JP6636550B2 - 組み換え代謝微生物およびその使用 - Google Patents

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Description

本発明は、ＣＯを含む基質の微生物発酵によるテルペンおよび／またはその前駆体の産
生のための組み換え微生物および方法に関する。
テルペン類は、５つの炭素を有するイソプレン単位から構成される天然に存在する化学
基質であり、様々な種類に分けられる。テルペン誘導体としては、炭素骨格の酸化もしく
は再配置、または多数の官能基追加もしくは再配置により形成され得るテルペノイド類（
イソプレノイド類としても知られている）が挙げられる。
テルペン類の例としては、イソプレン（Ｃ５ヘミテルペン）、ファルネセン（Ｃ１５セ
スキテルペン類）、アーテミシニン（Ｃ１５セスキテルペン類）、シトラール（Ｃ１０モ
ノテルペン類）、カロテノイド類（Ｃ４０テトラテルペン類）、メントール（Ｃ１０モノ
テルペン類）、カンファー（Ｃ１０モノテルペン類）、およびカンナビノイド類が挙げら
れる。
テルペン類は、多種多様な産業に使用される貴重なな商業産物である。最も多いトン単
位でテルペン類が使用されるのは樹脂、溶剤、香水、およびビタミン類としてである。た
とえば、イソプレンはたとえばタイヤ産業用の合成ゴム（シス−１，４−ポリイソプレン
）の生産に使用され；ファルネセンは輸送に使用されるエネルギー濃縮ドロップイン燃料
（ｄｒｏｐ−ｉｎ ｆｕｅｌ）またはジェット燃料として使用され；アルテミシニンはマ
ラリアの薬剤に使用され；かつシトラール、カロテノイド類、メントール、カンファー、
およびカンナビノイド類は医薬品、ブタジエン、および芳香成分の製造に使用される。
テルペン類は石油化学供給源から産生されてもよく、テレピンなどのテルペン供給原料
から産生されてもよい。たとえば、イソプレンはナフサまたはエチレン生産の石油分解の
副生成物として石油化学的に産生される。多くのテルペン類はまた、天然の供給源から比
較的少量抽出される。しかしながら、これらの産生方法は費用がかかり、持続可能ではな
く、および多くの場合気候変動への寄与を含む環境問題を引き起こす。
イソプレンの非常に強い可燃性の性質のため、既知の産生方法は、燃焼および爆発の可
能性を制限するために大規模なな安全対策を必要とする。
本発明の目的は、先行技術の欠点の１つ以上を克服することであり、または公衆にテル
ペン類および他の関連する産物を産生するための代替手段を少なくとも提供する。
微生物発酵はテルペン類の産生の代替的な選択肢を提供する。テルペン類は自然界に普
遍的に存在しており、たとえば細菌の細胞壁の生合成に関与し、かつＵＶ光の暴露から葉
を保護するためいくつかの木（たとえばポプラ）により産生される。しかしながら、全て
の細菌が代謝産物としてテルペン類および／またはテルペン類前駆体を産生するために必
要な細胞機構を含むわけではない。たとえば、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍまた
はＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉなどの酸化炭素栄養性酢酸産生菌（ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔ
ｒｏｐｈｉｃ ａｃｅｔｏｇｅｎ）は、一酸化炭素を含む基質を発酵させてエタノールな
どの産物を産生できるが、代謝産物としてテルペン類および／またはテルペン類の前駆体
を全く産生かつ発することがないことが知られている。さらに、大部分の細菌は、商業的
に有効なテルペン類を産生しないことが知られている。
本発明は、特に、ＣＯを含む基質の微生物発酵により１つ以上のテルペン類および／ま
たはその前駆体を産生する方法、ならびにこのような方法に使用する組み換え微生物を提
供する。
第１の態様では、本発明は、ＣＯを含む基質の発酵により１つ以上のテルペン類および
／またはその前駆体ならびに任意に１つ以上の他の産物を産生できる酸化炭素栄養性酢酸
産生組み換え微生物を提供する。
１つの特定の実施形態では、本微生物は、組み換え微生物をもたらす親微生物中には存
在しないメバロン酸（ＭＶＡ）経路中の１つ以上の酵素（本明細書中で外来性酵素と呼ば
れる）を発現するよう適合される。別の実施形態では、本微生物は、組み換え微生物をも
たらす親微生物中に存在するメバロン酸（ＭＶＡ）経路中の１つ以上の酵素（本明細書中
で内在性酵素）を過剰発現するよう適合される。
さらなる実施形態では、本微生物は、
（ａ）メバロン酸（ＭＶＡ）経路中の１つ以上の外来性酵素を発現しかつ／またはメバ
ロン酸（ＭＶＡ）経路中の１つ以上の内在性酵素を過剰発現し；かつ
（ｂ）ＤＸＳ経路中の１つ以上の外来性酵素を発現しかつ／またはＤＸＳ経路中の１つ
以上の内在性酵素を過剰発現するよう
適合される。
１つの実施形態では、メバロン酸（ＭＶＡ）経路由来の１つ以上の酵素は、
ａ）チオラーゼ（ＥＣ ２．３．１．９）
ｂ）ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ ２．３．３．１０）
ｃ）ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ １．１．１．８８）
ｄ）メバロン酸キナーゼ（ＥＣ ２．７．１．３６）
ｅ）ホスホメバロン酸キナーゼ（ＥＣ ２．７．４．２）
ｆ）メバロン酸ジホスホデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．３３）、および
ｇ）機能的に等価であるそれらのいずれかの変異体
からなる群から選択される。
さらなる実施形態では、ＤＸＳ経路由来の１つ以上の酵素は、
ａ）１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ ＤＸＳ（ＥＣ：２．２
．１．７）、
ｂ）１−デオキシ−Ｄ−キシルロース ５−リン酸レダクトイソメラーゼ ＤＸＲ（Ｅ
Ｃ：１．１．１．２６７）、
ｃ）２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール ４−リン酸シチジリルトランスフェラーゼ
ＩｓｐＤ （ＥＣ：２．７．７．６０）、
ｄ）４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール キナーゼ Ｉｓｐ
Ｅ（ＥＣ：２．７．１．１４８）、
ｅ）２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール ２，４−シクロ二リン酸シンターゼ Ｉｓ
ｐＦ（ＥＣ：４．６．１．１２）、
ｆ）４−ヒドロキシ−３−メチルブタ −２−エン−１−イル 二リン酸シンターゼ Ｉ
ｓｐＧ（ＥＣ：１．１７．７．１）、
ｇ）４−ヒドロキシ−３−メチルブタ −２−エニル 二リン酸レダクターゼ（ＥＣ：１
．１７．１．２）、および
ｈ）機能的に等価であるそれらのいずれかの変異体
からなる群から選択される。
さらなる実施形態では、１つ以上のさらなる外来性酵素または内在性酵素が発現または
過剰発現されてテルペン化合物またはその前駆体の産生をもたらし、この発現される外来
性酵素または過剰発現する内在性酵素は、
ａ）ゲラニルトランストランスフェラーゼ（EC: 2.5.1.10）、
ｂ）ヘプタプレニル二リン酸シンターゼ（ＥＣ：２．５．１．１０）、
ｃ）オクタプレニル−二リン酸シンターゼ（ＥＣ：２．５．１．９０）、
ｄ）イソプレンシンターゼ（ＥＣ ４．２．３．２７）、
ｅ）イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ（ＥＣ ５．３．３．２）、
ｆ）ファルネセンシンターゼ（ＥＣ ４．２．３．４６／ＥＣ ４．２．３．４７）、
および
ｇ）機能的に等価であるそれらのいずれかの変異体
からなる群から選択される。
１つの実施形態では、親微生物は、ＣＯを含む基質を発酵してアセチルＣｏＡを産生で
きるがアセチルＣｏＡをメバロン酸またはイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）に変換で
きず、かつ組み換え微生物はメバロン酸経路に関与する１つ以上の酵素を発現するよう適
合される。
１つの実施形態では、１つ以上のテルペンおよび／またはその前駆体は、メバロン酸、
ＩＰＰ、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）、イソプレン、ゲラニルピロリン酸（Ｇ
ＰＰ）、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）およびファルネセンから選択される。
１つの実施形態では、微生物は１つ以上の内在性核酸の発現を増大するよう適合された
１つ以上の外来性核酸を含み、かつ１つ以上の内在性核酸は本明細書で前述した酵素の内
の１つ以上をコードする。
１つの実施形態では、発現を増大するよう適合された１つ以上の外来性核酸は調節要素
である。１つの実施形態では、この調節要素はプロモーターである。１つの実施形態では
、このプロモーターは、構成的プロモーターである。１つの実施形態では、このプロモー
ターは、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌの遺伝子クラスターまたはホスホトランスアセチ
ラーゼ／酢酸キナーゼオペロンプロモーターを含む群から選択される。
１つの実施形態では、微生物は、前述した酵素の内の１つ以上をコードしかつ発現する
よう適合され１つ以上の外来性核酸を含む。１つの実施形態では、微生物は、酵素のうち
少なくとも２つをコードしかつ発現するよう適合され１つ以上の外来性核酸を含む。他の
実施形態では、微生物は、酵素のうち少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ
、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ以上をコードしか
つ発現するよう適合され１つ以上の外来性核酸を含む。
１つの実施形態では、１つ以上の外来性核酸は核酸構築物またはベクターであり、１つ
の特定の実施形態では、上記酵素の１つ以上を任意の組み合わせでコードするプラスミド
である。
１つの実施形態では、外来性核酸は発現プラスミドである。
１つの特定の実施形態では、親微生物は酸化炭素栄養性酢酸産生細菌の群から選択され
る。特定の実施形態では、微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇ
ｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃ
ｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎ
ｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｏｒｍ
ｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍａｇｎｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗ
ｏｏｄｉｉ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ ｂａｃｃｈｉｉ、Ｂｌａｕｔｉａ ｐｒｏｄ
ｕｃｔａ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏ
ａｃｅｔｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｓｐｏｒｏ
ｍｕｓａ ｏｖａｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕ
ｓａ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ、およびＴｈ
ｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｉｕｖｉからなる群から選択される。
１つの実施形態では、親微生物はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅ
ｎｕｍまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉである。１つの特定の実
施形態では、微生物はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＤＳ
Ｍ２３６９３である。別の特定の実施形態では、微生物はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊ
ｕｎｇｄａｈｌｉｉ ＤＳＭ１３５２８（またはＡＴＣＣ５５３８３）である。
１つの実施形態では、親微生物はＤＸＳ経路および／またはメバロン酸（ＭＶＡ）経路
中の１つ以上の遺伝子を欠いている。１つの実施形態では、親微生物は、
ａ）チオラーゼ（ＥＣ ２．３．１．９）、
ｂ）ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ ２．３．３．１０）、
ｃ）ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ １．１．１．８８）、
ｄ）メバロン酸キナーゼ（ＥＣ ２．７．１．３６）、
ｅ）ホスホメバロン酸キナーゼ（ＥＣ ２．７．４．２）、
ｆ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．３３）、
ｇ）１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ ＤＸＳ（ＥＣ：２．２．
１．７）、
ｈ）１−デオキシ−Ｄ−キシルロース ５−リン酸レダクトイソメラーゼ ＤＸＲ（ＥＣ
：１．１．１．２６７）、
ｉ）２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール ４−リン酸シチジリルトランスフェラーゼ
ＩｓｐＤ（ＥＣ：２．７．７．６０）、
ｊ）４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール キナーゼ ＩｓｐＥ
（ＥＣ：２．７．１．１４８）、
ｋ）２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール ２，４−シクロ二リン酸シンターゼ Ｉｓｐ
Ｆ（ＥＣ：４．６．１．１２）、
ｌ）４−ヒドロキシ−３−メチルブタ −２−エン−１−イル 二リン酸シンターゼ Ｉｓ
ｐＧ（ＥＣ：１．１７．７．１）、
ｍ）４−ヒドロキシ−３−メチルブタ −２−エニル 二リン酸レダクターゼ（ＥＣ：１．
１７．１．２）、および
ｎ）機能的に等価であるそれらのいずれかの変異体
からなる群から選択される酵素をコードする１つ以上の遺伝子を欠いている。
第２の態様では、本発明は、微生物中で発現する時微生物がＣＯを含む基質の発酵によ
り１つ以上のテルペン類および／またはその前駆体を産生することを可能にする、１つ以
上の酵素をコードする核酸を提供する。
１つの実施形態では、核酸は、微生物中で発現する時微生物がＣＯを含む基質の発酵に
より１つ以上のテルペン類および／またはその前駆体を産生することを可能にする、２つ
以上の酵素をコードする。１つの実施形態では、本発明の核酸は、このような酵素の少な
くとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少な
くとも８つ、少なくとも９つ以上をコードする。
１つの実施形態では、核酸はメバロン酸（ＭＶＡ）経路中の１つ以上の酵素をコードす
る。１つの実施形態では、１つ以上の酵素は、
ａ） チオラーゼ（ＥＣ ２．３．１．９）、
ｂ） ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ ２．３．３．１０）、
ｃ） ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ １．１．１．８８）、
ｄ） メバロン酸キナーゼ（ＥＣ ２．７．１．３６）、
ｅ） ホスホメバロン酸キナーゼ（ＥＣ ２．７．４．２）、
ｆ） ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．３３）、および
ｇ） 機能的に等価であるそれらのいずれかの変異体
からなる群から選択される。
特定の実施形態では、核酸はチオラーゼ（アセチルＣｏＡｃ−アセチルトランスフェラ
ーゼであってもよい）、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼおよびＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを
コードする。
さらなる実施形態では、核酸はメバロン酸（ＭＶＡ）経路中の１つ以上の酵素およびＤ
ＸＳ経路中の１つ以上のさらなる酵素をコードする。１つの実施形態では、ＤＸＳ経路由
来の１つ以上の酵素は、
ａ） １−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ ＤＸＳ（ＥＣ：２．
２．１．７）、
ｂ） １−デオキシ−Ｄ−キシルロース ５−リン酸レダクトイソメラーゼ ＤＸＲ（
ＥＣ：１．１．１．２６７）、
ｃ） ２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール ４−リン酸シチジリルトランスフェラー
ゼ ＩｓｐＤ（ＥＣ：２．７．７．６０）、
ｄ） ４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール キナーゼ Ｉｓ
ｐＥ（ＥＣ：２．７．１．１４８）、
ｅ） ２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール ２，４−シクロ二リン酸シンターゼ
ＩｓｐＦ（ＥＣ：４．６．１．１２）、
ｆ） ４−ヒドロキシ−３−メチルブタ −２−エン−１−イル 二リン酸シンターゼ
ＩｓｐＧ（ＥＣ：１．１７．７．１）、
ｇ） ４−ヒドロキシ−３−メチルブタ −２−エニル 二リン酸レダクターゼ（ＥＣ：
１．１７．１．２）、および
ｈ） 機能的に等価であるそれらのいずれかの変異体
からなる群から選択される。
さらなる実施形態では、核酸は、発現または過剰発現されてテルペン化合物またはその
前駆体の産生をもたらす１つ以上のさらなる外来性または内在性酵素をコードし、発現す
る外来性核酸または過剰発現する内在性核酸は、
ａ） ゲラニルトランストランスフェラーゼ Ｆｐｓ（ＥＣ：２．５．１．１０）、
ｂ） ヘプタプレニル二リン酸シンターゼ（ＥＣ：２．５．１．１０）、
ｃ） オクタプレニル−二リン酸シンターゼ（ＥＣ：２．５．１．９０）、
ｄ） イソプレンシンターゼ（ＥＣ ４．２．３．２７）、
ｅ） イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ（ＥＣ ５．３．３．２）、
ｆ） ファルネセンシンターゼ（ＥＣ ４．２．３．４６ ／ ＥＣ ４．２．３．４
７）、および
ｇ） 機能的に等価であるそれらのいずれかの変異体
からなる群から選択される酵素をコードする。
１つの実施形態では、チオラーゼ（ＥＣ ２．３．１．９）をコードする核酸は配列番
号４０の配列を有するか機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、チオラーゼ（ＥＣ ２．３．１．９）をコードする核酸は、配列
番号４１の配列を有するか機能的に等価なその変異体であるアセチルＣｏＡ ｃ−アセチ
ルトランスフェラーゼである。
１つの実施形態では、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ ２．３．３．１０）をコード
する核酸は配列番号４２の配列を有するか機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ １．１．１．８８）をコー
ドする核酸は配列番号４３の配列を有するか機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、メバロン酸キナーゼ（ＥＣ ２．７．１．３６）をコードする核
酸は配列番号５１の配列を有するか機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＥＣ ２．７．４．２）をコードす
る核酸は配列番号５２の配列を有するか機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．３
３）をコードする核酸は配列番号５３の配列を有するか機能的に等価なその変異体である
。
１つの実施形態では、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ ＤＸ
Ｓ（ＥＣ：２．２．１．７）をコードする核酸は配列番号１の配列を有するか機能的に等
価なその変異体である。
１つの実施形態では、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース ５−リン酸レダクトイソメラ
ーゼ ＤＸＲ（ＥＣ：１．１．１．２６７）をコードする核酸は配列番号３の配列を有す
るか機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール ４−リン酸シチジリルト
ランスフェラーゼ ＩｓｐＤ（ＥＣ：２．７．７．６０）をコードする核酸は配列番号５
の配列を有するか機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール
キナーゼ ＩｓｐＥ（ＥＣ：２．７．１．１４８）をコードする核酸は配列番号７の配列
を有するか機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール ２，４−シクロ二リン酸
シンターゼ ＩｓｐＦ（ＥＣ：４．６．１．１２）をコードする核酸は配列番号９の配列
を有するか機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、４−ヒドロキシ−３−メチルブタ −２−エン−１−イル 二リン
酸シンターゼ ＩｓｐＧ（ＥＣ：１．１７．７．１）をコードする核酸は配列番号１１の
配列を有するか機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、４−ヒドロキシ−３−メチルブタ −２−エニル 二リン酸レダク
ターゼ（ＥＣ：１．１７．１．２）をコードする核酸は配列番号１３の配列を有するか機
能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、ゲラニルトランストランスフェラーゼ Ｆｐｓをコードする核酸
は配列番号１５の配列を有するか、機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、ヘプタプレニル二リン酸シンターゼをコードする核酸は配列番号
１７の配列を有するか、機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、オクタプレニル−二リン酸シンターゼがポリプレニルシンテター
ゼであるオクタプレニル−二リン酸シンターゼ（ＥＣ：２．５．１．９０）をコードする
核酸は、配列番号１９の配列によりコードされるか、機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、イソプレンシンターゼ（ｉｓｐＳ）をコードする核酸は配列番号
２１の配列を有するか、機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、イソペンテニル−二リン酸デルタ−イソメラーゼ（ｉｄｉ）をコ
ードする核酸は配列番号５４の配列を有するか、機能的に等価な変異体である。
１つの実施形態では、ファルネセンシンターゼをコードする核酸は、配列番号５７の配
列を有するか、機能的に等価な変異体である。
１つの実施形態では、核酸は、以下の酵素
ａ） イソプレンシンターゼ；
ｂ） イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ（ｉｄｉ）；
ｃ） １−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ ＤＸＳ；
または機能的に等価なそれらの変異体
をコードする。
１つの実施形態では、核酸は、以下の酵素
ａ） チオラーゼ；
ｂ） ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ；
ｃ） ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ；
ｄ） メバロン酸キナーゼ；
ｅ） ホスホメバロン酸キナーゼ；
ｆ） ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ；
ｇ） イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ（ｉｄｉ）；および
ｈ） イソプレンシンターゼ；
または機能的に等価なそれらの変異体
をコードする。
１つの実施形態では、核酸は、以下の酵素
ａ） ゲラニルトランストランスフェラーゼ Ｆｐｓ；および
ｂ） ファルネセンシンターゼ
または機能的に等価なそれらの変異体
をコードする。
１つの実施形態では、本発明の核酸はプロモーターをさらに含む。１つの実施形態では
、プロモーターはその制御下で遺伝子の構成的発現を可能にする。特定の実施形態では、
Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ ｃｌｕｓｔｅｒプロモーターを使用する。別の特定の実
施形態では、ホスホトランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼオペロンプロモーターを使用す
る。１つの特定の実施形態では、プロモーターはＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ由
来である。
第３の態様では、本発明は、第２の態様の１つ以上の核酸を含む核酸構築物またはベク
ターを提供する。
１つの特定の実施形態では、核酸構築物またはベクターは発現構築物または発現ベクタ
ーである。１つの特定の実施形態では、発現構築物または発現ベクターはプラスミドであ
る。
第４の態様では、本発明は、第２の態様の核酸または第３の態様のベクターもしくは構
築物のうちのいずれか１つ以上を含む宿主生物を提供する。
第５の態様では、本発明は、本発明の第３の態様に記載の発現構築物またはベクター、
およびメチル化構築物またはベクターを含む組成物を提供する。
好ましくは、組成物は本発明の第１の態様に係る組み換え微生物を産生できる。
１つの特定の実施形態では、発現構築物／ベクターおよび／またはメチル化構築物／ベ
クターはプラスミドである。
第６の態様では、本発明は、本発明の第１の態様の組み換え微生物を使用して、ＣＯを
含む基質を発酵することを含む微生物発酵による、１つ以上のテルペン類および／または
その前駆体および任意に１つ以上の他の産生物の産生方法を提供する。
１つの実施形態では、本方法は、
（ａ）本発明の第１の態様の１つ以上の微生物の培養物を含む生物反応器にＣＯを含む
基質を提供するステップ；および
（ｂ）生物反応器中の培養物を嫌気的に発酵して少なくとも１つのテルペンおよび／ま
たはその前駆体を産生するステップ
を含む。
１つの実施形態では、本方法は、
（ａ）工業的工程の結果として生成したＣＯ含有気体を補足するステップ；
（ｂ）本発明の第１の態様の１つ以上の微生物を含む培養によりこのＣＯ含有気体を嫌
気的に発酵して少なくとも１つのテルペンおよび／またはその前駆体を産生するステップ
を含む。
本方法の態様の特定の実施形態では、微生物は水性培養媒体中で維持される。
本方法の態様の特定の実施形態では、基質の発酵は生物反応器中で行われる。
１つの実施形態では、１つ以上のテルペンおよび／またはその前駆体は、メバロン酸、
ＩＰＰ、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）、イソプレン、ゲラニルピロリン酸（Ｇ
ＰＰ）、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）およびファルネセンから選択される。
好ましくは、Ｃｏを含む基質はＣＯを含む気体の基質である。１つの実施形態では、基
質は工業廃ガスを含む。特定の実施形態では、気体は製鋼所の排ガスまたは合成ガスであ
る。
１つの実施形態では、基質は、概して、少なくとも約２０容量％〜約１００容量％のＣ
Ｏ、約２０容量％〜約７０容量％のＣＯ、約３０容量％〜約６０容量％のＣＯ、および約
４０〜５５容量％のＣＯなどの、ＣＯの主要比率を含む。特定の実施形態では、基質は約
２５容量％、または約３０容量％、または約３５容量％、または約４０容量％、または約
４５容量％、または約５０容量％、または約５５容量％、または約６０容量％のＣＯを含
む。
ある実施形態では、本方法は、発酵ブロスからテルペンまたはその前駆体および任意に
１つ以上の他の産物を回収するステップをさらに含む。
第７の態様では、本発明は、第６の態様の方法により産生される際の１つ以上のテルペ
ンおよび／またはその前駆体を提供する。１つの実施形態では、１つ以上のテルペンおよ
び／またはその前駆体は、メバロン酸、ＩＰＰ、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）
、イソプレン、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）およ
びファルネセンからなる群から選択される。
別の態様では、本発明は、本発明の第１の態様の微生物の産生方法であって、ＣＯを含
む基質の発酵により微生物が１つ以上のテルペン類および／またはその前駆体ならびに任
意に１つ以上の他の産物を産生できるまたはそれらの産生を増大できるよう、１つ以上の
核酸を導入することにより、酸化炭素栄養性酢酸産生微生物を形質転換することを含み、
親微生物はＣＯを含む発酵による１つ以上のテルペンおよび／または前駆体を産生できな
い、または低レベルで産生する、方法を提供する。
１つの特定の実施形態では、親微生物は、メバロン酸（ＭＶＡ）経路および任意でＤＸ
Ｓ経路中の１つ以上の酵素を発現するよう適合され１つ以上の外来性核酸を導入すること
により形質転換される。別の実施形態では、親微生物は、親微生物中に天然に存在するメ
バロン酸（ＭＶＡ）経路および任意でＤＸＳ経路の１つ以上の酵素を過剰発現するよう適
合され１つ以上の核酸を用いて形質転換される。
ある実施形態では、１つ以上の酵素は本明細書に前述した酵素である。
１つの実施形態では、単離され遺伝的に改変されている酸化炭素栄養性酢酸産生細菌が
提供され、細菌はメバロン酸経路またはＤＸＳ経路またはテルペン生合成経路中の酵素を
コードする外来性核酸を含み、それにより細菌は酵素を発現する。酵素は、
ａ） チオラーゼ（ＥＣ ２．３．１．９）；
ｂ） ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ ２．３．３．１０）；
ｃ） ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ １．１．１．８８）；
ｄ） メバロン酸キナーゼ（ＥＣ ２．７．１．３６）；
ｅ） ホスホメバロン酸キナーゼ（ＥＣ ２．７．４．２）；
ｆ） ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．３３）；１−デオ
キシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ ＤＸＳ（ＥＣ：２．２．１．７）；
ｇ） １−デオキシ−Ｄ−キシルロース ５−リン酸レダクトイソメラーゼ ＤＸＲ（
ＥＣ：１．１．１．２６７）；
ｈ） ２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール ４−リン酸シチジリルトランスフェラー
ゼ ＩｓｐＤ（ＥＣ：２．７．７．６０）；
ｉ） ４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール キナーゼ Ｉｓ
ｐＥ（ＥＣ：２．７．１．１４８）；
ｊ） ２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール ２；４−シクロ二リン酸シンターゼ Ｉ
ｓｐＦ（ＥＣ：４．６．１．１２）；
ｋ） ４−ヒドロキシ−３−メチルブタ −２−エン−１−イル 二リン酸シンターゼ
ＩｓｐＧ（ＥＣ：１．１７．７．１）；
ｌ） ４−ヒドロキシ−３−メチルブタ −２−エニル 二リン酸レダクターゼ（ＥＣ：
１．１７．１．２）；ゲラニルトランストランスフェラーゼ Ｆｐｓ（ＥＣ：２．５．１
．１０）；
ｍ） ヘプタプレニル二リン酸シンターゼ（ＥＣ：２．５．１．１０）；
ｎ） オクタプレニル−二リン酸シンターゼ（ＥＣ：２．５．１．９０）；
ｏ） イソプレンシンターゼ（ＥＣ ４．２．３．２７）；
ｐ） イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ（ＥＣ ５．３．３．２）；および
ｑ） ファルネセンシンターゼ（ＥＣ ４．２．３．４６ ／ ＥＣ ４．２．３．
４７）
からなる群から選択される。
いくつかの態様では、細菌は前記核酸の不在下では酵素を発現しない。いくつかの態様
では、細菌は嫌気条件下で酵素を発現する。
１つの実施形態は、酸化炭素栄養性酢酸産生細菌中で複製できるプラスミドを提供する
。プラスミドは、メバロン酸経路またはＤＸＳ経路またはテルペン生合成経路中の酵素を
コードする核酸を含み、それによりプラスミドが細菌中に存在する際、酵素が前記細菌に
より発現される、核酸。酵素は、
ａ） チオラーゼ（ＥＣ ２．３．１．９）；
ｂ） ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ ２．３．３．１０）；
ｃ） ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ １．１．１．８８）；
ｄ） メバロン酸キナーゼ（ＥＣ ２．７．１．３６）；
ｅ） ホスホメバロン酸キナーゼ（ＥＣ ２．７．４．２）；
ｆ） ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．３３）；１−デオ
キシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ ＤＸＳ（ＥＣ：２．２．１．７）；
ｇ） １−デオキシ−Ｄ−キシルロース ５−リン酸レダクトイソメラーゼ ＤＸＲ（
ＥＣ：１．１．１．２６７）；
ｈ） ２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール ４−リン酸シチジリルトランスフェラー
ゼ ＩｓｐＤ（ＥＣ：２．７．７．６０）；
ｉ） ４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール キナーゼ Ｉｓ
ｐＥ（ＥＣ：２．７．１．１４８）；
ｊ） ２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール ２；４−シクロ二リン酸シンターゼ
ＩｓｐＦ（ＥＣ：４．６．１．１２）；
ｋ） ４−ヒドロキシ−３−メチルブタ −２−エン−１−イル 二リン酸シンターゼ
ＩｓｐＧ（ＥＣ：１．１７．７．１）；
ｌ） ４−ヒドロキシ−３−メチルブタ −２−エニル 二リン酸レダクターゼ（ＥＣ：
１．１７．１．２）；ゲラニルトランストランスフェラーゼ Ｆｐｓ（ＥＣ：２．５．１
．１０）；
ｍ） ヘプタプレニル二リン酸シンターゼ（ＥＣ：２．５．１．１０）；
ｎ） オクタプレニル−二リン酸シンターゼ（ＥＣ：２．５．１．９０）；
ｏ） イソプレンシンターゼ（ＥＣ ４．２．３．２７）；
ｐ） イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ（ＥＣ ５．３．３．２）；および
ｑ） ファルネセンシンターゼ（ＥＣ ４．２．３．４６ ／ ＥＣ ４．２．３．４
７）
からなる群から選択される。
別の実施形態では、ＣＯおよび／またはＣＯ２をイソプレンに変換する工程が提供され
る。工程は、細菌がＣＯおよび／またはＣＯ２をイソプレンに変換するように、
培養媒体中の酸化炭素栄養性の酢酸産生細菌の培養物を含む生物反応器に気体のＣＯ含有
基質および／またはＣＯ２含有基質を通すことと、生物反応器からイソプレンを回収する
こととを含む。酸化炭素栄養性の酢酸産生細菌はイソプレンシンターゼを発現するよう遺
伝的に改変される。
別の実施形態では、イソプレンシンターゼをコードする核酸を含む、単離され遺伝的に
改変されている酸化炭素栄養性酢酸産生細菌を提供する。細菌はイソプレンシンターゼを
発現し、かつ細菌はジメチルアリル二リン酸（ｉｍｅｔｈｙｌａｌｌｙｌｄｉｐｈｏｓｐ
ｈａｔｅ）をイソプレンに変換できる。１つの態様では、イソプレンシンターゼはＰｏｐ
ｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓの酵素である。別の態様では、核酸は最適化されたコ
ドンである。さらに別の態様では、イソプレンシンターゼの発現はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕ
ｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ由来のピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダク
ターゼの遺伝子のプロモーターの転写制御下にある。
別の実施形態は、ＣＯおよび／またはＣＯ２をイソペンチル二リン酸（ＩＰＰ）に変換
する工程を提供する。工程は、細菌がＣＯおよび／またはＣＯ２をイソペンチル二リン酸
（ＩＰＰ）に変換するように、培養媒体中の酸化炭素栄養性の酢酸産生細菌の培養液を含
む生物反応器に気体のＣＯ含有基質および／またはＣＯ２含有基質を通すことと、生物反
応器からＩＰＰを回収することとを含む。酸化炭素栄養性の酢酸産生細菌はイソプレン二
リン酸Δイソメラーゼを発現するよう遺伝的に改変されている。
さらなる別の実施形態は、イソペンチル二リン酸Δイソメラーゼをコードする核酸を含
む、単離され遺伝的に改変されている酸化炭素栄養性酢酸産生細菌を提供する。細菌は、
イソペンチル二リン酸Δイソメラーゼを発現し、かつ細菌はジメチルアリル二リン酸塩を
イソペンチルジリン酸塩に変換できる。いくつかの態様では、核酸は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄ
ｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉのイソペンチル二リン酸Δ イソメラーゼをコードす
る。xxx missing linexx。他の態様では、核酸はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔ
ｈａｎｏｇｅｎｕｍおよびイソプレンシンターゼをコードする第２の核酸の下流由来のピ
ルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ遺伝子のプロモーターの転写制御下にあ
る。
さらなる別の実施形態では、ＣＯおよびＣＯ２をイソペンチル二リン酸塩（ＩＰＰ）お
よび／またはイソプレンに変換する工程を提供する。工程は、細菌がＣＯおよび／または
ＣＯ２をイソペンチル二リン酸塩（ＩＰＰ）および／またはイソプレンに変換するように
、培養媒体中の酸化炭素栄養性の酢酸産生細菌の培養物を含む生物反応器に気体のＣＯ含
有基質および／またはＣＯ２含有基質を通すことと、ＩＰＰおよび／またはイソプレンを
生物反応器から回収することとを含む。酸化炭素栄養性の酢酸産生細菌は、デオキシキシ
ルロース ５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）の酵素をコードする核酸のコピー数が増加す
るよう遺伝的に改変されており、増加したコピー数はゲノム当たり１を超える。
さらなる別の実施形態は、デオキシキシルロース ５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）酵
素をコードする核酸のゲノム当たり１超のコピー数を含む、単離され遺伝的に改変されて
いる酸化炭素栄養性酢酸産生細菌を提供する。いくつかの態様では、単離され遺伝的に改
変されている酸化炭素栄養性酢酸産生細菌は、イソプレンシンターゼをコードする核酸を
さらに含んでもよい。他の態様では、単離され遺伝的に改変されている酸化炭素栄養性酢
酸産生細菌は、イソペンチル二リン酸Δイソメラーゼをコードする核酸をさらに含んでも
よい。さらなる他の態様では、単離され遺伝的に改変されている酸化炭素栄養性酢酸産生
細菌は、イソペンチル二リン酸Δイソメラーゼをコードする核酸およびイソプレンシンタ
ーゼをコードする核酸をさらに含んでもよい。
他の実施形態は、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）をコードする核酸を含む単離さ
れ遺伝的に改変されている酸化炭素栄養性酢酸産生細菌が提供される。細菌はコード化さ
れた酵素を発現し、かつ酵素はこの細菌由来のものではない。いくつかの態様では、酵素
はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの酵素である。いくつかの態様では、酵
素は１つ以上のＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのプロモーターの制御下で発現され
る。いくつかの態様では、細菌は、チオラーゼ（ｔｈｌＡ／ｖｒａＢ）をコードする核酸
、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧＳ）をコードする核酸、およびＨＭＧ−ＣｏＡレダ
クターゼ（ＨＭＧＲ）をコードする核酸をさらに含む。いくつかの態様では、チオラーゼ
はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍのチオラーゼである。いくつ
かの態様では、細菌はジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭＤ）をコードする核
酸をさらに含む。
さらなる他の実施形態では、αフェネルセンシンターゼをコードする外来性核酸を含む
、単離され遺伝的に改変されている酸化炭素栄養性酢酸産生細菌が提供される。いくつか
の態様では、核酸は、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍでの発現に最適化されたコド
ンである。いくつかの態様では、αフェネルセンシンターゼはＭａｌｕｓ ｘ ｄｏｍｅ
ｓｔｉｃａ のα−ファルネセンシンターゼである。いくつかの態様では、細菌はゲラニ
ルトランストランスフェラーゼをコードする核酸セグメントをさらに含む。いくつかの態
様では、ゲラニルトランストランスフェラーゼ（ｇｅｒｎａｙｌｔｒａｎｓｔｒａｎｓｆ
ｅｒａｓｅ）はＥ．ｃｏｌｉのゲラニルトランストランスフェラーゼである。
本発明のいずれかの態様または実施形態に適切な、単離され遺伝的に改変されている酸
化炭素栄養性酢酸産生細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕ
ｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａ
ｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓ
ｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ、
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｏｒｍｉｃｏ
ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍａｇｎｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｏｏｄ
ｉｉ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ ｂａｃｃｈｉｉ、Ｂｌａｕｔｉａ ｐｒｏｄｕｃｔ
ａ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅ
ｔｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓ
ａ ｏｖａｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ
ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ、およびＴｈｅｒｍ
ｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｉｕｖｉからなる群から選択されてもよい。
また、本発明は、本願の明細書中に記されるまたは示される要素および特徴を部分的に
含むよう広くあってもよく、個別または集合的であってもよく、これらの一部、要素およ
び特徴のうちの２つ以上の組み合わせであってもよい。特定の整数が本明細書中に記載さ
れているが、特定の整数は本発明に関連する技術で知られている均等物を有すると本明細
書に記載されており、このような均等物は、以下に個別に記載されていない限り、本明細
書に組み込まれるものである。
本発明のこれらの態様および他の態様は、すべての新規態様について検討され、添付図
面を参照して例示の目的でのみ与えられる以下の記載により明白になるであろう。
は、テルペンの産生の経路図であり、本願に記載される遺伝子標的は太字の矢印で示される は、プラスミドｐＭＴＬ ８５１４６−ｉｓｐＳの遺伝子マップである。 は、プラスミドｐＭＴＬ ８５２４６−ｉｓｐＳ−ｉｄｉの遺伝子マップである。 は、プラスミドｐＭＴＬ ８５２４６−ｉｓｐＳ−ｉｄｉ−ｄｘｓの遺伝子マップである。 は、プラスミドｐＭＴＬ ８５２４６−ｉｓｐＳ−ｉｄｉ−ｄｘｓのシークエンシング結果である。 は、ＤＸＳおよびメバロン酸経路を介してＣＯからテルペンを産生するエネルギー論の比較を示す。 は、メバロン酸経路を示す。 は、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ形質変換体におけるプラスミドｐＭＴＬ ８５２４６−ｉｓｐＳ−ｉｄｉのイソプレン発現の存在を確認するアガロースゲル電気泳動の画像である。レーン１および２０は１００ｂｐＰｌｕｓＤＮＡラダーを示す。レーン３〜６、９〜１２、１５〜１８は、４つの異なるクローン由来の単離プラスミドをテンプレートとして用いたＰＣＲを示し、各々は以下の順である：ｃｏｌＥ１、ｅｒｍＢ、およびｉｄｉ。レーン２、８、および１４は陰性対照としてテンプレートのないＰＣＲを示し、各々は以下の順である：ｃｏｌＥ１、ｅｒｍＢ、およびｉｄｉ。レーン７、１３、および１９は陽性対照としてＥ．ｃｏｌｉ由来のｐＭＴＬ ８５２４６を用いたＰＣＲを示し、各々は以下の順である：ｃｏｌＥ１、ｅｒｍＢ、およびｉｄ。 は、メバロン酸発現プラスミドＭＴＬ８２１５−Ｐｐｔａａｃｋ−ｔｈｌＡ−ＨＭＧＳ−Ｐａｔｐ−ＨＭＧＲを示す。 は、イソプレン発現プラスミドｐＭＴＬ ８３１４−Ｐｐｔａａｃｋ−ｔｈｌＡ−ＨＭＧＳ−Ｐａｔｐ−ＨＭＧＲ−Ｐｒｎｆ−ＭＫ−ＰＭＫ−ＰＭＤ−Ｐｆｏｒ−ｉｄｉ−ｉｓｐＳを示す。 は、ファルネセン発現プラスミドｐＭＴＬ８３１４−Ｐｐｔａａｃｋ−ｔｈｌＡ−ＨＭＧＳ−Ｐａｔｐ−ＨＭＧＲ−Ｐｒｎｆ−ＭＫ−ＰＭＫ−ＰＭＤ−Ｐｆｏｒ−ｉｄｉ−ｉｓｐＡ−ＦＳを示す。 は、プラスミドｐＭＴＬ ８５２４６−ｉｓｐＳ−ｉｄｉ−ｄｘｓの遺伝子マップを示す。 は、プラスミドｐＭＴＬ ８５１４６−ｉｓｐＳをもつＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍを用いた遺伝子発現の実験の増幅チャートを示す。 は、プラスミドｐＭＴＬ ８５２４６−ｉｓｐＳ−ｉｄｉをもつＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍを用いた遺伝子発現の増幅チャートを示す。 は、プラスミドｐＭＴＬ ８５２４６−ｉｓｐＳ−ｉｄｉ−ｄｘｓをもつＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍを用いた遺伝子発現を実験した増幅チャートを示す。 は、プラスミドｐＭＴＬ８３１４Ｐｒｎｆ−ＭＫ−ＰＭＫ−ＰＭＤ−Ｐｆｏｒ−ｉｄｉ−ｉｓｐＡ−ＦＳの存在確認するＰＣＲを示す。予測バンドのサイズは１５８４ｂｐである。ＤＮＡマーカーは、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓの１ｋｂＤＮＡラダーである。 は、プラスミドｐＭＴＬ８３１４Ｐｒｎｆ−ＭＫ−ＰＭＫ−ＰＭＤ−Ｐｆｏｒ−ｉｄｉ−ｉｓｐＡ−ＦＳをもつ形質転換したＣ． ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｍｕｎの増殖曲線である。 は、メバロン酸キナーゼ（ＭＫ 配列番号：５１）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ 配列番号：５２）、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭＤ 配列番号：５３）、イソペンチル−二リン酸Δ−イソメラーゼ（ｉｄｉ 配列番号：５４）、ゲラニルトランストランスフェラーゼ（ｉｓｐＡ 配列番号：５６）およびファルネセンシンターゼ（Ｆｓ 配列番号５７）の遺伝子発現を示すＲＴ−ＰＲＣデータである。 は、ｉｄｉ−ｉｓｐＡ−ＦＳのｐＭＴＬ８３１４Ｐｒｎｆ−ＭＫ−ＰＭＫ−ＰＭＤ−Ｐを含む１ｍＭのメバロン酸を添加した培養物中のファルネセンの存在を検出および確認するＧＣ−ＭＳである。質量９３のイオンを含むピークををスキャンしたＧＣ−ＭＳクロトマトグラム。クロマトグラム１および２は形質転換されたＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍであり、３はＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ試料と同時に流入されるβファルネセン標準基質である。４は、αファルネセン産生を示す、Ｍ９グルコースで増殖させたプラスミドｐＭＴＬ８３１４Ｐｒｎｆ−ＭＫ−ＰＭＫ−ＰＭＤ−Ｐｆｏｒ−ｉｄｉ−ｉｓｐＡ−ＦＳをもつＥ．ｃｏｌｉである。５は、Ｅ．ｃｏｌｉ試料と同時に流入されるβファルネセンの標準基質である。Ｅ．ｃｏｌｉおよびＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ試料間の保持時間の差異は、分析機器に対する小さな変化によるものである。しかしながらβファルネセン標準基質および産生したαファルネセンの間の保持時間の差異はいずれの場合も全く同じであり、このことは質量スペクトルでの一致と合わせてＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのαファルネセン産生を確認する。 は、図１９で１Ａおよび２Ａと標識したピークのＭＳスペクトルである。ＭＳスペクトルはＮＩＳＴデータベーススペクトル（図２１）と一致し、ピークがαファルネセンであると確認される。 は、ＮＩＳＴ質量スペクトルデータベースからのαファルネセンのＭＳスペクトルである。
以下は、一般的な文言を用いた、その好ましい実施形態を含む本発明の記載である。本
発明は以下の本明細書の「実施例」の下の開示からさらにさらに明らかにされており、開
示は本発明を支持する実験データ、本発明の多様な態様の特定の実施例、および本発明を
実施する手段を提供する。
驚くべきことに、本発明者らは、酸化炭素栄養性の酢酸産生細菌を改変して、ＣＯを含
む基質の発酵によりイソプレンおよびファルネセンを含むテルペンおよびその前駆体を産
生することができた。このことは、それらの産生のための現在の方法に対して利点を有し
得る、これらの産物の産生のための代替手段を提供する。さらに、本発明者らは、さもな
ければ大気に放出され、かつ環境を汚染するであろう工業的工程からの一酸化炭素を使用
する手段を提供する。
本明細書では、「発酵ブロス」は、少なくとも栄養培地および細菌細胞を含む培養培地
を指す。
本明細書では、「シャトル微生物」は、メチルトランスフェラーゼ酵素が発現される微
生物であり、かつ目的微生物と異なる微生物を指す。
本明細書では、「目的微生物」は、発現構築物／ベクター上に含まれる遺伝子が発現さ
れる微生物であり、かつシャトル微生物と異なる微生物を指す。
「主な発酵産物」という用語は、最も高い濃度および／または収率で産生される１つの
発酵産物を意味すると意図される。
用語「効率を増大する」、「増大された効率」などは、発酵工程に関連して使用される
際、限定するものではないが、発酵を触媒する微生物の増殖速度、産生物濃度の上昇した
増殖および／または産物産生速度、消費された基質の容量あたり産生される所望の産物の
容量、所望産物の産生速度または産生レベル、および発酵の他の副産物と比較した所望の
産物の相対比率のうちの少なくとも１つの増加を含む。
「一酸化炭素を含む基質」およびそれに類する文言は、たとえば、１つ以上の細菌株の
増殖および／または発酵に一酸化炭素が利用可能である任意の基質を含むと理解されるべ
きである。
「一酸化炭素を含む気体基質」およびそれに類する文言および用語は、あるレベルの一
酸化炭素を含む任意の気体を含む。ある実施形態では、基質は少なくとも２０容量％〜１
００容量％のＣＯ、２０容量％〜７０容量％のＣＯ、３０容量％〜６０容量％のＣＯ、お
よび４０容量％〜５５容量％のＣＯを含む。特定の実施形態では、基質は約２５容量％、
または約３０容量％、または約３５容量％、または約４０容量％、または約４５容量％、
または約５０容量％、または約５５容量％、または約６０容量％のＣＯを含む。
基質が水素を含む必要はないが、Ｈ２の存在は、本発明の方法にしたがった形成を産生
するために有害であってはならない。特定の実施形態では、水素の存在は、アルコール産
生の総合的な効率を改善する。Xxmissing linexxたとえば、特定の実施形態では、基質は
約２：１、または１：１、または１：２の比率のＨ２：ＣＯを含んでもよい。１つの実施
形態では、基質は約３０容量％以下のＨ２、約２０容量％以下のＨ２、約１５容量％以下
のＨ２、または約１０容量％以下のＨ２を含む。他の実施形態では、基質の流れは、たと
えば、５％未満、または４％未満、または３％未満、または％未満、または１％未満の低
濃度のＨ２を含み、もしくは水素を実質的に含まない。基質はまた、たとえば、約１容量
％〜８０容量％、または１容量％〜約３０容量％のＣＯ２など、いくらかのＣＯ２を含ん
でもよい。１つの実施形態では、基質は約２０容量％以下のＣＯ２を含む。特定の実施形
態では、基質は約１５容量％以下のＣＯ２、約１０容量％以下のＣＯ２、約５容量％以下
のＣＯ２を含み、または実質的にＣＯ２を含まない。
以下に記載されるように、本発明の実施形態は、「ＣＯを含む気体基質」を送達かつ発
酵することに関して記載される。しかしながら、気体基質は代替的な形態にて提供されて
もよいことが理解されるべきである。たとえば、ＣＯを含む気体基質は液体に溶解されて
提供されてもよい。本質的に、液体は、一酸化炭素を含む気体で飽和され、その後その液
体を生物反応器に添加する。このことは標準的な方法を使用して達成し得る。例として、
微細気泡分散ジェネレータ（Ｈｅｎｓｉｒｉｓａｋ ｅｔ． ａｌ． Ｓｃａｌｅ−ｕｐ
ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ ｇｅｎｅｒａｔｏｒ ｆｏｒ
ａｅｒｏｂｉｃ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ； Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ １０１， Ｎｕｍｂｅｒ
３ ／ Ｏｃｔｏｂｅｒ， ２００２）を使用できる。さらなる例として、ＣＯを含む
気体基質が固体の支持体上に吸着されてもよい。このような代替方法は、用語「ＣＯを含
む基質」およびそれに類する用語の使用に含まれる。
本発明の特定の実施形態では、ＣＯ含有気体基質は、工業排ガスまたは工業廃棄ガスで
ある。「工業廃棄ガスまたは工業排ガス」は、工業行程により産生されるＣＯを含む任意
の気体を含み、また鉄金属製品製造、非鉄製品製造、石油精製工程、石炭の気化、バイオ
マスの気化、電力生産、カーボンブラック生産、およびコークの製造の結果として産生さ
れる気体を含むと広く解釈されるべきである。さらなる例が本明細書の他で提供されても
よい。
特段の記載が必要とされない限り、本明細書に使用される「発酵」、「発酵工程」、ま
たは「発酵反応」、およびそれに類する文言は、工程の増殖段階および産物生合成段階を
含むと意図される。さらに本明細書に記載されるように、いくつかの実施形態では、生物
反応器は第１の増殖リアクターおよび第２の発酵リアクターを含んでもよい。このように
、金属類または組成物を発酵反応に添加することは、これらのリアクターのいずれかまた
は両方への添加を含むことが理解べきである。
用語「生物反応器」は、１つ以上の容器および／またはタワー、またはパイプ配置から
なる発酵装置を含み、連続撹はん槽リアクター（ＣＳＴＲ）、固定化細胞リアクター（Ｉ
ＣＲ）、リクルベッド反応器（ＴＢＲ）、気ほう塔反応器、ガスリフト発酵槽、スタティ
ックミキサー、または気体―液体接触に適した他の装置を含む。いくつかの実施形態では
、生物反応器は第１の増殖リアクターおよび第２の発酵リアクターを含む。よって、基質
を生物反応器または発酵反応に添加することを指す際には、適切な場合これらのリアクタ
ーのいずれかまたは両方を含むことが理解される。
「外来性核酸」は、導入される微生物外に起源を有する核酸である。外来性核酸は、限
定するものではないが、導入される微生物（たとえば組み換え微生物の由来となる親微生
物）、導入される生物とは異なる微生物株または種類、あるいは人工的にまたは組み換え
にて作成した微生物株化または種類を含む任意の適切な供給源に由来してもよい。１つの
実施形態では、外来性核酸は導入される微生物内に天然に存在する核酸配列を表し、かつ
それらは導入されて特定の遺伝子の発現または過剰発現を増大する（たとえば、配列（た
とえば遺伝子）のコピー数を増大すること、または発現を増大するために強力なまたは構
成的なプロモーターを導入することにより）。別の実施形態では、外来性核酸は導入され
る微生物内には天然に存在しない核酸配列を表し、かつ微生物内に天然に存在しない産物
を発現させまたは微生物にとって天然の遺伝子の発現を増大させる（たとえば、プロモー
ターなどの調節要素を導入する場合）。外来性核酸は、導入される微生物のゲノム中に統
合するよう適合されてもよいし染色体外にある状態を保持するように適合されてもよい。
「外来性」はまた、タンパク質を指すのに使用してもよい。これは、組み換え微生物が
由来する親微生物中には存在しないタンパク質を指す。
組み換え微生物および核酸またはタンパク質に関して本明細書で使用される用語「内在
性」は、組み換え微生物が由来する親微生物に存在する任意の核酸またはタンパク質を指
す。
本発明は、本明細書で特に例示される配列と異なる核酸が実質的に同一に機能するなら
ば、それらの配列を使用して実施されてもよいことが理解されるべきである。タンパク質
またはペプチドをコードする核酸配列について、これは、コードされたタンパク質または
ペプチドが実質的に同一の機能を有することを意味する。プロモーター配列を表す核酸配
列については、変異型配列は１つ以上の遺伝子発現を促進する性質を有する。このような
核酸は、本明細書で「機能的に等価な変異体」と呼ばれてもよい。例として、核酸の機能
的に等価な変異体は、対立変異体、遺伝子のフラグメント、変異（欠損、挿入、ヌクレオ
チド置換など）および／または遺伝子多型を含む遺伝子などが挙げられる。他の微生物由
来のホモログ遺伝子もまた、本明細書に特に例示される配列の機能的に等価な変異体の例
と考えられてもよい。これらは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕ
ｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｃ． ｓａｃｃｈａｒｏｂｕ
ｔｙｌｉｃｕｍ、およびＣ． ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ
などの種のホモログ遺伝子を含み、この詳細は、ＧｅｎｅＢａｎｋまたはＮＣＢＩなどの
ウェブサイトに公開されており、利用可能である。「機能的に等価な変異体」という文言
はまた、特定の生物のコドン最適化の結果として配列が変化した核酸を含むと解釈される
べきである。本明細書に記載される核酸の「機能的に等価な変異体」は、同定された核酸
配列と好ましくは少なくとも約７０％、好ましくは８０％、より好ましくは８５％、好ま
しくは約９０％、好ましくは約９５％以上の核酸配列同一性を有する。
本発明は、その配列が本明細書に特に例示されるアミノ酸配列とは異なるポリペプチド
を使用して実施してもよいこともまた理解すべきである。これらの変異体は、本明細書で
は「機能的に等価の変異体」を呼ばれてもよい。タンパク質またはペプチドの機能的に等
価な変異体は、同定されたタンパク質またはペプチドと少なくとも４０％、好ましくは５
０％、好ましくは６０％、好ましくは７０％、好ましくは７５％、好ましくは８０％、好
ましくは９０％、好ましくは８５％、好ましくは９０％、好ましくは９５％以上のアミノ
酸同一性を共有し、かつ目的のタンパク質またはペプチドと実質的に同じ機能を有するタ
ンパク質またはペプチドを含む。このような変異体は、タンパク質またはペプチドのフラ
グメントの範囲内にあるものを含み、フラグメントは切り詰められた形態のポリペプチド
を含み、欠損は１〜５、〜１０、〜１５、〜２０、〜２５アミノ酸であってよく、および
ポリペプチドのいずれかの末端の１〜２５の残基から拡大してもよく、および欠損は領域
内の任意の長さであってもよく；または内部の位置にあってもよい。本明細書の特定のポ
リペプチドの機能的に等価な変異体はまた、たとえば前の段落に例示されるような、他の
細菌種のホモログ遺伝子により発現されるポリペプチドを含むと解釈されるべきである。
本明細書で使用される「実質的に同一の機能」は、核酸またはポリペプチドの変異体が
、もとの核酸またはポリペプチドの機能を実行できることを意味するよう意図される。た
とえば、本発明の酵素の変異体は、その酵素と同一の反応を触媒できる。しかしながら、
変異体がもとのポリペプチドまたは核酸と同一のレベルの活性を有することを意味するも
のではない。
機能的に等価な変異体がもとの核酸またはポリペプチドと実質的に同一の機能を有する
かどうかを、任意の既知の方法を使用して評価できる。しかしながら、例として、イソプ
レン合成酵素に関するＳｉｌｖｅｒらにより記載される方法（１９９１， Ｐｌａｎｔ
Ｐｈｙｓｉｏｌ． ９７： １５８８−１５９１）またはＺｈａｏらにより記載される方
法（２０１１， Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ９０：１９
１５-１９２２）、ファルネセンシンターゼに関するＧｒｅｅｎらによる方法（２００７
， Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ； ６８：１７６-１８８）、１−デオキシ−Ｄ−キ
シルロース ５−リン酸シンターゼＤｘｓに関するＫｕｚｕｙａｍａによる方法（２００
０， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８２， ８９１−８９７）、チオラーゼに関する
Ｂｅｒｎｄｔ ａｎｄ Ｓｃｈｌｅｇｅｌによる方法（１９７５， Ａｒｃｈ． Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ． １０３， ２１−３０）またはＳｔｉｍ−Ｈｅｒｎｄｏｎらによる方法
（１９９５， Ｇｅｎｅ １５４： ８１−８５）、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼに関する
Ｃａｂａｎｏらによる方法（１９９７， Ｉｎｓｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌ． Ｂ
ｉｏｌ．Ｍｅｔａｂ． ２７：４９９-５０５）、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼおよびに
メバロン酸キナーゼ酵素に関するＭａらによる方法（２０１１， Ｍｅｔａｂ． Ｅｎｇ
ｉｎ．， １３：５８８-５９７）、ホスホメバロン酸キナーゼに関するＨｅｒｄｅｎｄ
ｏｒｆ ａｎｄ Ｍｉｚｉｏｒｋｏによる方法（２００７， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
， ４６： １１７８０−８）、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼに関するＫｒｅ
ｐｋｉｙらによる方法（２００４， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． １３： １８７５−１
８８１）が挙げられる。また、Ｔｒｕｔｋｏらにより記載される（２００５， Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌｏｇｙ ７４： １５３−１５８）ようにホスミドマイシンまたはメビノリン
のような阻害剤を使用して、ＤＸＳおよびメバロン酸経路の遺伝子を同定することが可能
である。
本明細書で使用される際の「過剰に発現」、「過剰発現」などの用語および文言は、同
一条件下の親微生物の蛋白質（核酸を含む）の発現レベルと比較して１つ以上の蛋白質の
発現（同じ蛋白質をコードする１つ以上の核酸の発現を含む）のいずれかの増大を含むと
広く解釈されるべきである。タンパク質（または核酸）が任意の特定なレベルに発現する
という意味にとるべきではない。
「親微生物」は、本発明の組換え微生物を作成するために使用される微生物である。親
微生物は、天然に存在するもの（すなわち野生型微生物）または前もって修飾されている
が本発明の対象である１つ以上の酵素を発現または過剰に発現しないものである。したが
って、本発明の組換え微生物は、親微生物中で発現または過剰に発現しなかった１つ以上
の酵素を発現または過剰に発現するように修飾されてもよい。
核酸「構築物」または「ベクター」などの用語は、細胞内に遺伝子基質を移送するビヒ
クルとしての使用に適した任意の核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡを含む）を含むと広く解釈さ
れるべきである。この用語は、プラスミド、ウイルス（バクテリオファージを含む）、コ
スミドおよび人工染色体を含むと解釈されるべきである。構築物またはベクターは、１つ
以上の調節要素、複製起源、マルチクローニング部位および／または選択可能マーカーを
含んでもよい。１つの実施形態では、構築物またはベクターは、構築物またはベクターに
よりコードされた１つ以上の遺伝子発現を可能にするよう適合されている。核酸構築物ま
たはベクターは、裸核酸ならびに細胞への送達を促進する１つ以上の薬剤と製剤化した核
酸（たとえば、リポソーム結合型核酸、核酸が含まれている生物）を含む。
本明細書で言及される「テルペン」は、単純なテルペン類および複雑なテルペン類なら
びにアルコール、アルデヒドおよびケトンなどの酸素含有テルペン化合物を含む、結合さ
れたＣ５イソプレン単位からできる任意の化合物を含むと広く解釈されるべきである。単
純なテルペンは、針葉樹などの植物の精油および樹脂に見いだされる。より複雑なテルペ
ンは、テルペノイドおよびビタミンＡ、カロテノイド色素（リコピンなど）、スクアレン
、およびゴムを含む。モノテルペン類の例は、限定するものではないが、イソプレン、ピ
ネン、ネロール、シトラール、カンファー、メントール、リモネンを含む。セスキテルペ
ンの例としては、限定するものではないが、ネロリドール、ファルネソールが挙げられる
。ジテルペンの例としては、限定するものではないが、フィトール、ビタミンＡ１が挙げ
られる。スクアレンはトリテルペンの一例であり、カロテン（プロビタミンＡ１）はテト
ラテルペンである。
「テルペン前駆体」は、アセチルＣｏＡおよび任意にピルビン酸から開始したテルペン
を形成する反応の間に産生される化合物または中間体物質である。この用語は、メバロン
酸（ＭＶＡ）経路および任意にＤＸＳ経路に見いだされる前駆体化合物または中間体基質
ならびにＦＰＰおよびＧＰＰなどの、より長鎖のテルペンの下流の前駆体を指す。特定の
実施形態では、メバロン酸、ＩＰＰ、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）、ゲラニル
ピロリン酸(ＧＰＰ)およびファルネシルピロリン酸(ＦＰＰ)を含むが、これらに限定され
ない。
「ＤＸＳ経路」は、ピルビン酸およびＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸からＤＭＡ
ＰＰまたはＩＰＰへの酵素的経路である。それはまた、デオキシキシルロース ５−リン
酸（ＤＸＰ／ＤＸＰＳ／ＤＯＸＰまたはＤＸＳ）／メチルエリスリトール リン酸（ＭＥ
Ｐ）経路としても知られている。
「メバロン酸（ＭＶＡ）経路」は、アセチルＣｏａからＩＰＰまでの酵素的経路である
。
微生物
２つのテルペン産生経路、解糖系における２つの重要な中間体基質であるピルビン酸お
よびＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）から開始するデオキシキシルロース
５−リン酸（ＤＸＰ／ＤＸＰＳ／ＤＯＸＰまたはＤＸＳ）／メチルエリスリトール リ
ン酸（ＭＥＰ）経路（Ｈｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｊ． Ｂｉｏｌ．
ｃｈｅｍ． ２８２： ２１５７３−７７）、ならびにアセチルＣｏＡから開始するメバ
ロン酸（ＭＶＡ）経路（Ｍｉｚｉｏｒｋｏ， ２０１１， Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ
Ｂｉｏｐｈｙｓ， ５０５： １３１−１４３）が知られている。多くの異なる分類の微
生物が、これら経路のいずれかの存在について研究されている（Ｌａｎｇｅ ｅｔ ａｌ
．， ２０００， ＰＮＡＳ， ９７： １３１７２−７７； Ｔｒｕｔｋｏ ｅｔ ａ
ｌ．， ２００５， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ７４： １５３−１５８； Ｊｕｌ
ｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ， ７５： １３７７−８４）が、酸化炭素栄養性酢酸産生では研究されていな
かった。たとえばＤＸＳ経路は、Ｅ．ｃｏｌｉ、 Ｂａｃｉｌｌｕｓ、またはＭｙｃｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ中に存在すると見出されており、一方メバロン酸経路は、酵母Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ、またはＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ中に存在す
る。
酸化炭素栄養性酢酸産生性Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａ
ｈｌｉｉのゲノムは、２つの経路のいずれかの存在について本発明者らにより分析された
。ＤＸＳ経路のすべての遺伝子は、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍおよびＣ．ｌｊ
ｕｎｇｄａｈｌｉｉで同定され（表１）、一方メバロン酸経路は存在しなかった。さらに
、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ またはＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉなどの酸化
炭素栄養性酢酸産生は、代謝最終産物としていずれのテルペンを産生することも知られて
いない。
Figure 0006636550
イソプレン単位からの下流のテルペン類合成のための遺伝子もまた両生物で同定された
（表２）。
Figure 0006636550
テルペン類はエネルギー濃縮化合物であり、それらの合成は細胞がＡＴＰなどのヌクレ
オシド三リン酸の形態でエネルギーを費やす必要がある。基質としての糖の使用は、ＡＴ
Ｐのいくつかの分子を得るために解糖から供給される十分なエネルギーを必要とする。基
質として糖を使用するＤＸＳ経路を介したテルペン類および／またはその前駆体の産生は
、ピルビン酸およびＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）の利用可能性により
相対的に単純な方法で進行し、Ｇ３ＰはＣ５ペントースおよびＣ６ヘキソース糖由来であ
る。これらのＣ５およびＣ６分子はしたがって、テルペン類が構成されるＣ５イソプレン
単位へと比較的簡単に変換される。
ＣＯまたはＣＯ２のようなＣ１基質を使用する嫌気的酢酸産生では、Ｃ１単位からのヘ
ミテルペノイドなどの長い分子を合成することはより難しい。これは特に、Ｃ１０モノテ
ルペン類、Ｃ１５セスキテルペン類、またはＣ４０テトラテルペン類などのより長鎖のテ
ルペン類に当てはまる。これまでに酢酸産生菌（天然および組み換え微生物の両方）で報
告された最も多くの炭素原子をもつ産物は、Ｃ４化合物のブタノール（Ｋoｐｋｅ ｅｔ
ａｌ．， ２０１１， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２２：
３２０−３２５； Ｓｃｈｉｅｌ−Ｂｅｎｇｅｌｓｄｏｒｆ ａｎｄ Ｄuｒｒｅ， ２
０１２， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ： １０．１０１６／ｊ．ｆｅｂｓｌｅｔ．２０１
２．０４．０４３； Ｋoｐｋｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ．
Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． １０７： １３０８７−９２；米国特許第２０１１／０２３
６９４１号）および２，３−ブタンジオール（Ｋoｐｋｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１１，
Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ７７：５４６７−７５）であ
る。本発明者らは、アセチルＣｏＡ中間体を介してＣ１供給原料ＣＯを使用してこれらの
より長鎖のテルペンを嫌気的に産生することが驚くべきことに可能であることを示した。
嫌気的酢酸産生菌のＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路のエネルギー論はちょうど明ら
かになりつつあるが、嫌気的増殖条件下または糖発酵生物の解糖とは異なり、基質レベル
のリン酸化によるＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路ではＡＴＰを得ることはなく、実際
ＣＯ２のギ酸への活性化は実質的に１分子のＡＴＰを必要とし、かつ膜勾配を必要とする
。本発明者らは、産物の形成のための経路がエネルギー効率に優れていることが重要であ
ると指摘する。本発明者らは、酢酸産生菌では基質ＣＯまたはＣＯ２はアセチルＣｏＡに
直接運ばれ、これは特に糖系システムと比較した場合、６つの反応のみが必要であり、テ
ルペン類および／またはそれらの前駆体への最も直接的な経路を表す（図１）ことを指摘
する。嫌気的酢酸産生菌では利用可能なＡＴＰはより少ないが、本発明者らは、このより
直接的な経路はより高い代謝の流れを持続する(中間体反応のより高い化学的推進力のた
め)と考える。テルペン生合成経路におけるいくつかの中間体、例えば重要な中間体であ
るメバロン酸およびＦＰＰ、は効率良く代謝回転されないと多くの細菌にとって毒性であ
るため、より高い代謝の流れは重要である。
より高いＡＴＰが利用可能であるにも関わらず、この中間体の毒性の問題は、糖からのテ
ルペン産生における障害となり得る。
メバロン酸経路を介するＣＯからテルペン前駆体ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰ産生のエネル
ギー論をＤＸＳ経路と比較すると、メバロン酸経路はＡＴＰとしてより少ないヌクレオシ
ド三リン酸塩を必要とし、等価物の還元がより少なく、かつアセチルＣｏＡから６つの反
応ステップのみが必要でＤＸＳ経路と比べてより直接的でもあることを、本発明者らは指
摘する。これは、反応および代謝流量の速度に利点を提供し、かつ総合的なエネルギー効
率を増大させる。さらに、必要な酵素数がより少ないことは、組み換え微生物を産生する
ために必要とされる組み換え方法を簡易化する。
メバロン酸経路をもつ酢酸産生菌は同定されていないが、本発明者らは、メバロン酸経
路および任意にＤＸＳ経路をＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ
またはＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉなどの酸化炭素栄養性酢酸産生菌に導入してＣ１炭素
基質であるＣＯからテルペン類および／またはその前駆体を効率的に産生することが可能
であることを示した。これはすべての酸化炭素栄養性酢酸産生微生物に適用可能であるこ
とが期待される。
さらに、テルペン類および／またはその前駆体の産生は、嫌気的条件下で組み換え微生
物を使用して可能であるとは全く示されていなかった。イソプレンの嫌気的産生はより安
全な操作環境を提供する利点を有する。なぜなら、イソプレンは酸素の存在下で非常に可
燃性であり、室温および大気圧下では、１．５〜２．０％の引火下限界（ＬＦＬ）、およ
び２．０〜１２％の引火上限界（ＵＦＬ）を有するからである。燃焼は酸素なしに起こる
ことはないため、本発明者らは、嫌気的燃焼工程は、すべての生成物濃度、気体組成物、
温度および圧力範囲に渡りより安全であるため、望ましいと考える。
本明細書で前述したように、本発明は、１つ以上のテルペン類および／またはその前駆
体、ならびに任意に１つ以上の他の産物を、ＣＯを含む基質の発酵によって産生できる組
み換え微生物を提供する。
さらなる実施形態では、微生物は、
メバロン酸（ＭＶＡ）経路由来の１つ以上の外来性酵素を発現し、かつ／またはメバロ
ン酸（ＭＶＡ）経路由来の１つ以上の内在性酵素を過剰発現し；かつ
ａ）ＤＸＳ経路由来の１つ以上の外来性酵素を発現し、かつ／またはＤＸＳ経路由来の１
つ以上の内在性酵素を過剰発現するように
適合される。
１つの実施形態では、組み換え微生物が由来する親微生物はＣＯを含む基質を発酵して
アセチルＣｏＡを産生できるが、アセチルＣｏＡをメバロン酸またはイソペンチルピロリ
ン酸（ＩＰＰ）に変換できず、かつ組み換え微生物はメバロン酸経路に関与する１つ以上
の酵素を発現するよう適合される。
本微生物は、たとえば、微生物内の天然の遺伝子の発現を増大すること（たとえば、遺
伝子発現を駆動するためにより強力なまたは構成的なプロモーターを導入することにより
）と、酵素をコードしかつ酵素を発現するよう適合され外来性核酸を導入することにより
特定の酵素をコードする遺伝子のコピー数を増大することと、親微生物中には天然に存在
しない酵素をコードしかつ発現するよう適合された外来性核酸を導入することとを含む、
任意の数の組み換え方法により１つ以上の酵素を発現しまたは過剰に発現するよう適合さ
れてもよい。
１つの実施形態では、１つ以上の酵素はメバロン酸（ＭＶＡ）経路由来であり、かつ
ａ） チオラーゼ（ＥＣ ２．３．１．９）、
ｂ） ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ ２．３．３．１０）、
ｃ） ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ １．１．１．８８）、
ｄ） メバロン酸キナーゼ（ＥＣ ２．７．１．３６）、
ｅ） ホスホメバロン酸キナーゼ（ＥＣ ２．７．４．２）、
ｆ） ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．３３）、および
ｇ） 機能的に等価であるそれらのいずれかの変異体
からなる群から選択される。
さらなる実施形態では、任意の１つ以上の酵素はＤＸＳ経路由来であり、かつ
ａ） １−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ ＤＸＳ（ＥＣ：２．
２．１．７）、
ｂ） １−デオキシ−Ｄ−キシルロース ５−リン酸レダクトイソメラーゼ ＤＸＲ（
ＥＣ：１．１．１．２６７）、
ｃ） ２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール ４−リン酸シチジリルトランスフェラー
ゼ ＩｓｐＤ（ＥＣ：２．７．７．６０）、
ｄ） ４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール キナーゼ Ｉｓ
ｐＥ（ＥＣ：２．７．１．１４８）、
ｅ） ２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール ２，４−シクロ二リン酸シンターゼ
ＩｓｐＦ（ＥＣ：４．６．１．１２）、
ｆ） ４−ヒドロキシ−３−メチルブタ −２−エン−１−イル 二リン酸シンターゼ
ＩｓｐＧ（ＥＣ：１．１７．７．１）、
ｇ） ４−ヒドロキシ−３−メチルブタ −２−エニル 二リン酸レダクターゼ（ＥＣ：
１．１７．１．２）、および
ｈ） 機能的に等価であるそれらのいずれかの変異体
からなる群から選択される。
さらなる実施形態では、１つ以上の外来性または内在性のさらなる酵素は、発現または
過剰に発現されてテルペン化合物および／またはその前駆体の産生をもたらし、発現され
る外来性酵素、または過剰発現される内在性酵素は、
ａ） ゲラニルトランストランスフェラーゼ Ｆｐｓ（ＥＣ：２．５．１．１０）、
ｂ） ヘプタプレニル二リン酸シンターゼ（ＥＣ：２．５．１．１０）、
ｃ） オクタプレニル−二リン酸シンターゼ（ＥＣ：２．５．１．９０）、
ｄ） イソプレンシンターゼ（ＥＣ ４．２．３．２７）、
ｅ） イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ（ＥＣ ＥＣ ５．３．３．２）、
ｆ） ファルネセン シンターゼ（ＥＣ ４．２．３．４６ ／ ＥＣ ４．２．３．
４７）、および
ｇ） 機能的に等価であるそれらのいずれかの変異体．
からなる群から選択される。
例示のためのみに、各酵素の配列情報が本明細書の図面に列挙される。
本発明の微生物中で使用される酵素は、細菌の異なる属および種、または他の生物を含
む、任意の適切な供給源由来であってもよい。しかしながら、１つの実施形態では、酵素
はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来である。
１つの実施形態では、酵素イソプレンシンターゼ（ｉｓｐＳ）は、Ｐｏｐｌａｒ ｔｒ
ｅｍｕｌｏｉｄｅｓ由来である。さらなる実施形態では、それは、以下の配列番号２１に
例示される核酸配列、または機能的に等価なその変異体を有する。
１つの実施形態では、酵素デオキシキシルロース ５−リン酸シンターゼはＣ．ａｕｔ
ｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ由来であり、以下の配列番号１に例示される核酸配列によりコ
ードされおよび／または配列番号２に例示されるアミノ酸配列を有し、または機能的に等
価なそれらの変異体である。
１つの実施形態では、酵素１−デオキシ−Ｄ−キシルロース ５−リン酸レダクトイソ
メラーゼ ＤＸＲはＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ由来であり、および配列番号３
に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、酵素２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール ４−リン酸シチジリ
ルトランスフェラーゼ ＩｓｐＤはＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ由来であり、か
つ配列番号５に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体
である。
１つの実施形態では、酵素４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトー
ル キナーゼ ＩｓｐＥはＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ由来であり、かつ配列番
号７に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、酵素２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール ２，４−シクロ二リ
ン酸シンターゼ ＩｓｐＦはＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ由来であり、かつ配列
番号９に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である
。
１つの実施形態では、酵素４−ヒドロキシ−３−メチルブタ −２−エン−１−イル 二
リン酸シンターゼ ＩｓｐＧはＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ由来であり、かつ配
列番号１１に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体で
ある。
１つの実施形態では、酵素４−ヒドロキシ−３−メチルブタ −２−エニル 二リン酸レ
ダクターゼはＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ由来であり、かつ配列番号１３に例示
される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、酵素メバロン酸キナーゼ（ＭＫ）はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
ｓ ａｕｒｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ Ｍｕ５０由来であり、かつ配列番号５１に
例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、酵素ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）はＳｔａｐｈｙｌｏｃ
ｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ Ｍｕ５０由来であり、かつ以下の
配列番号５２に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体
である。
１つの実施形態では、酵素ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭＤ）はＳｔａ
ｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ Ｍｕ５０由来であり
、かつ配列番号５３に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその
変異体である。
１つの実施形態では、酵素イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ（ｉｄｉ）はＣ
ｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ由来であり、かつ以下の配列番号５４
に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、酵素チオラーゼ（ｔｈＩＡ）はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅ
ｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ ＡＴＣＣ８２４由来であり、かつ以下の配列番号４０に例示さ
れる核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、酵素はチオラーゼ酵素であり、かつＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
ｓ ａｕｒｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ Ｍｕ５０由来のアセチル-CoA ｃ−アセチ
ルトランスフェラーゼ（ｖｒａＢ）であり、かつ以下の配列番号４１に例示される核酸配
列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、酵素３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ シンター
ゼ（ＨＭＧＳ）はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅ
ｕｓ Ｍｕ５０由来であり、かつ以下の配列番号４２に例示される核酸配列によりコード
され、または機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、酵素ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡ レダクターゼ（ＨＭ
ＧＲ）はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ Ｍｕ
５０由来であり、かつ以下の配列番号４３に例示される核酸配列によりコードされ、また
は機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、酵素ゲラニルトランストランスフェラーゼ（ｉｓｐＡ）はＥｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｒ． Ｋ−１２ ｓｕｂｓｔｒ． ＭＧ１６５５由来
であり、以下の配列番号５６に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等
価なその変異体である。
１つの実施形態では、酵素ヘプタプレニル二リン酸シンターゼはＣ．ａｕｔｏｅｔｈａ
ｎｏｇｅｎｕｍ由来であり、かつ以下の配列番号１７に例示される核酸配列によりコード
され、または機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、酵素ポリプレニルシンテターゼはＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅ
ｎｕｍ由来であり、かつ配列番号１９に例示される核酸配列によりコードされ、または機
能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、酵素αファルネセンシンターゼ（ＦＳ）はＭａｌｕｓ ｘ ｄｏ
ｍｅｓｔｉｃａ由来であり、かつ以下の配列番号５７に例示される核酸配列によりコード
され、または機能的に等価なその変異体である。
微生物において使用する酵素および機能的変異体は、当業者に知られているアッセイに
より同定してもよい。特定の実施形態では、酵素イソプレンシンターゼは、Ｓｉｌｖｅｒ
ら （１９９１、 Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ９７： １５８８−１５９１）また
はＺｈａｏら（２０１１、 Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，
９０：１９１５-１９２２）によりまとめられた方法により同定されてもよい。さらなる
特定の実施形態では、ファルネセンシンターゼは、Ｇｒｅｅｎら （２００７、 Ｐｈｙ
ｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ； ６８： １７６−１８８）によりまとめられた方法により同
定されてもよい。さらなる特定の実施形態では、メバロン酸経路に由来する酵素は、ＨＭ
Ｇ−ＣｏＡシンターゼに関するＣａｂａｎｏら（１９９７、 Ｉｎｓｅｃｔ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２７： ４９９−５０５）による方法、ＨＭＧ−ＣｏＡ
レダクターゼおよびメバロン酸キナーゼに関するＭａらによる方法（２０１１、 Ｍｅｔ
ａｂ． Ｅｎｇｉｎ．， １３：５８８-５９７）、ホスホメバロン酸キナーゼによるＨ
ｅｒｄｅｎｄｏｒｆおよびＭｉｚｉｏｒｋｏによる方法（２００７、 Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ， ４６： １１７８０−８）、ならびにジホスホメバロン酸デカルボキシラー
ゼに関するＫｒｅｐｋｉｙらによる方法（２００４、 Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． １３
： １８７５−１８８１）、Ｍａ らによる２０１１、 Ｍｅｔａｂ． Ｅｎｇｉｎ．，
１３：５８８-５９７の方法により同定されてもよい。ＤＸＳ経路の１−デオキシ−Ｄ
−キシルロース ５−リン酸シンターゼは、Ｋｕｚｕｙａｍａら（２０００、 Ｊ． Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ． １８２， ８９１−８９７）によりまとめられた方法を使用してア
ッセイできる。また、Ｔｒｕｔｋｏら（２００５、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ７４：
１５３−１５８）により記載されるようにホスミドマイシンまたはメビロリン（ｍｅｖ
ｉｎｏｌｉｎｅ）のような阻害剤を使用して、ＤＸＳ経路およびメバロン酸経路の遺伝子
を同定することも可能である。
１つの実施形態では、微生物は、１つ以上の内在性核酸の発現を増大するよう適合され
た１つ以上の外来性核酸を含み、かつ１つ以上の内在性核酸は本明細書に前述される酵素
のうちの１つ以上をコードする。１つの実施形態では、発現を増大するよう適合され１つ
以上の外来性核酸は、調節要素である。１つの実施形態では、調節要素はプロモーターで
ある。１つの実施形態では、プロモーターは、好ましくは適切な発酵条件下で高活性であ
る構成的プロモーターである。誘導可能なプロモーターを使用することもできる。好まし
い実施形態では、プロモーターは、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ遺伝子クラスターまた
はホスホトランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼオペロンプロモーターを含む群から選択さ
れる。発現、好ましくは適切な発酵条件下での高レベルの発現を指揮できる他のプロモー
ターが、例示的な実施形態に代わるものとして有効であることは、当業者には理解できる
であろう。
１つの実施形態では、微生物は、本明細書に前述された１つ以上の酵素をコードしかつ
発現するよう適合され１つ以上の外来性核酸を含む。１つの実施形態では、微生物は、少
なくとも２つの酵素をコードしかつ発現するよう適合され１つ以上の外来性核酸を含む。
他の実施形態では、微生物は、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少な
くとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ以上の
酵素をコードしかつ発現するよう適合され１つ以上の外来性核酸を含む。
１つの特定の実施形態では、微生物は、本発明の酵素または機能的に等価なその変異体
をコードする１つ以上の外来性核酸を含む。
微生物は１つ以上の外来性核酸を含んでもよい。親微生物を２つ以上の遺伝子成分（遺
伝子または調節要素（たとえばプロモーター）など）で形質転換することが望ましい場合
、それらは１つ以上の外来性核酸に含まれてもよい。
１つの実施形態では、１つ以上の外来性核酸は核酸構築物またはベクターであり、１つ
の特定の実施形態では、任意の組み合わせで本明細書に記載される酵素の１つ以上をコー
ドするプラスミドである。
外来性核酸は、親微生物の形質転換の際、染色体の外に保持してもよく、または親微生
物のゲノムに統合してもよい。したがって、外来性核酸は、統合を支援するよう適合され
たさらなるヌクレオチド配列（たとえば、宿主ゲノムへのホモログ組み換えおよび標的化
した統合を可能にする領域）または、染色体外の構築物の発現および複製を支援するよう
適合されたさらなるヌクレオチド配列（たとえば、複製起源、プロモーターおよび他の調
節要素または配列）を含んでもよい。
１つの実施形態では、本明細書に前述した１つ以上の酵素をコードする外来性核酸は、
外来性核酸によりコードされる１つ以上の酵素の発現を促進するよう適合されプロモータ
ーをさらに含む。１つの実施形態では、プロモーターは、好ましくは適切な発酵条件下で
高活性である構成的プロモーターである。誘導可能なプロモーターも使用できる。好まし
い実施形態では、プロモーターは、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ遺伝子クラスターおよ
びホスホトランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼプロモーターを含む群から選択される。発
現、好ましくは適切な発酵条件下での高レベルの発現を指示できる他のプロモーターが、
例示した実施形態の代替方法として有効であることは、当業者には理解できるであろう。
１つの実施形態では、外来性核酸は発現プラスミドである。
１つの特定の実施形態では、親微生物がは酸化炭素栄養性酢酸産生細菌の群から選択さ
れる。特定の実施形態では、微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏ
ｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕ
ｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃａｔｏｌｏｇｅ
ｎｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｏｒ
ｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍａｇｎｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｗｏｏｄｉｉ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ ｂａｃｃｈｉｉ、Ｂｌａｕｔｉａ ｐｒｏ
ｄｕｃｔａ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍ
ｏａｃｅｔｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｓｐｏｒ
ｏｍｕｓａ ｏｖａｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍ
ｕｓａ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ、およびＴ
ｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｉｕｖｉを含む群から選択される。
１つの特定の実施形態では、親微生物は、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃ．
ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉおよび関連する単離菌を含む、エタノ
ール産生、酢酸産生クロストリジウムのクラスターから選択される。これらは、限定する
ものではないが、株化細胞Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＪＡＩ−１Ｔ ＤＳＭ
１００６１）［Ａｂｒｉｎｉ Ｊ， Ｎａｖｅａｕ Ｈ， Ｎｙｎｓ Ｅ−Ｊ： Ｃｌｏ
ｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ， ｓｐ． ｎｏｖ．， ａｎ ａ
ｎａｅｒｏｂｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈａｔ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ｅｔｈａｎｏｌ
ｆｒｏｍ ｃａｒｂｏｎ ｍｏｎｏｘｉｄｅ． Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １９
９４， ４： ３４５−３５１］、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＬＢＳ１５６
０（ＤＳＭ１９６３０）［Ｓｉｍｐｓｏｎ ＳＤ， Ｆｏｒｓｔｅｒ ＲＬ， Ｔｒａｎ
ＰＴ， Ｒｏｗｅ ＭＪ， Ｗａｒｎｅｒ ＩＬ： Ｎｏｖｅｌ ｂａｃｔｅｒｉａ
ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｈｅｒｅｏｆ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｐａｔｅｎ
ｔ ２００９， ＷＯ／２００９／０６４２００］、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕ
ｍ ＬＢＳ１５６１（ＤＳＭ２３６９３）、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ ＰＥＴＣＴ（
ＤＳＭ１３５２８ ＝ ＡＴＣＣ ５５３８３）［Ｔａｎｎｅｒ ＲＳ， Ｍｉｌｌｅｒ
ＬＭ， Ｙａｎｇ Ｄ： Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ ｓｐ．
ｎｏｖ．， ａｎ Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｃ Ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ Ｃｌｏｓｔｒｉｄ
ｉａｌ ｒＲＮＡ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ Ｉ． Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ １９９３， ４３： ２３２−２３６］、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ
ＥＲＩ−２（ＡＴＣＣ ５５３８０）［Ｇａｄｄｙ ＪＬ： Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｓｔａｉｎ ｗｈｉｃｈ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｆｒｏｍ ｗ
ａｓｔｅ ｇａｓｅｓ． ＵＳ ｐａｔｅｎｔ １９９７， ５，５９３，８８６］、Ｃ
．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ Ｃ−０１ （ＡＴＣＣ ５５９８８）［Ｇａｄｄｙ ＪＬ，
Ｃｌａｕｓｅｎ ＥＣ， Ｋｏ Ｃ−Ｗ： Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆ
ｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ａｓ ｗｅｌ
ｌ ａｓ ｓｏｌｖｅｎｔ ｆｏｒ ｉｔｓ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈ． ＵＳ ｐａｔｅｎｔ， ２００２， ６，
３６８，８１９］、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ Ｏ−５２ （ＡＴＣＣ ５５９８９）
［Ｇａｄｄｙ ＪＬ， Ｃｌａｕｓｅｎ ＥＣ， Ｋｏ Ｃ−Ｗ： Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ
ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｅｔｉｃ ａ
ｃｉｄ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｓｏｌｖｅｎｔ ｆｏｒ ｉｔｓ ｅｘｔｒａｃｔｉｏ
ｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈ． ＵＳ ｐａｔｅｎｔ
， ２００２， ６，３６８，８１９］、Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉ Ｐ１１Ｔ（ＡＴＣＣ
ＢＡＡ−６２２）［Ｈｕｈｎｋｅ ＲＬ， Ｌｅｗｉｓ ＲＳ， Ｔａｎｎｅｒ ＲＳ
： Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅ
ｌ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ Ｓｐｅｃｉｅｓ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｐａｔ
ｅｎｔ ２００８， ＷＯ ２００８／０２８０５５］、「Ｃ．ｃｏｓｋａｔｉｉ」［Ｚ
ａｈｎ ｅｔ ａｌ − Ｎｏｖｅｌ ｅｔｈａｎｏｌｏｇｅｎｉｃ ｓｐｅｃｉｅｓ
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｓｋａｔｉｉ （ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔ
ｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＵＳ２０１１０２２９９４７）］および「Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕ
ｍ ｓｐ．」（Ｔｙｕｒｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１２， Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｒ
ｅｓ． ４： １−１２）などの関連した単離菌、またはＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ
ＯＴＡ−１（Ｔｉｒａｄｏ−Ａｃｅｖｅｄｏ Ｏ． Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉ
ｏｅｔｈａｎｏｌ ｆｒｏｍ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｇａｓ Ｕｓｉｎｇ Ｃｌｏｓｔｒ
ｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ． ＰｈＤ ｔｈｅｓｉｓ， Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒ
ｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， ２０１０）などの変異株が挙げられ
る。これらの株は、クロストリジウムｒＲＮＡクラスター１内のサブクラスターを形成し
、それらの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、３０％前後の同様の低ＧＣ含量を有し９９％超同
一である。しかしながら、ＤＮＡ−ＤＮＡ再会合およびＤＮＡフィンガープリンティング
実験は、これらの株は別々の種に属することを示した［Ｈｕｈｎｋｅ ＲＬ， Ｌｅｗｉ
ｓ ＲＳ， Ｔａｎｎｅｒ ＲＳ： Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒ
ｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ Ｓｐｅｃｉｅｓ． Ｉｎ
ｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｐａｔｅｎｔ ２００８， ＷＯ ２００８／０２８０５５］
。
このクラスターのすべての種は、同様の形態およびサイズを有し（対数増殖期細胞は、
０．５〜０．７×３〜５μｍである）中温性（最適増殖温度 ３０〜３７℃）および厳密
に嫌気性である［Ｔａｎｎｅｒ ＲＳ， Ｍｉｌｌｅｒ ＬＭ， Ｙａｎｇ Ｄ： Ｃｌ
ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ ｓｐ． ｎｏｖ．， ａｎ Ａｃｅｔｏ
ｇｅｎｉｃ Ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ ｒＲＮＡ Ｈｏｍｏｌｏ
ｇｙ Ｇｒｏｕｐ Ｉ． Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９９３， ４
３： ２３２−２３６； Ａｂｒｉｎｉ Ｊ， Ｎａｖｅａｕ Ｈ， Ｎｙｎｓ Ｅ−Ｊ
： Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ， ｓｐ． ｎｏｖ．，
ａｎ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈａｔ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ｅｔ
ｈａｎｏｌ ｆｒｏｍ ｃａｒｂｏｎ ｍｏｎｏｘｉｄｅ． Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ １９９４， ４： ３４５−３５１； Ｈｕｈｎｋｅ ＲＬ， Ｌｅｗｉｓ ＲＳ
， Ｔａｎｎｅｒ ＲＳ： Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔ
ｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ Ｓｐｅｃｉｅｓ． Ｉｎｔｅｒｎ
ａｔｉｏｎａｌ ｐａｔｅｎｔ ２００８， ＷＯ ２００８／０２８０５５］。さらに
、これらは、同じｐＨ範囲（ｐＨ４〜７．５、最適初期ｐＨ：５．５〜６）、同様の増殖
率かつ主な発酵最終産物としてエタノールおよび酢酸を有する同様の代謝プロファイル、
ＣＯ含有気体での強力な独立栄養性増殖、ならびに特定の条件下で形成される少量の２，
３−ブタンジオールおよび乳酸、などの同様の主要な系統的な性質を共有する［Ｔａｎｎ
ｅｒ ＲＳ， Ｍｉｌｌｅｒ ＬＭ， Ｙａｎｇ Ｄ： Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊ
ｕｎｇｄａｈｌｉｉ ｓｐ． ｎｏｖ．， ａｎ Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｃ Ｓｐｅｃｉｅ
ｓ ｉｎ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ ｒＲＮＡ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ Ｉ．
Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９９３， ４３： ２３２−２３６；
Ａｂｒｉｎｉ Ｊ， Ｎａｖｅａｕ Ｈ， Ｎｙｎｓ Ｅ−Ｊ： Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕ
ｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ， ｓｐ． ｎｏｖ．， ａｎ ａｎａｅｒｏｂｉ
ｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈａｔ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ｅｔｈａｎｏｌ ｆｒｏｍ ｃ
ａｒｂｏｎ ｍｏｎｏｘｉｄｅ． Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １９９４， ４：
３４５−３５１； Ｈｕｈｎｋｅ ＲＬ， Ｌｅｗｉｓ ＲＳ， Ｔａｎｎｅｒ ＲＳ：
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ Ｓｐｅｃｉｅｓ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｐａｔｅ
ｎｔ ２００８， ＷＯ ２００８／０２８０５５］。インドール産生もまた、３つすべ
ての種で観察された。しかしながら、この種は、多様な糖（たとえばラムノース、アラビ
ノース）、酸（たとえばグルコン酸、クエン酸）、アミノ酸（たとえば、アルギニン、ヒ
スチジン）、または他の基質（たとえばベタイン、ブタノール）の基質の利用において差
異がある。さらに、一部の種は、特定のビタミン類（たとえばチアミン、ビオチン）に対
する独立栄養生物であることが見いだされたが、そうでない種もある。
１つの実施形態では、親酸化炭素栄養性酢酸産生微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘ
ｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｂｕ
ｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ ｂａｃｃｈｉｉ、Ｂｌａｕｔ
ｉａ ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ
ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃ
ａ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ、および Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａ
ｃｔｅｒ ｋｉｕｖｉからなる群から選択される。
第１または第２の態様の１つの特定の実施形態では、親微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉ
ｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌ
ｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒ
ｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄ
ｉｕｍ ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌ
ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍａ
ｇｎｕｍを含む酸化炭素栄養性クロストリジウムの群から選択される。
１つの実施形態では、微生物は、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃ．ｌｊｕｎ
ｇｄａｈｌｉｉ、および「Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉ」ならびに関連する単離菌を含む酸化
炭素栄養性クロストリジウムのクラスターから選択される。これらは、限定するものでは
ないが、細菌株Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＪＡＩ−１Ｔ（ＤＳＭ１００６１
） （Ａｂｒｉｎｉ， Ｎａｖｅａｕ， ＆ Ｎｙｎｓ， １９９４）、Ｃ．ａｕｔｏｅ
ｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＬＢＳ１５６０（ＤＳＭ１９６３０）（ＷＯ／２００９／０６４
２００）、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＬＢＳ１５６１（ＤＳＭ２３６９３）
、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ ＰＥＴＣＴ（ＤＳＭ１３５２８ ＝ ＡＴＣＣ ５５３
８３）（Ｔａｎｎｅｒ， Ｍｉｌｌｅｒ， ＆ Ｙａｎｇ， １９９３）、Ｃ．ｌｊｕｎ
ｇｄａｈｌｉｉ ＥＲＩ−２（ＡＴＣＣ ５５３８０）（米国特許第５，５９３，８８６
号）、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ Ｃ−０１（ＡＴＣＣ ５５９８８）（米国特許第６
，３６８，８１９号）、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ Ｏ−５２（ＡＴＣＣ ５５９８９
）（米国特許第６，３６８，８１９号）、または 「Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉ Ｐ１１Ｔ
」（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−６２２）（ＷＯ ２００８／０２８０５５）、ならびに「Ｃ．
ｃｏｓｋａｔｉｉ」 （米国特許第２０１１／０２２９９４７号）、「Ｃｌｏｓｔｒｉｄ
ｉｕｍ ｓｐ． ＭＴ３５１」（Ｍｉｃｈａｅｌ Ｔｙｕｒｉｎ ＆ Ｋｉｒｉｕｋｈｉ
ｎ， ２０１２）などの関連する単離菌およびＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ ＯＴＡ−１
（Ｔｉｒａｄｏ−Ａｃｅｖｅｄｏ Ｏ． Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｅｔｈａ
ｎｏｌ ｆｒｏｍ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｇａｓ Ｕｓｉｎｇ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ． ＰｈＤ ｔｈｅｓｉｓ， Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ
Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， ２０１０）などのそれらの変異株を含む。
ＤＮＡ−ＤＮＡ再会合およびＤＮＡフィンガープリンティングの実験により判定される
ように別々の種類であるにも関わらずこれらの株は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子レベルで少
なくとも９９％の同一性を有し、クロストリジウムｒＲＮＡクラスターＩ内のサブクラス
ターを形成する。（Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．， １９９４）（ＷＯ ２００８／０
２８０５５、米国特許第２０１１／０２２９９４７号）
このクラスターの株は、同様の遺伝子型および表現型の両方を有し、共通の特徴により
定義され、かつエネルギー保存および発酵代謝の同じ様式を共有する。このクラスターの
株はシトクロムを欠いており、かつＲｎｆ複合体を介してエネルギーを保存する。
このクラスターの株は４．２ＭＢｐ前後のゲノムサイズを有し（Ｋoｐｋｅ ｅｔ ａ
ｌ．， ２０１０）かつ３２モル％前後のＧＣ組成物を有し（Ａｂｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ
．， １９９４； Ｋoｐｋｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１０； Ｔａｎｎｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．， １９９３） （ＷＯ ２００８／０２８０５５； ＵＳ ｐａｔｅｎｔ ２０１
１／０２２９９４７）、かつＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の酵素をコードする必須
の重要な遺伝子オペロンが保存されている（一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ホルミルテト
ラヒドロ葉酸シンテターゼ、メチレン−テトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、ホルミル−
テトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、メチレン−テトラヒドロ葉酸レダクターゼ、およ
び一酸化炭素デヒドロゲナーゼ／アセチル−ＣｏＡシンターゼ）、ヒドロゲナーゼ、ギ酸
デヒドロゲナーゼ、Ｒｎｆ複合体（ｒｎｆＣＤＧＥＡＢ）、ピルビン酸：フェレドキシン
オキシドレダクターゼ、アルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（Ｋoｐｋｅ
ｅｔ ａｌ．， ２０１０， ２０１１）。Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路遺伝子
の組織化および数は、気体の取り込みに関与し、核酸およびアミノ酸配列において差異が
あるにも関わらず、すべての種において同じであることが見いだされている（Ｋoｐｋｅ
ｅｔ ａｌ．， ２０１１）。
これらの株は、同様の形態およびサイズを有し（対数増殖期細胞は、０．５〜０．７×
３〜５μｍである）、中温性であり（最適な増殖温度３０〜３７℃）、かつ厳密に嫌気性
である（Ａｂｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， １９９４； Ｔａｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，
１９９３）（ＷＯ ２００８／０２８０５５）。さらに、それらはすべて、同じｐＨ範囲
（ｐＨ４〜７．５ 最適初期ｐＨ５．５〜６）、同様の増殖比率でＣＯ含有気体での強力
な独立栄養性増殖、ならびにある条件下で形成される少量の２，３−ブタンジオールおよ
び乳酸を有する、主要な発酵の最終産物としてエタノールおよび酢酸を有する代謝プロフ
ァイル、などの同じの主要な系統発生性質を共有する（Ａｂｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，
１９９４； Ｋoｐｋｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１１； Ｔａｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，
１９９３）。しかしながら、これらの種は、様々な糖（たとえばラムノース、アラビノ
ース）、酸（たとえばグルコン酸、クエン酸）、アミノ酸（たとえばアルギニン、ヒスチ
ジン）、または他の基質（たとえばベタイン、ブタノール）の基質の利用において差異が
ある。一部の種はあるビタミン類（たとえばチアミン、ビオチン）に対して栄養要求性で
あることが見出されているが、他の種はそうではない。対応するアルコールへのカルボン
酸の還元が、様々なこれらの生物で示されている（Ｐｅｒｅｚ， Ｒｉｃｈｔｅｒ， Ｌ
ｏｆｔｕｓ， ＆ Ａｎｇｅｎｅｎｔ， ２０１２）。
記載される特徴は、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍまたはＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈ
ｌｉｉのような１つの生物に特異的ではなく、むしろ酸化炭素栄養性エタノール―合成ク
ロストリジウムの一般的な特徴である。したがって、本発明は、性能に差異があるかもし
れないが、これらの株全体で機能することが予測され得る。
本発明の組み換え酸化炭素栄養性酢酸産生微生物は、親酸化炭素栄養性酢酸産生微生物
および１つ以上の外来性核酸から、組み換え微生物を産生するための当業者に知られてい
る任意の数の技術を使用して、調製されてもよい。例としてのみであるが、形質転換（形
質導入またはトランスフェクションを含む）は、エレクトロポレーション、電気融合、超
音波処理、ポリエチレングリコール媒介形質転換、接合、または化学的および天然のコン
ピテンスにより達成されてもよい。適切な形質転換技術は例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ
， Ｆｒｉｔｓｃｈ ＥＦ， Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ： Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｕｒ Ｌａｂｒｏｔａｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｕｒ， １９８９に記載される。
エレクトロポレーションは、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ （Ｋoｐｋｅ ｅｔ ａｌ
．， ２０１０； Ｌｅａｎｇ， Ｕｅｋｉ， Ｎｅｖｉｎ， ＆ Ｌｏｖｌｅｙ， ２
０１２） （ＰＣＴ／ＮＺ２０１１／０００２０３； ＷＯ２０１２／０５３９０５）、
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ（ＰＣＴ／ＮＺ２０１１／０００２０３； ＷＯ２
０１２／０５３９０５）、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉ （Ｓｔｒaｔ
ｚ， Ｓａｕｅｒ， Ｋｕｈｎ， ＆ Ｄuｒｒｅ， １９９４）またはＭｏｏｒｅｌｌ
ａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ（Ｋｉｔａ ｅｔ ａｌ．， ２０１２）などのいくつ
かの酸化炭素栄養性酢酸産生菌について記載されており、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃ
ｕｍ（Ｍｅｒｍｅｌｓｔｅｉｎ， Ｗｅｌｋｅｒ， Ｂｅｎｎｅｔｔ， ＆ Ｐａｐｏｕ
ｔｓａｋｉｓ， １９９２）、Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ（Ｊｅｎｎｅｒｔ，
Ｔａｒｄｉｆ， Ｙｏｕｎｇ， ＆ Ｙｏｕｎｇ， ２０００）またはＣ．ｔｈｅｒｍｏ
ｃｅｌｌｕｍ（ＭＶ Ｔｙｕｒｉｎ， Ｄｅｓａｉ， ＆ Ｌｙｎｄ， ２００４）など
の多くのクロストリジウム菌で用いられる標準の方法である。
電気融合は、酢酸産生菌Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ． ＭＴ３５１ について記載
されている（Ｔｙｕｒｉｎ ａｎｄ Ｋｉｒｉｕｋｈｉｎ， ２０１２）。
プロファージ導入は、Ｃ．ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ（Ｐｒａｓａｎｎａ Ｔａｍａｒ
ａｐｕ Ｐａｒｔｈａｓａｒａｔｈｙ， ２０１０， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ
ａ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｃｌｏｓｔｒｉ
ｄｉｕｍ ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ ２５７７５ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔ
ｉｏｎ ｏｆ Ｍｕｔａｎｔｓ， Ｍａｓｔｅｒｓ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｗｅｓｔｅ
ｒｎ Ｋｅｎｔｕｃｋｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）の場合に同様に酸化炭素栄養性酢酸産
生菌について記載されている。
接合は、酢酸産生菌Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（Ｈｅｒｂｅｒｔ，
Ｏ’Ｋｅｅｆｆｅ， Ｐｕｒｄｙ， Ｅｌｍｏｒｅ， ＆ Ｍｉｎｔｏｎ， ２００３
）およびＣ．ａｃｅｔｏｂｕｙｌｉｃｕｍ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ， Ｙｏｕｎｇ， ＆ Ｙ
ｏｕｎｇ， １９９０）を含む多くの他のクロストリジウムに対して選択される方法とし
て記載されている。
１つの実施形態では、親株は唯一の炭素およびエネルギー供給源としてＣＯを使用する
。
１つの実施形態では、親微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇ
ｅｎｕｍまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉである。１つの特定の
実施形態では、微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ
ＤＳＭ２３６９３である。別の特定の実施形態では、微生物はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ ＤＳＭ１３５２８（またはＡＴＣＣ５５３８３）である。
核酸
本発明はまた、本発明の組換え微生物を作成するのに使用される１つ以上の核酸または
核酸構築物を提供する。
１つの実施形態では、核酸はメバロン酸（ＭＶＡ）経路および任意にＤＸＳ経路の１つ
以上の酵素をコードする配列を含み、微生物中で発現された場合ＣＯを含む基質の発酵に
より微生物に１つ以上のテルペン類および／またはその前駆体を産生させる。１つの特定
の実施形態では、本発明は、微生物中で発現された場合ＣＯを含む基質の発酵により微生
物に１つ以上のテルペン類および／またはその前駆体を産生させる、２つ以上の酵素をコ
ードする核酸を提供する。１つの実施形態では、本発明の核酸は３つ、４つ、または５つ
以上のそのような酵素をコードする。
１つの実施形態では、核酸によりコードされる１つ以上の酵素はメバロン酸（ＭＶＡ）
経路由来であり、
ａ） チオラーゼ（ＥＣ ２．３．１．９）、
ｂ） ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ ２．３．３．１０）、
ｃ） ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ １．１．１．８８）、
ｄ） メバロン酸キナーゼ（ＥＣ ２．７．１．３６）、
ｅ） ホスホメバロン酸キナーゼ（ＥＣ ２．７．４．２）、
ｆ） ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．３３）、および
ｇ） 機能的に等価であるそれらのいずれかの変異体
からなる群から選択される。
さらなる実施形態では、核酸によりコードされる１つ以上の酵素はＤＸＳ経路由来であ
り、
ａ） １−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ ＤＸＳ（ＥＣ：２．
２．１．７）、
ｂ） １−デオキシ−Ｄ−キシルロース ５−リン酸レダクトイソメラーゼ ＤＸＲ
（ＥＣ：１．１．１．２６７）、
ｃ） ２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール ４−リン酸シチジリルトランスフェラー
ゼ ＩｓｐＤ（ＥＣ：２．７．７．６０）、
ｄ） ４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール キナーゼ Ｉｓ
ｐＥ（ＥＣ：２．７．１．１４８）、
ｅ） ２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール ２，４−シクロ二リン酸シンターゼ Ｉ
ｓｐＦ（ＥＣ：４．６．１．１２）、
ｆ） ４−ヒドロキシ−３−メチルブタ −２−エン−１−イル 二リン酸シンターゼ
ＩｓｐＧ（ＥＣ：１．１７．７．１）、
ｇ） ４−ヒドロキシ−３−メチルブタ −２−エニル 二リン酸レダクターゼ（ＥＣ：
１．１７．１．２）、および
ｈ） 機能的に等価であるそれらのいずれかの変異体
からなる群から選択される。
さらなる実施形態では、核酸は、発現または過剰に発現されてテルペン類化合物および
／またはその前駆体の産生をもたらす１つ以上のさらなる酵素をコードし、発現される外
来性酵素、または過剰発現される内在性酵素は、
ａ） ゲラニルトランストランスフェラーゼ Ｆｐｓ（ＥＣ：２．５．１．１０）、
ｂ） ヘプタプレニル二リン酸シンターゼ（ＥＣ：２．５．１．１０）、
ｃ） オクタプレニル−二リン酸シンターゼ（ＥＣ：２．５．１．９０）、
ｄ） イソプレンシンターゼ（ＥＣ ４．２．３．２７）、
ｅ） イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ（ＥＣ ＥＣ ５．３．３．２）
ｆ）ファルネセンシンターゼシンターゼ（ＥＣ ４．２．３．４６／ＥＣ ４．２．３．
４７）、および
ｇ）機能的に等価なそれらのいずれかの変異体
からなる群から選択される。
上記酵素の各々をコードする例示的なアミノ酸配列および核酸配列は本明細書に提供さ
れ、または本明細書に前述されたようにＧｅｎＢａｎｋから取得できる。しかしながら、
、本明細書、ＧｅｎＢａｎｋおよび他のデータベース、ならびに遺伝子コードに含まれる
情報を考慮して、これらの酵素または機能的に等価なその変異体をコードする代替的な核
酸配列は当業者に明らかである。
さらなる実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ Ａ
ＴＣＣ８２４由来のチオラーゼ（ｔｈＩＡ）をコードする核酸は以下の配列番号４０に例
示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
さらなる実施形態では、チオラーゼがＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ
ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ Ｍｕ５０由来のアセチル−ＣｏＡ ｃ−アセチルトランスフ
ェラーゼ（ｖｒａＢ）である、チオラーゼをコードする核酸は、は以下の配列番号４１に
例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
さらなる実施形態では、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．
ａｕｒｅｕｓ Ｍｕ５０由来の３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ シンタ
ーゼ（ＨＭＧＳ）をコードする核酸は以下の配列番号４２に例示される核酸配列によりコ
ードされ、または機能的に等価なその変異体である。
さらなる実施形態では、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．
ａｕｒｅｕｓ Ｍｕ５０由来のヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡ レダクターゼ（Ｈ
ＭＧＲ）をコードする核酸は以下の配列番号４３に例示される核酸配列によりコードされ
、または機能的に等価なその変異体である。
さらなる実施形態では、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．
ａｕｒｅｕｓ Ｍｕ５０由来のメバロン酸キナーゼ（ＭＫ）をコードする核酸は以下の配
列番号５１に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体で
ある。
さらなる実施形態では、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．
ａｕｒｅｕｓ Ｍｕ５０由来のホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）をコードする核酸は
以下の配列番号５２に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその
変異体である。
さらなる実施形態では、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．
ａｕｒｅｕｓ Ｍｕ５０由来のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭＤ）をコー
ドする核酸は以下の配列番号５３に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的
に等価なその変異体である。
さらなる実施形態では、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ由来のデオキシキシルロ
ース ５−リン酸シンターゼをコードする核酸は配列番号１に例示される核酸配列により
コードされおよび／または以下の配列番号２に例示されるアミノ配列を有し、または機能
的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース ５−リン酸レダクトイソメラ
ーゼ ＤＸＲ（ＥＣ：１．１．１．２６７）をコードする核酸は配列番号３の配列を有し
、または機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール ４−リン酸シチジリルト
ランスフェラーゼ ＩｓｐＤ（ＥＣ：２．７．７．６０）をコードする核酸は配列番号５
の配列を有し、または機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール
キナーゼ ＩｓｐＥ（ＥＣ：２．７．１．１４８）をコードする核酸は配列番号７の配列
を有し、または機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール ２，４−シクロ二リン酸
シンターゼ ＩｓｐＦ（ＥＣ：４．６．１．１２）をコードする核酸は配列番号９の配列
を有し、または機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、４−ヒドロキシ−３−メチルブタ −２−エン−１−イル 二リン
酸シンターゼ ＩｓｐＧ（ＥＣ：１．１７．７．１）をコードする核酸は配列番号１１の
配列を有し、または機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、４−ヒドロキシ−３−メチルブタ −２−エニル 二リン酸レダク
ターゼ（ＥＣ：１．１７．１．２）をコードする核酸は配列番号１３の配列を有し、また
は機能的に等価なその変異体である。
さらなる実施形態では、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｒ． Ｋ−１２ ｓ
ｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５由来のゲラニルトランストランスフェラーゼ（ｉｓｐＡ）をコ
ードする核酸は以下の配列番号５６に例示される核酸配列によりコードされ、または機能
的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、ヘプタプレニル二リン酸シンターゼをコードする核酸は配列番号
１７の配列を有し、または機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、オクタプレニル−二リン酸シンターゼがポリプレニルシンテター
ゼであるオクタプレニル−二リン酸シンターゼ（ＥＣ：２．５．１．９０）をコードする
核酸は配列番号１９によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、Ｐｏｐｌａｒ ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ由来のイソプレンシンタ
ーゼ（ｉｓｐＳ）をコードする核酸は以下の配列番号２１に例示され、または機能的に等
価なその変異体である。
さらなる実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ由来のイ
ソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ（ｉｄｉ）をコードする核酸は配列番号５４に
例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
さらなる実施形態では、Ｍａｌｕｓ ｘ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ由来のαファルネセンシ
ンターゼ（ＦＳ）をコードする核酸は以下の配列番号５７に例示される核酸配列によりコ
ードされ、または機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、本発明の核酸はプロモーターをさらに含む。１つの実施形態では
、プロモーターはその制御下で遺伝子の構成的発現を可能にする。しかしながら、誘導可
能なプロモーターを使用してもよい。当業者は、本発明に使用される適切なプロモーター
を容易に理解するものである。好ましくは、プロモーターは、適切な発酵条件下で高レベ
ルの発現を導くことができる。特定の実施形態では、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌクラ
スタープロモーターを使用する。別の実施形態では、ホスホトランスアセチラーゼ／酢酸
キナーゼプロモーターを使用する。別の実施形態では、ピルビン酸：フェレドキシンオキ
シドレダクターゼプロモーター、Ｒｎｆ複合オペロンプロモーターまたはＡＴＰシンター
ゼオペロンプロモーターを使用する。１つの特定の実施形態では、プロモーターはＣ．ａ
ｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ由来である。
本発明の核酸は、親微生物の形質転換の際、染色体の外に保持してもよく、または微生
物のゲノム中に統合するよう適合させてもよい。したがって、本発明の核酸は、統合を支
援するよう適合された追加的なヌクレオチド配列（たとえば、相同組み換えおよび宿主ゲ
ノムへの標的化統合を可能にする領域）、または染色体外構築物の安定な発現および複製
を支援するように適合された追加的なヌクレオチド配列（たとえば、複製起源、プロモー
ター、および他の制御配列）を含んでもよい。
１つの実施形態では、核酸は、核酸構築物またはベクターである。１つの特定の実施形
態では、核酸構築物またはベクターは発現構築物またはベクターであるが、クローニング
に使用されるような他の構築物およびベクターも本発明に含まれる。１つの特定の実施形
態では、発現構築物またはベクターはプラスミドである。
本発明の発現構築物／ベクターは、もし望ましい場合、さらなるタンパク質の発現に適
した追加的な遺伝子ならびにプロモーターに加えて、任意の数の調節要素を含んでもよい
。１つの実施形態では、発現構築物／ベクターは、１つのプロモーターを含む。別の実施
形態では、発現構築物／ベクターは、２つ以上のプロモーターを含む。１つの特定の実施
形態では、発現構築物／ベクターは、発現される各遺伝子に対する１つのプロモーターを
含む。１つの実施形態では、発現構築物／ベクターは、１つ以上のリボソーム結合部位、
好ましくは発現する各遺伝子に対するリボソーム結合部位を含む。
本明細書に記載される核酸配列および構築物／ベクター配列は、リボソーム結合部位お
よび／または制限部位に必要であるもののような、標準的なリンカーヌクレオチドを含ん
でもよいことは当業者に明らかである。このようなリンカー配列は、必要であると解釈さ
れるべきではなく、また定義した配列を限定するものではない。
本発明の発現構築物／ベクターを含む、核酸および核酸構築物は、標準的な先行技術の
いずれかを使用して構築されてもよい。たとえば、化学的合成または組み換え技術を使用
してもよい。このような技術は、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋらにより（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９）に記載されている。さらなる例示的な技術は、
以下の本明細書の実施例部分に記載される。本質的に、個々の遺伝子および調節要素は、
遺伝子が発現されて所望のタンパク質を形成するようお互いに操作可能に結合されている
。本発明の使用に適切なベクターは、当業者に理解されている。しかしながら、例として
、以下のベクターが適切であろう：ｐＭＴＬ８００００ベクター、ｐＩＭＰ１、ｐＪＩＲ
７５０、および以下の本明細書の実施例に例示されるプラスミド。
本発明の核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはｃＤＮＡを含む任意の適切な形態であっても
よいことは明らかである。
本発明はまた、本明細書に記載される核酸のいずれかの１つ以上を含む、ウイルス、細
菌、および酵母を含む宿主生物、特に微生物を提供する。
生物産生方法
１つ以上の外来性核酸は、裸核酸として親微生物に送達されてもよく、または形質転換
工程を促進するために１つ以上の薬剤と製剤化されてもよい（たとえば、リポソーム結合
核酸、核酸が含まれる生物）。１つ以上の核酸は、適切なように、ＤＮＡ、ＲＮＡ，また
はその組み合わせであってもよい。制限酵素を特定の実施形態で使用してもよい；たとえ
ば、Ｍｕｒｒａｙ， Ｎ．Ｅ．らによる（２０００） Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ． Ｍｏｌｅ
ｃ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． ６４， ４１２．参照。
本発明の微生物は、親微生物および１つ以上の外来性核酸から、組み換え微生物を産生
するための任意の先行技術を使用して調製されてもよい。例として、形質転換（形質誘導
またはトランスフェクション）は、エレクトロポレーション、超音波処理、ポリエチレン
グリコール媒介形質転換、または化学的もしくは天然のコンピテンス、または接合により
達成されてもよい。適切な形質転換技術は、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ， Ｆｒｉ
ｔｓｃｈ ＥＦ， Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ： Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：
Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ
Ｌａｂｒｏｔａｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ， １
９８９．に記載される。
特定の実施形態では、形質転換される微生物中で活性な制限系のため、微生物に導入さ
れる核酸をメチル化する必要がある。これは以下に記載される技術を含む様々な技術を使
用して行うことができ、かつ以下の本明細書の実施例にさらに例示される。
例として、１つの実施形態では、本発明の組換え微生物は、以下のステップ：
ｂ）（ｉ）本明細書に記載される発現構築物／ベクターおよび（ｉｉ）メチルトランスフ
ェラーゼ遺伝子を含むメチル化構築物／ベクターのシャトル微生物への導入；
ｃ）メチルトランスフェラーゼの発現；
ｄ）シャトル微生物由来の１つ以上の構築物／ベクターの単離；
ｅ）１つ以上の構築物／ベクターの目的微生物への導入
を含む方法により産生される。
１つの実施形態では、ステップＢのメチルトランスフェラーゼ遺伝子は構成的に発現さ
れる。別の実施形態では、ステップＢのメチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現は誘導さ
れる。
シャトル微生物は、微生物、好ましくは、発現構築物／ベクターを構成する核酸配列の
メチル化を促進する、制限陰性の微生物である。特定の実施形態では、シャトル微生物は
、制限陰性のＥ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ、またはＬａｃｔｏ
ｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓである。
メチル化構築物／ベクターは、メチルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を含む
。
発現構築物／ベクターおよびメチル化構築物／ベクターがシャトル微生物に導入される
と、メチル化構築物／ベクター上に存在するメチルトランスフェラーゼ遺伝子が誘導され
る。本発明の１つの特定の実施形態では、メチル化構築物／ベクターは、誘導可能なｌａ
ｃプロモーターを含み、かつラクトースまたはその類似体、より好ましくはイソプロピル
―β―Ｄ−チオ―ガラクトシド（ＩＰＴＧ）の添加により誘導されるが、誘導は任意の適
切なプロモーター系によるものであってもよい。他の適切なプロモーターは、ａｒａ、ｔ
ｅｔ、またはＴ７システムを含む。本発明のさらなる実施形態では、メチル化構築物／ベ
クタープロモーターは構成的プロモーターである。
特定の実施形態では、メチル化構築物／ベクター上に存在する任意の遺伝子がシャトル
微生物で発現されるように、メチル化構築物／ベクターはシャトル微生物のアイデンティ
ティーに特異的な複製起源を有する。好ましくは、発現構築物上に存在する任意の遺伝子
が目的微生物で発現されるように、発現構築物／ベクターは、目的微生物のアイデンティ
ティーに特異的な複製起源を有する。
メチルトランスフェラーゼ酵素の発現は、発現構築物／ベクター上に存在する遺伝子の
メチル化をもたらす。発現構築物／ベクターはその後、任意の既知の方法にしたがいシャ
トル微生物から単離されてもよい。例として、本明細書の実施例に記載される方法を使用
して発現構築物／ベクターを単離してもよい。
１つの特定の実施形態では、構築物／ベクターのいずれもが共に単離されてもよい。
発現構築物／ベクターは、任意の既知の方法を使用して目的微生物に導入されてもよい
。しかしながら、例として、以下の実施例に記載される方法を使用してもよい。発現構築
物／ベクターはメチル化されるため、発現構築物／ベクター上に存在する核酸配列は目的
微生物に組み込まれることができ、かつうまく発現される。
メチルトランスフェラーゼ遺伝子がシャトル微生物に導入されかつ過剰に発現されるこ
とが予想される。したがって、１つの実施形態では、結果として得られるメチルトランス
フェラーゼ酵素を知られている方法を使用して収集し、発現プラスミドをメチル化するた
めに体外で使用してもよい。発現構築物／ベクターはそれから発現用の目的微生物に導入
されてもよい。別の実施形態では、メチルトランスフェラーゼ遺伝子がシャトル微生物の
ゲノムに誘導された後、シャトル微生物への発現構築物／ベクターの導入、シャトル微生
物からの１つ以上の構築物／ベクターの単離を行い、その後、目的微生物への発現構築物
／ベクターの導入が行われる。
上に定義される発現構築物／ベクターおよびメチル化構築物／ベクターが組み合わされ
て当該の組成物を提供してもよいことが予想される。このような組成物は、制限障壁機構
を回避して本発明の組換え微生物を産生するために特に有用である。
１つの特定の実施形態では、発現構築物／ベクターおよび／またはメチル化構築物／ベ
クターはプラスミドである。
本発明の微生物を産生するのに用いられる多くの適切なメチルトランスフェラーゼが当
業者には明らかである。しかしながら、例として、枯草菌ファージ ΦＴ１ メチルトラ
ンスフェラーゼおよび以下の本明細書の実施例に記載されるメチルトランスフェラーゼが
使用されてもよい。１つの実施形態では、メチルトランスフェラーゼは配列番号６０のア
ミノ酸配列を有し、または機能的に等価なその変異体である。所望のメチルトランスフェ
ラーゼ配列および遺伝子コードを考慮して、適切なメチルトランスフェラーゼをコードす
る核酸は明らかである。１つの実施形態では、メチルトランスフェラーゼをコードする核
酸は、以下の本明細書の実施例に記載されている通りである（たとえば、配列番号６３の
核酸、または機能的に等価なその変異体である）。
メチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を可能にするよう適合され任意の数の構築物／
ベクターを使用して、メチル化構築物／ベクターを生成してもよい。しかしながら、例と
して、以下の実施例に記載されるプラスミドを使用してもよい。
産生方法
本発明は、本発明の組換え微生物を使用してＣＯを含む基質を発酵することを含む微生
物発酵により、１つ以上のテルペン類および／またはその前駆体、ならびに任意に１つ以
上の他の産物を産生する方法を提供する。好ましくは、１つ以上のテルペンおよび／また
はその前駆体は、主要な発酵産物である。本発明の方法は、工業工程由来の大気中炭素の
排出の総量を低減するために使用してもよい。
好ましくは、発酵は、本発明の組換え微生物を使用して、生物反応器中で基質を嫌気的
に発酵して少なくとも１つ以上のテルペン類および／またはその前駆体を産生するステッ
プを含む。
１つの実施形態では、１つ以上のテルペン類および／またはその前駆体は、メバロン酸
、ＩＰＰ、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）、イソプレン、ゲラニルピロリン酸（
ＧＰＰ）、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）、およびファルネセンから選択される。
テルペノイドの重要な中間体ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰから直接イソプレンを産生しその
後これを用いてより長鎖のテルペン類を合成する代わりに、直接ゲラニルトランストラン
スフェラーゼを介して、Ｃ１０モノテルペノイド類またはＣ１５セスキテルペノイド類な
どのより長鎖のテルペン類を合成することも可能である（表６参照）。Ｃ１５セスキテル
ペノイド構築ブロックファルネシル―ＰＰからファルネセンを産生することが可能であり
、これは、エタノールと同様に、輸送燃料として使用できる。
１つの実施形態では、本方法は、
（ａ）本発明の１つ以上の微生物の培養物を含む生物反応器にＣＯを含む基質を提供する
ステップ；および
（ｂ）生物反応器の培養物を嫌気的に発酵して少なくとも１つのテルペンおよび／または
その前駆体を産生するステップと
を含む。
１つの実施形態では、本方法は、
ａ）工業的工程の結果として産生されたＣＯ含有気体を補足することと、
ｂ）本発明の１つ以上の微生物を含む培養による、少なくとも１つ以上のテルペンおよび
／またはその前駆体を産生するためのＣＯ含有気体の嫌気的発酵のステップ
を含む。
本発明の１つの実施形態では、微生物により発酵される気体状の基質は、ＣＯを含む気
体の基質である。気体状の基質は工業工程の副産物として得られる廃ガスを含むＣＯであ
ってもよく、または自動車の排気煙霧由来などのいくつかの他の供給源由来であってもよ
い。ある実施形態では、工業工程は、製鋼などの鉄金属製品製造、非鉄製品の製造、石油
精製工程、石炭の気化、電力生成、カーボンブラック生成、アンモニア生成、メタノール
産生および石炭製造からなる群から選択される。これらの実施形態では、ＣＯ含有気体は
、任意の便利な方法を使用して、大気中に排出される前に工業工程から補足されてもよい
。ＣＯは合成ガス（一酸化炭素および水素を含む気体）の成分であってもよい。工業工程
から生成したＣＯは通常燃焼されてＣＯ２を産生する。したがって本発明は、ＣＯ２温室
ガスの放出を低減しかつバイオ燃料として使用するテルペンを産生するのに特に有用であ
る。気体状のＣＯ含有基質の組成に応じて、発酵にこの基質を導入する前に、ダスト粒子
などの望ましくない不純物を除去するよう処置することもまた望ましい。たとえば、気体
状の基質は、知られている方法を使用して濾過され、または洗浄されてもよい。
細菌の増殖および少なくとも１つ以上のテルペンおよび／またはその前駆体に応じたＣ
Ｏを発生するために、ＣＯ含有基質の気体に加え、適切な液体栄養培地が生物反応器に供
給される必要があることが理解されるであろう。基質および培地は、連続形態、バッチ、
またはバッチ供給形態で生物反応器に供給されてもよい。栄養培地は、使用される微生物
の増殖を可能にするために十分なビタミン類および無機類を含む。ＣＯを使用するテルペ
ンおよび／またはその前駆体を産生するための発酵に適した嫌気性培地は当業者に知られ
ている。たとえば、適切な培地は、Ｂｉｅｂｅｌ（２００１）に記載される。本発明の１
つの実施形態では、培地は、以下の本明細書の実施例に記載される通りである。
発酵は、少なくとも１つ以上のテルペンおよび／またはその前駆体の発酵に応じたＣＯ
を発生させるための適切な条件下で行われることが望ましい。考慮されるべき反応条件と
しては、圧力、温度、ガス流量、液体流量、培地のｐＨ、培地の酸化還元電位、撹拌速度
（もし連続撹拌タンクリアクターが使用される場合）、接種レベル、液相中のＣＯが制限
されないことを保証するための最大気体基質濃度、および産生物阻害を回避するための最
大産生物濃度が挙げられる。
その上、多くの場合、基質の流れのＣＯ濃度（または気体状基質中のＣＯ分圧）を増大
させ、それによりＣＯが基質である発酵反応の効率を増大させることが望ましい。増大し
た圧力で操作することにより、気相から液相へＣＯ移送の速度が著しく増大し、少なくと
も１つ以上のテルペンおよび／またはその前駆体の産生のための炭素供給源としてＣＯが
微生物に取り込まれ得る。このことはまた、生物反応器が大気圧よりも高い圧力で維持さ
れる場合、保持時間（入力した気体の流量で割った生物反応器の液体容量として定義され
る）が、低減できることを意味する。最適反応条件は、使用される本発明の特定の微生物
に部分的に依存する。しかしながら、一般的に、大気圧よりも高い圧力で発酵を実施する
ことが好ましい。また、ＣＯから１つ以上のテルペンおよび／またはその前駆体への与え
られる変換比率は部分的に基質の保持時間の関数に依存し、また所望の保持時間を達成す
ることが今度は必要とされる生物反応器の容量を決定づけるため、加圧したシステムの使
用により必要とされる生物反応器の容量を大きく低減でき、その結果発酵器具の資本費用
を大きく低減できる。米国特許第５，５９３，８８６号に開示される実施例にしたがって
、生物反応器の容量はリアクターの作動圧力の増大に対して直線的比率で低減できうる。
すなわち、１０大気圧で作動する生物反応器は、１大気圧で作動する生物反応器の１／１
０の容量のみを必要とする。
例として、増加された圧力において気体からエタノールへの発酵を実施する利点が記載
されている。たとえば、国際公開公報第０２／０８４３８号は、３０ｐｓｉｇおよび７５
ｐｓｉｇの圧力下で気体からエタノールへの発酵を実施し、それぞれ１５０ｇ／日、３６
９ｇ／日の生産性でエタノールを得る。しかしながら、同様の媒体および投入気体組成物
を使用して大気圧で実施した発酵の例では、１日に１リットルあたり１０〜２０倍少ない
エタノールが産生されることがわかった。
また、ＣＯ含有気体状基質の導入速度は、液相のＣＯ濃度が制限されないことを保証す
るようなものであることが望ましい。これは、ＣＯが限定される条件の結果、１つ以上の
産生物が培養に消費され得ることによるものである。
発酵反応への供給に使用される気体流の組成は、反応の効率および／または費用に著し
く影響する。たとえば、Ｏ２は、嫌気的発酵工程の効率を低減する。発酵の前後の発酵工
程の段階における望ましくないまたは不必要な気体の処理は、このような段階の負担を増
大させる可能性がある（たとえば、気体流が生物反応器に入る前に圧縮される場合、発酵
には必要ではない気体を圧縮するために不必要なエネルギーが使用される）。したがって
、基質の流れ、特に工業供給源由来の基質の流れを処置して望ましくない成分を除去し、
かつ望ましい成分の濃度を増大させることが望ましい。
ある実施形態では、本発明の細菌の培養物は水性培養培地に維持される。好ましくは、
水性培養培地は最小嫌気性細菌増殖培地である。適切な培地は当業者に知られており、例
えば米国特許第５，１７３，４２９号、同第５，５９３，８８６号、および国際公開公報
第０２／０８４３８号に記載され、および本明細書で以下の実施例に記載される通りであ
る。
テルペン類および／もしくはその前駆体、または１つ以上のテルペン類、その前駆体、
および／または１つ以上の他の産物を含む混合流は、分別蒸留または蒸発、浸透気化法、
気体のストリッピングおよび液体―液体抽出などを含む抽出発酵などの、当業者に知られ
ている方法により発酵ブロスから回収されてもよい。
本発明のある好ましい実施形態では、１つ以上のテルペンおよび／またはその前駆体な
らびに１つ以上の産物は、生物反応器からブロスの一部を連続的に除去し、微生物細胞を
ブロスから（濾過により簡便に）分離し、およびブロスから１つ以上の産物を回収するこ
とにより、発酵ブロスから回収される。アルコールは、たとえば蒸留により簡便に回収さ
れる。アセトンは、たとえば蒸留により回収されてもよい。産生された任意の酸は、たと
えば活性炭への吸着により回収されてもよい。分離された微生物細胞は、好ましくは発酵
生物反応器に戻される。任意のアルコールおよび酸が除去された後に残存する細胞を含ま
ない透過物もまた、好ましくは発酵生物反応器に戻される。生物反応器に戻す前に、栄養
培地を補充するために追加的な栄養物（ビタミンＢなど）が細胞を含まない透過物に添加
されてもよい。
また、ブロスのｐＨが活性炭への酢酸の吸収を高めるために上述のように調節された場
合、ｐＨは、生物反応器に戻す前に、発酵生物反応器中のブロスのｐＨと同様のｐＨに再
調節されるべきである。
実施例
本発明を以下の限定する意味を持たない実施例を参照してより詳細に記載する。
実施例１：ＣＯからのイソプレン産生のためのＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍで
のイソプレンシンターゼの発現
本発明者らは、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍおよびＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉ
ｉなどの酸化炭素栄養性酢酸産生菌におけるテルペン生合成遺伝子を同定した。組み換え
微生物を、イソプレンを産生するように改変した。イソプレンは、ポプラなどのいくつか
の植物から、ＵＶ放射から葉を保護するため天然に発せられる。ポプラのイソプレンシン
ターゼ（ＥＣ ４．２．３．２７）遺伝子を、コドンを最適化して、ＣＯからイソプレン
を産生するように酸化炭素栄養性酢酸産生菌Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍに導入
した。この酵素は、テルペノイド生合成の鍵となる中間体ＤＭＡＰＰ（ジメチルアリル二
リン酸）を不可逆反応でイソプレンに変換する（図１）。
株および増殖条件：
すべてのサブクローニングステップを、以前に記載された標準的な株および増殖条件を
使用してＥ．ｃｏｌｉで実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｒｏｔａｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｕｒ， １９８９； Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ， Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅ
ｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｌｔｄ．， Ｈｏｂｏｋｅｎ， １９８７）。
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＤＳＭ１００６１およびＤＳＭ２３６９３（Ｄ
ＳＭ１００６１誘導体）を、ＤＳＭＺ（Ｔｈｅ Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏ
ｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｉｎｈｏｆｆｅ
ｎｓｔｒａsｅ ７ Ｂ， ３８１２４、ドイツブラウンシュヴァイク市）から取得した
。増殖を、厳密な嫌気的条件および技術を使用して３７℃で実行した（Ｈｕｎｇａｔｅ，
１９６９， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ． ３Ｂ．
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： １１７−１３２； Ｗｏｌｆ
ｅ， １９７１， Ａｄｖ． Ｍｉｃｒｏｂ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ６： １０７−１
４６）。酵母抽出物を含まない化学的に定義されたＰＥＴＣ培地（表１）ならびに唯一の
炭素およびエネルギー供給源として、製鋼排ガスを含む３０ｐｓｉの一酸化炭素（ニュー
ジーランドＧｌｅｎｂｒｏｏｋのＮｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｓｔｅｅｌで収集、組成：４４
％ ＣＯ、３２％ Ｎ２、２２％ ＣＯ２、２％ Ｈ２）
を使用した。
Figure 0006636550
Figure 0006636550
発現プラスミドの構築：
本発明では、標準的な組み換えＤＮＡおよび分子クローニング技術を使用した（Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋ Ｊ， Ｆｒｉｔｓｃｈ ＥＦ， Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ： Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ， １９８９； Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ， Ｂｒｅｎｔ Ｒ， Ｋ
ｉｎｇｓｔｏｎ ＲＥ， Ｍｏｏｒｅ ＤＤ， Ｓｅｉｄｍａｎ ＪＧ， Ｓｍｉｔｈ
ＪＡ， Ｓｔｒｕｈｌ Ｋ： Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｌｔｄ．， Ｈ
ｏｂｏｋｅｎ， １９８７）。Ｐｏｐｌａｒ ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓのイソプレンシン
ターゼ（ＡＡＱ１６５８８．１； ＧＩ：３３３５８２２９）を、コドンを最適化して（
配列番号２１）合成した。Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのピルビン酸：フェレド
キシンオキシドレダクターゼのプロモーター領域（配列番号２２）を使用してこの遺伝子
を発現した。
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＤＳＭ２３６９３由来の
ゲノムＤＮＡを、ＢｅｒｔｒａｍとＤuｒｒｅ（１９８９）による方法の改変法を使用し
て単離した。１晩培養した１００ｍｌの培養物を回収し（６，０００×ｇ、１５分、４℃
）、リン酸カリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．５）で洗浄して１．９ｍｌのＳＴＥ緩衝
液（５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２００ｍＭ スクロース；ｐＨ
８．０）に懸濁した。３００μｌのリゾチーム（〜１００，０００Ｕ）を添加して混合物
を３７℃で３０分間インキュベートした後、２８０μｌの１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ溶液を
添加し、さらに１０分間インキュベートした。２４０μｌのＥＤＴＡ溶液（０．５Ｍ、ｐ
Ｈ８）、２０μｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１Ｍ、ｐＨ７．５）、および１０μｌ ＲＮａｓ
ｅ Ａ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加することによりＲＮ
Ａを室温でs消化した。その後、１００μｌのプロテイナーゼＫ（０．５Ｕ）を添加し、
タンパク質の分解を３７℃で１〜３時間行った。最終的に、６００μｌの過塩素酸ナトリ
ウム（５Ｍ）を添加し、その後フェノール―クロロホルム抽出およびイソプロパノール沈
殿を行った。ＤＮＡの定量および定性分析を分光測定で行った。ピルビン酸：フェレドキ
シンオキシドレダクターゼ のプロモーター配列を、オリゴヌクレオチドＰｐｆｏｒ−Ｎ
ｏｔＩ−Ｆ（配列番号：２３：ＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＡＡＴＡＧＴＴＧＡＴＡＡＴＡ
ＡＴＧＣ）およびＰｐｆｏｒ−ＮｄｅＩ−Ｒ（配列番号：２４：ＴＡＣＧＣＡＴＡＴＧＡ
ＡＴＴＣＣＴＣＴＣＣＴＴＴＴＣＡＡＧＣ）を使用し、ｉＰｒｏｏｆ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄ
ｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）および
を以下のプログラムを使用するＰＣＲにより増幅した、そして最初の変性（９８℃、３０
秒）、続いて３２周期の変性（９８℃、１０秒間）、アニーリング（５０〜６２℃、３０
〜１２０秒）および伸長（７２℃、３０〜９０秒）、その後の最終伸長ステップ（７２℃
、１０分間）。
イソプレンシンターゼ発現プラスミドの構築：
発現プラスミドの構築を、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５α−Ｔ１Ｒ（体外ｇｅｎ）およびＸＬ
１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’ Ｋａｎ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で実施した。第１のステップ
で、増幅したＰｐｆｏｒプロモーター領域をＮｏｔＩおよびＮｄｅＩ制限部位を使用して
Ｅ．ｃｏｌｉ−ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍシャトルベクターｐＭＴＬ８５１４１ （ＦＪ７
９７６５１．１； Ｎｉｇｅｌ Ｍｉｎｔｏｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｔ
ｔｉｎｇｈａｍ； Ｈｅａｐ ｅｔ ａｌ．， ２００９）にクローニングし、プラスミ
ドｐＭＴＬ８５１４６を産生した。第２のステップとして、ｉｓｐＳを制限部位ＮｄｅＩ
およびＥｃｏＲＩを使用してｐＭＴＬ８５１４６にクローニングし、プラスミドｐＭＴＬ
８５１４６−ｉｓｐＳを得た（図２、配列番号２５）。
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍでの形質転換および発現
形質転換の前に、米国特許公開公報第２０１１／０２３６９４１号に記載されるように
、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉおよびＣ．ｌｊｕｎｇ
ｄａｈｌｉｉ由来のメチルトランスフェラーゼ遺伝子から設計したメチル化プラスミド（
配列番号６４）上に共発現される、合成したハイブリッドタイプＩＩメチルトランスフェ
ラーゼ（配列番６３）を使用して、ＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ中で生体内でメチル化した。
発現プラスミドおよびメチル化プラスミドの両方を、制限陰性のＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１
−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’ Ｋａｎ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の同じ細胞に形質転換したが、
これは、それらのグラム−（−）複製起源の適合性（発現プラスミドにおける高コピーの
ColE1およびメチル化プラスミドにおける低コピーのｐ１５Ａ）により可能である。生体
内メチル化を１ｍＭのＩＰＴＧの添加により誘導し、メチル化プラスミドをＱＩＡＧＥＮ
Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して単離した。この結果と
して得られる混合物を、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＤＳＭ２３６９３での形
質転換の実験に使用したが、多量（高コピー）発現プラスミドのみがクロストリジウム中
での複製を可能にするグラム−（＋）複製起源（ｒｅｐＬ）を有する。
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍへの形質転換：
すべての形質転換の実験の間、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＤＳＭ２３６９
３は、１ｇ／Ｌの酵母抽出物および１０ｇ／ｌのフルクトースならびに炭素供給源として
３０ｐｓｉの製鋼排ガス（ニュージーランドＧｌｅｎｂｒｏｏｋのＮｅｗ ＺＥａｌａｎ
ｄ Ｓｔｅｅｌから収集、組成：４４％ ＣＯ、３２％ Ｎ２、２２％ ＣＯ２、２％
Ｈ２）で補足されたＰＥＴＣ培地（表１）中で増殖させた。
コンピテント細胞を作製するために、５０ｍｌのＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ
ＤＳＭ２３６９３培養物を、新鮮な培地に継代し３日間連続で継代
培養した。これらの細胞を使用して、４０ｍＭのＤＬ−スレオニンを含む５０ｍｌのＰＥ
ＴＣ培地に０．０５のＯＤ６００ｍで播種した。培養物のＯＤ６００ｍが０．４に達した
際に、細胞を嫌気チャンバーに移し、４，７００×ｇおよび４℃で収集した。この培養物
を、氷冷したエレクトロポレーションバッファー（２７０ｍＭ スクロース、１ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ２、７ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）で２回洗浄し、最終的に６００μｌ
の新鮮なエレクトロポレーションバッファー懸濁した。この混合物を、メチル化プラスミ
ド混合物１μｇを含む０．４ｃｍの電極ギャップをもつあらかじめ氷冷したエレクトロポ
レーションキュベットに移し、すぐに以下の設定（２．５ｋＶ、６００Ω、および２５μ
Ｆ）でＧｅｎｅ ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌエレクトロポレーションシステム（Ｂｉｏ−
Ｒａｄ）を使用して電気を通した。時間定数は３．７〜４．０ｍｓが達成されたった。こ
の培養物を、５ｍｌの新鮮な培地に移した。細胞の再産生を、チューブホルダーを備えた
Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｈｅｌｉｏｓ Ｅｐｓｉｌｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅ
ｔｅｒ （Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して６００ｎｍの波長でモニタリングした。最初にバイ
オマスが低下した後、細胞は再び増殖を開始した。この時点からバイオマスが二倍になっ
た後、細胞を回収し、２００μｌの新鮮な培地に懸濁し、適切な抗生基質である４μｇ／
ｍｌクラリスロマイシンまたは１５μｇ／ｍｌチアンフェニコールを含む選択的ＰＥＴＣ
プレート（１．２％ Ｂａｃｔｏ（商標）アガロース（ＢＤ）を含む）にプレーティング
した。播種後３７℃の３０ｐｓｉの製鋼ガスで４〜５日で、コロニーが視認できた。
このコロニーを使用して、抗生基質を備えた２ｍｌのＰＥＴＣ培地に播種した。増殖が
発生した後、培養を、唯一の炭素供給源として３０ｐｓｉの製鋼ガスとともに、５ｍｌの
容量、次に５０ｍｌの容量にスケールアップした。
成功した形質転換の確認：
ＤＮＡの転移を検証するために、プラスミドミニプレップを、Ｚｙｐｐｙ ｐｌａｓｍ
ｉｄ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ）を使用して１０ｍｌの培養容量から実施し
た。単離したプラスミドの質は、クロストリジウムのエキソヌクレアーゼ活性のため制限
消化に十分ではなかったので［Ｂｕｒｃｈｈａｒｄｔ および Ｄuｒｒｅ， １９９０
］、オリゴヌクレオチドの対ｃｏｌＥ１−Ｆ（配列番号：６５：ＣＧＴＣＡＧＡＣＣＣＣ
ＧＴＡＧＡＡＡ）＋ｃｏｌＥ１−Ｒ（配列番号：６６：ＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＣＣＧＡＣ
ＣＣＴ）を用いて単離プラスミドでＰＣＲを実施した。ＰＣＲはｉＮｔＲＯＮ Ｍａｘｉ
ｍｉｓｅ Ｐｒｅｍｉｘ ＰＣＲ ｋｉｔ （Ｉｎｔｒｏｎ Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ）を使用して、以下の条件で行った：最初の変性（９４℃、２分間）、続いて３
５周期の変性（９４℃、２０秒間）、アニーリング（５５℃、２０秒間）、および伸長（
７２℃、６０秒間）、その後最終伸長ステップ（７２℃、５分間）。
クローンの同定を確認するために、ＤＮＡゲノムを、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎ
ｕｍ ＤＳＭ２３６９３の５０ｍｌの培養物から単離した（上記参照）。オリゴヌクレオ
チド（配列番号６７：ＣＣＧＡＡＴＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＣＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴ
ＧＧＣＴＣＡＧ）およびｒＰ２（配列番号：６８：ＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＡ
ＣＧＧＣＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ）［Ｗｅｉｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， １
９９１］およびｉＮｔＲＯＮ Ｍａｘｉｍｉｓｅ Ｐｒｅｍｉｘ ＰＣＲ ｋｉｔ（Ｉｎ
ｔｒｏｎ Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、１６ｓ ｒＲＮＡに対する
ＰＣＲを、以下の条件で行った：最初の変性（９４℃、２分間）、続いて３５周期の変性
（９４℃、２０秒）、アニーリング（５５℃、２０秒）、および伸長（７２℃、６０秒）
、その後最終伸長ステップ（７２℃、５分間）。シークエンスの結果は、Ｃ．ａｕｔｏｅ
ｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（ｒｒｓＡ）（Ｙ１８１７８，ＧＩ：７
２７１１０９）に対して少なくとも９９．９％同一であった。
イソプレンシンターゼ遺伝子の発現
ｑＲＴ−ＰＣＲ実験を、導入されたのイソプレンシンターゼの遺伝子がＣ．ａｕｔｏｅ
ｔｈａｎｏｇｅｎｕｍでうまく発現したことを確認するために実行した。
イソプレンシンターゼプラスミドｐＭＴＬ ８５１４６−ｉｓｐＳを含む培養物およびプ
ラスミドを含まない対照培養物を、５０ｍｌの血清用のビンおよび唯一のエネルギーおよ
び炭素の供給源として３０ｐｓｉ製鋼排ガス（ニュージーランドＧｌｅｎｂｒｏｏｋのＮ
ｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｓｔｅｅｌで収集、組成：４４％ ＣＯ、３２％ Ｎ２、２２％
ＣＯ２、２％ Ｈ２）を用いてＰＥＴＣ培地（表１）中で増殖させた。０．８ｍｌの試料
を０．５前後のＯＤ６００ｎｍの対数増殖期中に採取し、１．６ｍｌのＲＮＡ保護試薬（
Ｑｉａｇｅｎ）と混合した。この混合物を遠心し（６，０００×ｇ、５分、４℃）、細胞
沈殿物を、液体窒素ですばやく凍結し、ＲＮＡ抽出まで−８０℃で保存した。総ＲＮＡを
、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ）を使用してマニュアルのプロトコ
ル５にしたがって単離した。細胞の破壊を、混合物をシリンジに１０回通過させることに
より行い、５０μｌのＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅを含まない水で溶出した。ＤＮＡ−ｆｒｅ
ｅ(登録商標) Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用したＤＮａｓｅ Ｉ処理の後、逆転写ステ
ップを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓ
ｅ Ｋｉｔ （体外ｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）を使用して実行し
た。ＲＮＡを、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ， ＣＡ， ＵＳＡ）、Ｑｕｂｉ
ｔ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（体外ｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）を
使用して、およびゲル電気泳動により検査した。非ＲＴ対照を、オリゴヌクレオチド対ご
とに実施した。すべてのｑＲＴ−ＰＣＲ反応は、２５ｎｇのｃＤＮＡテンプレート、６７
ｎＭの各オリゴヌクレオチド(表２)、および１ｘ ｉＱ（商標）ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇ
ｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｃａｒｌｓ
ｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）を含む総反応容量１５μｌ中で、ＭｙｉＱ（商標）Ｓｉｎｇ
ｌｅ Ｃｏｌｏｕｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｒａ
ｔｏｒｉｅｓ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）を使用して二連で実施した。反
応条件は、９５℃を３分間、続いて４０周期の９５℃の１５秒間、５５℃を１５秒間およ
び７２℃を３０秒間であった。オリゴヌクレオチドの二量体化または他の増幅副産物の検
出のため、融解曲線分析を、ｑＰＣＲ（１℃／秒で５８℃から９５℃へ３８周期）の完了
直後に実施した。２つのハウスキーピング遺伝子（グアニル酸キナーゼおよびギ酸テトラ
ヒドロ葉酸リガーゼ）を標準化のために各ｃＤＮＡ試料に含めた。相対的な遺伝子発現の
決定を、Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｔｏｏｌ （Ｒ
ＥＳＴ(c)） ２００８ Ｖ２．０．７（３８）を使用して行った。４ｌｏｇ単位に渡る
ｃＤＮＡの段階希釈を使用して標準曲線を作成し、結果として得られる増幅効率を用いて
ｍＲＮＡの濃度を計算した。
Figure 0006636550
オリゴヌクレオチド対ｉｓｐＳを使用した野生型株では増幅が観察されなかったが、プ
ラスミドｐＭＴＬ ８５１４６−ｉｓｐＳをもつ株でｉｓｐＳオリゴヌクレオチド対を用
いてシグナルが測定され、ｉｓｐＳ遺伝子がうまく発現していることを確認した。
実施例２−重要なテルペン前駆体ＤＭＡＰＰ（ジメチルアリル二リン酸）およびＩＰＰ
（イソペンテニル二リン酸）間の変換のためのイソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラー
ゼの発現
前駆体ＤＭＡＰＰ（ジメチルアリル二リン酸）およびＩＰＰ（イソペンテニル二リン酸
）の利用可能性および均衡は、テルペン類の産生に重要である。ＤＸＳ経路はＩＰＰおよ
びＤＭＡＰＰを等しく合成するのに対し、メバロン酸経路ではＩＰＰのみが産生される。
イソプレンの産生では、イソプレンシンターゼとともに存在する前駆体ＤＭＡＰＰのみを
必要とし、一方より高度のテルペン類およびテルペノイド類の産生では、ゲラニルトラン
ストランスフェラーゼによりゲラニル−ＰＰを産生するために利用可能な等量のＩＰＰお
よびＤＭＡＰＰを有することが必要である。
イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ発現プラスミドの構築：
イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ（ＹＰ＿００１３１０１７４．１）をコー
ドするＣ． ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ由来のイソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラー
ゼ遺伝子ｉｄｉ（Ｇｅｎｅ ＩＤ：５２９４２６４）を、ｉｓｐＳの下流にクローニング
した。この遺伝子を、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍで上述した同一の方法を使用
して取得したＣ． ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＮＣＩＭＢ８０５２のゲノムＤＮＡ由来
のオリゴヌクレオチドＩｄｉ−Ｃｂｅｉ−ＳａｃＩ−Ｆ（配列番号：２６：ＧＴＧＡＧＣ
ＴＣＧＡＡＡＧＧＧＧＡＡＡＴＴＡＡＡＴＧ）およびＩｄｉ−Ｃｂｅｉ−ＫｐｎＩ−Ｒ（
配列番号：２７：ＡＴＧＧＴＡＣＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＴＡＴＴＴＡＧＡＣＧ）を使用し
て増幅した。このＰＣＲ産物を、ＳａｃＩおよびＫｐｎＩ制限部位を使用してベクターｐ
ＭＴＬ ８５１４６−ｉｓｐＳにクローニングし、プラスミドｐＭＴＬ８５１４６−ｉｓ
ｐＳ−ｉｄｉ（配列番号：２８）を得た。嫌気性抵抗マーカーを、制限酵素ＰｍｅＩおよ
びＦｓｅＩを使用してｃａｔＰからｅｒｍＢ（ベクターｐＭＴＬ８２２５４（ＦＪ７９７
６４６．１； Ｎｉｇｅｌ Ｍｉｎｔｏｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｔｔｉ
ｎｇｈａｍ； Ｈｅａｐ ｅｔ ａｌ．， ２００９から入手）に交換し、プラスミドｐ
ＭＴＬ８５２４６−ｉｓｐＳ−ｉｄｉを形成した（図３）。
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍでの形質転換および発現を、プラスミドｐＭＴＬ
８５１４６−ｉｓｐＳについて記載されるように実行した。形質転換の成功後に、増殖
実験を、５０ｍｌの血清ビンおよび唯一のエネルギーおよび炭素供給源として製鋼排ガス
（ニュージーランドＧｌｅｎｂｒｏｏｋのＮｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｓｔｅｅｌで収集、組
成：４４％ ＣＯ、３２％ Ｎ２、２２％ ＣＯ２、２％ Ｈ２）を用いてＰＥＴＣ培地
（表１）中で実行した。プラスミドがうまく導入されたことを確認するために、プラスミ
ドミニプレップＤＮＡを、上述したように形質転換体から実行した。ｃｏｌＥ１（ｃｏｌ
Ｅ１−Ｆ：配列番号：６５：ＣＧＴＣＡＧＡＣＣＣＣＧＴＡＧＡＡＡおよびｃｏｌＥ１−
Ｒ：配列番号：６６：ＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＣＣＧＡＣＣＣＴ）、ｅｒｍＢ（ｅｒｍＢ−
Ｆ：配列番号：１０６：ＴＴＴＧＴＡＡＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧおよびｅｒｍＢ−Ｒ：配
列番号：１０７：ＧＴＡＧＡＡＴＣＣＴＴＣＴＴＣＡＡＣ）およびｉｄｉ（Ｉｄｉ−Ｃｂ
ｅｉ−ＳａｃＩ−Ｆ：配列番号：２６：ＧＴＧＡＧＣＴＣＧＡＡＡＧＧＧＧＡＡＡＴＴＡ
ＡＡＴＧおよびＩｄｉ−Ｃｂｅｉ−ＫｐｎＩ−Ｒ：配列番号：２７：ＡＴＧＧＴＡＣＣＣ
ＣＡＡＡＴＣＴＴＴＡＴＴＴＡＧＡＣＧ）を標的とするオリゴヌクレオチド対を使用する
単離型プラスミドに対するＰＣＲで、形質転換の成功を確認した（図８）。同様に、これ
らの形質転換からゲノムＤＮＡを抽出し、オリゴヌクレオチドｆＤ１およびｒＰ２（上述
参照）を使用して得られた１６ｓ ｒＲＮＡアンプリコンがＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇ
ｅｎｕｍの１６Ｓ ｒＲＮＡの遺伝子(Ｙ１８１７８，ＧＩ：７２７１１０９)に対して９
９．９％同一であることを確認した。
イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼの遺伝子 ｉｄｉに対するオリゴヌクレオ
チド対（ｉｄｉ−Ｆ、配列番号：７１：ＡＴＡ ＣＧＴ ＧＣＴ ＧＴＡ ＧＴＣ ＡＴ
Ｃ ＣＡＡ ＧＡＴ Ａ および ｉｄｉＲ、配列番号：７２：ＴＣＴ ＴＣＡ ＡＧＴ
ＴＣＡ ＣＡＴ ＧＴＡ ＡＡＡ ＣＣＣ Ａ）およびプラスミドｐＭＴＬ ８５１４
６−ｉｓｐＳ−ｉｄｉをもつＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍを用いた血清ビンでの
増殖実験由来の試料を使用して、上述のように、遺伝子発現が成功したことの確認を行っ
た。イソプレンシンターゼ遺伝子ｉｓｐＳに対するシグナルもまた観察された（図１４）
。
実施例３−ＤＸＳ経路の過剰発現
ＤＸＳ経路を介するフローを改善するために、経路の遺伝子を過剰発現させた。経路の
最初のステップである、ピルビン酸およびＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸（Ｇ３Ｐ
）のデオキシキシルロース５−リン酸（ＤＸＰ／ＤＸＰＳ／ＤＯＸＰ）への変換は、デオ
キシキシルロース ５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）により触媒される。
ＤＸＳ過剰発現発現プラスミドの構築：
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのｄｘｓ遺伝子を、上述の他の遺伝子に記載され
るように、オリゴヌクレオチドＤｘｓ−ＳａｌＩ−Ｆ（配列番号：２９：ＧＣＡＧＴＣＧ
ＡＣＴＴＴＡＴＴＡＡＡＧＧＧＡＴＡＧＡＴＡＡ）およびＤｘｓ−ＸｈｏＩ−Ｒ（配列番
号：３０：ＴＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＴＡＴＧＡＣＴＴＡＣＣＴＣＴＧ）を用い
てゲノムＤＮＡから増幅させた。増幅された遺伝子を次にＳａｌＩおよびＸｈｏＩでプラ
スミドｐＭＴＬ８５２４６−ｉｓｐＳ−ｉｄｉ内にクローン化し、プラスミドｐＭＴＬ８
５２４６−ｉｓｐＳ−ｉｄｉ−ｄｘｓ（配列番号：３１および図４）を産生した。表３に
開示されるオリゴヌクレオチドを使用したＤＮＡの配列決定により、ｉｓｐＳ、ｉｄｉ、
およびｄｘｓのクローニングが変異なく成功したことを確認した（図５）。ｉｓｐＳおよ
びｉｄｉ遺伝子を、それぞれ実施例１および実施例２に記載する。
Figure 0006636550
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍでの形質転換および発現
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍｎでの形質転換および発現を、プラスミドｐＭＴ
Ｌ ８５１４６−ｉｓｐＳに記載されるように実行した。形質転換の成功後に、増殖実験
を、５０ｍｌの血清用のビンおよび単一のエネルギーおよび炭素の供給源として３０ｐｓ
ｉ製鋼排ガス（ニュージーランドＧｌｅｎｂｒｏｏｋのＮｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｓｔｅｅ
ｌで収集、組成：４４％ ＣＯ、３２％ Ｎ２、２２％ ＣＯ２、２％ Ｈ２）を用いＰ
ＥＴＣ培地（表１）中で実行した。遺伝子発現の確認を、ＯＤ６００ｎｍ＝０．７５で収
集した試料から上述したように実行した。オリゴヌクレオチド対 ｄｘｓ−Ｆ（配列番号
：７３：ＡＣＡＡＡＧＴＡＴＣＴＡＡＧＡＣＡＧＧＡＧＧＴＣＡ）およびｄｘｓ−Ｒ（配
列番号：７４：ＧＡＴＧＴＣＣＣＡＣＡＴＣＣＣＡＴＡＴＡＡＧＴＴＴ）を使用して、野
生型株およびプラスミドｐＭＴＬ ８５１４６−ｉｓｐＳ−ｉｄｉ−ｄｘｓをもつ株にお
ける遺伝子ｄｘｓの発現を測定した。プラスミドをもつ株でのｍＲＮＡレベルが、野生型
と比較して３倍超増加していることが見出された（図１５）。バイオマスはＲＮＡ抽出前
に規準化した。
実施例４−メバロン酸経路の導入および発現
メバロン酸経路の第１のステップ（図７）は、２分子のアセチルＣｏＡをアセトアセチ
ルＣｏＡ（およびＨＳ−ＣｏＡ）に変換するチオラーゼにより触媒される。この酵素は、
同一の発明者らにより酸化炭素栄養性酢酸産生菌のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅ
ｔｈａｎｏｇｅｎｕｍおよびＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉでうまく発現されている（米国
特許公開公報第２０１１／０２３６９４１号）。メバロン酸経路の残りの遺伝子の構築物
が設計されている。
メバロン酸発現プラスミドの構築：
標準的な組み換えＤＮＡおよび分子クローニング技術を使用した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，
Ｊ．， および Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｄ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ
， ＮＹ， ２００１）。メバロン酸経路の前半部によるメバロン酸の合成に必要とされ
る３つの遺伝子、すなわちチオラーゼ（ｔｈｌＡ／ｖｒａＢ）、ＨＭＧ−ＣｏＡシンター
ゼ（ＨＭＧＳ）およびＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＲ）は、オペロン（Ｐｐｔａ
ａｃｋ−ｔｈｌＡ／ｖｒａＢ−ＨＭＧＳ−Ｐａｔｐ−ＨＭＧＲ）としてコドンを最適化さ
れた。
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのホスホトランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼオ
ペロンプロモーター（Ｐｐｔａ−ａｃｋ）（配列番号：６１）を、チオラーゼおよびＨＭ
Ｇ−ＣｏＡシンターゼの発現に使用し、一方Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのＡＴ
Ｐシンターゼのプロモーター領域（Ｐａｔｐ）をＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの発現に使
用した。チオラーゼの２つの変異体、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉ
ｃｕｍ由来のｔｈｌＡおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕ由来のｖｒａＢ
を合成し、かつ、さらなるサブクローニングのためにＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位
を側面に位置した。ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧＳ）およびＨＭＧ−ＣｏＡレダク
ターゼ（ＨＭＧＲ）の両方をＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓから合成し、
さらなるサブクローニングのためＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ および ＫｐｎＩ−ＸｂａＩ制
限部位それぞれに側面に位置した。使用したすべての最適化ＤＮＡを表４に示す。
Figure 0006636550
ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡ レダクターゼ（ＨＭＧＲ）と共にＡＴＰシンタ
ーゼプロモーター（Ｐａｔｐ）を、オリゴヌクレオチドｐＵＣ５７−Ｆ（配列番号：４６
：ＡＧＣＡＧＡＴＴＧＴＡＣＴＧＡＧＡＧＴＧＣ）およびｐＵＣ５７−Ｒ（配列番号：４
７：ＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧ）を使用し、ならびにｐＵＣ５７−Ｐ
ａｔｐ−ＨＭＧＲをテンプレートとして使用して増幅した。２０３３ｂｐの増幅したフラ
グメントを、ＳａｃＩおよびＸｂａＩで消化して、Ｅ．ｃｏｌｉ−Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕ
ｍシャトルベクターｐＭＴＬ ８２１５１に連結し（ＦＪ７９７６； Ｎｉｇｅｌ Ｍｉ
ｎｔｏｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ， ＵＫ； Ｈｅａｐ
ｅｔ ａｌ．， ２００９， Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ７８：
７９−８５）、プラスミドｐＭＴＬ ８２１５１−Ｐａｔｐ−ＨＭＧＲ（配列番号：７６
）を得た。
３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ シンターゼ（ＨＭＧＳ）を、オリゴ
ヌクレオチドＥｃｏＲＩ−ＨＭＧＳ＿Ｆ（配列番号：７７：ＡＧＣＣＧＴＧＡＡＴＴＣＧ
ＡＧＧＣＴＴＴＴＡＣＴＡＡＡＡＡＣＡ）およびＥｃｏＲＩ−ＨＭＧＳ＿Ｒ（配列番号：
７８：ＡＧＧＣＧＴＣＴＡＧＡＴＧＴＴＣＧＴＣＴＣＴＡＣＡＡＡＴＡＡＴＴ）を使用し
て、コドンを合成したプラスミドｐＧＨ−ｓｅｑ３．２から増幅した。１３９１ｂｐの増
幅したフラグメントを、ＳａｃＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、以前に作成したプラスミド
ｐＭＴＬ ８２１５１−Ｐａｔｐ−ＨＭＧＲに連結して、ｐＭＴＬ ８２１５１−ＨＭＧ
Ｓ−Ｐａｔｐ−ＨＭＧＲ（配列番号：７９）を得た。作成したプラスミドｐＭＴＬ ８２
１５１−ＨＭＧＳ−Ｐａｔｐ−ＨＭＧＲ（配列番号：７９）および１７６８ ｂｐのコド
ンを最適化したオペロンＰｐｔａａｃｋ−ｔｈｌＡ／ｖｒａＢは、両方ともＮｏｔＩおよ
びＥｃｏＲＩで切断した。連結反応を実施し、その後Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ
ＭＲＦ’ Ｋａｎに形質転換して、プラスミドｐＭＴＬ８２１５−Ｐｐｔａａｃｋ−ｔｈ
ｌＡ／ｖｒａＢ−ＨＭＧＳ−Ｐａｔｐ−ＨＭＧＲ（配列番号：５０）を得た。
メバロン酸経路の後半部を介したメバロン酸からのテルペノイドの重要な中間体の合成
のために必要である５つの遺伝子、すなわち、メバロン酸キナーゼ（ＭＫ）、ホスホメバ
ロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭＤ）、イソペ
ンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ（ｉｄｉ）およびイソプレンシンターゼ（ｉｓｐＳ
）を、ＡＴＧ：Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｓ ＧｍｂＨ（Ｍｅｒｚｈａｕｓｅｎ、ドイツ
）によりコドンを最適化した。メバロン酸キナーゼ（ＭＫ）、ホスホメバロン酸キナーゼ
（ＰＭＫ）およびジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭＤ）を、Ｓｔａｐｈｙｌ
ｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓから取得した。
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのＲＮＦ複合体のプロモーター領域（Ｐｒｎｆ）
（配列番号：６２）を、メバロン酸キナーゼ（ＭＫ）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭ
Ｋ）およびジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭＤ）の発現に使用し、一方Ｃ．
ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼの
プロモーター領域（Ｐｆｏｒ）（配列番号：２２）を、イソペンテニル−二リン酸Δ−イ
ソメラーゼ（ｉｄｉ）およびイソプレンシンターゼ（ｉｓｐＳ）の発現に使用した。使用
されたすべてのＤＮＡ配列を表５に示す。コドンが最適化されたＰｒｎｆ−ＭＫを、オリ
ゴヌクレオチド ＮｏｔＩ−ＸｂａＩ−Ｐｒｎｆ−ＭＫ＿Ｆ（配列番号：８０：ＡＴＧＣ
ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＧＧＴＣＴＡＧＡＡＴＡＴＣＧＡＴＡＣＡＧＡＴＡＡＡＡＡＡＡＴ
ＡＴＡＴＡＡＴＡＣＡＧ）およびＳａｌＩ−Ｐｒｎｆ−ＭＫ＿Ｒ（配列番号：８１：ＴＧ
ＧＴＴＣＴＧＴＡＡＣＡＧＣＧＴＡＴＴＣＡＣＣＴＧＣ）で合成プラスミドｐＧＨ− Ｐ
ｒｎｆ−ＭＫ−ＰＭＫ−ＰＭＤから増幅した。その後、増幅した遺伝子をＮｏｔＩおよび
ＳａｌＩでプラスミドｐＭＴＬ８３１４５（配列番号：４９）にクローニングして、プラ
スミドｐＭＴＬ８３１４−Ｐｒｎｆ−ＭＫ（配列番号：８２）を産生した。この結果とし
て得られるプラスミドおよびコドンを最適化した２１６５ｂｐのフラグメントＰＭＫ−Ｐ
ＭＤを、ＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。連結反応を実施してプラスミドｐＭ
ＴＬ ８３１４−Ｐｒｎｆ−ＭＫ−ＰＭＫ−ＰＭＤ（配列番号：８３）を得た。
メバロン酸経路をもたないイソプレン発現プラスミドを、制限部位AgelおよびＮｈｅｌ
の側面に位置するイソプレンシンターゼ（ｉｓｐＳ）を以前に作成したファルネセンプラ
スミドｐＭＴＬ ８３１４−Ｐｒｎｆ−ＭＫ−ＰＭＫ−ＰＭＤ−Ｐｆｏｒ−ｉｄｉ−ｉｓ
ｐＡ−ＦＳ（配列番号：９１）に連結することにより作成し、プラスミドｐＭＴＬ８３１
４−Ｐｒｎｆ−ＭＫ−ＰＭＫ−ＰＭＤ−Ｐｆｏｒ−ｉｄｉ−ｉｓｐＳ（配列番号：８４）
を得た。最終的なイソプレン発現プラスミドｐＭＴＬ ８３１４−Ｐｐｔａａｃｋ−ｔｈ
ｌＡ−ＨＭＧＳ−Ｐａｔｐ−ＨＭＧＲ−Ｐｒｎｆ−ＭＫ−ＰＭＫ−ＰＭＤ−Ｐｆｏｒ−ｉ
ｄｉ−ｉｓｐＳ（配列番号：５８、図１０）を、ＮｏｔＩおよびＸｂａＩを使用してｐＭ
ＴＬ８２１５−Ｐｐｔａａｃｋ−ｔｈｌＡ−ＨＭＧＳ−Ｐａｔｐ−ＨＭＧＲ（配列番号：
５０）由来のＰｐｔａａｃｋ−ｔｈｌＡ−ＨＭＧＳ−Ｐａｔｐ−ＨＭＧＲの４３６０ｂｐ
のフラグメントとｐＭＴＬ ８３１４−Ｐｒｎｆ−ＭＫ−ＰＭＫ−ＰＭＤ−Ｐｆｏｒ−ｉ
ｄｉ−ｉｓｐＳ（配列番号：８４）を連結することにより作成した。
Figure 0006636550
実施例５‐メバロン酸経路を介したＣＯからのファルネセンの産生のためのＣ．ａｕｔ
ｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍへのファルネセンシンターゼの導入
テルペノイドの重要な中間体ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰから直接イソプレンを産生してよ
り長鎖のテルペンを合成する代わりに、ゲラニルトランストランスフェラーゼを介して、
直接Ｃ１０モノテルペノイド類またはＣ１５セスキテルペノイド類などの長鎖テルペン類
を合成することも可能である（表６参照）。Ｃ１５セスキテルペノイド構築ブロックファ
ルネシルＰＰから、ファルネセンを産生することが可能であり、これはエタノールと同じ
く、輸送燃料に使用できる。
ファルネセン発現プラスミドの構築
メバロン酸経路を介したＩＰＰおよびＤＭＡＰＰからのファルネセン合成に必要とされ
る２つの遺伝子、すなわち、ゲラニルトランストランスフェラーゼ（ｉｓｐＡ）およびα
ファルネセンシンターゼ（ＦＳ）を、コドンを最適化した。ゲラニルトランストランスフ
ェラーゼ（ｉｓｐＡ）はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｒ． Ｋ−１２ ｓｕ
ｂｓｔｒから取得しＭＧ１６５５アルファダルファルネセンシンターゼ（ＦＳ）はＭａｌ
ｕｓ ｘ ｄｏｍｅｓｔｉｃａから取得した。使用されたすべてのＤＮＡ配列を表６に記
載する。コドンを最適化したｉｄｉは、メバロン酸経路ｉｄｉ＿Ｆ（配列番号：８６：Ａ
ＧＧＣＡＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＣＡＧＡＧＴＡＴＡＴＡＡＴＡＧＣＡＧＴＡＧ）およびｉ
ｄｉ＿Ｒ２（配列番号：８７： ＡＧＧＣＧＣＡＡＧＣＴＴＧＧＣＧＣＡＣＣＧＧＴＴＴ
ＡＴＴＴＡＡＡＴＡＴＣＴＴＡＴＴＴＴＣＡＧＣ）で合成プラスミドｐＭＴＬ８３２４５
−Ｐｆｏｒ−ＦＳ−ｉｄｉ（配列番号：８５）から増幅した。その後、増幅した遺伝子を
、ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでプラスミドｐＭＴＬ８３２４５−Ｐｆｏｒにクローン
化し、プラスミドｐＭＴＬ８３２４５−Ｐｆｏｒ−ｉｄｉ（配列番号：８８）を産生した
。この結果として得られたプラスミドおよびファルネセンシンターゼの１７５４ｂｐのコ
ドン最適化フラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｈｅＩで消化した。連結反応を実施
して、プラスミドｐＭＴＬ８３２４５−Ｐｆｏｒ−ｉｄｉ−ＦＳ（配列番号：８９）を得
た。ｉｓｐＡの９４６ｂｐフラグメントおよびｐＭＴＬ８３２４５−Ｐｆｏｒ−ｉｄｉ−
ＦＳを、ＡｇｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、結合させ、結果としてプラスミドｐＭ
ＴＬ８３２４５−Ｐｆｏｒ−ｉｄｉ−ｉｓｐＡ−ＦＳ（配列番号：９０）を作成した。上
流のメバロン酸経路をもたないファルネセン発現プラスミドは、ｐＭＴＬ８３２４５−Ｐ
ｆｏｒ−ｉｄｉ−ｉｓｐＡ−ＦＳからのＰｆｏｒ−ｉｄｉ−ｉｓｐＡ−ＦＳの２５１６ｂ
ｐのフラグメントをｐＭＴＬ ８３１４−Ｐｒｎｆ−ＭＫ−ＰＭＫ−ＰＭＤに連結するこ
とにより作成して、プラスミドｐＭＴＬ ８３１４−Ｐｒｎｆ−ＭＫ−ＰＭＫ−ＰＭＤ−
Ｐｆｏｒ−ｉｄｉ−ｉｓｐＡ−ＦＳ（配列番号：９１）を得た。最終的なファルネセン発
現プラスミドＭＴＬ８３１４５−ｔｈｌＡ−ＨＭＧＳ−Ｐａｔｐ−ＨＭＧＲ−Ｐｒｎｆ−
ＭＫ−ＰＭＫ−ＰＭＤ−Ｐｆｏｒ−ｉｄｉ−ｉｓｐＡ−ＦＳ（配列番号：５９および図１
８）は、制限部位ＮｏｔＩおよびＸｂａＩを使用してｐＭＴＬ８２１５−Ｐｐｔａａｃｋ
−ｔｈｌＡ−ＨＭＧＳ−Ｐａｔｐ−ＨＭＧＲ （配列番号：５０）由来のＰｐｔａａｃｋ
−ｔｈｌＡ−ＨＭＧＳ−Ｐａｔｐ−ＨＭＧＲの４６３０ｂｐフラグメントをｐＭＴＬ ８
３１４−Ｐｒｎｆ−ＭＫ−ＰＭＫ−ＰＭＤ−Ｐｆｏｒ−ｉｄｉ−ｉｓｐＡ−ＦＳ（配列番
号：９１）と連結することにより作成される。
Figure 0006636550
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍへの形質転換
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍでの形質転換および発現を、実施例１に記載する
ように実行した。
成功した形質転換の確認
ＭＴＬ８３１４−Ｐｒｎｆ−ＭＫ−ＰＭＫ−ＰＭＤ−Ｐｆｏｒ−ｉｄｉ−ｉｓｐＡ−Ｆ
Ｓ（配列番号：５９）の存在を、ｇａｒｍ＋ve ｐｅｒｐｌｉｃｏｎの一部およびｐＭＴ
Ｌ８３１ｘｘｘの一連のプラスミド上のｃａｔ遺伝子の大部分を選択的に増幅するオリゴ
ヌクレオチドｒｅｐＨＦ（配列番号：９２：ＡＡＧＡＡＧＧＧＣＧＴＡＴＡＴＧＡＡＡＡ
ＣＴＴＧＴ）およびｃａｔＲ（配列番号：９３：ＴＴＣＧＴＴＴＡＣＡＡＡＡＣＧＧＣＡ
ＡＡＴＧＴＧＡ）を使用して、コロニーＰＣＲにより確認した。１８５４ｂｐのバンドを
得た（図１６）。
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍでの下流メバロン酸経路の発現
下流のメバロン酸経路遺伝子であるメバロン酸キナーゼ（ＭＫ 配列番号：５１）、ホ
スホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ 配列番号：５２）、ジホスホメバロン酸デカルボキシ
ラーゼ（ＰＭＤ 配列番号：５３）、イソペンチル−二リン酸Δ−イソメラーゼ（ｉｄｉ
；配列番号：５４）、ゲラニルトランストランスフェラーゼ（ｉｓｐＡ；配列番号：５６
）およびファルネセンシンターゼ（ＦＳ配列番号５７）の発現の確認を、実施例１に上述
するように行った。使用したオリゴヌクレオチドを表７に列挙する。
Figure 0006636550
下流メバロン酸経路のすべての遺伝子の発現を確認するＲｔ−ＰＣＲデータを図１８に
示し、このデータはまた表８にまとめた。
Figure 0006636550
メバロン酸からのαファルネセンの産生
プラスミドｐＭＴＬ８３１４−Ｐｒｎｆ−ＭＫ−ＰＭＫ−ＰＭＤ−Ｐｆｏｒ−ｉｄｉ−
ｉｓｐＡ−ＦＳの形質転換の成功を確認した後に、唯一の炭素およびエネルギー供給源と
して３０ｐｓｉのＲｅａｌ Ｍｉｌｌ Ｇａｓ（ニュージーランドＧｌｅｎｂｒｏｏｋの
Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｓｔｅｅｌで収集、組成：４４％ ＣＯ、３２％ Ｎ２、２２％
ＣＯ２、２％ Ｈ２）を用いて、２５０ｍｌの血清ビン中の５０ｍｌＰＥＴＣ培地（表
１）で増殖実験を行った。すべての培養物を、血清ビンを保持するよう適合されオービタ
ル振盪機上で、３７℃でインキュベートした。形質転換物を、１ｍＭのメバロン酸を追加
した新鮮な培地に継代培養する前に、ＯＤ６００が、〜０．４となるまで増殖させた。メ
バロン酸のない対照を、同一の培養物から同一の時間に設定した。ＧＣ−ＭＳ（ガスクロ
マトグラフィー-質量分析）の試料を、各時点で採取した。図１７は、２つの対照培養物
および１ｍＭのメバロン酸を供給した２つの培養物の代表的な増殖曲線を示す。ファルネ
センが、実験の開始から６６時間後および９０時間後に採取した試料で検出された(図１
９〜２１)。
ガスクロマトグラフィー-質量分析によるαファルネセンの検出
αファルネセンのＧＣ−ＭＳ検出のため、５ｍｌの培養物に対し、２ｍｌのヘキサンを
添加し、激しく振って密封したガラスのバルク管（ｂａｌｃｈ ｔｕｂｅ）中で混合する
ことによりヘキサン抽出を実施した。その後、この管を、５分間超音波処置ウォーターバ
スでインキュベートして相の分離を促進した。４００μｌのヘキサン抽出物をＧＣバイア
ル（ｖａｉｌ）に移しオートローダーに装填した。試料を、０．２５μｍのフィルム厚の
ＥＣ−１０００カラム（ Ｇｒａｃｅ Ｄａｖｉｄｓｏｎ， ＯＲ， ＵＳＡ）、ＶＡＲ
ＩＡＮ ＭＳ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ （Ｖａｒｉａｎ Ｉｎｃ， ＣＡ， ＵＳＡ．
Ｎｏｗ Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＮＩＳＴ ＭＳ Ｓｅａ
ｒｃｈ ２．０ （Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）を
備えたＶＡＲＩＡＮ ＧＣ３８００ ＭＳ４０００ ｉｏｎｔｒａｐ ＧＣ／ＭＳ （Ｖ
ａｒｉａｎ Ｉｎｃ， ＣＡ， ＵＳＡ． Ｎｏｗ Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ）で分析した。注入容量は１μｌであり、ヘリウムキャリアーガスの流量は１ｍ
ｌ／分であった。
本発明は本明細書に記載されている通りであり、これは、過度の実験を行うことなく本
明細書を読むことにより本発明の実施を可能とすることを目的とする。しかしながら、本
発明の範囲を逸脱することなく、多くの成分およびパラメータを、特定の内容に変動また
は修正してもよく、知られている均等物に変えてもよいことは、当業者に明らかである。
また、このような修正および均等物は、個々に設定されるように本明細書に組み込まれて
いることは明らかである。発明の名称、表題などは、本文書の読み手の理解を高めるため
に提供されるものであり、本発明の範囲を限定するように読み取られるものではない。
もし存在する場合には、上記かつ以下に引用されるすべての特許出願、特許、および公
開公報のすべての開示は、本明細書に参照として援用される。しかしながら、いずれの特
許出願、特許、および公開公報に対する参照は、有効な先行技術を構成するまたは世界の
いずれかの国で共通な一般的知識の部分を形成すると認識されるものではなく、また示唆
されるものではない。
特段の記載がない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉ
ｓｉｎｇ）」などの用語は、排他的な意味と反対の包括的な意味として理解され、すなわ
ち「限定するものではないが、〜を含む」と理解される。

Claims (14)

  1. Clostridium属細菌又はMoorella属細菌の組換え細胞であって、
    非メバロン酸経路によるイソペンテニル二リン酸合成能を有し、
    導入された核酸として、イソプレン合成酵素をコードする第一核酸を有し、当該第一核酸が前記組換え細胞内で発現し、
    導入された核酸として、メバロン酸経路で作用する酵素群をコードする第二核酸をさらに有し、当該第二核酸が前記組換え細胞内で発現し、メバロン酸経路によるイソペンテニル二リン酸合成能をさらに有し、
    前記メバロン酸経路で作用する酵素群は、チオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ及びジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼを含み、
    一酸化炭素を含む気体基質からイソプレンを生産可能である組換え細胞。
  2. Clostridium属細菌又はMoorella属細菌の組換え細胞であって、
    一酸化炭素を含む気体基質からアセチルＣｏＡを合成する機能を有し、
    導入された核酸として、イソプレン合成酵素をコードする第一核酸を有し、当該第一核酸が前記組換え細胞内で発現し、
    導入された核酸として、メバロン酸経路で作用する酵素群をコードする第二核酸をさらに有し、当該第二核酸が前記組換え細胞内で発現し、メバロン酸経路によるイソペンテニル二リン酸合成能をさらに有し、
    前記メバロン酸経路で作用する酵素群は、チオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ及びジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼを含み、
    一酸化炭素を含む気体基質からイソプレンを生産可能である組換え細胞。
  3. 前記組換え細胞であって前記第二核酸を有さないものと比較して、２倍以上のイソプレンを生産可能である請求項１又は２に記載の組換え細胞。
  4. 前記メバロン酸経路は、酵母のメバロン酸経路である請求項１〜３のいずれかに記載の組換え細胞。
  5. 前記イソプレン合成酵素は、ポプラ（Populus tremuloides）由来のものである請求項１〜４のいずれかに記載の組換え細胞。
  6. 前記イソプレン合成酵素をコードする核酸は、下記（ａ）又は（ｂ）の核酸である請求項１〜５のいずれかに記載の組換え細胞。
    （ａ）配列番号２１の配列を有する核酸
    （ｂ）配列番号２１の核酸配列と９０％以上の核酸配列同一性を有する、配列番号２１の配列を有する核酸の機能的に等価な変異体
  7. 前記第一核酸及び／又は前記第二核酸は、コドンが最適化されたものである請求項１〜８のいずれかに記載の組換え細胞。
  8. 前記第一核酸及び／又は前記第二核酸は、組換え細胞のゲノムに組み込まれている請求項１〜７のいずれかに記載の組換え細胞。
  9. 前記第一核酸及び／又は前記第二核酸は、プラスミドに組み込まれている請求項１〜７のいずれかに記載の組換え細胞。
  10. 請求項１〜９のいずれかに記載の組換え細胞を、一酸化炭素を含む気体基質を炭素源として用いて培養し、当該組換え細胞にイソプレンを生産させるイソプレンの生産方法。
  11. 請求項１〜９のいずれかに記載の組換え細胞に、一酸化炭素を含む気体基質を接触させ、当該組換え細胞に前記気体基質からイソプレンを生産させるイソプレンの生産方法。
  12. 気体基質が、さらに水素及び／又は二酸化炭素を含む、請求項１０又は１１に記載の方法。
  13. 気体基質が、鉄金属製品製造、非鉄製品製造、石油精製、石炭ガス化、電力生産、カーボンブラック製造、アンモニア製造、メタノール製造、コークス製造およびそれらの組み合わせからなる群から選択される工業プロセス由来のものである、請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法。
  14. 気体が合成ガスである、請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法。
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