JP6636550B2 - 組み換え代謝微生物およびその使用 - Google Patents
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- C12Y202/01007—1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase (2.2.1.7)
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- C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
- C12Y205/0101—(2E,6E)-Farnesyl diphosphate synthase (2.5.1.10), i.e. geranyltranstransferase
-
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- C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
- C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
- C12Y205/0109—All-trans-octaprenyl-diphosphate synthase (2.5.1.90)
-
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- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
- C12Y207/01036—Mevalonate kinase (2.7.1.36)
-
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- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
- C12Y207/01148—4-(Cytidine 5'-diphospho)-2-C-methyl-D-erythritol kinase (2.7.1.148)
-
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- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/04—Phosphotransferases with a phosphate group as acceptor (2.7.4)
- C12Y207/04002—Phosphomevalonate kinase (2.7.4.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12Y207/0706—2-C-Methyl-D-erythritol 4-phosphate cytidylyltransferase (2.7.7.60)
-
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- C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
- C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
- C12Y401/01033—Diphosphomevalonate decarboxylase (4.1.1.33), i.e. mevalonate-pyrophosphate decarboxylase
-
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- C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
- C12Y402/03—Carbon-oxygen lyases (4.2) acting on phosphates (4.2.3)
- C12Y402/03027—Isoprene synthase (4.2.3.27)
-
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- C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
- C12Y402/03—Carbon-oxygen lyases (4.2) acting on phosphates (4.2.3)
- C12Y402/03046—Alpha-farnesene synthase (4.2.3.46)
-
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- C12Y406/00—Phosphorus-oxygen lyases (4.6)
- C12Y406/01—Phosphorus-oxygen lyases (4.6.1)
- C12Y406/01012—2-C-Methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate synthase (4.6.1.12)
-
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-
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Description
生のための組み換え微生物および方法に関する。
基質であり、様々な種類に分けられる。テルペン誘導体としては、炭素骨格の酸化もしく
は再配置、または多数の官能基追加もしくは再配置により形成され得るテルペノイド類(
イソプレノイド類としても知られている)が挙げられる。
スキテルペン類)、アーテミシニン(C15セスキテルペン類)、シトラール(C10モ
ノテルペン類)、カロテノイド類(C40テトラテルペン類)、メントール(C10モノ
テルペン類)、カンファー(C10モノテルペン類)、およびカンナビノイド類が挙げら
れる。
位でテルペン類が使用されるのは樹脂、溶剤、香水、およびビタミン類としてである。た
とえば、イソプレンはたとえばタイヤ産業用の合成ゴム(シス−1,4−ポリイソプレン
)の生産に使用され;ファルネセンは輸送に使用されるエネルギー濃縮ドロップイン燃料
(drop−in fuel)またはジェット燃料として使用され;アルテミシニンはマ
ラリアの薬剤に使用され;かつシトラール、カロテノイド類、メントール、カンファー、
およびカンナビノイド類は医薬品、ブタジエン、および芳香成分の製造に使用される。
から産生されてもよい。たとえば、イソプレンはナフサまたはエチレン生産の石油分解の
副生成物として石油化学的に産生される。多くのテルペン類はまた、天然の供給源から比
較的少量抽出される。しかしながら、これらの産生方法は費用がかかり、持続可能ではな
く、および多くの場合気候変動への寄与を含む環境問題を引き起こす。
能性を制限するために大規模なな安全対策を必要とする。
ペン類および他の関連する産物を産生するための代替手段を少なくとも提供する。
遍的に存在しており、たとえば細菌の細胞壁の生合成に関与し、かつUV光の暴露から葉
を保護するためいくつかの木(たとえばポプラ)により産生される。しかしながら、全て
の細菌が代謝産物としてテルペン類および/またはテルペン類前駆体を産生するために必
要な細胞機構を含むわけではない。たとえば、C.autoethanogenumまた
はC.ljungdahliiなどの酸化炭素栄養性酢酸産生菌(carboxydot
rophic acetogen)は、一酸化炭素を含む基質を発酵させてエタノールな
どの産物を産生できるが、代謝産物としてテルペン類および/またはテルペン類の前駆体
を全く産生かつ発することがないことが知られている。さらに、大部分の細菌は、商業的
に有効なテルペン類を産生しないことが知られている。
たはその前駆体を産生する方法、ならびにこのような方法に使用する組み換え微生物を提
供する。
/またはその前駆体ならびに任意に1つ以上の他の産物を産生できる酸化炭素栄養性酢酸
産生組み換え微生物を提供する。
在しないメバロン酸(MVA)経路中の1つ以上の酵素(本明細書中で外来性酵素と呼ば
れる)を発現するよう適合される。別の実施形態では、本微生物は、組み換え微生物をも
たらす親微生物中に存在するメバロン酸(MVA)経路中の1つ以上の酵素(本明細書中
で内在性酵素)を過剰発現するよう適合される。
(a)メバロン酸(MVA)経路中の1つ以上の外来性酵素を発現しかつ/またはメバ
ロン酸(MVA)経路中の1つ以上の内在性酵素を過剰発現し;かつ
(b)DXS経路中の1つ以上の外来性酵素を発現しかつ/またはDXS経路中の1つ
以上の内在性酵素を過剰発現するよう
適合される。
a)チオラーゼ(EC 2.3.1.9)
b)HMG−CoAシンターゼ(EC 2.3.3.10)
c)HMG−CoAレダクターゼ(EC 1.1.1.88)
d)メバロン酸キナーゼ(EC 2.7.1.36)
e)ホスホメバロン酸キナーゼ(EC 2.7.4.2)
f)メバロン酸ジホスホデカルボキシラーゼ(EC 4.1.1.33)、および
g)機能的に等価であるそれらのいずれかの変異体
からなる群から選択される。
a)1−デオキシ−D−キシルロース−5−リン酸シンターゼ DXS(EC:2.2
.1.7)、
b)1−デオキシ−D−キシルロース 5−リン酸レダクトイソメラーゼ DXR(E
C:1.1.1.267)、
c)2−C−メチル−D−エリスリトール 4−リン酸シチジリルトランスフェラーゼ
IspD (EC:2.7.7.60)、
d)4−ジホスホシチジル−2−C−メチル−D−エリスリトール キナーゼ Isp
E(EC:2.7.1.148)、
e)2−C−メチル−D−エリスリトール 2,4−シクロ二リン酸シンターゼ Is
pF(EC:4.6.1.12)、
f)4−ヒドロキシ−3−メチルブタ −2−エン−1−イル 二リン酸シンターゼ I
spG(EC:1.17.7.1)、
g)4−ヒドロキシ−3−メチルブタ −2−エニル 二リン酸レダクターゼ(EC:1
.17.1.2)、および
h)機能的に等価であるそれらのいずれかの変異体
からなる群から選択される。
過剰発現されてテルペン化合物またはその前駆体の産生をもたらし、この発現される外来
性酵素または過剰発現する内在性酵素は、
a)ゲラニルトランストランスフェラーゼ(EC: 2.5.1.10)、
b)ヘプタプレニル二リン酸シンターゼ(EC:2.5.1.10)、
c)オクタプレニル−二リン酸シンターゼ(EC:2.5.1.90)、
d)イソプレンシンターゼ(EC 4.2.3.27)、
e)イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ(EC 5.3.3.2)、
f)ファルネセンシンターゼ(EC 4.2.3.46/EC 4.2.3.47)、
および
g)機能的に等価であるそれらのいずれかの変異体
からなる群から選択される。
きるがアセチルCoAをメバロン酸またはイソペンテニルピロリン酸(IPP)に変換で
きず、かつ組み換え微生物はメバロン酸経路に関与する1つ以上の酵素を発現するよう適
合される。
IPP、ジメチルアリル二リン酸(DMAPP)、イソプレン、ゲラニルピロリン酸(G
PP)、ファルネシルピロリン酸(FPP)およびファルネセンから選択される。
1つ以上の外来性核酸を含み、かつ1つ以上の内在性核酸は本明細書で前述した酵素の内
の1つ以上をコードする。
である。1つの実施形態では、この調節要素はプロモーターである。1つの実施形態では
、このプロモーターは、構成的プロモーターである。1つの実施形態では、このプロモー
ターは、Wood−Ljungdahlの遺伝子クラスターまたはホスホトランスアセチ
ラーゼ/酢酸キナーゼオペロンプロモーターを含む群から選択される。
よう適合され1つ以上の外来性核酸を含む。1つの実施形態では、微生物は、酵素のうち
少なくとも2つをコードしかつ発現するよう適合され1つ以上の外来性核酸を含む。他の
実施形態では、微生物は、酵素のうち少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ
、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ以上をコードしか
つ発現するよう適合され1つ以上の外来性核酸を含む。
の特定の実施形態では、上記酵素の1つ以上を任意の組み合わせでコードするプラスミド
である。
る。特定の実施形態では、微生物は、Clostridium autoethanog
enum、Clostridium ljungdahlii、Clostridium
ragsdalei、Clostridium carboxidivorans、C
lostridium drakei、Clostridium scatologen
es、Clostridium aceticum、Clostridium form
icoaceticum、Clostridium magnum、Butyribac
terium methylotrophicum、Acetobacterium w
oodii、Alkalibaculum bacchii、Blautia prod
ucta、Eubacterium limosum、Moorella thermo
acetica、Moorella thermautotrophica、Sporo
musa ovata、Sporomusa silvacetica、Sporomu
sa sphaeroides、Oxobacter pfennigii、およびTh
ermoanaerobacter kiuviからなる群から選択される。
numまたはClostridium ljungdahliiである。1つの特定の実
施形態では、微生物はClostridium autoethanogenum DS
M23693である。別の特定の実施形態では、微生物はClostridium lj
ungdahlii DSM13528(またはATCC55383)である。
中の1つ以上の遺伝子を欠いている。1つの実施形態では、親微生物は、
a)チオラーゼ(EC 2.3.1.9)、
b)HMG−CoAシンターゼ(EC 2.3.3.10)、
c)HMG−CoAレダクターゼ(EC 1.1.1.88)、
d)メバロン酸キナーゼ(EC 2.7.1.36)、
e)ホスホメバロン酸キナーゼ(EC 2.7.4.2)、
f)ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ(EC 4.1.1.33)、
g)1−デオキシ−D−キシルロース−5−リン酸シンターゼ DXS(EC:2.2.
1.7)、
h)1−デオキシ−D−キシルロース 5−リン酸レダクトイソメラーゼ DXR(EC
:1.1.1.267)、
i)2−C−メチル−D−エリスリトール 4−リン酸シチジリルトランスフェラーゼ
IspD(EC:2.7.7.60)、
j)4−ジホスホシチジル−2−C−メチル−D−エリスリトール キナーゼ IspE
(EC:2.7.1.148)、
k)2−C−メチル−D−エリスリトール 2,4−シクロ二リン酸シンターゼ Isp
F(EC:4.6.1.12)、
l)4−ヒドロキシ−3−メチルブタ −2−エン−1−イル 二リン酸シンターゼ Is
pG(EC:1.17.7.1)、
m)4−ヒドロキシ−3−メチルブタ −2−エニル 二リン酸レダクターゼ(EC:1.
17.1.2)、および
n)機能的に等価であるそれらのいずれかの変異体
からなる群から選択される酵素をコードする1つ以上の遺伝子を欠いている。
り1つ以上のテルペン類および/またはその前駆体を産生することを可能にする、1つ以
上の酵素をコードする核酸を提供する。
より1つ以上のテルペン類および/またはその前駆体を産生することを可能にする、2つ
以上の酵素をコードする。1つの実施形態では、本発明の核酸は、このような酵素の少な
くとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少な
くとも8つ、少なくとも9つ以上をコードする。
る。1つの実施形態では、1つ以上の酵素は、
a) チオラーゼ(EC 2.3.1.9)、
b) HMG−CoAシンターゼ(EC 2.3.3.10)、
c) HMG−CoAレダクターゼ(EC 1.1.1.88)、
d) メバロン酸キナーゼ(EC 2.7.1.36)、
e) ホスホメバロン酸キナーゼ(EC 2.7.4.2)、
f) ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ(EC 4.1.1.33)、および
g) 機能的に等価であるそれらのいずれかの変異体
からなる群から選択される。
ーゼであってもよい)、HMG−CoAシンターゼおよびHMG−CoAレダクターゼを
コードする。
XS経路中の1つ以上のさらなる酵素をコードする。1つの実施形態では、DXS経路由
来の1つ以上の酵素は、
a) 1−デオキシ−D−キシルロース−5−リン酸シンターゼ DXS(EC:2.
2.1.7)、
b) 1−デオキシ−D−キシルロース 5−リン酸レダクトイソメラーゼ DXR(
EC:1.1.1.267)、
c) 2−C−メチル−D−エリスリトール 4−リン酸シチジリルトランスフェラー
ゼ IspD(EC:2.7.7.60)、
d) 4−ジホスホシチジル−2−C−メチル−D−エリスリトール キナーゼ Is
pE(EC:2.7.1.148)、
e) 2−C−メチル−D−エリスリトール 2,4−シクロ二リン酸シンターゼ
IspF(EC:4.6.1.12)、
f) 4−ヒドロキシ−3−メチルブタ −2−エン−1−イル 二リン酸シンターゼ
IspG(EC:1.17.7.1)、
g) 4−ヒドロキシ−3−メチルブタ −2−エニル 二リン酸レダクターゼ(EC:
1.17.1.2)、および
h) 機能的に等価であるそれらのいずれかの変異体
からなる群から選択される。
前駆体の産生をもたらす1つ以上のさらなる外来性または内在性酵素をコードし、発現す
る外来性核酸または過剰発現する内在性核酸は、
a) ゲラニルトランストランスフェラーゼ Fps(EC:2.5.1.10)、
b) ヘプタプレニル二リン酸シンターゼ(EC:2.5.1.10)、
c) オクタプレニル−二リン酸シンターゼ(EC:2.5.1.90)、
d) イソプレンシンターゼ(EC 4.2.3.27)、
e) イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ(EC 5.3.3.2)、
f) ファルネセンシンターゼ(EC 4.2.3.46 / EC 4.2.3.4
7)、および
g) 機能的に等価であるそれらのいずれかの変異体
からなる群から選択される酵素をコードする。
号40の配列を有するか機能的に等価なその変異体である。
番号41の配列を有するか機能的に等価なその変異体であるアセチルCoA c−アセチ
ルトランスフェラーゼである。
する核酸は配列番号42の配列を有するか機能的に等価なその変異体である。
ドする核酸は配列番号43の配列を有するか機能的に等価なその変異体である。
酸は配列番号51の配列を有するか機能的に等価なその変異体である。
る核酸は配列番号52の配列を有するか機能的に等価なその変異体である。
3)をコードする核酸は配列番号53の配列を有するか機能的に等価なその変異体である
。
S(EC:2.2.1.7)をコードする核酸は配列番号1の配列を有するか機能的に等
価なその変異体である。
ーゼ DXR(EC:1.1.1.267)をコードする核酸は配列番号3の配列を有す
るか機能的に等価なその変異体である。
ランスフェラーゼ IspD(EC:2.7.7.60)をコードする核酸は配列番号5
の配列を有するか機能的に等価なその変異体である。
キナーゼ IspE(EC:2.7.1.148)をコードする核酸は配列番号7の配列
を有するか機能的に等価なその変異体である。
シンターゼ IspF(EC:4.6.1.12)をコードする核酸は配列番号9の配列
を有するか機能的に等価なその変異体である。
酸シンターゼ IspG(EC:1.17.7.1)をコードする核酸は配列番号11の
配列を有するか機能的に等価なその変異体である。
ターゼ(EC:1.17.1.2)をコードする核酸は配列番号13の配列を有するか機
能的に等価なその変異体である。
は配列番号15の配列を有するか、機能的に等価なその変異体である。
17の配列を有するか、機能的に等価なその変異体である。
ゼであるオクタプレニル−二リン酸シンターゼ(EC:2.5.1.90)をコードする
核酸は、配列番号19の配列によりコードされるか、機能的に等価なその変異体である。
21の配列を有するか、機能的に等価なその変異体である。
ードする核酸は配列番号54の配列を有するか、機能的に等価な変異体である。
列を有するか、機能的に等価な変異体である。
a) イソプレンシンターゼ;
b) イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ(idi);
c) 1−デオキシ−D−キシルロース−5−リン酸シンターゼ DXS;
または機能的に等価なそれらの変異体
をコードする。
a) チオラーゼ;
b) HMG−CoAシンターゼ;
c) HMG−CoAレダクターゼ;
d) メバロン酸キナーゼ;
e) ホスホメバロン酸キナーゼ;
f) ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ;
g) イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ(idi);および
h) イソプレンシンターゼ;
または機能的に等価なそれらの変異体
をコードする。
a) ゲラニルトランストランスフェラーゼ Fps;および
b) ファルネセンシンターゼ
または機能的に等価なそれらの変異体
をコードする。
、プロモーターはその制御下で遺伝子の構成的発現を可能にする。特定の実施形態では、
Wood−Ljungdahl clusterプロモーターを使用する。別の特定の実
施形態では、ホスホトランスアセチラーゼ/酢酸キナーゼオペロンプロモーターを使用す
る。1つの特定の実施形態では、プロモーターはC.autoethanogenum由
来である。
ターを提供する。
ーである。1つの特定の実施形態では、発現構築物または発現ベクターはプラスミドであ
る。
築物のうちのいずれか1つ以上を含む宿主生物を提供する。
およびメチル化構築物またはベクターを含む組成物を提供する。
クターはプラスミドである。
含む基質を発酵することを含む微生物発酵による、1つ以上のテルペン類および/または
その前駆体および任意に1つ以上の他の産生物の産生方法を提供する。
(a)本発明の第1の態様の1つ以上の微生物の培養物を含む生物反応器にCOを含む
基質を提供するステップ;および
(b)生物反応器中の培養物を嫌気的に発酵して少なくとも1つのテルペンおよび/ま
たはその前駆体を産生するステップ
を含む。
(a)工業的工程の結果として生成したCO含有気体を補足するステップ;
(b)本発明の第1の態様の1つ以上の微生物を含む培養によりこのCO含有気体を嫌
気的に発酵して少なくとも1つのテルペンおよび/またはその前駆体を産生するステップ
を含む。
IPP、ジメチルアリル二リン酸(DMAPP)、イソプレン、ゲラニルピロリン酸(G
PP)、ファルネシルピロリン酸(FPP)およびファルネセンから選択される。
質は工業廃ガスを含む。特定の実施形態では、気体は製鋼所の排ガスまたは合成ガスであ
る。
O、約20容量%〜約70容量%のCO、約30容量%〜約60容量%のCO、および約
40〜55容量%のCOなどの、COの主要比率を含む。特定の実施形態では、基質は約
25容量%、または約30容量%、または約35容量%、または約40容量%、または約
45容量%、または約50容量%、または約55容量%、または約60容量%のCOを含
む。
1つ以上の他の産物を回収するステップをさらに含む。
ンおよび/またはその前駆体を提供する。1つの実施形態では、1つ以上のテルペンおよ
び/またはその前駆体は、メバロン酸、IPP、ジメチルアリル二リン酸(DMAPP)
、イソプレン、ゲラニルピロリン酸(GPP)、ファルネシルピロリン酸(FPP)およ
びファルネセンからなる群から選択される。
む基質の発酵により微生物が1つ以上のテルペン類および/またはその前駆体ならびに任
意に1つ以上の他の産物を産生できるまたはそれらの産生を増大できるよう、1つ以上の
核酸を導入することにより、酸化炭素栄養性酢酸産生微生物を形質転換することを含み、
親微生物はCOを含む発酵による1つ以上のテルペンおよび/または前駆体を産生できな
い、または低レベルで産生する、方法を提供する。
S経路中の1つ以上の酵素を発現するよう適合され1つ以上の外来性核酸を導入すること
により形質転換される。別の実施形態では、親微生物は、親微生物中に天然に存在するメ
バロン酸(MVA)経路および任意でDXS経路の1つ以上の酵素を過剰発現するよう適
合され1つ以上の核酸を用いて形質転換される。
提供され、細菌はメバロン酸経路またはDXS経路またはテルペン生合成経路中の酵素を
コードする外来性核酸を含み、それにより細菌は酵素を発現する。酵素は、
a) チオラーゼ(EC 2.3.1.9);
b) HMG−CoAシンターゼ(EC 2.3.3.10);
c) HMG−CoAレダクターゼ(EC 1.1.1.88);
d) メバロン酸キナーゼ(EC 2.7.1.36);
e) ホスホメバロン酸キナーゼ(EC 2.7.4.2);
f) ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ(EC 4.1.1.33);1−デオ
キシ−D−キシルロース−5−リン酸シンターゼ DXS(EC:2.2.1.7);
g) 1−デオキシ−D−キシルロース 5−リン酸レダクトイソメラーゼ DXR(
EC:1.1.1.267);
h) 2−C−メチル−D−エリスリトール 4−リン酸シチジリルトランスフェラー
ゼ IspD(EC:2.7.7.60);
i) 4−ジホスホシチジル−2−C−メチル−D−エリスリトール キナーゼ Is
pE(EC:2.7.1.148);
j) 2−C−メチル−D−エリスリトール 2;4−シクロ二リン酸シンターゼ I
spF(EC:4.6.1.12);
k) 4−ヒドロキシ−3−メチルブタ −2−エン−1−イル 二リン酸シンターゼ
IspG(EC:1.17.7.1);
l) 4−ヒドロキシ−3−メチルブタ −2−エニル 二リン酸レダクターゼ(EC:
1.17.1.2);ゲラニルトランストランスフェラーゼ Fps(EC:2.5.1
.10);
m) ヘプタプレニル二リン酸シンターゼ(EC:2.5.1.10);
n) オクタプレニル−二リン酸シンターゼ(EC:2.5.1.90);
o) イソプレンシンターゼ(EC 4.2.3.27);
p) イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ(EC 5.3.3.2);および
q) ファルネセンシンターゼ(EC 4.2.3.46 / EC 4.2.3.
47)
からなる群から選択される。
では、細菌は嫌気条件下で酵素を発現する。
。プラスミドは、メバロン酸経路またはDXS経路またはテルペン生合成経路中の酵素を
コードする核酸を含み、それによりプラスミドが細菌中に存在する際、酵素が前記細菌に
より発現される、核酸。酵素は、
a) チオラーゼ(EC 2.3.1.9);
b) HMG−CoAシンターゼ(EC 2.3.3.10);
c) HMG−CoAレダクターゼ(EC 1.1.1.88);
d) メバロン酸キナーゼ(EC 2.7.1.36);
e) ホスホメバロン酸キナーゼ(EC 2.7.4.2);
f) ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ(EC 4.1.1.33);1−デオ
キシ−D−キシルロース−5−リン酸シンターゼ DXS(EC:2.2.1.7);
g) 1−デオキシ−D−キシルロース 5−リン酸レダクトイソメラーゼ DXR(
EC:1.1.1.267);
h) 2−C−メチル−D−エリスリトール 4−リン酸シチジリルトランスフェラー
ゼ IspD(EC:2.7.7.60);
i) 4−ジホスホシチジル−2−C−メチル−D−エリスリトール キナーゼ Is
pE(EC:2.7.1.148);
j) 2−C−メチル−D−エリスリトール 2;4−シクロ二リン酸シンターゼ
IspF(EC:4.6.1.12);
k) 4−ヒドロキシ−3−メチルブタ −2−エン−1−イル 二リン酸シンターゼ
IspG(EC:1.17.7.1);
l) 4−ヒドロキシ−3−メチルブタ −2−エニル 二リン酸レダクターゼ(EC:
1.17.1.2);ゲラニルトランストランスフェラーゼ Fps(EC:2.5.1
.10);
m) ヘプタプレニル二リン酸シンターゼ(EC:2.5.1.10);
n) オクタプレニル−二リン酸シンターゼ(EC:2.5.1.90);
o) イソプレンシンターゼ(EC 4.2.3.27);
p) イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ(EC 5.3.3.2);および
q) ファルネセンシンターゼ(EC 4.2.3.46 / EC 4.2.3.4
7)
からなる群から選択される。
る。工程は、細菌がCOおよび/またはCO2をイソプレンに変換するように、
培養媒体中の酸化炭素栄養性の酢酸産生細菌の培養物を含む生物反応器に気体のCO含有
基質および/またはCO2含有基質を通すことと、生物反応器からイソプレンを回収する
こととを含む。酸化炭素栄養性の酢酸産生細菌はイソプレンシンターゼを発現するよう遺
伝的に改変される。
改変されている酸化炭素栄養性酢酸産生細菌を提供する。細菌はイソプレンシンターゼを
発現し、かつ細菌はジメチルアリル二リン酸(imethylallyldiphosp
hate)をイソプレンに変換できる。1つの態様では、イソプレンシンターゼはPop
ulus tremuloidesの酵素である。別の態様では、核酸は最適化されたコ
ドンである。さらに別の態様では、イソプレンシンターゼの発現はClostridiu
m autoethanogenum由来のピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダク
ターゼの遺伝子のプロモーターの転写制御下にある。
する工程を提供する。工程は、細菌がCOおよび/またはCO2をイソペンチル二リン酸
(IPP)に変換するように、培養媒体中の酸化炭素栄養性の酢酸産生細菌の培養液を含
む生物反応器に気体のCO含有基質および/またはCO2含有基質を通すことと、生物反
応器からIPPを回収することとを含む。酸化炭素栄養性の酢酸産生細菌はイソプレン二
リン酸Δイソメラーゼを発現するよう遺伝的に改変されている。
む、単離され遺伝的に改変されている酸化炭素栄養性酢酸産生細菌を提供する。細菌は、
イソペンチル二リン酸Δイソメラーゼを発現し、かつ細菌はジメチルアリル二リン酸塩を
イソペンチルジリン酸塩に変換できる。いくつかの態様では、核酸は、Clostrid
ium beijerinckiiのイソペンチル二リン酸Δ イソメラーゼをコードす
る。xxx missing linexx。他の態様では、核酸はClostridium autoet
hanogenumおよびイソプレンシンターゼをコードする第2の核酸の下流由来のピ
ルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ遺伝子のプロモーターの転写制御下にあ
る。
よび/またはイソプレンに変換する工程を提供する。工程は、細菌がCOおよび/または
CO2をイソペンチル二リン酸塩(IPP)および/またはイソプレンに変換するように
、培養媒体中の酸化炭素栄養性の酢酸産生細菌の培養物を含む生物反応器に気体のCO含
有基質および/またはCO2含有基質を通すことと、IPPおよび/またはイソプレンを
生物反応器から回収することとを含む。酸化炭素栄養性の酢酸産生細菌は、デオキシキシ
ルロース 5−リン酸シンターゼ(DXS)の酵素をコードする核酸のコピー数が増加す
るよう遺伝的に改変されており、増加したコピー数はゲノム当たり1を超える。
素をコードする核酸のゲノム当たり1超のコピー数を含む、単離され遺伝的に改変されて
いる酸化炭素栄養性酢酸産生細菌を提供する。いくつかの態様では、単離され遺伝的に改
変されている酸化炭素栄養性酢酸産生細菌は、イソプレンシンターゼをコードする核酸を
さらに含んでもよい。他の態様では、単離され遺伝的に改変されている酸化炭素栄養性酢
酸産生細菌は、イソペンチル二リン酸Δイソメラーゼをコードする核酸をさらに含んでも
よい。さらなる他の態様では、単離され遺伝的に改変されている酸化炭素栄養性酢酸産生
細菌は、イソペンチル二リン酸Δイソメラーゼをコードする核酸およびイソプレンシンタ
ーゼをコードする核酸をさらに含んでもよい。
れ遺伝的に改変されている酸化炭素栄養性酢酸産生細菌が提供される。細菌はコード化さ
れた酵素を発現し、かつ酵素はこの細菌由来のものではない。いくつかの態様では、酵素
はStaphylococcus aureusの酵素である。いくつかの態様では、酵
素は1つ以上のC.autoethanogenumのプロモーターの制御下で発現され
る。いくつかの態様では、細菌は、チオラーゼ(thlA/vraB)をコードする核酸
、HMG−CoAシンターゼ(HMGS)をコードする核酸、およびHMG−CoAレダ
クターゼ(HMGR)をコードする核酸をさらに含む。いくつかの態様では、チオラーゼ
はClostridium acetobutylicumのチオラーゼである。いくつ
かの態様では、細菌はジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ(PMD)をコードする核
酸をさらに含む。
、単離され遺伝的に改変されている酸化炭素栄養性酢酸産生細菌が提供される。いくつか
の態様では、核酸は、C.autoethanogenumでの発現に最適化されたコド
ンである。いくつかの態様では、αフェネルセンシンターゼはMalus x dome
stica のα−ファルネセンシンターゼである。いくつかの態様では、細菌はゲラニ
ルトランストランスフェラーゼをコードする核酸セグメントをさらに含む。いくつかの態
様では、ゲラニルトランストランスフェラーゼ(gernayltranstransf
erase)はE.coliのゲラニルトランストランスフェラーゼである。
化炭素栄養性酢酸産生細菌は、Clostridium autoethanogenu
m、Clostridium ljungdahlii、Clostridium ra
gsdalei、Clostridium carboxidivorans、Clos
tridium drakei、Clostridium scatologenes、
Clostridium aceticum、Clostridium formico
aceticum、Clostridium magnum、Butyribacter
ium methylotrophicum、Acetobacterium wood
ii、Alkalibaculum bacchii、Blautia product
a、Eubacterium limosum、Moorella thermoace
tica、Moorella thermautotrophica、Sporomus
a ovata、Sporomusa silvacetica、Sporomusa
sphaeroides、Oxobacter pfennigii、およびTherm
oanaerobacter kiuviからなる群から選択されてもよい。
含むよう広くあってもよく、個別または集合的であってもよく、これらの一部、要素およ
び特徴のうちの2つ以上の組み合わせであってもよい。特定の整数が本明細書中に記載さ
れているが、特定の整数は本発明に関連する技術で知られている均等物を有すると本明細
書に記載されており、このような均等物は、以下に個別に記載されていない限り、本明細
書に組み込まれるものである。
面を参照して例示の目的でのみ与えられる以下の記載により明白になるであろう。
発明は以下の本明細書の「実施例」の下の開示からさらにさらに明らかにされており、開
示は本発明を支持する実験データ、本発明の多様な態様の特定の実施例、および本発明を
実施する手段を提供する。
む基質の発酵によりイソプレンおよびファルネセンを含むテルペンおよびその前駆体を産
生することができた。このことは、それらの産生のための現在の方法に対して利点を有し
得る、これらの産物の産生のための代替手段を提供する。さらに、本発明者らは、さもな
ければ大気に放出され、かつ環境を汚染するであろう工業的工程からの一酸化炭素を使用
する手段を提供する。
を指す。
生物であり、かつ目的微生物と異なる微生物を指す。
れる微生物であり、かつシャトル微生物と異なる微生物を指す。
発酵産物を意味すると意図される。
際、限定するものではないが、発酵を触媒する微生物の増殖速度、産生物濃度の上昇した
増殖および/または産物産生速度、消費された基質の容量あたり産生される所望の産物の
容量、所望産物の産生速度または産生レベル、および発酵の他の副産物と比較した所望の
産物の相対比率のうちの少なくとも1つの増加を含む。
増殖および/または発酵に一酸化炭素が利用可能である任意の基質を含むと理解されるべ
きである。
酸化炭素を含む任意の気体を含む。ある実施形態では、基質は少なくとも20容量%〜1
00容量%のCO、20容量%〜70容量%のCO、30容量%〜60容量%のCO、お
よび40容量%〜55容量%のCOを含む。特定の実施形態では、基質は約25容量%、
または約30容量%、または約35容量%、または約40容量%、または約45容量%、
または約50容量%、または約55容量%、または約60容量%のCOを含む。
するために有害であってはならない。特定の実施形態では、水素の存在は、アルコール産
生の総合的な効率を改善する。Xxmissing linexxたとえば、特定の実施形態では、基質は
約2:1、または1:1、または1:2の比率のH2:COを含んでもよい。1つの実施
形態では、基質は約30容量%以下のH2、約20容量%以下のH2、約15容量%以下
のH2、または約10容量%以下のH2を含む。他の実施形態では、基質の流れは、たと
えば、5%未満、または4%未満、または3%未満、または%未満、または1%未満の低
濃度のH2を含み、もしくは水素を実質的に含まない。基質はまた、たとえば、約1容量
%〜80容量%、または1容量%〜約30容量%のCO2など、いくらかのCO2を含ん
でもよい。1つの実施形態では、基質は約20容量%以下のCO2を含む。特定の実施形
態では、基質は約15容量%以下のCO2、約10容量%以下のCO2、約5容量%以下
のCO2を含み、または実質的にCO2を含まない。
酵することに関して記載される。しかしながら、気体基質は代替的な形態にて提供されて
もよいことが理解されるべきである。たとえば、COを含む気体基質は液体に溶解されて
提供されてもよい。本質的に、液体は、一酸化炭素を含む気体で飽和され、その後その液
体を生物反応器に添加する。このことは標準的な方法を使用して達成し得る。例として、
微細気泡分散ジェネレータ(Hensirisak et. al. Scale−up
of microbubble dispersion generator for
aerobic fermentation; Applied Biochemis
try and Biotechnology Volume 101, Number
3 / October, 2002)を使用できる。さらなる例として、COを含む
気体基質が固体の支持体上に吸着されてもよい。このような代替方法は、用語「COを含
む基質」およびそれに類する用語の使用に含まれる。
ある。「工業廃棄ガスまたは工業排ガス」は、工業行程により産生されるCOを含む任意
の気体を含み、また鉄金属製品製造、非鉄製品製造、石油精製工程、石炭の気化、バイオ
マスの気化、電力生産、カーボンブラック生産、およびコークの製造の結果として産生さ
れる気体を含むと広く解釈されるべきである。さらなる例が本明細書の他で提供されても
よい。
たは「発酵反応」、およびそれに類する文言は、工程の増殖段階および産物生合成段階を
含むと意図される。さらに本明細書に記載されるように、いくつかの実施形態では、生物
反応器は第1の増殖リアクターおよび第2の発酵リアクターを含んでもよい。このように
、金属類または組成物を発酵反応に添加することは、これらのリアクターのいずれかまた
は両方への添加を含むことが理解べきである。
なる発酵装置を含み、連続撹はん槽リアクター(CSTR)、固定化細胞リアクター(I
CR)、リクルベッド反応器(TBR)、気ほう塔反応器、ガスリフト発酵槽、スタティ
ックミキサー、または気体―液体接触に適した他の装置を含む。いくつかの実施形態では
、生物反応器は第1の増殖リアクターおよび第2の発酵リアクターを含む。よって、基質
を生物反応器または発酵反応に添加することを指す際には、適切な場合これらのリアクタ
ーのいずれかまたは両方を含むことが理解される。
定するものではないが、導入される微生物(たとえば組み換え微生物の由来となる親微生
物)、導入される生物とは異なる微生物株または種類、あるいは人工的にまたは組み換え
にて作成した微生物株化または種類を含む任意の適切な供給源に由来してもよい。1つの
実施形態では、外来性核酸は導入される微生物内に天然に存在する核酸配列を表し、かつ
それらは導入されて特定の遺伝子の発現または過剰発現を増大する(たとえば、配列(た
とえば遺伝子)のコピー数を増大すること、または発現を増大するために強力なまたは構
成的なプロモーターを導入することにより)。別の実施形態では、外来性核酸は導入され
る微生物内には天然に存在しない核酸配列を表し、かつ微生物内に天然に存在しない産物
を発現させまたは微生物にとって天然の遺伝子の発現を増大させる(たとえば、プロモー
ターなどの調節要素を導入する場合)。外来性核酸は、導入される微生物のゲノム中に統
合するよう適合されてもよいし染色体外にある状態を保持するように適合されてもよい。
由来する親微生物中には存在しないタンパク質を指す。
性」は、組み換え微生物が由来する親微生物に存在する任意の核酸またはタンパク質を指
す。
ば、それらの配列を使用して実施されてもよいことが理解されるべきである。タンパク質
またはペプチドをコードする核酸配列について、これは、コードされたタンパク質または
ペプチドが実質的に同一の機能を有することを意味する。プロモーター配列を表す核酸配
列については、変異型配列は1つ以上の遺伝子発現を促進する性質を有する。このような
核酸は、本明細書で「機能的に等価な変異体」と呼ばれてもよい。例として、核酸の機能
的に等価な変異体は、対立変異体、遺伝子のフラグメント、変異(欠損、挿入、ヌクレオ
チド置換など)および/または遺伝子多型を含む遺伝子などが挙げられる。他の微生物由
来のホモログ遺伝子もまた、本明細書に特に例示される配列の機能的に等価な変異体の例
と考えられてもよい。これらは、Clostridium acetobutylicu
m、Clostridium beijerinckii、C. saccharobu
tylicum、およびC. saccharoperbutylacetonicum
などの種のホモログ遺伝子を含み、この詳細は、GeneBankまたはNCBIなどの
ウェブサイトに公開されており、利用可能である。「機能的に等価な変異体」という文言
はまた、特定の生物のコドン最適化の結果として配列が変化した核酸を含むと解釈される
べきである。本明細書に記載される核酸の「機能的に等価な変異体」は、同定された核酸
配列と好ましくは少なくとも約70%、好ましくは80%、より好ましくは85%、好ま
しくは約90%、好ましくは約95%以上の核酸配列同一性を有する。
を使用して実施してもよいこともまた理解すべきである。これらの変異体は、本明細書で
は「機能的に等価の変異体」を呼ばれてもよい。タンパク質またはペプチドの機能的に等
価な変異体は、同定されたタンパク質またはペプチドと少なくとも40%、好ましくは5
0%、好ましくは60%、好ましくは70%、好ましくは75%、好ましくは80%、好
ましくは90%、好ましくは85%、好ましくは90%、好ましくは95%以上のアミノ
酸同一性を共有し、かつ目的のタンパク質またはペプチドと実質的に同じ機能を有するタ
ンパク質またはペプチドを含む。このような変異体は、タンパク質またはペプチドのフラ
グメントの範囲内にあるものを含み、フラグメントは切り詰められた形態のポリペプチド
を含み、欠損は1〜5、〜10、〜15、〜20、〜25アミノ酸であってよく、および
ポリペプチドのいずれかの末端の1〜25の残基から拡大してもよく、および欠損は領域
内の任意の長さであってもよく;または内部の位置にあってもよい。本明細書の特定のポ
リペプチドの機能的に等価な変異体はまた、たとえば前の段落に例示されるような、他の
細菌種のホモログ遺伝子により発現されるポリペプチドを含むと解釈されるべきである。
、もとの核酸またはポリペプチドの機能を実行できることを意味するよう意図される。た
とえば、本発明の酵素の変異体は、その酵素と同一の反応を触媒できる。しかしながら、
変異体がもとのポリペプチドまたは核酸と同一のレベルの活性を有することを意味するも
のではない。
かどうかを、任意の既知の方法を使用して評価できる。しかしながら、例として、イソプ
レン合成酵素に関するSilverらにより記載される方法(1991, Plant
Physiol. 97: 1588−1591)またはZhaoらにより記載される方
法(2011, Appl Microbiol Biotechnol, 90:19
15-1922)、ファルネセンシンターゼに関するGreenらによる方法(2007
, Phytochemistry; 68:176-188)、1−デオキシ−D−キ
シルロース 5−リン酸シンターゼDxsに関するKuzuyamaによる方法(200
0, J. Bacteriol. 182, 891−897)、チオラーゼに関する
Berndt and Schlegelによる方法(1975, Arch. Mic
robiol. 103, 21−30)またはStim−Herndonらによる方法
(1995, Gene 154: 81−85)、HMG−CoAシンターゼに関する
Cabanoらによる方法(1997, Insect Biochem. Mol. B
iol.Metab. 27:499-505)、HMG−CoAレダクターゼおよびに
メバロン酸キナーゼ酵素に関するMaらによる方法(2011, Metab. Eng
in., 13:588-597)、ホスホメバロン酸キナーゼに関するHerdend
orf and Miziorkoによる方法(2007, Biochemistry
, 46: 11780−8)、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼに関するKre
pkiyらによる方法(2004, Protein Sci. 13: 1875−1
881)が挙げられる。また、Trutkoらにより記載される(2005, Micr
obiology 74: 153−158)ようにホスミドマイシンまたはメビノリン
のような阻害剤を使用して、DXSおよびメバロン酸経路の遺伝子を同定することが可能
である。
一条件下の親微生物の蛋白質(核酸を含む)の発現レベルと比較して1つ以上の蛋白質の
発現(同じ蛋白質をコードする1つ以上の核酸の発現を含む)のいずれかの増大を含むと
広く解釈されるべきである。タンパク質(または核酸)が任意の特定なレベルに発現する
という意味にとるべきではない。
微生物は、天然に存在するもの(すなわち野生型微生物)または前もって修飾されている
が本発明の対象である1つ以上の酵素を発現または過剰に発現しないものである。したが
って、本発明の組換え微生物は、親微生物中で発現または過剰に発現しなかった1つ以上
の酵素を発現または過剰に発現するように修飾されてもよい。
クルとしての使用に適した任意の核酸(DNAおよびRNAを含む)を含むと広く解釈さ
れるべきである。この用語は、プラスミド、ウイルス(バクテリオファージを含む)、コ
スミドおよび人工染色体を含むと解釈されるべきである。構築物またはベクターは、1つ
以上の調節要素、複製起源、マルチクローニング部位および/または選択可能マーカーを
含んでもよい。1つの実施形態では、構築物またはベクターは、構築物またはベクターに
よりコードされた1つ以上の遺伝子発現を可能にするよう適合されている。核酸構築物ま
たはベクターは、裸核酸ならびに細胞への送達を促進する1つ以上の薬剤と製剤化した核
酸(たとえば、リポソーム結合型核酸、核酸が含まれている生物)を含む。
びにアルコール、アルデヒドおよびケトンなどの酸素含有テルペン化合物を含む、結合さ
れたC5イソプレン単位からできる任意の化合物を含むと広く解釈されるべきである。単
純なテルペンは、針葉樹などの植物の精油および樹脂に見いだされる。より複雑なテルペ
ンは、テルペノイドおよびビタミンA、カロテノイド色素(リコピンなど)、スクアレン
、およびゴムを含む。モノテルペン類の例は、限定するものではないが、イソプレン、ピ
ネン、ネロール、シトラール、カンファー、メントール、リモネンを含む。セスキテルペ
ンの例としては、限定するものではないが、ネロリドール、ファルネソールが挙げられる
。ジテルペンの例としては、限定するものではないが、フィトール、ビタミンA1が挙げ
られる。スクアレンはトリテルペンの一例であり、カロテン(プロビタミンA1)はテト
ラテルペンである。
を形成する反応の間に産生される化合物または中間体物質である。この用語は、メバロン
酸(MVA)経路および任意にDXS経路に見いだされる前駆体化合物または中間体基質
ならびにFPPおよびGPPなどの、より長鎖のテルペンの下流の前駆体を指す。特定の
実施形態では、メバロン酸、IPP、ジメチルアリル二リン酸(DMAPP)、ゲラニル
ピロリン酸(GPP)およびファルネシルピロリン酸(FPP)を含むが、これらに限定され
ない。
PPまたはIPPへの酵素的経路である。それはまた、デオキシキシルロース 5−リン
酸(DXP/DXPS/DOXPまたはDXS)/メチルエリスリトール リン酸(ME
P)経路としても知られている。
。
2つのテルペン産生経路、解糖系における2つの重要な中間体基質であるピルビン酸お
よびD−グリセルアルデヒド−3−リン酸(G3P)から開始するデオキシキシルロース
5−リン酸(DXP/DXPS/DOXPまたはDXS)/メチルエリスリトール リ
ン酸(MEP)経路(Hunter et al., 2007, J. Biol.
chem. 282: 21573−77)、ならびにアセチルCoAから開始するメバ
ロン酸(MVA)経路(Miziorko, 2011, Arch Biochem
Biophys, 505: 131−143)が知られている。多くの異なる分類の微
生物が、これら経路のいずれかの存在について研究されている(Lange et al
., 2000, PNAS, 97: 13172−77; Trutko et a
l., 2005, Microbiology, 74: 153−158; Jul
sing et al., 2007, Appl Microbiol Biotec
hnol, 75: 1377−84)が、酸化炭素栄養性酢酸産生では研究されていな
かった。たとえばDXS経路は、E.coli、 Bacillus、またはMycob
acterium中に存在すると見出されており、一方メバロン酸経路は、酵母Sacc
haromyces、Cloroflexus、またはMyxococcus中に存在す
る。
hliiのゲノムは、2つの経路のいずれかの存在について本発明者らにより分析された
。DXS経路のすべての遺伝子は、C.autoethanogenumおよびC.lj
ungdahliiで同定され(表1)、一方メバロン酸経路は存在しなかった。さらに
、C.autoethanogenum またはC.ljungdahliiなどの酸化
炭素栄養性酢酸産生は、代謝最終産物としていずれのテルペンを産生することも知られて
いない。
オシド三リン酸の形態でエネルギーを費やす必要がある。基質としての糖の使用は、AT
Pのいくつかの分子を得るために解糖から供給される十分なエネルギーを必要とする。基
質として糖を使用するDXS経路を介したテルペン類および/またはその前駆体の産生は
、ピルビン酸およびD−グリセルアルデヒド−3−リン酸(G3P)の利用可能性により
相対的に単純な方法で進行し、G3PはC5ペントースおよびC6ヘキソース糖由来であ
る。これらのC5およびC6分子はしたがって、テルペン類が構成されるC5イソプレン
単位へと比較的簡単に変換される。
ミテルペノイドなどの長い分子を合成することはより難しい。これは特に、C10モノテ
ルペン類、C15セスキテルペン類、またはC40テトラテルペン類などのより長鎖のテ
ルペン類に当てはまる。これまでに酢酸産生菌(天然および組み換え微生物の両方)で報
告された最も多くの炭素原子をもつ産物は、C4化合物のブタノール(Kopke et
al., 2011, Curr. Opin. Biotechnol. 22:
320−325; Schiel−Bengelsdorf and Durre, 2
012, FEBS Letters: 10.1016/j.febslet.201
2.04.043; Kopke et al., 2011, Proc. Nat.
Sci. U.S.A. 107: 13087−92;米国特許第2011/023
6941号)および2,3−ブタンジオール(Kopke et al., 2011,
Appl. Environ. Microbiol. 77:5467−75)であ
る。本発明者らは、アセチルCoA中間体を介してC1供給原料COを使用してこれらの
より長鎖のテルペンを嫌気的に産生することが驚くべきことに可能であることを示した。
かになりつつあるが、嫌気的増殖条件下または糖発酵生物の解糖とは異なり、基質レベル
のリン酸化によるWood−Ljungdahl経路ではATPを得ることはなく、実際
CO2のギ酸への活性化は実質的に1分子のATPを必要とし、かつ膜勾配を必要とする
。本発明者らは、産物の形成のための経路がエネルギー効率に優れていることが重要であ
ると指摘する。本発明者らは、酢酸産生菌では基質COまたはCO2はアセチルCoAに
直接運ばれ、これは特に糖系システムと比較した場合、6つの反応のみが必要であり、テ
ルペン類および/またはそれらの前駆体への最も直接的な経路を表す(図1)ことを指摘
する。嫌気的酢酸産生菌では利用可能なATPはより少ないが、本発明者らは、このより
直接的な経路はより高い代謝の流れを持続する(中間体反応のより高い化学的推進力のた
め)と考える。テルペン生合成経路におけるいくつかの中間体、例えば重要な中間体であ
るメバロン酸およびFPP、は効率良く代謝回転されないと多くの細菌にとって毒性であ
るため、より高い代謝の流れは重要である。
より高いATPが利用可能であるにも関わらず、この中間体の毒性の問題は、糖からのテ
ルペン産生における障害となり得る。
ギー論をDXS経路と比較すると、メバロン酸経路はATPとしてより少ないヌクレオシ
ド三リン酸塩を必要とし、等価物の還元がより少なく、かつアセチルCoAから6つの反
応ステップのみが必要でDXS経路と比べてより直接的でもあることを、本発明者らは指
摘する。これは、反応および代謝流量の速度に利点を提供し、かつ総合的なエネルギー効
率を増大させる。さらに、必要な酵素数がより少ないことは、組み換え微生物を産生する
ために必要とされる組み換え方法を簡易化する。
路および任意にDXS経路をClostridium autoethanogenum
またはC.ljungdahliiなどの酸化炭素栄養性酢酸産生菌に導入してC1炭素
基質であるCOからテルペン類および/またはその前駆体を効率的に産生することが可能
であることを示した。これはすべての酸化炭素栄養性酢酸産生微生物に適用可能であるこ
とが期待される。
物を使用して可能であるとは全く示されていなかった。イソプレンの嫌気的産生はより安
全な操作環境を提供する利点を有する。なぜなら、イソプレンは酸素の存在下で非常に可
燃性であり、室温および大気圧下では、1.5〜2.0%の引火下限界(LFL)、およ
び2.0〜12%の引火上限界(UFL)を有するからである。燃焼は酸素なしに起こる
ことはないため、本発明者らは、嫌気的燃焼工程は、すべての生成物濃度、気体組成物、
温度および圧力範囲に渡りより安全であるため、望ましいと考える。
体、ならびに任意に1つ以上の他の産物を、COを含む基質の発酵によって産生できる組
み換え微生物を提供する。
メバロン酸(MVA)経路由来の1つ以上の外来性酵素を発現し、かつ/またはメバロ
ン酸(MVA)経路由来の1つ以上の内在性酵素を過剰発現し;かつ
a)DXS経路由来の1つ以上の外来性酵素を発現し、かつ/またはDXS経路由来の1
つ以上の内在性酵素を過剰発現するように
適合される。
アセチルCoAを産生できるが、アセチルCoAをメバロン酸またはイソペンチルピロリ
ン酸(IPP)に変換できず、かつ組み換え微生物はメバロン酸経路に関与する1つ以上
の酵素を発現するよう適合される。
伝子発現を駆動するためにより強力なまたは構成的なプロモーターを導入することにより
)と、酵素をコードしかつ酵素を発現するよう適合され外来性核酸を導入することにより
特定の酵素をコードする遺伝子のコピー数を増大することと、親微生物中には天然に存在
しない酵素をコードしかつ発現するよう適合された外来性核酸を導入することとを含む、
任意の数の組み換え方法により1つ以上の酵素を発現しまたは過剰に発現するよう適合さ
れてもよい。
a) チオラーゼ(EC 2.3.1.9)、
b) HMG−CoAシンターゼ(EC 2.3.3.10)、
c) HMG−CoAレダクターゼ(EC 1.1.1.88)、
d) メバロン酸キナーゼ(EC 2.7.1.36)、
e) ホスホメバロン酸キナーゼ(EC 2.7.4.2)、
f) ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ(EC 4.1.1.33)、および
g) 機能的に等価であるそれらのいずれかの変異体
からなる群から選択される。
a) 1−デオキシ−D−キシルロース−5−リン酸シンターゼ DXS(EC:2.
2.1.7)、
b) 1−デオキシ−D−キシルロース 5−リン酸レダクトイソメラーゼ DXR(
EC:1.1.1.267)、
c) 2−C−メチル−D−エリスリトール 4−リン酸シチジリルトランスフェラー
ゼ IspD(EC:2.7.7.60)、
d) 4−ジホスホシチジル−2−C−メチル−D−エリスリトール キナーゼ Is
pE(EC:2.7.1.148)、
e) 2−C−メチル−D−エリスリトール 2,4−シクロ二リン酸シンターゼ
IspF(EC:4.6.1.12)、
f) 4−ヒドロキシ−3−メチルブタ −2−エン−1−イル 二リン酸シンターゼ
IspG(EC:1.17.7.1)、
g) 4−ヒドロキシ−3−メチルブタ −2−エニル 二リン酸レダクターゼ(EC:
1.17.1.2)、および
h) 機能的に等価であるそれらのいずれかの変異体
からなる群から選択される。
過剰に発現されてテルペン化合物および/またはその前駆体の産生をもたらし、発現され
る外来性酵素、または過剰発現される内在性酵素は、
a) ゲラニルトランストランスフェラーゼ Fps(EC:2.5.1.10)、
b) ヘプタプレニル二リン酸シンターゼ(EC:2.5.1.10)、
c) オクタプレニル−二リン酸シンターゼ(EC:2.5.1.90)、
d) イソプレンシンターゼ(EC 4.2.3.27)、
e) イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ(EC EC 5.3.3.2)、
f) ファルネセン シンターゼ(EC 4.2.3.46 / EC 4.2.3.
47)、および
g) 機能的に等価であるそれらのいずれかの変異体.
からなる群から選択される。
む、任意の適切な供給源由来であってもよい。しかしながら、1つの実施形態では、酵素
はStaphylococcus aureus由来である。
emuloides由来である。さらなる実施形態では、それは、以下の配列番号21に
例示される核酸配列、または機能的に等価なその変異体を有する。
oethanogenum由来であり、以下の配列番号1に例示される核酸配列によりコ
ードされおよび/または配列番号2に例示されるアミノ酸配列を有し、または機能的に等
価なそれらの変異体である。
メラーゼ DXRはC.autoethanogenum由来であり、および配列番号3
に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
ルトランスフェラーゼ IspDはC.autoethanogenum由来であり、か
つ配列番号5に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体
である。
ル キナーゼ IspEはC.autoethanogenum由来であり、かつ配列番
号7に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
ン酸シンターゼ IspFはC.autoethanogenum由来であり、かつ配列
番号9に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である
。
リン酸シンターゼ IspGはC.autoethanogenum由来であり、かつ配
列番号11に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体で
ある。
ダクターゼはC.autoethanogenum由来であり、かつ配列番号13に例示
される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
s aureus subsp.aureus Mu50由来であり、かつ配列番号51に
例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
occus aureus subsp.aureus Mu50由来であり、かつ以下の
配列番号52に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体
である。
phylococcus aureus subsp.aureus Mu50由来であり
、かつ配列番号53に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその
変異体である。
lostridium beijerinckii由来であり、かつ以下の配列番号54
に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
tobutylicum ATCC824由来であり、かつ以下の配列番号40に例示さ
れる核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
s aureus subsp.aureus Mu50由来のアセチル-CoA c−アセチ
ルトランスフェラーゼ(vraB)であり、かつ以下の配列番号41に例示される核酸配
列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
ゼ(HMGS)はStaphylococcus aureus subsp.aure
us Mu50由来であり、かつ以下の配列番号42に例示される核酸配列によりコード
され、または機能的に等価なその変異体である。
GR)はStaphylococcus aureus subsp.aureus Mu
50由来であり、かつ以下の配列番号43に例示される核酸配列によりコードされ、また
は機能的に等価なその変異体である。
herichia coli str. K−12 substr. MG1655由来
であり、以下の配列番号56に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等
価なその変異体である。
nogenum由来であり、かつ以下の配列番号17に例示される核酸配列によりコード
され、または機能的に等価なその変異体である。
num由来であり、かつ配列番号19に例示される核酸配列によりコードされ、または機
能的に等価なその変異体である。
mestica由来であり、かつ以下の配列番号57に例示される核酸配列によりコード
され、または機能的に等価なその変異体である。
より同定してもよい。特定の実施形態では、酵素イソプレンシンターゼは、Silver
ら (1991、 Plant Physiol. 97: 1588−1591)また
はZhaoら(2011、 Appl Microbiol Biotechnol,
90:1915-1922)によりまとめられた方法により同定されてもよい。さらなる
特定の実施形態では、ファルネセンシンターゼは、Greenら (2007、 Phy
tochemistry; 68: 176−188)によりまとめられた方法により同
定されてもよい。さらなる特定の実施形態では、メバロン酸経路に由来する酵素は、HM
G−CoAシンターゼに関するCabanoら(1997、 Insect Bioch
em. Mol. Biol. 27: 499−505)による方法、HMG−CoA
レダクターゼおよびメバロン酸キナーゼに関するMaらによる方法(2011、 Met
ab. Engin., 13:588-597)、ホスホメバロン酸キナーゼによるH
erdendorfおよびMiziorkoによる方法(2007、 Biochemi
stry, 46: 11780−8)、ならびにジホスホメバロン酸デカルボキシラー
ゼに関するKrepkiyらによる方法(2004、 Protein Sci. 13
: 1875−1881)、Ma らによる2011、 Metab. Engin.,
13:588-597の方法により同定されてもよい。DXS経路の1−デオキシ−D
−キシルロース 5−リン酸シンターゼは、Kuzuyamaら(2000、 J. B
acteriol. 182, 891−897)によりまとめられた方法を使用してア
ッセイできる。また、Trutkoら(2005、 Microbiology 74:
153−158)により記載されるようにホスミドマイシンまたはメビロリン(mev
inoline)のような阻害剤を使用して、DXS経路およびメバロン酸経路の遺伝子
を同定することも可能である。
た1つ以上の外来性核酸を含み、かつ1つ以上の内在性核酸は本明細書に前述される酵素
のうちの1つ以上をコードする。1つの実施形態では、発現を増大するよう適合され1つ
以上の外来性核酸は、調節要素である。1つの実施形態では、調節要素はプロモーターで
ある。1つの実施形態では、プロモーターは、好ましくは適切な発酵条件下で高活性であ
る構成的プロモーターである。誘導可能なプロモーターを使用することもできる。好まし
い実施形態では、プロモーターは、Wood−Ljungdahl遺伝子クラスターまた
はホスホトランスアセチラーゼ/酢酸キナーゼオペロンプロモーターを含む群から選択さ
れる。発現、好ましくは適切な発酵条件下での高レベルの発現を指揮できる他のプロモー
ターが、例示的な実施形態に代わるものとして有効であることは、当業者には理解できる
であろう。
発現するよう適合され1つ以上の外来性核酸を含む。1つの実施形態では、微生物は、少
なくとも2つの酵素をコードしかつ発現するよう適合され1つ以上の外来性核酸を含む。
他の実施形態では、微生物は、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少な
くとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ以上の
酵素をコードしかつ発現するよう適合され1つ以上の外来性核酸を含む。
をコードする1つ以上の外来性核酸を含む。
伝子または調節要素(たとえばプロモーター)など)で形質転換することが望ましい場合
、それらは1つ以上の外来性核酸に含まれてもよい。
の特定の実施形態では、任意の組み合わせで本明細書に記載される酵素の1つ以上をコー
ドするプラスミドである。
物のゲノムに統合してもよい。したがって、外来性核酸は、統合を支援するよう適合され
たさらなるヌクレオチド配列(たとえば、宿主ゲノムへのホモログ組み換えおよび標的化
した統合を可能にする領域)または、染色体外の構築物の発現および複製を支援するよう
適合されたさらなるヌクレオチド配列(たとえば、複製起源、プロモーターおよび他の調
節要素または配列)を含んでもよい。
外来性核酸によりコードされる1つ以上の酵素の発現を促進するよう適合されプロモータ
ーをさらに含む。1つの実施形態では、プロモーターは、好ましくは適切な発酵条件下で
高活性である構成的プロモーターである。誘導可能なプロモーターも使用できる。好まし
い実施形態では、プロモーターは、Wood−Ljungdahl遺伝子クラスターおよ
びホスホトランスアセチラーゼ/酢酸キナーゼプロモーターを含む群から選択される。発
現、好ましくは適切な発酵条件下での高レベルの発現を指示できる他のプロモーターが、
例示した実施形態の代替方法として有効であることは、当業者には理解できるであろう。
れる。特定の実施形態では、微生物は、Clostridium autoethano
genum、Clostridium ljungdahlii、Clostridiu
m ragsdalei、Clostridium carboxidivorans、
Clostridium drakei、Clostridium scatologe
nes、Clostridium aceticum、Clostridium for
micoaceticum、Clostridium magnum、Butyriba
cterium methylotrophicum、Acetobacterium
woodii、Alkalibaculum bacchii、Blautia pro
ducta、Eubacterium limosum、Moorella therm
oacetica、Moorella thermautotrophica、Spor
omusa ovata、Sporomusa silvacetica、Sporom
usa sphaeroides、Oxobacter pfennigii、およびT
hermoanaerobacter kiuviを含む群から選択される。
ljungdahlii、C.ragsdaleiおよび関連する単離菌を含む、エタノ
ール産生、酢酸産生クロストリジウムのクラスターから選択される。これらは、限定する
ものではないが、株化細胞C.autoethanogenum JAI−1T DSM
10061)[Abrini J, Naveau H, Nyns E−J: Clo
stridium autoethanogenum, sp. nov., an a
naerobic bacterium that produces ethanol
from carbon monoxide. Arch Microbiol 19
94, 4: 345−351]、C.autoethanogenum LBS156
0(DSM19630)[Simpson SD, Forster RL, Tran
PT, Rowe MJ, Warner IL: Novel bacteria
and methods thereof. International paten
t 2009, WO/2009/064200]、C.autoethanogenu
m LBS1561(DSM23693)、C.ljungdahlii PETCT(
DSM13528 = ATCC 55383)[Tanner RS, Miller
LM, Yang D: Clostridium ljungdahlii sp.
nov., an Acetogenic Species in Clostrid
ial rRNA Homology Group I. Int J Syst Ba
cteriol 1993, 43: 232−236]、C.ljungdahlii
ERI−2(ATCC 55380)[Gaddy JL: Clostridium
stain which produces acetic acid from w
aste gases. US patent 1997, 5,593,886]、C
.ljungdahlii C−01 (ATCC 55988)[Gaddy JL,
Clausen EC, Ko C−W: Microbial process f
or the preparation of acetic acid as wel
l as solvent for its extraction from the
fermentation broth. US patent, 2002, 6,
368,819]、C.ljungdahlii O−52 (ATCC 55989)
[Gaddy JL, Clausen EC, Ko C−W: Microbial
process for the preparation of acetic a
cid as well as solvent for its extractio
n from the fermentation broth. US patent
, 2002, 6,368,819]、C.ragsdalei P11T(ATCC
BAA−622)[Huhnke RL, Lewis RS, Tanner RS
: Isolation and Characterization of nove
l Clostridial Species. International pat
ent 2008, WO 2008/028055]、「C.coskatii」[Z
ahn et al − Novel ethanologenic species
Clostridium coskatii (US Patent Applicat
ion number US20110229947)]および「Clostridiu
m sp.」(Tyurin et al., 2012, J. Biotech R
es. 4: 1−12)などの関連した単離菌、またはC.ljungdahlii
OTA−1(Tirado−Acevedo O. Production of Bi
oethanol from Synthesis Gas Using Clostr
idium ljungdahlii. PhD thesis, North Car
olina State University, 2010)などの変異株が挙げられ
る。これらの株は、クロストリジウムrRNAクラスター1内のサブクラスターを形成し
、それらの16S rRNA遺伝子は、30%前後の同様の低GC含量を有し99%超同
一である。しかしながら、DNA−DNA再会合およびDNAフィンガープリンティング
実験は、これらの株は別々の種に属することを示した[Huhnke RL, Lewi
s RS, Tanner RS: Isolation and Character
ization of novel Clostridial Species. In
ternational patent 2008, WO 2008/028055]
。
0.5〜0.7×3〜5μmである)中温性(最適増殖温度 30〜37℃)および厳密
に嫌気性である[Tanner RS, Miller LM, Yang D: Cl
ostridium ljungdahlii sp. nov., an Aceto
genic Species in Clostridial rRNA Homolo
gy Group I. Int J Syst Bacteriol 1993, 4
3: 232−236; Abrini J, Naveau H, Nyns E−J
: Clostridium autoethanogenum, sp. nov.,
an anaerobic bacterium that produces et
hanol from carbon monoxide. Arch Microbi
ol 1994, 4: 345−351; Huhnke RL, Lewis RS
, Tanner RS: Isolation and Characterizat
ion of novel Clostridial Species. Intern
ational patent 2008, WO 2008/028055]。さらに
、これらは、同じpH範囲(pH4〜7.5、最適初期pH:5.5〜6)、同様の増殖
率かつ主な発酵最終産物としてエタノールおよび酢酸を有する同様の代謝プロファイル、
CO含有気体での強力な独立栄養性増殖、ならびに特定の条件下で形成される少量の2,
3−ブタンジオールおよび乳酸、などの同様の主要な系統的な性質を共有する[Tann
er RS, Miller LM, Yang D: Clostridium lj
ungdahlii sp. nov., an Acetogenic Specie
s in Clostridial rRNA Homology Group I.
Int J Syst Bacteriol 1993, 43: 232−236;
Abrini J, Naveau H, Nyns E−J: Clostridiu
m autoethanogenum, sp. nov., an anaerobi
c bacterium that produces ethanol from c
arbon monoxide. Arch Microbiol 1994, 4:
345−351; Huhnke RL, Lewis RS, Tanner RS:
Isolation and Characterization of novel
Clostridial Species. International pate
nt 2008, WO 2008/028055]。インドール産生もまた、3つすべ
ての種で観察された。しかしながら、この種は、多様な糖(たとえばラムノース、アラビ
ノース)、酸(たとえばグルコン酸、クエン酸)、アミノ酸(たとえば、アルギニン、ヒ
スチジン)、または他の基質(たとえばベタイン、ブタノール)の基質の利用において差
異がある。さらに、一部の種は、特定のビタミン類(たとえばチアミン、ビオチン)に対
する独立栄養生物であることが見いだされたが、そうでない種もある。
autoethanogenum、Clostridium ljungdahlii、
Clostridium ragsdalei、Clostridium carbox
idivorans、Clostridium drakei、Clostridium
scatologenes、Butyribacterium limosum、Bu
tyribacterium methylotrophicum、Acetobact
erium woodii、Alkalibaculum bacchii、Blaut
ia producta、Eubacterium limosum、Moorella
thermoacetica、Moorella thermautotrophic
a、Oxobacter pfennigii、および Thermoanaeroba
cter kiuviからなる群から選択される。
um autoethanogenum、Clostridium ljungdahl
ii、Clostridium ragsdalei、Clostridium car
boxidivorans、Clostridium drakei、Clostrid
ium scatologenes、Clostridium aceticum、Cl
ostridium formicoaceticum、Clostridium ma
gnumを含む酸化炭素栄養性クロストリジウムの群から選択される。
gdahlii、および「C.ragsdalei」ならびに関連する単離菌を含む酸化
炭素栄養性クロストリジウムのクラスターから選択される。これらは、限定するものでは
ないが、細菌株C.autoethanogenum JAI−1T(DSM10061
) (Abrini, Naveau, & Nyns, 1994)、C.autoe
thanogenum LBS1560(DSM19630)(WO/2009/064
200)、C.autoethanogenum LBS1561(DSM23693)
、C.ljungdahlii PETCT(DSM13528 = ATCC 553
83)(Tanner, Miller, & Yang, 1993)、C.ljun
gdahlii ERI−2(ATCC 55380)(米国特許第5,593,886
号)、C.ljungdahlii C−01(ATCC 55988)(米国特許第6
,368,819号)、C.ljungdahlii O−52(ATCC 55989
)(米国特許第6,368,819号)、または 「C.ragsdalei P11T
」(ATCC BAA−622)(WO 2008/028055)、ならびに「C.
coskatii」 (米国特許第2011/0229947号)、「Clostrid
ium sp. MT351」(Michael Tyurin & Kiriukhi
n, 2012)などの関連する単離菌およびC.ljungdahlii OTA−1
(Tirado−Acevedo O. Production of Bioetha
nol from Synthesis Gas Using Clostridium
ljungdahlii. PhD thesis, North Carolina
State University, 2010)などのそれらの変異株を含む。
ように別々の種類であるにも関わらずこれらの株は、16S rRNA遺伝子レベルで少
なくとも99%の同一性を有し、クロストリジウムrRNAクラスターI内のサブクラス
ターを形成する。(Collins et al., 1994)(WO 2008/0
28055、米国特許第2011/0229947号)
定義され、かつエネルギー保存および発酵代謝の同じ様式を共有する。このクラスターの
株はシトクロムを欠いており、かつRnf複合体を介してエネルギーを保存する。
l., 2010)かつ32モル%前後のGC組成物を有し(Abrini et al
., 1994; Kopke et al., 2010; Tanner et a
l., 1993) (WO 2008/028055; US patent 201
1/0229947)、かつWood−Ljungdahl経路の酵素をコードする必須
の重要な遺伝子オペロンが保存されている(一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ホルミルテト
ラヒドロ葉酸シンテターゼ、メチレン−テトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、ホルミル−
テトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、メチレン−テトラヒドロ葉酸レダクターゼ、およ
び一酸化炭素デヒドロゲナーゼ/アセチル−CoAシンターゼ)、ヒドロゲナーゼ、ギ酸
デヒドロゲナーゼ、Rnf複合体(rnfCDGEAB)、ピルビン酸:フェレドキシン
オキシドレダクターゼ、アルデヒド:フェレドキシンオキシドレダクターゼ(Kopke
et al., 2010, 2011)。Wood−Ljungdahl経路遺伝子
の組織化および数は、気体の取り込みに関与し、核酸およびアミノ酸配列において差異が
あるにも関わらず、すべての種において同じであることが見いだされている(Kopke
et al., 2011)。
3〜5μmである)、中温性であり(最適な増殖温度30〜37℃)、かつ厳密に嫌気性
である(Abrini et al., 1994; Tanner et al.,
1993)(WO 2008/028055)。さらに、それらはすべて、同じpH範囲
(pH4〜7.5 最適初期pH5.5〜6)、同様の増殖比率でCO含有気体での強力
な独立栄養性増殖、ならびにある条件下で形成される少量の2,3−ブタンジオールおよ
び乳酸を有する、主要な発酵の最終産物としてエタノールおよび酢酸を有する代謝プロフ
ァイル、などの同じの主要な系統発生性質を共有する(Abrini et al.,
1994; Kopke et al., 2011; Tanner et al.,
1993)。しかしながら、これらの種は、様々な糖(たとえばラムノース、アラビノ
ース)、酸(たとえばグルコン酸、クエン酸)、アミノ酸(たとえばアルギニン、ヒスチ
ジン)、または他の基質(たとえばベタイン、ブタノール)の基質の利用において差異が
ある。一部の種はあるビタミン類(たとえばチアミン、ビオチン)に対して栄養要求性で
あることが見出されているが、他の種はそうではない。対応するアルコールへのカルボン
酸の還元が、様々なこれらの生物で示されている(Perez, Richter, L
oftus, & Angenent, 2012)。
liiのような1つの生物に特異的ではなく、むしろ酸化炭素栄養性エタノール―合成ク
ロストリジウムの一般的な特徴である。したがって、本発明は、性能に差異があるかもし
れないが、これらの株全体で機能することが予測され得る。
および1つ以上の外来性核酸から、組み換え微生物を産生するための当業者に知られてい
る任意の数の技術を使用して、調製されてもよい。例としてのみであるが、形質転換(形
質導入またはトランスフェクションを含む)は、エレクトロポレーション、電気融合、超
音波処理、ポリエチレングリコール媒介形質転換、接合、または化学的および天然のコン
ピテンスにより達成されてもよい。適切な形質転換技術は例えば、Sambrook J
, Fritsch EF, Maniatis T: Molecular Clon
ing: A laboratory Manual, Cold Spring Ha
rbour Labrotary Press, Cold Spring Harbo
ur, 1989に記載される。
., 2010; Leang, Ueki, Nevin, & Lovley, 2
012) (PCT/NZ2011/000203; WO2012/053905)、
C.autoethanogenum(PCT/NZ2011/000203; WO2
012/053905)、Acetobacterium woodii (Strat
z, Sauer, Kuhn, & Durre, 1994)またはMoorell
a thermoacetica(Kita et al., 2012)などのいくつ
かの酸化炭素栄養性酢酸産生菌について記載されており、C.acetobutylic
um(Mermelstein, Welker, Bennett, & Papou
tsakis, 1992)、C.cellulolyticum(Jennert,
Tardif, Young, & Young, 2000)またはC.thermo
cellum(MV Tyurin, Desai, & Lynd, 2004)など
の多くのクロストリジウム菌で用いられる標準の方法である。
されている(Tyurin and Kiriukhin, 2012)。
apu Parthasarathy, 2010, Development of
a Genetic Modification System in Clostri
dium scatologenes ATCC 25775 for Generat
ion of Mutants, Masters Project Weste
rn Kentucky University)の場合に同様に酸化炭素栄養性酢酸産
生菌について記載されている。
O’Keeffe, Purdy, Elmore, & Minton, 2003
)およびC.acetobuylicum(Williams, Young, & Y
oung, 1990)を含む多くの他のクロストリジウムに対して選択される方法とし
て記載されている。
。
enumまたはClostridium ljungdahliiである。1つの特定の
実施形態では、微生物は、Clostridium autoethanogenum
DSM23693である。別の特定の実施形態では、微生物はClostridium
ljungdahlii DSM13528(またはATCC55383)である。
本発明はまた、本発明の組換え微生物を作成するのに使用される1つ以上の核酸または
核酸構築物を提供する。
以上の酵素をコードする配列を含み、微生物中で発現された場合COを含む基質の発酵に
より微生物に1つ以上のテルペン類および/またはその前駆体を産生させる。1つの特定
の実施形態では、本発明は、微生物中で発現された場合COを含む基質の発酵により微生
物に1つ以上のテルペン類および/またはその前駆体を産生させる、2つ以上の酵素をコ
ードする核酸を提供する。1つの実施形態では、本発明の核酸は3つ、4つ、または5つ
以上のそのような酵素をコードする。
経路由来であり、
a) チオラーゼ(EC 2.3.1.9)、
b) HMG−CoAシンターゼ(EC 2.3.3.10)、
c) HMG−CoAレダクターゼ(EC 1.1.1.88)、
d) メバロン酸キナーゼ(EC 2.7.1.36)、
e) ホスホメバロン酸キナーゼ(EC 2.7.4.2)、
f) ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ(EC 4.1.1.33)、および
g) 機能的に等価であるそれらのいずれかの変異体
からなる群から選択される。
り、
a) 1−デオキシ−D−キシルロース−5−リン酸シンターゼ DXS(EC:2.
2.1.7)、
b) 1−デオキシ−D−キシルロース 5−リン酸レダクトイソメラーゼ DXR
(EC:1.1.1.267)、
c) 2−C−メチル−D−エリスリトール 4−リン酸シチジリルトランスフェラー
ゼ IspD(EC:2.7.7.60)、
d) 4−ジホスホシチジル−2−C−メチル−D−エリスリトール キナーゼ Is
pE(EC:2.7.1.148)、
e) 2−C−メチル−D−エリスリトール 2,4−シクロ二リン酸シンターゼ I
spF(EC:4.6.1.12)、
f) 4−ヒドロキシ−3−メチルブタ −2−エン−1−イル 二リン酸シンターゼ
IspG(EC:1.17.7.1)、
g) 4−ヒドロキシ−3−メチルブタ −2−エニル 二リン酸レダクターゼ(EC:
1.17.1.2)、および
h) 機能的に等価であるそれらのいずれかの変異体
からなる群から選択される。
/またはその前駆体の産生をもたらす1つ以上のさらなる酵素をコードし、発現される外
来性酵素、または過剰発現される内在性酵素は、
a) ゲラニルトランストランスフェラーゼ Fps(EC:2.5.1.10)、
b) ヘプタプレニル二リン酸シンターゼ(EC:2.5.1.10)、
c) オクタプレニル−二リン酸シンターゼ(EC:2.5.1.90)、
d) イソプレンシンターゼ(EC 4.2.3.27)、
e) イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ(EC EC 5.3.3.2)
f)ファルネセンシンターゼシンターゼ(EC 4.2.3.46/EC 4.2.3.
47)、および
g)機能的に等価なそれらのいずれかの変異体
からなる群から選択される。
れ、または本明細書に前述されたようにGenBankから取得できる。しかしながら、
、本明細書、GenBankおよび他のデータベース、ならびに遺伝子コードに含まれる
情報を考慮して、これらの酵素または機能的に等価なその変異体をコードする代替的な核
酸配列は当業者に明らかである。
TCC824由来のチオラーゼ(thIA)をコードする核酸は以下の配列番号40に例
示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
subsp.aureus Mu50由来のアセチル−CoA c−アセチルトランスフ
ェラーゼ(vraB)である、チオラーゼをコードする核酸は、は以下の配列番号41に
例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
aureus Mu50由来の3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリル−CoA シンタ
ーゼ(HMGS)をコードする核酸は以下の配列番号42に例示される核酸配列によりコ
ードされ、または機能的に等価なその変異体である。
aureus Mu50由来のヒドロキシメチルグルタリル−CoA レダクターゼ(H
MGR)をコードする核酸は以下の配列番号43に例示される核酸配列によりコードされ
、または機能的に等価なその変異体である。
aureus Mu50由来のメバロン酸キナーゼ(MK)をコードする核酸は以下の配
列番号51に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体で
ある。
aureus Mu50由来のホスホメバロン酸キナーゼ(PMK)をコードする核酸は
以下の配列番号52に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその
変異体である。
aureus Mu50由来のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ(PMD)をコー
ドする核酸は以下の配列番号53に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的
に等価なその変異体である。
ース 5−リン酸シンターゼをコードする核酸は配列番号1に例示される核酸配列により
コードされおよび/または以下の配列番号2に例示されるアミノ配列を有し、または機能
的に等価なその変異体である。
ーゼ DXR(EC:1.1.1.267)をコードする核酸は配列番号3の配列を有し
、または機能的に等価なその変異体である。
ランスフェラーゼ IspD(EC:2.7.7.60)をコードする核酸は配列番号5
の配列を有し、または機能的に等価なその変異体である。
キナーゼ IspE(EC:2.7.1.148)をコードする核酸は配列番号7の配列
を有し、または機能的に等価なその変異体である。
シンターゼ IspF(EC:4.6.1.12)をコードする核酸は配列番号9の配列
を有し、または機能的に等価なその変異体である。
酸シンターゼ IspG(EC:1.17.7.1)をコードする核酸は配列番号11の
配列を有し、または機能的に等価なその変異体である。
ターゼ(EC:1.17.1.2)をコードする核酸は配列番号13の配列を有し、また
は機能的に等価なその変異体である。
ubstr.MG1655由来のゲラニルトランストランスフェラーゼ(ispA)をコ
ードする核酸は以下の配列番号56に例示される核酸配列によりコードされ、または機能
的に等価なその変異体である。
17の配列を有し、または機能的に等価なその変異体である。
ゼであるオクタプレニル−二リン酸シンターゼ(EC:2.5.1.90)をコードする
核酸は配列番号19によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
ーゼ(ispS)をコードする核酸は以下の配列番号21に例示され、または機能的に等
価なその変異体である。
ソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ(idi)をコードする核酸は配列番号54に
例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
ンターゼ(FS)をコードする核酸は以下の配列番号57に例示される核酸配列によりコ
ードされ、または機能的に等価なその変異体である。
、プロモーターはその制御下で遺伝子の構成的発現を可能にする。しかしながら、誘導可
能なプロモーターを使用してもよい。当業者は、本発明に使用される適切なプロモーター
を容易に理解するものである。好ましくは、プロモーターは、適切な発酵条件下で高レベ
ルの発現を導くことができる。特定の実施形態では、Wood−Ljungdahlクラ
スタープロモーターを使用する。別の実施形態では、ホスホトランスアセチラーゼ/酢酸
キナーゼプロモーターを使用する。別の実施形態では、ピルビン酸:フェレドキシンオキ
シドレダクターゼプロモーター、Rnf複合オペロンプロモーターまたはATPシンター
ゼオペロンプロモーターを使用する。1つの特定の実施形態では、プロモーターはC.a
utoethanogenum由来である。
物のゲノム中に統合するよう適合させてもよい。したがって、本発明の核酸は、統合を支
援するよう適合された追加的なヌクレオチド配列(たとえば、相同組み換えおよび宿主ゲ
ノムへの標的化統合を可能にする領域)、または染色体外構築物の安定な発現および複製
を支援するように適合された追加的なヌクレオチド配列(たとえば、複製起源、プロモー
ター、および他の制御配列)を含んでもよい。
態では、核酸構築物またはベクターは発現構築物またはベクターであるが、クローニング
に使用されるような他の構築物およびベクターも本発明に含まれる。1つの特定の実施形
態では、発現構築物またはベクターはプラスミドである。
した追加的な遺伝子ならびにプロモーターに加えて、任意の数の調節要素を含んでもよい
。1つの実施形態では、発現構築物/ベクターは、1つのプロモーターを含む。別の実施
形態では、発現構築物/ベクターは、2つ以上のプロモーターを含む。1つの特定の実施
形態では、発現構築物/ベクターは、発現される各遺伝子に対する1つのプロモーターを
含む。1つの実施形態では、発現構築物/ベクターは、1つ以上のリボソーム結合部位、
好ましくは発現する各遺伝子に対するリボソーム結合部位を含む。
よび/または制限部位に必要であるもののような、標準的なリンカーヌクレオチドを含ん
でもよいことは当業者に明らかである。このようなリンカー配列は、必要であると解釈さ
れるべきではなく、また定義した配列を限定するものではない。
いずれかを使用して構築されてもよい。たとえば、化学的合成または組み換え技術を使用
してもよい。このような技術は、たとえば、Sambrookらにより(Molecul
ar Cloning: A laboratory manual, Cold Sp
ring Harbor Laboratory Press, Cold Sprin
g Harbor, NY, 1989)に記載されている。さらなる例示的な技術は、
以下の本明細書の実施例部分に記載される。本質的に、個々の遺伝子および調節要素は、
遺伝子が発現されて所望のタンパク質を形成するようお互いに操作可能に結合されている
。本発明の使用に適切なベクターは、当業者に理解されている。しかしながら、例として
、以下のベクターが適切であろう:pMTL80000ベクター、pIMP1、pJIR
750、および以下の本明細書の実施例に例示されるプラスミド。
よいことは明らかである。
菌、および酵母を含む宿主生物、特に微生物を提供する。
1つ以上の外来性核酸は、裸核酸として親微生物に送達されてもよく、または形質転換
工程を促進するために1つ以上の薬剤と製剤化されてもよい(たとえば、リポソーム結合
核酸、核酸が含まれる生物)。1つ以上の核酸は、適切なように、DNA、RNA,また
はその組み合わせであってもよい。制限酵素を特定の実施形態で使用してもよい;たとえ
ば、Murray, N.E.らによる(2000) Microbial. Mole
c. Biol. Rev. 64, 412.参照。
するための任意の先行技術を使用して調製されてもよい。例として、形質転換(形質誘導
またはトランスフェクション)は、エレクトロポレーション、超音波処理、ポリエチレン
グリコール媒介形質転換、または化学的もしくは天然のコンピテンス、または接合により
達成されてもよい。適切な形質転換技術は、たとえば、Sambrook J, Fri
tsch EF, Maniatis T: Molecular Cloning:
A laboratory Manual, Cold Spring Harbour
Labrotary Press, Cold Spring Harbour, 1
989.に記載される。
れる核酸をメチル化する必要がある。これは以下に記載される技術を含む様々な技術を使
用して行うことができ、かつ以下の本明細書の実施例にさらに例示される。
b)(i)本明細書に記載される発現構築物/ベクターおよび(ii)メチルトランスフ
ェラーゼ遺伝子を含むメチル化構築物/ベクターのシャトル微生物への導入;
c)メチルトランスフェラーゼの発現;
d)シャトル微生物由来の1つ以上の構築物/ベクターの単離;
e)1つ以上の構築物/ベクターの目的微生物への導入
を含む方法により産生される。
れる。別の実施形態では、ステップBのメチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現は誘導さ
れる。
メチル化を促進する、制限陰性の微生物である。特定の実施形態では、シャトル微生物は
、制限陰性のE.coli、Bacillus subtillis、またはLacto
coccus lactisである。
。
と、メチル化構築物/ベクター上に存在するメチルトランスフェラーゼ遺伝子が誘導され
る。本発明の1つの特定の実施形態では、メチル化構築物/ベクターは、誘導可能なla
cプロモーターを含み、かつラクトースまたはその類似体、より好ましくはイソプロピル
―β―D−チオ―ガラクトシド(IPTG)の添加により誘導されるが、誘導は任意の適
切なプロモーター系によるものであってもよい。他の適切なプロモーターは、ara、t
et、またはT7システムを含む。本発明のさらなる実施形態では、メチル化構築物/ベ
クタープロモーターは構成的プロモーターである。
微生物で発現されるように、メチル化構築物/ベクターはシャトル微生物のアイデンティ
ティーに特異的な複製起源を有する。好ましくは、発現構築物上に存在する任意の遺伝子
が目的微生物で発現されるように、発現構築物/ベクターは、目的微生物のアイデンティ
ティーに特異的な複製起源を有する。
メチル化をもたらす。発現構築物/ベクターはその後、任意の既知の方法にしたがいシャ
トル微生物から単離されてもよい。例として、本明細書の実施例に記載される方法を使用
して発現構築物/ベクターを単離してもよい。
。しかしながら、例として、以下の実施例に記載される方法を使用してもよい。発現構築
物/ベクターはメチル化されるため、発現構築物/ベクター上に存在する核酸配列は目的
微生物に組み込まれることができ、かつうまく発現される。
とが予想される。したがって、1つの実施形態では、結果として得られるメチルトランス
フェラーゼ酵素を知られている方法を使用して収集し、発現プラスミドをメチル化するた
めに体外で使用してもよい。発現構築物/ベクターはそれから発現用の目的微生物に導入
されてもよい。別の実施形態では、メチルトランスフェラーゼ遺伝子がシャトル微生物の
ゲノムに誘導された後、シャトル微生物への発現構築物/ベクターの導入、シャトル微生
物からの1つ以上の構築物/ベクターの単離を行い、その後、目的微生物への発現構築物
/ベクターの導入が行われる。
て当該の組成物を提供してもよいことが予想される。このような組成物は、制限障壁機構
を回避して本発明の組換え微生物を産生するために特に有用である。
クターはプラスミドである。
業者には明らかである。しかしながら、例として、枯草菌ファージ ΦT1 メチルトラ
ンスフェラーゼおよび以下の本明細書の実施例に記載されるメチルトランスフェラーゼが
使用されてもよい。1つの実施形態では、メチルトランスフェラーゼは配列番号60のア
ミノ酸配列を有し、または機能的に等価なその変異体である。所望のメチルトランスフェ
ラーゼ配列および遺伝子コードを考慮して、適切なメチルトランスフェラーゼをコードす
る核酸は明らかである。1つの実施形態では、メチルトランスフェラーゼをコードする核
酸は、以下の本明細書の実施例に記載されている通りである(たとえば、配列番号63の
核酸、または機能的に等価なその変異体である)。
ベクターを使用して、メチル化構築物/ベクターを生成してもよい。しかしながら、例と
して、以下の実施例に記載されるプラスミドを使用してもよい。
本発明は、本発明の組換え微生物を使用してCOを含む基質を発酵することを含む微生
物発酵により、1つ以上のテルペン類および/またはその前駆体、ならびに任意に1つ以
上の他の産物を産生する方法を提供する。好ましくは、1つ以上のテルペンおよび/また
はその前駆体は、主要な発酵産物である。本発明の方法は、工業工程由来の大気中炭素の
排出の総量を低減するために使用してもよい。
に発酵して少なくとも1つ以上のテルペン類および/またはその前駆体を産生するステッ
プを含む。
、IPP、ジメチルアリル二リン酸(DMAPP)、イソプレン、ゲラニルピロリン酸(
GPP)、ファルネシルピロリン酸(FPP)、およびファルネセンから選択される。
後これを用いてより長鎖のテルペン類を合成する代わりに、直接ゲラニルトランストラン
スフェラーゼを介して、C10モノテルペノイド類またはC15セスキテルペノイド類な
どのより長鎖のテルペン類を合成することも可能である(表6参照)。C15セスキテル
ペノイド構築ブロックファルネシル―PPからファルネセンを産生することが可能であり
、これは、エタノールと同様に、輸送燃料として使用できる。
(a)本発明の1つ以上の微生物の培養物を含む生物反応器にCOを含む基質を提供する
ステップ;および
(b)生物反応器の培養物を嫌気的に発酵して少なくとも1つのテルペンおよび/または
その前駆体を産生するステップと
を含む。
a)工業的工程の結果として産生されたCO含有気体を補足することと、
b)本発明の1つ以上の微生物を含む培養による、少なくとも1つ以上のテルペンおよび
/またはその前駆体を産生するためのCO含有気体の嫌気的発酵のステップ
を含む。
体の基質である。気体状の基質は工業工程の副産物として得られる廃ガスを含むCOであ
ってもよく、または自動車の排気煙霧由来などのいくつかの他の供給源由来であってもよ
い。ある実施形態では、工業工程は、製鋼などの鉄金属製品製造、非鉄製品の製造、石油
精製工程、石炭の気化、電力生成、カーボンブラック生成、アンモニア生成、メタノール
産生および石炭製造からなる群から選択される。これらの実施形態では、CO含有気体は
、任意の便利な方法を使用して、大気中に排出される前に工業工程から補足されてもよい
。COは合成ガス(一酸化炭素および水素を含む気体)の成分であってもよい。工業工程
から生成したCOは通常燃焼されてCO2を産生する。したがって本発明は、CO2温室
ガスの放出を低減しかつバイオ燃料として使用するテルペンを産生するのに特に有用であ
る。気体状のCO含有基質の組成に応じて、発酵にこの基質を導入する前に、ダスト粒子
などの望ましくない不純物を除去するよう処置することもまた望ましい。たとえば、気体
状の基質は、知られている方法を使用して濾過され、または洗浄されてもよい。
Oを発生するために、CO含有基質の気体に加え、適切な液体栄養培地が生物反応器に供
給される必要があることが理解されるであろう。基質および培地は、連続形態、バッチ、
またはバッチ供給形態で生物反応器に供給されてもよい。栄養培地は、使用される微生物
の増殖を可能にするために十分なビタミン類および無機類を含む。COを使用するテルペ
ンおよび/またはその前駆体を産生するための発酵に適した嫌気性培地は当業者に知られ
ている。たとえば、適切な培地は、Biebel(2001)に記載される。本発明の1
つの実施形態では、培地は、以下の本明細書の実施例に記載される通りである。
を発生させるための適切な条件下で行われることが望ましい。考慮されるべき反応条件と
しては、圧力、温度、ガス流量、液体流量、培地のpH、培地の酸化還元電位、撹拌速度
(もし連続撹拌タンクリアクターが使用される場合)、接種レベル、液相中のCOが制限
されないことを保証するための最大気体基質濃度、および産生物阻害を回避するための最
大産生物濃度が挙げられる。
させ、それによりCOが基質である発酵反応の効率を増大させることが望ましい。増大し
た圧力で操作することにより、気相から液相へCO移送の速度が著しく増大し、少なくと
も1つ以上のテルペンおよび/またはその前駆体の産生のための炭素供給源としてCOが
微生物に取り込まれ得る。このことはまた、生物反応器が大気圧よりも高い圧力で維持さ
れる場合、保持時間(入力した気体の流量で割った生物反応器の液体容量として定義され
る)が、低減できることを意味する。最適反応条件は、使用される本発明の特定の微生物
に部分的に依存する。しかしながら、一般的に、大気圧よりも高い圧力で発酵を実施する
ことが好ましい。また、COから1つ以上のテルペンおよび/またはその前駆体への与え
られる変換比率は部分的に基質の保持時間の関数に依存し、また所望の保持時間を達成す
ることが今度は必要とされる生物反応器の容量を決定づけるため、加圧したシステムの使
用により必要とされる生物反応器の容量を大きく低減でき、その結果発酵器具の資本費用
を大きく低減できる。米国特許第5,593,886号に開示される実施例にしたがって
、生物反応器の容量はリアクターの作動圧力の増大に対して直線的比率で低減できうる。
すなわち、10大気圧で作動する生物反応器は、1大気圧で作動する生物反応器の1/1
0の容量のみを必要とする。
されている。たとえば、国際公開公報第02/08438号は、30psigおよび75
psigの圧力下で気体からエタノールへの発酵を実施し、それぞれ150g/日、36
9g/日の生産性でエタノールを得る。しかしながら、同様の媒体および投入気体組成物
を使用して大気圧で実施した発酵の例では、1日に1リットルあたり10〜20倍少ない
エタノールが産生されることがわかった。
るようなものであることが望ましい。これは、COが限定される条件の結果、1つ以上の
産生物が培養に消費され得ることによるものである。
く影響する。たとえば、O2は、嫌気的発酵工程の効率を低減する。発酵の前後の発酵工
程の段階における望ましくないまたは不必要な気体の処理は、このような段階の負担を増
大させる可能性がある(たとえば、気体流が生物反応器に入る前に圧縮される場合、発酵
には必要ではない気体を圧縮するために不必要なエネルギーが使用される)。したがって
、基質の流れ、特に工業供給源由来の基質の流れを処置して望ましくない成分を除去し、
かつ望ましい成分の濃度を増大させることが望ましい。
水性培養培地は最小嫌気性細菌増殖培地である。適切な培地は当業者に知られており、例
えば米国特許第5,173,429号、同第5,593,886号、および国際公開公報
第02/08438号に記載され、および本明細書で以下の実施例に記載される通りであ
る。
および/または1つ以上の他の産物を含む混合流は、分別蒸留または蒸発、浸透気化法、
気体のストリッピングおよび液体―液体抽出などを含む抽出発酵などの、当業者に知られ
ている方法により発酵ブロスから回収されてもよい。
らびに1つ以上の産物は、生物反応器からブロスの一部を連続的に除去し、微生物細胞を
ブロスから(濾過により簡便に)分離し、およびブロスから1つ以上の産物を回収するこ
とにより、発酵ブロスから回収される。アルコールは、たとえば蒸留により簡便に回収さ
れる。アセトンは、たとえば蒸留により回収されてもよい。産生された任意の酸は、たと
えば活性炭への吸着により回収されてもよい。分離された微生物細胞は、好ましくは発酵
生物反応器に戻される。任意のアルコールおよび酸が除去された後に残存する細胞を含ま
ない透過物もまた、好ましくは発酵生物反応器に戻される。生物反応器に戻す前に、栄養
培地を補充するために追加的な栄養物(ビタミンBなど)が細胞を含まない透過物に添加
されてもよい。
合、pHは、生物反応器に戻す前に、発酵生物反応器中のブロスのpHと同様のpHに再
調節されるべきである。
本発明を以下の限定する意味を持たない実施例を参照してより詳細に記載する。
のイソプレンシンターゼの発現
本発明者らは、C.autoethanogenumおよびC.ljungdahli
iなどの酸化炭素栄養性酢酸産生菌におけるテルペン生合成遺伝子を同定した。組み換え
微生物を、イソプレンを産生するように改変した。イソプレンは、ポプラなどのいくつか
の植物から、UV放射から葉を保護するため天然に発せられる。ポプラのイソプレンシン
ターゼ(EC 4.2.3.27)遺伝子を、コドンを最適化して、COからイソプレン
を産生するように酸化炭素栄養性酢酸産生菌C.autoethanogenumに導入
した。この酵素は、テルペノイド生合成の鍵となる中間体DMAPP(ジメチルアリル二
リン酸)を不可逆反応でイソプレンに変換する(図1)。
すべてのサブクローニングステップを、以前に記載された標準的な株および増殖条件を
使用してE.coliで実施した(Sambrook et al, Molecula
r Cloning: A laboratory Manual, Cold Spr
ing Harbour Labrotary Press, Cold Spring
Harbour, 1989; Ausubel et al, Current p
rotocols in molecular biology, John Wile
y & Sons, Ltd., Hoboken, 1987)。
SM10061誘導体)を、DSMZ(The German Collection o
f Microorganisms and Cell Cultures、Inhoffe
nstrase 7 B, 38124、ドイツブラウンシュヴァイク市)から取得した
。増殖を、厳密な嫌気的条件および技術を使用して37℃で実行した(Hungate,
1969, Methods in Microbiology, vol. 3B.
Academic Press, New York: 117−132; Wolf
e, 1971, Adv. Microb. Physiol., 6: 107−1
46)。酵母抽出物を含まない化学的に定義されたPETC培地(表1)ならびに唯一の
炭素およびエネルギー供給源として、製鋼排ガスを含む30psiの一酸化炭素(ニュー
ジーランドGlenbrookのNew Zealand Steelで収集、組成:44
% CO、32% N2、22% CO2、2% H2)
を使用した。
本発明では、標準的な組み換えDNAおよび分子クローニング技術を使用した(Sam
brook J, Fritsch EF, Maniatis T: Molecul
ar Cloning: A laboratory Manual, Cold Sp
ring Harbour Laboratory Press, Cold Spri
ng Harbour, 1989; Ausubel FM, Brent R, K
ingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith
JA, Struhl K: Current protocols in molec
ular biology. John Wiley & Sons, Ltd., H
oboken, 1987)。Poplar tremuloidesのイソプレンシン
ターゼ(AAQ16588.1; GI:33358229)を、コドンを最適化して(
配列番号21)合成した。C.autoethanogenumのピルビン酸:フェレド
キシンオキシドレダクターゼのプロモーター領域(配列番号22)を使用してこの遺伝子
を発現した。
ゲノムDNAを、BertramとDurre(1989)による方法の改変法を使用し
て単離した。1晩培養した100mlの培養物を回収し(6,000×g、15分、4℃
)、リン酸カリウム緩衝液(10mM、pH7.5)で洗浄して1.9mlのSTE緩衝
液(50 mM Tris−HCl、1mM EDTA、200mM スクロース;pH
8.0)に懸濁した。300μlのリゾチーム(〜100,000U)を添加して混合物
を37℃で30分間インキュベートした後、280μlの10%(w/v)SDS溶液を
添加し、さらに10分間インキュベートした。240μlのEDTA溶液(0.5M、p
H8)、20μl Tris−HCl(1M、pH7.5)、および10μl RNas
e A(Fermentas Life Sciences)を添加することによりRN
Aを室温でs消化した。その後、100μlのプロテイナーゼK(0.5U)を添加し、
タンパク質の分解を37℃で1〜3時間行った。最終的に、600μlの過塩素酸ナトリ
ウム(5M)を添加し、その後フェノール―クロロホルム抽出およびイソプロパノール沈
殿を行った。DNAの定量および定性分析を分光測定で行った。ピルビン酸:フェレドキ
シンオキシドレダクターゼ のプロモーター配列を、オリゴヌクレオチドPpfor−N
otI−F(配列番号:23:AAGCGGCCGCAAAATAGTTGATAATA
ATGC)およびPpfor−NdeI−R(配列番号:24:TACGCATATGA
ATTCCTCTCCTTTTCAAGC)を使用し、iProof High Fid
elity DNAポリメラーゼ(Bio−Rad Laboratories)および
を以下のプログラムを使用するPCRにより増幅した、そして最初の変性(98℃、30
秒)、続いて32周期の変性(98℃、10秒間)、アニーリング(50〜62℃、30
〜120秒)および伸長(72℃、30〜90秒)、その後の最終伸長ステップ(72℃
、10分間)。
発現プラスミドの構築を、E.coli株DH5α−T1R(体外gen)およびXL
1−Blue MRF’ Kan(Stratagene)で実施した。第1のステップ
で、増幅したPpforプロモーター領域をNotIおよびNdeI制限部位を使用して
E.coli−ClostridiumシャトルベクターpMTL85141 (FJ7
97651.1; Nigel Minton, University of Not
tingham; Heap et al., 2009)にクローニングし、プラスミ
ドpMTL85146を産生した。第2のステップとして、ispSを制限部位NdeI
およびEcoRIを使用してpMTL85146にクローニングし、プラスミドpMTL
85146−ispSを得た(図2、配列番号25)。
形質転換の前に、米国特許公開公報第2011/0236941号に記載されるように
、C.autoethanogenum、C.ragsdaleiおよびC.ljung
dahlii由来のメチルトランスフェラーゼ遺伝子から設計したメチル化プラスミド(
配列番号64)上に共発現される、合成したハイブリッドタイプIIメチルトランスフェ
ラーゼ(配列番63)を使用して、DNAをE.coli中で生体内でメチル化した。
−Blue MRF’ Kan(Stratagene)の同じ細胞に形質転換したが、
これは、それらのグラム−(−)複製起源の適合性(発現プラスミドにおける高コピーの
ColE1およびメチル化プラスミドにおける低コピーのp15A)により可能である。生体
内メチル化を1mMのIPTGの添加により誘導し、メチル化プラスミドをQIAGEN
Plasmid Midi Kit(QIAGEN)を使用して単離した。この結果と
して得られる混合物を、C.autoethanogenum DSM23693での形
質転換の実験に使用したが、多量(高コピー)発現プラスミドのみがクロストリジウム中
での複製を可能にするグラム−(+)複製起源(repL)を有する。
すべての形質転換の実験の間、C.autoethanogenum DSM2369
3は、1g/Lの酵母抽出物および10g/lのフルクトースならびに炭素供給源として
30psiの製鋼排ガス(ニュージーランドGlenbrookのNew ZEalan
d Steelから収集、組成:44% CO、32% N2、22% CO2、2%
H2)で補足されたPETC培地(表1)中で増殖させた。
DSM23693培養物を、新鮮な培地に継代し3日間連続で継代
培養した。これらの細胞を使用して、40mMのDL−スレオニンを含む50mlのPE
TC培地に0.05のOD600mで播種した。培養物のOD600mが0.4に達した
際に、細胞を嫌気チャンバーに移し、4,700×gおよび4℃で収集した。この培養物
を、氷冷したエレクトロポレーションバッファー(270mM スクロース、1mM M
gCl2、7mM リン酸ナトリウム、pH7.4)で2回洗浄し、最終的に600μl
の新鮮なエレクトロポレーションバッファー懸濁した。この混合物を、メチル化プラスミ
ド混合物1μgを含む0.4cmの電極ギャップをもつあらかじめ氷冷したエレクトロポ
レーションキュベットに移し、すぐに以下の設定(2.5kV、600Ω、および25μ
F)でGene pulser Xcellエレクトロポレーションシステム(Bio−
Rad)を使用して電気を通した。時間定数は3.7〜4.0msが達成されたった。こ
の培養物を、5mlの新鮮な培地に移した。細胞の再産生を、チューブホルダーを備えた
Spectronic Helios Epsilon Spectrophotome
ter (Thermo)を使用して600nmの波長でモニタリングした。最初にバイ
オマスが低下した後、細胞は再び増殖を開始した。この時点からバイオマスが二倍になっ
た後、細胞を回収し、200μlの新鮮な培地に懸濁し、適切な抗生基質である4μg/
mlクラリスロマイシンまたは15μg/mlチアンフェニコールを含む選択的PETC
プレート(1.2% Bacto(商標)アガロース(BD)を含む)にプレーティング
した。播種後37℃の30psiの製鋼ガスで4〜5日で、コロニーが視認できた。
発生した後、培養を、唯一の炭素供給源として30psiの製鋼ガスとともに、5mlの
容量、次に50mlの容量にスケールアップした。
DNAの転移を検証するために、プラスミドミニプレップを、Zyppy plasm
id miniprep kit(Zymo)を使用して10mlの培養容量から実施し
た。単離したプラスミドの質は、クロストリジウムのエキソヌクレアーゼ活性のため制限
消化に十分ではなかったので[Burchhardt および Durre, 1990
]、オリゴヌクレオチドの対colE1−F(配列番号:65:CGTCAGACCCC
GTAGAAA)+colE1−R(配列番号:66:CTCTCCTGTTCCGAC
CCT)を用いて単離プラスミドでPCRを実施した。PCRはiNtRON Maxi
mise Premix PCR kit (Intron Bio Technolo
gies)を使用して、以下の条件で行った:最初の変性(94℃、2分間)、続いて3
5周期の変性(94℃、20秒間)、アニーリング(55℃、20秒間)、および伸長(
72℃、60秒間)、その後最終伸長ステップ(72℃、5分間)。
um DSM23693の50mlの培養物から単離した(上記参照)。オリゴヌクレオ
チド(配列番号67:CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCCT
GGCTCAG)およびrP2(配列番号:68:CCCGGGATCCAAGCTTA
CGGCTACCTTGTTACGACTT)[Weisberg et al., 1
991]およびiNtRON Maximise Premix PCR kit(In
tron Bio Technologies)を使用して、16s rRNAに対する
PCRを、以下の条件で行った:最初の変性(94℃、2分間)、続いて35周期の変性
(94℃、20秒)、アニーリング(55℃、20秒)、および伸長(72℃、60秒)
、その後最終伸長ステップ(72℃、5分間)。シークエンスの結果は、C.autoe
thanogenumの16s rRNA遺伝子(rrsA)(Y18178,GI:7
271109)に対して少なくとも99.9%同一であった。
qRT−PCR実験を、導入されたのイソプレンシンターゼの遺伝子がC.autoe
thanogenumでうまく発現したことを確認するために実行した。
ラスミドを含まない対照培養物を、50mlの血清用のビンおよび唯一のエネルギーおよ
び炭素の供給源として30psi製鋼排ガス(ニュージーランドGlenbrookのN
ew Zealand Steelで収集、組成:44% CO、32% N2、22%
CO2、2% H2)を用いてPETC培地(表1)中で増殖させた。0.8mlの試料
を0.5前後のOD600nmの対数増殖期中に採取し、1.6mlのRNA保護試薬(
Qiagen)と混合した。この混合物を遠心し(6,000×g、5分、4℃)、細胞
沈殿物を、液体窒素ですばやく凍結し、RNA抽出まで−80℃で保存した。総RNAを
、RNeasy Mini Kit (Qiagen)を使用してマニュアルのプロトコ
ル5にしたがって単離した。細胞の破壊を、混合物をシリンジに10回通過させることに
より行い、50μlのRNase/DNaseを含まない水で溶出した。DNA−fre
e(登録商標) Kit(Ambion)を使用したDNase I処理の後、逆転写ステ
ップを、SuperScript III Reverse Transcriptas
e Kit (体外gen, Carlsbad, CA, USA)を使用して実行し
た。RNAを、Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent
Technologies, Santa Clara, CA, USA)、Qubi
t Fluorometer(体外gen, Carlsbad, CA, USA)を
使用して、およびゲル電気泳動により検査した。非RT対照を、オリゴヌクレオチド対ご
とに実施した。すべてのqRT−PCR反応は、25ngのcDNAテンプレート、67
nMの各オリゴヌクレオチド(表2)、および1x iQ(商標)SYBR(登録商標)G
reen Supermix(Bio−Rad Labratories, Carls
bad, CA, USA)を含む総反応容量15μl中で、MyiQ(商標)Sing
le Colour Detection System(Bio−Rad Labra
tories, Carlsbad, CA, USA)を使用して二連で実施した。反
応条件は、95℃を3分間、続いて40周期の95℃の15秒間、55℃を15秒間およ
び72℃を30秒間であった。オリゴヌクレオチドの二量体化または他の増幅副産物の検
出のため、融解曲線分析を、qPCR(1℃/秒で58℃から95℃へ38周期)の完了
直後に実施した。2つのハウスキーピング遺伝子(グアニル酸キナーゼおよびギ酸テトラ
ヒドロ葉酸リガーゼ)を標準化のために各cDNA試料に含めた。相対的な遺伝子発現の
決定を、Relative Expression Software Tool (R
EST(c)) 2008 V2.0.7(38)を使用して行った。4log単位に渡る
cDNAの段階希釈を使用して標準曲線を作成し、結果として得られる増幅効率を用いて
mRNAの濃度を計算した。
ラスミドpMTL 85146−ispSをもつ株でispSオリゴヌクレオチド対を用
いてシグナルが測定され、ispS遺伝子がうまく発現していることを確認した。
(イソペンテニル二リン酸)間の変換のためのイソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラー
ゼの発現
前駆体DMAPP(ジメチルアリル二リン酸)およびIPP(イソペンテニル二リン酸
)の利用可能性および均衡は、テルペン類の産生に重要である。DXS経路はIPPおよ
びDMAPPを等しく合成するのに対し、メバロン酸経路ではIPPのみが産生される。
イソプレンの産生では、イソプレンシンターゼとともに存在する前駆体DMAPPのみを
必要とし、一方より高度のテルペン類およびテルペノイド類の産生では、ゲラニルトラン
ストランスフェラーゼによりゲラニル−PPを産生するために利用可能な等量のIPPお
よびDMAPPを有することが必要である。
イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ(YP_001310174.1)をコー
ドするC. beijerinckii由来のイソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラー
ゼ遺伝子idi(Gene ID:5294264)を、ispSの下流にクローニング
した。この遺伝子を、C.autoethanogenumで上述した同一の方法を使用
して取得したC. beijerinckii NCIMB8052のゲノムDNA由来
のオリゴヌクレオチドIdi−Cbei−SacI−F(配列番号:26:GTGAGC
TCGAAAGGGGAAATTAAATG)およびIdi−Cbei−KpnI−R(
配列番号:27:ATGGTACCCCAAATCTTTATTTAGACG)を使用し
て増幅した。このPCR産物を、SacIおよびKpnI制限部位を使用してベクターp
MTL 85146−ispSにクローニングし、プラスミドpMTL85146−is
pS−idi(配列番号:28)を得た。嫌気性抵抗マーカーを、制限酵素PmeIおよ
びFseIを使用してcatPからermB(ベクターpMTL82254(FJ797
646.1; Nigel Minton, University of Notti
ngham; Heap et al., 2009から入手)に交換し、プラスミドp
MTL85246−ispS−idiを形成した(図3)。
85146−ispSについて記載されるように実行した。形質転換の成功後に、増殖
実験を、50mlの血清ビンおよび唯一のエネルギーおよび炭素供給源として製鋼排ガス
(ニュージーランドGlenbrookのNew Zealand Steelで収集、組
成:44% CO、32% N2、22% CO2、2% H2)を用いてPETC培地
(表1)中で実行した。プラスミドがうまく導入されたことを確認するために、プラスミ
ドミニプレップDNAを、上述したように形質転換体から実行した。colE1(col
E1−F:配列番号:65:CGTCAGACCCCGTAGAAAおよびcolE1−
R:配列番号:66:CTCTCCTGTTCCGACCCT)、ermB(ermB−
F:配列番号:106:TTTGTAATTAAGAAGGAGおよびermB−R:配
列番号:107:GTAGAATCCTTCTTCAAC)およびidi(Idi−Cb
ei−SacI−F:配列番号:26:GTGAGCTCGAAAGGGGAAATTA
AATGおよびIdi−Cbei−KpnI−R:配列番号:27:ATGGTACCC
CAAATCTTTATTTAGACG)を標的とするオリゴヌクレオチド対を使用する
単離型プラスミドに対するPCRで、形質転換の成功を確認した(図8)。同様に、これ
らの形質転換からゲノムDNAを抽出し、オリゴヌクレオチドfD1およびrP2(上述
参照)を使用して得られた16s rRNAアンプリコンがC.autoethanog
enumの16S rRNAの遺伝子(Y18178,GI:7271109)に対して9
9.9%同一であることを確認した。
チド対(idi−F、配列番号:71:ATA CGT GCT GTA GTC AT
C CAA GAT A および idiR、配列番号:72:TCT TCA AGT
TCA CAT GTA AAA CCC A)およびプラスミドpMTL 8514
6−ispS−idiをもつC.autoethanogenumを用いた血清ビンでの
増殖実験由来の試料を使用して、上述のように、遺伝子発現が成功したことの確認を行っ
た。イソプレンシンターゼ遺伝子ispSに対するシグナルもまた観察された(図14)
。
DXS経路を介するフローを改善するために、経路の遺伝子を過剰発現させた。経路の
最初のステップである、ピルビン酸およびD−グリセルアルデヒド−3−リン酸(G3P
)のデオキシキシルロース5−リン酸(DXP/DXPS/DOXP)への変換は、デオ
キシキシルロース 5−リン酸シンターゼ(DXS)により触媒される。
C.autoethanogenumのdxs遺伝子を、上述の他の遺伝子に記載され
るように、オリゴヌクレオチドDxs−SalI−F(配列番号:29:GCAGTCG
ACTTTATTAAAGGGATAGATAA)およびDxs−XhoI−R(配列番
号:30:TGCTCGAGTTAAAATATATGACTTACCTCTG)を用い
てゲノムDNAから増幅させた。増幅された遺伝子を次にSalIおよびXhoIでプラ
スミドpMTL85246−ispS−idi内にクローン化し、プラスミドpMTL8
5246−ispS−idi−dxs(配列番号:31および図4)を産生した。表3に
開示されるオリゴヌクレオチドを使用したDNAの配列決定により、ispS、idi、
およびdxsのクローニングが変異なく成功したことを確認した(図5)。ispSおよ
びidi遺伝子を、それぞれ実施例1および実施例2に記載する。
C.autoethanogenumnでの形質転換および発現を、プラスミドpMT
L 85146−ispSに記載されるように実行した。形質転換の成功後に、増殖実験
を、50mlの血清用のビンおよび単一のエネルギーおよび炭素の供給源として30ps
i製鋼排ガス(ニュージーランドGlenbrookのNew Zealand Stee
lで収集、組成:44% CO、32% N2、22% CO2、2% H2)を用いP
ETC培地(表1)中で実行した。遺伝子発現の確認を、OD600nm=0.75で収
集した試料から上述したように実行した。オリゴヌクレオチド対 dxs−F(配列番号
:73:ACAAAGTATCTAAGACAGGAGGTCA)およびdxs−R(配
列番号:74:GATGTCCCACATCCCATATAAGTTT)を使用して、野
生型株およびプラスミドpMTL 85146−ispS−idi−dxsをもつ株にお
ける遺伝子dxsの発現を測定した。プラスミドをもつ株でのmRNAレベルが、野生型
と比較して3倍超増加していることが見出された(図15)。バイオマスはRNA抽出前
に規準化した。
メバロン酸経路の第1のステップ(図7)は、2分子のアセチルCoAをアセトアセチ
ルCoA(およびHS−CoA)に変換するチオラーゼにより触媒される。この酵素は、
同一の発明者らにより酸化炭素栄養性酢酸産生菌のClostridium autoe
thanogenumおよびC.ljungdahliiでうまく発現されている(米国
特許公開公報第2011/0236941号)。メバロン酸経路の残りの遺伝子の構築物
が設計されている。
標準的な組み換えDNAおよび分子クローニング技術を使用した(Sambrook,
J., および Russell, D., Molecular cloning:
A Laboratory Manual 3rd Ed., Cold Sprin
g Harbour Lab Press, Cold Spring Harbour
, NY, 2001)。メバロン酸経路の前半部によるメバロン酸の合成に必要とされ
る3つの遺伝子、すなわちチオラーゼ(thlA/vraB)、HMG−CoAシンター
ゼ(HMGS)およびHMG−CoAレダクターゼ(HMGR)は、オペロン(Ppta
ack−thlA/vraB−HMGS−Patp−HMGR)としてコドンを最適化さ
れた。
ペロンプロモーター(Ppta−ack)(配列番号:61)を、チオラーゼおよびHM
G−CoAシンターゼの発現に使用し、一方C.autoethanogenumのAT
Pシンターゼのプロモーター領域(Patp)をHMG−CoAレダクターゼの発現に使
用した。チオラーゼの2つの変異体、Clostridium acetobutyli
cum由来のthlAおよびStaphylococcus aureu由来のvraB
を合成し、かつ、さらなるサブクローニングのためにNdeIおよびEcoRI制限部位
を側面に位置した。HMG−CoAシンターゼ(HMGS)およびHMG−CoAレダク
ターゼ(HMGR)の両方をStaphylococcus aureusから合成し、
さらなるサブクローニングのためEcoRI−SacI および KpnI−XbaI制
限部位それぞれに側面に位置した。使用したすべての最適化DNAを表4に示す。
ーゼプロモーター(Patp)を、オリゴヌクレオチドpUC57−F(配列番号:46
:AGCAGATTGTACTGAGAGTGC)およびpUC57−R(配列番号:4
7:ACAGCTATGACCATGATTACG)を使用し、ならびにpUC57−P
atp−HMGRをテンプレートとして使用して増幅した。2033bpの増幅したフラ
グメントを、SacIおよびXbaIで消化して、E.coli−Clostridiu
mシャトルベクターpMTL 82151に連結し(FJ7976; Nigel Mi
nton, University of Nottingham, UK; Heap
et al., 2009, J Microbiol Methods. 78:
79−85)、プラスミドpMTL 82151−Patp−HMGR(配列番号:76
)を得た。
ヌクレオチドEcoRI−HMGS_F(配列番号:77:AGCCGTGAATTCG
AGGCTTTTACTAAAAACA)およびEcoRI−HMGS_R(配列番号:
78:AGGCGTCTAGATGTTCGTCTCTACAAATAATT)を使用し
て、コドンを合成したプラスミドpGH−seq3.2から増幅した。1391bpの増
幅したフラグメントを、SacIおよびEcoRIで消化し、以前に作成したプラスミド
pMTL 82151−Patp−HMGRに連結して、pMTL 82151−HMG
S−Patp−HMGR(配列番号:79)を得た。作成したプラスミドpMTL 82
151−HMGS−Patp−HMGR(配列番号:79)および1768 bpのコド
ンを最適化したオペロンPptaack−thlA/vraBは、両方ともNotIおよ
びEcoRIで切断した。連結反応を実施し、その後E.coli XL1−Blue
MRF’ Kanに形質転換して、プラスミドpMTL8215−Pptaack−th
lA/vraB−HMGS−Patp−HMGR(配列番号:50)を得た。
のために必要である5つの遺伝子、すなわち、メバロン酸キナーゼ(MK)、ホスホメバ
ロン酸キナーゼ(PMK)、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ(PMD)、イソペ
ンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ(idi)およびイソプレンシンターゼ(ispS
)を、ATG:Biosynthetics GmbH(Merzhausen、ドイツ
)によりコドンを最適化した。メバロン酸キナーゼ(MK)、ホスホメバロン酸キナーゼ
(PMK)およびジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ(PMD)を、Staphyl
ococcus aureusから取得した。
(配列番号:62)を、メバロン酸キナーゼ(MK)、ホスホメバロン酸キナーゼ(PM
K)およびジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ(PMD)の発現に使用し、一方C.
autoethanogenumのピルビン酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼの
プロモーター領域(Pfor)(配列番号:22)を、イソペンテニル−二リン酸Δ−イ
ソメラーゼ(idi)およびイソプレンシンターゼ(ispS)の発現に使用した。使用
されたすべてのDNA配列を表5に示す。コドンが最適化されたPrnf−MKを、オリ
ゴヌクレオチド NotI−XbaI−Prnf−MK_F(配列番号:80:ATGC
GCGGCCGCTAGGTCTAGAATATCGATACAGATAAAAAAAT
ATATAATACAG)およびSalI−Prnf−MK_R(配列番号:81:TG
GTTCTGTAACAGCGTATTCACCTGC)で合成プラスミドpGH− P
rnf−MK−PMK−PMDから増幅した。その後、増幅した遺伝子をNotIおよび
SalIでプラスミドpMTL83145(配列番号:49)にクローニングして、プラ
スミドpMTL8314−Prnf−MK(配列番号:82)を産生した。この結果とし
て得られるプラスミドおよびコドンを最適化した2165bpのフラグメントPMK−P
MDを、SalIおよびHindIIIで消化した。連結反応を実施してプラスミドpM
TL 8314−Prnf−MK−PMK−PMD(配列番号:83)を得た。
の側面に位置するイソプレンシンターゼ(ispS)を以前に作成したファルネセンプラ
スミドpMTL 8314−Prnf−MK−PMK−PMD−Pfor−idi−is
pA−FS(配列番号:91)に連結することにより作成し、プラスミドpMTL831
4−Prnf−MK−PMK−PMD−Pfor−idi−ispS(配列番号:84)
を得た。最終的なイソプレン発現プラスミドpMTL 8314−Pptaack−th
lA−HMGS−Patp−HMGR−Prnf−MK−PMK−PMD−Pfor−i
di−ispS(配列番号:58、図10)を、NotIおよびXbaIを使用してpM
TL8215−Pptaack−thlA−HMGS−Patp−HMGR(配列番号:
50)由来のPptaack−thlA−HMGS−Patp−HMGRの4360bp
のフラグメントとpMTL 8314−Prnf−MK−PMK−PMD−Pfor−i
di−ispS(配列番号:84)を連結することにより作成した。
oethanogenumへのファルネセンシンターゼの導入
テルペノイドの重要な中間体IPPおよびDMAPPから直接イソプレンを産生してよ
り長鎖のテルペンを合成する代わりに、ゲラニルトランストランスフェラーゼを介して、
直接C10モノテルペノイド類またはC15セスキテルペノイド類などの長鎖テルペン類
を合成することも可能である(表6参照)。C15セスキテルペノイド構築ブロックファ
ルネシルPPから、ファルネセンを産生することが可能であり、これはエタノールと同じ
く、輸送燃料に使用できる。
メバロン酸経路を介したIPPおよびDMAPPからのファルネセン合成に必要とされ
る2つの遺伝子、すなわち、ゲラニルトランストランスフェラーゼ(ispA)およびα
ファルネセンシンターゼ(FS)を、コドンを最適化した。ゲラニルトランストランスフ
ェラーゼ(ispA)はEscherichia coli str. K−12 su
bstrから取得しMG1655アルファダルファルネセンシンターゼ(FS)はMal
us x domesticaから取得した。使用されたすべてのDNA配列を表6に記
載する。コドンを最適化したidiは、メバロン酸経路idi_F(配列番号:86:A
GGCACTCGAGATGGCAGAGTATATAATAGCAGTAG)およびi
di_R2(配列番号:87: AGGCGCAAGCTTGGCGCACCGGTTT
ATTTAAATATCTTATTTTCAGC)で合成プラスミドpMTL83245
−Pfor−FS−idi(配列番号:85)から増幅した。その後、増幅した遺伝子を
、XhoIおよびHindIIIでプラスミドpMTL83245−Pforにクローン
化し、プラスミドpMTL83245−Pfor−idi(配列番号:88)を産生した
。この結果として得られたプラスミドおよびファルネセンシンターゼの1754bpのコ
ドン最適化フラグメントを、HindIIIおよびNheIで消化した。連結反応を実施
して、プラスミドpMTL83245−Pfor−idi−FS(配列番号:89)を得
た。ispAの946bpフラグメントおよびpMTL83245−Pfor−idi−
FSを、AgeIおよびHindIIIで消化し、結合させ、結果としてプラスミドpM
TL83245−Pfor−idi−ispA−FS(配列番号:90)を作成した。上
流のメバロン酸経路をもたないファルネセン発現プラスミドは、pMTL83245−P
for−idi−ispA−FSからのPfor−idi−ispA−FSの2516b
pのフラグメントをpMTL 8314−Prnf−MK−PMK−PMDに連結するこ
とにより作成して、プラスミドpMTL 8314−Prnf−MK−PMK−PMD−
Pfor−idi−ispA−FS(配列番号:91)を得た。最終的なファルネセン発
現プラスミドMTL83145−thlA−HMGS−Patp−HMGR−Prnf−
MK−PMK−PMD−Pfor−idi−ispA−FS(配列番号:59および図1
8)は、制限部位NotIおよびXbaIを使用してpMTL8215−Pptaack
−thlA−HMGS−Patp−HMGR (配列番号:50)由来のPptaack
−thlA−HMGS−Patp−HMGRの4630bpフラグメントをpMTL 8
314−Prnf−MK−PMK−PMD−Pfor−idi−ispA−FS(配列番
号:91)と連結することにより作成される。
C.autoethanogenumでの形質転換および発現を、実施例1に記載する
ように実行した。
MTL8314−Prnf−MK−PMK−PMD−Pfor−idi−ispA−F
S(配列番号:59)の存在を、garm+ve perpliconの一部およびpMT
L831xxxの一連のプラスミド上のcat遺伝子の大部分を選択的に増幅するオリゴ
ヌクレオチドrepHF(配列番号:92:AAGAAGGGCGTATATGAAAA
CTTGT)およびcatR(配列番号:93:TTCGTTTACAAAACGGCA
AATGTGA)を使用して、コロニーPCRにより確認した。1854bpのバンドを
得た(図16)。
下流のメバロン酸経路遺伝子であるメバロン酸キナーゼ(MK 配列番号:51)、ホ
スホメバロン酸キナーゼ(PMK 配列番号:52)、ジホスホメバロン酸デカルボキシ
ラーゼ(PMD 配列番号:53)、イソペンチル−二リン酸Δ−イソメラーゼ(idi
;配列番号:54)、ゲラニルトランストランスフェラーゼ(ispA;配列番号:56
)およびファルネセンシンターゼ(FS配列番号57)の発現の確認を、実施例1に上述
するように行った。使用したオリゴヌクレオチドを表7に列挙する。
プラスミドpMTL8314−Prnf−MK−PMK−PMD−Pfor−idi−
ispA−FSの形質転換の成功を確認した後に、唯一の炭素およびエネルギー供給源と
して30psiのReal Mill Gas(ニュージーランドGlenbrookの
New Zealand Steelで収集、組成:44% CO、32% N2、22%
CO2、2% H2)を用いて、250mlの血清ビン中の50mlPETC培地(表
1)で増殖実験を行った。すべての培養物を、血清ビンを保持するよう適合されオービタ
ル振盪機上で、37℃でインキュベートした。形質転換物を、1mMのメバロン酸を追加
した新鮮な培地に継代培養する前に、OD600が、〜0.4となるまで増殖させた。メ
バロン酸のない対照を、同一の培養物から同一の時間に設定した。GC−MS(ガスクロ
マトグラフィー-質量分析)の試料を、各時点で採取した。図17は、2つの対照培養物
および1mMのメバロン酸を供給した2つの培養物の代表的な増殖曲線を示す。ファルネ
センが、実験の開始から66時間後および90時間後に採取した試料で検出された(図1
9〜21)。
αファルネセンのGC−MS検出のため、5mlの培養物に対し、2mlのヘキサンを
添加し、激しく振って密封したガラスのバルク管(balch tube)中で混合する
ことによりヘキサン抽出を実施した。その後、この管を、5分間超音波処置ウォーターバ
スでインキュベートして相の分離を促進した。400μlのヘキサン抽出物をGCバイア
ル(vail)に移しオートローダーに装填した。試料を、0.25μmのフィルム厚の
EC−1000カラム( Grace Davidson, OR, USA)、VAR
IAN MS workstation (Varian Inc, CA, USA.
Now Agilent Technologies)およびNIST MS Sea
rch 2.0 (Agilent Technologies, CA, USA)を
備えたVARIAN GC3800 MS4000 iontrap GC/MS (V
arian Inc, CA, USA. Now Agilent Technolo
gies)で分析した。注入容量は1μlであり、ヘリウムキャリアーガスの流量は1m
l/分であった。
明細書を読むことにより本発明の実施を可能とすることを目的とする。しかしながら、本
発明の範囲を逸脱することなく、多くの成分およびパラメータを、特定の内容に変動また
は修正してもよく、知られている均等物に変えてもよいことは、当業者に明らかである。
また、このような修正および均等物は、個々に設定されるように本明細書に組み込まれて
いることは明らかである。発明の名称、表題などは、本文書の読み手の理解を高めるため
に提供されるものであり、本発明の範囲を限定するように読み取られるものではない。
開公報のすべての開示は、本明細書に参照として援用される。しかしながら、いずれの特
許出願、特許、および公開公報に対する参照は、有効な先行技術を構成するまたは世界の
いずれかの国で共通な一般的知識の部分を形成すると認識されるものではなく、また示唆
されるものではない。
sing)」などの用語は、排他的な意味と反対の包括的な意味として理解され、すなわ
ち「限定するものではないが、〜を含む」と理解される。
Claims (14)
- Clostridium属細菌又はMoorella属細菌の組換え細胞であって、
非メバロン酸経路によるイソペンテニル二リン酸合成能を有し、
導入された核酸として、イソプレン合成酵素をコードする第一核酸を有し、当該第一核酸が前記組換え細胞内で発現し、
導入された核酸として、メバロン酸経路で作用する酵素群をコードする第二核酸をさらに有し、当該第二核酸が前記組換え細胞内で発現し、メバロン酸経路によるイソペンテニル二リン酸合成能をさらに有し、
前記メバロン酸経路で作用する酵素群は、チオラーゼ、HMG−CoAシンターゼ、HMG−CoAレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ及びジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼを含み、
一酸化炭素を含む気体基質からイソプレンを生産可能である組換え細胞。 - Clostridium属細菌又はMoorella属細菌の組換え細胞であって、
一酸化炭素を含む気体基質からアセチルCoAを合成する機能を有し、
導入された核酸として、イソプレン合成酵素をコードする第一核酸を有し、当該第一核酸が前記組換え細胞内で発現し、
導入された核酸として、メバロン酸経路で作用する酵素群をコードする第二核酸をさらに有し、当該第二核酸が前記組換え細胞内で発現し、メバロン酸経路によるイソペンテニル二リン酸合成能をさらに有し、
前記メバロン酸経路で作用する酵素群は、チオラーゼ、HMG−CoAシンターゼ、HMG−CoAレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ及びジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼを含み、
一酸化炭素を含む気体基質からイソプレンを生産可能である組換え細胞。 - 前記組換え細胞であって前記第二核酸を有さないものと比較して、2倍以上のイソプレンを生産可能である請求項1又は2に記載の組換え細胞。
- 前記メバロン酸経路は、酵母のメバロン酸経路である請求項1〜3のいずれかに記載の組換え細胞。
- 前記イソプレン合成酵素は、ポプラ(Populus tremuloides)由来のものである請求項1〜4のいずれかに記載の組換え細胞。
- 前記イソプレン合成酵素をコードする核酸は、下記(a)又は(b)の核酸である請求項1〜5のいずれかに記載の組換え細胞。
(a)配列番号21の配列を有する核酸
(b)配列番号21の核酸配列と90%以上の核酸配列同一性を有する、配列番号21の配列を有する核酸の機能的に等価な変異体 - 前記第一核酸及び/又は前記第二核酸は、コドンが最適化されたものである請求項1〜8のいずれかに記載の組換え細胞。
- 前記第一核酸及び/又は前記第二核酸は、組換え細胞のゲノムに組み込まれている請求項1〜7のいずれかに記載の組換え細胞。
- 前記第一核酸及び/又は前記第二核酸は、プラスミドに組み込まれている請求項1〜7のいずれかに記載の組換え細胞。
- 請求項1〜9のいずれかに記載の組換え細胞を、一酸化炭素を含む気体基質を炭素源として用いて培養し、当該組換え細胞にイソプレンを生産させるイソプレンの生産方法。
- 請求項1〜9のいずれかに記載の組換え細胞に、一酸化炭素を含む気体基質を接触させ、当該組換え細胞に前記気体基質からイソプレンを生産させるイソプレンの生産方法。
- 気体基質が、さらに水素及び/又は二酸化炭素を含む、請求項10又は11に記載の方法。
- 気体基質が、鉄金属製品製造、非鉄製品製造、石油精製、石炭ガス化、電力生産、カーボンブラック製造、アンモニア製造、メタノール製造、コークス製造およびそれらの組み合わせからなる群から選択される工業プロセス由来のものである、請求項10〜12のいずれかに記載の方法。
- 気体が合成ガスである、請求項10〜12のいずれかに記載の方法。
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