagta ctgaatggga tgagtgtaga tacttcttat 840
ctaaaagatt taacatcatt tttattaaat agagaaaagt ga 882
<210> 16
<211> 293
<212> PRT
<213> 自产乙醇梭菌
<400> 16
Met Glu Ile Lys Gly Val Ile Glu Thr Leu Arg Glu Glu Leu Asn Lys
1 5 10 15
Tyr Leu Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Lys Gly Ser Tyr Asn Lys Arg Val
20 25 30
Tyr Glu Ala Met Gln Tyr Ser Leu Asp Ala Gly Gly Lys Arg Ile Arg
35 40 45
Pro Leu Leu Phe Leu Leu Thr Tyr Lys Leu Tyr Lys Thr Asp Cys Asn
50 55 60
Glu Val Met Asp Ile Ala Ala Ala Ile Glu Met Ile His Thr Tyr Ser
65 70 75 80
Leu Ile His Asp Asp Leu Pro Ala Met Asp Asn Asp Asp Leu Arg Arg
85 90 95
Gly Lys Pro Thr Asn His Lys Val Phe Gly Glu Ala Ile Ala Val Leu
100 105 110
Ala Gly Asp Gly Leu Leu Asn Glu Ala Met Ser Leu Met Phe Arg His
115 120 125
Cys Ile Gly Lys Lys Asp Asn Ala Ile Arg Ala Cys Ser Ile Ile Ser
130 135 140
Glu Ser Ala Gly Ala Asp Gly Met Val Gly Gly Gln Thr Val Asp Ile
145 150 155 160
Leu Ser Glu Asn Thr Lys Ile Pro Ile Asp Gln Leu Tyr Tyr Met His
165 170 175
Ser Lys Lys Thr Gly Ala Leu Ile Lys Gly Ser Ile Ile Ser Ala Ala
180 185 190
Val Tyr Ala Gly Ala Ser Lys Ala Glu Ile Asp Lys Leu Ser Tyr Tyr
195 200 205
Gly Glu Lys Leu Gly Leu Ala Phe Gln Ile Lys Asp Asp Ile Leu Asp
210 215 220
Leu Thr Gly Asp Thr Ala Leu Leu Gly Lys Lys Ile Lys Ser Asp Leu
225 230 235 240
Asn Asn Asn Lys Thr Thr Phe Ile Ser Thr Tyr Gly Ile Asn Lys Cys
245 250 255
Lys Glu Met Cys Asn Ser Ile Thr Ser Glu Cys Ile Gly Val Leu Asn
260 265 270
Gly Met Ser Val Asp Thr Ser Tyr Leu Lys Asp Leu Thr Ser Phe Leu
275 280 285
Leu Asn Arg Glu Lys
290
<210> 17
<211> 519
<212> DNA
<213> 自产乙醇梭菌
<400> 17
atgaataaaa caaggaaaat ggttttttta agctttctaa caagtatggc tttagtcata 60
tacataatag aaactcaagt tccggtttta tttcccggaa taaaattagg acttgcaaat 120
acaatttccc tagctgcact tatacttata ggatggaaag aagccttact aattatgttt 180
ttaaggacgc ttctaggatc tatgtttggt gggacaatgt ctacctttat gttcagcata 240
gccggaggaa ttttaagtaa cattgttatg atccttctat acaaatattt taaaaattcc 300
ttaagtctat ggactataag catatgcggg gcaatatttc acaacatagg ccaactttta 360
gtagcttcta tagtaattca agattttagg atatacatat atctaccggt gcttttaatc 420
tctgctataa tcacaggata ctttataggt tggtgcgtga aattcctaac taataactta 480
tataaaattc ctatgtttaa agaattaaaa aataagtaa 519
<210> 18
<211> 172
<212> PRT
<213> 自产乙醇梭菌
<400> 18
Met Asn Lys Thr Arg Lys Met Val Phe Leu Ser Phe Leu Thr Ser Met
1 5 10 15
Ala Leu Val Ile Tyr Ile Ile Glu Thr Gln Val Pro Val Leu Phe Pro
20 25 30
Gly Ile Lys Leu Gly Leu Ala Asn Thr Ile Ser Leu Ala Ala Leu Ile
35 40 45
Leu Ile Gly Trp Lys Glu Ala Leu Leu Ile Met Phe Leu Arg Thr Leu
50 55 60
Leu Gly Ser Met Phe Gly Gly Thr Met Ser Thr Phe Met Phe Ser Ile
65 70 75 80
Ala Gly Gly Ile Leu Ser Asn Ile Val Met Ile Leu Leu Tyr Lys Tyr
85 90 95
Phe Lys Asn Ser Leu Ser Leu Trp Thr Ile Ser Ile Cys Gly Ala Ile
100 105 110
Phe His Asn Ile Gly Gln Leu Leu Val Ala Ser Ile Val Ile Gln Asp
115 120 125
Phe Arg Ile Tyr Ile Tyr Leu Pro Val Leu Leu Ile Ser Ala Ile Ile
130 135 140
Thr Gly Tyr Phe Ile Gly Trp Cys Val Lys Phe Leu Thr Asn Asn Leu
145 150 155 160
Tyr Lys Ile Pro Met Phe Lys Glu Leu Lys Asn Lys
165 170
<210> 19
<211> 825
<212> DNA
<213> 自产乙醇梭菌
<400> 19
atgaacttcg atggaatttc aattccaata ataaaagaac ttaatcaact tgagttagag 60
ttaaaaaata ttgcatcaaa attagattct actgttacac aagatatttt tacctacttt 120
ttttcaattc caggtaaaag actaagacct acattaacat ttttatctgc aggtgctatt 180
agtagcgagc ttacttcatc tgcaaaacac aacttaattc agttgtcaat aagcttagag 240
cttattcaca gcgctagtct aattcatgat gatatcatag atggtgactt actaagacgt 300
ggtcagaaaa ccttaaataa gacctttgga aataaaatag cagtacttgc cggtgatgct 360
ttgtactcaa gggcctttac tattttctca gatactctgc caagagaatt tgcgcaggta 420
atgggcagag ttactgaatc aatgtctgta gctgaaatat taaatgctaa caatccctct 480
cccgatcgtg aaacctattt taaaatcatc ttaggaaaaa cagcatcttt catgagcgct 540
tgttgtaggc ttggtggcag catagcttat gccccttacg aagagtctaa tatgctttct 600
aaatacggtg aaaaccttgg tatggcatat caaatactgg atgattatat cgatgaggat 660
cccgttgcaa tgaaaaatgt aactattgaa gagggatttg aatttgcata taatgccaaa 720
gcttctattg aaaatttaaa agactcagca tacaaacaaa gcttaataat gttagtagac 780
tatgttttag atttttatag tcctaaggta gagaatacat tatag 825
<210> 20
<211> 274
<212> PRT
<213> 自产乙醇梭菌
<400> 20
Met Asn Phe Asp Gly Ile Ser Ile Pro Ile Ile Lys Glu Leu Asn Gln
1 5 10 15
Leu Glu Leu Glu Leu Lys Asn Ile Ala Ser Lys Leu Asp Ser Thr Val
20 25 30
Thr Gln Asp Ile Phe Thr Tyr Phe Phe Ser Ile Pro Gly Lys Arg Leu
35 40 45
Arg Pro Thr Leu Thr Phe Leu Ser Ala Gly Ala Ile Ser Ser Glu Leu
50 55 60
Thr Ser Ser Ala Lys His Asn Leu Ile Gln Leu Ser Ile Ser Leu Glu
65 70 75 80
Leu Ile His Ser Ala Ser Leu Ile His Asp Asp Ile Ile Asp Gly Asp
85 90 95
Leu Leu Arg Arg Gly Gln Lys Thr Leu Asn Lys Thr Phe Gly Asn Lys
100 105 110
Ile Ala Val Leu Ala Gly Asp Ala Leu Tyr Ser Arg Ala Phe Thr Ile
115 120 125
Phe Ser Asp Thr Leu Pro Arg Glu Phe Ala Gln Val Met Gly Arg Val
130 135 140
Thr Glu Ser Met Ser Val Ala Glu Ile Leu Asn Ala Asn Asn Pro Ser
145 150 155 160
Pro Asp Arg Glu Thr Tyr Phe Lys Ile Ile Leu Gly Lys Thr Ala Ser
165 170 175
Phe Met Ser Ala Cys Cys Arg Leu Gly Gly Ser Ile Ala Tyr Ala Pro
180 185 190
Tyr Glu Glu Ser Asn Met Leu Ser Lys Tyr Gly Glu Asn Leu Gly Met
195 200 205
Ala Tyr Gln Ile Leu Asp Asp Tyr Ile Asp Glu Asp Pro Val Ala Met
210 215 220
Lys Asn Val Thr Ile Glu Glu Gly Phe Glu Phe Ala Tyr Asn Ala Lys
225 230 235 240
Ala Ser Ile Glu Asn Leu Lys Asp Ser Ala Tyr Lys Gln Ser Leu Ile
245 250 255
Met Leu Val Asp Tyr Val Leu Asp Phe Tyr Ser Pro Lys Val Glu Asn
260 265 270
Thr Leu
<210> 21
<211> 1797
<212> DNA
<213> 美洲山杨(Populus tremuloides)
<400> 21
catatggcaa cagaattatt atgtttacac agacctatat cacttactca caaacttttt 60
aggaatccat tacctaaagt tattcaagct acacctttaa cattaaaact taggtgtagt 120
gtttctacag aaaatgtatc atttagtgag acagaaactg aaacaagaag atcagcaaat 180
tatgaaccaa attcttggga ttatgattat cttctttctt ctgatactga tgagtcaata 240
gaagtacata aagataaggc taagaaatta gaagctgaag ttaggagaga aataaataat 300
gagaaggctg aatttcttac acttcttgaa cttattgata atgtacaaag acttggatta 360
ggatatagat ttgagtctga tataagaaga gcattagata gatttgtaag tagtggagga 420
tttgatggag ttactaaaac ttcattacat ggaacagcat tatcatttag gttattaagg 480
caacatggtt ttgaagtatc tcaagaagct tttagtggat ttaaagatca gaatggaaac 540
tttcttgaga atttaaagga agacataaaa gcaattcttt ctctttatga agcatcattt 600
ttagcattag aaggtgagaa tatattagat gaggctaaag tatttgcaat atctcatctt 660
aaagaactta gtgaagaaaa gattggtaaa gaattagctg aacaagtttc acatgcttta 720
gaattaccat tacatagaag aacacaaaga ttagaagcag tttggtcaat agaagcatat 780
agaaagaaag aagacgcaaa tcaagtactt ttagaacttg caatacttga ctacaatatg 840
attcaaagtg tatatcagag ggatttaaga gaaacatcaa gatggtggag aagagtagga 900
ttagcaacta aattacattt tgctagagat aggcttattg aaagttttta ttgggctgtt 960
ggagttgctt ttgaaccaca atattctgat tgcagaaata gtgtagcaaa gatgttttca 1020
tttgttacta taattgacga tatttacgat gtatatggaa ctttagatga acttgaactt 1080
tttactgatg cagttgaaag atgggatgta aatgctatta atgatcttcc tgattatatg 1140
aagttatgtt ttcttgcact ttacaatact attaacgaga tagcttacga taacttaaaa 1200
gataaaggtg agaacatact tccttattta acaaaagcat gggcagattt atgtaatgca 1260
tttcttcaag aagctaagtg gctttataat aaatcaacac ctacatttga tgattatttt 1320
ggaaatgcat ggaaaagttc tagtggacct ttacagctta tttttgctta ttttgctgta 1380
gtacagaaca ttaaaaagga agagattgag aatcttcaga aatatcatga cataatatca 1440
agacctagtc acatttttag gctttgtaat gatttagcat ctgcttcagc agaaatagca 1500
agaggtgaaa ctgctaattc tgtaagttgt tatatgagaa caaaaggtat atctgaagaa 1560
ttagctactg aaagtgttat gaatcttata gacgaaactt ggaagaaaat gaacaaagaa 1620
aaacttggtg gatctttatt tgcaaaacct tttgttgaga ctgctataaa tttagctaga 1680
cagtctcatt gcacatatca taatggtgat gcacatacta gtccagatga attaactagg 1740
aaaagagtac ttagtgtaat aactgaacca atattaccat ttgaaagata agaattc 1797
<210> 22
<211> 617
<212> DNA
<213> 自产乙醇梭菌
<400> 22
ggttaatgtt aaaaatttat agtataactt taaaaaactg tcttaaaaag ttgttatata 60
aaaaatgttg acaattaaac agctatttag tgcaaaacaa ccataaaaat ttaaaaaata 120
ccataaatta cttgaaaaat agttgataat aatgtagagt tataaacaaa ggtgaaaagc 180
attacttgta ttctttttta tatattatta taaattaaaa tgaagctgta ttagaaaaaa 240
tacacacctg taatataaaa ttttaaatta atttttaatt ttttcaaaat gtattttaca 300
tgtttagaat tttgatgtat attaaaatag tagaatacat aagatactta atttaattaa 360
agatagttaa gtacttttca atgtgctttt ttagatgttt aatacaaatc tttaattgta 420
aaagaaatgc tgtactattt actgtactag tgacgggatt aaactgtatt aattataaat 480
aaaaaataag tacagttgtt taaaattata ttttgtatta aatctaatag tacgatgtaa 540
gttattttat actattgcta gtttaataaa aagatttaat tatatacttg aaaaggagag 600
gaatttttat gcgtaaa 617
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸Ppfor-NotI-F
<400> 23
aagcggccgc aaaatagttg ataataatgc 30
<210> 24
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸Ppfor-NdeI-R
<400> 24
tacgcatatg aattcctctc cttttcaagc 30
<210> 25
<211> 5345
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒pMTL 85146-ispS
<400> 25
aattcgagct cggtacccgg ggatcctcta gagtcgacgt cacgcgtcca tggagatctc 60
gaggcctgca gacatgcaag cttggcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa 120
aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt 180
aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa 240
tggcgctagc ataaaaataa gaagcctgca tttgcaggct tcttattttt atggcgcgcc 300
gcattcactt cttttctata taaatatgag cgaagcgaat aagcgtcgga aaagcagcaa 360
aaagtttcct ttttgctgtt ggagcatggg ggttcagggg gtgcagtatc tgacgtcaat 420
gccgagcgaa agcgagccga agggtagcat ttacgttaga taaccccctg atatgctccg 480
acgctttata tagaaaagaa gattcaacta ggtaaaatct taatataggt tgagatgata 540
aggtttataa ggaatttgtt tgttctaatt tttcactcat tttgttctaa tttcttttaa 600
caaatgttct ttttttttta gaacagttat gatatagtta gaatagttta aaataaggag 660
tgagaaaaag atgaaagaaa gatatggaac agtctataaa ggctctcaga ggctcataga 720
cgaagaaagt ggagaagtca tagaggtaga caagttatac cgtaaacaaa cgtctggtaa 780
cttcgtaaag gcatatatag tgcaattaat aagtatgtta gatatgattg gcggaaaaaa 840
acttaaaatc gttaactata tcctagataa tgtccactta agtaacaata caatgatagc 900
tacaacaaga gaaatagcaa aagctacagg aacaagtcta caaacagtaa taacaacact 960
taaaatctta gaagaaggaa atattataaa aagaaaaact ggagtattaa tgttaaaccc 1020
tgaactacta atgagaggcg acgaccaaaa acaaaaatac ctcttactcg aatttgggaa 1080
ctttgagcaa gaggcaaatg aaatagattg acctcccaat aacaccacgt agttattggg 1140
aggtcaatct atgaaatgcg attaagggcc ggccagtggg caagttgaaa aattcacaaa 1200
aatgtggtat aatatctttg ttcattagag cgataaactt gaatttgaga gggaacttag 1260
atggtatttg aaaaaattga taaaaatagt tggaacagaa aagagtattt tgaccactac 1320
tttgcaagtg taccttgtac ctacagcatg accgttaaag tggatatcac acaaataaag 1380
gaaaagggaa tgaaactata tcctgcaatg ctttattata ttgcaatgat tgtaaaccgc 1440
cattcagagt ttaggacggc aatcaatcaa gatggtgaat tggggatata tgatgagatg 1500
ataccaagct atacaatatt tcacaatgat actgaaacat tttccagcct ttggactgag 1560
tgtaagtctg actttaaatc atttttagca gattatgaaa gtgatacgca acggtatgga 1620
aacaatcata gaatggaagg aaagccaaat gctccggaaa acatttttaa tgtatctatg 1680
ataccgtggt caaccttcga tggctttaat ctgaatttgc agaaaggata tgattatttg 1740
attcctattt ttactatggg gaaatattat aaagaagata acaaaattat acttcctttg 1800
gcaattcaag ttcatcacgc agtatgtgac ggatttcaca tttgccgttt tgtaaacgaa 1860
ttgcaggaat tgataaatag ttaacttcag gtttgtctgt aactaaaaac aagtatttaa 1920
gcaaaaacat cgtagaaata cggtgttttt tgttacccta agtttaaact cctttttgat 1980
aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta 2040
gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa 2100
acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt 2160
tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgttct tctagtgtag 2220
ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta 2280
atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca 2340
agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag 2400
cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa 2460
agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga 2520
acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc 2580
gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc 2640
ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt 2700
gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt 2760
gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag 2820
gaagcggaag agcgcccaat acgcagggcc ccctgcagga taaaaaaatt gtagataaat 2880
tttataaaat agttttatct acaatttttt tatcaggaaa cagctatgac cgcggccgcg 2940
gttaatgtta aaaatttata gtataacttt aaaaaactgt cttaaaaagt tgttatataa 3000
aaaatgttga caattaaaca gctatttagt gcaaaacaac cataaaaatt taaaaaatac 3060
cataaattac ttgaaaaata gttgataata atgtagagtt ataaacaaag gtgaaaagca 3120
ttacttgtat tcttttttat atattattat aaattaaaat gaagctgtat tagaaaaaat 3180
acacacctgt aatataaaat tttaaattaa tttttaattt tttcaaaatg tattttacat 3240
gtttagaatt ttgatgtata ttaaaatagt agaatacata agatacttaa tttaattaaa 3300
gatagttaag tacttttcaa tgtgcttttt tagatgttta atacaaatct ttaattgtaa 3360
aagaaatgct gtactattta ctgtactagt gacgggatta aactgtatta attataaata 3420
aaaaataagt acagttgttt aaaattatat tttgtattaa atctaatagt acgatgtaag 3480
ttattttata ctattgctag tttaataaaa agatttaatt atatacttga aaaggagagg 3540
aatttttatg cgtcatatgg caacagaatt attatgttta cacagaccta tatcacttac 3600
tcacaaactt tttaggaatc cattacctaa agttattcaa gctacacctt taacattaaa 3660
acttaggtgt agtgtttcta cagaaaatgt atcatttagt gagacagaaa ctgaaacaag 3720
aagatcagca aattatgaac caaattcttg ggattatgat tatcttcttt cttctgatac 3780
tgatgagtca atagaagtac ataaagataa ggctaagaaa ttagaagctg aagttaggag 3840
agaaataaat aatgagaagg ctgaatttct tacacttctt gaacttattg ataatgtaca 3900
aagacttgga ttaggatata gatttgagtc tgatataaga agagcattag atagatttgt 3960
aagtagtgga ggatttgatg gagttactaa aacttcatta catggaacag cattatcatt 4020
taggttatta aggcaacatg gttttgaagt atctcaagaa gcttttagtg gatttaaaga 4080
tcagaatgga aactttcttg agaatttaaa ggaagacata aaagcaattc tttctcttta 4140
tgaagcatca tttttagcat tagaaggtga gaatatatta gatgaggcta aagtatttgc 4200
aatatctcat cttaaagaac ttagtgaaga aaagattggt aaagaattag ctgaacaagt 4260
ttcacatgct ttagaattac cattacatag aagaacacaa agattagaag cagtttggtc 4320
aatagaagca tatagaaaga aagaagacgc aaatcaagta cttttagaac ttgcaatact 4380
tgactacaat atgattcaaa gtgtatatca gagggattta agagaaacat caagatggtg 4440
gagaagagta ggattagcaa ctaaattaca ttttgctaga gataggctta ttgaaagttt 4500
ttattgggct gttggagttg cttttgaacc acaatattct gattgcagaa atagtgtagc 4560
aaagatgttt tcatttgtta ctataattga cgatatttac gatgtatatg gaactttaga 4620
tgaacttgaa ctttttactg atgcagttga aagatgggat gtaaatgcta ttaatgatct 4680
tcctgattat atgaagttat gttttcttgc actttacaat actattaacg agatagctta 4740
cgataactta aaagataaag gtgagaacat acttccttat ttaacaaaag catgggcaga 4800
tttatgtaat gcatttcttc aagaagctaa gtggctttat aataaatcaa cacctacatt 4860
tgatgattat tttggaaatg catggaaaag ttctagtgga cctttacagc ttatttttgc 4920
ttattttgct gtagtacaga acattaaaaa ggaagagatt gagaatcttc agaaatatca 4980
tgacataata tcaagaccta gtcacatttt taggctttgt aatgatttag catctgcttc 5040
agcagaaata gcaagaggtg aaactgctaa ttctgtaagt tgttatatga gaacaaaagg 5100
tatatctgaa gaattagcta ctgaaagtgt tatgaatctt atagacgaaa cttggaagaa 5160
aatgaacaaa gaaaaacttg gtggatcttt atttgcaaaa ccttttgttg agactgctat 5220
aaatttagct agacagtctc attgcacata tcataatggt gatgcacata ctagtccaga 5280
tgaattaact aggaaaagag tacttagtgt aataactgaa ccaatattac catttgaaag 5340
ataag 5345
<210> 26
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸Idi-Cbei-SacI-F
<400> 26
gtgagctcga aaggggaaat taaatg 26
<210> 27
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸Idi-Cbei-KpnI-R
<400> 27
atggtacccc aaatctttat ttagacg 27
<210> 28
<211> 5905
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒pMTL85246-ispS-idi
<400> 28
ccggggatcc tctagagtcg acgtcacgcg tccatggaga tctcgaggcc tgcagacatg 60
caagcttggc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc 120
aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc 180
gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatggcgc tagcataaaa 240
ataagaagcc tgcatttgca ggcttcttat ttttatggcg cgccgcattc acttcttttc 300
tatataaata tgagcgaagc gaataagcgt cggaaaagca gcaaaaagtt tcctttttgc 360
tgttggagca tgggggttca gggggtgcag tatctgacgt caatgccgag cgaaagcgag 420
ccgaagggta gcatttacgt tagataaccc cctgatatgc tccgacgctt tatatagaaa 480
agaagattca actaggtaaa atcttaatat aggttgagat gataaggttt ataaggaatt 540
tgtttgttct aatttttcac tcattttgtt ctaatttctt ttaacaaatg ttcttttttt 600
tttagaacag ttatgatata gttagaatag tttaaaataa ggagtgagaa aaagatgaaa 660
gaaagatatg gaacagtcta taaaggctct cagaggctca tagacgaaga aagtggagaa 720
gtcatagagg tagacaagtt ataccgtaaa caaacgtctg gtaacttcgt aaaggcatat 780
atagtgcaat taataagtat gttagatatg attggcggaa aaaaacttaa aatcgttaac 840
tatatcctag ataatgtcca cttaagtaac aatacaatga tagctacaac aagagaaata 900
gcaaaagcta caggaacaag tctacaaaca gtaataacaa cacttaaaat cttagaagaa 960
ggaaatatta taaaaagaaa aactggagta ttaatgttaa accctgaact actaatgaga 1020
ggcgacgacc aaaaacaaaa atacctctta ctcgaatttg ggaactttga gcaagaggca 1080
aatgaaatag attgacctcc caataacacc acgtagttat tgggaggtca atctatgaaa 1140
tgcgattaag ggccggccag tgggcaagtt gaaaaattca caaaaatgtg gtataatatc 1200
tttgttcatt agagcgataa acttgaattt gagagggaac ttagatggta tttgaaaaaa 1260
ttgataaaaa tagttggaac agaaaagagt attttgacca ctactttgca agtgtacctt 1320
gtacctacag catgaccgtt aaagtggata tcacacaaat aaaggaaaag ggaatgaaac 1380
tatatcctgc aatgctttat tatattgcaa tgattgtaaa ccgccattca gagtttagga 1440
cggcaatcaa tcaagatggt gaattgggga tatatgatga gatgatacca agctatacaa 1500
tatttcacaa tgatactgaa acattttcca gcctttggac tgagtgtaag tctgacttta 1560
aatcattttt agcagattat gaaagtgata cgcaacggta tggaaacaat catagaatgg 1620
aaggaaagcc aaatgctccg gaaaacattt ttaatgtatc tatgataccg tggtcaacct 1680
tcgatggctt taatctgaat ttgcagaaag gatatgatta tttgattcct atttttacta 1740
tggggaaata ttataaagaa gataacaaaa ttatacttcc tttggcaatt caagttcatc 1800
acgcagtatg tgacggattt cacatttgcc gttttgtaaa cgaattgcag gaattgataa 1860
atagttaact tcaggtttgt ctgtaactaa aaacaagtat ttaagcaaaa acatcgtaga 1920
aatacggtgt tttttgttac cctaagttta aactcctttt tgataatctc atgaccaaaa 1980
tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat 2040
cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc 2100
taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg 2160
gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc 2220
acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg 2280
ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg 2340
ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa 2400
cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg 2460
aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga 2520
gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct 2580
gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca 2640
gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc 2700
ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg 2760
ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc 2820
caatacgcag ggccccctgc aggataaaaa aattgtagat aaattttata aaatagtttt 2880
atctacaatt tttttatcag gaaacagcta tgaccgcggc cgcggttaat gttaaaaatt 2940
tatagtataa ctttaaaaaa ctgtcttaaa aagttgttat ataaaaaatg ttgacaatta 3000
aacagctatt tagtgcaaaa caaccataaa aatttaaaaa ataccataaa ttacttgaaa 3060
aatagttgat aataatgtag agttataaac aaaggtgaaa agcattactt gtattctttt 3120
ttatatatta ttataaatta aaatgaagct gtattagaaa aaatacacac ctgtaatata 3180
aaattttaaa ttaattttta attttttcaa aatgtatttt acatgtttag aattttgatg 3240
tatattaaaa tagtagaata cataagatac ttaatttaat taaagatagt taagtacttt 3300
tcaatgtgct tttttagatg tttaatacaa atctttaatt gtaaaagaaa tgctgtacta 3360
tttactgtac tagtgacggg attaaactgt attaattata aataaaaaat aagtacagtt 3420
gtttaaaatt atattttgta ttaaatctaa tagtacgatg taagttattt tatactattg 3480
ctagtttaat aaaaagattt aattatatac ttgaaaagga gaggaatttt tatgcgtcat 3540
atggcaacag aattattatg tttacacaga cctatatcac ttactcacaa actttttagg 3600
aatccattac ctaaagttat tcaagctaca cctttaacat taaaacttag gtgtagtgtt 3660
tctacagaaa atgtatcatt tagtgagaca gaaactgaaa caagaagatc agcaaattat 3720
gaaccaaatt cttgggatta tgattatctt ctttcttctg atactgatga gtcaatagaa 3780
gtacataaag ataaggctaa gaaattagaa gctgaagtta ggagagaaat aaataatgag 3840
aaggctgaat ttcttacact tcttgaactt attgataatg tacaaagact tggattagga 3900
tatagatttg agtctgatat aagaagagca ttagatagat ttgtaagtag tggaggattt 3960
gatggagtta ctaaaacttc attacatgga acagcattat catttaggtt attaaggcaa 4020
catggttttg aagtatctca agaagctttt agtggattta aagatcagaa tggaaacttt 4080
cttgagaatt taaaggaaga cataaaagca attctttctc tttatgaagc atcattttta 4140
gcattagaag gtgagaatat attagatgag gctaaagtat ttgcaatatc tcatcttaaa 4200
gaacttagtg aagaaaagat tggtaaagaa ttagctgaac aagtttcaca tgctttagaa 4260
ttaccattac atagaagaac acaaagatta gaagcagttt ggtcaataga agcatataga 4320
aagaaagaag acgcaaatca agtactttta gaacttgcaa tacttgacta caatatgatt 4380
caaagtgtat atcagaggga tttaagagaa acatcaagat ggtggagaag agtaggatta 4440
gcaactaaat tacattttgc tagagatagg cttattgaaa gtttttattg ggctgttgga 4500
gttgcttttg aaccacaata ttctgattgc agaaatagtg tagcaaagat gttttcattt 4560
gttactataa ttgacgatat ttacgatgta tatggaactt tagatgaact tgaacttttt 4620
actgatgcag ttgaaagatg ggatgtaaat gctattaatg atcttcctga ttatatgaag 4680
ttatgttttc ttgcacttta caatactatt aacgagatag cttacgataa cttaaaagat 4740
aaaggtgaga acatacttcc ttatttaaca aaagcatggg cagatttatg taatgcattt 4800
cttcaagaag ctaagtggct ttataataaa tcaacaccta catttgatga ttattttgga 4860
aatgcatgga aaagttctag tggaccttta cagcttattt ttgcttattt tgctgtagta 4920
cagaacatta aaaaggaaga gattgagaat cttcagaaat atcatgacat aatatcaaga 4980
cctagtcaca tttttaggct ttgtaatgat ttagcatctg cttcagcaga aatagcaaga 5040
ggtgaaactg ctaattctgt aagttgttat atgagaacaa aaggtatatc tgaagaatta 5100
gctactgaaa gtgttatgaa tcttatagac gaaacttgga agaaaatgaa caaagaaaaa 5160
cttggtggat ctttatttgc aaaacctttt gttgagactg ctataaattt agctagacag 5220
tctcattgca catatcataa tggtgatgca catactagtc cagatgaatt aactaggaaa 5280
agagtactta gtgtaataac tgaaccaata ttaccatttg aaagataaga attcgagctc 5340
gaaaggggaa attaaatggc agaatatata atagctgtag atgaatttga taacgaaata 5400
ggttcaattg aaaaaatgga ggctcaccgt aaaggaacat tacatagagc tttttctata 5460
ttagtattta attctaaaaa tcaattgtta ttacagaaaa gaaatgtaaa aaaatatcat 5520
tcgcctggtc tctggacaaa tacgtgctgt agtcatccaa gatacggtga aagtttacat 5580
gatgcgattt atagaaggct taaggaagaa atgggtttta catgtgaact tgaagaagta 5640
tttagtttta tttataaagt aaaacttgaa gataatcttt ttgaaaatga atatgatcat 5700
gtattcattg ggaaatatga tggagaaata attgtaaaca aagatgaagt agatgatttt 5760
aagtgggttg atattaatga ggttaagaag gatattatag aaaggccaga agcatacact 5820
tattggttca agtatttagt taataaggca gaaaacaaaa tatttaaata agtaagaatt 5880
tcgtctaaat aaagatttgg ggtac 5905
<210> 29
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸Dxs-SalI-F
<400> 29
gcagtcgact ttattaaagg gatagataa 29
<210> 30
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸Dxs-XhoI-R
<400> 30
tgctcgagtt aaaatatatg acttacctct g 31
<210> 31
<211> 7784
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒pMTL85246-ispS-idi-dxs
<400> 31
tcgaggcctg cagacatgca agcttggcac tggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg 60
aaaaccctgg cgttacccaa cttaatcgcc ttgcagcaca tccccctttc gccagctggc 120
gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg 180
aatggcgcta gcataaaaat aagaagcctg catttgcagg cttcttattt ttatggcgcg 240
ccgcattcac ttcttttcta tataaatatg agcgaagcga ataagcgtcg gaaaagcagc 300
aaaaagtttc ctttttgctg ttggagcatg ggggttcagg gggtgcagta tctgacgtca 360
atgccgagcg aaagcgagcc gaagggtagc atttacgtta gataaccccc tgatatgctc 420
cgacgcttta tatagaaaag aagattcaac taggtaaaat cttaatatag gttgagatga 480
taaggtttat aaggaatttg tttgttctaa tttttcactc attttgttct aatttctttt 540
aacaaatgtt cttttttttt tagaacagtt atgatatagt tagaatagtt taaaataagg 600
agtgagaaaa agatgaaaga aagatatgga acagtctata aaggctctca gaggctcata 660
gacgaagaaa gtggagaagt catagaggta gacaagttat accgtaaaca aacgtctggt 720
aacttcgtaa aggcatatat agtgcaatta ataagtatgt tagatatgat tggcggaaaa 780
aaacttaaaa tcgttaacta tatcctagat aatgtccact taagtaacaa tacaatgata 840
gctacaacaa gagaaatagc aaaagctaca ggaacaagtc tacaaacagt aataacaaca 900
cttaaaatct tagaagaagg aaatattata aaaagaaaaa ctggagtatt aatgttaaac 960
cctgaactac taatgagagg cgacgaccaa aaacaaaaat acctcttact cgaatttggg 1020
aactttgagc aagaggcaaa tgaaatagat tgacctccca ataacaccac gtagttattg 1080
ggaggtcaat ctatgaaatg cgattaaggg ccggccagtg ggcaagttga aaaattcaca 1140
aaaatgtggt ataatatctt tgttcattag agcgataaac ttgaatttga gagggaactt 1200
agatggtatt tgaaaaaatt gataaaaata gttggaacag aaaagagtat tttgaccact 1260
actttgcaag tgtaccttgt acctacagca tgaccgttaa agtggatatc acacaaataa 1320
aggaaaaggg aatgaaacta tatcctgcaa tgctttatta tattgcaatg attgtaaacc 1380
gccattcaga gtttaggacg gcaatcaatc aagatggtga attggggata tatgatgaga 1440
tgataccaag ctatacaata tttcacaatg atactgaaac attttccagc ctttggactg 1500
agtgtaagtc tgactttaaa tcatttttag cagattatga aagtgatacg caacggtatg 1560
gaaacaatca tagaatggaa ggaaagccaa atgctccgga aaacattttt aatgtatcta 1620
tgataccgtg gtcaaccttc gatggcttta atctgaattt gcagaaagga tatgattatt 1680
tgattcctat ttttactatg gggaaatatt ataaagaaga taacaaaatt atacttcctt 1740
tggcaattca agttcatcac gcagtatgtg acggatttca catttgccgt tttgtaaacg 1800
aattgcagga attgataaat agttaacttc aggtttgtct gtaactaaaa acaagtattt 1860
aagcaaaaac atcgtagaaa tacggtgttt tttgttaccc taagtttaaa ctcctttttg 1920
ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg 1980
tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc 2040
aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc 2100
tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtt cttctagtgt 2160
agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc 2220
taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact 2280
caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac 2340
agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag 2400
aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg 2460
gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg 2520
tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga 2580
gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt 2640
ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct 2700
ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg 2760
aggaagcgga agagcgccca atacgcaggg ccccctgcag gataaaaaaa ttgtagataa 2820
attttataaa atagttttat ctacaatttt tttatcagga aacagctatg accgcggccg 2880
cggttaatgt taaaaattta tagtataact ttaaaaaact gtcttaaaaa gttgttatat 2940
aaaaaatgtt gacaattaaa cagctattta gtgcaaaaca accataaaaa tttaaaaaat 3000
accataaatt acttgaaaaa tagttgataa taatgtagag ttataaacaa aggtgaaaag 3060
cattacttgt attctttttt atatattatt ataaattaaa atgaagctgt attagaaaaa 3120
atacacacct gtaatataaa attttaaatt aatttttaat tttttcaaaa tgtattttac 3180
atgtttagaa ttttgatgta tattaaaata gtagaataca taagatactt aatttaatta 3240
aagatagtta agtacttttc aatgtgcttt tttagatgtt taatacaaat ctttaattgt 3300
aaaagaaatg ctgtactatt tactgtacta gtgacgggat taaactgtat taattataaa 3360
taaaaaataa gtacagttgt ttaaaattat attttgtatt aaatctaata gtacgatgta 3420
agttatttta tactattgct agtttaataa aaagatttaa ttatatactt gaaaaggaga 3480
ggaattttta tgcgtcatat ggcaacagaa ttattatgtt tacacagacc tatatcactt 3540
actcacaaac tttttaggaa tccattacct aaagttattc aagctacacc tttaacatta 3600
aaacttaggt gtagtgtttc tacagaaaat gtatcattta gtgagacaga aactgaaaca 3660
agaagatcag caaattatga accaaattct tgggattatg attatcttct ttcttctgat 3720
actgatgagt caatagaagt acataaagat aaggctaaga aattagaagc tgaagttagg 3780
agagaaataa ataatgagaa ggctgaattt cttacacttc ttgaacttat tgataatgta 3840
caaagacttg gattaggata tagatttgag tctgatataa gaagagcatt agatagattt 3900
gtaagtagtg gaggatttga tggagttact aaaacttcat tacatggaac agcattatca 3960
tttaggttat taaggcaaca tggttttgaa gtatctcaag aagcttttag tggatttaaa 4020
gatcagaatg gaaactttct tgagaattta aaggaagaca taaaagcaat tctttctctt 4080
tatgaagcat catttttagc attagaaggt gagaatatat tagatgaggc taaagtattt 4140
gcaatatctc atcttaaaga acttagtgaa gaaaagattg gtaaagaatt agctgaacaa 4200
gtttcacatg ctttagaatt accattacat agaagaacac aaagattaga agcagtttgg 4260
tcaatagaag catatagaaa gaaagaagac gcaaatcaag tacttttaga acttgcaata 4320
cttgactaca atatgattca aagtgtatat cagagggatt taagagaaac atcaagatgg 4380
tggagaagag taggattagc aactaaatta cattttgcta gagataggct tattgaaagt 4440
ttttattggg ctgttggagt tgcttttgaa ccacaatatt ctgattgcag aaatagtgta 4500
gcaaagatgt tttcatttgt tactataatt gacgatattt acgatgtata tggaacttta 4560
gatgaacttg aactttttac tgatgcagtt gaaagatggg atgtaaatgc tattaatgat 4620
cttcctgatt atatgaagtt atgttttctt gcactttaca atactattaa cgagatagct 4680
tacgataact taaaagataa aggtgagaac atacttcctt atttaacaaa agcatgggca 4740
gatttatgta atgcatttct tcaagaagct aagtggcttt ataataaatc aacacctaca 4800
tttgatgatt attttggaaa tgcatggaaa agttctagtg gacctttaca gcttattttt 4860
gcttattttg ctgtagtaca gaacattaaa aaggaagaga ttgagaatct tcagaaatat 4920
catgacataa tatcaagacc tagtcacatt tttaggcttt gtaatgattt agcatctgct 4980
tcagcagaaa tagcaagagg tgaaactgct aattctgtaa gttgttatat gagaacaaaa 5040
ggtatatctg aagaattagc tactgaaagt gttatgaatc ttatagacga aacttggaag 5100
aaaatgaaca aagaaaaact tggtggatct ttatttgcaa aaccttttgt tgagactgct 5160
ataaatttag ctagacagtc tcattgcaca tatcataatg gtgatgcaca tactagtcca 5220
gatgaattaa ctaggaaaag agtacttagt gtaataactg aaccaatatt accatttgaa 5280
agataagaat tcgagctcga aaggggaaat taaatggcag aatatataat agctgtagat 5340
gaatttgata acgaaatagg ttcaattgaa aaaatggagg ctcaccgtaa aggaacatta 5400
catagagctt tttctatatt agtatttaat tctaaaaatc aattgttatt acagaaaaga 5460
aatgtaaaaa aatatcattc gcctggtctc tggacaaata cgtgctgtag tcatccaaga 5520
tacggtgaaa gtttacatga tgcgatttat agaaggctta aggaagaaat gggttttaca 5580
tgtgaacttg aagaagtatt tagttttatt tataaagtaa aacttgaaga taatcttttt 5640
gaaaatgaat atgatcatgt attcattggg aaatatgatg gagaaataat tgtaaacaaa 5700
gatgaagtag atgattttaa gtgggttgat attaatgagg ttaagaagga tattatagaa 5760
aggccagaag catacactta ttggttcaag tatttagtta ataaggcaga aaacaaaata 5820
tttaaataag taagaatttc gtctaaataa agatttgggg tacccgggga tcctctagag 5880
tcgactttat taaagggata gataaggatg agtaatttat tagataatta taaagatata 5940
aatgacgtaa agaagatgtc gttaaatgat aaaaaaaagc tagctagaga aattagaaaa 6000
tttttaatag acaaagtatc taagacagga ggtcatttgg cgtctaactt aggggttgtg 6060
gagctcactt tgagtttatt tagtgtattt gatctaaatt atgataaact tatatgggat 6120
gtgggacatc aggcttatgt gcataaaatc ctcacgggaa gaaaggataa atttgatact 6180
ttaaggcaat ttggaggatt aagtggattt cctaaaaggt gcgaaagtat atatgatttt 6240
ttcgaaacag ggcatagtag tacttcaata tctgcagcac ttggaatggc tagggctaga 6300
gatttaaagc atgagaaata taatgttgtt gcagttatag gagatggagc acttactgga 6360
ggtatggcac tagaggccct aaatgatgta ggttatagaa aaactaagct tataataata 6420
ttaaatgata atcaaatgtc tataggaaaa aatgtaggtg gagtatctaa atatttaaat 6480
aaacttagag tggaccctaa gtataataaa tttaaagcgg atgtagaagc taaattaaaa 6540
aagataccta atataggaaa aggaatggca aaatatcttg aaaaggtaaa aaatggaata 6600
aaacaaatgg tagttcctgg aatgtttttt gaagatatgg gaattaaata tttaggacca 6660
atagatggtc ataatataaa agaacttaca gacgtactcg cttctgcaaa agacatacaa 6720
ggtccagtta ttatacatat aataactaag aaaggaaaag gatatgaatt tgcaagaaaa 6780
aaatccaggt aaattccatg gaatagggcc ttttaattgc gccaatggtg aactggatgc 6840
tggatcttca aatacttatt ccaaggcctt tggaaatgaa atggtaaagc tagcagaaaa 6900
agacgataga atagtggcta taactgcagc catgagggat ggaacaggtc ttaaaagttt 6960
ttctcaaaag tttcctgaaa ggttttttga tgtgggaata gcagaacagc atgctgtaac 7020
cctggcagct ggaatggcac aggcaaattt aaaacctgta tttgcagttt actctacttt 7080
tcttcaaaga gcttatgatc aacttattca tgatgtatgt atgcaaaaac ttccagtagt 7140
ttttgctgta gatagggccg gcattgtagg agaagatggt gaaacacatc agggaatatt 7200
tgatttatct tacttaacgg aaatgccaca tatgacgctt atgtctccta aatgtataga 7260
tgaacttcca tatatgttaa aatgggcatt aggccagagt tttcctgtag ctataaggta 7320
tccaagggga ggagatagtg tatgtctcaa tcccgtagaa aattttaaac ttggaaagtg 7380
ggactgtatt tcaaatgaag gcagtgtagc aataattgct cagggtaaaa tggtacaaaa 7440
tgcagtgtta gcaggaaaaa aacttaaaga aaagggtata gatgtaagga ttataagtgc 7500
atgttttatt aagccgctgg acaaggaaat gttaaacagg ttagttgaag aaagtgtaac 7560
tatcgttact gttgaagaca atgtaataag aggaggatta ggatcctata tattagaata 7620
tgtaaataaa ttaaataaaa aagtaaaaat aataaactta gggtttgatg ataagtttgt 7680
acagcatgga aaatccgata ttttgtataa gctgtatggt ttggatccta aaggtatcgt 7740
aaatagtgta cttgaagcag cagaggtaag tcatatattt taac 7784
<210> 32
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸M13R
<400> 32
caggaaacag ctatgac 17
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸异戊二烯-seq1
<400> 33
gttattcaag ctacaccttt 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸异戊二烯-seq2
<400> 34
gattggtaaa gaattagctg 20
<210> 35
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸异戊二烯-seq3
<400> 35
tcaagaagct aagtggct 18
<210> 36
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸异戊二烯-seq4
<400> 36
ctcaccgtaa aggaaca 17
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸异戊二烯-seq5
<400> 37
gctagctaga gaaattagaa 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸异戊二烯-seq6
<400> 38
ggaatggcaa aatatcttga 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸异戊二烯-seq7
<400> 39
gaaacacatc agggaatatt 20
<210> 40
<211> 1179
<212> DNA
<213> 丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)
<400> 40
atgaaagagg ttgttattgc atcagctgtt agaactgcaa taggatctta tggaaaaagt 60
cttaaagatg taccagcagt agacttaggt gcaactgcaa taaaggaagc agtaaagaaa 120
gcaggtataa aacctgaaga tgttaatgaa gttattttag gaaacgtatt acaagctgga 180
cttggacaga atccagctag acaggcatca ttcaaagcag gattaccagt agagatacct 240
gctatgacta ttaataaagt ttgtggttca ggattaagaa cagtttcttt agctgctcaa 300
attataaaag ctggtgacgc agatgtaata atagcaggtg gtatggaaaa tatgtcaaga 360
gcaccatacc ttgctaataa tgctagatgg ggttatagaa tgggaaacgc taaatttgta 420
gacgaaatga taactgatgg actttgggat gcatttaacg attatcacat gggaattact 480
gctgaaaata tagctgagag atggaatata agtagagaag aacaagatga gtttgcactt 540
gcatctcaga aaaaggcaga agaagctatt aaatcaggac aatttaaaga tgaaattgtt 600
ccagtagtaa ttaaaggtag aaaaggtgaa acagttgtag acactgatga acatcctaga 660
tttggatcta caatagaagg tttagctaaa ttaaagcctg cttttaagaa agacggaaca 720
gtaactgctg gaaacgcatc aggtttaaat gattgtgcag ctgttttagt tattatgtct 780
gctgaaaagg caaaggaatt aggtgttaaa ccacttgcta agatagttag ttatggttca 840
gcaggtgtag atcctgctat tatgggatat ggaccttttt atgctacaaa ggcagctatt 900
gaaaaggctg gttggacagt tgatgaactt gatcttatag agtcaaatga ggcatttgca 960
gcacaaagtc ttgctgttgc taaggatctt aaattcgata tgaataaagt aaatgtaaac 1020
ggtggtgcta tagcacttgg tcatccaata ggtgctagtg gtgctagaat tttagttaca 1080
ttagttcatg caatgcaaaa gagagacgct aaaaagggac ttgcaacttt atgcataggt 1140
ggtggtcaag gaacagcaat acttcttgaa aaatgttaa 1179
<210> 41
<211> 1140
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌亚种金色类群(Staphylococcus aureus subsp. aureus)
<400> 41
atgaatcagg ctgttatagt tgctgcaaag agaactgcat ttggaaaata tggtggtact 60
ttaaaacacc ttgaaccaga acaattactt aagccattat ttcagcactt taaagaaaaa 120
tatcctgaag ttatatctaa aatagatgat gtagttttag gaaacgtagt tggaaatggt 180
ggtaatattg ctagaaaagc acttcttgaa gcaggattaa aagatagtat accaggtgta 240
actatagaca gacaatgcgg atctggatta gaatcagtac aatacgcatg tagaatgata 300
caagcaggtg ctggaaaagt ttatattgca ggtggtgttg aatctacatc aagagcacct 360
tggaaaataa agagaccaca ttctgtttat gaaactgcat taccagagtt ctatgaaaga 420
gcatcattcg cacctgaaat gtcagatcca agtatgatac aaggtgctga gaatgtagct 480
aaaatgtatg atgttagtag agaacttcaa gatgagtttg catacagatc acatcaactt 540
acagctgaaa atgtaaagaa tggaaatatt tcacaagaaa ttcttccaat aacagtaaag 600
ggtgaaatat tcaatactga tgaaagttta aaatctcata ttccaaaaga taatttcggt 660
agatttaaac ctgtaataaa aggtggtact gtaacagctg ctaatagttg tatgaagaac 720
gatggtgcag tattattact tattatggaa aaggatatgg cttatgaact tggatttgag 780
catggattat tatttaaaga cggtgtaact gtaggtgtag atagtaactt tccaggaata 840
ggacctgttc ctgctatatc aaatctttta aagagaaacc aacttacaat agaaaatatt 900
gaagtaattg agataaatga agcattttct gctcaggtag ttgcttgtca gcaagctctt 960
aatataagta atactcagtt aaacatttgg ggtggtgcat tagcaagtgg tcatccttat 1020
ggtgcatcag gtgcacagtt agttacaaga ttattttata tgttcgataa agagacaatg 1080
attgcttcta tgggaatagg tggtggttta ggaaatgcag ctctttttac tagattttaa 1140
<210> 42
<211> 1167
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌亚种金色类群
<400> 42
atgactatag gaattgacaa aataaacttt tacgtaccaa aatattatgt agatatggca 60
aaattagcag aagcaagaca agtagaccca aataaatttc ttattggaat aggacagact 120
gaaatggcag ttagtccagt aaaccaagat atagtatcaa tgggtgctaa tgctgctaaa 180
gatataataa ctgatgaaga caaaaagaaa ataggaatgg taatagtagc aactgagtca 240
gcagtagatg cagcaaaggc agcagcagta cagattcata atttattagg tattcaacca 300
tttgcaagat gtttcgaaat gaaagaagca tgttatgctg ctactcctgc aattcagtta 360
gctaaggatt atttagctac aagaccaaat gagaaagttt tagttatagc tacagataca 420
gctagatatg gacttaattc aggtggtgaa cctactcaag gtgctggtgc tgttgctatg 480
gttatagctc ataatcctag tatacttgca ttaaatgaag acgctgttgc ttatacagaa 540
gatgtttatg atttctggag accaacagga cataagtatc cattagtaga tggtgcttta 600
tcaaaagacg catatattag atcttttcaa caatcttgga atgaatatgc taagagacaa 660
ggaaagagtt tagctgattt tgctagtctt tgctttcatg ttccttttac taaaatgggt 720
aaaaaggctt tagaatctat aatagataac gcagatgaaa caactcaaga gagattaaga 780
tctggatatg aagatgcagt tgattacaat agatatgttg gaaatatata cacaggaagt 840
ctttatcttt ctcttataag tcttcttgaa aatagagatt tacaggctgg tgaaactatt 900
ggattatttt catacggatc aggttctgtt ggtgaatttt attcagctac acttgtagaa 960
ggatataaag atcaccttga tcaggcagca cacaaagcac ttttaaacaa tagaactgaa 1020
gtatcagtag atgcatacga aacatttttc aagagatttg atgatgtaga atttgatgaa 1080
gagcaggatg cagttcatga agatagacat atattctatc tttcaaacat agagaataat 1140
gtaagagaat atcatagacc tgaataa 1167
<210> 43
<211> 1278
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌亚种金色类群
<400> 43
atgcaatcat tagacaaaaa tttcagacat ttatcaagac aacaaaagtt acaacaatta 60
gttgataaac agtggctttc agaagatcag tttgatattt tacttaatca tcctcttata 120
gatgaagaag ttgctaatag tcttatagaa aatgtaattg cacagggtgc attaccagtt 180
ggacttcttc ctaatataat agttgatgat aaggcttatg ttgtaccaat gatggttgaa 240
gaacctagtg ttgttgcagc tgcatcttat ggtgctaaat tagtaaatca gacaggtgga 300
tttaaaactg tatcatcaga aagaataatg attggacaga tagtatttga tggtgtagat 360
gacactgaaa aattaagtgc agatattaaa gcattagaaa aacaaataca taagattgca 420
gatgaagcat atcctagtat aaaagcaaga ggtggtggtt atcaaagaat agcaatagat 480
acatttccag agcaacaact tttaagtctt aaggtatttg tagatacaaa agatgctatg 540
ggtgctaata tgcttaatac tatacttgag gcaataactg cattccttaa aaatgaatct 600
cctcaatcag atatattaat gtctatactt tcaaaccatg caactgctag tgtagtaaaa 660
gtacaaggtg agatagatgt aaaagatctt gctagaggtg aaagaacagg tgaagaagta 720
gctaagagaa tggaaagagc ttctgtatta gctcaggttg atattcatag agctgcaaca 780
cataacaaag gtgttatgaa tggaatacat gctgttgttt tagctacagg aaatgatact 840
agaggtgctg aagcatctgc acatgcatac gcatcaagag acggacaata tagaggtata 900
gcaacttgga gatatgatca gaagagacaa agacttattg gaactattga agttccaatg 960
acacttgcta tagtaggtgg tggtactaaa gtattaccaa tagctaaggc atcattagag 1020
ttattaaatg ttgattctgc acaagaactt ggacacgtag ttgctgctgt tggattagca 1080
caaaactttg ctgcttgtag agcacttgtt tctgaaggta ttcaacaagg acacatgtca 1140
ttacaatata aaagtttagc aatagtagta ggtgcaaaag gtgacgagat agcacaagta 1200
gcagaagctc ttaaacagga accaagagct aatacacagg ttgctgaaag aattttacag 1260
gaaattagac agcaataa 1278
<210> 44
<211> 552
<212> DNA
<213> 自产乙醇梭菌
<400> 44
agatagtcat aatagttcca gaatagttca atttagaaat tagactaaac ttcaaaatgt 60
ttgttaaata tataccaatc tagtatagat attttttaaa tactggactt aaacagtagt 120
aatttgccta aaaaattttt tcaatttttt ttaaaaaatc cttttcaagt tgtacattgt 180
tatggtaata tgtaattgaa gaagttatgt agtaatattg taaacgtttc ttgatttttt 240
tacatccatg tagtgcttaa aaaaccaaaa tatgtcacat gcacttgtat atttcaaata 300
acaatattta ttttctcgtt aaattcacaa ataatttatt aataatatca ataaccaaga 360
ttatacttaa atggatgttt attttttaac acttttatag taaatatatt tattttatgt 420
agtaaaaagg ttataattat aattgtattt attacaatta attaaaataa aaaatagggt 480
tttaggtaaa attaagttat tttaagaagt aattacaata aaaattgaag ttatttcttt 540
aaggaggaaa tt 552
<210> 45
<211> 386
<212> DNA
<213> 自产乙醇梭菌
<400> 45
gttataattt tcaattttca ttctttttaa aggagattag catacatttt atcataatta 60
tacagacaat atagtaatat atgatgttaa aatatcaata tatggttaaa aatctgtata 120
ttttttccca ttttaattat ttgtactata atattacact gagtgtattg catatttaaa 180
aaatatttgg tacaattagt tagttaaata aattctaaat tgtaaattat cagaatcctt 240
attaaggaaa tacatagatt taaggagaaa tcataaaaag gtgtaatata aactggctaa 300
aattgagcaa aaattgagca attaagactt tttgattgta tctttttata tatttaaggt 360
atataatctt atttatattg ggggaa 386
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸pUC57-F
<400> 46
agcagattgt actgagagtg c 21
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸pUC57-R
<400> 47
acagctatga ccatgattac g 21
<210> 48
<211> 3552
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒pMTL 85245
<400> 48
aaactccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga 60
gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta 120
atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa 180
gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact 240
gttcttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca 300
tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt 360
accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg 420
ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag 480
cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta 540
agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat 600
ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg 660
tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc 720
ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac 780
cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc 840
gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc ccaatacgca gggccccctg caggataaaa 900
aaattgtaga taaattttat aaaatagttt tatctacaat ttttttatca ggaaacagct 960
atgaccgcgg ccgcaatatg atatttatgt ccattgtgaa agggattata ttcaactatt 1020
attccagtta cgttcataga aattttcctt tctaaaatat tttattccat gtcaagaact 1080
ctgtttattt cattaaagaa ctataagtac aaagtataag gcatttgaaa aaataggcta 1140
gtatattgat tgattattta ttttaaaatg cctaagtgaa atatatacat attataacaa 1200
taaaataagt attagtgtag gatttttaaa tagagtatct attttcagat taaatttttg 1260
attatttgat ttacattata taatattgag taaagtattg actagcaaaa ttttttgata 1320
ctttaatttg tgaaatttct tatcaaaagt tatatttttg aataattttt attgaaaaat 1380
acaactaaaa aggattatag tataagtgtg tgtaattttg tgttaaattt aaagggagga 1440
aatgaacatg aaacatatgg tgaccatgat tacgaattcg agctcggtac ccggggatcc 1500
tctagagtcg acgtcacgcg tccatggaga tctcgaggcc tgcagacatg caagcttggc 1560
actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg 1620
ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc gcaccgatcg 1680
cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatggcgc tagcataaaa ataagaagcc 1740
tgcatttgca ggcttcttat ttttatggcg cgccgcattc acttcttttc tatataaata 1800
tgagcgaagc gaataagcgt cggaaaagca gcaaaaagtt tcctttttgc tgttggagca 1860
tgggggttca gggggtgcag tatctgacgt caatgccgag cgaaagcgag ccgaagggta 1920
gcatttacgt tagataaccc cctgatatgc tccgacgctt tatatagaaa agaagattca 1980
actaggtaaa atcttaatat aggttgagat gataaggttt ataaggaatt tgtttgttct 2040
aatttttcac tcattttgtt ctaatttctt ttaacaaatg ttcttttttt tttagaacag 2100
ttatgatata gttagaatag tttaaaataa ggagtgagaa aaagatgaaa gaaagatatg 2160
gaacagtcta taaaggctct cagaggctca tagacgaaga aagtggagaa gtcatagagg 2220
tagacaagtt ataccgtaaa caaacgtctg gtaacttcgt aaaggcatat atagtgcaat 2280
taataagtat gttagatatg attggcggaa aaaaacttaa aatcgttaac tatatcctag 2340
ataatgtcca cttaagtaac aatacaatga tagctacaac aagagaaata gcaaaagcta 2400
caggaacaag tctacaaaca gtaataacaa cacttaaaat cttagaagaa ggaaatatta 2460
taaaaagaaa aactggagta ttaatgttaa accctgaact actaatgaga ggcgacgacc 2520
aaaaacaaaa atacctctta ctcgaatttg ggaactttga gcaagaggca aatgaaatag 2580
attgacctcc caataacacc acgtagttat tgggaggtca atctatgaaa tgcgattaag 2640
ggccggccga agcaaactta agagtgtgtt gatagtgcag tatcttaaaa ttttgtataa 2700
taggaattga agttaaatta gatgctaaaa atttgtaatt aagaaggagt gattacatga 2760
acaaaaatat aaaatattct caaaactttt taacgagtga aaaagtactc aaccaaataa 2820
taaaacaatt gaatttaaaa gaaaccgata ccgtttacga aattggaaca ggtaaagggc 2880
atttaacgac gaaactggct aaaataagta aacaggtaac gtctattgaa ttagacagtc 2940
atctattcaa cttatcgtca gaaaaattaa aactgaatac tcgtgtcact ttaattcacc 3000
aagatattct acagtttcaa ttccctaaca aacagaggta taaaattgtt gggagtattc 3060
cttaccattt aagcacacaa attattaaaa aagtggtttt tgaaagccat gcgtctgaca 3120
tctatctgat tgttgaagaa ggattctaca agcgtacctt ggatattcac cgaacactag 3180
ggttgctctt gcacactcaa gtctcgattc agcaattgct taagctgcca gcggaatgct 3240
ttcatcctaa accaaaagta aacagtgtct taataaaact tacccgccat accacagatg 3300
ttccagataa atattggaag ctatatacgt actttgtttc aaaatgggtc aatcgagaat 3360
atcgtcaact gtttactaaa aatcagtttc atcaagcaat gaaacacgcc aaagtaaaca 3420
atttaagtac cgttacttat gagcaagtat tgtctatttt taatagttat ctattattta 3480
acgggaggaa ataattctat gagtcgcttt tgtaaatttg gaaagttaca cgttactaaa 3540
gggaatgtgt tt 3552
<210> 49
<211> 4186
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒pMTL 83145
<400> 49
aaactccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga 60
gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta 120
atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa 180
gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact 240
gttcttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca 300
tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt 360
accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg 420
ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag 480
cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta 540
agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat 600
ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg 660
tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc 720
ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac 780
cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc 840
gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc ccaatacgca gggccccctg caggataaaa 900
aaattgtaga taaattttat aaaatagttt tatctacaat ttttttatca ggaaacagct 960
atgaccgcgg ccgcaatatg atatttatgt ccattgtgaa agggattata ttcaactatt 1020
attccagtta cgttcataga aattttcctt tctaaaatat tttattccat gtcaagaact 1080
ctgtttattt cattaaagaa ctataagtac aaagtataag gcatttgaaa aaataggcta 1140
gtatattgat tgattattta ttttaaaatg cctaagtgaa atatatacat attataacaa 1200
taaaataagt attagtgtag gatttttaaa tagagtatct attttcagat taaatttttg 1260
attatttgat ttacattata taatattgag taaagtattg actagcaaaa ttttttgata 1320
ctttaatttg tgaaatttct tatcaaaagt tatatttttg aataattttt attgaaaaat 1380
acaactaaaa aggattatag tataagtgtg tgtaattttg tgttaaattt aaagggagga 1440
aatgaacatg aaacatatgg tgaccatgat tacgaattcg agctcggtac ccggggatcc 1500
tctagagtcg acgtcacgcg tccatggaga tctcgaggcc tgcagacatg caagcttggc 1560
actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg 1620
ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc gcaccgatcg 1680
cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatggcgc tagcataaaa ataagaagcc 1740
tgcatttgca ggcttcttat ttttatggcg cgccgccatt atttttttga acaattgaca 1800
attcatttct tattttttat taagtgatag tcaaaaggca taacagtgct gaatagaaag 1860
aaatttacag aaaagaaaat tatagaattt agtatgatta attatactca tttatgaatg 1920
tttaattgaa tacaaaaaaa aatacttgtt atgtattcaa ttacgggtta aaatatagac 1980
aagttgaaaa atttaataaa aaaataagtc ctcagctctt atatattaag ctaccaactt 2040
agtatataag ccaaaactta aatgtgctac caacacatca agccgttaga gaactctatc 2100
tatagcaata tttcaaatgt accgacatac aagagaaaca ttaactatat atattcaatt 2160
tatgagatta tcttaacaga tataaatgta aattgcaata agtaagattt agaagtttat 2220
agcctttgtg tattggaagc agtacgcaaa ggctttttta tttgataaaa attagaagta 2280
tatttatttt ttcataatta atttatgaaa atgaaagggg gtgagcaaag tgacagagga 2340
aagcagtatc ttatcaaata acaaggtatt agcaatatca ttattgactt tagcagtaaa 2400
cattatgact tttatagtgc ttgtagctaa gtagtacgaa agggggagct ttaaaaagct 2460
ccttggaata catagaattc ataaattaat ttatgaaaag aagggcgtat atgaaaactt 2520
gtaaaaattg caaagagttt attaaagata ctgaaatatg caaaatacat tcgttgatga 2580
ttcatgataa aacagtagca acctattgca gtaaatacaa tgagtcaaga tgtttacata 2640
aagggaaagt ccaatgtatt aattgttcaa agatgaaccg atatggatgg tgtgccataa 2700
aaatgagatg ttttacagag gaagaacaga aaaaagaacg tacatgcatt aaatattatg 2760
caaggagctt taaaaaagct catgtaaaga agagtaaaaa gaaaaaataa tttatttatt 2820
aatttaatat tgagagtgcc gacacagtat gcactaaaaa atatatctgt ggtgtagtga 2880
gccgatacaa aaggatagtc actcgcattt tcataataca tcttatgtta tgattatgtg 2940
tcggtgggac ttcacgacga aaacccacaa taaaaaaaga gttcggggta gggttaagca 3000
tagttgaggc aactaaacaa tcaagctagg atatgcagta gcagaccgta aggtcgttgt 3060
ttaggtgtgt tgtaatacat acgctattaa gatgtaaaaa tacggatacc aatgaaggga 3120
aaagtataat ttttggatgt agtttgtttg ttcatctatg ggcaaactac gtccaaagcc 3180
gtttccaaat ctgctaaaaa gtatatcctt tctaaaatca aagtcaagta tgaaatcata 3240
aataaagttt aattttgaag ttattatgat attatgtttt tctattaaaa taaattaagt 3300
atatagaata gtttaataat agtatatact taatgtgata agtgtctgac agtgtcacag 3360
aaaggatgat tgttatggat tataagcggc cggccagtgg gcaagttgaa aaattcacaa 3420
aaatgtggta taatatcttt gttcattaga gcgataaact tgaatttgag agggaactta 3480
gatggtattt gaaaaaattg ataaaaatag ttggaacaga aaagagtatt ttgaccacta 3540
ctttgcaagt gtaccttgta cctacagcat gaccgttaaa gtggatatca cacaaataaa 3600
ggaaaaggga atgaaactat atcctgcaat gctttattat attgcaatga ttgtaaaccg 3660
ccattcagag tttaggacgg caatcaatca agatggtgaa ttggggatat atgatgagat 3720
gataccaagc tatacaatat ttcacaatga tactgaaaca ttttccagcc tttggactga 3780
gtgtaagtct gactttaaat catttttagc agattatgaa agtgatacgc aacggtatgg 3840
aaacaatcat agaatggaag gaaagccaaa tgctccggaa aacattttta atgtatctat 3900
gataccgtgg tcaaccttcg atggctttaa tctgaatttg cagaaaggat atgattattt 3960
gattcctatt tttactatgg ggaaatatta taaagaagat aacaaaatta tacttccttt 4020
ggcaattcaa gttcatcacg cagtatgtga cggatttcac atttgccgtt ttgtaaacga 4080
attgcaggaa ttgataaata gttaacttca ggtttgtctg taactaaaaa caagtattta 4140
agcaaaaaca tcgtagaaat acggtgtttt ttgttaccct aagttt 4186
<210> 50
<211> 9827
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒pMTL8215-Pptaack-thlA-HMGS-Patp-HMGR
<400> 50
cctgcaggat aaaaaaattg tagataaatt ttataaaata gttttatcta caattttttt 60
atcaggaaac agctatgacc gcggccgcag atagtcataa tagttccaga atagttcaat 120
ttagaaatta gactaaactt caaaatgttt gttaaatata taccaatcta gtatagatat 180
tttttaaata ctggacttaa acagtagtaa tttgcctaaa aaattttttc aatttttttt 240
aaaaaatcct tttcaagttg tacattgtta tggtaatatg taattgaaga agttatgtag 300
taatattgta aacgtttctt gattttttta catccatgta gtgcttaaaa aaccaaaata 360
tgtcacatgc acttgtatat ttcaaataac aatatttatt ttctcgttaa attcacaaat 420
aatttattaa taatatcaat aaccaagatt atacttaaat ggatgtttat tttttaacac 480
ttttatagta aatatattta ttttatgtag taaaaaggtt ataattataa ttgtatttat 540
tacaattaat taaaataaaa aatagggttt taggtaaaat taagttattt taagaagtaa 600
ttacaataaa aattgaagtt atttctttaa ggaggaaatt catatgaaag aggttgttat 660
tgcatcagct gttagaactg caataggatc ttatggaaaa agtcttaaag atgtaccagc 720
agtagactta ggtgcaactg caataaagga agcagtaaag aaagcaggta taaaacctga 780
agatgttaat gaagttattt taggaaacgt attacaagct ggacttggac agaatccagc 840
tagacaggca tcattcaaag caggattacc agtagagata cctgctatga ctattaataa 900
agtttgtggt tcaggattaa gaacagtttc tttagctgct caaattataa aagctggtga 960
cgcagatgta ataatagcag gtggtatgga aaatatgtca agagcaccat accttgctaa 1020
taatgctaga tggggttata gaatgggaaa cgctaaattt gtagacgaaa tgataactga 1080
tggactttgg gatgcattta acgattatca catgggaatt actgctgaaa atatagctga 1140
gagatggaat ataagtagag aagaacaaga tgagtttgca cttgcatctc agaaaaaggc 1200
agaagaagct attaaatcag gacaatttaa agatgaaatt gttccagtag taattaaagg 1260
tagaaaaggt gaaacagttg tagacactga tgaacatcct agatttggat ctacaataga 1320
aggtttagct aaattaaagc ctgcttttaa gaaagacgga acagtaactg ctggaaacgc 1380
atcaggttta aatgattgtg cagctgtttt agttattatg tctgctgaaa aggcaaagga 1440
attaggtgtt aaaccacttg ctaagatagt tagttatggt tcagcaggtg tagatcctgc 1500
tattatggga tatggacctt tttatgctac aaaggcagct attgaaaagg ctggttggac 1560
agttgatgaa cttgatctta tagagtcaaa tgaggcattt gcagcacaaa gtcttgctgt 1620
tgctaaggat cttaaattcg atatgaataa agtaaatgta aacggtggtg ctatagcact 1680
tggtcatcca ataggtgcta gtggtgctag aattttagtt acattagttc atgcaatgca 1740
aaagagagac gctaaaaagg gacttgcaac tttatgcata ggtggtggtc aaggaacagc 1800
aatacttctt gaaaaatgtt aagaattcga ggcttttact aaaaacaata aaaacaggag 1860
gaaataatat gactatagga attgacaaaa taaactttta cgtaccaaaa tattatgtag 1920
atatggcaaa attagcagaa gcaagacaag tagacccaaa taaatttctt attggaatag 1980
gacagactga aatggcagtt agtccagtaa accaagatat agtatcaatg ggtgctaatg 2040
ctgctaaaga tataataact gatgaagaca aaaagaaaat aggaatggta atagtagcaa 2100
ctgagtcagc agtagatgca gcaaaggcag cagcagtaca gattcataat ttattaggta 2160
ttcaaccatt tgcaagatgt ttcgaaatga aagaagcatg ttatgctgct actcctgcaa 2220
ttcagttagc taaggattat ttagctacaa gaccaaatga gaaagtttta gttatagcta 2280
cagatacagc tagatatgga cttaattcag gtggtgaacc tactcaaggt gctggtgctg 2340
ttgctatggt tatagctcat aatcctagta tacttgcatt aaatgaagac gctgttgctt 2400
atacagaaga tgtttatgat ttctggagac caacaggaca taagtatcca ttagtagatg 2460
gtgctttatc aaaagacgca tatattagat cttttcaaca atcttggaat gaatatgcta 2520
agagacaagg aaagagttta gctgattttg ctagtctttg ctttcatgtt ccttttacta 2580
aaatgggtaa aaaggcttta gaatctataa tagataacgc agatgaaaca actcaagaga 2640
gattaagatc tggatatgaa gatgcagttg attacaatag atatgttgga aatatataca 2700
caggaagtct ttatctttct cttataagtc ttcttgaaaa tagagattta caggctggtg 2760
aaactattgg attattttca tacggatcag gttctgttgg tgaattttat tcagctacac 2820
ttgtagaagg atataaagat caccttgatc aggcagcaca caaagcactt ttaaacaata 2880
gaactgaagt atcagtagat gcatacgaaa catttttcaa gagatttgat gatgtagaat 2940
ttgatgaaga gcaggatgca gttcatgaag atagacatat attctatctt tcaaacatag 3000
agaataatgt aagagaatat catagacctg aataagagct cgttataatt ttcaattttc 3060
attcttttta aaggagatta gcatacattt tatcataatt atacagacaa tatagtaata 3120
tatgatgtta aaatatcaat atatggttaa aaatctgtat attttttccc attttaatta 3180
tttgtactat aatattacac tgagtgtatt gcatatttaa aaaatatttg gtacaattag 3240
ttagttaaat aaattctaaa ttgtaaatta tcagaatcct tattaaggaa atacatagat 3300
ttaaggagaa atcataaaaa ggtgtaatat aaactggcta aaattgagca aaaattgagc 3360
aattaagact ttttgattgt atctttttat atatttaagg tatataatct tatttatatt 3420
gggggaaggt accatgcaat cattagacaa aaatttcaga catttatcaa gacaacaaaa 3480
gttacaacaa ttagttgata aacagtggct ttcagaagat cagtttgata ttttacttaa 3540
tcatcctctt atagatgaag aagttgctaa tagtcttata gaaaatgtaa ttgcacaggg 3600
tgcattacca gttggacttc ttcctaatat aatagttgat gataaggctt atgttgtacc 3660
aatgatggtt gaagaaccta gtgttgttgc agctgcatct tatggtgcta aattagtaaa 3720
tcagacaggt ggatttaaaa ctgtatcatc agaaagaata atgattggac agatagtatt 3780
tgatggtgta gatgacactg aaaaattaag tgcagatatt aaagcattag aaaaacaaat 3840
acataagatt gcagatgaag catatcctag tataaaagca agaggtggtg gttatcaaag 3900
aatagcaata gatacatttc cagagcaaca acttttaagt cttaaggtat ttgtagatac 3960
aaaagatgct atgggtgcta atatgcttaa tactatactt gaggcaataa ctgcattcct 4020
taaaaatgaa tctcctcaat cagatatatt aatgtctata ctttcaaacc atgcaactgc 4080
tagtgtagta aaagtacaag gtgagataga tgtaaaagat cttgctagag gtgaaagaac 4140
aggtgaagaa gtagctaaga gaatggaaag agcttctgta ttagctcagg ttgatattca 4200
tagagctgca acacataaca aaggtgttat gaatggaata catgctgttg ttttagctac 4260
aggaaatgat actagaggtg ctgaagcatc tgcacatgca tacgcatcaa gagacggaca 4320
atatagaggt atagcaactt ggagatatga tcagaagaga caaagactta ttggaactat 4380
tgaagttcca atgacacttg ctatagtagg tggtggtact aaagtattac caatagctaa 4440
ggcatcatta gagttattaa atgttgattc tgcacaagaa cttggacacg tagttgctgc 4500
tgttggatta gcacaaaact ttgctgcttg tagagcactt gtttctgaag gtattcaaca 4560
aggacacatg tcattacaat ataaaagttt agcaatagta gtaggtgcaa aaggtgacga 4620
gatagcacaa gtagcagaag ctcttaaaca ggaaccaaga gctaatacac aggttgctga 4680
aagaatttta caggaaatta gacagcaata atctagagtc gacgtcacgc gtccatggag 4740
atctcgaggc ctgcagacat gcaagcttgg cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact 4800
gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc acatccccct ttcgccagct 4860
ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg 4920
gcgaatggcg ctagcataaa aataagaagc ctgcatttgc aggcttctta tttttatggc 4980
gcgccgttct gaatccttag ctaatggttc aacaggtaac tatgacgaag atagcaccct 5040
ggataagtct gtaatggatt ctaaggcatt taatgaagac gtgtatataa aatgtgctaa 5100
tgaaaaagaa aatgcgttaa aagagcctaa aatgagttca aatggttttg aaattgattg 5160
gtagtttaat ttaatatatt ttttctattg gctatctcga tacctataga atcttctgtt 5220
cacttttgtt tttgaaatat aaaaaggggc tttttagccc ctttttttta aaactccgga 5280
ggagtttctt cattcttgat actatacgta actattttcg atttgacttc attgtcaatt 5340
aagctagtaa aatcaatggt taaaaaacaa aaaacttgca tttttctacc tagtaattta 5400
taattttaag tgtcgagttt aaaagtataa tttaccagga aaggagcaag ttttttaata 5460
aggaaaaatt tttcctttta aaattctatt tcgttatatg actaattata atcaaaaaaa 5520
tgaaaataaa caagaggtaa aaactgcttt agagaaatgt actgataaaa aaagaaaaaa 5580
tcctagattt acgtcataca tagcaccttt aactactaag aaaaatattg aaaggacttc 5640
cacttgtgga gattatttgt ttatgttgag tgatgcagac ttagaacatt ttaaattaca 5700
taaaggtaat ttttgcggta atagattttg tccaatgtgt agttggcgac ttgcttgtaa 5760
ggatagttta gaaatatcta ttcttatgga gcatttaaga aaagaagaaa ataaagagtt 5820
tatattttta actcttacaa ctccaaatgt aaaaagttat gatcttaatt attctattaa 5880
acaatataat aaatctttta aaaaattaat ggagcgtaag gaagttaagg atataactaa 5940
aggttatata agaaaattag aagtaactta ccaaaaggaa aaatacataa caaaggattt 6000
atggaaaata aaaaaagatt attatcaaaa aaaaggactt gaaattggtg atttagaacc 6060
taattttgat acttataatc ctcattttca tgtagttatt gcagttaata aaagttattt 6120
tacagataaa aattattata taaatcgaga aagatggttg gaattatgga agtttgctac 6180
taaggatgat tctataactc aagttgatgt tagaaaagca aaaattaatg attataaaga 6240
ggtttacgaa cttgcgaaat attcagctaa agacactgat tatttaatat cgaggccagt 6300
atttgaaatt ttttataaag cattaaaagg caagcaggta ttagttttta gtggattttt 6360
taaagatgca cacaaattgt acaagcaagg aaaacttgat gtttataaaa agaaagatga 6420
aattaaatat gtctatatag tttattataa ttggtgcaaa aaacaatatg aaaaaactag 6480
aataagggaa cttacggaag atgaaaaaga agaattaaat caagatttaa tagatgaaat 6540
agaaatagat taaagtgtaa ctatacttta tatatatatg attaaaaaaa taaaaaacaa 6600
cagcctatta ggttgttgtt ttttattttc tttattaatt tttttaattt ttagttttta 6660
gttctttttt aaaataagtt tcagcctctt tttcaatatt ttttaaagaa ggagtatttg 6720
catgaattgc cttttttcta acagacttag gaaatatttt aacagtatct tcttgcgccg 6780
gtgattttgg aacttcataa cttactaatt tataattatt attttctttt ttaattgtaa 6840
cagttgcaaa agaagctgaa cctgttcctt caactagttt atcatcttca atataatatt 6900
cttgacctat atagtataaa tatattttta ttatattttt acttttttct gaatctatta 6960
ttttataatc ataaaaagtt ttaccaccaa aagaaggttg tactccttct ggtccaacat 7020
atttttttac tatattatct aaataatttt tgggaactgg tgttgtaatt tgattaatcg 7080
aacaaccagt tatacttaaa ggaattataa ctataaaaat atataggatt atctttttaa 7140
atttcattat tggcctcctt tttattaaat ttatgttacc ataaaaagga cataacggga 7200
atatgtagaa tatttttaat gtagacaaaa ttttacataa atataaagaa aggaagtgtt 7260
tgtttaaatt ttatagcaaa ctatcaaaaa ttagggggat aaaaatttat gaaaaaaagg 7320
ttttcgatgt tatttttatg tttaacttta atagtttgtg gtttatttac aaattcggcc 7380
ggccagtggg caagttgaaa aattcacaaa aatgtggtat aatatctttg ttcattagag 7440
cgataaactt gaatttgaga gggaacttag atggtatttg aaaaaattga taaaaatagt 7500
tggaacagaa aagagtattt tgaccactac tttgcaagtg taccttgtac ctacagcatg 7560
accgttaaag tggatatcac acaaataaag gaaaagggaa tgaaactata tcctgcaatg 7620
ctttattata ttgcaatgat tgtaaaccgc cattcagagt ttaggacggc aatcaatcaa 7680
gatggtgaat tggggatata tgatgagatg ataccaagct atacaatatt tcacaatgat 7740
actgaaacat tttccagcct ttggactgag tgtaagtctg actttaaatc atttttagca 7800
gattatgaaa gtgatacgca acggtatgga aacaatcata gaatggaagg aaagccaaat 7860
gctccggaaa acatttttaa tgtatctatg ataccgtggt caaccttcga tggctttaat 7920
ctgaatttgc agaaaggata tgattatttg attcctattt ttactatggg gaaatattat 7980
aaagaagata acaaaattat acttcctttg gcaattcaag ttcatcacgc agtatgtgac 8040
ggatttcaca tttgccgttt tgtaaacgaa ttgcaggaat tgataaatag ttaacttcag 8100
gtttgtctgt aactaaaaac aagtatttaa gcaaaaacat cgtagaaata cggtgttttt 8160
tgttacccta agtttaaact cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag 8220
ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct 8280
ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt 8340
tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg 8400
cagataccaa atactgttct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct 8460
gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc 8520
gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg 8580
tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa 8640
ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg 8700
gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg 8760
ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga 8820
tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt 8880
ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct 8940
gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga 9000
acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag agcgcccaat acgcagggcc 9060
ccctgcttcg gggtcattat agcgattttt tcggtatatc catccttttt cgcacgatat 9120
acaggatttt gccaaagggt tcgtgtagac tttccttggt gtatccaacg gcgtcagccg 9180
ggcaggatag gtgaagtagg cccacccgcg agcgggtgtt ccttcttcac tgtcccttat 9240
tcgcacctgg cggtgctcaa cgggaatcct gctctgcgag gctggccggc taccgccggc 9300
gtaacagatg agggcaagcg gatggctgat gaaaccaagc caaccaggaa gggcagccca 9360
cctatcaagg tgtactgcct tccagacgaa cgaagagcga ttgaggaaaa ggcggcggcg 9420
gccggcatga gcctgtcggc ctacctgctg gccgtcggcc agggctacaa aatcacgggc 9480
gtcgtggact atgagcacgt ccgcgagctg gcccgcatca atggcgacct gggccgcctg 9540
ggcggcctgc tgaaactctg gctcaccgac gacccgcgca cggcgcggtt cggtgatgcc 9600
acgatcctcg ccctgctggc gaagatcgaa gagaagcagg acgagcttgg caaggtcatg 9660
atgggcgtgg tccgcccgag ggcagagcca tgactttttt agccgctaaa acggccgggg 9720
ggtgcgcgtg attgccaagc acgtccccat gcgctccatc aagaagagcg acttcgcgga 9780
gctggtgaag tacatcaccg acgagcaagg caagaccgat cgggccc 9827
<210> 51
<211> 843
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌亚种金色类群
<400> 51
atgatagctg ttccatttaa cgctggaaaa ataaaagttt taattgaggc attagaatct 60
ggaaattatt catcaataaa atcagatgta tatgacggaa tgttatatga tgcaccagat 120
caccttaaat cattagtaaa cagatttgta gaacttaata atataactga gccattagca 180
gtaactatac agacaaatct tcctccttca agaggtcttg gatctagtgc agctgttgct 240
gttgcttttg taagagcaag ttatgatttc ttaggaaaaa gtttaactaa agaagagctt 300
atagaaaagg ctaattgggc tgaacaaata gctcatggaa agccatctgg aatagataca 360
caaacaatag tatctggaaa gcctgtttgg tttcaaaagg gacatgcaga aacacttaaa 420
actctttcac ttgatggata catggtagta attgatacag gtgttaaagg aagtacaaga 480
caggctgtag aagatgttca taaactttgc gaagatcctc aatatatgag tcacgtaaaa 540
cacataggaa aacttgtact tagagcatct gatgttattg aacatcataa ctttgaagca 600
cttgctgata tattcaatga atgtcatgct gatttaaagg ctcttacagt aagtcatgac 660
aaaatagaac agttaatgaa gataggaaaa gaaaatggtg ctatagctgg taaattaact 720
ggtgctggta gaggtggttc aatgttatta cttgcaaaag acttaccaac tgcaaagaat 780
atagttaaag cagtagagaa agctggtgca gcacatactt ggattgaaaa tttaggtggt 840
taa 843
<210> 52
<211> 1077
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌亚种金色类群
<400> 52
atgatacaag taaaggcacc aggaaaatta tatatagcag gtgaatacgc tgttacagaa 60
ccaggatata aatctgttct tatagctctt gatagatttg ttacagctac tattgaggaa 120
gctgatcaat acaaaggaac aatacattca aaggcattac atcacaatcc agtaactttt 180
agtagagatg aagattctat tgttatatca gacccacacg cagcaaaaca acttaattat 240
gtagtaactg ctatagaaat atttgagcaa tatgcaaaat catgtgacat agcaatgaag 300
cattttcatt taactataga ttctaactta gatgatagta atggacataa gtatggactt 360
ggatcttctg ctgctgtttt agtttcagta attaaagtac ttaacgaatt ttatgatatg 420
aaactttcaa acctttatat atataagtta gcagtaattg ctaatatgaa attacagagt 480
ttatcttcat gcggtgatat agcagtaagt gtttattcag gttggttagc ttattctaca 540
tttgaccatg aatgggtaaa acaccagata gaagatacaa cagttgaaga agtacttatt 600
aaaaattggc ctggattaca catagagcca cttcaagctc ctgaaaatat ggaagttctt 660
ataggttgga caggtagtcc agctagtagt cctcattttg tttctgaagt taaaagactt 720
aagtcagatc cttcatttta cggtgatttc ttagaagatt cacatagatg tgtagaaaaa 780
ttaattcatg cattcaaaac taataatatt aagggtgttc agaaaatggt aagacagaat 840
agaactatta tacaaagaat ggataaggaa gcaacagttg atatagagac tgagaagtta 900
aaatatttat gtgatattgc tgaaaaatat catggtgcaa gtaaaacttc aggtgctggt 960
ggtggtgatt gcggaataac tataataaat aaggatgtag acaaagagaa aatatatgat 1020
gaatggacta aacatggaat aaagcctctt aagtttaata tttatcatgg acaataa 1077
<210> 53
<211> 984
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌亚种金色类群
<400> 53
atgataaaat ctggaaaagc aagagcacac actaatatag cacttataaa atattggggt 60
aagaaagatg aggcattaat aataccaatg aataactcaa tatcagtaac tttagaaaag 120
ttttatactg aaacaaaagt tacatttaac gatcagctta ctcaagatca attttggctt 180
aatggtgaaa aagtttctgg aaaagaatta gaaaagattt caaagtatat ggatattgtt 240
agaaatagag ctggaataga ttggtatgct gagatagaat ctgataattt tgttcctaca 300
gctgctggtc ttgctagttc tgctagtgct tatgcagcat tagctgctgc atgtaaccaa 360
gcacttgatt tacagttaag tgataaagac ttaagtagat tagctagaat tggatcagga 420
tcagcatcaa gatcaatata cggtggtttt gcagaatggg aaaaaggata taatgacgaa 480
acttcttatg ctgttccatt agaaagtaat cactttgaag atgatcttgc tatgattttt 540
gtagtaataa accaacattc taaaaaggtt ccttcaagat atggaatgtc tcttacaaga 600
aatacaagta gattctatca atattggtta gaccatattg atgaagatct tgcagaagca 660
aaggcagcaa tacaagataa ggattttaag agattaggtg aagttattga agagaatgga 720
cttagaatgc atgctacaaa tcttggatca actccacctt ttacttactt agtacaagag 780
tcatacgatg taatggcatt agtacatgag tgtagagaag caggatatcc atgctatttc 840
actatggatg ctggacctaa tgtaaaaata cttgtagaga agaaaaacaa acaacagata 900
atagataaac ttttaactca gttcgataat aatcagataa tagatagtga tattatagct 960
acaggtattg aaattataga ataa 984
<210> 54
<211> 516
<212> DNA
<213> 拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)
<400> 54
atggcagagt atataatagc agtagatgag ttcgataacg aaataggatc aatagaaaag 60
atggaagctc atagaaaagg aacacttcat agagcattca gtattttagt ttttaactca 120
aagaatcaac ttttattaca gaaaagaaat gtaaagaaat atcactctcc aggattatgg 180
acaaacactt gttgtagtca cccaagatat ggtgaatctc ttcatgatgc tatatacaga 240
agattaaaag aagagatggg atttacttgc gaacttgaag aagtattctc attcatatat 300
aaggtaaaac ttgaagataa tttatttgag aatgaatatg accatgtatt tattggtaaa 360
tatgatggtg agataattgt taataaagat gaagttgatg attttaaatg ggtagacatt 420
aatgaagtta aaaaggacat aatagaaaga cctgaggcat atacttactg gtttaagtat 480
cttgtaaata aagctgaaaa taagatattt aaataa 516
<210> 55
<211> 120
<212> DNA
<213> 自产乙醇梭菌
<400> 55
atatcgatac agataaaaaa atatataata cagaagaaaa aattataaat ttgtggtata 60
atataaagta tagtaattta agtttaaacc tcgtgaaaac gctaacaaat aataggaggt 120
<210> 56
<211> 900
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 56
atggatttcc cacaacaatt agaagcatgt gtaaaacagg ctaatcaggc acttagtaga 60
tttattgctc ctcttccttt tcaaaataca ccagtagtag aaactatgca atacggtgca 120
cttttaggtg gtaaaagatt aagaccattc ttagtatatg ctacaggaca tatgtttggt 180
gtatcaacta atactttaga cgctccagct gctgctgttg aatgtattca tgcatattct 240
ttaatacatg atgacttacc agcaatggat gacgatgatt taagaagagg tttacctaca 300
tgtcatgtta aatttggtga agctaatgca attttagcag gtgacgcttt acaaacttta 360
gctttttcta tactttcaga tgcagacatg cctgaagttt cagatagaga tagaatttct 420
atgatatcag agcttgcatc tgcatcagga atagctggaa tgtgcggtgg tcaagcactt 480
gatttagatg cagaaggtaa acacgtacca cttgatgcat tagagagaat tcatagacat 540
aaaacaggtg ctcttataag agcagcagta agattaggtg ctttaagtgc tggtgacaag 600
ggtagaagag cacttccagt acttgataag tatgcagaaa gtataggatt agcttttcaa 660
gttcaagatg acatacttga cgttgttggt gatactgcta ctttaggaaa aagacagggt 720
gcagatcagc aattaggaaa atctacatac cctgctttac ttggattaga acaggctaga 780
aagaaagcaa gagacttaat agatgacgca agacaaagtc ttaaacagtt agctgaacaa 840
tcacttgaca caagtgcact tgaagcactt gcagattata ttatacagag aaacaagtaa 900
<210> 57
<211> 975
<212> DNA
<213> 苹果(Malus x domestica)
<400> 57
atggaattta gagtacattt acaggcagac aacgaacaga aaatatttca aaatcaaatg 60
aaaccagagc cagaagcatc atatcttata aatcaaagaa gaagtgctaa ttataaacca 120
aacatttgga aaaacgattt tcttgatcag tctttaatat caaaatatga tggtgatgaa 180
tatagaaaac tttcagaaaa gttaatagaa gaagtaaaga tatacatatc agcagagact 240
atggatttag ttgctaaatt agaacttata gattctgtta gaaaacttgg acttgctaat 300
ctttttgaga aagaaataaa ggaagcatta gacagtatag cagcaataga atcagataat 360
ttaggaacta gagacgatct ttatggaaca gctcttcatt ttaagattct tagacagcat 420
ggatataagg taagtcaaga tatatttggt agatttatgg atgagaaagg aacattagaa 480
aatcatcact ttgcacactt aaaaggaatg ttagaattat ttgaggcaag taatcttgga 540
tttgaaggtg aagacatatt agatgaagct aaagcatctc ttacacttgc tcttagagat 600
tcaggacata tttgttatcc agactcaaac ttaagtagag atgtagttca tagtttagaa 660
ttacctagtc atagaagagt tcaatggttc gatgtaaaat ggcagattaa tgcatacgaa 720
aaagatattt gtagagtaaa tgcaacttta ttagagttag caaagttaaa ttttaatgtt 780
gttcaagctc agcttcagaa gaatcttaga gaagctagta gatggtgggc taatcttggt 840
ttcgcagata atttaaagtt tgctagagat agacttgtag agtgtttttc atgcgcagta 900
ggtgtagcat ttgaaccaga gcattcatct tttagaatat gtttaactaa ggtaattaat 960
cttgttctta ttata 975
<210> 58
<211> 13817
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pMTL8314-Pptaack-thlA-HMGS-Patp-HMGR-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-isp
S
<400> 58
aaactccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga 60
gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta 120
atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa 180
gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact 240
gttcttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca 300
tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt 360
accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg 420
ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag 480
cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta 540
agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat 600
ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg 660
tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc 720
ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac 780
cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc 840
gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc ccaatacgca gggccccctg caggataaaa 900
aaattgtaga taaattttat aaaatagttt tatctacaat ttttttatca ggaaacagct 960
atgaccgcgg ccgcagatag tcataatagt tccagaatag ttcaatttag aaattagact 1020
aaacttcaaa atgtttgtta aatatatacc aatctagtat agatattttt taaatactgg 1080
acttaaacag tagtaatttg cctaaaaaat tttttcaatt ttttttaaaa aatccttttc 1140
aagttgtaca ttgttatggt aatatgtaat tgaagaagtt atgtagtaat attgtaaacg 1200
tttcttgatt tttttacatc catgtagtgc ttaaaaaacc aaaatatgtc acatgcactt 1260
gtatatttca aataacaata tttattttct cgttaaattc acaaataatt tattaataat 1320
atcaataacc aagattatac ttaaatggat gtttattttt taacactttt atagtaaata 1380
tatttatttt atgtagtaaa aaggttataa ttataattgt atttattaca attaattaaa 1440
ataaaaaata gggttttagg taaaattaag ttattttaag aagtaattac aataaaaatt 1500
gaagttattt ctttaaggag gaaattcata tgaaagaggt tgttattgca tcagctgtta 1560
gaactgcaat aggatcttat ggaaaaagtc ttaaagatgt accagcagta gacttaggtg 1620
caactgcaat aaaggaagca gtaaagaaag caggtataaa acctgaagat gttaatgaag 1680
ttattttagg aaacgtatta caagctggac ttggacagaa tccagctaga caggcatcat 1740
tcaaagcagg attaccagta gagatacctg ctatgactat taataaagtt tgtggttcag 1800
gattaagaac agtttcttta gctgctcaaa ttataaaagc tggtgacgca gatgtaataa 1860
tagcaggtgg tatggaaaat atgtcaagag caccatacct tgctaataat gctagatggg 1920
gttatagaat gggaaacgct aaatttgtag acgaaatgat aactgatgga ctttgggatg 1980
catttaacga ttatcacatg ggaattactg ctgaaaatat agctgagaga tggaatataa 2040
gtagagaaga acaagatgag tttgcacttg catctcagaa aaaggcagaa gaagctatta 2100
aatcaggaca atttaaagat gaaattgttc cagtagtaat taaaggtaga aaaggtgaaa 2160
cagttgtaga cactgatgaa catcctagat ttggatctac aatagaaggt ttagctaaat 2220
taaagcctgc ttttaagaaa gacggaacag taactgctgg aaacgcatca ggtttaaatg 2280
attgtgcagc tgttttagtt attatgtctg ctgaaaaggc aaaggaatta ggtgttaaac 2340
cacttgctaa gatagttagt tatggttcag caggtgtaga tcctgctatt atgggatatg 2400
gaccttttta tgctacaaag gcagctattg aaaaggctgg ttggacagtt gatgaacttg 2460
atcttataga gtcaaatgag gcatttgcag cacaaagtct tgctgttgct aaggatctta 2520
aattcgatat gaataaagta aatgtaaacg gtggtgctat agcacttggt catccaatag 2580
gtgctagtgg tgctagaatt ttagttacat tagttcatgc aatgcaaaag agagacgcta 2640
aaaagggact tgcaacttta tgcataggtg gtggtcaagg aacagcaata cttcttgaaa 2700
aatgttaaga attcgaggct tttactaaaa acaataaaaa caggaggaaa taatatgact 2760
ataggaattg acaaaataaa cttttacgta ccaaaatatt atgtagatat ggcaaaatta 2820
gcagaagcaa gacaagtaga cccaaataaa tttcttattg gaataggaca gactgaaatg 2880
gcagttagtc cagtaaacca agatatagta tcaatgggtg ctaatgctgc taaagatata 2940
ataactgatg aagacaaaaa gaaaatagga atggtaatag tagcaactga gtcagcagta 3000
gatgcagcaa aggcagcagc agtacagatt cataatttat taggtattca accatttgca 3060
agatgtttcg aaatgaaaga agcatgttat gctgctactc ctgcaattca gttagctaag 3120
gattatttag ctacaagacc aaatgagaaa gttttagtta tagctacaga tacagctaga 3180
tatggactta attcaggtgg tgaacctact caaggtgctg gtgctgttgc tatggttata 3240
gctcataatc ctagtatact tgcattaaat gaagacgctg ttgcttatac agaagatgtt 3300
tatgatttct ggagaccaac aggacataag tatccattag tagatggtgc tttatcaaaa 3360
gacgcatata ttagatcttt tcaacaatct tggaatgaat atgctaagag acaaggaaag 3420
agtttagctg attttgctag tctttgcttt catgttcctt ttactaaaat gggtaaaaag 3480
gctttagaat ctataataga taacgcagat gaaacaactc aagagagatt aagatctgga 3540
tatgaagatg cagttgatta caatagatat gttggaaata tatacacagg aagtctttat 3600
ctttctctta taagtcttct tgaaaataga gatttacagg ctggtgaaac tattggatta 3660
ttttcatacg gatcaggttc tgttggtgaa ttttattcag ctacacttgt agaaggatat 3720
aaagatcacc ttgatcaggc agcacacaaa gcacttttaa acaatagaac tgaagtatca 3780
gtagatgcat acgaaacatt tttcaagaga tttgatgatg tagaatttga tgaagagcag 3840
gatgcagttc atgaagatag acatatattc tatctttcaa acatagagaa taatgtaaga 3900
gaatatcata gacctgaata agagctcgtt ataattttca attttcattc tttttaaagg 3960
agattagcat acattttatc ataattatac agacaatata gtaatatatg atgttaaaat 4020
atcaatatat ggttaaaaat ctgtatattt tttcccattt taattatttg tactataata 4080
ttacactgag tgtattgcat atttaaaaaa tatttggtac aattagttag ttaaataaat 4140
tctaaattgt aaattatcag aatccttatt aaggaaatac atagatttaa ggagaaatca 4200
taaaaaggtg taatataaac tggctaaaat tgagcaaaaa ttgagcaatt aagacttttt 4260
gattgtatct ttttatatat ttaaggtata taatcttatt tatattgggg gaaggtacca 4320
tgcaatcatt agacaaaaat ttcagacatt tatcaagaca acaaaagtta caacaattag 4380
ttgataaaca gtggctttca gaagatcagt ttgatatttt acttaatcat cctcttatag 4440
atgaagaagt tgctaatagt cttatagaaa atgtaattgc acagggtgca ttaccagttg 4500
gacttcttcc taatataata gttgatgata aggcttatgt tgtaccaatg atggttgaag 4560
aacctagtgt tgttgcagct gcatcttatg gtgctaaatt agtaaatcag acaggtggat 4620
ttaaaactgt atcatcagaa agaataatga ttggacagat agtatttgat ggtgtagatg 4680
acactgaaaa attaagtgca gatattaaag cattagaaaa acaaatacat aagattgcag 4740
atgaagcata tcctagtata aaagcaagag gtggtggtta tcaaagaata gcaatagata 4800
catttccaga gcaacaactt ttaagtctta aggtatttgt agatacaaaa gatgctatgg 4860
gtgctaatat gcttaatact atacttgagg caataactgc attccttaaa aatgaatctc 4920
ctcaatcaga tatattaatg tctatacttt caaaccatgc aactgctagt gtagtaaaag 4980
tacaaggtga gatagatgta aaagatcttg ctagaggtga aagaacaggt gaagaagtag 5040
ctaagagaat ggaaagagct tctgtattag ctcaggttga tattcataga gctgcaacac 5100
ataacaaagg tgttatgaat ggaatacatg ctgttgtttt agctacagga aatgatacta 5160
gaggtgctga agcatctgca catgcatacg catcaagaga cggacaatat agaggtatag 5220
caacttggag atatgatcag aagagacaaa gacttattgg aactattgaa gttccaatga 5280
cacttgctat agtaggtggt ggtactaaag tattaccaat agctaaggca tcattagagt 5340
tattaaatgt tgattctgca caagaacttg gacacgtagt tgctgctgtt ggattagcac 5400
aaaactttgc tgcttgtaga gcacttgttt ctgaaggtat tcaacaagga cacatgtcat 5460
tacaatataa aagtttagca atagtagtag gtgcaaaagg tgacgagata gcacaagtag 5520
cagaagctct taaacaggaa ccaagagcta atacacaggt tgctgaaaga attttacagg 5580
aaattagaca gcaataatct agaatatcga tacagataaa aaaatatata atacagaaga 5640
aaaaattata aatttgtggt ataatataaa gtatagtaat ttaagtttaa acctcgtgaa 5700
aacgctaaca aataatagga ggtcaattga tgatagctgt tccatttaac gctggaaaaa 5760
taaaagtttt aattgaggca ttagaatctg gaaattattc atcaataaaa tcagatgtat 5820
atgacggaat gttatatgat gcaccagatc accttaaatc attagtaaac agatttgtag 5880
aacttaataa tataactgag ccattagcag taactataca gacaaatctt cctccttcaa 5940
gaggtcttgg atctagtgca gctgttgctg ttgcttttgt aagagcaagt tatgatttct 6000
taggaaaaag tttaactaaa gaagagctta tagaaaaggc taattgggct gaacaaatag 6060
ctcatggaaa gccatctgga atagatacac aaacaatagt atctggaaag cctgtttggt 6120
ttcaaaaggg acatgcagaa acacttaaaa ctctttcact tgatggatac atggtagtaa 6180
ttgatacagg tgttaaagga agtacaagac aggctgtaga agatgttcat aaactttgcg 6240
aagatcctca atatatgagt cacgtaaaac acataggaaa acttgtactt agagcatctg 6300
atgttattga acatcataac tttgaagcac ttgctgatat attcaatgaa tgtcatgctg 6360
atttaaaggc tcttacagta agtcatgaca aaatagaaca gttaatgaag ataggaaaag 6420
aaaatggtgc tatagctggt aaattaactg gtgctggtag aggtggttca atgttattac 6480
ttgcaaaaga cttaccaact gcaaagaata tagttaaagc agtagagaaa gctggtgcag 6540
cacatacttg gattgaaaat ttaggtggtt aagtcgacaa agacactaaa aaattataaa 6600
agtaaaggag gacattaaat gatacaagta aaggcaccag gaaaattata tatagcaggt 6660
gaatacgctg ttacagaacc aggatataaa tctgttctta tagctcttga tagatttgtt 6720
acagctacta ttgaggaagc tgatcaatac aaaggaacaa tacattcaaa ggcattacat 6780
cacaatccag taacttttag tagagatgaa gattctattg ttatatcaga cccacacgca 6840
gcaaaacaac ttaattatgt agtaactgct atagaaatat ttgagcaata tgcaaaatca 6900
tgtgacatag caatgaagca ttttcattta actatagatt ctaacttaga tgatagtaat 6960
ggacataagt atggacttgg atcttctgct gctgttttag tttcagtaat taaagtactt 7020
aacgaatttt atgatatgaa actttcaaac ctttatatat ataagttagc agtaattgct 7080
aatatgaaat tacagagttt atcttcatgc ggtgatatag cagtaagtgt ttattcaggt 7140
tggttagctt attctacatt tgaccatgaa tgggtaaaac accagataga agatacaaca 7200
gttgaagaag tacttattaa aaattggcct ggattacaca tagagccact tcaagctcct 7260
gaaaatatgg aagttcttat aggttggaca ggtagtccag ctagtagtcc tcattttgtt 7320
tctgaagtta aaagacttaa gtcagatcct tcattttacg gtgatttctt agaagattca 7380
catagatgtg tagaaaaatt aattcatgca ttcaaaacta ataatattaa gggtgttcag 7440
aaaatggtaa gacagaatag aactattata caaagaatgg ataaggaagc aacagttgat 7500
atagagactg agaagttaaa atatttatgt gatattgctg aaaaatatca tggtgcaagt 7560
aaaacttcag gtgctggtgg tggtgattgc ggaataacta taataaataa ggatgtagac 7620
aaagagaaaa tatatgatga atggactaaa catggaataa agcctcttaa gtttaatatt 7680
tatcatggac aataaccatg gtcaataatc ttacaataaa taaaagaaag gaggcaaaaa 7740
tatgataaaa tctggaaaag caagagcaca cactaatata gcacttataa aatattgggg 7800
taagaaagat gaggcattaa taataccaat gaataactca atatcagtaa ctttagaaaa 7860
gttttatact gaaacaaaag ttacatttaa cgatcagctt actcaagatc aattttggct 7920
taatggtgaa aaagtttctg gaaaagaatt agaaaagatt tcaaagtata tggatattgt 7980
tagaaataga gctggaatag attggtatgc tgagatagaa tctgataatt ttgttcctac 8040
agctgctggt cttgctagtt ctgctagtgc ttatgcagca ttagctgctg catgtaacca 8100
agcacttgat ttacagttaa gtgataaaga cttaagtaga ttagctagaa ttggatcagg 8160
atcagcatca agatcaatat acggtggttt tgcagaatgg gaaaaaggat ataatgacga 8220
aacttcttat gctgttccat tagaaagtaa tcactttgaa gatgatcttg ctatgatttt 8280
tgtagtaata aaccaacatt ctaaaaaggt tccttcaaga tatggaatgt ctcttacaag 8340
aaatacaagt agattctatc aatattggtt agaccatatt gatgaagatc ttgcagaagc 8400
aaaggcagca atacaagata aggattttaa gagattaggt gaagttattg aagagaatgg 8460
acttagaatg catgctacaa atcttggatc aactccacct tttacttact tagtacaaga 8520
gtcatacgat gtaatggcat tagtacatga gtgtagagaa gcaggatatc catgctattt 8580
cactatggat gctggaccta atgtaaaaat acttgtagag aagaaaaaca aacaacagat 8640
aatagataaa cttttaactc agttcgataa taatcagata atagatagtg atattatagc 8700
tacaggtatt gaaattatag aataaactag ttgtatatta aaatagtaga atacataaga 8760
tacttaattt aattaaagat agttaagtac ttttcaatgt gcttttttag atgtttaata 8820
caaatcttta attgtaaaag aaatgctgta ctatttactg ttctagtgac gggattaaac 8880
tgtattaatt ataaataaaa aataagtaca gttgtttaaa attatatttt gtattaaatc 8940
taatagtacg atgtaagtta ttttatacta ttgctagttt aataaaaaga tttaattata 9000
tacttgaaaa ggagaggaac tcgagatggc agagtatata atagcagtag atgagttcga 9060
taacgaaata ggatcaatag aaaagatgga agctcataga aaaggaacac ttcatagagc 9120
attcagtatt ttagttttta actcaaagaa tcaactttta ttacagaaaa gaaatgtaaa 9180
gaaatatcac tctccaggat tatggacaaa cacttgttgt agtcacccaa gatatggtga 9240
atctcttcat gatgctatat acagaagatt aaaagaagag atgggattta cttgcgaact 9300
tgaagaagta ttctcattca tatataaggt aaaacttgaa gataatttat ttgagaatga 9360
atatgaccat gtatttattg gtaaatatga tggtgagata attgttaata aagatgaagt 9420
tgatgatttt aaatgggtag acattaatga agttaaaaag gacataatag aaagacctga 9480
ggcatatact tactggttta agtatcttgt aaataaagct gaaaataaga tatttaaata 9540
aaccggtggg aggaaatgaa catggcaaca gaattattat gtttacacag acctatatca 9600
cttactcaca aactttttag gaatccatta cctaaagtta ttcaagctac acctttaaca 9660
ttaaaactta ggtgtagtgt ttctacagaa aatgtatcat ttagtgagac agaaactgaa 9720
acaagaagat cagcaaatta tgaaccaaat tcttgggatt atgattatct tctttcttct 9780
gatactgatg agtcaataga agtacataaa gataaggcta agaaattaga agctgaagtt 9840
aggagagaaa taaataatga gaaggctgaa tttcttacac ttcttgaact tattgataat 9900
gtacaaagac ttggattagg atatagattt gagtctgata taagaagagc attagataga 9960
tttgtaagta gtggaggatt tgatggagtt actaaaactt cattacatgg aacagcatta 10020
tcatttaggt tattaaggca acatggtttt gaagtatctc aagaagcttt tagtggattt 10080
aaagatcaga atggaaactt tcttgagaat ttaaaggaag acataaaagc aattctttct 10140
ctttatgaag catcattttt agcattagaa ggtgagaata tattagatga ggctaaagta 10200
tttgcaatat ctcatcttaa agaacttagt gaagaaaaga ttggtaaaga attagctgaa 10260
caagtttcac atgctttaga attaccatta catagaagaa cacaaagatt agaagcagtt 10320
tggtcaatag aagcatatag aaagaaagaa gacgcaaatc aagtactttt agaacttgca 10380
atacttgact acaatatgat tcaaagtgta tatcagaggg atttaagaga aacatcaaga 10440
tggtggagaa gagtaggatt agcaactaaa ttacattttg ctagagatag gcttattgaa 10500
agtttttatt gggctgttgg agttgctttt gaaccacaat attctgattg cagaaatagt 10560
gtagcaaaga tgttttcatt tgttactata attgacgata tttacgatgt atatggaact 10620
ttagatgaac ttgaactttt tactgatgca gttgaaagat gggatgtaaa tgctattaat 10680
gatcttcctg attatatgaa gttatgtttt cttgcacttt acaatactat taacgagata 10740
gcttacgata acttaaaaga taaaggtgag aacatacttc cttatttaac aaaagcatgg 10800
gcagatttat gtaatgcatt tcttcaagaa gctaagtggc tttataataa atcaacacct 10860
acatttgatg attattttgg aaatgcatgg aaaagttcta gtggaccttt acagcttatt 10920
tttgcttatt ttgctgtagt acagaacatt aaaaaggaag agattgagaa tcttcagaaa 10980
tatcatgaca taatatcaag acctagtcac atttttaggc tttgtaatga tttagcatct 11040
gcttcagcag aaatagcaag aggtgaaact gctaattctg taagttgtta tatgagaaca 11100
aaaggtatat ctgaagaatt agctactgaa agtgttatga atcttataga cgaaacttgg 11160
aagaaaatga acaaagaaaa acttggtgga tctttatttg caaaaccttt tgttgagact 11220
gctataaatt tagctagaca gtctcattgc acatatcata atggtgatgc acatactagt 11280
ccagatgaat taactaggaa aagagtactt agtgtaataa ctgaaccaat attaccattt 11340
gaaagataag ctagcataaa aataagaagc ctgcatttgc aggcttctta tttttatggc 11400
gcgccgccat tatttttttg aacaattgac aattcatttc ttatttttta ttaagtgata 11460
gtcaaaaggc ataacagtgc tgaatagaaa gaaatttaca gaaaagaaaa ttatagaatt 11520
tagtatgatt aattatactc atttatgaat gtttaattga atacaaaaaa aaatacttgt 11580
tatgtattca attacgggtt aaaatataga caagttgaaa aatttaataa aaaaataagt 11640
cctcagctct tatatattaa gctaccaact tagtatataa gccaaaactt aaatgtgcta 11700
ccaacacatc aagccgttag agaactctat ctatagcaat atttcaaatg taccgacata 11760
caagagaaac attaactata tatattcaat ttatgagatt atcttaacag atataaatgt 11820
aaattgcaat aagtaagatt tagaagttta tagcctttgt gtattggaag cagtacgcaa 11880
aggctttttt atttgataaa aattagaagt atatttattt tttcataatt aatttatgaa 11940
aatgaaaggg ggtgagcaaa gtgacagagg aaagcagtat cttatcaaat aacaaggtat 12000
tagcaatatc attattgact ttagcagtaa acattatgac ttttatagtg cttgtagcta 12060
agtagtacga aagggggagc tttaaaaagc tccttggaat acatagaatt cataaattaa 12120
tttatgaaaa gaagggcgta tatgaaaact tgtaaaaatt gcaaagagtt tattaaagat 12180
actgaaatat gcaaaataca ttcgttgatg attcatgata aaacagtagc aacctattgc 12240
agtaaataca atgagtcaag atgtttacat aaagggaaag tccaatgtat taattgttca 12300
aagatgaacc gatatggatg gtgtgccata aaaatgagat gttttacaga ggaagaacag 12360
aaaaaagaac gtacatgcat taaatattat gcaaggagct ttaaaaaagc tcatgtaaag 12420
aagagtaaaa agaaaaaata atttatttat taatttaata ttgagagtgc cgacacagta 12480
tgcactaaaa aatatatctg tggtgtagtg agccgataca aaaggatagt cactcgcatt 12540
ttcataatac atcttatgtt atgattatgt gtcggtggga cttcacgacg aaaacccaca 12600
ataaaaaaag agttcggggt agggttaagc atagttgagg caactaaaca atcaagctag 12660
gatatgcagt agcagaccgt aaggtcgttg tttaggtgtg ttgtaataca tacgctatta 12720
agatgtaaaa atacggatac caatgaaggg aaaagtataa tttttggatg tagtttgttt 12780
gttcatctat gggcaaacta cgtccaaagc cgtttccaaa tctgctaaaa agtatatcct 12840
ttctaaaatc aaagtcaagt atgaaatcat aaataaagtt taattttgaa gttattatga 12900
tattatgttt ttctattaaa ataaattaag tatatagaat agtttaataa tagtatatac 12960
ttaatgtgat aagtgtctga cagtgtcaca gaaaggatga ttgttatgga ttataagcgg 13020
ccggccagtg ggcaagttga aaaattcaca aaaatgtggt ataatatctt tgttcattag 13080
agcgataaac ttgaatttga gagggaactt agatggtatt tgaaaaaatt gataaaaata 13140
gttggaacag aaaagagtat tttgaccact actttgcaag tgtaccttgt acctacagca 13200
tgaccgttaa agtggatatc acacaaataa aggaaaaggg aatgaaacta tatcctgcaa 13260
tgctttatta tattgcaatg attgtaaacc gccattcaga gtttaggacg gcaatcaatc 13320
aagatggtga attggggata tatgatgaga tgataccaag ctatacaata tttcacaatg 13380
atactgaaac attttccagc ctttggactg agtgtaagtc tgactttaaa tcatttttag 13440
cagattatga aagtgatacg caacggtatg gaaacaatca tagaatggaa ggaaagccaa 13500
atgctccgga aaacattttt aatgtatcta tgataccgtg gtcaaccttc gatggcttta 13560
atctgaattt gcagaaagga tatgattatt tgattcctat ttttactatg gggaaatatt 13620
ataaagaaga taacaaaatt atacttcctt tggcaattca agttcatcac gcagtatgtg 13680
acggatttca catttgccgt tttgtaaacg aattgcagga attgataaat agttaacttc 13740
aggtttgtct gtaactaaaa acaagtattt aagcaaaaac atcgtagaaa tacggtgttt 13800
tttgttaccc taagttt 13817
<210> 59
<211> 14709
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒
pMTL8314-Pptaack-thlA-HMGS-Patp-HMGR-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-isp
A-FS
<400> 59
aaactccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga 60
gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta 120
atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa 180
gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact 240
gttcttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca 300
tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt 360
accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg 420
ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag 480
cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta 540
agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat 600
ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg 660
tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc 720
ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac 780
cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc 840
gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc ccaatacgca gggccccctg caggataaaa 900
aaattgtaga taaattttat aaaatagttt tatctacaat ttttttatca ggaaacagct 960
atgaccgcgg ccgcagatag tcataatagt tccagaatag ttcaatttag aaattagact 1020
aaacttcaaa atgtttgtta aatatatacc aatctagtat agatattttt taaatactgg 1080
acttaaacag tagtaatttg cctaaaaaat tttttcaatt ttttttaaaa aatccttttc 1140
aagttgtaca ttgttatggt aatatgtaat tgaagaagtt atgtagtaat attgtaaacg 1200
tttcttgatt tttttacatc catgtagtgc ttaaaaaacc aaaatatgtc acatgcactt 1260
gtatatttca aataacaata tttattttct cgttaaattc acaaataatt tattaataat 1320
atcaataacc aagattatac ttaaatggat gtttattttt taacactttt atagtaaata 1380
tatttatttt atgtagtaaa aaggttataa ttataattgt atttattaca attaattaaa 1440
ataaaaaata gggttttagg taaaattaag ttattttaag aagtaattac aataaaaatt 1500
gaagttattt ctttaaggag gaaattcata tgaaagaggt tgttattgca tcagctgtta 1560
gaactgcaat aggatcttat ggaaaaagtc ttaaagatgt accagcagta gacttaggtg 1620
caactgcaat aaaggaagca gtaaagaaag caggtataaa acctgaagat gttaatgaag 1680
ttattttagg aaacgtatta caagctggac ttggacagaa tccagctaga caggcatcat 1740
tcaaagcagg attaccagta gagatacctg ctatgactat taataaagtt tgtggttcag 1800
gattaagaac agtttcttta gctgctcaaa ttataaaagc tggtgacgca gatgtaataa 1860
tagcaggtgg tatggaaaat atgtcaagag caccatacct tgctaataat gctagatggg 1920
gttatagaat gggaaacgct aaatttgtag acgaaatgat aactgatgga ctttgggatg 1980
catttaacga ttatcacatg ggaattactg ctgaaaatat agctgagaga tggaatataa 2040
gtagagaaga acaagatgag tttgcacttg catctcagaa aaaggcagaa gaagctatta 2100
aatcaggaca atttaaagat gaaattgttc cagtagtaat taaaggtaga aaaggtgaaa 2160
cagttgtaga cactgatgaa catcctagat ttggatctac aatagaaggt ttagctaaat 2220
taaagcctgc ttttaagaaa gacggaacag taactgctgg aaacgcatca ggtttaaatg 2280
attgtgcagc tgttttagtt attatgtctg ctgaaaaggc aaaggaatta ggtgttaaac 2340
cacttgctaa gatagttagt tatggttcag caggtgtaga tcctgctatt atgggatatg 2400
gaccttttta tgctacaaag gcagctattg aaaaggctgg ttggacagtt gatgaacttg 2460
atcttataga gtcaaatgag gcatttgcag cacaaagtct tgctgttgct aaggatctta 2520
aattcgatat gaataaagta aatgtaaacg gtggtgctat agcacttggt catccaatag 2580
gtgctagtgg tgctagaatt ttagttacat tagttcatgc aatgcaaaag agagacgcta 2640
aaaagggact tgcaacttta tgcataggtg gtggtcaagg aacagcaata cttcttgaaa 2700
aatgttaaga attcgaggct tttactaaaa acaataaaaa caggaggaaa taatatgact 2760
ataggaattg acaaaataaa cttttacgta ccaaaatatt atgtagatat ggcaaaatta 2820
gcagaagcaa gacaagtaga cccaaataaa tttcttattg gaataggaca gactgaaatg 2880
gcagttagtc cagtaaacca agatatagta tcaatgggtg ctaatgctgc taaagatata 2940
ataactgatg aagacaaaaa gaaaatagga atggtaatag tagcaactga gtcagcagta 3000
gatgcagcaa aggcagcagc agtacagatt cataatttat taggtattca accatttgca 3060
agatgtttcg aaatgaaaga agcatgttat gctgctactc ctgcaattca gttagctaag 3120
gattatttag ctacaagacc aaatgagaaa gttttagtta tagctacaga tacagctaga 3180
tatggactta attcaggtgg tgaacctact caaggtgctg gtgctgttgc tatggttata 3240
gctcataatc ctagtatact tgcattaaat gaagacgctg ttgcttatac agaagatgtt 3300
tatgatttct ggagaccaac aggacataag tatccattag tagatggtgc tttatcaaaa 3360
gacgcatata ttagatcttt tcaacaatct tggaatgaat atgctaagag acaaggaaag 3420
agtttagctg attttgctag tctttgcttt catgttcctt ttactaaaat gggtaaaaag 3480
gctttagaat ctataataga taacgcagat gaaacaactc aagagagatt aagatctgga 3540
tatgaagatg cagttgatta caatagatat gttggaaata tatacacagg aagtctttat 3600
ctttctctta taagtcttct tgaaaataga gatttacagg ctggtgaaac tattggatta 3660
ttttcatacg gatcaggttc tgttggtgaa ttttattcag ctacacttgt agaaggatat 3720
aaagatcacc ttgatcaggc agcacacaaa gcacttttaa acaatagaac tgaagtatca 3780
gtagatgcat acgaaacatt tttcaagaga tttgatgatg tagaatttga tgaagagcag 3840
gatgcagttc atgaagatag acatatattc tatctttcaa acatagagaa taatgtaaga 3900
gaatatcata gacctgaata agagctcgtt ataattttca attttcattc tttttaaagg 3960
agattagcat acattttatc ataattatac agacaatata gtaatatatg atgttaaaat 4020
atcaatatat ggttaaaaat ctgtatattt tttcccattt taattatttg tactataata 4080
ttacactgag tgtattgcat atttaaaaaa tatttggtac aattagttag ttaaataaat 4140
tctaaattgt aaattatcag aatccttatt aaggaaatac atagatttaa ggagaaatca 4200
taaaaaggtg taatataaac tggctaaaat tgagcaaaaa ttgagcaatt aagacttttt 4260
gattgtatct ttttatatat ttaaggtata taatcttatt tatattgggg gaaggtacca 4320
tgcaatcatt agacaaaaat ttcagacatt tatcaagaca acaaaagtta caacaattag 4380
ttgataaaca gtggctttca gaagatcagt ttgatatttt acttaatcat cctcttatag 4440
atgaagaagt tgctaatagt cttatagaaa atgtaattgc acagggtgca ttaccagttg 4500
gacttcttcc taatataata gttgatgata aggcttatgt tgtaccaatg atggttgaag 4560
aacctagtgt tgttgcagct gcatcttatg gtgctaaatt agtaaatcag acaggtggat 4620
ttaaaactgt atcatcagaa agaataatga ttggacagat agtatttgat ggtgtagatg 4680
acactgaaaa attaagtgca gatattaaag cattagaaaa acaaatacat aagattgcag 4740
atgaagcata tcctagtata aaagcaagag gtggtggtta tcaaagaata gcaatagata 4800
catttccaga gcaacaactt ttaagtctta aggtatttgt agatacaaaa gatgctatgg 4860
gtgctaatat gcttaatact atacttgagg caataactgc attccttaaa aatgaatctc 4920
ctcaatcaga tatattaatg tctatacttt caaaccatgc aactgctagt gtagtaaaag 4980
tacaaggtga gatagatgta aaagatcttg ctagaggtga aagaacaggt gaagaagtag 5040
ctaagagaat ggaaagagct tctgtattag ctcaggttga tattcataga gctgcaacac 5100
ataacaaagg tgttatgaat ggaatacatg ctgttgtttt agctacagga aatgatacta 5160
gaggtgctga agcatctgca catgcatacg catcaagaga cggacaatat agaggtatag 5220
caacttggag atatgatcag aagagacaaa gacttattgg aactattgaa gttccaatga 5280
cacttgctat agtaggtggt ggtactaaag tattaccaat agctaaggca tcattagagt 5340
tattaaatgt tgattctgca caagaacttg gacacgtagt tgctgctgtt ggattagcac 5400
aaaactttgc tgcttgtaga gcacttgttt ctgaaggtat tcaacaagga cacatgtcat 5460
tacaatataa aagtttagca atagtagtag gtgcaaaagg tgacgagata gcacaagtag 5520
cagaagctct taaacaggaa ccaagagcta atacacaggt tgctgaaaga attttacagg 5580
aaattagaca gcaataatct agaatatcga tacagataaa aaaatatata atacagaaga 5640
aaaaattata aatttgtggt ataatataaa gtatagtaat ttaagtttaa acctcgtgaa 5700
aacgctaaca aataatagga ggtcaattga tgatagctgt tccatttaac gctggaaaaa 5760
taaaagtttt aattgaggca ttagaatctg gaaattattc atcaataaaa tcagatgtat 5820
atgacggaat gttatatgat gcaccagatc accttaaatc attagtaaac agatttgtag 5880
aacttaataa tataactgag ccattagcag taactataca gacaaatctt cctccttcaa 5940
gaggtcttgg atctagtgca gctgttgctg ttgcttttgt aagagcaagt tatgatttct 6000
taggaaaaag tttaactaaa gaagagctta tagaaaaggc taattgggct gaacaaatag 6060
ctcatggaaa gccatctgga atagatacac aaacaatagt atctggaaag cctgtttggt 6120
ttcaaaaggg acatgcagaa acacttaaaa ctctttcact tgatggatac atggtagtaa 6180
ttgatacagg tgttaaagga agtacaagac aggctgtaga agatgttcat aaactttgcg 6240
aagatcctca atatatgagt cacgtaaaac acataggaaa acttgtactt agagcatctg 6300
atgttattga acatcataac tttgaagcac ttgctgatat attcaatgaa tgtcatgctg 6360
atttaaaggc tcttacagta agtcatgaca aaatagaaca gttaatgaag ataggaaaag 6420
aaaatggtgc tatagctggt aaattaactg gtgctggtag aggtggttca atgttattac 6480
ttgcaaaaga cttaccaact gcaaagaata tagttaaagc agtagagaaa gctggtgcag 6540
cacatacttg gattgaaaat ttaggtggtt aagtcgacaa agacactaaa aaattataaa 6600
agtaaaggag gacattaaat gatacaagta aaggcaccag gaaaattata tatagcaggt 6660
gaatacgctg ttacagaacc aggatataaa tctgttctta tagctcttga tagatttgtt 6720
acagctacta ttgaggaagc tgatcaatac aaaggaacaa tacattcaaa ggcattacat 6780
cacaatccag taacttttag tagagatgaa gattctattg ttatatcaga cccacacgca 6840
gcaaaacaac ttaattatgt agtaactgct atagaaatat ttgagcaata tgcaaaatca 6900
tgtgacatag caatgaagca ttttcattta actatagatt ctaacttaga tgatagtaat 6960
ggacataagt atggacttgg atcttctgct gctgttttag tttcagtaat taaagtactt 7020
aacgaatttt atgatatgaa actttcaaac ctttatatat ataagttagc agtaattgct 7080
aatatgaaat tacagagttt atcttcatgc ggtgatatag cagtaagtgt ttattcaggt 7140
tggttagctt attctacatt tgaccatgaa tgggtaaaac accagataga agatacaaca 7200
gttgaagaag tacttattaa aaattggcct ggattacaca tagagccact tcaagctcct 7260
gaaaatatgg aagttcttat aggttggaca ggtagtccag ctagtagtcc tcattttgtt 7320
tctgaagtta aaagacttaa gtcagatcct tcattttacg gtgatttctt agaagattca 7380
catagatgtg tagaaaaatt aattcatgca ttcaaaacta ataatattaa gggtgttcag 7440
aaaatggtaa gacagaatag aactattata caaagaatgg ataaggaagc aacagttgat 7500
atagagactg agaagttaaa atatttatgt gatattgctg aaaaatatca tggtgcaagt 7560
aaaacttcag gtgctggtgg tggtgattgc ggaataacta taataaataa ggatgtagac 7620
aaagagaaaa tatatgatga atggactaaa catggaataa agcctcttaa gtttaatatt 7680
tatcatggac aataaccatg gtcaataatc ttacaataaa taaaagaaag gaggcaaaaa 7740
tatgataaaa tctggaaaag caagagcaca cactaatata gcacttataa aatattgggg 7800
taagaaagat gaggcattaa taataccaat gaataactca atatcagtaa ctttagaaaa 7860
gttttatact gaaacaaaag ttacatttaa cgatcagctt actcaagatc aattttggct 7920
taatggtgaa aaagtttctg gaaaagaatt agaaaagatt tcaaagtata tggatattgt 7980
tagaaataga gctggaatag attggtatgc tgagatagaa tctgataatt ttgttcctac 8040
agctgctggt cttgctagtt ctgctagtgc ttatgcagca ttagctgctg catgtaacca 8100
agcacttgat ttacagttaa gtgataaaga cttaagtaga ttagctagaa ttggatcagg 8160
atcagcatca agatcaatat acggtggttt tgcagaatgg gaaaaaggat ataatgacga 8220
aacttcttat gctgttccat tagaaagtaa tcactttgaa gatgatcttg ctatgatttt 8280
tgtagtaata aaccaacatt ctaaaaaggt tccttcaaga tatggaatgt ctcttacaag 8340
aaatacaagt agattctatc aatattggtt agaccatatt gatgaagatc ttgcagaagc 8400
aaaggcagca atacaagata aggattttaa gagattaggt gaagttattg aagagaatgg 8460
acttagaatg catgctacaa atcttggatc aactccacct tttacttact tagtacaaga 8520
gtcatacgat gtaatggcat tagtacatga gtgtagagaa gcaggatatc catgctattt 8580
cactatggat gctggaccta atgtaaaaat acttgtagag aagaaaaaca aacaacagat 8640
aatagataaa cttttaactc agttcgataa taatcagata atagatagtg atattatagc 8700
tacaggtatt gaaattatag aataaactag ttgtatatta aaatagtaga atacataaga 8760
tacttaattt aattaaagat agttaagtac ttttcaatgt gcttttttag atgtttaata 8820
caaatcttta attgtaaaag aaatgctgta ctatttactg ttctagtgac gggattaaac 8880
tgtattaatt ataaataaaa aataagtaca gttgtttaaa attatatttt gtattaaatc 8940
taatagtacg atgtaagtta ttttatacta ttgctagttt aataaaaaga tttaattata 9000
tacttgaaaa ggagaggaac tcgagatggc agagtatata atagcagtag atgagttcga 9060
taacgaaata ggatcaatag aaaagatgga agctcataga aaaggaacac ttcatagagc 9120
attcagtatt ttagttttta actcaaagaa tcaactttta ttacagaaaa gaaatgtaaa 9180
gaaatatcac tctccaggat tatggacaaa cacttgttgt agtcacccaa gatatggtga 9240
atctcttcat gatgctatat acagaagatt aaaagaagag atgggattta cttgcgaact 9300
tgaagaagta ttctcattca tatataaggt aaaacttgaa gataatttat ttgagaatga 9360
atatgaccat gtatttattg gtaaatatga tggtgagata attgttaata aagatgaagt 9420
tgatgatttt aaatgggtag acattaatga agttaaaaag gacataatag aaagacctga 9480
ggcatatact tactggttta agtatcttgt aaataaagct gaaaataaga tatttaaata 9540
aaccggtcag taacgaatag aattagaaaa acaaaggagg caagacaatg gatttcccac 9600
aacaattaga agcatgtgta aaacaggcta atcaggcact tagtagattt attgctcctc 9660
ttccttttca aaatacacca gtagtagaaa ctatgcaata cggtgcactt ttaggtggta 9720
aaagattaag accattctta gtatatgcta caggacacat gtttggtgta tcaactaata 9780
ctttagacgc tccagctgct gctgttgaat gtattcatgc ttattcttta atacatgatg 9840
acttaccagc aatggatgac gatgatttaa gaagaggttt acctacatgt catgttaaat 9900
ttggtgaagc taatgcaatt ttagcaggtg acgctttaca aactttagct ttttctatac 9960
tttcagatgc agacatgcct gaagtttcag atagagatag aatttctatg atatcagagc 10020
ttgcatctgc atcaggaata gctggaatgt gcggtggtca agcacttgat ttagatgcag 10080
aaggtaaaca cgtaccactt gatgctttag agagaataca tagacataaa acaggtgctc 10140
ttataagagc agcagtaaga ttaggtgctt taagtgctgg tgacaagggt agaagagcac 10200
ttccagtact tgataagtat gcagaaagta taggattagc ttttcaagtt caagatgaca 10260
tacttgacgt tgttggtgat actgctactt taggaaaaag acagggtgca gatcagcaat 10320
taggaaaatc tacataccct gctttacttg gattagaaca ggctagaaag aaagcaagag 10380
acttaataga tgacgcaaga caaagtctta aacagttagc tgaacaatca cttgacacaa 10440
gtgcacttga agcacttgca gattatatta tacagagaaa caagtaaaag cttttaaagg 10500
aggggaaaaa atggaattta gagtacattt acaggcagac aacgaacaga aaatatttca 10560
aaatcaaatg aaaccagagc cagaagcatc atatcttata aatcaaagaa gaagtgctaa 10620
ttataaacca aacatttgga aaaacgattt tcttgatcag tctttaatat caaaatatga 10680
tggtgatgaa tatagaaaac tttcagaaaa gttaatagaa gaagtaaaga tatacatatc 10740
agcagagact atggatttag ttgctaaatt agaacttata gattctgtta gaaaacttgg 10800
acttgctaat ctttttgaga aagaaataaa ggaagcatta gacagtatag cagcaataga 10860
atcagataat ttaggaacta gagacgatct ttatggaaca gctcttcatt ttaagattct 10920
tagacagcat ggatataagg taagtcaaga tatatttggt agatttatgg atgagaaagg 10980
aacattagaa aatcatcact ttgcacactt aaaaggaatg ttagaattat ttgaggcaag 11040
taatcttgga tttgaaggtg aagacatatt agatgaagct aaagcatctc ttacacttgc 11100
tcttagagat tcaggacata tttgttatcc agactcaaac ttaagtagag atgtagttca 11160
tagtttagaa ttacctagtc atagaagagt tcaatggttc gatgtaaaat ggcagattaa 11220
tgcatacgaa aaagatattt gtagagtaaa tgcaacttta ttagagttag caaagttaaa 11280
ttttaatgtt gttcaagctc agcttcagaa gaatcttaga gaagctagta gatggtgggc 11340
taatcttggt ttcgcagata atttaaagtt tgctagagat agacttgtag agtgtttttc 11400
atgcgcagta ggtgtagcat ttgaaccaga gcattcatct tttagaatat gtttaactaa 11460
ggtaattaat cttgttctta ttatagatga tgtatacgat atatatggat ctgaagaaga 11520
gttaaaacat tttacaaatg ctgttgatag atgggacagt agagaaacag aacagcttcc 11580
tgaatgcatg aaaatgtgtt ttcaagtatt atataacact acttgcgaaa tagcaagaga 11640
gatagaagaa gaaaacggtt ggaatcaagt attacctcaa cttactaagg tttgggctga 11700
tttttgtaag gctcttttag ttgaagcaga gtggtacaat aaatcacata ttccaacatt 11760
agaagaatat cttagaaacg gatgtatatc aagtagtgta tctgtacttt tagttcactc 11820
tttcttttca ataactcatg aaggtacaaa agaaatggct gatttcttac ataaaaatga 11880
agatctttta tacaacataa gtcttatagt aagattaaac aatgatttag gtacatcagc 11940
tgctgaacag gaaagaggtg attctccttc ttctatagtt tgctatatga gagaagttaa 12000
tgcttctgaa gagactgcaa gaaagaatat aaagggaatg attgataatg cttggaaaaa 12060
ggttaatgga aaatgtttca caactaacca agttccattt ctttcatcat tcatgaataa 12120
tgcaactaac atggcaagag tagcacactc attatataaa gacggtgatg gttttggtga 12180
tcaagaaaaa ggacctagaa cacatattct tagtttatta ttccaacctt tagtaaatta 12240
agctagcata aaaataagaa gcctgcattt gcaggcttct tatttttatg gcgcgccgcc 12300
attatttttt tgaacaattg acaattcatt tcttattttt tattaagtga tagtcaaaag 12360
gcataacagt gctgaataga aagaaattta cagaaaagaa aattatagaa tttagtatga 12420
ttaattatac tcatttatga atgtttaatt gaatacaaaa aaaaatactt gttatgtatt 12480
caattacggg ttaaaatata gacaagttga aaaatttaat aaaaaaataa gtcctcagct 12540
cttatatatt aagctaccaa cttagtatat aagccaaaac ttaaatgtgc taccaacaca 12600
tcaagccgtt agagaactct atctatagca atatttcaaa tgtaccgaca tacaagagaa 12660
acattaacta tatatattca atttatgaga ttatcttaac agatataaat gtaaattgca 12720
ataagtaaga tttagaagtt tatagccttt gtgtattgga agcagtacgc aaaggctttt 12780
ttatttgata aaaattagaa gtatatttat tttttcataa ttaatttatg aaaatgaaag 12840
ggggtgagca aagtgacaga ggaaagcagt atcttatcaa ataacaaggt attagcaata 12900
tcattattga ctttagcagt aaacattatg acttttatag tgcttgtagc taagtagtac 12960
gaaaggggga gctttaaaaa gctccttgga atacatagaa ttcataaatt aatttatgaa 13020
aagaagggcg tatatgaaaa cttgtaaaaa ttgcaaagag tttattaaag atactgaaat 13080
atgcaaaata cattcgttga tgattcatga taaaacagta gcaacctatt gcagtaaata 13140
caatgagtca agatgtttac ataaagggaa agtccaatgt attaattgtt caaagatgaa 13200
ccgatatgga tggtgtgcca taaaaatgag atgttttaca gaggaagaac agaaaaaaga 13260
acgtacatgc attaaatatt atgcaaggag ctttaaaaaa gctcatgtaa agaagagtaa 13320
aaagaaaaaa taatttattt attaatttaa tattgagagt gccgacacag tatgcactaa 13380
aaaatatatc tgtggtgtag tgagccgata caaaaggata gtcactcgca ttttcataat 13440
acatcttatg ttatgattat gtgtcggtgg gacttcacga cgaaaaccca caataaaaaa 13500
agagttcggg gtagggttaa gcatagttga ggcaactaaa caatcaagct aggatatgca 13560
gtagcagacc gtaaggtcgt tgtttaggtg tgttgtaata catacgctat taagatgtaa 13620
aaatacggat accaatgaag ggaaaagtat aatttttgga tgtagtttgt ttgttcatct 13680
atgggcaaac tacgtccaaa gccgtttcca aatctgctaa aaagtatatc ctttctaaaa 13740
tcaaagtcaa gtatgaaatc ataaataaag tttaattttg aagttattat gatattatgt 13800
ttttctatta aaataaatta agtatataga atagtttaat aatagtatat acttaatgtg 13860
ataagtgtct gacagtgtca cagaaaggat gattgttatg gattataagc ggccggccag 13920
tgggcaagtt gaaaaattca caaaaatgtg gtataatatc tttgttcatt agagcgataa 13980
acttgaattt gagagggaac ttagatggta tttgaaaaaa ttgataaaaa tagttggaac 14040
agaaaagagt attttgacca ctactttgca agtgtacctt gtacctacag catgaccgtt 14100
aaagtggata tcacacaaat aaaggaaaag ggaatgaaac tatatcctgc aatgctttat 14160
tatattgcaa tgattgtaaa ccgccattca gagtttagga cggcaatcaa tcaagatggt 14220
gaattgggga tatatgatga gatgatacca agctatacaa tatttcacaa tgatactgaa 14280
acattttcca gcctttggac tgagtgtaag tctgacttta aatcattttt agcagattat 14340
gaaagtgata cgcaacggta tggaaacaat catagaatgg aaggaaagcc aaatgctccg 14400
gaaaacattt ttaatgtatc tatgataccg tggtcaacct tcgatggctt taatctgaat 14460
ttgcagaaag gatatgatta tttgattcct atttttacta tggggaaata ttataaagaa 14520
gataacaaaa ttatacttcc tttggcaatt caagttcatc acgcagtatg tgacggattt 14580
cacatttgcc gttttgtaaa cgaattgcag gaattgataa atagttaact tcaggtttgt 14640
ctgtaactaa aaacaagtat ttaagcaaaa acatcgtaga aatacggtgt tttttgttac 14700
cctaagttt 14709
<210> 60
<211> 601
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 混合II型甲基转移酶(hybrid Type II methyltransferase)
<400> 60
Met Phe Pro Cys Asn Ala Tyr Ile Glu Tyr Gly Asp Lys Asn Met Asn
1 5 10 15
Ser Phe Ile Glu Asp Val Glu Gln Ile Tyr Asn Phe Ile Lys Lys Asn
20 25 30
Ile Asp Val Glu Glu Lys Met His Phe Ile Glu Thr Tyr Lys Gln Lys
35 40 45
Ser Asn Met Lys Lys Glu Ile Ser Phe Ser Glu Glu Tyr Tyr Lys Gln
50 55 60
Lys Ile Met Asn Gly Lys Asn Gly Val Val Tyr Thr Pro Pro Glu Met
65 70 75 80
Ala Ala Phe Met Val Lys Asn Leu Ile Asn Val Asn Asp Val Ile Gly
85 90 95
Asn Pro Phe Ile Lys Ile Ile Asp Pro Ser Cys Gly Ser Gly Asn Leu
100 105 110
Ile Cys Lys Cys Phe Leu Tyr Leu Asn Arg Ile Phe Ile Lys Asn Ile
115 120 125
Glu Val Ile Asn Ser Lys Asn Asn Leu Asn Leu Lys Leu Glu Asp Ile
130 135 140
Ser Tyr His Ile Val Arg Asn Asn Leu Phe Gly Phe Asp Ile Asp Glu
145 150 155 160
Thr Ala Ile Lys Val Leu Lys Ile Asp Leu Phe Leu Ile Ser Asn Gln
165 170 175
Phe Ser Glu Lys Asn Phe Gln Val Lys Asp Phe Leu Val Glu Asn Ile
180 185 190
Asp Arg Lys Tyr Asp Val Phe Ile Gly Asn Pro Pro Tyr Ile Gly His
195 200 205
Lys Ser Val Asp Ser Ser Tyr Ser Tyr Val Leu Arg Lys Ile Tyr Gly
210 215 220
Ser Ile Tyr Arg Asp Lys Gly Asp Ile Ser Tyr Cys Phe Phe Gln Lys
225 230 235 240
Ser Leu Lys Cys Leu Lys Glu Gly Gly Lys Leu Val Phe Val Thr Ser
245 250 255
Arg Tyr Phe Cys Glu Ser Cys Ser Gly Lys Glu Leu Arg Lys Phe Leu
260 265 270
Ile Glu Asn Thr Ser Ile Tyr Lys Ile Ile Asp Phe Tyr Gly Ile Arg
275 280 285
Pro Phe Lys Arg Val Gly Ile Asp Pro Met Ile Ile Phe Leu Val Arg
290 295 300
Thr Lys Asn Trp Asn Asn Asn Ile Glu Ile Ile Arg Pro Asn Lys Ile
305 310 315 320
Glu Lys Asn Glu Lys Asn Lys Phe Leu Asp Ser Leu Phe Leu Asp Lys
325 330 335
Ser Glu Lys Cys Lys Lys Phe Ser Ile Ser Gln Lys Ser Ile Asn Asn
340 345 350
Asp Gly Trp Val Phe Val Asp Glu Val Glu Lys Asn Ile Ile Asp Lys
355 360 365
Ile Lys Glu Lys Ser Lys Phe Ile Leu Lys Asp Ile Cys His Ser Cys
370 375 380
Gln Gly Ile Ile Thr Gly Cys Asp Arg Ala Phe Ile Val Asp Arg Asp
385 390 395 400
Ile Ile Asn Ser Arg Lys Ile Glu Leu Arg Leu Ile Lys Pro Trp Ile
405 410 415
Lys Ser Ser His Ile Arg Lys Asn Glu Val Ile Lys Gly Glu Lys Phe
420 425 430
Ile Ile Tyr Ser Asn Leu Ile Glu Asn Glu Thr Glu Cys Pro Asn Ala
435 440 445
Ile Lys Tyr Ile Glu Gln Tyr Lys Lys Arg Leu Met Glu Arg Arg Glu
450 455 460
Cys Lys Lys Gly Thr Arg Lys Trp Tyr Glu Leu Gln Trp Gly Arg Lys
465 470 475 480
Pro Glu Ile Phe Glu Glu Lys Lys Ile Val Phe Pro Tyr Lys Ser Cys
485 490 495
Asp Asn Arg Phe Ala Leu Asp Lys Gly Ser Tyr Phe Ser Ala Asp Ile
500 505 510
Tyr Ser Leu Val Leu Lys Lys Asn Val Pro Phe Thr Tyr Glu Ile Leu
515 520 525
Leu Asn Ile Leu Asn Ser Pro Leu Tyr Glu Phe Tyr Phe Lys Thr Phe
530 535 540
Ala Lys Lys Leu Gly Glu Asn Leu Tyr Glu Tyr Tyr Pro Asn Asn Leu
545 550 555 560
Met Lys Leu Cys Ile Pro Ser Ile Asp Phe Gly Gly Glu Asn Asn Ile
565 570 575
Glu Lys Lys Leu Tyr Asp Phe Phe Gly Leu Thr Asp Lys Glu Ile Glu
580 585 590
Ile Val Glu Lys Ile Lys Asp Asn Cys
595 600
<210> 61
<211> 419
<212> DNA
<213> 自产乙醇梭菌
<400> 61
agaaattttc ctttctaaaa tattttattc catgtcaaga actctgttta tttcattaaa 60
gaactataag tacaaagtat aaggcatttg aaaaaatagg ctagtatatt gattgattat 120
ttattttaaa atgcctaagt gaaatatata catattataa caataaaata agtattagtg 180
taggattttt aaatagagta tctattttca gattaaattt ttgattattt gatttacatt 240
atataatatt gagtaaagta ttgactagca aaattttttg atactttaat ttgtgaaatt 300
tcttatcaaa agttatattt ttgaataatt tttattgaaa aatacaacta aaaaggatta 360
tagtataagt gtgtgtaatt ttgtgttaaa tttaaaggga ggaaatgaac atgaaattg 419
<210> 62
<211> 567
<212> DNA
<213> 自产乙醇梭菌
<400> 62
ctcctaattt tgaaatctaa tatatctatt aaatcatatt ttcatatgta aataaataag 60
tttttatgca attttgaaaa aggtatttgc ataaaacggc ttgaaatcaa tagttaacgc 120
aatagttatt cttttagcat acattaagtc aacaaaatta gcatgtaata attatgaata 180
attattacat atattcaata ttatattaaa aaaaatactt tgttttaagt ataaagtaaa 240
aaaataggca taaatgtaac aaaaactgtt aattttttgt gtcaataatt tttgttatat 300
tattttaatt aaatttttca catgtataat taaaagtaag atagatattc taatgtactt 360
acttaggtag aaaaacatgt atacaaaatt aaaaaactat tataacacat agtatcaata 420
ttgaaggtaa tactgttcaa tatcgataca gataaaaaaa atatataata cagaagaaaa 480
aattataaat ttgtggtata atataaagta tagtaattta agtttaaacc tcgtgaaaac 540
gctaacaaat aataggaggt gtattat 567
<210> 63
<211> 1806
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 混合II型甲基转移酶
<400> 63
atgtttccgt gcaatgccta tatcgaatat ggtgataaaa atatgaacag ctttatcgaa 60
gatgtggaac agatctacaa cttcattaaa aagaacattg atgtggaaga aaagatgcat 120
ttcattgaaa cctataaaca gaaaagcaac atgaagaaag agattagctt tagcgaagaa 180
tactataaac agaagattat gaacggcaaa aatggcgttg tgtacacccc gccggaaatg 240
gcggccttta tggttaaaaa tctgatcaac gttaacgatg ttattggcaa tccgtttatt 300
aaaatcattg acccgagctg cggtagcggc aatctgattt gcaaatgttt tctgtatctg 360
aatcgcatct ttattaagaa cattgaggtg attaacagca aaaataacct gaatctgaaa 420
ctggaagaca tcagctacca catcgttcgc aacaatctgt ttggcttcga tattgacgaa 480
accgcgatca aagtgctgaa aattgatctg tttctgatca gcaaccaatt tagcgagaaa 540
aatttccagg ttaaagactt tctggtggaa aatattgatc gcaaatatga cgtgttcatt 600
ggtaatccgc cgtatatcgg tcacaaaagc gtggacagca gctacagcta cgtgctgcgc 660
aaaatctacg gcagcatcta ccgcgacaaa ggcgatatca gctattgttt ctttcagaag 720
agcctgaaat gtctgaagga aggtggcaaa ctggtgtttg tgaccagccg ctacttctgc 780
gagagctgca gcggtaaaga actgcgtaaa ttcctgatcg aaaacacgag catttacaag 840
atcattgatt tttacggcat ccgcccgttc aaacgcgtgg gtatcgatcc gatgattatt 900
tttctggttc gtacgaagaa ctggaacaat aacattgaaa ttattcgccc gaacaagatt 960
gaaaagaacg aaaagaacaa attcctggat agcctgttcc tggacaaaag cgaaaagtgt 1020
aaaaagttta gcattagcca gaaaagcatt aataacgatg gctgggtttt cgtggacgaa 1080
gtggagaaaa acattatcga caaaatcaaa gagaaaagca agttcattct gaaagatatt 1140
tgccatagct gtcaaggcat tatcaccggt tgtgatcgcg cctttattgt ggaccgtgat 1200
atcatcaata gccgtaagat cgaactgcgt ctgattaaac cgtggattaa aagcagccat 1260
atccgtaaga atgaagttat taagggcgaa aaattcatca tctatagcaa cctgattgag 1320
aatgaaaccg agtgtccgaa tgcgattaaa tatatcgaac agtacaagaa acgtctgatg 1380
gagcgccgcg aatgcaaaaa gggcacgcgt aagtggtatg aactgcaatg gggccgtaaa 1440
ccggaaatct tcgaagaaaa gaaaattgtt ttcccgtata aaagctgtga caatcgtttt 1500
gcactggata agggtagcta ttttagcgca gacatttata gcctggttct gaagaaaaat 1560
gtgccgttca cctatgagat cctgctgaat atcctgaata gcccgctgta cgagttttac 1620
tttaagacct tcgcgaaaaa gctgggcgag aatctgtacg agtactatcc gaacaacctg 1680
atgaagctgt gcatcccgag catcgatttc ggcggtgaga acaatattga gaaaaagctg 1740
tatgatttct ttggtctgac ggataaagaa attgagattg tggagaagat caaagataac 1800
tgctaa 1806
<210> 64
<211> 4709
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 设计的甲基化质粒
<400> 64
gtttgccacc tgacgtctaa gaaaaggaat attcagcaat ttgcccgtgc cgaagaaagg 60
cccacccgtg aaggtgagcc agtgagttga ttgctacgta attagttagt tagcccttag 120
tgactcgtaa tacgactcac tatagggctc gaggcggccg cgcaacgcaa ttaatgtgag 180
ttagctcact cattaggcac cccaggcttt acactttatg cttccggctc gtatgttgtg 240
tggaattgtg agcggataac aatttcacac aggaaacaca tatgtttccg tgcaatgcct 300
atatcgaata tggtgataaa aatatgaaca gctttatcga agatgtggaa cagatctaca 360
acttcattaa aaagaacatt gatgtggaag aaaagatgca tttcattgaa acctataaac 420
agaaaagcaa catgaagaaa gagattagct ttagcgaaga atactataaa cagaagatta 480
tgaacggcaa aaatggcgtt gtgtacaccc cgccggaaat ggcggccttt atggttaaaa 540
atctgatcaa cgttaacgat gttattggca atccgtttat taaaatcatt gacccgagct 600
gcggtagcgg caatctgatt tgcaaatgtt ttctgtatct gaatcgcatc tttattaaga 660
acattgaggt gattaacagc aaaaataacc tgaatctgaa actggaagac atcagctacc 720
acatcgttcg caacaatctg tttggcttcg atattgacga aaccgcgatc aaagtgctga 780
aaattgatct gtttctgatc agcaaccaat ttagcgagaa aaatttccag gttaaagact 840
ttctggtgga aaatattgat cgcaaatatg acgtgttcat tggtaatccg ccgtatatcg 900
gtcacaaaag cgtggacagc agctacagct acgtgctgcg caaaatctac ggcagcatct 960
accgcgacaa aggcgatatc agctattgtt tctttcagaa gagcctgaaa tgtctgaagg 1020
aaggtggcaa actggtgttt gtgaccagcc gctacttctg cgagagctgc agcggtaaag 1080
aactgcgtaa attcctgatc gaaaacacga gcatttacaa gatcattgat ttttacggca 1140
tccgcccgtt caaacgcgtg ggtatcgatc cgatgattat ttttctggtt cgtacgaaga 1200
actggaacaa taacattgaa attattcgcc cgaacaagat tgaaaagaac gaaaagaaca 1260
aattcctgga tagcctgttc ctggacaaaa gcgaaaagtg taaaaagttt agcattagcc 1320
agaaaagcat taataacgat ggctgggttt tcgtggacga agtggagaaa aacattatcg 1380
acaaaatcaa agagaaaagc aagttcattc tgaaagatat ttgccatagc tgtcaaggca 1440
ttatcaccgg ttgtgatcgc gcctttattg tggaccgtga tatcatcaat agccgtaaga 1500
tcgaactgcg tctgattaaa ccgtggatta aaagcagcca tatccgtaag aatgaagtta 1560
ttaagggcga aaaattcatc atctatagca acctgattga gaatgaaacc gagtgtccga 1620
atgcgattaa atatatcgaa cagtacaaga aacgtctgat ggagcgccgc gaatgcaaaa 1680
agggcacgcg taagtggtat gaactgcaat ggggccgtaa accggaaatc ttcgaagaaa 1740
agaaaattgt tttcccgtat aaaagctgtg acaatcgttt tgcactggat aagggtagct 1800
attttagcgc agacatttat agcctggttc tgaagaaaaa tgtgccgttc acctatgaga 1860
tcctgctgaa tatcctgaat agcccgctgt acgagtttta ctttaagacc ttcgcgaaaa 1920
agctgggcga gaatctgtac gagtactatc cgaacaacct gatgaagctg tgcatcccga 1980
gcatcgattt cggcggtgag aacaatattg agaaaaagct gtatgatttc tttggtctga 2040
cggataaaga aattgagatt gtggagaaga tcaaagataa ctgctaagaa ttcgatatca 2100
cccgggaact agtctgcagc cctttagtga gggttaattg gagtcactaa gggttagtta 2160
gttagattag cagaaagtca aaagcctccg accggaggct tttgactaaa acttcccttg 2220
gggttatcat tggggctcac tcaaaggcgg taatcagata aaaaaaatcc ttagctttcg 2280
ctaaggatga tttctgctag agatggaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga 2340
ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt 2400
gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc 2460
gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct 2520
gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata 2580
ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt 2640
gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc 2700
ttaataagat gatcttcttg agatcgtttt ggtctgcgcg taatctcttg ctctgaaaac 2760
gaaaaaaccg ccttgcaggg cggtttttcg aaggttctct gagctaccaa ctctttgaac 2820
cgaggtaact ggcttggagg agcgcagtca ccaaaacttg tcctttcagt ttagccttaa 2880
ccggcgcatg acttcaagac taactcctct aaatcaatta ccagtggctg ctgccagtgg 2940
tgcttttgca tgtctttccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg 3000
gtcggactga acggggggtt cgtgcataca gtccagcttg gagcgaactg cctacccgga 3060
actgagtgtc aggcgtggaa tgagacaaac gcggccataa cagcggaatg acaccggtaa 3120
accgaaaggc aggaacagga gagcgcacga gggagccgcc aggggaaacg cctggtatct 3180
ttatagtcct gtcgggtttc gccaccactg atttgagcgt cagatttcgt gatgcttgtc 3240
aggggggcgg agcctatgga aaaacggctt tgccgcggcc ctctcacttc cctgttaagt 3300
atcttcctgg catcttccag gaaatctccg ccccgttcgt aagccatttc cgctcgccgc 3360
agtcgaacga ccgagcgtag cgagtcagtg agcgaggaag cggaatatat cctgtatcac 3420
atattctgct gacgcaccgg tgcagccttt tttctcctgc cacatgaagc acttcactga 3480
caccctcatc agtgccaaca tagtaagcca gtatacactc cgctagcgct gaggtctgcc 3540
tcgtgaagaa ggtgttgctg actcatacca ggcctgaatc gccccatcat ccagccagaa 3600
agtgagggag ccacggttga tgagagcttt gttgtaggtg gaccagttgg tgattttgaa 3660
cttttgcttt gccacggaac ggtctgcgtt gtcgggaaga tgcgtgatct gatccttcaa 3720
ctcagcaaaa gttcgattta ttcaacaaag ccacgttgtg tctcaaaatc tctgatgtta 3780
cattgcacaa gataaaaata tatcatcatg aacaataaaa ctgtctgctt acataaacag 3840
taatacaagg ggtgtttact agaggttgat cgggcacgta agaggttcca actttcacca 3900
taatgaaata agatcactac cgggcgtatt ttttgagtta tcgagatttt caggagctaa 3960
ggaagctaaa atggagaaaa aaatcacggg atataccacc gttgatatat cccaatggca 4020
tcgtaaagaa cattttgagg catttcagtc agttgctcaa tgtacctata accagaccgt 4080
tcagctggat attacggcct ttttaaagac cgtaaagaaa aataagcaca agttttatcc 4140
ggcctttatt cacattcttg cccgcctgat gaacgctcac ccggagtttc gtatggccat 4200
gaaagacggt gagctggtga tctgggatag tgttcaccct tgttacaccg ttttccatga 4260
gcaaactgaa acgttttcgt ccctctggag tgaataccac gacgatttcc ggcagtttct 4320
ccacatatat tcgcaagatg tggcgtgtta cggtgaaaac ctggcctatt tccctaaagg 4380
gtttattgag aatatgtttt ttgtctcagc caatccctgg gtgagtttca ccagttttga 4440
tttaaacgtg gccaatatgg acaacttctt cgcccccgtt ttcacgatgg gcaaatatta 4500
tacgcaaggc gacaaggtgc tgatgccgct ggcgatccag gttcatcatg ccgtttgtga 4560
tggcttccat gtcggccgca tgcttaatga attacaacag tactgtgatg agtggcaggg 4620
cggggcgtaa taatactagc tccggcaaaa aaacgggcaa ggtgtcacca ccctgccctt 4680
tttctttaaa accgaaaaga ttacttcgc 4709
<210> 65
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸colE1-F
<400> 65
cgtcagaccc cgtagaaa 18
<210> 66
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸colE1-R
<400> 66
ctctcctgtt ccgaccct 18
<210> 67
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸fD1
<400> 67
ccgaattcgt cgacaacaga gtttgatcct ggctcag 37
<210> 68
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸Rp2
<400> 68
cccgggatcc aagcttacgg ctaccttgtt acgactt 37
<210> 69
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸ispS-F
<400> 69
aggctgaatt tcttacactt cttga 25
<210> 70
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸ispS-R
<400> 70
gtaactccat caaatcctcc actac 25
<210> 71
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸idi-F
<400> 71
atacgtgctg tagtcatcca agata 25
<210> 72
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸idiR
<400> 72
tcttcaagtt cacatgtaaa accca 25
<210> 73
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸dxs-F
<400> 73
acaaagtatc taagacagga ggtca 25
<210> 74
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸dxs-R
<400> 74
gatgtcccac atcccatata agttt 25
<210> 75
<211> 6018
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒pMTL85246-IspS-Idi
<400> 75
ccggggatcc tctagagtcg acgtcacgcg tccatggaga tctcgaggcc tgcagacatg 60
caagcttggc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc 120
aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc 180
gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatggcgc tagcataaaa 240
ataagaagcc tgcatttgca ggcttcttat ttttatggcg cgccgcattc acttcttttc 300
tatataaata tgagcgaagc gaataagcgt cggaaaagca gcaaaaagtt tcctttttgc 360
tgttggagca tgggggttca gggggtgcag tatctgacgt caatgccgag cgaaagcgag 420
ccgaagggta gcatttacgt tagataaccc cctgatatgc tccgacgctt tatatagaaa 480
agaagattca actaggtaaa atcttaatat aggttgagat gataaggttt ataaggaatt 540
tgtttgttct aatttttcac tcattttgtt ctaatttctt ttaacaaatg ttcttttttt 600
tttagaacag ttatgatata gttagaatag tttaaaataa ggagtgagaa aaagatgaaa 660
gaaagatatg gaacagtcta taaaggctct cagaggctca tagacgaaga aagtggagaa 720
gtcatagagg tagacaagtt ataccgtaaa caaacgtctg gtaacttcgt aaaggcatat 780
atagtgcaat taataagtat gttagatatg attggcggaa aaaaacttaa aatcgttaac 840
tatatcctag ataatgtcca cttaagtaac aatacaatga tagctacaac aagagaaata 900
gcaaaagcta caggaacaag tctacaaaca gtaataacaa cacttaaaat cttagaagaa 960
ggaaatatta taaaaagaaa aactggagta ttaatgttaa accctgaact actaatgaga 1020
ggcgacgacc aaaaacaaaa atacctctta ctcgaatttg ggaactttga gcaagaggca 1080
aatgaaatag attgacctcc caataacacc acgtagttat tgggaggtca atctatgaaa 1140
tgcgattaag ggccggccga agcaaactta agagtgtgtt gatagtgcag tatcttaaaa 1200
ttttgtataa taggaattga agttaaatta gatgctaaaa atttgtaatt aagaaggagt 1260
gattacatga acaaaaatat aaaatattct caaaactttt taacgagtga aaaagtactc 1320
aaccaaataa taaaacaatt gaatttaaaa gaaaccgata ccgtttacga aattggaaca 1380
ggtaaagggc atttaacgac gaaactggct aaaataagta aacaggtaac gtctattgaa 1440
ttagacagtc atctattcaa cttatcgtca gaaaaattaa aactgaatac tcgtgtcact 1500
ttaattcacc aagatattct acagtttcaa ttccctaaca aacagaggta taaaattgtt 1560
gggagtattc cttaccattt aagcacacaa attattaaaa aagtggtttt tgaaagccat 1620
gcgtctgaca tctatctgat tgttgaagaa ggattctaca agcgtacctt ggatattcac 1680
cgaacactag ggttgctctt gcacactcaa gtctcgattc agcaattgct taagctgcca 1740
gcggaatgct ttcatcctaa accaaaagta aacagtgtct taataaaact tacccgccat 1800
accacagatg ttccagataa atattggaag ctatatacgt actttgtttc aaaatgggtc 1860
aatcgagaat atcgtcaact gtttactaaa aatcagtttc atcaagcaat gaaacacgcc 1920
aaagtaaaca atttaagtac cgttacttat gagcaagtat tgtctatttt taatagttat 1980
ctattattta acgggaggaa ataattctat gagtcgcttt tgtaaatttg gaaagttaca 2040
cgttactaaa gggaatgtgt ttaaactcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta 2100
acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg 2160
agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc 2220
ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag 2280
cagagcgcag ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa 2340
gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc 2400
cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc 2460
gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta 2520
caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag 2580
aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct 2640
tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga 2700
gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc 2760
ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt 2820
atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg 2880
cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcccaatacg 2940
cagggccccc tgcaggataa aaaaattgta gataaatttt ataaaatagt tttatctaca 3000
atttttttat caggaaacag ctatgaccgc ggccgcggtt aatgttaaaa atttatagta 3060
taactttaaa aaactgtctt aaaaagttgt tatataaaaa atgttgacaa ttaaacagct 3120
atttagtgca aaacaaccat aaaaatttaa aaaataccat aaattacttg aaaaatagtt 3180
gataataatg tagagttata aacaaaggtg aaaagcatta cttgtattct tttttatata 3240
ttattataaa ttaaaatgaa gctgtattag aaaaaataca cacctgtaat ataaaatttt 3300
aaattaattt ttaatttttt caaaatgtat tttacatgtt tagaattttg atgtatatta 3360
aaatagtaga atacataaga tacttaattt aattaaagat agttaagtac ttttcaatgt 3420
gcttttttag atgtttaata caaatcttta attgtaaaag aaatgctgta ctatttactg 3480
tactagtgac gggattaaac tgtattaatt ataaataaaa aataagtaca gttgtttaaa 3540
attatatttt gtattaaatc taatagtacg atgtaagtta ttttatacta ttgctagttt 3600
aataaaaaga tttaattata tacttgaaaa ggagaggaat ttttatgcgt catatggcaa 3660
cagaattatt atgtttacac agacctatat cacttactca caaacttttt aggaatccat 3720
tacctaaagt tattcaagct acacctttaa cattaaaact taggtgtagt gtttctacag 3780
aaaatgtatc atttagtgag acagaaactg aaacaagaag atcagcaaat tatgaaccaa 3840
attcttggga ttatgattat cttctttctt ctgatactga tgagtcaata gaagtacata 3900
aagataaggc taagaaatta gaagctgaag ttaggagaga aataaataat gagaaggctg 3960
aatttcttac acttcttgaa cttattgata atgtacaaag acttggatta ggatatagat 4020
ttgagtctga tataagaaga gcattagata gatttgtaag tagtggagga tttgatggag 4080
ttactaaaac ttcattacat ggaacagcat tatcatttag gttattaagg caacatggtt 4140
ttgaagtatc tcaagaagct tttagtggat ttaaagatca gaatggaaac tttcttgaga 4200
atttaaagga agacataaaa gcaattcttt ctctttatga agcatcattt ttagcattag 4260
aaggtgagaa tatattagat gaggctaaag tatttgcaat atctcatctt aaagaactta 4320
gtgaagaaaa gattggtaaa gaattagctg aacaagtttc acatgcttta gaattaccat 4380
tacatagaag aacacaaaga ttagaagcag tttggtcaat agaagcatat agaaagaaag 4440
aagacgcaaa tcaagtactt ttagaacttg caatacttga ctacaatatg attcaaagtg 4500
tatatcagag ggatttaaga gaaacatcaa gatggtggag aagagtagga ttagcaacta 4560
aattacattt tgctagagat aggcttattg aaagttttta ttgggctgtt ggagttgctt 4620
ttgaaccaca atattctgat tgcagaaata gtgtagcaaa gatgttttca tttgttacta 4680
taattgacga tatttacgat gtatatggaa ctttagatga acttgaactt tttactgatg 4740
cagttgaaag atgggatgta aatgctatta atgatcttcc tgattatatg aagttatgtt 4800
ttcttgcact ttacaatact attaacgaga tagcttacga taacttaaaa gataaaggtg 4860
agaacatact tccttattta acaaaagcat gggcagattt atgtaatgca tttcttcaag 4920
aagctaagtg gctttataat aaatcaacac ctacatttga tgattatttt ggaaatgcat 4980
ggaaaagttc tagtggacct ttacagctta tttttgctta ttttgctgta gtacagaaca 5040
ttaaaaagga agagattgag aatcttcaga aatatcatga cataatatca agacctagtc 5100
acatttttag gctttgtaat gatttagcat ctgcttcagc agaaatagca agaggtgaaa 5160
ctgctaattc tgtaagttgt tatatgagaa caaaaggtat atctgaagaa ttagctactg 5220
aaagtgttat gaatcttata gacgaaactt ggaagaaaat gaacaaagaa aaacttggtg 5280
gatctttatt tgcaaaacct tttgttgaga ctgctataaa tttagctaga cagtctcatt 5340
gcacatatca taatggtgat gcacatacta gtccagatga attaactagg aaaagagtac 5400
ttagtgtaat aactgaacca atattaccat ttgaaagata agaattcgag ctcgaaaggg 5460
gaaattaaat ggcagaatat ataatagctg tagatgaatt tgataacgaa ataggttcaa 5520
ttgaaaaaat ggaggctcac cgtaaaggaa cattacatag agctttttct atattagtat 5580
ttaattctaa aaatcaattg ttattacaga aaagaaatgt aaaaaaatat cattcgcctg 5640
gtctctggac aaatacgtgc tgtagtcatc caagatacgg tgaaagttta catgatgcga 5700
tttatagaag gcttaaggaa gaaatgggtt ttacatgtga acttgaagaa gtatttagtt 5760
ttatttataa agtaaaactt gaagataatc tttttgaaaa tgaatatgat catgtattca 5820
ttgggaaata tgatggagaa ataattgtaa acaaagatga agtagatgat tttaagtggg 5880
ttgatattaa tgaggttaag aaggatatta tagaaaggcc agaagcatac acttattggt 5940
tcaagtattt agttaataag gcagaaaaca aaatatttaa ataagtaaga atttcgtcta 6000
aataaagatt tggggtac 6018
<210> 76
<211> 6909
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒pMTL 82151-Patp-HMGR
<400> 76
cctgcaggat aaaaaaattg tagataaatt ttataaaata gttttatcta caattttttt 60
atcaggaaac agctatgacc gcggccgctg tatccatatg accatgatta cgaattcgag 120
ctcgttataa ttttcaattt tcattctttt taaaggagat tagcatacat tttatcataa 180
ttatacagac aatatagtaa tatatgatgt taaaatatca atatatggtt aaaaatctgt 240
atattttttc ccattttaat tatttgtact ataatattac actgagtgta ttgcatattt 300
aaaaaatatt tggtacaatt agttagttaa ataaattcta aattgtaaat tatcagaatc 360
cttattaagg aaatacatag atttaaggag aaatcataaa aaggtgtaat ataaactggc 420
taaaattgag caaaaattga gcaattaaga ctttttgatt gtatcttttt atatatttaa 480
ggtatataat cttatttata ttgggggaag gtaccatgca atcattagac aaaaatttca 540
gacatttatc aagacaacaa aagttacaac aattagttga taaacagtgg ctttcagaag 600
atcagtttga tattttactt aatcatcctc ttatagatga agaagttgct aatagtctta 660
tagaaaatgt aattgcacag ggtgcattac cagttggact tcttcctaat ataatagttg 720
atgataaggc ttatgttgta ccaatgatgg ttgaagaacc tagtgttgtt gcagctgcat 780
cttatggtgc taaattagta aatcagacag gtggatttaa aactgtatca tcagaaagaa 840
taatgattgg acagatagta tttgatggtg tagatgacac tgaaaaatta agtgcagata 900
ttaaagcatt agaaaaacaa atacataaga ttgcagatga agcatatcct agtataaaag 960
caagaggtgg tggttatcaa agaatagcaa tagatacatt tccagagcaa caacttttaa 1020
gtcttaaggt atttgtagat acaaaagatg ctatgggtgc taatatgctt aatactatac 1080
ttgaggcaat aactgcattc cttaaaaatg aatctcctca atcagatata ttaatgtcta 1140
tactttcaaa ccatgcaact gctagtgtag taaaagtaca aggtgagata gatgtaaaag 1200
atcttgctag aggtgaaaga acaggtgaag aagtagctaa gagaatggaa agagcttctg 1260
tattagctca ggttgatatt catagagctg caacacataa caaaggtgtt atgaatggaa 1320
tacatgctgt tgttttagct acaggaaatg atactagagg tgctgaagca tctgcacatg 1380
catacgcatc aagagacgga caatatagag gtatagcaac ttggagatat gatcagaaga 1440
gacaaagact tattggaact attgaagttc caatgacact tgctatagta ggtggtggta 1500
ctaaagtatt accaatagct aaggcatcat tagagttatt aaatgttgat tctgcacaag 1560
aacttggaca cgtagttgct gctgttggat tagcacaaaa ctttgctgct tgtagagcac 1620
ttgtttctga aggtattcaa caaggacaca tgtcattaca atataaaagt ttagcaatag 1680
tagtaggtgc aaaaggtgac gagatagcac aagtagcaga agctcttaaa caggaaccaa 1740
gagctaatac acaggttgct gaaagaattt tacaggaaat tagacagcaa taatctagag 1800
tcgacgtcac gcgtccatgg agatctcgag gcctgcagac atgcaagctt ggcactggcc 1860
gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca 1920
gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc 1980
caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg cgctagcata aaaataagaa gcctgcattt 2040
gcaggcttct tatttttatg gcgcgccgtt ctgaatcctt agctaatggt tcaacaggta 2100
actatgacga agatagcacc ctggataagt ctgtaatgga ttctaaggca tttaatgaag 2160
acgtgtatat aaaatgtgct aatgaaaaag aaaatgcgtt aaaagagcct aaaatgagtt 2220
caaatggttt tgaaattgat tggtagttta atttaatata ttttttctat tggctatctc 2280
gatacctata gaatcttctg ttcacttttg tttttgaaat ataaaaaggg gctttttagc 2340
cccttttttt taaaactccg gaggagtttc ttcattcttg atactatacg taactatttt 2400
cgatttgact tcattgtcaa ttaagctagt aaaatcaatg gttaaaaaac aaaaaacttg 2460
catttttcta cctagtaatt tataatttta agtgtcgagt ttaaaagtat aatttaccag 2520
gaaaggagca agttttttaa taaggaaaaa tttttccttt taaaattcta tttcgttata 2580
tgactaatta taatcaaaaa aatgaaaata aacaagaggt aaaaactgct ttagagaaat 2640
gtactgataa aaaaagaaaa aatcctagat ttacgtcata catagcacct ttaactacta 2700
agaaaaatat tgaaaggact tccacttgtg gagattattt gtttatgttg agtgatgcag 2760
acttagaaca ttttaaatta cataaaggta atttttgcgg taatagattt tgtccaatgt 2820
gtagttggcg acttgcttgt aaggatagtt tagaaatatc tattcttatg gagcatttaa 2880
gaaaagaaga aaataaagag tttatatttt taactcttac aactccaaat gtaaaaagtt 2940
atgatcttaa ttattctatt aaacaatata ataaatcttt taaaaaatta atggagcgta 3000
aggaagttaa ggatataact aaaggttata taagaaaatt agaagtaact taccaaaagg 3060
aaaaatacat aacaaaggat ttatggaaaa taaaaaaaga ttattatcaa aaaaaaggac 3120
ttgaaattgg tgatttagaa cctaattttg atacttataa tcctcatttt catgtagtta 3180
ttgcagttaa taaaagttat tttacagata aaaattatta tataaatcga gaaagatggt 3240
tggaattatg gaagtttgct actaaggatg attctataac tcaagttgat gttagaaaag 3300
caaaaattaa tgattataaa gaggtttacg aacttgcgaa atattcagct aaagacactg 3360
attatttaat atcgaggcca gtatttgaaa ttttttataa agcattaaaa ggcaagcagg 3420
tattagtttt tagtggattt tttaaagatg cacacaaatt gtacaagcaa ggaaaacttg 3480
atgtttataa aaagaaagat gaaattaaat atgtctatat agtttattat aattggtgca 3540
aaaaacaata tgaaaaaact agaataaggg aacttacgga agatgaaaaa gaagaattaa 3600
atcaagattt aatagatgaa atagaaatag attaaagtgt aactatactt tatatatata 3660
tgattaaaaa aataaaaaac aacagcctat taggttgttg ttttttattt tctttattaa 3720
tttttttaat ttttagtttt tagttctttt ttaaaataag tttcagcctc tttttcaata 3780
ttttttaaag aaggagtatt tgcatgaatt gccttttttc taacagactt aggaaatatt 3840
ttaacagtat cttcttgcgc cggtgatttt ggaacttcat aacttactaa tttataatta 3900
ttattttctt ttttaattgt aacagttgca aaagaagctg aacctgttcc ttcaactagt 3960
ttatcatctt caatataata ttcttgacct atatagtata aatatatttt tattatattt 4020
ttactttttt ctgaatctat tattttataa tcataaaaag ttttaccacc aaaagaaggt 4080
tgtactcctt ctggtccaac atattttttt actatattat ctaaataatt tttgggaact 4140
ggtgttgtaa tttgattaat cgaacaacca gttatactta aaggaattat aactataaaa 4200
atatatagga ttatcttttt aaatttcatt attggcctcc tttttattaa atttatgtta 4260
ccataaaaag gacataacgg gaatatgtag aatattttta atgtagacaa aattttacat 4320
aaatataaag aaaggaagtg tttgtttaaa ttttatagca aactatcaaa aattaggggg 4380
ataaaaattt atgaaaaaaa ggttttcgat gttattttta tgtttaactt taatagtttg 4440
tggtttattt acaaattcgg ccggccagtg ggcaagttga aaaattcaca aaaatgtggt 4500
ataatatctt tgttcattag agcgataaac ttgaatttga gagggaactt agatggtatt 4560
tgaaaaaatt gataaaaata gttggaacag aaaagagtat tttgaccact actttgcaag 4620
tgtaccttgt acctacagca tgaccgttaa agtggatatc acacaaataa aggaaaaggg 4680
aatgaaacta tatcctgcaa tgctttatta tattgcaatg attgtaaacc gccattcaga 4740
gtttaggacg gcaatcaatc aagatggtga attggggata tatgatgaga tgataccaag 4800
ctatacaata tttcacaatg atactgaaac attttccagc ctttggactg agtgtaagtc 4860
tgactttaaa tcatttttag cagattatga aagtgatacg caacggtatg gaaacaatca 4920
tagaatggaa ggaaagccaa atgctccgga aaacattttt aatgtatcta tgataccgtg 4980
gtcaaccttc gatggcttta atctgaattt gcagaaagga tatgattatt tgattcctat 5040
ttttactatg gggaaatatt ataaagaaga taacaaaatt atacttcctt tggcaattca 5100
agttcatcac gcagtatgtg acggatttca catttgccgt tttgtaaacg aattgcagga 5160
attgataaat agttaacttc aggtttgtct gtaactaaaa acaagtattt aagcaaaaac 5220
atcgtagaaa tacggtgttt tttgttaccc taagtttaaa ctcctttttg ataatctcat 5280
gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat 5340
caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa 5400
accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa 5460
ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtt cttctagtgt agccgtagtt 5520
aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt 5580
accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata 5640
gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt 5700
ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac 5760
gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga 5820
gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg 5880
ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa 5940
aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat 6000
gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc 6060
tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga 6120
agagcgccca atacgcaggg ccccctgctt cggggtcatt atagcgattt tttcggtata 6180
tccatccttt ttcgcacgat atacaggatt ttgccaaagg gttcgtgtag actttccttg 6240
gtgtatccaa cggcgtcagc cgggcaggat aggtgaagta ggcccacccg cgagcgggtg 6300
ttccttcttc actgtccctt attcgcacct ggcggtgctc aacgggaatc ctgctctgcg 6360
aggctggccg gctaccgccg gcgtaacaga tgagggcaag cggatggctg atgaaaccaa 6420
gccaaccagg aagggcagcc cacctatcaa ggtgtactgc cttccagacg aacgaagagc 6480
gattgaggaa aaggcggcgg cggccggcat gagcctgtcg gcctacctgc tggccgtcgg 6540
ccagggctac aaaatcacgg gcgtcgtgga ctatgagcac gtccgcgagc tggcccgcat 6600
caatggcgac ctgggccgcc tgggcggcct gctgaaactc tggctcaccg acgacccgcg 6660
cacggcgcgg ttcggtgatg ccacgatcct cgccctgctg gcgaagatcg aagagaagca 6720
ggacgagctt ggcaaggtca tgatgggcgt ggtccgcccg agggcagagc catgactttt 6780
ttagccgcta aaacggccgg ggggtgcgcg tgattgccaa gcacgtcccc atgcgctcca 6840
tcaagaagag cgacttcgcg gagctggtga agtacatcac cgacgagcaa ggcaagaccg 6900
atcgggccc 6909
<210> 77
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸EcoRI-HMGS_F
<400> 77
agccgtgaat tcgaggcttt tactaaaaac a 31
<210> 78
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸EcoRI-HMGS_R
<400> 78
aggcgtctag atgttcgtct ctacaaataa tt 32
<210> 79
<211> 8116
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒pMTL 82151-HMGS-Patp-HMGR
<400> 79
cctgcaggat aaaaaaattg tagataaatt ttataaaata gttttatcta caattttttt 60
atcaggaaac agctatgacc gcggccgctg tatccatatg accatgatta cgaattcgag 120
gcttttacta aaaacaataa aaacaggagg aaataatatg actataggaa ttgacaaaat 180
aaacttttac gtaccaaaat attatgtaga tatggcaaaa ttagcagaag caagacaagt 240
agacccaaat aaatttctta ttggaatagg acagactgaa atggcagtta gtccagtaaa 300
ccaagatata gtatcaatgg gtgctaatgc tgctaaagat ataataactg atgaagacaa 360
aaagaaaata ggaatggtaa tagtagcaac tgagtcagca gtagatgcag caaaggcagc 420
agcagtacag attcataatt tattaggtat tcaaccattt gcaagatgtt tcgaaatgaa 480
agaagcatgt tatgctgcta ctcctgcaat tcagttagct aaggattatt tagctacaag 540
accaaatgag aaagttttag ttatagctac agatacagct agatatggac ttaattcagg 600
tggtgaacct actcaaggtg ctggtgctgt tgctatggtt atagctcata atcctagtat 660
acttgcatta aatgaagacg ctgttgctta tacagaagat gtttatgatt tctggagacc 720
aacaggacat aagtatccat tagtagatgg tgctttatca aaagacgcat atattagatc 780
ttttcaacaa tcttggaatg aatatgctaa gagacaagga aagagtttag ctgattttgc 840
tagtctttgc tttcatgttc cttttactaa aatgggtaaa aaggctttag aatctataat 900
agataacgca gatgaaacaa ctcaagagag attaagatct ggatatgaag atgcagttga 960
ttacaataga tatgttggaa atatatacac aggaagtctt tatctttctc ttataagtct 1020
tcttgaaaat agagatttac aggctggtga aactattgga ttattttcat acggatcagg 1080
ttctgttggt gaattttatt cagctacact tgtagaagga tataaagatc accttgatca 1140
ggcagcacac aaagcacttt taaacaatag aactgaagta tcagtagatg catacgaaac 1200
atttttcaag agatttgatg atgtagaatt tgatgaagag caggatgcag ttcatgaaga 1260
tagacatata ttctatcttt caaacataga gaataatgta agagaatatc atagacctga 1320
ataagagctc gttataattt tcaattttca ttctttttaa aggagattag catacatttt 1380
atcataatta tacagacaat atagtaatat atgatgttaa aatatcaata tatggttaaa 1440
aatctgtata ttttttccca ttttaattat ttgtactata atattacact gagtgtattg 1500
catatttaaa aaatatttgg tacaattagt tagttaaata aattctaaat tgtaaattat 1560
cagaatcctt attaaggaaa tacatagatt taaggagaaa tcataaaaag gtgtaatata 1620
aactggctaa aattgagcaa aaattgagca attaagactt tttgattgta tctttttata 1680
tatttaaggt atataatctt atttatattg ggggaaggta ccatgcaatc attagacaaa 1740
aatttcagac atttatcaag acaacaaaag ttacaacaat tagttgataa acagtggctt 1800
tcagaagatc agtttgatat tttacttaat catcctctta tagatgaaga agttgctaat 1860
agtcttatag aaaatgtaat tgcacagggt gcattaccag ttggacttct tcctaatata 1920
atagttgatg ataaggctta tgttgtacca atgatggttg aagaacctag tgttgttgca 1980
gctgcatctt atggtgctaa attagtaaat cagacaggtg gatttaaaac tgtatcatca 2040
gaaagaataa tgattggaca gatagtattt gatggtgtag atgacactga aaaattaagt 2100
gcagatatta aagcattaga aaaacaaata cataagattg cagatgaagc atatcctagt 2160
ataaaagcaa gaggtggtgg ttatcaaaga atagcaatag atacatttcc agagcaacaa 2220
cttttaagtc ttaaggtatt tgtagataca aaagatgcta tgggtgctaa tatgcttaat 2280
actatacttg aggcaataac tgcattcctt aaaaatgaat ctcctcaatc agatatatta 2340
atgtctatac tttcaaacca tgcaactgct agtgtagtaa aagtacaagg tgagatagat 2400
gtaaaagatc ttgctagagg tgaaagaaca ggtgaagaag tagctaagag aatggaaaga 2460
gcttctgtat tagctcaggt tgatattcat agagctgcaa cacataacaa aggtgttatg 2520
aatggaatac atgctgttgt tttagctaca ggaaatgata ctagaggtgc tgaagcatct 2580
gcacatgcat acgcatcaag agacggacaa tatagaggta tagcaacttg gagatatgat 2640
cagaagagac aaagacttat tggaactatt gaagttccaa tgacacttgc tatagtaggt 2700
ggtggtacta aagtattacc aatagctaag gcatcattag agttattaaa tgttgattct 2760
gcacaagaac ttggacacgt agttgctgct gttggattag cacaaaactt tgctgcttgt 2820
agagcacttg tttctgaagg tattcaacaa ggacacatgt cattacaata taaaagttta 2880
gcaatagtag taggtgcaaa aggtgacgag atagcacaag tagcagaagc tcttaaacag 2940
gaaccaagag ctaatacaca ggttgctgaa agaattttac aggaaattag acagcaataa 3000
tctagagtcg acgtcacgcg tccatggaga tctcgaggcc tgcagacatg caagcttggc 3060
actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg 3120
ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc gcaccgatcg 3180
cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatggcgc tagcataaaa ataagaagcc 3240
tgcatttgca ggcttcttat ttttatggcg cgccgttctg aatccttagc taatggttca 3300
acaggtaact atgacgaaga tagcaccctg gataagtctg taatggattc taaggcattt 3360
aatgaagacg tgtatataaa atgtgctaat gaaaaagaaa atgcgttaaa agagcctaaa 3420
atgagttcaa atggttttga aattgattgg tagtttaatt taatatattt tttctattgg 3480
ctatctcgat acctatagaa tcttctgttc acttttgttt ttgaaatata aaaaggggct 3540
ttttagcccc ttttttttaa aactccggag gagtttcttc attcttgata ctatacgtaa 3600
ctattttcga tttgacttca ttgtcaatta agctagtaaa atcaatggtt aaaaaacaaa 3660
aaacttgcat ttttctacct agtaatttat aattttaagt gtcgagttta aaagtataat 3720
ttaccaggaa aggagcaagt tttttaataa ggaaaaattt ttccttttaa aattctattt 3780
cgttatatga ctaattataa tcaaaaaaat gaaaataaac aagaggtaaa aactgcttta 3840
gagaaatgta ctgataaaaa aagaaaaaat cctagattta cgtcatacat agcaccttta 3900
actactaaga aaaatattga aaggacttcc acttgtggag attatttgtt tatgttgagt 3960
gatgcagact tagaacattt taaattacat aaaggtaatt tttgcggtaa tagattttgt 4020
ccaatgtgta gttggcgact tgcttgtaag gatagtttag aaatatctat tcttatggag 4080
catttaagaa aagaagaaaa taaagagttt atatttttaa ctcttacaac tccaaatgta 4140
aaaagttatg atcttaatta ttctattaaa caatataata aatcttttaa aaaattaatg 4200
gagcgtaagg aagttaagga tataactaaa ggttatataa gaaaattaga agtaacttac 4260
caaaaggaaa aatacataac aaaggattta tggaaaataa aaaaagatta ttatcaaaaa 4320
aaaggacttg aaattggtga tttagaacct aattttgata cttataatcc tcattttcat 4380
gtagttattg cagttaataa aagttatttt acagataaaa attattatat aaatcgagaa 4440
agatggttgg aattatggaa gtttgctact aaggatgatt ctataactca agttgatgtt 4500
agaaaagcaa aaattaatga ttataaagag gtttacgaac ttgcgaaata ttcagctaaa 4560
gacactgatt atttaatatc gaggccagta tttgaaattt tttataaagc attaaaaggc 4620
aagcaggtat tagtttttag tggatttttt aaagatgcac acaaattgta caagcaagga 4680
aaacttgatg tttataaaaa gaaagatgaa attaaatatg tctatatagt ttattataat 4740
tggtgcaaaa aacaatatga aaaaactaga ataagggaac ttacggaaga tgaaaaagaa 4800
gaattaaatc aagatttaat agatgaaata gaaatagatt aaagtgtaac tatactttat 4860
atatatatga ttaaaaaaat aaaaaacaac agcctattag gttgttgttt tttattttct 4920
ttattaattt ttttaatttt tagtttttag ttctttttta aaataagttt cagcctcttt 4980
ttcaatattt tttaaagaag gagtatttgc atgaattgcc ttttttctaa cagacttagg 5040
aaatatttta acagtatctt cttgcgccgg tgattttgga acttcataac ttactaattt 5100
ataattatta ttttcttttt taattgtaac agttgcaaaa gaagctgaac ctgttccttc 5160
aactagttta tcatcttcaa tataatattc ttgacctata tagtataaat atatttttat 5220
tatattttta cttttttctg aatctattat tttataatca taaaaagttt taccaccaaa 5280
agaaggttgt actccttctg gtccaacata tttttttact atattatcta aataattttt 5340
gggaactggt gttgtaattt gattaatcga acaaccagtt atacttaaag gaattataac 5400
tataaaaata tataggatta tctttttaaa tttcattatt ggcctccttt ttattaaatt 5460
tatgttacca taaaaaggac ataacgggaa tatgtagaat atttttaatg tagacaaaat 5520
tttacataaa tataaagaaa ggaagtgttt gtttaaattt tatagcaaac tatcaaaaat 5580
tagggggata aaaatttatg aaaaaaaggt tttcgatgtt atttttatgt ttaactttaa 5640
tagtttgtgg tttatttaca aattcggccg gccagtgggc aagttgaaaa attcacaaaa 5700
atgtggtata atatctttgt tcattagagc gataaacttg aatttgagag ggaacttaga 5760
tggtatttga aaaaattgat aaaaatagtt ggaacagaaa agagtatttt gaccactact 5820
ttgcaagtgt accttgtacc tacagcatga ccgttaaagt ggatatcaca caaataaagg 5880
aaaagggaat gaaactatat cctgcaatgc tttattatat tgcaatgatt gtaaaccgcc 5940
attcagagtt taggacggca atcaatcaag atggtgaatt ggggatatat gatgagatga 6000
taccaagcta tacaatattt cacaatgata ctgaaacatt ttccagcctt tggactgagt 6060
gtaagtctga ctttaaatca tttttagcag attatgaaag tgatacgcaa cggtatggaa 6120
acaatcatag aatggaagga aagccaaatg ctccggaaaa catttttaat gtatctatga 6180
taccgtggtc aaccttcgat ggctttaatc tgaatttgca gaaaggatat gattatttga 6240
ttcctatttt tactatgggg aaatattata aagaagataa caaaattata cttcctttgg 6300
caattcaagt tcatcacgca gtatgtgacg gatttcacat ttgccgtttt gtaaacgaat 6360
tgcaggaatt gataaatagt taacttcagg tttgtctgta actaaaaaca agtatttaag 6420
caaaaacatc gtagaaatac ggtgtttttt gttaccctaa gtttaaactc ctttttgata 6480
atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag 6540
aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa 6600
caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt 6660
ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgttctt ctagtgtagc 6720
cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa 6780
tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa 6840
gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc 6900
ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa 6960
gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa 7020
caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg 7080
ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc 7140
tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg 7200
ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg 7260
agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg 7320
aagcggaaga gcgcccaata cgcagggccc cctgcttcgg ggtcattata gcgatttttt 7380
cggtatatcc atcctttttc gcacgatata caggattttg ccaaagggtt cgtgtagact 7440
ttccttggtg tatccaacgg cgtcagccgg gcaggatagg tgaagtaggc ccacccgcga 7500
gcgggtgttc cttcttcact gtcccttatt cgcacctggc ggtgctcaac gggaatcctg 7560
ctctgcgagg ctggccggct accgccggcg taacagatga gggcaagcgg atggctgatg 7620
aaaccaagcc aaccaggaag ggcagcccac ctatcaaggt gtactgcctt ccagacgaac 7680
gaagagcgat tgaggaaaag gcggcggcgg ccggcatgag cctgtcggcc tacctgctgg 7740
ccgtcggcca gggctacaaa atcacgggcg tcgtggacta tgagcacgtc cgcgagctgg 7800
cccgcatcaa tggcgacctg ggccgcctgg gcggcctgct gaaactctgg ctcaccgacg 7860
acccgcgcac ggcgcggttc ggtgatgcca cgatcctcgc cctgctggcg aagatcgaag 7920
agaagcagga cgagcttggc aaggtcatga tgggcgtggt ccgcccgagg gcagagccat 7980
gactttttta gccgctaaaa cggccggggg gtgcgcgtga ttgccaagca cgtccccatg 8040
cgctccatca agaagagcga cttcgcggag ctggtgaagt acatcaccga cgagcaaggc 8100
aagaccgatc gggccc 8116
<210> 80
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸NotI-XbaI-Prnf-MK_F
<400> 80
atgcgcggcc gctaggtcta gaatatcgat acagataaaa aaatatataa tacag 55
<210> 81
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸SalI-Prnf-MK_R
<400> 81
tggttctgta acagcgtatt cacctgc 27
<210> 82
<211> 4633
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒pMTL8314-Prnf-MK
<400> 82
aaactccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga 60
gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta 120
atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa 180
gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact 240
gttcttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca 300
tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt 360
accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg 420
ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag 480
cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta 540
agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat 600
ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg 660
tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc 720
ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac 780
cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc 840
gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc ccaatacgca gggccccctg caggataaaa 900
aaattgtaga taaattttat aaaatagttt tatctacaat ttttttatca ggaaacagct 960
atgaccgcgg ccgctaggtc tagaatatcg atacagataa aaaaatatat aatacagaag 1020
aaaaaattat aaatttgtgg tataatataa agtatagtaa tttaagttta aacctcgtga 1080
aaacgctaac aaataatagg aggtcaattg atgatagctg ttccatttaa cgctggaaaa 1140
ataaaagttt taattgaggc attagaatct ggaaattatt catcaataaa atcagatgta 1200
tatgacggaa tgttatatga tgcaccagat caccttaaat cattagtaaa cagatttgta 1260
gaacttaata atataactga gccattagca gtaactatac agacaaatct tcctccttca 1320
agaggtcttg gatctagtgc agctgttgct gttgcttttg taagagcaag ttatgatttc 1380
ttaggaaaaa gtttaactaa agaagagctt atagaaaagg ctaattgggc tgaacaaata 1440
gctcatggaa agccatctgg aatagataca caaacaatag tatctggaaa gcctgtttgg 1500
tttcaaaagg gacatgcaga aacacttaaa actctttcac ttgatggata catggtagta 1560
attgatacag gtgttaaagg aagtacaaga caggctgtag aagatgttca taaactttgc 1620
gaagatcctc aatatatgag tcacgtaaaa cacataggaa aacttgtact tagagcatct 1680
gatgttattg aacatcataa ctttgaagca cttgctgata tattcaatga atgtcatgct 1740
gatttaaagg ctcttacagt aagtcatgac aaaatagaac agttaatgaa gataggaaaa 1800
gaaaatggtg ctatagctgg taaattaact ggtgctggta gaggtggttc aatgttatta 1860
cttgcaaaag acttaccaac tgcaaagaat atagttaaag cagtagagaa agctggtgca 1920
gcacatactt ggattgaaaa tttaggtggt taagtcgacg tcacgcgtcc atggagatct 1980
cgaggcctgc agacatgcaa gcttggcact ggccgtcgtt ttacaacgtc gtgactggga 2040
aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat ccccctttcg ccagctggcg 2100
taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgcagcc tgaatggcga 2160
atggcgctag cataaaaata agaagcctgc atttgcaggc ttcttatttt tatggcgcgc 2220
cgccattatt tttttgaaca attgacaatt catttcttat tttttattaa gtgatagtca 2280
aaaggcataa cagtgctgaa tagaaagaaa tttacagaaa agaaaattat agaatttagt 2340
atgattaatt atactcattt atgaatgttt aattgaatac aaaaaaaaat acttgttatg 2400
tattcaatta cgggttaaaa tatagacaag ttgaaaaatt taataaaaaa ataagtcctc 2460
agctcttata tattaagcta ccaacttagt atataagcca aaacttaaat gtgctaccaa 2520
cacatcaagc cgttagagaa ctctatctat agcaatattt caaatgtacc gacatacaag 2580
agaaacatta actatatata ttcaatttat gagattatct taacagatat aaatgtaaat 2640
tgcaataagt aagatttaga agtttatagc ctttgtgtat tggaagcagt acgcaaaggc 2700
ttttttattt gataaaaatt agaagtatat ttattttttc ataattaatt tatgaaaatg 2760
aaagggggtg agcaaagtga cagaggaaag cagtatctta tcaaataaca aggtattagc 2820
aatatcatta ttgactttag cagtaaacat tatgactttt atagtgcttg tagctaagta 2880
gtacgaaagg gggagcttta aaaagctcct tggaatacat agaattcata aattaattta 2940
tgaaaagaag ggcgtatatg aaaacttgta aaaattgcaa agagtttatt aaagatactg 3000
aaatatgcaa aatacattcg ttgatgattc atgataaaac agtagcaacc tattgcagta 3060
aatacaatga gtcaagatgt ttacataaag ggaaagtcca atgtattaat tgttcaaaga 3120
tgaaccgata tggatggtgt gccataaaaa tgagatgttt tacagaggaa gaacagaaaa 3180
aagaacgtac atgcattaaa tattatgcaa ggagctttaa aaaagctcat gtaaagaaga 3240
gtaaaaagaa aaaataattt atttattaat ttaatattga gagtgccgac acagtatgca 3300
ctaaaaaata tatctgtggt gtagtgagcc gatacaaaag gatagtcact cgcattttca 3360
taatacatct tatgttatga ttatgtgtcg gtgggacttc acgacgaaaa cccacaataa 3420
aaaaagagtt cggggtaggg ttaagcatag ttgaggcaac taaacaatca agctaggata 3480
tgcagtagca gaccgtaagg tcgttgttta ggtgtgttgt aatacatacg ctattaagat 3540
gtaaaaatac ggataccaat gaagggaaaa gtataatttt tggatgtagt ttgtttgttc 3600
atctatgggc aaactacgtc caaagccgtt tccaaatctg ctaaaaagta tatcctttct 3660
aaaatcaaag tcaagtatga aatcataaat aaagtttaat tttgaagtta ttatgatatt 3720
atgtttttct attaaaataa attaagtata tagaatagtt taataatagt atatacttaa 3780
tgtgataagt gtctgacagt gtcacagaaa ggatgattgt tatggattat aagcggccgg 3840
ccagtgggca agttgaaaaa ttcacaaaaa tgtggtataa tatctttgtt cattagagcg 3900
ataaacttga atttgagagg gaacttagat ggtatttgaa aaaattgata aaaatagttg 3960
gaacagaaaa gagtattttg accactactt tgcaagtgta ccttgtacct acagcatgac 4020
cgttaaagtg gatatcacac aaataaagga aaagggaatg aaactatatc ctgcaatgct 4080
ttattatatt gcaatgattg taaaccgcca ttcagagttt aggacggcaa tcaatcaaga 4140
tggtgaattg gggatatatg atgagatgat accaagctat acaatatttc acaatgatac 4200
tgaaacattt tccagccttt ggactgagtg taagtctgac tttaaatcat ttttagcaga 4260
ttatgaaagt gatacgcaac ggtatggaaa caatcataga atggaaggaa agccaaatgc 4320
tccggaaaac atttttaatg tatctatgat accgtggtca accttcgatg gctttaatct 4380
gaatttgcag aaaggatatg attatttgat tcctattttt actatgggga aatattataa 4440
agaagataac aaaattatac ttcctttggc aattcaagtt catcacgcag tatgtgacgg 4500
atttcacatt tgccgttttg taaacgaatt gcaggaattg ataaatagtt aacttcaggt 4560
ttgtctgtaa ctaaaaacaa gtatttaagc aaaaacatcg tagaaatacg gtgttttttg 4620
ttaccctaag ttt 4633
<210> 83
<211> 6753
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒pMTL 8314-Prnf-MK-PMK-PMD
<400> 83
aaactccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga 60
gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta 120
atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa 180
gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact 240
gttcttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca 300
tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt 360
accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg 420
ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag 480
cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta 540
agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat 600
ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg 660
tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc 720
ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac 780
cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc 840
gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc ccaatacgca gggccccctg caggataaaa 900
aaattgtaga taaattttat aaaatagttt tatctacaat ttttttatca ggaaacagct 960
atgaccgcgg ccgctaggtc tagaatatcg atacagataa aaaaatatat aatacagaag 1020
aaaaaattat aaatttgtgg tataatataa agtatagtaa tttaagttta aacctcgtga 1080
aaacgctaac aaataatagg aggtcaattg atgatagctg ttccatttaa cgctggaaaa 1140
ataaaagttt taattgaggc attagaatct ggaaattatt catcaataaa atcagatgta 1200
tatgacggaa tgttatatga tgcaccagat caccttaaat cattagtaaa cagatttgta 1260
gaacttaata atataactga gccattagca gtaactatac agacaaatct tcctccttca 1320
agaggtcttg gatctagtgc agctgttgct gttgcttttg taagagcaag ttatgatttc 1380
ttaggaaaaa gtttaactaa agaagagctt atagaaaagg ctaattgggc tgaacaaata 1440
gctcatggaa agccatctgg aatagataca caaacaatag tatctggaaa gcctgtttgg 1500
tttcaaaagg gacatgcaga aacacttaaa actctttcac ttgatggata catggtagta 1560
attgatacag gtgttaaagg aagtacaaga caggctgtag aagatgttca taaactttgc 1620
gaagatcctc aatatatgag tcacgtaaaa cacataggaa aacttgtact tagagcatct 1680
gatgttattg aacatcataa ctttgaagca cttgctgata tattcaatga atgtcatgct 1740
gatttaaagg ctcttacagt aagtcatgac aaaatagaac agttaatgaa gataggaaaa 1800
gaaaatggtg ctatagctgg taaattaact ggtgctggta gaggtggttc aatgttatta 1860
cttgcaaaag acttaccaac tgcaaagaat atagttaaag cagtagagaa agctggtgca 1920
gcacatactt ggattgaaaa tttaggtggt taagtcgaca aagacactaa aaaattataa 1980
aagtaaagga ggacattaaa tgatacaagt aaaggcacca ggaaaattat atatagcagg 2040
tgaatacgct gttacagaac caggatataa atctgttctt atagctcttg atagatttgt 2100
tacagctact attgaggaag ctgatcaata caaaggaaca atacattcaa aggcattaca 2160
tcacaatcca gtaactttta gtagagatga agattctatt gttatatcag acccacacgc 2220
agcaaaacaa cttaattatg tagtaactgc tatagaaata tttgagcaat atgcaaaatc 2280
atgtgacata gcaatgaagc attttcattt aactatagat tctaacttag atgatagtaa 2340
tggacataag tatggacttg gatcttctgc tgctgtttta gtttcagtaa ttaaagtact 2400
taacgaattt tatgatatga aactttcaaa cctttatata tataagttag cagtaattgc 2460
taatatgaaa ttacagagtt tatcttcatg cggtgatata gcagtaagtg tttattcagg 2520
ttggttagct tattctacat ttgaccatga atgggtaaaa caccagatag aagatacaac 2580
agttgaagaa gtacttatta aaaattggcc tggattacac atagagccac ttcaagctcc 2640
tgaaaatatg gaagttctta taggttggac aggtagtcca gctagtagtc ctcattttgt 2700
ttctgaagtt aaaagactta agtcagatcc ttcattttac ggtgatttct tagaagattc 2760
acatagatgt gtagaaaaat taattcatgc attcaaaact aataatatta agggtgttca 2820
gaaaatggta agacagaata gaactattat acaaagaatg gataaggaag caacagttga 2880
tatagagact gagaagttaa aatatttatg tgatattgct gaaaaatatc atggtgcaag 2940
taaaacttca ggtgctggtg gtggtgattg cggaataact ataataaata aggatgtaga 3000
caaagagaaa atatatgatg aatggactaa acatggaata aagcctctta agtttaatat 3060
ttatcatgga caataaccat ggtcaataat cttacaataa ataaaagaaa ggaggcaaaa 3120
atatgataaa atctggaaaa gcaagagcac acactaatat agcacttata aaatattggg 3180
gtaagaaaga tgaggcatta ataataccaa tgaataactc aatatcagta actttagaaa 3240
agttttatac tgaaacaaaa gttacattta acgatcagct tactcaagat caattttggc 3300
ttaatggtga aaaagtttct ggaaaagaat tagaaaagat ttcaaagtat atggatattg 3360
ttagaaatag agctggaata gattggtatg ctgagataga atctgataat tttgttccta 3420
cagctgctgg tcttgctagt tctgctagtg cttatgcagc attagctgct gcatgtaacc 3480
aagcacttga tttacagtta agtgataaag acttaagtag attagctaga attggatcag 3540
gatcagcatc aagatcaata tacggtggtt ttgcagaatg ggaaaaagga tataatgacg 3600
aaacttctta tgctgttcca ttagaaagta atcactttga agatgatctt gctatgattt 3660
ttgtagtaat aaaccaacat tctaaaaagg ttccttcaag atatggaatg tctcttacaa 3720
gaaatacaag tagattctat caatattggt tagaccatat tgatgaagat cttgcagaag 3780
caaaggcagc aatacaagat aaggatttta agagattagg tgaagttatt gaagagaatg 3840
gacttagaat gcatgctaca aatcttggat caactccacc ttttacttac ttagtacaag 3900
agtcatacga tgtaatggca ttagtacatg agtgtagaga agcaggatat ccatgctatt 3960
tcactatgga tgctggacct aatgtaaaaa tacttgtaga gaagaaaaac aaacaacaga 4020
taatagataa acttttaact cagttcgata ataatcagat aatagatagt gatattatag 4080
ctacaggtat tgaaattata gaataaacta gttccgctaa gcttggcact ggccgtcgtt 4140
ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat 4200
ccccctttcg ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag 4260
ttgcgcagcc tgaatggcga atggcgctag cataaaaata agaagcctgc atttgcaggc 4320
ttcttatttt tatggcgcgc cgccattatt tttttgaaca attgacaatt catttcttat 4380
tttttattaa gtgatagtca aaaggcataa cagtgctgaa tagaaagaaa tttacagaaa 4440
agaaaattat agaatttagt atgattaatt atactcattt atgaatgttt aattgaatac 4500
aaaaaaaaat acttgttatg tattcaatta cgggttaaaa tatagacaag ttgaaaaatt 4560
taataaaaaa ataagtcctc agctcttata tattaagcta ccaacttagt atataagcca 4620
aaacttaaat gtgctaccaa cacatcaagc cgttagagaa ctctatctat agcaatattt 4680
caaatgtacc gacatacaag agaaacatta actatatata ttcaatttat gagattatct 4740
taacagatat aaatgtaaat tgcaataagt aagatttaga agtttatagc ctttgtgtat 4800
tggaagcagt acgcaaaggc ttttttattt gataaaaatt agaagtatat ttattttttc 4860
ataattaatt tatgaaaatg aaagggggtg agcaaagtga cagaggaaag cagtatctta 4920
tcaaataaca aggtattagc aatatcatta ttgactttag cagtaaacat tatgactttt 4980
atagtgcttg tagctaagta gtacgaaagg gggagcttta aaaagctcct tggaatacat 5040
agaattcata aattaattta tgaaaagaag ggcgtatatg aaaacttgta aaaattgcaa 5100
agagtttatt aaagatactg aaatatgcaa aatacattcg ttgatgattc atgataaaac 5160
agtagcaacc tattgcagta aatacaatga gtcaagatgt ttacataaag ggaaagtcca 5220
atgtattaat tgttcaaaga tgaaccgata tggatggtgt gccataaaaa tgagatgttt 5280
tacagaggaa gaacagaaaa aagaacgtac atgcattaaa tattatgcaa ggagctttaa 5340
aaaagctcat gtaaagaaga gtaaaaagaa aaaataattt atttattaat ttaatattga 5400
gagtgccgac acagtatgca ctaaaaaata tatctgtggt gtagtgagcc gatacaaaag 5460
gatagtcact cgcattttca taatacatct tatgttatga ttatgtgtcg gtgggacttc 5520
acgacgaaaa cccacaataa aaaaagagtt cggggtaggg ttaagcatag ttgaggcaac 5580
taaacaatca agctaggata tgcagtagca gaccgtaagg tcgttgttta ggtgtgttgt 5640
aatacatacg ctattaagat gtaaaaatac ggataccaat gaagggaaaa gtataatttt 5700
tggatgtagt ttgtttgttc atctatgggc aaactacgtc caaagccgtt tccaaatctg 5760
ctaaaaagta tatcctttct aaaatcaaag tcaagtatga aatcataaat aaagtttaat 5820
tttgaagtta ttatgatatt atgtttttct attaaaataa attaagtata tagaatagtt 5880
taataatagt atatacttaa tgtgataagt gtctgacagt gtcacagaaa ggatgattgt 5940
tatggattat aagcggccgg ccagtgggca agttgaaaaa ttcacaaaaa tgtggtataa 6000
tatctttgtt cattagagcg ataaacttga atttgagagg gaacttagat ggtatttgaa 6060
aaaattgata aaaatagttg gaacagaaaa gagtattttg accactactt tgcaagtgta 6120
ccttgtacct acagcatgac cgttaaagtg gatatcacac aaataaagga aaagggaatg 6180
aaactatatc ctgcaatgct ttattatatt gcaatgattg taaaccgcca ttcagagttt 6240
aggacggcaa tcaatcaaga tggtgaattg gggatatatg atgagatgat accaagctat 6300
acaatatttc acaatgatac tgaaacattt tccagccttt ggactgagtg taagtctgac 6360
tttaaatcat ttttagcaga ttatgaaagt gatacgcaac ggtatggaaa caatcataga 6420
atggaaggaa agccaaatgc tccggaaaac atttttaatg tatctatgat accgtggtca 6480
accttcgatg gctttaatct gaatttgcag aaaggatatg attatttgat tcctattttt 6540
actatgggga aatattataa agaagataac aaaattatac ttcctttggc aattcaagtt 6600
catcacgcag tatgtgacgg atttcacatt tgccgttttg taaacgaatt gcaggaattg 6660
ataaatagtt aacttcaggt ttgtctgtaa ctaaaaacaa gtatttaagc aaaaacatcg 6720
tagaaatacg gtgttttttg ttaccctaag ttt 6753
<210> 84
<211> 9198
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒pMTL8314-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispS
<400> 84
aaactccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga 60
gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta 120
atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa 180
gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact 240
gttcttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca 300
tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt 360
accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg 420
ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag 480
cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta 540
agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat 600
ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg 660
tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc 720
ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac 780
cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc 840
gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc ccaatacgca gggccccctg caggataaaa 900
aaattgtaga taaattttat aaaatagttt tatctacaat ttttttatca ggaaacagct 960
atgaccgcgg ccgctaggtc tagaatatcg atacagataa aaaaatatat aatacagaag 1020
aaaaaattat aaatttgtgg tataatataa agtatagtaa tttaagttta aacctcgtga 1080
aaacgctaac aaataatagg aggtcaattg atgatagctg ttccatttaa cgctggaaaa 1140
ataaaagttt taattgaggc attagaatct ggaaattatt catcaataaa atcagatgta 1200
tatgacggaa tgttatatga tgcaccagat caccttaaat cattagtaaa cagatttgta 1260
gaacttaata atataactga gccattagca gtaactatac agacaaatct tcctccttca 1320
agaggtcttg gatctagtgc agctgttgct gttgcttttg taagagcaag ttatgatttc 1380
ttaggaaaaa gtttaactaa agaagagctt atagaaaagg ctaattgggc tgaacaaata 1440
gctcatggaa agccatctgg aatagataca caaacaatag tatctggaaa gcctgtttgg 1500
tttcaaaagg gacatgcaga aacacttaaa actctttcac ttgatggata catggtagta 1560
attgatacag gtgttaaagg aagtacaaga caggctgtag aagatgttca taaactttgc 1620
gaagatcctc aatatatgag tcacgtaaaa cacataggaa aacttgtact tagagcatct 1680
gatgttattg aacatcataa ctttgaagca cttgctgata tattcaatga atgtcatgct 1740
gatttaaagg ctcttacagt aagtcatgac aaaatagaac agttaatgaa gataggaaaa 1800
gaaaatggtg ctatagctgg taaattaact ggtgctggta gaggtggttc aatgttatta 1860
cttgcaaaag acttaccaac tgcaaagaat atagttaaag cagtagagaa agctggtgca 1920
gcacatactt ggattgaaaa tttaggtggt taagtcgaca aagacactaa aaaattataa 1980
aagtaaagga ggacattaaa tgatacaagt aaaggcacca ggaaaattat atatagcagg 2040
tgaatacgct gttacagaac caggatataa atctgttctt atagctcttg atagatttgt 2100
tacagctact attgaggaag ctgatcaata caaaggaaca atacattcaa aggcattaca 2160
tcacaatcca gtaactttta gtagagatga agattctatt gttatatcag acccacacgc 2220
agcaaaacaa cttaattatg tagtaactgc tatagaaata tttgagcaat atgcaaaatc 2280
atgtgacata gcaatgaagc attttcattt aactatagat tctaacttag atgatagtaa 2340
tggacataag tatggacttg gatcttctgc tgctgtttta gtttcagtaa ttaaagtact 2400
taacgaattt tatgatatga aactttcaaa cctttatata tataagttag cagtaattgc 2460
taatatgaaa ttacagagtt tatcttcatg cggtgatata gcagtaagtg tttattcagg 2520
ttggttagct tattctacat ttgaccatga atgggtaaaa caccagatag aagatacaac 2580
agttgaagaa gtacttatta aaaattggcc tggattacac atagagccac ttcaagctcc 2640
tgaaaatatg gaagttctta taggttggac aggtagtcca gctagtagtc ctcattttgt 2700
ttctgaagtt aaaagactta agtcagatcc ttcattttac ggtgatttct tagaagattc 2760
acatagatgt gtagaaaaat taattcatgc attcaaaact aataatatta agggtgttca 2820
gaaaatggta agacagaata gaactattat acaaagaatg gataaggaag caacagttga 2880
tatagagact gagaagttaa aatatttatg tgatattgct gaaaaatatc atggtgcaag 2940
taaaacttca ggtgctggtg gtggtgattg cggaataact ataataaata aggatgtaga 3000
caaagagaaa atatatgatg aatggactaa acatggaata aagcctctta agtttaatat 3060
ttatcatgga caataaccat ggtcaataat cttacaataa ataaaagaaa ggaggcaaaa 3120
atatgataaa atctggaaaa gcaagagcac acactaatat agcacttata aaatattggg 3180
gtaagaaaga tgaggcatta ataataccaa tgaataactc aatatcagta actttagaaa 3240
agttttatac tgaaacaaaa gttacattta acgatcagct tactcaagat caattttggc 3300
ttaatggtga aaaagtttct ggaaaagaat tagaaaagat ttcaaagtat atggatattg 3360
ttagaaatag agctggaata gattggtatg ctgagataga atctgataat tttgttccta 3420
cagctgctgg tcttgctagt tctgctagtg cttatgcagc attagctgct gcatgtaacc 3480
aagcacttga tttacagtta agtgataaag acttaagtag attagctaga attggatcag 3540
gatcagcatc aagatcaata tacggtggtt ttgcagaatg ggaaaaagga tataatgacg 3600
aaacttctta tgctgttcca ttagaaagta atcactttga agatgatctt gctatgattt 3660
ttgtagtaat aaaccaacat tctaaaaagg ttccttcaag atatggaatg tctcttacaa 3720
gaaatacaag tagattctat caatattggt tagaccatat tgatgaagat cttgcagaag 3780
caaaggcagc aatacaagat aaggatttta agagattagg tgaagttatt gaagagaatg 3840
gacttagaat gcatgctaca aatcttggat caactccacc ttttacttac ttagtacaag 3900
agtcatacga tgtaatggca ttagtacatg agtgtagaga agcaggatat ccatgctatt 3960
tcactatgga tgctggacct aatgtaaaaa tacttgtaga gaagaaaaac aaacaacaga 4020
taatagataa acttttaact cagttcgata ataatcagat aatagatagt gatattatag 4080
ctacaggtat tgaaattata gaataaacta gttgtatatt aaaatagtag aatacataag 4140
atacttaatt taattaaaga tagttaagta cttttcaatg tgctttttta gatgtttaat 4200
acaaatcttt aattgtaaaa gaaatgctgt actatttact gttctagtga cgggattaaa 4260
ctgtattaat tataaataaa aaataagtac agttgtttaa aattatattt tgtattaaat 4320
ctaatagtac gatgtaagtt attttatact attgctagtt taataaaaag atttaattat 4380
atacttgaaa aggagaggaa ctcgagatgg cagagtatat aatagcagta gatgagttcg 4440
ataacgaaat aggatcaata gaaaagatgg aagctcatag aaaaggaaca cttcatagag 4500
cattcagtat tttagttttt aactcaaaga atcaactttt attacagaaa agaaatgtaa 4560
agaaatatca ctctccagga ttatggacaa acacttgttg tagtcaccca agatatggtg 4620
aatctcttca tgatgctata tacagaagat taaaagaaga gatgggattt acttgcgaac 4680
ttgaagaagt attctcattc atatataagg taaaacttga agataattta tttgagaatg 4740
aatatgacca tgtatttatt ggtaaatatg atggtgagat aattgttaat aaagatgaag 4800
ttgatgattt taaatgggta gacattaatg aagttaaaaa ggacataata gaaagacctg 4860
aggcatatac ttactggttt aagtatcttg taaataaagc tgaaaataag atatttaaat 4920
aaaccggtgg gaggaaatga acatggcaac agaattatta tgtttacaca gacctatatc 4980
acttactcac aaacttttta ggaatccatt acctaaagtt attcaagcta cacctttaac 5040
attaaaactt aggtgtagtg tttctacaga aaatgtatca tttagtgaga cagaaactga 5100
aacaagaaga tcagcaaatt atgaaccaaa ttcttgggat tatgattatc ttctttcttc 5160
tgatactgat gagtcaatag aagtacataa agataaggct aagaaattag aagctgaagt 5220
taggagagaa ataaataatg agaaggctga atttcttaca cttcttgaac ttattgataa 5280
tgtacaaaga cttggattag gatatagatt tgagtctgat ataagaagag cattagatag 5340
atttgtaagt agtggaggat ttgatggagt tactaaaact tcattacatg gaacagcatt 5400
atcatttagg ttattaaggc aacatggttt tgaagtatct caagaagctt ttagtggatt 5460
taaagatcag aatggaaact ttcttgagaa tttaaaggaa gacataaaag caattctttc 5520
tctttatgaa gcatcatttt tagcattaga aggtgagaat atattagatg aggctaaagt 5580
atttgcaata tctcatctta aagaacttag tgaagaaaag attggtaaag aattagctga 5640
acaagtttca catgctttag aattaccatt acatagaaga acacaaagat tagaagcagt 5700
ttggtcaata gaagcatata gaaagaaaga agacgcaaat caagtacttt tagaacttgc 5760
aatacttgac tacaatatga ttcaaagtgt atatcagagg gatttaagag aaacatcaag 5820
atggtggaga agagtaggat tagcaactaa attacatttt gctagagata ggcttattga 5880
aagtttttat tgggctgttg gagttgcttt tgaaccacaa tattctgatt gcagaaatag 5940
tgtagcaaag atgttttcat ttgttactat aattgacgat atttacgatg tatatggaac 6000
tttagatgaa cttgaacttt ttactgatgc agttgaaaga tgggatgtaa atgctattaa 6060
tgatcttcct gattatatga agttatgttt tcttgcactt tacaatacta ttaacgagat 6120
agcttacgat aacttaaaag ataaaggtga gaacatactt ccttatttaa caaaagcatg 6180
ggcagattta tgtaatgcat ttcttcaaga agctaagtgg ctttataata aatcaacacc 6240
tacatttgat gattattttg gaaatgcatg gaaaagttct agtggacctt tacagcttat 6300
ttttgcttat tttgctgtag tacagaacat taaaaaggaa gagattgaga atcttcagaa 6360
atatcatgac ataatatcaa gacctagtca catttttagg ctttgtaatg atttagcatc 6420
tgcttcagca gaaatagcaa gaggtgaaac tgctaattct gtaagttgtt atatgagaac 6480
aaaaggtata tctgaagaat tagctactga aagtgttatg aatcttatag acgaaacttg 6540
gaagaaaatg aacaaagaaa aacttggtgg atctttattt gcaaaacctt ttgttgagac 6600
tgctataaat ttagctagac agtctcattg cacatatcat aatggtgatg cacatactag 6660
tccagatgaa ttaactagga aaagagtact tagtgtaata actgaaccaa tattaccatt 6720
tgaaagataa gctagcataa aaataagaag cctgcatttg caggcttctt atttttatgg 6780
cgcgccgcca ttattttttt gaacaattga caattcattt cttatttttt attaagtgat 6840
agtcaaaagg cataacagtg ctgaatagaa agaaatttac agaaaagaaa attatagaat 6900
ttagtatgat taattatact catttatgaa tgtttaattg aatacaaaaa aaaatacttg 6960
ttatgtattc aattacgggt taaaatatag acaagttgaa aaatttaata aaaaaataag 7020
tcctcagctc ttatatatta agctaccaac ttagtatata agccaaaact taaatgtgct 7080
accaacacat caagccgtta gagaactcta tctatagcaa tatttcaaat gtaccgacat 7140
acaagagaaa cattaactat atatattcaa tttatgagat tatcttaaca gatataaatg 7200
taaattgcaa taagtaagat ttagaagttt atagcctttg tgtattggaa gcagtacgca 7260
aaggcttttt tatttgataa aaattagaag tatatttatt ttttcataat taatttatga 7320
aaatgaaagg gggtgagcaa agtgacagag gaaagcagta tcttatcaaa taacaaggta 7380
ttagcaatat cattattgac tttagcagta aacattatga cttttatagt gcttgtagct 7440
aagtagtacg aaagggggag ctttaaaaag ctccttggaa tacatagaat tcataaatta 7500
atttatgaaa agaagggcgt atatgaaaac ttgtaaaaat tgcaaagagt ttattaaaga 7560
tactgaaata tgcaaaatac attcgttgat gattcatgat aaaacagtag caacctattg 7620
cagtaaatac aatgagtcaa gatgtttaca taaagggaaa gtccaatgta ttaattgttc 7680
aaagatgaac cgatatggat ggtgtgccat aaaaatgaga tgttttacag aggaagaaca 7740
gaaaaaagaa cgtacatgca ttaaatatta tgcaaggagc tttaaaaaag ctcatgtaaa 7800
gaagagtaaa aagaaaaaat aatttattta ttaatttaat attgagagtg ccgacacagt 7860
atgcactaaa aaatatatct gtggtgtagt gagccgatac aaaaggatag tcactcgcat 7920
tttcataata catcttatgt tatgattatg tgtcggtggg acttcacgac gaaaacccac 7980
aataaaaaaa gagttcgggg tagggttaag catagttgag gcaactaaac aatcaagcta 8040
ggatatgcag tagcagaccg taaggtcgtt gtttaggtgt gttgtaatac atacgctatt 8100
aagatgtaaa aatacggata ccaatgaagg gaaaagtata atttttggat gtagtttgtt 8160
tgttcatcta tgggcaaact acgtccaaag ccgtttccaa atctgctaaa aagtatatcc 8220
tttctaaaat caaagtcaag tatgaaatca taaataaagt ttaattttga agttattatg 8280
atattatgtt tttctattaa aataaattaa gtatatagaa tagtttaata atagtatata 8340
cttaatgtga taagtgtctg acagtgtcac agaaaggatg attgttatgg attataagcg 8400
gccggccagt gggcaagttg aaaaattcac aaaaatgtgg tataatatct ttgttcatta 8460
gagcgataaa cttgaatttg agagggaact tagatggtat ttgaaaaaat tgataaaaat 8520
agttggaaca gaaaagagta ttttgaccac tactttgcaa gtgtaccttg tacctacagc 8580
atgaccgtta aagtggatat cacacaaata aaggaaaagg gaatgaaact atatcctgca 8640
atgctttatt atattgcaat gattgtaaac cgccattcag agtttaggac ggcaatcaat 8700
caagatggtg aattggggat atatgatgag atgataccaa gctatacaat atttcacaat 8760
gatactgaaa cattttccag cctttggact gagtgtaagt ctgactttaa atcattttta 8820
gcagattatg aaagtgatac gcaacggtat ggaaacaatc atagaatgga aggaaagcca 8880
aatgctccgg aaaacatttt taatgtatct atgataccgt ggtcaacctt cgatggcttt 8940
aatctgaatt tgcagaaagg atatgattat ttgattccta tttttactat ggggaaatat 9000
tataaagaag ataacaaaat tatacttcct ttggcaattc aagttcatca cgcagtatgt 9060
gacggatttc acatttgccg ttttgtaaac gaattgcagg aattgataaa tagttaactt 9120
caggtttgtc tgtaactaaa aacaagtatt taagcaaaaa catcgtagaa atacggtgtt 9180
ttttgttacc ctaagttt 9198
<210> 85
<211> 6841
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒pMTL83245-Pfor-FS-idi
<400> 85
aaactccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga 60
gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta 120
atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa 180
gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact 240
gttcttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca 300
tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt 360
accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg 420
ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag 480
cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta 540
agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat 600
ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg 660
tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc 720
ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac 780
cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc 840
gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc ccaatacgca gggccccctg caggataaaa 900
aaattgtaga taaattttat aaaatagttt tatctacaat ttttttatca ggaaacagct 960
atgaccgcgg ccgcaatatg atatttatgt ccattgtgaa agggattata ttcaactatt 1020
attccagtta cgttcataga aattttcctt tctaaaatat tttattccat gtcaagaact 1080
ctgtttattt cattaaagaa ctataagtac aaagtataag gcatttgaaa aaataggcta 1140
gtatattgat tgattattta ttttaaaatg cctaagtgaa atatatacat attataacaa 1200
taaaataagt attagtgtag gatttttaaa tagagtatct attttcagat taaatttttg 1260
attatttgat ttacattata taatattgag taaagtattg actagcaaaa ttttttgata 1320
ctttaatttg tgaaatttct tatcaaaagt tatatttttg aataattttt attgaaaaat 1380
acaactaaaa aggattatag tataagtgtg tgtaattttg tgttaaattt aaagggagga 1440
aatgaacatg aaacatatgg tgaccatgat tacgaattcg agctcggtac ccggggatcc 1500
tctagttgta tattaaaata gtagaataca taagatactt aatttaatta aagatagtta 1560
agtacttttc aatgtgcttt tttagatgtt taatacaaat ctttaattgt aaaagaaatg 1620
ctgtactatt tactgttcta gtgacgggat taaactgtat taattataaa taaaaaataa 1680
gtacagttgt ttaaaattat attttgtatt aaatctaata gtacgatgta agttatttta 1740
tactattgct agtttaataa aaagatttaa ttatatactt gaaaaggaga ggaactcgag 1800
atggaattta gagtacattt acaggcagac aacgaacaga aaatatttca aaatcaaatg 1860
aaaccagagc cagaagcatc atatcttata aatcaaagaa gaagtgctaa ttataaacca 1920
aacatttgga aaaacgattt tcttgatcag tctttaatat caaaatatga tggtgatgaa 1980
tatagaaaac tttcagaaaa gttaatagaa gaagtaaaga tatacatatc agcagagact 2040
atggatttag ttgctaaatt agaacttata gattctgtta gaaaacttgg acttgctaat 2100
ctttttgaga aagaaataaa ggaagcatta gacagtatag cagcaataga atcagataat 2160
ttaggaacta gagacgatct ttatggaaca gctcttcatt ttaagattct tagacagcat 2220
ggatataagg taagtcaaga tatatttggt agatttatgg atgagaaagg aacattagaa 2280
aatcatcact ttgcacactt aaaaggaatg ttagaattat ttgaggcaag taatcttgga 2340
tttgaaggtg aagacatatt agatgaagct aaagcatctc ttacacttgc tcttagagat 2400
tcaggacata tttgttatcc agactcaaac ttaagtagag atgtagttca tagtttagaa 2460
ttacctagtc atagaagagt tcaatggttc gatgtaaaat ggcagattaa tgcatacgaa 2520
aaagatattt gtagagtaaa tgcaacttta ttagagttag caaagttaaa ttttaatgtt 2580
gttcaagctc agcttcagaa gaatcttaga gaagctagta gatggtgggc taatcttggt 2640
ttcgcagata atttaaagtt tgctagagat agacttgtag agtgtttttc atgcgcagta 2700
ggtgtagcat ttgaaccaga gcattcatct tttagaatat gtttaactaa ggtaattaat 2760
cttgttctta ttatagatga tgtatacgat atatatggat ctgaagaaga gttaaaacat 2820
tttacaaatg ctgttgatag atgggacagt agagaaacag aacagcttcc tgaatgcatg 2880
aaaatgtgtt ttcaagtatt atataacact acttgcgaaa tagcaagaga gatagaagaa 2940
gaaaacggtt ggaatcaagt attacctcaa cttactaagg tttgggctga tttttgtaag 3000
gctcttttag ttgaagcaga gtggtacaat aaatcacata ttccaacatt agaagaatat 3060
cttagaaacg gatgtatatc aagtagtgta tctgtacttt tagttcactc tttcttttca 3120
ataactcatg aaggtacaaa agaaatggct gatttcttac ataaaaatga agatctttta 3180
tacaacataa gtcttatagt aagattaaac aatgatttag gtacatcagc tgctgaacag 3240
gaaagaggtg attctccttc ttctatagtt tgctatatga gagaagttaa tgcttctgaa 3300
gagactgcaa gaaagaatat aaagggaatg attgataatg cttggaaaaa ggttaatgga 3360
aaatgtttca caactaacca agttccattt ctttcatcat tcatgaataa tgcaactaac 3420
atggcaagag tagcacactc attatataaa gacggtgatg gttttggtga tcaagaaaaa 3480
ggacctagaa cacatattct tagtttatta ttccaacctt tagtaaatta actgcagggt 3540
tcaaaacata gattaaaaaa ttaaaggagg ggaaaaaatg gcagagtata taatagcagt 3600
agatgagttc gataacgaaa taggatcaat agaaaagatg gaagctcata gaaaaggaac 3660
acttcataga gcattcagta ttttagtttt taactcaaag aatcaacttt tattacagaa 3720
aagaaatgta aagaaatatc actctccagg attatggaca aacacttgtt gtagtcaccc 3780
aagatatggt gaatctcttc atgatgctat atacagaaga ttaaaagaag agatgggatt 3840
tacttgcgaa cttgaagaag tattctcatt catatataag gtaaaacttg aagataattt 3900
atttgagaat gaatatgacc atgtatttat tggtaaatat gatggtgaga taattgttaa 3960
taaagatgaa gttgatgatt ttaaatgggt agacattaat gaagttaaaa aggacataat 4020
agaaagacct gaggcatata cttactggtt taagtatctt gtaaataaag ctgaaaataa 4080
gatatttaaa taaaagcttg gcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc 4140
ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata 4200
gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggc 4260
gctagcataa aaataagaag cctgcatttg caggcttctt atttttatgg cgcgccgcca 4320
ttattttttt gaacaattga caattcattt cttatttttt attaagtgat agtcaaaagg 4380
cataacagtg ctgaatagaa agaaatttac agaaaagaaa attatagaat ttagtatgat 4440
taattatact catttatgaa tgtttaattg aatacaaaaa aaaatacttg ttatgtattc 4500
aattacgggt taaaatatag acaagttgaa aaatttaata aaaaaataag tcctcagctc 4560
ttatatatta agctaccaac ttagtatata agccaaaact taaatgtgct accaacacat 4620
caagccgtta gagaactcta tctatagcaa tatttcaaat gtaccgacat acaagagaaa 4680
cattaactat atatattcaa tttatgagat tatcttaaca gatataaatg taaattgcaa 4740
taagtaagat ttagaagttt atagcctttg tgtattggaa gcagtacgca aaggcttttt 4800
tatttgataa aaattagaag tatatttatt ttttcataat taatttatga aaatgaaagg 4860
gggtgagcaa agtgacagag gaaagcagta tcttatcaaa taacaaggta ttagcaatat 4920
cattattgac tttagcagta aacattatga cttttatagt gcttgtagct aagtagtacg 4980
aaagggggag ctttaaaaag ctccttggaa tacatagaat tcataaatta atttatgaaa 5040
agaagggcgt atatgaaaac ttgtaaaaat tgcaaagagt ttattaaaga tactgaaata 5100
tgcaaaatac attcgttgat gattcatgat aaaacagtag caacctattg cagtaaatac 5160
aatgagtcaa gatgtttaca taaagggaaa gtccaatgta ttaattgttc aaagatgaac 5220
cgatatggat ggtgtgccat aaaaatgaga tgttttacag aggaagaaca gaaaaaagaa 5280
cgtacatgca ttaaatatta tgcaaggagc tttaaaaaag ctcatgtaaa gaagagtaaa 5340
aagaaaaaat aatttattta ttaatttaat attgagagtg ccgacacagt atgcactaaa 5400
aaatatatct gtggtgtagt gagccgatac aaaaggatag tcactcgcat tttcataata 5460
catcttatgt tatgattatg tgtcggtggg acttcacgac gaaaacccac aataaaaaaa 5520
gagttcgggg tagggttaag catagttgag gcaactaaac aatcaagcta ggatatgcag 5580
tagcagaccg taaggtcgtt gtttaggtgt gttgtaatac atacgctatt aagatgtaaa 5640
aatacggata ccaatgaagg gaaaagtata atttttggat gtagtttgtt tgttcatcta 5700
tgggcaaact acgtccaaag ccgtttccaa atctgctaaa aagtatatcc tttctaaaat 5760
caaagtcaag tatgaaatca taaataaagt ttaattttga agttattatg atattatgtt 5820
tttctattaa aataaattaa gtatatagaa tagtttaata atagtatata cttaatgtga 5880
taagtgtctg acagtgtcac agaaaggatg attgttatgg attataagcg gccggccgaa 5940
gcaaacttaa gagtgtgttg atagtgcagt atcttaaaat tttgtataat aggaattgaa 6000
gttaaattag atgctaaaaa tttgtaatta agaaggagtg attacatgaa caaaaatata 6060
aaatattctc aaaacttttt aacgagtgaa aaagtactca accaaataat aaaacaattg 6120
aatttaaaag aaaccgatac cgtttacgaa attggaacag gtaaagggca tttaacgacg 6180
aaactggcta aaataagtaa acaggtaacg tctattgaat tagacagtca tctattcaac 6240
ttatcgtcag aaaaattaaa actgaatact cgtgtcactt taattcacca agatattcta 6300
cagtttcaat tccctaacaa acagaggtat aaaattgttg ggagtattcc ttaccattta 6360
agcacacaaa ttattaaaaa agtggttttt gaaagccatg cgtctgacat ctatctgatt 6420
gttgaagaag gattctacaa gcgtaccttg gatattcacc gaacactagg gttgctcttg 6480
cacactcaag tctcgattca gcaattgctt aagctgccag cggaatgctt tcatcctaaa 6540
ccaaaagtaa acagtgtctt aataaaactt acccgccata ccacagatgt tccagataaa 6600
tattggaagc tatatacgta ctttgtttca aaatgggtca atcgagaata tcgtcaactg 6660
tttactaaaa atcagtttca tcaagcaatg aaacacgcca aagtaaacaa tttaagtacc 6720
gttacttatg agcaagtatt gtctattttt aatagttatc tattatttaa cgggaggaaa 6780
taattctatg agtcgctttt gtaaatttgg aaagttacac gttactaaag ggaatgtgtt 6840
t 6841
<210> 86
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸idi_F2
<400> 86
aggcactcga gatggcagag tatataatag cagtag 36
<210> 87
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸idi_R2
<400> 87
aggcgcaagc ttggcgcacc ggtttattta aatatcttat tttcagc 47
<210> 88
<211> 5075
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒pMTL83245-Pfor-idi
<400> 88
aaactccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga 60
gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta 120
atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa 180
gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact 240
gttcttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca 300
tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt 360
accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg 420
ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag 480
cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta 540
agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat 600
ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg 660
tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc 720
ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac 780
cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc 840
gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc ccaatacgca gggccccctg caggataaaa 900
aaattgtaga taaattttat aaaatagttt tatctacaat ttttttatca ggaaacagct 960
atgaccgcgg ccgcaatatg atatttatgt ccattgtgaa agggattata ttcaactatt 1020
attccagtta cgttcataga aattttcctt tctaaaatat tttattccat gtcaagaact 1080
ctgtttattt cattaaagaa ctataagtac aaagtataag gcatttgaaa aaataggcta 1140
gtatattgat tgattattta ttttaaaatg cctaagtgaa atatatacat attataacaa 1200
taaaataagt attagtgtag gatttttaaa tagagtatct attttcagat taaatttttg 1260
attatttgat ttacattata taatattgag taaagtattg actagcaaaa ttttttgata 1320
ctttaatttg tgaaatttct tatcaaaagt tatatttttg aataattttt attgaaaaat 1380
acaactaaaa aggattatag tataagtgtg tgtaattttg tgttaaattt aaagggagga 1440
aatgaacatg aaacatatgg tgaccatgat tacgaattcg agctcggtac ccggggatcc 1500
tctagttgta tattaaaata gtagaataca taagatactt aatttaatta aagatagtta 1560
agtacttttc aatgtgcttt tttagatgtt taatacaaat ctttaattgt aaaagaaatg 1620
ctgtactatt tactgttcta gtgacgggat taaactgtat taattataaa taaaaaataa 1680
gtacagttgt ttaaaattat attttgtatt aaatctaata gtacgatgta agttatttta 1740
tactattgct agtttaataa aaagatttaa ttatatactt gaaaaggaga ggaactcgag 1800
atggcagagt atataatagc agtagatgag ttcgataacg aaataggatc aatagaaaag 1860
atggaagctc atagaaaagg aacacttcat agagcattca gtattttagt ttttaactca 1920
aagaatcaac ttttattaca gaaaagaaat gtaaagaaat atcactctcc aggattatgg 1980
acaaacactt gttgtagtca cccaagatat ggtgaatctc ttcatgatgc tatatacaga 2040
agattaaaag aagagatggg atttacttgc gaacttgaag aagtattctc attcatatat 2100
aaggtaaaac ttgaagataa tttatttgag aatgaatatg accatgtatt tattggtaaa 2160
tatgatggtg agataattgt taataaagat gaagttgatg attttaaatg ggtagacatt 2220
aatgaagtta aaaaggacat aatagaaaga cctgaggcat atacttactg gtttaagtat 2280
cttgtaaata aagctgaaaa taagatattt aaataaaccg gtgcgccaag cttggcactg 2340
gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt 2400
gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct 2460
tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tggcgctagc ataaaaataa gaagcctgca 2520
tttgcaggct tcttattttt atggcgcgcc gccattattt ttttgaacaa ttgacaattc 2580
atttcttatt ttttattaag tgatagtcaa aaggcataac agtgctgaat agaaagaaat 2640
ttacagaaaa gaaaattata gaatttagta tgattaatta tactcattta tgaatgttta 2700
attgaataca aaaaaaaata cttgttatgt attcaattac gggttaaaat atagacaagt 2760
tgaaaaattt aataaaaaaa taagtcctca gctcttatat attaagctac caacttagta 2820
tataagccaa aacttaaatg tgctaccaac acatcaagcc gttagagaac tctatctata 2880
gcaatatttc aaatgtaccg acatacaaga gaaacattaa ctatatatat tcaatttatg 2940
agattatctt aacagatata aatgtaaatt gcaataagta agatttagaa gtttatagcc 3000
tttgtgtatt ggaagcagta cgcaaaggct tttttatttg ataaaaatta gaagtatatt 3060
tattttttca taattaattt atgaaaatga aagggggtga gcaaagtgac agaggaaagc 3120
agtatcttat caaataacaa ggtattagca atatcattat tgactttagc agtaaacatt 3180
atgactttta tagtgcttgt agctaagtag tacgaaaggg ggagctttaa aaagctcctt 3240
ggaatacata gaattcataa attaatttat gaaaagaagg gcgtatatga aaacttgtaa 3300
aaattgcaaa gagtttatta aagatactga aatatgcaaa atacattcgt tgatgattca 3360
tgataaaaca gtagcaacct attgcagtaa atacaatgag tcaagatgtt tacataaagg 3420
gaaagtccaa tgtattaatt gttcaaagat gaaccgatat ggatggtgtg ccataaaaat 3480
gagatgtttt acagaggaag aacagaaaaa agaacgtaca tgcattaaat attatgcaag 3540
gagctttaaa aaagctcatg taaagaagag taaaaagaaa aaataattta tttattaatt 3600
taatattgag agtgccgaca cagtatgcac taaaaaatat atctgtggtg tagtgagccg 3660
atacaaaagg atagtcactc gcattttcat aatacatctt atgttatgat tatgtgtcgg 3720
tgggacttca cgacgaaaac ccacaataaa aaaagagttc ggggtagggt taagcatagt 3780
tgaggcaact aaacaatcaa gctaggatat gcagtagcag accgtaaggt cgttgtttag 3840
gtgtgttgta atacatacgc tattaagatg taaaaatacg gataccaatg aagggaaaag 3900
tataattttt ggatgtagtt tgtttgttca tctatgggca aactacgtcc aaagccgttt 3960
ccaaatctgc taaaaagtat atcctttcta aaatcaaagt caagtatgaa atcataaata 4020
aagtttaatt ttgaagttat tatgatatta tgtttttcta ttaaaataaa ttaagtatat 4080
agaatagttt aataatagta tatacttaat gtgataagtg tctgacagtg tcacagaaag 4140
gatgattgtt atggattata agcggccggc cgaagcaaac ttaagagtgt gttgatagtg 4200
cagtatctta aaattttgta taataggaat tgaagttaaa ttagatgcta aaaatttgta 4260
attaagaagg agtgattaca tgaacaaaaa tataaaatat tctcaaaact ttttaacgag 4320
tgaaaaagta ctcaaccaaa taataaaaca attgaattta aaagaaaccg ataccgttta 4380
cgaaattgga acaggtaaag ggcatttaac gacgaaactg gctaaaataa gtaaacaggt 4440
aacgtctatt gaattagaca gtcatctatt caacttatcg tcagaaaaat taaaactgaa 4500
tactcgtgtc actttaattc accaagatat tctacagttt caattcccta acaaacagag 4560
gtataaaatt gttgggagta ttccttacca tttaagcaca caaattatta aaaaagtggt 4620
ttttgaaagc catgcgtctg acatctatct gattgttgaa gaaggattct acaagcgtac 4680
cttggatatt caccgaacac tagggttgct cttgcacact caagtctcga ttcagcaatt 4740
gcttaagctg ccagcggaat gctttcatcc taaaccaaaa gtaaacagtg tcttaataaa 4800
acttacccgc cataccacag atgttccaga taaatattgg aagctatata cgtactttgt 4860
ttcaaaatgg gtcaatcgag aatatcgtca actgtttact aaaaatcagt ttcatcaagc 4920
aatgaaacac gccaaagtaa acaatttaag taccgttact tatgagcaag tattgtctat 4980
ttttaatagt tatctattat ttaacgggag gaaataattc tatgagtcgc ttttgtaaat 5040
ttggaaagtt acacgttact aaagggaatg tgttt 5075
<210> 89
<211> 6662
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒pMTL83245-Pfor-idi-FS
<400> 89
aaactccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga 60
gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta 120
atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa 180
gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact 240
gttcttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca 300
tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt 360
accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg 420
ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag 480
cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta 540
agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat 600
ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg 660
tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc 720
ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac 780
cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc 840
gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc ccaatacgca gggccccctg caggataaaa 900
aaattgtaga taaattttat aaaatagttt tatctacaat ttttttatca ggaaacagct 960
atgaccgcgg ccgcaatatg atatttatgt ccattgtgaa agggattata ttcaactatt 1020
attccagtta cgttcataga aattttcctt tctaaaatat tttattccat gtcaagaact 1080
ctgtttattt cattaaagaa ctataagtac aaagtataag gcatttgaaa aaataggcta 1140
gtatattgat tgattattta ttttaaaatg cctaagtgaa atatatacat attataacaa 1200
taaaataagt attagtgtag gatttttaaa tagagtatct attttcagat taaatttttg 1260
attatttgat ttacattata taatattgag taaagtattg actagcaaaa ttttttgata 1320
ctttaatttg tgaaatttct tatcaaaagt tatatttttg aataattttt attgaaaaat 1380
acaactaaaa aggattatag tataagtgtg tgtaattttg tgttaaattt aaagggagga 1440
aatgaacatg aaacatatgg tgaccatgat tacgaattcg agctcggtac ccggggatcc 1500
tctagttgta tattaaaata gtagaataca taagatactt aatttaatta aagatagtta 1560
agtacttttc aatgtgcttt tttagatgtt taatacaaat ctttaattgt aaaagaaatg 1620
ctgtactatt tactgttcta gtgacgggat taaactgtat taattataaa taaaaaataa 1680
gtacagttgt ttaaaattat attttgtatt aaatctaata gtacgatgta agttatttta 1740
tactattgct agtttaataa aaagatttaa ttatatactt gaaaaggaga ggaactcgag 1800
atggcagagt atataatagc agtagatgag ttcgataacg aaataggatc aatagaaaag 1860
atggaagctc atagaaaagg aacacttcat agagcattca gtattttagt ttttaactca 1920
aagaatcaac ttttattaca gaaaagaaat gtaaagaaat atcactctcc aggattatgg 1980
acaaacactt gttgtagtca cccaagatat ggtgaatctc ttcatgatgc tatatacaga 2040
agattaaaag aagagatggg atttacttgc gaacttgaag aagtattctc attcatatat 2100
aaggtaaaac ttgaagataa tttatttgag aatgaatatg accatgtatt tattggtaaa 2160
tatgatggtg agataattgt taataaagat gaagttgatg attttaaatg ggtagacatt 2220
aatgaagtta aaaaggacat aatagaaaga cctgaggcat atacttactg gtttaagtat 2280
cttgtaaata aagctgaaaa taagatattt aaataaaccg gtgcgccaag cttttaaagg 2340
aggggaaaaa atggaattta gagtacattt acaggcagac aacgaacaga aaatatttca 2400
aaatcaaatg aaaccagagc cagaagcatc atatcttata aatcaaagaa gaagtgctaa 2460
ttataaacca aacatttgga aaaacgattt tcttgatcag tctttaatat caaaatatga 2520
tggtgatgaa tatagaaaac tttcagaaaa gttaatagaa gaagtaaaga tatacatatc 2580
agcagagact atggatttag ttgctaaatt agaacttata gattctgtta gaaaacttgg 2640
acttgctaat ctttttgaga aagaaataaa ggaagcatta gacagtatag cagcaataga 2700
atcagataat ttaggaacta gagacgatct ttatggaaca gctcttcatt ttaagattct 2760
tagacagcat ggatataagg taagtcaaga tatatttggt agatttatgg atgagaaagg 2820
aacattagaa aatcatcact ttgcacactt aaaaggaatg ttagaattat ttgaggcaag 2880
taatcttgga tttgaaggtg aagacatatt agatgaagct aaagcatctc ttacacttgc 2940
tcttagagat tcaggacata tttgttatcc agactcaaac ttaagtagag atgtagttca 3000
tagtttagaa ttacctagtc atagaagagt tcaatggttc gatgtaaaat ggcagattaa 3060
tgcatacgaa aaagatattt gtagagtaaa tgcaacttta ttagagttag caaagttaaa 3120
ttttaatgtt gttcaagctc agcttcagaa gaatcttaga gaagctagta gatggtgggc 3180
taatcttggt ttcgcagata atttaaagtt tgctagagat agacttgtag agtgtttttc 3240
atgcgcagta ggtgtagcat ttgaaccaga gcattcatct tttagaatat gtttaactaa 3300
ggtaattaat cttgttctta ttatagatga tgtatacgat atatatggat ctgaagaaga 3360
gttaaaacat tttacaaatg ctgttgatag atgggacagt agagaaacag aacagcttcc 3420
tgaatgcatg aaaatgtgtt ttcaagtatt atataacact acttgcgaaa tagcaagaga 3480
gatagaagaa gaaaacggtt ggaatcaagt attacctcaa cttactaagg tttgggctga 3540
tttttgtaag gctcttttag ttgaagcaga gtggtacaat aaatcacata ttccaacatt 3600
agaagaatat cttagaaacg gatgtatatc aagtagtgta tctgtacttt tagttcactc 3660
tttcttttca ataactcatg aaggtacaaa agaaatggct gatttcttac ataaaaatga 3720
agatctttta tacaacataa gtcttatagt aagattaaac aatgatttag gtacatcagc 3780
tgctgaacag gaaagaggtg attctccttc ttctatagtt tgctatatga gagaagttaa 3840
tgcttctgaa gagactgcaa gaaagaatat aaagggaatg attgataatg cttggaaaaa 3900
ggttaatgga aaatgtttca caactaacca agttccattt ctttcatcat tcatgaataa 3960
tgcaactaac atggcaagag tagcacactc attatataaa gacggtgatg gttttggtga 4020
tcaagaaaaa ggacctagaa cacatattct tagtttatta ttccaacctt tagtaaatta 4080
agctagcata aaaataagaa gcctgcattt gcaggcttct tatttttatg gcgcgccgcc 4140
attatttttt tgaacaattg acaattcatt tcttattttt tattaagtga tagtcaaaag 4200
gcataacagt gctgaataga aagaaattta cagaaaagaa aattatagaa tttagtatga 4260
ttaattatac tcatttatga atgtttaatt gaatacaaaa aaaaatactt gttatgtatt 4320
caattacggg ttaaaatata gacaagttga aaaatttaat aaaaaaataa gtcctcagct 4380
cttatatatt aagctaccaa cttagtatat aagccaaaac ttaaatgtgc taccaacaca 4440
tcaagccgtt agagaactct atctatagca atatttcaaa tgtaccgaca tacaagagaa 4500
acattaacta tatatattca atttatgaga ttatcttaac agatataaat gtaaattgca 4560
ataagtaaga tttagaagtt tatagccttt gtgtattgga agcagtacgc aaaggctttt 4620
ttatttgata aaaattagaa gtatatttat tttttcataa ttaatttatg aaaatgaaag 4680
ggggtgagca aagtgacaga ggaaagcagt atcttatcaa ataacaaggt attagcaata 4740
tcattattga ctttagcagt aaacattatg acttttatag tgcttgtagc taagtagtac 4800
gaaaggggga gctttaaaaa gctccttgga atacatagaa ttcataaatt aatttatgaa 4860
aagaagggcg tatatgaaaa cttgtaaaaa ttgcaaagag tttattaaag atactgaaat 4920
atgcaaaata cattcgttga tgattcatga taaaacagta gcaacctatt gcagtaaata 4980
caatgagtca agatgtttac ataaagggaa agtccaatgt attaattgtt caaagatgaa 5040
ccgatatgga tggtgtgcca taaaaatgag atgttttaca gaggaagaac agaaaaaaga 5100
acgtacatgc attaaatatt atgcaaggag ctttaaaaaa gctcatgtaa agaagagtaa 5160
aaagaaaaaa taatttattt attaatttaa tattgagagt gccgacacag tatgcactaa 5220
aaaatatatc tgtggtgtag tgagccgata caaaaggata gtcactcgca ttttcataat 5280
acatcttatg ttatgattat gtgtcggtgg gacttcacga cgaaaaccca caataaaaaa 5340
agagttcggg gtagggttaa gcatagttga ggcaactaaa caatcaagct aggatatgca 5400
gtagcagacc gtaaggtcgt tgtttaggtg tgttgtaata catacgctat taagatgtaa 5460
aaatacggat accaatgaag ggaaaagtat aatttttgga tgtagtttgt ttgttcatct 5520
atgggcaaac tacgtccaaa gccgtttcca aatctgctaa aaagtatatc ctttctaaaa 5580
tcaaagtcaa gtatgaaatc ataaataaag tttaattttg aagttattat gatattatgt 5640
ttttctatta aaataaatta agtatataga atagtttaat aatagtatat acttaatgtg 5700
ataagtgtct gacagtgtca cagaaaggat gattgttatg gattataagc ggccggccga 5760
agcaaactta agagtgtgtt gatagtgcag tatcttaaaa ttttgtataa taggaattga 5820
agttaaatta gatgctaaaa atttgtaatt aagaaggagt gattacatga acaaaaatat 5880
aaaatattct caaaactttt taacgagtga aaaagtactc aaccaaataa taaaacaatt 5940
gaatttaaaa gaaaccgata ccgtttacga aattggaaca ggtaaagggc atttaacgac 6000
gaaactggct aaaataagta aacaggtaac gtctattgaa ttagacagtc atctattcaa 6060
cttatcgtca gaaaaattaa aactgaatac tcgtgtcact ttaattcacc aagatattct 6120
acagtttcaa ttccctaaca aacagaggta taaaattgtt gggagtattc cttaccattt 6180
aagcacacaa attattaaaa aagtggtttt tgaaagccat gcgtctgaca tctatctgat 6240
tgttgaagaa ggattctaca agcgtacctt ggatattcac cgaacactag ggttgctctt 6300
gcacactcaa gtctcgattc agcaattgct taagctgcca gcggaatgct ttcatcctaa 6360
accaaaagta aacagtgtct taataaaact tacccgccat accacagatg ttccagataa 6420
atattggaag ctatatacgt actttgtttc aaaatgggtc aatcgagaat atcgtcaact 6480
gtttactaaa aatcagtttc atcaagcaat gaaacacgcc aaagtaaaca atttaagtac 6540
cgttacttat gagcaagtat tgtctatttt taatagttat ctattattta acgggaggaa 6600
ataattctat gagtcgcttt tgtaaatttg gaaagttaca cgttactaaa gggaatgtgt 6660
tt 6662
<210> 90
<211> 7077
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒pMTL83245-Pfor-idi-ispA-FS
<400> 90
aaactccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga 60
gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta 120
atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa 180
gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact 240
gttcttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca 300
tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt 360
accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg 420
ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag 480
cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta 540
agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat 600
ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg 660
tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc 720
ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac 780
cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc 840
gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc ccaatacgca gggccccctg caggataaaa 900
aaattgtaga taaattttat aaaatagttt tatctacaat ttttttatca ggaaacagct 960
atgaccgcgg ccgcaccgag actagttgta tattaaaata gtagaataca taagatactt 1020
aatttaatta aagatagtta agtacttttc aatgtgcttt tttagatgtt taatacaaat 1080
ctttaattgt aaaagaaatg ctgtactatt tactgttcta gtgacgggat taaactgtat 1140
taattataaa taaaaaataa gtacagttgt ttaaaattat attttgtatt aaatctaata 1200
gtacgatgta agttatttta tactattgct agtttaataa aaagatttaa ttatatactt 1260
gaaaaggaga ggaactcgag atggcagagt atataatagc agtagatgag ttcgataacg 1320
aaataggatc aatagaaaag atggaagctc atagaaaagg aacacttcat agagcattca 1380
gtattttagt ttttaactca aagaatcaac ttttattaca gaaaagaaat gtaaagaaat 1440
atcactctcc aggattatgg acaaacactt gttgtagtca cccaagatat ggtgaatctc 1500
ttcatgatgc tatatacaga agattaaaag aagagatggg atttacttgc gaacttgaag 1560
aagtattctc attcatatat aaggtaaaac ttgaagataa tttatttgag aatgaatatg 1620
accatgtatt tattggtaaa tatgatggtg agataattgt taataaagat gaagttgatg 1680
attttaaatg ggtagacatt aatgaagtta aaaaggacat aatagaaaga cctgaggcat 1740
atacttactg gtttaagtat cttgtaaata aagctgaaaa taagatattt aaataaaccg 1800
gtcagtaacg aatagaatta gaaaaacaaa ggaggcaaga caatggattt cccacaacaa 1860
ttagaagcat gtgtaaaaca ggctaatcag gcacttagta gatttattgc tcctcttcct 1920
tttcaaaata caccagtagt agaaactatg caatacggtg cacttttagg tggtaaaaga 1980
ttaagaccat tcttagtata tgctacagga cacatgtttg gtgtatcaac taatacttta 2040
gacgctccag ctgctgctgt tgaatgtatt catgcttatt ctttaataca tgatgactta 2100
ccagcaatgg atgacgatga tttaagaaga ggtttaccta catgtcatgt taaatttggt 2160
gaagctaatg caattttagc aggtgacgct ttacaaactt tagctttttc tatactttca 2220
gatgcagaca tgcctgaagt ttcagataga gatagaattt ctatgatatc agagcttgca 2280
tctgcatcag gaatagctgg aatgtgcggt ggtcaagcac ttgatttaga tgcagaaggt 2340
aaacacgtac cacttgatgc tttagagaga atacatagac ataaaacagg tgctcttata 2400
agagcagcag taagattagg tgctttaagt gctggtgaca agggtagaag agcacttcca 2460
gtacttgata agtatgcaga aagtatagga ttagcttttc aagttcaaga tgacatactt 2520
gacgttgttg gtgatactgc tactttagga aaaagacagg gtgcagatca gcaattagga 2580
aaatctacat accctgcttt acttggatta gaacaggcta gaaagaaagc aagagactta 2640
atagatgacg caagacaaag tcttaaacag ttagctgaac aatcacttga cacaagtgca 2700
cttgaagcac ttgcagatta tattatacag agaaacaagt aaaagctttt aaaggagggg 2760
aaaaaatgga atttagagta catttacagg cagacaacga acagaaaata tttcaaaatc 2820
aaatgaaacc agagccagaa gcatcatatc ttataaatca aagaagaagt gctaattata 2880
aaccaaacat ttggaaaaac gattttcttg atcagtcttt aatatcaaaa tatgatggtg 2940
atgaatatag aaaactttca gaaaagttaa tagaagaagt aaagatatac atatcagcag 3000
agactatgga tttagttgct aaattagaac ttatagattc tgttagaaaa cttggacttg 3060
ctaatctttt tgagaaagaa ataaaggaag cattagacag tatagcagca atagaatcag 3120
ataatttagg aactagagac gatctttatg gaacagctct tcattttaag attcttagac 3180
agcatggata taaggtaagt caagatatat ttggtagatt tatggatgag aaaggaacat 3240
tagaaaatca tcactttgca cacttaaaag gaatgttaga attatttgag gcaagtaatc 3300
ttggatttga aggtgaagac atattagatg aagctaaagc atctcttaca cttgctctta 3360
gagattcagg acatatttgt tatccagact caaacttaag tagagatgta gttcatagtt 3420
tagaattacc tagtcataga agagttcaat ggttcgatgt aaaatggcag attaatgcat 3480
acgaaaaaga tatttgtaga gtaaatgcaa ctttattaga gttagcaaag ttaaatttta 3540
atgttgttca agctcagctt cagaagaatc ttagagaagc tagtagatgg tgggctaatc 3600
ttggtttcgc agataattta aagtttgcta gagatagact tgtagagtgt ttttcatgcg 3660
cagtaggtgt agcatttgaa ccagagcatt catcttttag aatatgttta actaaggtaa 3720
ttaatcttgt tcttattata gatgatgtat acgatatata tggatctgaa gaagagttaa 3780
aacattttac aaatgctgtt gatagatggg acagtagaga aacagaacag cttcctgaat 3840
gcatgaaaat gtgttttcaa gtattatata acactacttg cgaaatagca agagagatag 3900
aagaagaaaa cggttggaat caagtattac ctcaacttac taaggtttgg gctgattttt 3960
gtaaggctct tttagttgaa gcagagtggt acaataaatc acatattcca acattagaag 4020
aatatcttag aaacggatgt atatcaagta gtgtatctgt acttttagtt cactctttct 4080
tttcaataac tcatgaaggt acaaaagaaa tggctgattt cttacataaa aatgaagatc 4140
ttttatacaa cataagtctt atagtaagat taaacaatga tttaggtaca tcagctgctg 4200
aacaggaaag aggtgattct ccttcttcta tagtttgcta tatgagagaa gttaatgctt 4260
ctgaagagac tgcaagaaag aatataaagg gaatgattga taatgcttgg aaaaaggtta 4320
atggaaaatg tttcacaact aaccaagttc catttctttc atcattcatg aataatgcaa 4380
ctaacatggc aagagtagca cactcattat ataaagacgg tgatggtttt ggtgatcaag 4440
aaaaaggacc tagaacacat attcttagtt tattattcca acctttagta aattaagcta 4500
gcataaaaat aagaagcctg catttgcagg cttcttattt ttatggcgcg ccgccattat 4560
ttttttgaac aattgacaat tcatttctta ttttttatta agtgatagtc aaaaggcata 4620
acagtgctga atagaaagaa atttacagaa aagaaaatta tagaatttag tatgattaat 4680
tatactcatt tatgaatgtt taattgaata caaaaaaaaa tacttgttat gtattcaatt 4740
acgggttaaa atatagacaa gttgaaaaat ttaataaaaa aataagtcct cagctcttat 4800
atattaagct accaacttag tatataagcc aaaacttaaa tgtgctacca acacatcaag 4860
ccgttagaga actctatcta tagcaatatt tcaaatgtac cgacatacaa gagaaacatt 4920
aactatatat attcaattta tgagattatc ttaacagata taaatgtaaa ttgcaataag 4980
taagatttag aagtttatag cctttgtgta ttggaagcag tacgcaaagg cttttttatt 5040
tgataaaaat tagaagtata tttatttttt cataattaat ttatgaaaat gaaagggggt 5100
gagcaaagtg acagaggaaa gcagtatctt atcaaataac aaggtattag caatatcatt 5160
attgacttta gcagtaaaca ttatgacttt tatagtgctt gtagctaagt agtacgaaag 5220
ggggagcttt aaaaagctcc ttggaataca tagaattcat aaattaattt atgaaaagaa 5280
gggcgtatat gaaaacttgt aaaaattgca aagagtttat taaagatact gaaatatgca 5340
aaatacattc gttgatgatt catgataaaa cagtagcaac ctattgcagt aaatacaatg 5400
agtcaagatg tttacataaa gggaaagtcc aatgtattaa ttgttcaaag atgaaccgat 5460
atggatggtg tgccataaaa atgagatgtt ttacagagga agaacagaaa aaagaacgta 5520
catgcattaa atattatgca aggagcttta aaaaagctca tgtaaagaag agtaaaaaga 5580
aaaaataatt tatttattaa tttaatattg agagtgccga cacagtatgc actaaaaaat 5640
atatctgtgg tgtagtgagc cgatacaaaa ggatagtcac tcgcattttc ataatacatc 5700
ttatgttatg attatgtgtc ggtgggactt cacgacgaaa acccacaata aaaaaagagt 5760
tcggggtagg gttaagcata gttgaggcaa ctaaacaatc aagctaggat atgcagtagc 5820
agaccgtaag gtcgttgttt aggtgtgttg taatacatac gctattaaga tgtaaaaata 5880
cggataccaa tgaagggaaa agtataattt ttggatgtag tttgtttgtt catctatggg 5940
caaactacgt ccaaagccgt ttccaaatct gctaaaaagt atatcctttc taaaatcaaa 6000
gtcaagtatg aaatcataaa taaagtttaa ttttgaagtt attatgatat tatgtttttc 6060
tattaaaata aattaagtat atagaatagt ttaataatag tatatactta atgtgataag 6120
tgtctgacag tgtcacagaa aggatgattg ttatggatta taagcggccg gccgaagcaa 6180
acttaagagt gtgttgatag tgcagtatct taaaattttg tataatagga attgaagtta 6240
aattagatgc taaaaatttg taattaagaa ggagtgatta catgaacaaa aatataaaat 6300
attctcaaaa ctttttaacg agtgaaaaag tactcaacca aataataaaa caattgaatt 6360
taaaagaaac cgataccgtt tacgaaattg gaacaggtaa agggcattta acgacgaaac 6420
tggctaaaat aagtaaacag gtaacgtcta ttgaattaga cagtcatcta ttcaacttat 6480
cgtcagaaaa attaaaactg aatactcgtg tcactttaat tcaccaagat attctacagt 6540
ttcaattccc taacaaacag aggtataaaa ttgttgggag tattccttac catttaagca 6600
cacaaattat taaaaaagtg gtttttgaaa gccatgcgtc tgacatctat ctgattgttg 6660
aagaaggatt ctacaagcgt accttggata ttcaccgaac actagggttg ctcttgcaca 6720
ctcaagtctc gattcagcaa ttgcttaagc tgccagcgga atgctttcat cctaaaccaa 6780
aagtaaacag tgtcttaata aaacttaccc gccataccac agatgttcca gataaatatt 6840
ggaagctata tacgtacttt gtttcaaaat gggtcaatcg agaatatcgt caactgttta 6900
ctaaaaatca gtttcatcaa gcaatgaaac acgccaaagt aaacaattta agtaccgtta 6960
cttatgagca agtattgtct atttttaata gttatctatt atttaacggg aggaaataat 7020
tctatgagtc gcttttgtaa atttggaaag ttacacgtta ctaaagggaa tgtgttt 7077
<210> 91
<211> 10090
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒pMTL 8314-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS
<400> 91
aaactccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga 60
gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta 120
atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa 180
gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact 240
gttcttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca 300
tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt 360
accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg 420
ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag 480
cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta 540
agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat 600
ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg 660
tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc 720
ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac 780
cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc 840
gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc ccaatacgca gggccccctg caggataaaa 900
aaattgtaga taaattttat aaaatagttt tatctacaat ttttttatca ggaaacagct 960
atgaccgcgg ccgctaggtc tagaatatcg atacagataa aaaaatatat aatacagaag 1020
aaaaaattat aaatttgtgg tataatataa agtatagtaa tttaagttta aacctcgtga 1080
aaacgctaac aaataatagg aggtcaattg atgatagctg ttccatttaa cgctggaaaa 1140
ataaaagttt taattgaggc attagaatct ggaaattatt catcaataaa atcagatgta 1200
tatgacggaa tgttatatga tgcaccagat caccttaaat cattagtaaa cagatttgta 1260
gaacttaata atataactga gccattagca gtaactatac agacaaatct tcctccttca 1320
agaggtcttg gatctagtgc agctgttgct gttgcttttg taagagcaag ttatgatttc 1380
ttaggaaaaa gtttaactaa agaagagctt atagaaaagg ctaattgggc tgaacaaata 1440
gctcatggaa agccatctgg aatagataca caaacaatag tatctggaaa gcctgtttgg 1500
tttcaaaagg gacatgcaga aacacttaaa actctttcac ttgatggata catggtagta 1560
attgatacag gtgttaaagg aagtacaaga caggctgtag aagatgttca taaactttgc 1620
gaagatcctc aatatatgag tcacgtaaaa cacataggaa aacttgtact tagagcatct 1680
gatgttattg aacatcataa ctttgaagca cttgctgata tattcaatga atgtcatgct 1740
gatttaaagg ctcttacagt aagtcatgac aaaatagaac agttaatgaa gataggaaaa 1800
gaaaatggtg ctatagctgg taaattaact ggtgctggta gaggtggttc aatgttatta 1860
cttgcaaaag acttaccaac tgcaaagaat atagttaaag cagtagagaa agctggtgca 1920
gcacatactt ggattgaaaa tttaggtggt taagtcgaca aagacactaa aaaattataa 1980
aagtaaagga ggacattaaa tgatacaagt aaaggcacca ggaaaattat atatagcagg 2040
tgaatacgct gttacagaac caggatataa atctgttctt atagctcttg atagatttgt 2100
tacagctact attgaggaag ctgatcaata caaaggaaca atacattcaa aggcattaca 2160
tcacaatcca gtaactttta gtagagatga agattctatt gttatatcag acccacacgc 2220
agcaaaacaa cttaattatg tagtaactgc tatagaaata tttgagcaat atgcaaaatc 2280
atgtgacata gcaatgaagc attttcattt aactatagat tctaacttag atgatagtaa 2340
tggacataag tatggacttg gatcttctgc tgctgtttta gtttcagtaa ttaaagtact 2400
taacgaattt tatgatatga aactttcaaa cctttatata tataagttag cagtaattgc 2460
taatatgaaa ttacagagtt tatcttcatg cggtgatata gcagtaagtg tttattcagg 2520
ttggttagct tattctacat ttgaccatga atgggtaaaa caccagatag aagatacaac 2580
agttgaagaa gtacttatta aaaattggcc tggattacac atagagccac ttcaagctcc 2640
tgaaaatatg gaagttctta taggttggac aggtagtcca gctagtagtc ctcattttgt 2700
ttctgaagtt aaaagactta agtcagatcc ttcattttac ggtgatttct tagaagattc 2760
acatagatgt gtagaaaaat taattcatgc attcaaaact aataatatta agggtgttca 2820
gaaaatggta agacagaata gaactattat acaaagaatg gataaggaag caacagttga 2880
tatagagact gagaagttaa aatatttatg tgatattgct gaaaaatatc atggtgcaag 2940
taaaacttca ggtgctggtg gtggtgattg cggaataact ataataaata aggatgtaga 3000
caaagagaaa atatatgatg aatggactaa acatggaata aagcctctta agtttaatat 3060
ttatcatgga caataaccat ggtcaataat cttacaataa ataaaagaaa ggaggcaaaa 3120
atatgataaa atctggaaaa gcaagagcac acactaatat agcacttata aaatattggg 3180
gtaagaaaga tgaggcatta ataataccaa tgaataactc aatatcagta actttagaaa 3240
agttttatac tgaaacaaaa gttacattta acgatcagct tactcaagat caattttggc 3300
ttaatggtga aaaagtttct ggaaaagaat tagaaaagat ttcaaagtat atggatattg 3360
ttagaaatag agctggaata gattggtatg ctgagataga atctgataat tttgttccta 3420
cagctgctgg tcttgctagt tctgctagtg cttatgcagc attagctgct gcatgtaacc 3480
aagcacttga tttacagtta agtgataaag acttaagtag attagctaga attggatcag 3540
gatcagcatc aagatcaata tacggtggtt ttgcagaatg ggaaaaagga tataatgacg 3600
aaacttctta tgctgttcca ttagaaagta atcactttga agatgatctt gctatgattt 3660
ttgtagtaat aaaccaacat tctaaaaagg ttccttcaag atatggaatg tctcttacaa 3720
gaaatacaag tagattctat caatattggt tagaccatat tgatgaagat cttgcagaag 3780
caaaggcagc aatacaagat aaggatttta agagattagg tgaagttatt gaagagaatg 3840
gacttagaat gcatgctaca aatcttggat caactccacc ttttacttac ttagtacaag 3900
agtcatacga tgtaatggca ttagtacatg agtgtagaga agcaggatat ccatgctatt 3960
tcactatgga tgctggacct aatgtaaaaa tacttgtaga gaagaaaaac aaacaacaga 4020
taatagataa acttttaact cagttcgata ataatcagat aatagatagt gatattatag 4080
ctacaggtat tgaaattata gaataaacta gttgtatatt aaaatagtag aatacataag 4140
atacttaatt taattaaaga tagttaagta cttttcaatg tgctttttta gatgtttaat 4200
acaaatcttt aattgtaaaa gaaatgctgt actatttact gttctagtga cgggattaaa 4260
ctgtattaat tataaataaa aaataagtac agttgtttaa aattatattt tgtattaaat 4320
ctaatagtac gatgtaagtt attttatact attgctagtt taataaaaag atttaattat 4380
atacttgaaa aggagaggaa ctcgagatgg cagagtatat aatagcagta gatgagttcg 4440
ataacgaaat aggatcaata gaaaagatgg aagctcatag aaaaggaaca cttcatagag 4500
cattcagtat tttagttttt aactcaaaga atcaactttt attacagaaa agaaatgtaa 4560
agaaatatca ctctccagga ttatggacaa acacttgttg tagtcaccca agatatggtg 4620
aatctcttca tgatgctata tacagaagat taaaagaaga gatgggattt acttgcgaac 4680
ttgaagaagt attctcattc atatataagg taaaacttga agataattta tttgagaatg 4740
aatatgacca tgtatttatt ggtaaatatg atggtgagat aattgttaat aaagatgaag 4800
ttgatgattt taaatgggta gacattaatg aagttaaaaa ggacataata gaaagacctg 4860
aggcatatac ttactggttt aagtatcttg taaataaagc tgaaaataag atatttaaat 4920
aaaccggtca gtaacgaata gaattagaaa aacaaaggag gcaagacaat ggatttccca 4980
caacaattag aagcatgtgt aaaacaggct aatcaggcac ttagtagatt tattgctcct 5040
cttccttttc aaaatacacc agtagtagaa actatgcaat acggtgcact tttaggtggt 5100
aaaagattaa gaccattctt agtatatgct acaggacaca tgtttggtgt atcaactaat 5160
actttagacg ctccagctgc tgctgttgaa tgtattcatg cttattcttt aatacatgat 5220
gacttaccag caatggatga cgatgattta agaagaggtt tacctacatg tcatgttaaa 5280
tttggtgaag ctaatgcaat tttagcaggt gacgctttac aaactttagc tttttctata 5340
ctttcagatg cagacatgcc tgaagtttca gatagagata gaatttctat gatatcagag 5400
cttgcatctg catcaggaat agctggaatg tgcggtggtc aagcacttga tttagatgca 5460
gaaggtaaac acgtaccact tgatgcttta gagagaatac atagacataa aacaggtgct 5520
cttataagag cagcagtaag attaggtgct ttaagtgctg gtgacaaggg tagaagagca 5580
cttccagtac ttgataagta tgcagaaagt ataggattag cttttcaagt tcaagatgac 5640
atacttgacg ttgttggtga tactgctact ttaggaaaaa gacagggtgc agatcagcaa 5700
ttaggaaaat ctacataccc tgctttactt ggattagaac aggctagaaa gaaagcaaga 5760
gacttaatag atgacgcaag acaaagtctt aaacagttag ctgaacaatc acttgacaca 5820
agtgcacttg aagcacttgc agattatatt atacagagaa acaagtaaaa gcttttaaag 5880
gaggggaaaa aatggaattt agagtacatt tacaggcaga caacgaacag aaaatatttc 5940
aaaatcaaat gaaaccagag ccagaagcat catatcttat aaatcaaaga agaagtgcta 6000
attataaacc aaacatttgg aaaaacgatt ttcttgatca gtctttaata tcaaaatatg 6060
atggtgatga atatagaaaa ctttcagaaa agttaataga agaagtaaag atatacatat 6120
cagcagagac tatggattta gttgctaaat tagaacttat agattctgtt agaaaacttg 6180
gacttgctaa tctttttgag aaagaaataa aggaagcatt agacagtata gcagcaatag 6240
aatcagataa tttaggaact agagacgatc tttatggaac agctcttcat tttaagattc 6300
ttagacagca tggatataag gtaagtcaag atatatttgg tagatttatg gatgagaaag 6360
gaacattaga aaatcatcac tttgcacact taaaaggaat gttagaatta tttgaggcaa 6420
gtaatcttgg atttgaaggt gaagacatat tagatgaagc taaagcatct cttacacttg 6480
ctcttagaga ttcaggacat atttgttatc cagactcaaa cttaagtaga gatgtagttc 6540
atagtttaga attacctagt catagaagag ttcaatggtt cgatgtaaaa tggcagatta 6600
atgcatacga aaaagatatt tgtagagtaa atgcaacttt attagagtta gcaaagttaa 6660
attttaatgt tgttcaagct cagcttcaga agaatcttag agaagctagt agatggtggg 6720
ctaatcttgg tttcgcagat aatttaaagt ttgctagaga tagacttgta gagtgttttt 6780
catgcgcagt aggtgtagca tttgaaccag agcattcatc ttttagaata tgtttaacta 6840
aggtaattaa tcttgttctt attatagatg atgtatacga tatatatgga tctgaagaag 6900
agttaaaaca ttttacaaat gctgttgata gatgggacag tagagaaaca gaacagcttc 6960
ctgaatgcat gaaaatgtgt tttcaagtat tatataacac tacttgcgaa atagcaagag 7020
agatagaaga agaaaacggt tggaatcaag tattacctca acttactaag gtttgggctg 7080
atttttgtaa ggctctttta gttgaagcag agtggtacaa taaatcacat attccaacat 7140
tagaagaata tcttagaaac ggatgtatat caagtagtgt atctgtactt ttagttcact 7200
ctttcttttc aataactcat gaaggtacaa aagaaatggc tgatttctta cataaaaatg 7260
aagatctttt atacaacata agtcttatag taagattaaa caatgattta ggtacatcag 7320
ctgctgaaca ggaaagaggt gattctcctt cttctatagt ttgctatatg agagaagtta 7380
atgcttctga agagactgca agaaagaata taaagggaat gattgataat gcttggaaaa 7440
aggttaatgg aaaatgtttc acaactaacc aagttccatt tctttcatca ttcatgaata 7500
atgcaactaa catggcaaga gtagcacact cattatataa agacggtgat ggttttggtg 7560
atcaagaaaa aggacctaga acacatattc ttagtttatt attccaacct ttagtaaatt 7620
aagctagcat aaaaataaga agcctgcatt tgcaggcttc ttatttttat ggcgcgccgc 7680
cattattttt ttgaacaatt gacaattcat ttcttatttt ttattaagtg atagtcaaaa 7740
ggcataacag tgctgaatag aaagaaattt acagaaaaga aaattataga atttagtatg 7800
attaattata ctcatttatg aatgtttaat tgaatacaaa aaaaaatact tgttatgtat 7860
tcaattacgg gttaaaatat agacaagttg aaaaatttaa taaaaaaata agtcctcagc 7920
tcttatatat taagctacca acttagtata taagccaaaa cttaaatgtg ctaccaacac 7980
atcaagccgt tagagaactc tatctatagc aatatttcaa atgtaccgac atacaagaga 8040
aacattaact atatatattc aatttatgag attatcttaa cagatataaa tgtaaattgc 8100
aataagtaag atttagaagt ttatagcctt tgtgtattgg aagcagtacg caaaggcttt 8160
tttatttgat aaaaattaga agtatattta ttttttcata attaatttat gaaaatgaaa 8220
gggggtgagc aaagtgacag aggaaagcag tatcttatca aataacaagg tattagcaat 8280
atcattattg actttagcag taaacattat gacttttata gtgcttgtag ctaagtagta 8340
cgaaaggggg agctttaaaa agctccttgg aatacataga attcataaat taatttatga 8400
aaagaagggc gtatatgaaa acttgtaaaa attgcaaaga gtttattaaa gatactgaaa 8460
tatgcaaaat acattcgttg atgattcatg ataaaacagt agcaacctat tgcagtaaat 8520
acaatgagtc aagatgttta cataaaggga aagtccaatg tattaattgt tcaaagatga 8580
accgatatgg atggtgtgcc ataaaaatga gatgttttac agaggaagaa cagaaaaaag 8640
aacgtacatg cattaaatat tatgcaagga gctttaaaaa agctcatgta aagaagagta 8700
aaaagaaaaa ataatttatt tattaattta atattgagag tgccgacaca gtatgcacta 8760
aaaaatatat ctgtggtgta gtgagccgat acaaaaggat agtcactcgc attttcataa 8820
tacatcttat gttatgatta tgtgtcggtg ggacttcacg acgaaaaccc acaataaaaa 8880
aagagttcgg ggtagggtta agcatagttg aggcaactaa acaatcaagc taggatatgc 8940
agtagcagac cgtaaggtcg ttgtttaggt gtgttgtaat acatacgcta ttaagatgta 9000
aaaatacgga taccaatgaa gggaaaagta taatttttgg atgtagtttg tttgttcatc 9060
tatgggcaaa ctacgtccaa agccgtttcc aaatctgcta aaaagtatat cctttctaaa 9120
atcaaagtca agtatgaaat cataaataaa gtttaatttt gaagttatta tgatattatg 9180
tttttctatt aaaataaatt aagtatatag aatagtttaa taatagtata tacttaatgt 9240
gataagtgtc tgacagtgtc acagaaagga tgattgttat ggattataag cggccggcca 9300
gtgggcaagt tgaaaaattc acaaaaatgt ggtataatat ctttgttcat tagagcgata 9360
aacttgaatt tgagagggaa cttagatggt atttgaaaaa attgataaaa atagttggaa 9420
cagaaaagag tattttgacc actactttgc aagtgtacct tgtacctaca gcatgaccgt 9480
taaagtggat atcacacaaa taaaggaaaa gggaatgaaa ctatatcctg caatgcttta 9540
ttatattgca atgattgtaa accgccattc agagtttagg acggcaatca atcaagatgg 9600
tgaattgggg atatatgatg agatgatacc aagctataca atatttcaca atgatactga 9660
aacattttcc agcctttgga ctgagtgtaa gtctgacttt aaatcatttt tagcagatta 9720
tgaaagtgat acgcaacggt atggaaacaa tcatagaatg gaaggaaagc caaatgctcc 9780
ggaaaacatt tttaatgtat ctatgatacc gtggtcaacc ttcgatggct ttaatctgaa 9840
tttgcagaaa ggatatgatt atttgattcc tatttttact atggggaaat attataaaga 9900
agataacaaa attatacttc ctttggcaat tcaagttcat cacgcagtat gtgacggatt 9960
tcacatttgc cgttttgtaa acgaattgca ggaattgata aatagttaac ttcaggtttg 10020
tctgtaacta aaaacaagta tttaagcaaa aacatcgtag aaatacggtg ttttttgtta 10080
ccctaagttt 10090
<210> 92
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸repHF
<400> 92
aagaagggcg tatatgaaaa cttgt 25
<210> 93
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸catR
<400> 93
ttcgtttaca aaacggcaaa tgtga 25
<210> 94
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸MK-RTPCR-F
<400> 94
gtgctggtag aggtggttca 20
<210> 95
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸MK-RTPCR-R
<400> 95
ccaagtatgt gctgcaccag 20
<210> 96
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸PMK-RTPCR-F
<400> 96
atatcagacc cacacgcagc 20
<210> 97
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸PMK-RTPCR-R
<400> 97
aatgcttcat tgctatgtca catg 24
<210> 98
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸PMD-RTPCR-F
<400> 98
gcagaagcaa aggcagcaat 20
<210> 99
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸PMD-RTPCR-R
<400> 99
ttgatccaag atttgtagca tgc 23
<210> 100
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸idi-RTPCR-F
<400> 100
ggacaaacac ttgttgtagt cacc 24
<210> 101
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸idi-RTPCR-R
<400> 101
tcaagttcgc aagtaaatcc ca 22
<210> 102
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸ispA-RTPCR-F
<400> 102
accagcaatg gatgacgatg 20
<210> 103
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸ispA-RTPCR-R
<400> 103
agtttgtaaa gcgtcacctg c 21
<210> 104
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸FS-RTPCR-F
<400> 104
aagctagtag atggtgggct 20
<210> 105
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸FS-RTPCR-R
<400> 105
aatgctacac ctactgcgca 20
<210> 106
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸ermB-F
<400> 106
tttgtaatta agaaggag 18
<210> 107
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸ermB-R
<400> 107
gtagaatcct tcttcaac 18
<210> 108
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸GnK-F
<400> 108
tcaggacctt ctggaactgg 20
<210> 109
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸GnK-R
<400> 109
acctcccctt ttcttggaga 20
<210> 110
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸FoT4L-F
<400> 110
caggtttcgg tgctgaccta 20
<210> 111
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸FoT4L-F
<400> 111
aactccgccg ttgtatttca 20

Claims (15)

1.一种通过微生物发酵产生一种或多种萜烯和/或其前体的方法，所述方法包括向包含重组的一氧化碳营养产乙酸细菌的培养物的生物反应器中提供包含CO的气态底物且在厌氧条件下发酵所述培养物以从所述气态底物产生一种或多种萜烯和/或其前体，
其中所述细菌包含一种或多种编码以下酶的外源性核酸：
(a)甲羟戊酸途径中的酶，其选自硫解酶；HMG-CoA合酶；HMG-CoA还原酶；甲羟戊酸激酶；磷酸甲羟戊酸激酶；和二磷酸甲羟戊酸脱羧酶；
(b)DXS途径中的酶，其选自1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶DXS；1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶DXR；2-C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸胞苷酰基转移酶IspD；4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藻糖醇激酶IspE；2-C-甲基-D-赤藻糖醇2,4-环二磷酸合酶IspF；4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合酶IspG；和4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶；或
(c)萜烯生物合成途径中的酶，其选自香叶基转移酶Fps；七异戊烯基二磷酸合酶；八异戊烯基二磷酸合酶；异戊二烯合酶；异戊烯基二磷酸δ-异构酶；和法呢烯合酶。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述细菌为梭菌属(Clostridium)细菌。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述细菌选自自产乙醇梭菌(Clostridiumautoethanogenum)、杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、拉氏梭菌(Clostridiumragsdalei)、食一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)、德雷克氏梭菌(Clostridium drakei)、粪味梭菌(Clostridium scatologenes)、醋酸梭菌(Clostridiumaceticum)、蚁酸醋酸梭菌(Clostridium formicoaceticum)、大梭菌(Clostridiummagnum)、食甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)、巴氏嗜碱菌(Alkalibaculum bacchii)、延长布劳特氏菌(Blautia producta)、粘液真杆菌(Eubacterium limosum)、热醋穆尔氏菌(Moorellathermoacetica)、热自养穆尔氏菌(Moorella thermautotrophica)、卵形鼠孢菌(Sporomusa ovata)、森林乙酸香蕉孢菌(Sporomusa silvacetica)、类球鼠孢菌(Sporomusa sphaeroides)、普氏产醋杆菌(Oxobacter pfennigii)和凯伍热厌氧杆状菌(Thermoanaerobacter kiuvi)。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述细菌选自自产乙醇梭菌、杨氏梭菌和拉氏梭菌。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述萜烯或其前体选自甲羟戊酸、焦磷酸异戊烯酯(IPP)、焦磷酸二甲基烯丙酯(DMAPP)、异戊二烯、焦磷酸香叶酯(GPP)、焦磷酸法呢酯(FPP)和法呢烯。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述萜烯或其前体是异戊二烯，且所述细菌包含编码异戊二烯合酶的外源性核酸。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述异戊二烯合酶是美洲山杨(Populustremuloides)异戊二烯合酶。
8.如权利要求1所述的方法，其中萜烯或其前体是焦磷酸异戊烯酯(IPP)，且其中所述细菌包含编码异戊烯基二磷酸δ-异构酶的外源性核酸。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述异戊烯基二磷酸δ-异构酶是拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)异戊烯基二磷酸δ异构酶。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述细菌包含编码异戊二烯合酶、异戊烯基二磷酸δ异构酶和1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶DXS的外源性核酸。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述气态底物包含至少20％的CO。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述气态底物还包含CO2。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述气态底物还包含H2。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述气态底物来源于选自铁金属产品制备、石油精炼、煤的气化、电力生产、炭黑生产、氨生产、甲醇生产和焦炭制备的工业过程。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述气态底物是合成气。
CN202010130561.9A 2012-06-01 2013-06-04 重组代谢微生物及其用途 Pending CN111304260A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261654412P 2012-06-01 2012-06-01
US61/654,412 2012-06-01
CN201380041086.6A CN104822823B8 (zh) 2012-06-01 2013-06-04 重组代谢微生物及其用途

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380041086.6A Division CN104822823B8 (zh) 2012-06-01 2013-06-04 重组代谢微生物及其用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111304260A true CN111304260A (zh) 2020-06-19

Family

ID=49670710

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010082952.8A Pending CN111218418A (zh) 2012-06-01 2013-06-04 重组代谢微生物及其用途
CN201380041086.6A Active CN104822823B8 (zh) 2012-06-01 2013-06-04 重组代谢微生物及其用途
CN202010130561.9A Pending CN111304260A (zh) 2012-06-01 2013-06-04 重组代谢微生物及其用途

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010082952.8A Pending CN111218418A (zh) 2012-06-01 2013-06-04 重组代谢微生物及其用途
CN201380041086.6A Active CN104822823B8 (zh) 2012-06-01 2013-06-04 重组代谢微生物及其用途

Country Status (10)

Country Link
US (5) US20130323820A1 (zh)
EP (3) EP3346008B1 (zh)
JP (2) JP6643083B2 (zh)
CN (3) CN111218418A (zh)
DK (2) DK3346008T3 (zh)
EA (1) EA028892B1 (zh)
ES (2) ES2674984T3 (zh)
IN (1) IN2014DN10236A (zh)
PL (2) PL3346008T3 (zh)
WO (1) WO2013180584A1 (zh)

Families Citing this family (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130323820A1 (en) * 2012-06-01 2013-12-05 Lanzatech New Zealand Limited Recombinant microorganisms and uses therefor
CN111621453A (zh) * 2012-10-23 2020-09-04 积水化学工业株式会社 重组细胞以及异戊二烯的生产方法
RU2013146377A (ru) * 2013-10-17 2015-04-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИЗОПРЕНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ РОДА Bacillus
HUE051262T2 (hu) 2014-01-28 2021-03-01 Lanzatech New Zealand Ltd Módszer rekombináns mirkoorganizmus elõállítására
KR102533454B1 (ko) * 2014-01-30 2023-05-17 란자테크 엔지, 인크. 재조합 미생물 및 이들의 사용 방법
JP6325862B2 (ja) * 2014-03-25 2018-05-16 積水化学工業株式会社 組換え細胞、並びに、環式モノテルペンの生産方法
JP2016059313A (ja) * 2014-09-17 2016-04-25 積水化学工業株式会社 組換え細胞、並びに、イソプレン又は環式イソプレノイドの生産方法
US9834792B2 (en) 2014-10-22 2017-12-05 Lanzatech New Zealand Limited Multi-stage bioreactor processes
CN107076714B (zh) 2014-10-22 2019-12-10 朗泽科技新西兰有限公司 气体测试单元和方法
PT3230459T (pt) * 2014-12-08 2020-12-18 Lanzatech New Zealand Ltd Microrganismos recombinantes que exibem fluxo aumentado através de uma via de fermentação
EP3262153A4 (en) 2015-02-23 2018-07-04 Lanzatech New Zealand Limited Recombinant acetogenic bacterium for the conversion of methane to products
DE102015103608A1 (de) * 2015-03-11 2016-09-15 Basf Se Verfahren zur mikrobiellen de novo Synthese von Terpenen
US20190017076A1 (en) 2015-08-17 2019-01-17 Invista North America S.A.R.L. Methods, cells and reagents for production of isoprene, derivatives and intermediates thereof
WO2017029549A2 (en) 2015-08-17 2017-02-23 Conradie Alex Van Eck Methods, hosts, and reagents related thereto for production of unsaturated pentahydrocarbons, derivatives and intermediates thereof
CN108884467A (zh) 2015-10-13 2018-11-23 朗泽科技新西兰有限公司 包含产能发酵途径的基因工程菌
EP3385378A4 (en) * 2015-11-30 2019-04-24 Sekisui Chemical Co., Ltd. RECOMBINANT CELL, PROCESS FOR PRODUCING THE RECOMBINANT CELL, AND PROCESS FOR PRODUCING AN ORGANIC COMPOUND
EP3981869A1 (en) 2015-12-03 2022-04-13 LanzaTech NZ, Inc. Arginine as sole nitrogen source for c1-fixing microorganism
US10358661B2 (en) 2015-12-28 2019-07-23 Lanzatech New Zealand Limited Microorganism with modified hydrogenase activity
EP4234707A3 (en) 2016-02-01 2024-06-05 LanzaTech NZ, Inc. Integrated fermentation and electrolysis process
CA3015665C (en) 2016-02-26 2020-09-22 Lanzatech New Zealand Limited Crispr/cas systems for c1-fixing bacteria
EP3464559A4 (en) 2016-05-14 2020-02-12 Lanzatech, Inc. MODIFIED ALDEHYDE / FERREDOXIN OXYDOREDUCTASE MICROORGANISM AND RELATED METHODS
JPWO2018070141A1 (ja) * 2016-10-13 2019-08-08 積水化学工業株式会社 偏性嫌気性酢酸生成微生物、並びに、組換え微生物
KR102000755B1 (ko) * 2016-12-27 2019-07-17 한국과학기술원 외부 유전자가 도입된 재조합 미생물 및 상기 미생물을 이용하여 개미산과 이산화탄소로부터 유용물질을 제조하는 방법
GB201701548D0 (en) * 2017-01-31 2017-03-15 Univ Manchester Process for producing monoterpenes
WO2018155272A1 (ja) 2017-02-27 2018-08-30 積水化学工業株式会社 組換え細胞、組換え細胞の製造方法、並びに、イソプレン又はテルペンの生産方法
WO2019006257A1 (en) * 2017-06-30 2019-01-03 Invista North America .S.A.R.L. METHODS, SYNTHETIC HOSTS AND REAGENTS FOR HYDROCARBON BIOSYNTHESIS
WO2019006255A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Invista North America S.A.R.L. METHODS, MATERIALS, SYNTHETIC HOSTS AND REAGENTS FOR HYDROCARBON BIOSYNTHESIS AND DERIVATIVES
WO2019051069A1 (en) 2017-09-08 2019-03-14 Lanzatech, Inc. METHODS AND SYSTEMS FOR PRODUCING METABOLITES USING SUBSTRATES CONTAINING C1 COMPOUNDS RICH IN HYDROGEN
US11505809B2 (en) 2017-09-28 2022-11-22 Inv Nylon Chemicals Americas Llc Organisms and biosynthetic processes for hydrocarbon synthesis
CN109722404B (zh) * 2017-10-30 2021-03-12 中国石油化工股份有限公司 利用纤维素制备金合欢烯的工程菌株及方法
JP2021505154A (ja) 2017-12-07 2021-02-18 ザイマージェン インコーポレイテッド 発酵によって（６ｅ）−８−ヒドロキシゲラニオールを生産するための設計された生合成経路
US11555209B2 (en) 2017-12-19 2023-01-17 Lanzatech, Inc. Microorganisms and methods for the biological production of ethylene glycol
CN111868047A (zh) 2017-12-21 2020-10-30 齐默尔根公司 荆芥内半缩醛氧化还原酶、荆芥内半缩醛合酶和能够产生荆芥内酯的微生物
EP3752276A4 (en) 2018-02-12 2021-11-17 Lanzatech, Inc. METHODS FOR IMPROVING CARBON CONVERSION EFFICIENCY
KR102122898B1 (ko) * 2018-02-26 2020-06-15 주식회사 엠디헬스케어 블라우티아 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도
CA3097019A1 (en) 2018-04-20 2019-10-24 Lanzatech, Inc. Intermittent electrolysis streams
CA3120151C (en) 2018-11-19 2024-04-30 Lanzatech, Inc. Integration of fermentation and gasification
MY196166A (en) 2019-02-08 2023-03-17 Lanzatech Inc Process For Recovering Close Boiling Products
CN109666683B (zh) * 2019-02-27 2021-10-29 昆明理工大学 乙酰辅酶A乙酰转移酶基因RKAcaT2及其应用
US20220145336A1 (en) 2019-03-20 2022-05-12 Global Bioenergies Means and methods for producing isobutene from acetyl-coa
CN109777815B (zh) * 2019-03-28 2021-10-29 昆明理工大学 HMG-CoA合成酶基因RKHMGCS及其应用
CA3138589C (en) 2019-07-11 2024-04-02 Lanzatech, Inc. Methods for optimizing gas utilization
CN110702821B (zh) * 2019-11-26 2022-06-07 四川大学华西医院 一种慢性阻塞性肺疾病分型检测试剂盒
CA3167620A1 (en) 2020-02-17 2021-08-26 Hai HE Method for the incorporation of formaldehyde into biomass
JP2023520257A (ja) 2020-06-06 2023-05-16 ランザテク，インコーポレイテッド アセトラクテートデカルボキシラーゼ遺伝子座位でのノックインを有する微生物
CA3195088C (en) 2021-02-08 2024-04-23 Fungmin Liew Recombinant microorganisms and their use in the production of 3-hydroxypropionate [3-hp]
CN115181803A (zh) * 2021-04-07 2022-10-14 暨南大学 检测多子小瓜虫的Taqman探针qPCR检测引物组和应用
TW202307202A (zh) 2021-08-06 2023-02-16 美商朗澤科技有限公司 用於改良乙二醇之生物產生的微生物及方法
EP4399284A1 (en) 2021-09-06 2024-07-17 Global Bioenergies Organisms producing less crotonic acid
EP4144838A1 (en) 2021-09-06 2023-03-08 Global Bioenergies Organisms producing less crotonic acid
US12091648B2 (en) 2021-11-03 2024-09-17 Lanzatech, Inc. System and method for generating bubbles in a vessel
US12077800B2 (en) 2022-06-16 2024-09-03 Lanzatech, Inc. Liquid distributor system and process of liquid distribution

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1630718A (zh) * 2001-06-06 2005-06-22 Dsmip资产公司 改进的类异戊二烯生产
WO2009111513A1 (en) * 2008-03-03 2009-09-11 Joule Biotechnologies, Inc. Engineered co2 fixing microorganisms producing carbon-based products of interest
US20110236941A1 (en) * 2010-10-22 2011-09-29 Lanzatech New Zealand Limited Recombinant microorganism and methods of production thereof

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2002A (en) 1841-03-12 Tor and planter for plowing
US5173429A (en) 1990-11-09 1992-12-22 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Clostridiumm ljungdahlii, an anaerobic ethanol and acetate producing microorganism
US5593886A (en) 1992-10-30 1997-01-14 Gaddy; James L. Clostridium stain which produces acetic acid from waste gases
US6531303B1 (en) * 1998-07-06 2003-03-11 Arkion Life Sciences Llc Method of producing geranylgeraniol
UA72220C2 (uk) 1998-09-08 2005-02-15 Байоенджініерінг Рісорсиз, Інк. Незмішувана з водою суміш розчинник/співрозчинник для екстрагування оцтової кислоти, спосіб одержання оцтової кислоти (варіанти), спосіб анаеробного мікробного бродіння для одержання оцтової кислоти (варіанти), модифікований розчинник та спосіб його одержання
DK1303629T3 (da) 2000-07-25 2006-10-30 Emmaus Foundation Inc Fremgangsmåde til forögelse af ethanolproduktion fra mikrobiel fermetering
US8114645B2 (en) * 2006-05-19 2012-02-14 The Regents Of The University Of California Methods for increasing isoprenoid and isoprenoid precursor production by modulating fatty acid levels
US7704723B2 (en) 2006-08-31 2010-04-27 The Board Of Regents For Oklahoma State University Isolation and characterization of novel clostridial species
WO2008039499A2 (en) * 2006-09-26 2008-04-03 The Regents Of The University Of California Production of isoprenoids and isoprenoid precursors
JP2010525816A (ja) * 2007-05-01 2010-07-29 アシドフィル，エルエルシー 代謝改変光合成微生物を用いて二酸化炭素を炭化水素に直接変換する方法
BRPI0816951B1 (pt) * 2007-09-20 2023-01-17 Amyris, Inc Método para produzir um composto isoprenóide
US20090082495A1 (en) * 2007-09-20 2009-03-26 Rene Jean Zimmer Pneumatic Tire
BRPI0820556B1 (pt) 2007-11-13 2016-03-22 Lanzatech New Zealand Ltd bactéria e métodos para uso das mesmas
SG191671A1 (en) * 2007-12-13 2013-07-31 Danisco Us Inc Cultured cells that produce isoprene and methods for producing isoprene
EP2245137B1 (en) * 2008-01-22 2017-08-16 Genomatica, Inc. Methods and organisms for utilizing synthesis gas or other gaseous carbon sources and methanol
WO2010019696A2 (en) * 2008-08-12 2010-02-18 Allylix, Inc. Method for production of isoprenoids
US8895288B2 (en) * 2008-12-30 2014-11-25 Danisco Us Inc. Methods of producing isoprene and a co-product
TWI427149B (zh) * 2009-06-17 2014-02-21 Danisco Us Inc 使用ｄｘｐ及ｍｖａ途徑之改良之異戊二烯製造
US8759047B2 (en) * 2009-09-16 2014-06-24 Coskata, Inc. Process for fermentation of syngas from indirect gasification
US8143037B2 (en) 2010-03-19 2012-03-27 Coskata, Inc. Ethanologenic Clostridium species, Clostridium coskatii
CN103025688A (zh) * 2010-06-17 2013-04-03 丹尼斯科美国公司 包含异戊二烯衍生物的燃料组合物
US8987431B2 (en) * 2010-07-01 2015-03-24 Coskata, Inc. Essential genes encoding conserved metabolic pathway function in autotrophic solventogenic clostridial species
US20120045812A1 (en) * 2010-08-06 2012-02-23 Danisco Us Inc. PRODUCTION OF ISOPRENE UNDER NEUTRAL pH CONDITIONS
CN103415618A (zh) * 2010-08-19 2013-11-27 新西兰郎泽科技公司 使用对含一氧化碳的底物的微生物发酵来生产化学物质的方法
WO2012034023A2 (en) * 2010-09-10 2012-03-15 University Of Delaware Recombinant clostridia that fix co2 and co and uses thereof
US20110256600A1 (en) * 2011-02-02 2011-10-20 Lanzatech New Zealand Limited Recombinant Microorganisms and Methods of Use Thereof
EP2678432B1 (en) 2011-02-25 2018-08-01 Lanzatech New Zealand Limited Recombinant microorganisms and uses therefor
CA2850794A1 (en) * 2011-10-07 2013-04-11 Danisco Us Inc. Methods for increasing microbial production of isoprene, isoprenoids, and isoprenoid precursor molecules using glucose and acetate co-metabolism
WO2013181647A2 (en) * 2012-06-01 2013-12-05 Danisco Us Inc. Compositions and methods of producing isoprene and/or industrrial bio-products using anaerobic microorganisms
US20130323820A1 (en) * 2012-06-01 2013-12-05 Lanzatech New Zealand Limited Recombinant microorganisms and uses therefor
US20150152441A1 (en) 2013-11-29 2015-06-04 Lanzatech New Zealand Limited Methods and systems for improving fermentation efficiency

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1630718A (zh) * 2001-06-06 2005-06-22 Dsmip资产公司 改进的类异戊二烯生产
WO2009111513A1 (en) * 2008-03-03 2009-09-11 Joule Biotechnologies, Inc. Engineered co2 fixing microorganisms producing carbon-based products of interest
US20110236941A1 (en) * 2010-10-22 2011-09-29 Lanzatech New Zealand Limited Recombinant microorganism and methods of production thereof

Also Published As

Publication number Publication date
IN2014DN10236A (zh) 2015-08-07
CN104822823B8 (zh) 2020-05-22
US11459589B2 (en) 2022-10-04
JP6643083B2 (ja) 2020-02-12
EP2855662A1 (en) 2015-04-08
US20230013524A1 (en) 2023-01-19
US20130323820A1 (en) 2013-12-05
US20210062229A1 (en) 2021-03-04
EP3346008B1 (en) 2020-10-07
EP3795680A1 (en) 2021-03-24
US20180142265A1 (en) 2018-05-24
ES2841725T3 (es) 2021-07-09
US10913958B2 (en) 2021-02-09
WO2013180584A1 (en) 2013-12-05
CN111218418A (zh) 2020-06-02
DK3346008T3 (da) 2021-01-11
CN104822823B (zh) 2020-02-14
EA028892B1 (ru) 2018-01-31
CN104822823A (zh) 2015-08-05
EP2855662B1 (en) 2018-03-21
EA201492206A1 (ru) 2015-09-30
JP6636550B2 (ja) 2020-01-29
EP3346008A1 (en) 2018-07-11
US20150191747A1 (en) 2015-07-09
JP2015519065A (ja) 2015-07-09
PL2855662T3 (pl) 2018-08-31
PL3346008T3 (pl) 2021-04-19
EP2855662A4 (en) 2015-12-30
DK2855662T3 (en) 2018-06-25
ES2674984T3 (es) 2018-07-05
JP2018110584A (ja) 2018-07-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK2855662T3 (en) RECOMBINANT MICROORGANISMS AND APPLICATIONS THEREOF
KR102121886B1 (ko) 재조합 미생물 및 이의 용도
AU2021203008B9 (en) Genetically engineered bacterium comprising energy-generating fermentation pathway
KR101640325B1 (ko) 재조합 미생물에 의한 일산화탄소로부터 부탄올의 제조
KR101511639B1 (ko) 재조합 미생물 및 이의 사용 방법
DK2670846T3 (en) METHODS FOR THE DEVELOPMENT OF TERPEN SYNTHASE VARIETIES
KR20210149060A (ko) Tn7-유사 트랜스포존을 사용한 rna-유도된 dna 통합
KR20120136349A (ko) 고가의 화학적 생성물의 미생물 생산, 및 관련 조성물, 방법 및 시스템
KR20150014953A (ko) 케톨-산 리덕토아이소머라아제 효소 및 사용 방법
KR20140015136A (ko) 3-히드록시프로피온산 및 다른 생성물의 제조 방법
TW201233798A (en) Recombinant microorganisms and methods of use thereof
KR20140092759A (ko) 숙주 세포 및 아이소부탄올의 제조 방법
KR20140113997A (ko) 부탄올 생성을 위한 유전자 스위치
KR20110122672A (ko) 이소프렌 및 공-산물을 제조하는 방법
KR20110076868A (ko) 분리 조건 및/또는 안전한 작업 범위 하에서의 ｃ5 탄화수소가 없는 이소프렌의 제조 방법 및 조성물
DK2768848T3 (en) METHODS AND PROCEDURES FOR EXPRESSION AND SECRETARY OF PEPTIDES AND PROTEINS
JP2024037919A (ja) モルフィナンアルカロイドおよび誘導体を生成する方法
KR20210100585A (ko) 형질전환 생물체 선별용 마커 조성물, 형질전환 생물체 및 형질전환 방법
KR102308556B1 (ko) 변경된 일산화탄소 탈수소효소(codh) 활성을 가지는 유전자 조작된 박테리아
KR102282778B1 (ko) 재조합 미생물 및 이의 사용 방법
KR20230012530A (ko) 이소프레노이드의 생산을 위한 개선된 방법
CN114746549A (zh) 加快细胞内生物学设计的模块化、无细胞蛋白质表达载体

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB03 Change of inventor or designer information
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: M. Copke

Inventor before: Chen Yiting

Inventor before: F.Liu

Inventor before: M. Copke

CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: Illinois, America

Applicant after: LANZATECH NEW ZEALAND Ltd.

Address before: Oakland, New Zealand

Applicant before: LANZATECH NEW ZEALAND Ltd.