CN117980473A - 产生较少巴豆酸的生物体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种重组生物体或微生物，所述重组生物体或微生物由于以下中的至少一者而与其所来源于的生物体或微生物相比具有减少的巴豆酸库：(i)巴豆酰辅酶A至丁酰辅酶A的转化增加；和/或丁酰辅酶A至丁酸的转化增加；(ii)巴豆酰辅酶A至3‑羟基丁酰辅酶A的转化增加；和/或3‑羟基丁酰辅酶A至3‑羟基丁酸的转化增加；(iii)巴豆酸至巴豆酰辅酶A的转化增加；(iv)巴豆酰基‑[酰基载体蛋白]至丁酰基[酰基载体蛋白]的转化增加；(v)巴豆酰辅酶A至巴豆酸的转化减少；和/或(vi)巴豆酰基‑[酰基载体蛋白]至巴豆酸的转化减少。此外，本发明涉及这种重组生物体或微生物用于用阿魏酸脱羧酶生产烯烃的用途。进一步，本发明涉及一种通过在合适的条件下在合适的培养基中培养这种重组生物体或微生物来生产异丁烯或丁二烯的方法。
Description
本发明涉及一种重组生物体或微生物，所述重组生物体或微生物由于以下中的至少一者而与其所来源于的生物体或微生物相比具有减少的巴豆酸库：(i)巴豆酰辅酶A至丁酰辅酶A的转化增加；和/或丁酰辅酶A至丁酸的转化增加；(ii)巴豆酰辅酶A至3-羟基丁酰辅酶A的转化增加；和/或3-羟基丁酰辅酶A至3-羟基丁酸的转化增加；(iii)巴豆酸至巴豆酰辅酶A的转化增加；(iv)巴豆酰基-[酰基载体蛋白]至丁酰基[酰基载体蛋白]的转化增加；(v)巴豆酰基-[酰基载体蛋白]至巴豆酸的转化减少；和/或巴豆酰辅酶A至巴豆酸的转化减少。此外，本发明涉及这种重组生物体或微生物用于用阿魏酸脱羧酶生产烯烃的用途。进一步，本发明涉及一种通过在合适的条件下在合适的培养基中培养这种重组生物体或微生物来生产异丁烯或丁二烯的方法。
背景技术
目前大量化合物源自石化产品。烯烃(例如乙烯、丙烯、不同的丁烯或戊烯)用于塑料工业，例如用于生产聚丙烯或聚乙烯，以及用于化学工业的其他领域和燃料领域。丁烯以四种形式存在，所述四种形式中的一种形式是异丁烯(也称为2-甲基丙烯)，进入汽车燃料抗爆添加剂甲基叔丁基醚(MTBE)的组成中。异丁烯还可用于生产异辛烯，所述异辛烯继而可还原为异辛烷(2,2,4-三甲基戊烷)；异辛烷的辛烷值非常高，使其成为所谓“汽油”发动机的最佳燃料。目前，烯烃(例如异丁烯)是通过石油产品的催化裂化生产的(或者在己烯的情况下从煤或天然气通过费托工艺的衍生物生产)。因此，生产成本与石油价格密切相关。此外，催化裂化有时与相当大的技术困难相关，这增加了工艺复杂性和生产成本。
在与地球化学循环相协调的可持续工业运营背景下，需要通过生物途径生产烯烃，例如异丁烯。第一代生物燃料由乙醇的发酵生产组成，因为食品加工业中已经存在发酵和蒸馏过程。第二代生物燃料的生产正处于探索阶段，特别涵盖长链醇(丁醇和戊醇)、萜烯、直链烷烃和脂肪酸的生产。最近的两篇评论提供了对这个领域中的研究的总体概述：Ladygina等人(Process Biochemistry 41(2006)、1001)和Wackett(Current Opinions inChemical Biology 21(2008)、187)。
已经描述了通过酵母小红酵母(Rhodotorula minuta)将异戊酸盐转化为异丁烯(Fujii等人(Appl.Environ.Microbiol.54(1988),583))，但这种反应的效率远未达到允许工业应用的水平。反应机理由Fukuda等人(BBRC 201(1994),516)阐明并且涉及细胞色素P450酶，所述细胞色素P450酶通过还原氧代铁基基团FeV＝O来使异戊酸盐脱羧基。通过这种途径进行的异丁烯的大规模生物合成似乎非常不利，因为它需要合成和降解一分子亮氨酸以形成一分子异丁烯。此外，催化反应的酶使用血红素作为辅因子，不太适合细菌中的重组表达和酶参数的改进。由于所有这些原因，这种途径似乎不太可能作为工业开发的基础。其他微生物已被描述为略微能够从异戊酸盐自然产生异丁烯；所获得的产率甚至低于使用小红酵母获得的产率(Fukuda等人，(Agric.Biol.Chem.48(1984),1679))。
Gogerty等人(Appl.Environm.Microbiol.76(2010),8004-8010)和van Leeuwen等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.93(2012),1377-1387)描述了通过酶促转化从乙酰乙酰辅酶A生产异丁烯，其中所提出途径的最后一个步骤是通过使用甲羟戊酸二磷酸脱羧酶来转化3-羟基-3-甲基丁酸(也称为3-羟基异戊酸盐(HIV))。
这种用于从3-羟基-3-甲基丁酸生产异丁烯的反应也描述于WO2010/001078中，所述专利一般而言描述了用于通过生物过程产生烯烃的方法，特别是用于从3-羟基链烷酸酯类型的分子生产末端烯烃(特别是丙烯、乙烯、1-丁烯、异丁烯或异戊烯)的方法。
WO2012/052427还描述了一种用于通过生物过程产生烯烃的方法，与此同时特别描述了一种用于从3-羟基链烷酸酯类型的分子产生烯烃(例如丙烯、乙烯、1-丁烯、异丁烯或异戊烯)的方法。在这种上下文中，用于从3-羟基-3-甲基丁酸生产异丁烯的反应也描述于WO2012/052427中。
WO 2016/042012描述了用于生产所述3-羟基-3-甲基丁酸的方法。具体地，WO2016/042012描述了用于生产3-羟基-3-甲基丁酸的方法，所述方法包括将3-甲基巴豆酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酸的步骤和将由此产生的3-甲基巴豆酸进一步酶促转化成3-羟基-3-甲基丁酸的步骤。
在Gogerty等人(出处同上)中和在van Leeuwen等人(出处同上)中，建议通过3-甲基巴豆酰辅酶A经由3-羟基-3-甲基丁酰辅酶A的转化来实现3-羟基-3-甲基丁酸的生产。为了进一步提高用于从可再生资源生产异丁烯的方法的效率和可变性，已经开发了用于通过以下方式来提供异丁烯及其前体的替代路线：提供用于生产异丁烯的方法，所述方法包括将3-甲基巴豆酸(也称为3-甲基-2-丁烯酸、3,3-二甲基丙烯酸或千里光酸)酶促转化成异丁烯。
具体地，在WO 2017/085167中，已经描述了用于生产异丁烯的方法，所述方法包括将3-甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯，其中3-甲基巴豆酸至异丁烯的酶促转化是通过利用与FMN异戊二烯基转移酶相关联的异戊二烯化的FMN依赖性脱羧酶来实现的，其中所述FMN异戊二烯基转移酶催化利用磷酸二甲基烯丙酯(DMAP)将黄素辅因子(FMN或FAD)异戊烯化成黄素衍生的辅因子，而这些酶已经以最终导致异丁烯的生产的途径人工实现。此外，在WO2017/085167中，已经描述了方法，其中此类方法进一步包括(a)通过将3-甲基巴豆酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酸来提供3-甲基巴豆酸，或(b)通过将3-羟基异戊酸盐(HIV)酶促转化成3-甲基巴豆酸来提供3-甲基巴豆酸。
WO 2017/085167还描述了这种已被开发用于经由3-甲基巴豆酸从3-甲基巴豆酰辅酶A或经由3-甲基巴豆酸从3-羟基异戊酸盐(HIV)生产异丁烯的方法可以嵌入到用于从乙酰辅酶A开始生产异丁烯的途径中，所述乙酰辅酶A是在许多生化反应中使用的代谢中的中心成分和重要关键分子。对应的反应示意性地示出在图1中。
在WO 2018/206262中，其描述了当使用焦磷酸二甲基烯丙酯(DMAPP)代替DMAP时，通过利用与FMN异戊二烯基转移酶相关联的异戊二烯化FMN依赖性脱羧酶，将3-甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯。此外，WO 2018/206262描述了通过利用与FMN异戊二烯基转移酶相关联的异戊二烯化FMN依赖性脱羧酶将3-甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯，其中所述FMN异戊二烯基转移酶催化利用磷酸二甲基烯丙酯(DMAP)和/或焦磷酸二甲基烯丙酯(DMAPP)将黄素辅因子(FMN或FAD)异戊烯化成黄素衍生的辅因子，所述黄素衍生的辅因子是上述从乙酰辅酶A到异丁烯的总体代谢途径的关键步骤。已经发现，在这个关键步骤中，磷酸二甲基烯丙酯(DMAP)和/或焦磷酸二甲基烯丙酯(DMAPP)的可用性以及黄素辅因子FMN的可用性是限制因素，而在WO 2018/206262中描述了通过增加磷酸二甲基烯丙酯(DMAP)和/或焦磷酸二甲基烯丙酯(DMAPP)的库/量以确保异戊二烯化黄素辅因子(FMN或FAD)的有效生物合成的改进方法。
WO 2020/188033描述了一种用于从乙酰辅酶A生产异丁烯的改进方法，其中通过增加泛酸盐的摄取和/或增加泛酸盐至辅酶A的转化来增加生产菌株中可用的乙酰辅酶A的库。
尽管如上所述，现有技术中已经描述了各种用于通过生物系统中的酶促转化来生产异丁烯，从而允许使用可再生资源作为原材料的方法，但是仍然需要提高此类方法的效率和有效性，以便提高产率并使所述方法具有商业吸引力。
发明内容
本发明通过提供一种重组生物体或微生物满足了这个要求，所述重组生物体或微生物由于以下中的至少一者而与其所来源于的生物体或微生物相比具有减少的巴豆酸库：
(i)巴豆酰辅酶A至丁酰辅酶A的转化增加；和/或丁酰辅酶A至丁酸的转化增加；
(ii)巴豆酰辅酶A至3-羟基丁酰辅酶A的转化增加；和/或3-羟基丁酰辅酶A至3-羟基丁酸的转化增加；
(iii)巴豆酸至巴豆酰辅酶A的转化增加；
(iv)巴豆酰基-[酰基载体蛋白]至丁酰基[酰基载体蛋白]的转化增加；
(v)巴豆酰基-[酰基载体蛋白]至巴豆酸的转化减少；和/或
(vi)巴豆酰辅酶A至巴豆酸的转化减少。
本发明人已经惊奇地发现巴豆酸、2-戊烯酸和2-己烯酸是阿魏酸脱羧酶(FDC，参见图2)的不可逆抑制剂，其优选地在工业过程中用于将3-甲基巴豆酸转化成异丁烯。在重组生物体或微生物中，FDC的底物3-甲基巴豆酸可以通过多步酶促过程从乙酰辅酶A产生。3-甲基巴豆酸至异丁烯的最终转化可以在已用于生产3-甲基巴豆酸的同一重组生物体或微生物中进行。在此类一步法中，需要重组生物体或微生物编码FDC酶。或者，异丁烯可以以两步法从3-甲基巴豆酸生产。为此，可使包含所产生的3-甲基巴豆酸的重组生物体或微生物发酵培养基在体内或体外生物转化反应中与编码FDC酶的重组生物体或微生物接触。在替代的两步法中，第一重组生物体或微生物可用于将乙酰辅酶A转化成3-羟基异戊酸，然后所产生的3-羟基异戊酸可通过第二重组生物体或微生物(经由3-甲基巴豆酸和FDC)转化成异丁烯。
当在重组生物体或微生物中产生3-甲基巴豆酸和/或异丁烯时，巴豆酸、2-戊烯酸和/或2-己烯酸可能是副产物，并且由于它们对FDC的抑制效应，所以即使是痕量的，也会降低整个过程的生产率。因此，降低和/或耗竭用于生产3-甲基巴豆酸和/或异丁烯的重组生物体或微生物中的巴豆酸、2-戊烯酸和/或2-己烯酸的细胞内和细胞外水平可导致显著改善的产物形成。本发明人已经成功地证明，减少重组微生物中的巴豆酸库导致异丁烯的形成增加(参见实施例2和实施例3)。
在本文中，本发明人已经确定了各种用于减少重组生物体或微生物中的巴豆酸库的策略。具体地，本发明人已经确定了用于通过以下方式减少重组生物体或微生物中的巴豆酸库的策略：(a)引导代谢通量远离巴豆酸和/或(b)直接防止巴豆酸的形成。
减少的巴豆酸库
根据本发明的重组生物体或微生物的特征在于由于以下而与其来源的生物体或微生物相比具有减少的巴豆酸库：
(i)巴豆酰辅酶A至丁酰辅酶A的转化增加；和/或丁酰辅酶A至丁酸的转化增加；
(ii)巴豆酰辅酶A至3-羟基丁酰辅酶A的转化增加；和/或3-羟基丁酰辅酶A至3-羟基丁酸的转化增加；
(iii)巴豆酸至巴豆酰辅酶A的转化增加；
(iv)巴豆酰基-[酰基载体蛋白]至丁酰基[酰基载体蛋白]的转化增加；
(v)巴豆酰辅酶A至巴豆酸的转化减少；和/或
(vi)巴豆酰基-[酰基载体蛋白]至巴豆酸的转化减少。
如本发明中所用的术语“减少的巴豆酸库”一般而言意指重组(经遗传修饰的)生物体或微生物中巴豆酸的量和/或可用性低于对应的未经修饰的生物体或微生物中的巴豆酸的量和/或可用性。在优选的实施方式中，在本发明的上下文中，“减少的巴豆酸库”意指经遗传修饰的重组生物体或微生物中巴豆酸的量和/或可用性比对应的未经修饰的生物体或微生物中的巴豆酸的量和/或可用性低至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
应当理解的是，巴豆酸是可以容易地跨生物膜扩散的疏水性分子。由于其扩散行为，预计巴豆酸的细胞内浓度至少在一定程度上与培养基中的巴豆酸浓度相关。因此，“巴豆酸库”并不严格限于生物体或微生物中巴豆酸的“细胞内库”，还可以延伸至包含所述生物体或微生物的培养基。因此，如果第一生物体或微生物的培养基中的巴豆酸浓度低于第二生物体或微生物的培养基中的巴豆酸浓度，则可以确定第一生物体或微生物与第二生物体或微生物相比具有减少的巴豆酸库。当进行此类比较时，重要的是比较具有可比的细胞密度并且优选地可比的培养体积的细胞培养物中的巴豆酸浓度。
在本发明中，应当理解的是，具有“减少的巴豆酸库”的重组生物体或微生物也可以被定义为“产生较少的巴豆酸”的重组生物体或微生物。也就是说，术语“库”不应严格理解为“细胞内库”。
如本发明中所用的术语“巴豆酰辅酶A至丁酰辅酶A的转化增加”一般而言意指重组(经遗传修饰的)生物体或微生物中的下述对应酶的表达和/或活性高于对应的未经修饰的生物体或微生物中的下述对应酶的表达和/或活性。在优选的实施方式中，在本发明的上下文中，“巴豆酰辅酶A至丁酰辅酶A的转化增加”意指经遗传修饰的重组生物体或微生物中的下述对应酶表达和/或活性比对应的未经修饰的生物体或微生物中的下述对应酶表达和/或活性高至少1％、2％、5％、7％或10％，优选地至少20％，更优选地至少30％或50％，甚至更优选地至少70％或80％，特别优选地至少90％或100％。在甚至更优选的实施方式中，与对应的未经修饰的生物体或微生物相比，经遗传修饰的重组生物体或微生物中的下述酶的表达和/或活性可高至少150％、至少200％或至少500％。在特别优选的实施方式中，经遗传修饰的重组生物体或微生物中的下述酶的表达和/或活性比对应的未经修饰的生物体或微生物中的下述酶的表达和/或活性高至少2倍、5倍、7倍并且更优选地至少10倍。
如本发明中所用的术语“丁酰辅酶A至丁酸的转化增加”一般而言意指重组(经遗传修饰的)生物体或微生物中的下述对应酶的表达和/或活性高于对应的未经修饰的生物体或微生物中的下述对应酶的表达和/或活性。在优选的实施方式中，在本发明的上下文中，“丁酰辅酶A至丁酸的转化增加”意指经遗传修饰的重组生物体或微生物中的下述对应酶表达和/或活性比对应的未经修饰的生物体或微生物中的下述对应酶表达和/或活性高至少1％、2％、5％、7％或10％，优选地至少20％，更优选地至少30％或50％，甚至更优选地至少70％或80％，特别优选地至少90％或100％。在甚至更优选的实施方式中，与对应的未经修饰的生物体或微生物相比，经遗传修饰的重组生物体或微生物中的下述酶的表达和/或活性可高至少150％、至少200％或至少500％。在特别优选的实施方式中，经遗传修饰的重组生物体或微生物中的下述酶的表达和/或活性比对应的未经修饰的生物体或微生物中的下述酶的表达和/或活性高至少2倍、5倍、7倍并且更优选地至少10倍。
如本发明中所用的术语“巴豆酰辅酶A至3-羟基丁酰辅酶A的转化增加”一般而言意指重组(经遗传修饰的)生物体或微生物中的下述对应酶的表达和/或活性高于对应的未经修饰的生物体或微生物中的下述对应酶的表达和/或活性。在优选的实施方式中，在本发明的上下文中，“巴豆酰辅酶A至3-羟基丁酰辅酶A的转化增加”意指经遗传修饰的重组生物体或微生物中的下述对应酶表达和/或活性比对应的未经修饰的生物体或微生物中的下述对应酶表达和/或活性高至少1％、2％、5％、7％或10％，优选地至少20％，更优选地至少30％或50％，甚至更优选地至少70％或80％，特别优选地至少90％或100％。在甚至更优选的实施方式中，与对应的未经修饰的生物体或微生物相比，经遗传修饰的重组生物体或微生物中的下述酶的表达和/或活性可高至少150％、至少200％或至少500％。在特别优选的实施方式中，经遗传修饰的重组生物体或微生物中的下述酶的表达和/或活性比对应的未经修饰的生物体或微生物中的下述酶的表达和/或活性高至少2倍、5倍、7倍并且更优选地至少10倍。
如本发明中所用的术语“3-羟基丁酰辅酶A至3-羟基丁酸的转化增加”一般而言意指重组(经遗传修饰的)生物体或微生物中的下述对应酶的表达和/或活性高于对应的未经修饰的生物体或微生物中的下述对应酶的表达和/或活性。在优选的实施方式中，在本发明的上下文中，“3-羟基丁酰辅酶A至3-羟基丁酸的转化增加”意指经遗传修饰的重组生物体或微生物中的下述对应酶表达和/或活性比对应的未经修饰的生物体或微生物中的下述对应酶表达和/或活性高至少1％、2％、5％、7％或10％，优选地至少20％，更优选地至少30％或50％，甚至更优选地至少70％或80％，特别优选地至少90％或100％。在甚至更优选的实施方式中，与对应的未经修饰的生物体或微生物相比，经遗传修饰的重组生物体或微生物中的下述酶的表达和/或活性可高至少150％、至少200％或至少500％。在特别优选的实施方式中，经遗传修饰的重组生物体或微生物中的下述酶的表达和/或活性比对应的未经修饰的生物体或微生物中的下述酶的表达和/或活性高至少2倍、5倍、7倍并且更优选地至少10倍。
如本发明中所用的术语“巴豆酸至巴豆酰辅酶A的转化增加”一般而言意指重组(经遗传修饰的)生物体或微生物中的下述对应酶的表达和/或活性高于对应的未经修饰的生物体或微生物中的下述对应酶的表达和/或活性。在优选的实施方式中，在本发明的上下文中，“巴豆酸至巴豆酰辅酶A的转化增加”意指经遗传修饰的重组生物体或微生物中的下述对应酶表达和/或活性比对应的未经修饰的生物体或微生物中的下述对应酶表达和/或活性高至少1％、2％、5％、7％或10％，优选地至少20％，更优选地至少30％或50％，甚至更优选地至少70％或80％，特别优选地至少90％或100％。在甚至更优选的实施方式中，与对应的未经修饰的生物体或微生物相比，经遗传修饰的重组生物体或微生物中的下述酶的表达和/或活性可高至少150％、至少200％或至少500％。在特别优选的实施方式中，经遗传修饰的重组生物体或微生物中的下述酶的表达和/或活性比对应的未经修饰的生物体或微生物中的下述酶的表达和/或活性高至少2倍、5倍、7倍并且更优选地至少10倍。
如本发明中所用的术语“巴豆酰基-[酰基载体蛋白]至丁酰基[酰基载体蛋白]的转化增加”一般而言意指重组(经遗传修饰的)生物体或微生物中的下述对应酶的表达和/或活性高于对应的未经修饰的生物体或微生物中的下述对应酶的表达和/或活性。在优选的实施方式中，在本发明的上下文中，“巴豆酰基-[酰基载体蛋白]至丁酰基[酰基载体蛋白]的转化增加”意指经遗传修饰的重组生物体或微生物中的下述对应酶表达和/或活性比对应的未经修饰的生物体或微生物中的下述对应酶表达和/或活性高至少1％、2％、5％、7％或10％，优选地至少20％，更优选地至少30％或50％，甚至更优选地至少70％或80％，特别优选地至少90％或100％。在甚至更优选的实施方式中，与对应的未经修饰的生物体或微生物相比，经遗传修饰的重组生物体或微生物中的下述酶的表达和/或活性可高至少150％、至少200％或至少500％。在特别优选的实施方式中，经遗传修饰的重组生物体或微生物中的下述酶的表达和/或活性比对应的未经修饰的生物体或微生物中的下述酶的表达和/或活性高至少2倍、5倍、7倍并且更优选地至少10倍。
如本发明中所用的术语“巴豆酰基-[酰基载体蛋白]至巴豆酸的转化减少”一般而言意指重组(经遗传修饰的)生物体或微生物中的下述对应酶的表达和/或活性低于对应的未经修饰的生物体或微生物中的下述对应酶的表达和/或活性。在优选的实施方式中，在本发明的上下文中，“巴豆酰基-[酰基载体蛋白]至巴豆酸的转化减少”意指经遗传修饰的重组生物体或微生物中的下述对应酶的表达和/或活性比对应的未经修饰的生物体或微生物中的下述对应酶的表达和/或活性低至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。或者，可以改变下述对应酶的底物特异性，使得对巴豆酰基-[酰基载体蛋白]的亲和力降低至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，优选地与此同时对其他底物的亲和力保持不变。
如本发明中所用的术语“巴豆酰辅酶A至巴豆酸的转化减少”一般而言意指重组(经遗传修饰的)生物体或微生物中的下述对应酶的表达和/或活性低于对应的未经修饰的生物体或微生物中的下述对应酶的表达和/或活性。在优选的实施方式中，在本发明的上下文中，“巴豆酰辅酶A至巴豆酸的转化减少”意指经遗传修饰的重组生物体或微生物中的下述对应酶的表达和/或活性比对应的未经修饰的生物体或微生物中的下述对应酶的表达和/或活性低至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。或者，可以改变下述对应酶的底物特异性，使得对巴豆酰辅酶A的亲和力降低至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，优选地与此同时对其他底物的亲和力保持不变。
用于测量细胞中的巴豆酸库的方法和测定已在本领域中描述(Lie等人，Biosynthesis of butenoic acid through fatty acid biosynthesis pathway inEscherichia coli,Appl Microbiol Biotechnol；DOI 10.1007/s00253-014-6233-2)。简而言之，巴豆酸由于其疏水性可以被动地跨细胞膜扩散。因此，可以通过以下方式容易地测定细胞中的巴豆酸库：在液体培养基中培养所述细胞，以及通过合适的方法(例如HPLC或GC-MS)测量上清液中巴豆酸的浓度。
在某些实施方式中，生物体或微生物中的巴豆酸库可以使用HPLC来测定(Ma等人，Simultaneous determination of organic acids and saccharides in lactic acidfermentation broth from biomass using high performance liquidchromatography.Se Pu.2012年1月；30(1):62-6.doi:10.3724/sp.j.1123.2011.09033)。为此，包含根据本发明的生物体或微生物的液体细胞培养物的上清液可以通过0.22μm注射器过滤器过滤以用于HPLC分析。可以通过配备有Aminex HPX-87H 300mm×7.8mm柱(Bio-Rad)和二极管阵列检测器的HPLC(Agilent 1260系列，德国)在210nm处测量样品。可以使用流动相6mM H2SO4在55℃下以0.5mL/min的流率执行分析。巴豆酸的浓度可以使用线性回归用校准曲线来定量测定。可以采用外标法来得到回归方程。
用于测量相较于其所来源于的生物体或微生物的巴豆酰辅酶A至丁酰辅酶A的转化(增加)的方法和测定是本领域技术人员已知的，或者可以在没有过度负担和不需要发明技能的情况下开发。例如，重组(经遗传修饰的)生物体或微生物可以在与对应的未经修饰的生物体或微生物类似的条件下培养，并且全细胞裂解物可以从生物体或微生物两者制备。为了测定巴豆酰辅酶A至丁酰辅酶A的转化，可以使细胞裂解物与巴豆酰辅酶A在合适的条件下接触，并且可以用本领域已知的分析方法来测定丁酰辅酶A的形成。
用于测量相较于其所来源于的生物体或微生物的丁酰辅酶A至丁酸的转化(增加)的方法和测定是本领域技术人员已知的，或者可以在没有过度负担和不需要发明技能的情况下开发。例如，重组(经遗传修饰的)生物体或微生物可以在与对应的未经修饰的生物体或微生物类似的条件下培养，并且全细胞裂解物可以从生物体或微生物两者制备。为了测定丁酰辅酶A至丁酸的转化，可以使细胞裂解物与丁酰辅酶A在合适的条件下接触，并且可以用本领域已知的分析方法来测定丁酸的形成。
用于测量相较于其所来源于的生物体或微生物的巴豆酰辅酶A至3-羟基丁酰辅酶A的转化(增加)的方法和测定是本领域技术人员已知的，或者可以在没有过度负担和不需要发明技能的情况下开发。例如，重组(经遗传修饰的)生物体或微生物可以在与对应的未经修饰的生物体或微生物类似的条件下培养，并且全细胞裂解物可以从生物体或微生物两者制备。为了测定巴豆酰辅酶A至3-羟基丁酰辅酶A的转化，可以使细胞裂解物与巴豆酰辅酶A在合适的条件下接触，并且可以用本领域已知的分析方法来测定3-羟基丁酰辅酶A的形成。
用于测量相较于其所来源于的生物体或微生物的3-羟基丁酰辅酶A至3-羟基丁酸的转化(增加)的方法和测定是本领域技术人员已知的，或者可以在没有过度负担和不需要发明技能的情况下开发。例如，重组(经遗传修饰的)生物体或微生物可以在与对应的未经修饰的生物体或微生物类似的条件下培养，并且全细胞裂解物可以从生物体或微生物两者制备。为了测定3-羟基丁酰辅酶A至3-羟基丁酸的转化，可以使细胞裂解物与3-羟基丁酰辅酶A在合适的条件下接触，并且可以用本领域已知的分析方法来测定3-羟基丁酸的形成。
用于测量相较于其所来源于的生物体或微生物的巴豆酸至巴豆酰辅酶A的转化(增加)的方法和测定是本领域技术人员已知的，或者可以在没有过度负担和不需要发明技能的情况下开发。例如，重组(经遗传修饰的)生物体或微生物可以在与对应的未经修饰的生物体或微生物类似的条件下培养，并且全细胞裂解物可以从生物体或微生物两者制备。为了测定巴豆酸至巴豆酰辅酶A的转化，可以使细胞裂解物与巴豆酸在合适的条件下接触，并且可以用本领域已知的分析方法来测定巴豆酰辅酶A的形成。
用于测量相较于其所来源于的生物体或微生物的巴豆酰基-[酰基载体蛋白]至丁酰基[酰基载体蛋白]的转化(增加)的方法和测定是本领域技术人员已知的，或者可以在没有过度负担和不需要发明技能的情况下开发。例如，重组(经遗传修饰的)生物体或微生物可以在与对应的未经修饰的生物体或微生物类似的条件下培养，并且全细胞裂解物可以从生物体或微生物两者制备。为了测定巴豆酰基-[酰基载体蛋白]至丁酰基[酰基载体蛋白]的转化，可以使细胞裂解物与巴豆酰基-[酰基载体蛋白]在合适的条件下接触，并且可以用本领域已知的分析方法来测定丁酰基[酰基载体蛋白]的形成。
用于测量相较于其所来源于的生物体或微生物的巴豆酰基-[酰基载体蛋白]至巴豆酸的转化(减少)的方法和测定是本领域技术人员已知的，或者可以在没有过度负担和不需要发明技能的情况下开发。例如，重组(经遗传修饰的)生物体或微生物可以在与对应的未经修饰的生物体或微生物类似的条件下培养，并且全细胞裂解物可以从生物体或微生物两者制备。为了测定巴豆酰基-[酰基载体蛋白]至巴豆酸的转化，可以使细胞裂解物与巴豆酰基-[酰基载体蛋白]在合适的条件下接触，并且可以用合适分析方法来测定巴豆酸的形成。上文公开了用于检测和/或定量巴豆酸水平的合适方法。
用于测量相较于其所来源于的生物体或微生物的巴豆酰辅酶A至巴豆酸的转化(减少)的方法和测定是本领域技术人员已知的，或者可以在没有过度负担和不需要发明技能的情况下开发。例如，重组(经遗传修饰的)生物体或微生物可以在与对应的未经修饰的生物体或微生物类似的条件下培养，并且全细胞裂解物可以从生物体或微生物两者制备。为了测定巴豆酰辅酶A至巴豆酸的转化，可以使细胞裂解物与巴豆酰辅酶A在合适的条件下接触，并且可以用合适分析方法来测定巴豆酸的形成。上文公开了用于检测和/或定量巴豆酸水平的合适方法。
通常，(i)巴豆酰辅酶A至丁酰辅酶A的转化增加；和/或丁酰辅酶A至丁酸的转化增加；(ii)巴豆酰辅酶A至3-羟基丁酰辅酶A的转化增加；和/或3-羟基丁酰辅酶A至3-羟基丁酸的转化增加；(iii)巴豆酸至巴豆酰辅酶A的转化增加；和/或(iv)巴豆酰基-[酰基载体蛋白]至丁酰基[酰基载体蛋白]的转化增加可以通过某种蛋白的重组表达来实现。
类似地，巴豆酰基-[酰基载体蛋白]和/或巴豆酰辅酶A至巴豆酸的转化减少可以通过减少从巴豆酰辅酶A和/或巴豆酰基-[酰基载体蛋白]至巴豆酸的代谢通量来实现。
重组生物体或微生物相较于其所来源于的重组生物体或微生物具有减少的巴豆酸库，而这种减少的巴豆酸库是由于：(i)巴豆酰辅酶A至丁酰辅酶A的转化增加；和/或丁酰辅酶A至丁酸的转化增加；(ii)巴豆酰辅酶A至3-羟基丁酰辅酶A的转化增加；和/或3-羟基丁酰辅酶A至3-羟基丁酸的转化增加；(iii)巴豆酸至巴豆酰辅酶A的转化增加；(iv)巴豆酰基-[酰基载体蛋白]至丁酰基[酰基载体蛋白]的转化增加；和/或(v)巴豆酰基-[酰基载体蛋白]和/或巴豆酰辅酶A至巴豆酸的转化减少可以通过在下文中更详细描述的不同重组修饰来实现。
一般而言，这个上下文中的“重组”表示通过添加、去除或修饰染色体或染色体外基因或调节基序(例如启动子)，或通过生物体的融合，或通过添加任何类型的载体(例如质粒)，对生物体或微生物的人工遗传修饰。
术语“重组表达”表示涉及遗传修饰的蛋白质产生，优选地以便产生相对于其宿主而言外源或异源来源的蛋白质，即，所述蛋白质并非天然存在于生产宿主中，或以便产生经修饰或突变的内源蛋白质。
本发明的上下文中的“重组表达”优选地是“过表达”。在这种上下文中的“过表达(Overexpression/overexpressing)”表示优选地源自与表达其的生物体不同的生物体的蛋白质在宿主生物体中的重组表达与所述宿主生物体或微生物中存在的所述蛋白质的天然表达相比增加了至少10％，优选地20％、50％、100％、500％和可能更多。这种定义还涵盖不存在所述蛋白质的天然表达的情况。
因此，简而言之，根据本发明的重组表达导致减少的巴豆酸库可能是由于(1)相应内源基因的过表达，(2)相应异源基因的引入和/或(3)具有增大的活性(例如，相对于其所衍生自的相应酶增大的催化对应反应的活性，或者增大的转运蛋白活性)的突变蛋白的表达。
在某些实施方式中，本文所公开的酶中的一种或多种酶的增大水平可以通过增加编码所述酶的核酸的拷贝数来实现。在某些实施方式中，可以将相应核酸克隆到表达载体中。如本文所用的术语“表达载体”表示在合适的宿主细胞内自主繁殖(即不依赖于染色体核酸)并且其特征在于存在至少一个“表达盒”的核酸运载工具(质粒)。如本文所用，术语“表达盒”是指能够允许感兴趣的核酸序列(即“异源”核酸序列)的基因表达的遗传构建体。这需要此类表达盒包含含有与转录和/或翻译调节有关的信息的调控序列元件，并且此类调控序列“可操作地连接”至感兴趣的核酸序列。可操作的连接是其中调控序列元件和待表达的核酸序列以使得能够进行基因表达的方式连接的连接。用于将核酸分子克隆到表达载体中的方法是本领域中众所周知的。此外，技术人员知道可用于本发明的合适表达载体。
在某些实施方式中，核酸可以处于重组启动子的控制下。重组启动子可以是本领域中已知的任何合适的诱导型或组成型启动子。也就是说，技术人员知道可用于在特定生物体或微生物中表达核酸的多种启动子。此外，技术人员能够测试不同的启动子以便鉴定产生所需表达水平的启动子。
在某些实施方式中，本文所公开的酶中的两种或更多种酶可以在单个表达载体中编码。所述两种或更多种酶中的每种酶可以处于单独的启动子的控制下，或者所述两种或更多种酶可以处于相同启动子的控制下。
替代地或另外，一种或多种酶的增加水平可以通过将编码所述酶的核酸的一个或多个拷贝整合到本发明的重组生物体或微生物的基因组中来实现。所述核酸可编码内源或异源酶。也就是说，基因组整合可导致内源基因的拷贝数增加或异源核酸的引入。整合到本发明的重组生物体或微生物的基因组中的核酸可以包含其天然启动子或重组启动子，即诱导型或组成型启动子。用于将核酸分子引入基因组中的基于重组的方法是本领域中众所周知的。
在某些实施方式中，编码本文所公开的酶中的一种或多种酶的核酸可以整合到基因组中，并且此外，编码相同酶的核酸可以另外从表达载体过表达。
在本发明内，巴豆酰基-[酰基载体蛋白]和/或巴豆酰辅酶A至巴豆酸的转化减少可以通过降低下文所讨论的一种或多种酶的水平和/或活性来实现。或者，巴豆酰基-[酰基载体蛋白]和/或巴豆酰辅酶A至巴豆酸的转化减少可以通过改变下文所讨论的一种或多种酶的底物特异性来实现。
在具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的重组生物体或微生物，其中酶水平降低是由于(i)所述生物体或微生物中编码相应酶的基因的完全或部分缺失；或(ii)所述生物体或微生物中编码相应酶的基因的调控元件的修饰。
也就是说，在某些实施方式中，从巴豆酰基-[酰基载体蛋白]和/或巴豆酰辅酶A至巴豆酸的代谢通量减少可以通过将一个或多个缺失突变引入生物体或微生物的染色体中来实现。优选地，此类缺失突变导致编码参与巴豆酰基-[酰基载体蛋白]和/或巴豆酰辅酶A至巴豆酸的转化的酶的一种或多种基因的表达减少。
在某些实施方式中，缺失是编码参与巴豆酰基-[酰基载体蛋白]和/或巴豆酰辅酶A至巴豆酸的转化的酶的基因的完全缺失。完全缺失是这样的缺失，其中基因的所有密码子被从生物体或微生物的染色体去除。基因的完全缺失还可以包括基因调控元件(例如启动子)，或甚至邻近基因的附加缺失。
在某些实施方式中，缺失可以是编码参与巴豆酰基-[酰基载体蛋白]和/或巴豆酰辅酶A至巴豆酸的转化的酶的基因的部分缺失。在部分缺失突变体中，从生物体或微生物的染色体中仅去除基因的片段。优选地，部分缺失产生非功能性酶。非功能性酶可以通过使编码酶的必需结构域(例如包含活性位点的结构域)的基因的部分缺失，或通过向所述基因中引入移码来获得。
除了修饰编码参与巴豆酰基-[酰基载体蛋白]和/或巴豆酰辅酶A至巴豆酸的转化的酶的基因的编码序列外，还可以通过修饰所述基因的调控元件来降低此类基因的表达水平。如本文所用，术语“调控元件”是指控制核酸序列的表达的一些方面的遗传元件。例如，启动子是促进可操作连接的编码区的转录起始的调控元件。其他调控元件是核糖体结合位点、剪接信号、多腺苷酸化信号、终止信号等。
降低生物体或微生物中参与巴豆酰基-[酰基载体蛋白]和/或巴豆酰辅酶A至巴豆酸的转化的酶的水平可以通过使编码所述酶的基因的启动子和/或另外的调控元件完全或部分地缺失来实现。替代地或另外，可通过引入点突变和/或将核酸分子插入编码参与巴豆酰基-[酰基载体蛋白]和/或巴豆酰辅酶A至巴豆酸的转化的酶的基因的调控元件中，来降低生物体或微生物中参与巴豆酰基-[酰基载体蛋白]和/或巴豆酰辅酶A至巴豆酸的转化的酶的表达水平。例如，在细菌中，将点突变引入核糖体结合位点可以大大减少下游核酸的表达。
技术人员熟知允许使染色体DNA缺失和/或将外源DNA插入生物体或微生物的染色体中的分子工程化方法。
为了减少从巴豆酰基-[酰基载体蛋白]和/或巴豆酰辅酶A至巴豆酸的代谢通量，可降低至少一种参与巴豆酰基-[酰基载体蛋白]和/或巴豆酰辅酶A至巴豆酸的转化的酶的水平。具体地，参与巴豆酰基-[酰基载体蛋白]和/或巴豆酰辅酶A至巴豆酸的转化的酶的表达水平可降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。技术人员知道酶的水平可以降低100％，例如通过使编码所述酶的整个基因缺失。然而，在某些实施方式中，可能需要仅部分地降低酶水平，例如如果完全去除酶将导致活力降低的话。在此类实施方式中，将优选的是通过修饰编码所述酶的基因的调控元件来降低酶水平。
不受理论的束缚，用于测量蛋白质的表达(水平)的方法和测定包括蛋白质印迹、ELISA等。在另一实施方式中，表达(水平)的测量是通过测量对应RNA的量完成的。对应方法是本领域技术人员众所周知的并且包括例如Northern印迹或逆转录定量PCR(RT-qPCR)。
在具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的重组生物体或微生物，其中酶活性降低是由于(i)编码所述生物体或微生物中的相应酶的基因的失活突变；和/或(ii)添加相应酶的抑制剂。
代替降低至少一种参与巴豆酰基-[酰基载体蛋白]和/或巴豆酰辅酶A至巴豆酸的转化的酶的表达水平，还可以修饰一种或多种酶的活性。
也就是说，还可以通过将突变引入编码参与巴豆酰基-[酰基载体蛋白]和/或巴豆酰辅酶A至巴豆酸的转化的酶的基因中，来减少从巴豆酰基-[酰基载体蛋白]和/或巴豆酰辅酶A至巴豆酸的代谢通量。例如，将点突变或外源核酸引入编码参与巴豆酰基-[酰基载体蛋白]和/或巴豆酰辅酶A至巴豆酸的转化的酶的基因中可导致无活性的基因产物或具有降低的活性的基因产物。特别地，酶的活性位点的突变可导致具有降低的或消失的活性的酶变体。
或者，可以通过添加合适的抑制剂来降低生物体或微生物中酶的活性。抑制剂可以是生物体或微生物本身所产生的内源性抑制剂，或者添加到生物体或微生物中的外源性抑制剂。在某些实施方式中，可以将抑制剂的前体分子添加到生物体或微生物中，然后通过生物体或微生物本身将所述前体分子转化为抑制剂。如果生物体或微生物包含导致内源性抑制剂产量增加的遗传修饰，则称所述抑制剂被“添加”到所述生物体或微生物中。相比之下，向生物体或微生物中添加外源性抑制剂可以通过向培养基中添加抑制剂或其前体来实现。
为了减少从巴豆酰基-[酰基载体蛋白]和/或巴豆酰辅酶A至巴豆酸的代谢通量，可降低至少一种参与巴豆酰基-[酰基载体蛋白]和/或巴豆酰辅酶A至巴豆酸的转化的酶的活性。具体地，参与巴豆酰基-[酰基载体蛋白]和/或巴豆酰辅酶A至巴豆酸的转化的酶的活性可降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。技术人员知道，酶的活性可以降低100％，例如通过替换酶的活性位点中的一个或多个必需氨基酸。然而，在某些实施方式中，可能需要酶活性的仅部分降低，例如如果酶活性完全降低将导致活力降低。
必须指出的是，从巴豆酰基-[酰基载体蛋白]和/或巴豆酰辅酶A至巴豆酸的代谢通量减少也可以通过改变酶的底物特异性来实现。也就是说，酶可以经工程化，使得其对巴豆酰基-[酰基载体蛋白]和/或巴豆酰辅酶A仅具有最小的亲和力，但仍然可以催化其他底物的水解。
用于测量酶的活性的方法和测定是本领域技术人员众所周知的。优选地，术语活性涉及酶的比活性。如本文所用，术语“比活性”定义为给定量的蛋白质中的活性单位。因此，比活性不是直接测量的，而是通过将(1)酶样品的以单位/ml计的活性除以(2)该样品中的蛋白质浓度来计算，因此比活性以单位/mg计表示。
为了测定酶或其突变变体的比活性，可以通过本领域已知的方法重组表达和纯化酶。然后可以用合适的底物测定所述酶或酶变体的比活性。此外，可以用纯化的酶测定抑制剂对比活性的影响。
减少从巴豆酰辅酶A至巴豆酸的代谢通量
在本发明中，减少的巴豆酸库可以通过减少巴豆酰辅酶A至巴豆酸的转化来实现。本领域中已知的是巴豆酰辅酶A由硫酯水解酶转化成巴豆酸。例如，在大肠杆菌(E.coli)中，巴豆酰辅酶A可以由硫酯水解酶YdiI(MenI)水解成巴豆酸。为了防止从巴豆酰辅酶A形成巴豆酸，本发明人已经开发了多种策略来减少从巴豆酰辅酶A至巴豆酸的代谢通量。
这些策略涉及：
(i)增加巴豆酰辅酶A至丁酰辅酶A的转化；和/或
(ii)增加丁酰辅酶A至丁酸的转化；和/或
(iii)增加巴豆酰辅酶A至3-羟基丁酰辅酶A的转化；和/或
(iv)增加3-羟基丁酰辅酶A至3-羟基丁酸的转化。
增加巴豆酰辅酶A至丁酰辅酶A的转化
在某些实施方式中，从巴豆酰辅酶A至巴豆酸的代谢通量可以通过增加从巴豆酰辅酶A至丁酰辅酶A的代谢通量来减少。也就是说，通过增加巴豆酰辅酶A至丁酰辅酶A的转化，更少量的巴豆酰辅酶A将可用于水解成巴豆酸。
为了增加巴豆酰辅酶A至丁酰辅酶A的转化，编码可以催化巴豆酰辅酶A至丁酰辅酶A的转化的酶的基因可以在根据本发明的重组生物体或微生物中过表达。所述酶可以是外源酶，所述外源酶已被证明有效催化巴豆酰辅酶A至丁酰辅酶A的转化。或者，酶可以是内源酶，所述内源酶由于重组表达而可以以更高的浓度获得。此外，酶可以是已经工程化以更有效地将巴豆酰辅酶A转化成丁酰辅酶A的外源酶或内源酶。
因此，在具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的重组生物体或微生物，其中巴豆酰辅酶A至丁酰辅酶A的转化增加是由于所述生物体或微生物中能够减少碳-碳双键的酶(EC 1.3)的水平和/或活性增加。
也就是说，重组生物体或微生物可以过表达任何能够将巴豆酰辅酶A转化成丁酰辅酶A的EC 1.3类的酶。
在具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的重组生物体或微生物，其中能够还原碳-碳双键的酶(EC 1.3)是NADH或NADPH依赖性的(EC 1.3.1)或黄素依赖性的(EC1.3.8)。
催化将巴豆酰辅酶A转化成丁酰辅酶A的酶可以依赖于任何辅因子，或甚至非辅因子依赖性的，只要它可催化将巴豆酰辅酶A转化成丁酰辅酶A即可。然而，在优选实施方式中，能够还原碳-碳双键并且具体地将巴豆酰辅酶A还原成丁酰辅酶A的酶是NADH或NADPH依赖性的(EC 1.3.1)或黄素依赖性的(EC 1.3.8)。
在某些实施方式中，催化将巴豆酰辅酶A转化成丁酰辅酶A的酶可以是巴豆酰辅酶A还原酶(EC 1.3.1.86)。巴豆酰辅酶A还原酶的非限制性示例是来自山丘链霉菌(Streptomyces collinus)的Ccr。然而，巴豆酰辅酶A还原酶已在其他生物体中描述。来自山丘链霉菌的Ccr的氨基酸序列(Uniprot登录号：Q53865)如SEQ ID NO:1所示。
来自山丘链霉菌的Ccr(SEQ ID NO:1)：
在某些实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码与SEQ ID NO:1所示的多肽具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多肽的核酸序列。在其他实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码具有源自SEQ ID NO:1所示的多肽的至少50个、100个、200个、300个或400个氨基酸的连续段的核酸序列。
在某些实施方式中，催化将巴豆酰辅酶A转化成丁酰辅酶A的酶可以是反式-2-烯酰基辅酶A还原酶(EC 1.3.1.44)。反式-2-烯酰基辅酶A还原酶的非限制性示例是来自齿垢密螺旋体(Treponema denticola)的FabV。然而，反式-2-烯酰基辅酶A还原酶已在其他生物体中描述。来自齿垢密螺旋体的FabV的氨基酸序列(Uniprot登录号：Q73Q47)如SEQ ID NO:2所示。
来自齿垢密螺旋体的FabV(SEQ ID NO:2)：
在某些实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码与SEQ ID NO:2所示的多肽具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多肽的核酸序列。在其他实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码具有源自SEQ ID NO:2所示的多肽的至少50个、100个、200个、300个或350个氨基酸的连续段的核酸序列。
在某个实施方式中，催化将巴豆酰辅酶A转化成丁酰辅酶A的酶可以是烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(EC 1.3.1.9)。烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶的非限制性示例是来自大肠杆菌(Escherichia coli.)的FabI。然而，烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶已在其他生物体中描述。来自大肠杆菌的FabI的氨基酸序列(Uniprot登录号：P0AEK4)如SEQ ID NO:3所示。
来自大肠杆菌的FabI(SEQ ID NO:3)：
在某些实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码与SEQ ID NO:3所示的多肽具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多肽的核酸序列。在其他实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码具有源自SEQ ID NO:3所示的多肽的至少50个、100个、150个、200个或250个氨基酸的连续段的核酸序列。
在某些实施方式中，催化将巴豆酰辅酶A转化成丁酰辅酶A的酶可以是短链酰基辅酶A脱氢酶(EC 1.3.8.1)。短链酰基辅酶A脱氢酶的非限制性示例是来自埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii)的短链酰基辅酶A脱氢酶。然而，短链酰基辅酶A脱氢酶已在其他生物体中描述。埃氏巨型球菌短链酰基辅酶A脱氢酶的氨基酸序列(Uniprot登录号：Q06319)如SEQ ID NO:4所示。
埃氏巨型球菌短链酰基辅酶A脱氢酶(SEQ ID NO:4)：
在某些实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码与SEQ ID NO:4所示的多肽具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多肽的核酸序列。在其他实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码具有源自SEQ ID NO:4所示的多肽的至少50个、100个、200个、300个或350个氨基酸的连续段的核酸序列。
在某些实施方式中，催化将巴豆酰辅酶A转化成丁酰辅酶A的酶可以是丁酰辅酶A脱氢酶(EC 1.3.8.1)。丁酰辅酶A脱氢酶的非限制性示例是来自发酵氨基酸球菌(Acidaminococcus fermentans)的丁酰辅酶A脱氢酶。然而，丁酰辅酶A脱氢酶已在其他生物体中描述。发酵氨基酸球菌丁酰辅酶A脱氢酶的氨基酸序列(Uniprot登录号：D2RL84)如SEQ ID NO:5所示。
发酵氨基酸球菌丁酰辅酶A脱氢酶(SEQ ID NO:5)：
在某些实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码与SEQ ID NO:5所示的多肽具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多肽的核酸序列。在其他实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码具有源自SEQ ID NO:5所示的多肽的至少50个、100个、200个、300个或350个氨基酸的连续段的核酸序列。
优选地，发酵氨基酸球菌丁酰辅酶A脱氢酶与来自发酵氨基酸球菌的电子转移黄素蛋白(Etf)(SEQ ID NO:54；参见Chowdhury等人，Studies on the Mechanism ofElectron Bifurcation Catalyzed by Electron Transferring Flavoprotein(Etf)andButyryl-CoA Dehydrogenase(Bcd)of Acidaminococcus fermentans；(2014)J Biol Chem289:5145-5157)组合使用。
在优选实施方式中，催化将巴豆酰辅酶A转化成丁酰辅酶A的酶可以是反式-2-烯酰基辅酶A还原酶(EC 1.3.1.44)或烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(EC 1.3.1.9)，特别是任何反式-2-烯酰基辅酶A还原酶或烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶或其变体，如上所定义。
在某些实施方式中，本发明涉及一种重组生物体或微生物，所述重组生物体或微生物包含编码能够还原碳-碳双键的NADH或NADPH依赖性酶(EC 1.3.1)和/或能够还原碳-碳双键的黄素依赖性酶(EC 1.3.8)的核酸，优选地其中能够还原碳-碳双键的NADH或NADPH依赖性酶(EC 1.3.1)是巴豆酰辅酶A还原酶(EC 1.3.1.86)、反式-2-烯酰基辅酶A还原酶(EC 1.3.1.44)和/或烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(EC 1.3.1.9)，并且其中能够还原碳-碳双键的黄素依赖性酶(EC 1.3.8)是短链酰基辅酶A脱氢酶(EC 1.3.8.1)，优选其中能够还原碳-碳双键的NADH或NADPH依赖性酶(EC 1.3.1)是反式-2-烯酰基辅酶A还原酶(EC1.3.1.44)和/或烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(EC 1.3.1.9)，优选地其中能够还原碳-碳双键的NADH或NADPH依赖性酶(EC 1.3.1)是反式-2-烯酰基辅酶A还原酶(EC 1.3.1.44)。在特别优选的实施方式中，反式-2-烯酰基辅酶A还原酶(EC 1.3.1.44)是来自齿垢密螺旋体的FabV或其活性变体。在另一特别优选的实施方式中，烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(EC1.3.1.9)是来自大肠杆菌的FabI或其活性变体。然而，应当理解的是，来自其他物种的FabV和FabI的同源物或其活性变体可以替代地用于本发明中。
在某些实施方式中，重组生物体或微生物中所述酶的水平和/或活性与其所来源于的生物体或微生物相比增加。酶的水平和/或活性增加可以如本文所述来实现。在某些实施方式中，核酸处于启动子的控制下。在某些实施方式中，核酸和/或启动子是异源来源的。在某些实施方式中，启动子不是核酸的天然启动子。在某些实施方式中，包含启动子的核酸被整合到基因组中和/或位于染色体外元件上，例如质粒上。在某些实施方式中，重组生物体或微生物是能够产生3-甲基巴豆酸和/或异丁烯的生物体，例如本文所公开的生物体中的任何一种生物体。此外，重组生物体或微生物可包含导致巴豆酸库减少的一种或多种附加修饰，如本文所述。
增加丁酰辅酶A至丁酸的转化
在某些实施方式中，还可以通过增加从丁酰辅酶A至丁酸的代谢通量来减少从巴豆酰辅酶A至巴豆酸的代谢通量。将丁酰辅酶A转化成丁酸将减少重组生物体或微生物中的丁酰辅酶A库。这继而将引导从巴豆酰辅酶A至丁酰辅酶A并远离巴豆酸的代谢通量，从而减少重组生物体或微生物的巴豆酸库。
为了增加丁酰辅酶A至丁酸的转化，编码可以催化将丁酰辅酶A转化成丁酸的酶的基因可以在根据本发明的重组生物体或微生物中过表达。所述酶可以是外源酶，所述外源酶已被证明有效催化丁酰辅酶A至丁酸的转化。或者，酶可以是内源酶，所述内源酶由于重组表达而可以以更高的浓度获得。此外，酶可以是已经工程化以更有效地将丁酰辅酶A转化成丁酸的外源酶或内源酶。
因此，在具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的重组生物体或微生物，其中丁酰辅酶A至丁酸的转化增加是由于所述生物体或微生物中硫酯水解酶(EC 3.1.2)、辅酶A转移酶(EC 2.8.3)、酸性硫醇连接酶(EC 6.2.1)、磷酸酰基转移酶(EC 2.3.1)和/或酸性激酶(EC 2.7.2)的水平和/或活性增加。
也就是说，重组生物体或微生物可以过表达任何能够将丁酰辅酶A转化成丁酸的EC 3.1.2类、2.8.3类、6.2.1类、2.3.1类和/或2.7.2类的酶。
在具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的重组生物体或微生物，其中硫酯水解酶(EC 3.1.2)是1,4-二羟基-2-萘酰基-辅酶A水解酶(EC 3.1.2.28)或酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)。
催化将丁酰辅酶A转化成丁酸的酶可以是任何有效催化将丁酰辅酶A转化成丁酸的EC 3.1.2类的酶。然而，在优选的实施方式中，硫酯水解酶可以是1,4-二羟基-2-萘酰基-辅酶A水解酶(EC 3.1.2.28)或酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)。
在某些实施方式中，催化将丁酰辅酶A转化成丁酸的酶可以是1,4-二羟基-2-萘酰基-辅酶A水解酶(EC 3.1.2.28)。1,4-二羟基-2-萘酰基-辅酶A水解酶的非限制性示例是来自大肠杆菌或弗氏志贺菌(Shigella flexneri)的MenI。然而，1,4-二羟基-2-萘酰基-辅酶A水解酶已在其他生物体中描述。来自大肠杆菌的MenI的氨基酸序列(Uniprot登录号：P77781)如SEQ ID NO:6所示。来自弗氏志贺菌的MenI的氨基酸序列(Uniprot登录号：Q0T487)如SEQ ID NO:7所示。
来自大肠杆菌的MenI(SEQ ID NO:6)：
来自弗氏志贺菌的MenI(SEQ ID NO:7)：
在某些实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示的多肽具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多肽的核酸序列。在其他实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码具有源自SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示的多肽的至少20个、40个、60个、80个或100个氨基酸的连续段的核酸序列。
在某些实施方式中，催化将丁酰辅酶A转化成丁酸的酶可以是酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)。酰基辅酶A硫酯酶2的非限制性示例是来自大肠杆菌的TesB。然而，酰基辅酶A硫酯酶2已在其他生物体中描述。来自大肠杆菌的TesB的氨基酸序列(Uniprot登录号：P0AGG3)如SEQ ID NO:8所示。
来自大肠杆菌的TesB(SEQ ID NO:8)：
在某些实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码与SEQ ID NO:8所示的多肽具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多肽的核酸序列。在其他实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码具有源自SEQ ID NO:8所示的多肽的至少50个、100个、200个、300个或350个氨基酸的连续段的核酸序列。
在具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的重组生物体或微生物，其中辅酶A转移酶(EC 2.8.3)是乙酸辅酶A转移酶或丁酰辅酶A:乙酸辅酶A转移酶(EC 2.8.3.8)。
催化将丁酰辅酶A转化成丁酸的酶可以是任何有效催化将丁酰辅酶A转化成丁酸的EC 2.8.3类的酶。然而，在优选实施方式中，辅酶A转移酶可以是乙酸辅酶A转移酶或丁酰辅酶A:乙酸辅酶A转移酶(EC 2.8.3.8)。
在某些实施方式中，催化将丁酰辅酶A转化成丁酸的酶可以是乙酸辅酶A转移酶(EC 2.8.3.8)。乙酸辅酶A转移酶的非限制性示例是来自钩虫贪铜菌(Cupriavidusnecator)的YdiF(Pct)。然而，乙酸辅酶A转移酶已在其他生物体中描述。来自钩虫贪铜菌的YdiF(Pct)的氨基酸序列(Uniprot登录号：Q0K874)如SEQ ID NO:9所示。
来自钩虫贪铜菌的YdiF(Pct)(SEQ ID NO:9)：
在某些实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码与SEQ ID NO:9所示的多肽具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多肽的核酸序列。在其他实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码具有源自SEQ ID NO:9所示的多肽的至少100个、200个、300个、400个或500个氨基酸的连续段的核酸序列。
在某些实施方式中，催化将丁酰辅酶A转化成丁酸的酶可以是丁酸:乙酰辅酶A转移酶(EC 2.8.3.8)。丁酸:乙酰辅酶A转移酶的非限制性示例是来自沃氏共养单胞菌沃氏亚种(Syntrophomonas wolfei subsp.Wolfei)的Swol_1932和Swol_0436。然而，丁酸:乙酰辅酶A转移酶已在其他生物体中描述。来自沃氏共养单胞菌沃氏亚种的Swol_1932的氨基酸序列(Uniprot登录号：Q0AVM5)如SEQ ID NO:10所示。来自沃氏共养单胞菌沃氏亚种的Swol_0436的氨基酸序列(Uniprot登录号：Q0AZT0)如SEQ ID NO:11所示。
来自沃氏共养单胞菌沃氏亚种的Swol_1932(SEQ ID NO:10)：
来自沃氏共养单胞菌沃氏亚种的Swol_0436(SEQ ID NO:11)：
在某些实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11所示的多肽具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多肽的核酸序列。在其他实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码具有源自SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11所示的多肽的至少100个、200个、300个、350个或400个氨基酸的连续段的核酸序列。
在具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的重组生物体或微生物，其中酸性硫醇连接酶(EC 6.2.1)是乙酸辅酶A连接酶(形成ADP)(EC 6.2.1.13)。
催化将丁酰辅酶A转化成丁酸的酶可以是任何有效催化将丁酰辅酶A转化成丁酸的EC 6.2.1类的酶。然而，在优选的实施方式中，酸性硫醇连接酶可以是乙酸辅酶A连接酶(形成ADP)(EC 6.2.1.13)。
在某些实施方式中，催化将丁酰辅酶A转化成丁酸的酶可以是乙酸辅酶A连接酶(形成ADP)(EC 6.2.1.13)。乙酸辅酶A连接酶(形成ADP)的非限制性示例是来自肠贾第虫(Giardia intestinalis)(兰氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia))的Q9Y1N2。乙酸辅酶A连接酶(形成ADP)的另外非限制性示例由来自橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)的基因Caur_3920或来自痢疾变形虫(Entamoeba histolytica)的基因EHI_178960编码。来自肠贾第虫(兰氏贾第鞭毛虫)的Q9Y1N2的氨基酸序列(Uniprot登录号：Q9Y1N2)如SEQ ID NO:12所示。由来自橙色绿屈挠菌的基因Caur_3920编码的乙酸辅酶A连接酶(形成ADP)的氨基酸序列(Uniprot登录号：A9WDH8)如SEQ ID NO:13所示。由来自痢疾变形虫的基因EHI_178960编码的乙酸辅酶A连接酶(形成ADP)的氨基酸序列(Uniprot登录号：C4LUV9)如SEQID NO:14所示。
来自肠贾第虫(兰氏贾第鞭毛虫)的Q9Y1N2(SEQ ID NO:12)：
来自橙色绿屈挠菌的Caur_3920(SEQ ID NO:13)：
来自痢疾变形虫的EHI_178960(SEQ ID NO:14)：
在某些实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码与SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所示的多肽具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多肽的核酸序列。在其他实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码具有源自SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ IDNO:14所示的多肽的至少200个、300个、400个、500个或600个氨基酸的连续段的核酸序列。
在具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的重组生物体或微生物，其中所述磷酸酰基转移酶(EC 2.3.1)是磷酸丁酰转移酶(EC 2.3.1.19)和/或其中所述酸性激酶(EC2.7.2)是丁酸激酶(EC 2.7.2.7)。
催化将丁酰辅酶A转化成丁酸的酶可以是任何有效催化将丁酰辅酶A转化成丁酸的EC 2.3.1类和2.7.2类的酶或酶组合。也就是说，丁酰辅酶A至丁酸的转化可以由具有磷酸酰基转移酶和酸性激酶活性的单一酶催化。或者，丁酰辅酶A至丁酸的转化可以通过磷酸酰基转移酶和酸性激酶的组合来催化。在优选的实施方式中，磷酸酰基转移酶(EC 2.3.1)可以是磷酸丁酰转移酶(EC 2.3.1.19)并且酸性激酶(EC 2.7.2)可以是丁酸激酶(EC2.7.2.7)。
在某些实施方式中，参与丁酰辅酶A至丁酸的转化的酶可以是磷酸丁酰转移酶(EC2.3.1.19)。磷酸丁酰转移酶的非限制性示例是来自丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)的Ptb。然而，磷酸丁酰转移酶已在其他生物体中描述。来自丙酮丁醇梭菌的Ptb的氨基酸序列(Uniprot登录号：P58255)如SEQ ID NO:15所示。
来自丙酮丁醇梭菌的Ptb(SEQ ID NO:15)：
在某些实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码与SEQ ID NO:15所示的多肽具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多肽的核酸序列。在其他实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码具有源自SEQ ID NO:15所示的多肽的至少50个、100个、150个、200个或250个氨基酸的连续段的核酸序列。
在某些实施方式中，参与丁酰辅酶A至丁酸的转化的酶可以是丁酸激酶(EC2.7.2.7)。丁酸激酶的非限制性示例是来自丙酮丁醇梭菌的Buk。然而，丁酸激酶已在其他生物体中描述。来自丙酮丁醇梭菌的Buk的氨基酸序列(Uniprot登录号：Q45829)如SEQ IDNO:16所示。
来自丙酮丁醇梭菌的Buk(SEQ ID NO:16)：
在某些实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码与SEQ ID NO:16所示的多肽具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多肽的核酸序列。在其他实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码具有源自SEQ ID NO:16所示的多肽的至少100个、150个、200个、250个或300个氨基酸的连续段的核酸序列。
在某些实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物编码磷酸酰基转移酶和酸性激酶。在某些实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物编码磷酸丁酰转移酶和丁酸激酶。在某些实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物编码来自丙酮丁醇梭菌的Ptb和Buk或上文已定义的其任何序列变体或衍生物。
优选地，催化将丁酰辅酶A转化成丁酸的酶对丁酰辅酶A具有高亲和力并且对巴豆酰辅酶A具有低亲和力。也就是说，催化将丁酰辅酶A转化成丁酸的酶优选地具有与巴豆酰辅酶A相比至少2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍高的对丁酰辅酶A的亲和力(更低的Km)。技术人员知道用于确定酶对底物的亲和力(Km)的方法。在某些实施方式中，用于将丁酰辅酶A转化成丁酸的酶可经遗传工程化以降低其对巴豆酰辅酶A的亲和力(增加的Km)。
在某些实施方式中，本发明涉及一种重组生物体或微生物，所述重组生物体或微生物包含编码硫酯水解酶(EC 3.1.2)、辅酶A转移酶(EC 2.8.3)、酸性硫醇连接酶(EC6.2.1)、磷酸酰基转移酶(EC 2.3.1)和/或酸性激酶(EC 2.7.2)的核酸，优选地其中硫酯水解酶(EC 3.1.2)是1,4-二羟基-2-萘酰基-辅酶A水解酶(EC 3.1.2.28)和/或酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)，其中辅酶A转移酶(EC 2.8.3)是乙酸辅酶A转移酶和/或丁酰辅酶A:乙酸辅酶A转移酶(EC 2.8.3.8)，其中所述酸性硫醇连接酶(EC 6.2.1)是乙酸辅酶A连接酶(形成ADP)(EC 6.2.1.13)，其中磷酸酰基转移酶(EC 2.3.1)是磷酸丁酰转移酶(EC2.3.1.19)和/或其中酸性激酶(EC 2.7.2)是丁酸激酶(EC 2.7.2.7)。在某些实施方式中，本发明的重组生物体或微生物中所述酶的水平和/或活性与其所来源于的生物体或微生物相比增加。酶的水平和/或活性增加可以如本文所述来实现。在某些实施方式中，核酸处于启动子的控制下。在某些实施方式中，核酸和/或启动子是异源来源的。在某些实施方式中，启动子不是核酸的天然启动子。在某些实施方式中，包含启动子的核酸被整合到基因组中和/或位于染色体外元件上，例如质粒上。在某些实施方式中，重组生物体或微生物是能够产生3-甲基巴豆酸和/或异丁烯的生物体，例如本文所公开的生物体中的任何一种生物体。此外，重组生物体或微生物可包含导致巴豆酸库减少的一种或多种附加修饰，如本文所述。
在优选实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物的特征在于，与其所来源于的生物体或微生物相比，巴豆酰辅酶A至丁酰辅酶A的转化增加，并且所产生的丁酰辅酶A至丁酸的转化增加。也就是说，通过同时过表达可将巴豆酰辅酶A转化成丁酰辅酶A的第一酶和可将丁酰辅酶A转化成丁酸的第二酶，可更有效地引导代谢通量远离巴豆酸。
也就是说，在某些实施方式中，由于巴豆酰辅酶A至丁酰辅酶A的转化增加并且丁酰辅酶A至丁酸的转化增加，所以根据本发明的重组生物体或微生物可具有减少的巴豆酸库。
为此，巴豆酰辅酶A至丁酰辅酶A的转化增加可由于所述生物体或微生物中能够还原碳-碳双键的酶(EC 1.3)的水平和/或活性增加而实现，并且丁酰辅酶A至丁酸的转化增加可由于同一生物体或微生物中硫酯水解酶(EC 3.1.2)、辅酶A转移酶(EC 2.8.3)、酸性硫醇连接酶(EC 6.2.1)、磷酸酰基转移酶(EC 2.3.1)和/或酸性激酶(EC 2.7.2)的水平和/或活性增加而实现。
在某些实施方式中，能够还原碳-碳双键的酶(EC 1.3)可以是NADH或NADPH依赖性的(EC 1.3.1)或黄素依赖性的(EC 1.3.8)。
也就是说，在一个实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物是这样的生物体，所述生物体具有增加的水平和/或活性的能够还原碳-碳双键的NADH或NADPH依赖性酶(EC 1.3.1)和增加的水平的以下中的一者或多者：硫酯水解酶(EC 3.1.2)、辅酶A转移酶(EC 2.8.3)、酸性硫醇连接酶(EC 6.2.1)、磷酸酰基转移酶(EC 2.3.1)和/或酸性激酶(EC2.7.2)。
在另一实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物是这样的生物体，所述生物体具有：
a)增加的水平和/或活性的以下中的一者或多者：烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(EC 1.3.1.9)、反式-2-烯酰基辅酶A还原酶(EC 1.3.1.44)、巴豆酰辅酶A还原酶(EC1.3.1.86)和/或短链酰基辅酶A脱氢酶(EC 1.3.8.1)；以及
b)增加的水平和/或活性的以下中的一者或多者：1,4-二羟基-2-萘酰基-辅酶A水解酶(EC 3.1.2.28)、酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)、乙酸辅酶A转移酶或丁酰辅酶A:乙酸辅酶A转移酶(EC 2.8.3.8)、乙酸辅酶A连接酶(形成ADP)(EC 6.2.1.13)、磷酸丁酰转移酶(EC 2.3.1.19)和/或丁酸激酶(EC 2.7.2.7)。
在优选的实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物是这样的生物体，所述生物体具有增加的水平和/或活性的烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(EC 1.3.1.9)和增加的水平和/或活性的以下中的一者或多者：1,4-二羟基-2-萘酰基-辅酶A水解酶(EC3.1.2.28)、酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)、乙酸辅酶A转移酶或丁酰辅酶A:乙酸辅酶A转移酶(EC 2.8.3.8)、乙酸辅酶A连接酶(形成ADP)(EC 6.2.1.13)、磷酸丁酰转移酶(EC2.3.1.19)和/或丁酸激酶(EC 2.7.2.7)。
在另一优选的实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物是这样的生物体，所述生物体具有增加的水平和/或活性的反式-2-烯酰基辅酶A还原酶(EC 1.3.1.44)和增加的水平和/或活性的以下中的一者或多者：1,4-二羟基-2-萘酰基-辅酶A水解酶(EC3.1.2.28)、酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)、乙酸辅酶A转移酶或丁酰辅酶A:乙酸辅酶A转移酶(EC 2.8.3.8)、乙酸辅酶A连接酶(形成ADP)(EC 6.2.1.13)、磷酸丁酰转移酶(EC2.3.1.19)和/或丁酸激酶(EC 2.7.2.7)。
在另一优选的实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物是这样的生物体，所述生物体具有增加的水平和/或活性的巴豆酰辅酶A还原酶(EC 1.3.1.86)和增加的水平和/或活性的以下中的一者或多者：1,4-二羟基-2-萘酰基-辅酶A水解酶(EC 3.1.2.28)、酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)、乙酸辅酶A转移酶或丁酰辅酶A:乙酸辅酶A转移酶(EC2.8.3.8)、乙酸辅酶A连接酶(形成ADP)(EC 6.2.1.13)、磷酸丁酰转移酶(EC 2.3.1.19)和/或丁酸激酶(EC 2.7.2.7)。
在一个实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物是这样的生物体，所述生物体具有增加的水平和/或活性的能够还原碳-碳双键的黄素依赖性酶(EC 1.3.8)和增加的水平和/或活性的以下中的一者或多者：硫酯水解酶(EC 3.1.2)、辅酶A转移酶(EC2.8.3)、酸性硫醇连接酶(EC 6.2.1)、磷酸酰基转移酶(EC 2.3.1)和/或酸性激酶(EC2.7.2)。
在优选的实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物是这样的生物体，所述生物体具有增加的水平和/或活性的短链酰基辅酶A脱氢酶(EC 1.3.8.1)和增加的水平和/或活性的以下中的一者或多者：1,4-二羟基-2-萘酰基-辅酶A水解酶(EC 3.1.2.28)、酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)、乙酸辅酶A转移酶或丁酰辅酶A:乙酸辅酶A转移酶(EC2.8.3.8)、乙酸辅酶A连接酶(形成ADP)(EC 6.2.1.13)、磷酸丁酰转移酶(EC 2.3.1.19)和/或丁酸激酶(EC 2.7.2.7)。
增加巴豆酰辅酶A至3-羟基丁酰辅酶A的转化
在某些实施方式中，从巴豆酰辅酶A至巴豆酸的代谢通量可以通过增加从巴豆酰辅酶A至3-羟基丁酰辅酶A的代谢通量来减少。也就是说，通过增加巴豆酰辅酶A至3-羟基丁酰辅酶A的转化，更少量的巴豆酰辅酶A将可用于水解成巴豆酸。
为了增加巴豆酰辅酶A至3-羟基丁酰辅酶A的转化，编码可以催化巴豆酰辅酶A至3-羟基丁酰辅酶A的转化的酶的基因可以在根据本发明的重组生物体或微生物中过表达。所述酶可以是外源酶，所述外源酶已被证明有效催化巴豆酰辅酶A至3-羟基丁酰辅酶A的转化。或者，酶可以是内源酶，所述内源酶由于重组表达而可以以更高的浓度获得。此外，酶可以是已经工程化以更有效地将巴豆酰辅酶A转化成3-羟基丁酰辅酶A的外源酶或内源酶。
因此，在具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的重组生物体或微生物，其中巴豆酰辅酶A至3-羟基丁酰辅酶A的转化增加是由于所述生物体或微生物中水裂合酶(EC4.2.1)的水平和/或活性增加。
也就是说，重组生物体或微生物可以过表达任何能够将巴豆酰辅酶A转化成3-羟基丁酰辅酶A的EC 4.2.1类的酶。
在具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的重组生物体或微生物，其中所述氢裂合酶(EC 4.2.1)是短链烯酰基辅酶A水合酶(EC 4.2.1.150)、3-羟基丁酰辅酶A脱水酶(EC 4.2.1.55)或烯酰辅酶A水合酶(EC 4.2.1.17)。
催化将巴豆酰辅酶A转化成3-羟基丁酰辅酶A的酶可以是任何水裂合酶(EC4.2.1)，只要它可催化将巴豆酰辅酶A转化成3-羟基丁酰辅酶A即可。然而，在优选的实施方式中，水裂合酶是短链烯酰基辅酶A水合酶(EC 4.2.1.150)、3-羟基丁酰辅酶A脱水酶(EC4.2.1.55)或烯酰辅酶A水合酶(EC 4.2.1.17)。
在某些实施方式中，催化将巴豆酰辅酶A转化成3-羟基丁酰辅酶A的酶可以是短链烯酰基辅酶A水合酶(EC 4.2.1.150)。短链烯酰基辅酶A水合酶的非限制性示例是来自红色亚栖热菌(Meiothermus ruber)、勤奋金属球菌(Metallosphaera sedula)和丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)的短链烯酰基辅酶A水合酶。然而，短链烯酰基辅酶A水合酶已在其他生物体中描述。来自红色亚栖热菌的短链烯酰基辅酶A水合酶的氨基酸序列(Uniprot登录号：D3PLE5)如SEQ ID NO:17所示。来自勤奋金属球菌的短链烯酰基辅酶A水合酶的氨基酸序列(Uniprot登录号：A4YDS4)如SEQ ID NO:18所示。来自丙酮丁醇梭菌的短链烯酰基辅酶A水合酶的氨基酸序列(Uniprot登录号：P52046)如SEQ ID NO:19所示。
来自红色亚栖热菌的短链烯酰辅酶A水合酶(SEQ ID NO:17)：
来自勤奋金属球菌的短链烯酰基辅酶A水合酶(SEQ ID NO:18)：
来自丙酮丁醇梭菌的短链烯酰基辅酶A水合酶(SEQ ID NO:19)：
在某些实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码与SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19所示的多肽具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多肽的核酸序列。在其他实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码具有源自SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18或SEQ IDNO:19所示的多肽的至少50个、100个、150个、200个或250个氨基酸的连续段的核酸序列。
在某些实施方式中，催化将巴豆酰辅酶A转化成3-羟基丁酰辅酶A的酶可以是3-羟基丁酰辅酶A脱水酶(EC 4.2.1.55)。3-羟基丁酰辅酶A脱水酶的非限制性示例是来自和平铁古球菌(Ferroglobus placidus)的3-羟基丁酰辅酶A脱水酶。然而，3-羟基丁酰辅酶A脱水酶已在其他生物体中描述。来自和平铁古球菌的3-羟基丁酰辅酶A脱水酶的氨基酸序列(Uniprot登录号：D3RXI4)如SEQ ID NO:20所示。
来自和平铁古球菌的3-羟基丁酰辅酶A脱水酶(SEQ ID NO:20)：
在某些实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码与SEQ ID NO:20所示的多肽具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多肽的核酸序列。在其他实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码具有源自SEQ ID NO:20所示的多肽的至少100个、200个、300个、400个或500个氨基酸的连续段的核酸序列。
在某些实施方式中，催化将巴豆酰辅酶A转化成3-羟基丁酰辅酶A的酶可以是烯酰辅酶A水合酶(EC 4.2.1.17)。烯酰辅酶A水合酶的非限制性示例是来自褐家鼠(Rattusnorvegicus)的烯酰辅酶A水合酶。然而，烯酰辅酶A水合酶已在其他生物体中描述。来自褐家鼠的烯酰辅酶A水合酶的氨基酸序列(Uniprot登录号：P14604)如SEQ ID NO:21所示。
来自褐家鼠的烯酰辅酶A水合酶(SEQ ID NO:21)：
在某些实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码与SEQ ID NO:21所示的多肽具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多肽的核酸序列。在其他实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码具有源自SEQ ID NO:21所示的多肽的至少50个、100个、150个、200个或250个氨基酸的连续段的核酸序列。
在某些实施方式中，本发明涉及一种重组生物体或微生物，所述重组生物体或微生物包含编码水裂合酶(EC 4.2.1)的核酸，优选地其中所述水裂合酶(EC 4.2.1)是短链烯酰基辅酶A水合酶(EC 4.2.1.150)、3-羟基丁酰辅酶A脱水酶(EC 4.2.1.55)和/或烯酰辅酶A水合酶(EC 4.2.1.17)，优选地其中所述水裂合酶(EC 4.2.1)是短链烯酰基辅酶A水合酶(EC 4.2.1.150)。在某些实施方式中，本发明的重组生物体或微生物中所述酶的水平和/或活性与其所来源于的生物体或微生物相比增加。酶的水平和/或活性增加可以如本文所述来实现。在某些实施方式中，核酸处于启动子的控制下。在某些实施方式中，核酸和/或启动子是异源来源的。在某些实施方式中，启动子不是核酸的天然启动子。在某些实施方式中，包含启动子的核酸被整合到基因组中和/或位于染色体外元件上，例如质粒上。在某些实施方式中，重组生物体或微生物是能够产生3-甲基巴豆酸和/或异丁烯的生物体，例如本文所公开的生物体中的任何一种生物体。此外，重组生物体或微生物可包含导致巴豆酸库减少的一种或多种附加修饰，如本文所述。
增加3-羟基丁酰辅酶A至3-羟基丁酸的转化
在某些实施方式中，还可以通过增加从3-羟基丁酰辅酶A至3-羟基丁酸的代谢通量来减少从巴豆酰辅酶A至巴豆酸的代谢通量。将3-羟基丁酰辅酶A转化成3-羟基丁酸将减少重组生物体或微生物中的3-羟基丁酰辅酶A库。这继而将引导从巴豆酰辅酶A至3-羟基丁酰辅酶A并远离巴豆酸的代谢通量，从而减少重组生物体或微生物的巴豆酸库。
为了增加3-羟基丁酰辅酶A至3-羟基丁酸的转化，编码可以催化将3-羟基丁酰辅酶A转化成3-羟基丁酸的酶的基因可以在根据本发明的重组生物体或微生物中过表达。所述酶可以是外源酶，所述外源酶已被证明有效催化3-羟基丁酰辅酶A至3-羟基丁酸的转化。或者，酶可以是内源酶，所述内源酶由于重组表达而可以以更高的浓度获得。此外，酶可以是已经工程化以更有效地将3-羟基丁酰辅酶A转化成3-羟基丁酸的外源酶或内源酶。
因此，在具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的重组生物体或微生物，其中3-羟基丁酰辅酶A至3-羟基丁酸的转化增加是由于所述生物体或微生物中硫酯水解酶(EC3.1.2)的水平和/或活性增加。
也就是说，重组生物体或微生物可以过表达任何能够将3-羟基丁酰辅酶A转化成3-羟基丁酸的EC 3.1.2类的酶。
在具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的重组生物体或微生物，其中硫酯水解酶(EC 3.1.2)是棕榈酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.2)或酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)。
催化将3-羟基丁酰辅酶A转化成3-羟基丁酸的酶可以是任何有效催化将3-羟基丁酰辅酶A转化成3-羟基丁酸的EC 3.1.2类的酶。然而，在优选的实施方式中，硫酯水解酶可以是棕榈酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.2)或酰基辅酶A硫酯酶2(EC3.1.2.20)。
在某些实施方式中，催化将3-羟基丁酰辅酶A转化成3-羟基丁酸的酶可以是棕榈酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.2)。棕榈酰辅酶A水解酶的非限制性示例是来自深海发光杆菌(Photobacterium profundum)的棕榈酰辅酶A水解酶。然而，棕榈酰辅酶A水解酶已在其他生物体中描述。来自深海发光杆菌的棕榈酰辅酶A水解酶的氨基酸序列(Uniprot登录号：Q93CG9)如SEQ ID NO:22所示。
来自深海发光杆菌的棕榈酰辅酶A水解酶(SEQ ID NO:22)：
在某些实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码与SEQ ID NO:22所示的多肽具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多肽的核酸序列。在其他实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码具有源自SEQ ID NO:22所示的多肽的至少20个、40个、60个、80个或100个氨基酸的连续段的核酸序列。
在某些实施方式中，催化将3-羟基丁酰辅酶A转化成3-羟基丁酸的酶可以是酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)。酰基辅酶A硫酯酶2的非限制性示例是来自大肠杆菌的TesB和YciA。然而，酰基辅酶A硫酯酶2已在其他生物体中描述。来自大肠杆菌的TesB的氨基酸序列(Uniprot登录号：P0AGG2)如SEQ ID NO:23所示。来自大肠杆菌的YciA的氨基酸序列(Uniprot登录号：P0A8Z0)如SEQ ID NO:24所示。
来自大肠杆菌的TesB(SEQ ID NO:23)：
来自大肠杆菌的YciA(SEQ ID NO:24)：
在某些实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码与SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的多肽具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多肽的核酸序列。在其他实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码具有源自SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的多肽的至少20个、40个、60个、80个或100个氨基酸的连续段的核酸序列。
优选地，催化将3-羟基丁酰辅酶A转化成3-羟基丁酸的酶对3-羟基丁酰辅酶A具有高亲和力并且对巴豆酰辅酶A具有低亲和力。也就是说，催化将3-羟基丁酰辅酶A转化成3-羟基丁酸的酶优选地具有与巴豆酰辅酶A相比至少2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍高的对3-羟基丁酰辅酶A的亲和力(更低的Km)。技术人员知道用于确定酶对底物的亲和力(Km)的方法。在某些实施方式中，用于将3-羟基丁酰辅酶A转化成3-羟基丁酸的酶可经遗传工程化以降低其对巴豆酰辅酶A的亲和力(增加的Km)。
在某些实施方式中，本发明涉及一种重组生物体或微生物，所述重组生物体或微生物包含编码硫酯水解酶(EC 3.1.2)的核酸，优选地其中所述硫酯水解酶(EC 3.1.2)是棕榈酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.2)和/或酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)。在某些实施方式中，本发明的重组生物体或微生物中所述酶的水平和/或活性与其所来源于的生物体或微生物相比增加。酶的水平和/或活性增加可以如本文所述来实现。在某些实施方式中，核酸处于启动子的控制下。在某些实施方式中，核酸和/或启动子是异源来源的。在某些实施方式中，启动子不是核酸的天然启动子。在某些实施方式中，包含启动子的核酸被整合到基因组中和/或位于染色体外元件上，例如质粒上。在某些实施方式中，重组生物体或微生物是能够产生3-甲基巴豆酸和/或异丁烯的生物体，例如本文所公开的生物体中的任何一种生物体。此外，重组生物体或微生物可包含导致巴豆酸库减少的一种或多种附加修饰，如本文所述。
在优选实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物的特征在于，与其所来源于的生物体或微生物相比，巴豆酰辅酶A至3-羟基丁酰辅酶A的转化增加，并且所产生的3-羟基丁酰辅酶A至3-羟基丁酸的转化增加。也就是说，通过同时过表达可将巴豆酰辅酶A转化成3-羟基丁酰辅酶A的第一酶和可将3-羟基丁酰辅酶A转化成3-羟基丁酸的第二酶，可更有效地引导代谢通量远离巴豆酸。
也就是说，在某些实施方式中，由于巴豆酰辅酶A至3-羟基丁酰辅酶A的转化增加并且3-羟基丁酰辅酶A至3-羟基丁酸的转化增加，所以根据本发明的重组生物体或微生物可具有减少的巴豆酸库。
为此，巴豆酰辅酶A至3-羟基丁酰辅酶A的转化增加可由于所述生物体或微生物中水裂合酶(EC 4.2.1)的水平和/或活性增加而实现，并且3-羟基丁酰辅酶A至3-羟基丁酸的转化增加可由于硫酯水解酶(EC 3.1.2)的水平和/或活性增加而实现。
在另一实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物是这样的生物体，所述生物体具有：
a)增加的水平和/或活性的以下中的一者或多者：短链烯酰基辅酶A水合酶(EC4.2.1.150)、3-羟基丁酰辅酶A脱水酶(EC 4.2.1.55)和/或烯酰辅酶A水合酶(EC4.2.1.17)；以及
b)增加的水平和/或活性的以下中的一者或多者：棕榈酰辅酶A水解酶(EC3.1.2.2)和/或酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)。
在优选的实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物是这样的生物体，所述生物体具有增加水平和/或活性的短链烯酰基辅酶A水合酶(EC 4.2.1.150)和增加水平和/或活性的以下中的一者或多者：棕榈酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.2)和/或酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)。
在另一优选实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物是这样的生物体，所述生物体具有增加水平和/或活性的3-羟基丁酰辅酶A脱水酶(EC 4.2.1.55)和增加水平和/或活性的以下中的一者或多者：棕榈酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.2)和/或酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)。
在另一优选实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物是这样的生物体，所述生物体具有增加水平和/或活性的烯酰辅酶A水合酶(EC 4.2.1.17)和增加水平和/或活性的以下中的一者或多者：棕榈酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.2)和/或酰基辅酶A硫酯酶2(EC3.1.2.20)。
减少从巴豆酰基-[酰基载体蛋白]至巴豆酸的代谢通量
在本发明内，还可以通过减少巴豆酰基-[酰基载体蛋白]至巴豆酸的转化来实现减少的巴豆酸库。巴豆酰基-[酰基载体蛋白]可以通过合适的硫酯水解酶转化成巴豆酸。为了防止从巴豆酰基-[酰基载体蛋白]形成巴豆酸，本发明人已经开发了不同的策略来减少从巴豆酰基-[酰基载体蛋白]至巴豆酸的代谢通量。
这些策略涉及：
(i)增加巴豆酰基-[酰基载体蛋白]至丁酰基-[酰基载体蛋白]的转化；和/或
(ii)减少巴豆酰基-[酰基载体蛋白]至巴豆酸的转化。
增加巴豆酰基-[酰基载体蛋白]至丁酰基-[酰基载体蛋白]的转化
在某些实施方式中，可以通过增加从巴豆酰基-[酰基载体蛋白]至丁酰基-[酰基载体蛋白]的代谢通量来减少从巴豆酰基-[酰基载体蛋白]至巴豆酸的代谢通量。也就是说，通过增加巴豆酰基-[酰基载体蛋白]至丁酰基-[酰基载体蛋白]的转化，更少量的巴豆酰基-[酰基载体蛋白]将可用于水解成巴豆酸。所产生的丁酰基-[酰基载体蛋白]可以进入脂肪酸延伸途径并且因此将不会在根据本发明的重组生物体或微生物中积累。
为了增加巴豆酰基-[酰基载体蛋白]至丁酰基-[酰基载体蛋白]的转化，编码可催化将巴豆酰基-[酰基载体蛋白]转化成丁酰基-[酰基载体蛋白]的酶的基因可以在根据本发明的重组生物体或微生物中过表达。所述酶可以是外源酶，所述外源酶已被证明有效催化巴豆酰基-[酰基载体蛋白]至丁酰基-[酰基载体蛋白]的转化。或者，酶可以是内源酶，所述内源酶由于重组表达而可以以更高的浓度获得。此外，酶可以是已经工程化以更有效地将巴豆酰基-[酰基载体蛋白]转化成丁酰基-[酰基载体蛋白]的外源酶或内源酶。
因此，在具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的重组生物体或微生物，其中巴豆酰基-[酰基载体蛋白]至丁酰基[酰基载体蛋白]的转化增加是由于所述生物体或微生物中NADH或NADPH依赖性烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(EC 1.3.1)的水平和/或活性增加。
也就是说，重组生物体或微生物可以过表达任何能够将巴豆酰基-[酰基载体蛋白]转化成丁酰基-[酰基载体蛋白]的EC 1.3.1类的酶。
在某些实施方式中，催化将巴豆酰基-[酰基载体蛋白]转化成丁酰基-[酰基载体蛋白]的酶可以是烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(NADH依赖性)(EC 1.3.1.9)。
在某些实施方式中，催化将巴豆酰基-[酰基载体蛋白]转化成丁酰基-[酰基载体蛋白]的酶可以是来自大肠杆菌的FabI(EC 1.3.1.9和EC 1.3.1.104)。来自大肠杆菌的FabI的氨基酸序列(Uniprot登录号：P0AEK4)如SEQ ID NO:3所示。
在某些实施方式中，催化将巴豆酰基-[酰基载体蛋白]转化成丁酰基-[酰基载体蛋白]的酶可以是来自枯草芽孢杆菌的FabI(EC 1.3.1.9)。来自枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的FabI的氨基酸序列(Uniprot登录号：P54616)如SEQ ID NO:25所示。
来自枯草芽孢杆菌的FabI(SEQ ID NO:25)：
在某些实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码与SEQ ID NO:25所示的多肽具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多肽的核酸序列。在其他实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码具有源自SEQ ID NO:25所示的多肽的至少50个、100个、150个、200个或250个氨基酸的连续段的核酸序列。
在某些实施方式中，催化将巴豆酰基-[酰基载体蛋白]转化成丁酰基-[酰基载体蛋白]的酶可以是烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(NADPH依赖性)(EC 1.3.1.104)。
在某些实施方式中，催化将巴豆酰基-[酰基载体蛋白]转化成丁酰基-[酰基载体蛋白]的酶可以是来自枯草芽孢杆菌的FabL(EC 1.3.1.104)。来自枯草芽孢杆菌的FabL的氨基酸序列(Uniprot登录号：P71079)如SEQ ID NO:26所示。
来自枯草芽孢杆菌的FabL(SEQ ID NO:26)：
在某些实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码与SEQ ID NO:26所示的多肽具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多肽的核酸序列。在其他实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码具有源自SEQ ID NO:26所示的多肽的至少50个、100个、150个、200个或250个氨基酸的连续段的核酸序列。
在某些实施方式中，催化将巴豆酰基-[酰基载体蛋白]转化成丁酰基-[酰基载体蛋白]的酶可以是烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(NADPH依赖性，Re特异性)(EC1.3.1.39)。
在某些实施方式中，催化将巴豆酰基-[酰基载体蛋白]转化成丁酰基-[酰基载体蛋白]的酶可以是来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的FabI(EC 1.3.1.39)。来自金黄色葡萄球菌的FabI的氨基酸序列(Uniprot登录号：Q2FZQ3)如SEQ ID NO:27所示。
来自金黄色葡萄球菌的FabI(SEQ ID NO:27)：
在某些实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码与SEQ ID NO:27所示的多肽具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多肽的核酸序列。在其他实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码具有源自SEQ ID NO:27所示的多肽的至少50个、100个、150个、200个或250个氨基酸的连续段的核酸序列。
在某些实施方式中，催化将巴豆酰基-[酰基载体蛋白]转化成丁酰基-[酰基载体蛋白]的酶可以是烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(NADPH依赖性，Si特异性)(EC1.3.1.10)。
在某些实施方式中，催化将巴豆酰基-[酰基载体蛋白]转化成丁酰基-[酰基载体蛋白]的酶可以是来自牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)的FabK(EC 1.3.1.10和EC 1.3.1.39)。来自牙龈卟啉单胞菌的FabK的氨基酸序列(Uniprot登录号：Q7MAW0)如SEQ ID NO:28所示。
来自牙龈卟啉单胞菌的FabK(SEQ ID NO:28)：
在某些实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码与SEQ ID NO:28所示的多肽具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多肽的核酸序列。在其他实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码具有源自SEQ ID NO:28所示的多肽的至少50个、100个、150个、200个或250个氨基酸的连续段的核酸序列。
在某些实施方式中，催化将巴豆酰基-[酰基载体蛋白]转化成丁酰基-[酰基载体蛋白]的酶可以是来自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的FabK(EC 1.3.1.10)。来自肺炎链球菌的FabK的氨基酸序列(Uniprot登录号：Q9FBC5)如SEQ ID NO:29所示。
来自肺炎链球菌的FabK(SEQ ID NO:29)：
在某些实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码与SEQ ID NO:29所示的多肽具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多肽的核酸序列。在其他实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码具有源自SEQ ID NO:29所示的多肽的至少50个、100个、150个、200个或250个氨基酸的连续段的核酸序列。
在某些实施方式中，催化将巴豆酰基-[酰基载体蛋白]转化成丁酰基-[酰基载体蛋白]的酶可以是来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的ETR1(EC 1.3.1.104)。来自酿酒酵母的ETR1的氨基酸序列(Uniprot登录号：P38071)如SEQ ID NO:30所示。
来自酿酒酵母的ETR1(SEQ ID NO:30)：
在某些实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码与SEQ ID NO:30所示的多肽具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多肽的核酸序列。在其他实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码具有源自SEQ ID NO:30所示的多肽的至少100个、150个、200个、250个或300个氨基酸的连续段的核酸序列。
在某些实施方式中，催化将巴豆酰基-[酰基载体蛋白]转化成丁酰基-[酰基载体蛋白]的酶可以是反式-2-烯酰基辅酶A还原酶(NAD+)(EC 1.3.1.44)。
在某些实施方式中，催化将巴豆酰基-[酰基载体蛋白]转化成丁酰基-[酰基载体蛋白]的酶可以是来自鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia mallei)的FabV(EC 1.3.1.9和EC 1.3.1.44)。来自鼻疽伯克霍尔德氏菌的FabV的氨基酸序列(Uniprot登录号：Q62L02)如SEQ ID NO:31所示。
来自鼻疽伯克霍尔德氏菌的FabV(SEQ ID NO:31)：
在某些实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码与SEQ ID NO:31所示的多肽具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多肽的核酸序列。在其他实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码具有源自SEQ ID NO:31所示的多肽的至少100个、150个、200个、250个或300个氨基酸的连续段的核酸序列。
在某些实施方式中，催化将巴豆酰基-[酰基载体蛋白]转化成丁酰基-[酰基载体蛋白]的酶可以是来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的FabV(EC 1.3.1.9和EC1.3.1.44)。来自铜绿假单胞菌的FabV的氨基酸序列(Uniprot登录号：Q9HZP8)如SEQ IDNO:32所示。
来自铜绿假单胞菌的FabV(SEQ ID NO:32)：
在某些实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码与SEQ ID NO:32所示的多肽具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多肽的核酸序列。在其他实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码具有源自SEQ ID NO:32所示的多肽的至少100个、150个、200个、250个或300个氨基酸的连续段的核酸序列。
在某些实施方式中，催化将巴豆酰基-[酰基载体蛋白]转化成丁酰基-[酰基载体蛋白]的酶可以是来自霍乱弧菌(Vibrio cholera)的FabV(EC 1.3.1.9和EC 1.3.1.44)。来自霍乱弧菌的FabV的氨基酸序列(Uniprot登录号：Q9KRA3)如SEQ ID NO:33所示。
来自霍乱弧菌的FabV(SEQ ID NO:33)：
在某些实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码与SEQ ID NO:33所示的多肽具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多肽的核酸序列。在其他实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码具有源自SEQ ID NO:33所示的多肽的至少100个、150个、200个、250个或300个氨基酸的连续段的核酸序列。
在某些实施方式中，催化将巴豆酰基-[酰基载体蛋白]转化成丁酰基-[酰基载体蛋白]的酶可以是来自齿垢密螺旋体的FabV。来自齿垢密螺旋体的FabV的氨基酸序列(Uniprot登录号：Q73Q47)如SEQ ID NO:2所示。
在某些实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码与SEQ ID NO:2所示的多肽具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多肽的核酸序列。在其他实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码具有源自SEQ ID NO:2所示的多肽的至少50个、100个、200个、300个或350个氨基酸的连续段的核酸序列。
在某些实施方式中，催化将巴豆酰基-[酰基载体蛋白]转化成丁酰基-[酰基载体蛋白]的酶可以是来自铜绿假单胞菌的FabI(EC 1.3.1.9)。来自铜绿假单胞菌的FabI的氨基酸序列(Uniprot登录号：Q9ZFE4)如SEQ ID NO:34所示。
来自铜绿假单胞菌的FabI(SEQ ID NO:34)：
在某些实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码与SEQ ID NO:34所示的多肽具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多肽的核酸序列。在其他实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码具有源自SEQ ID NO:34所示的多肽的至少50个、100个、150个、200个或250个氨基酸的连续段的核酸序列。
在某些实施方式中，催化将巴豆酰基-[酰基载体蛋白]转化成丁酰基-[酰基载体蛋白]的酶可以是来自类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)的FabI(EC1.3.1.9)。来自类鼻疽伯克霍尔德菌的FabI的氨基酸序列(Uniprot登录号：Q3JQY0)如SEQID NO:35所示。
来自类鼻疽伯克霍尔德菌的FabI(SEQ ID NO:35)：
在某些实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码与SEQ ID NO:35所示的多肽具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多肽的核酸序列。在其他实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码具有源自SEQ ID NO:35所示的多肽的至少50个、100个、150个、200个或250个氨基酸的连续段的核酸序列。
在优选的实施方式中，催化将巴豆酰基-[酰基载体蛋白]转化成丁酰基[酰基载体蛋白]的酶可以是反式-2-烯酰基辅酶A还原酶(EC 1.3.1.44)、烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(NADH)(EC 1.3.1.9)或烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(NADPH)(EC 1.3.1.104)，特别是任何反式-2-烯酰基辅酶A还原酶或烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶或其变体，如上文所定义。
在某些实施方式中，本发明涉及一种重组生物体或微生物，所述重组生物体或微生物包含编码能够还原碳-碳双键的NADH或NADPH依赖性酶(EC 1.3.1)的核酸，优选地其中所述能够还原碳-碳双键的NADH或NADPH依赖性酶(EC 1.3.1)是烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(NADH依赖性)(EC 1.3.1.9)、烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(NADPH依赖性)(EC1.3.1.104)、烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(NADPH依赖性、Re特异性)(EC 1.3.1.39)、烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(NADPH依赖性、Si特异性)(EC 1.3.1.10)，和/或反式-2-烯酰基辅酶A还原酶(NAD+)(EC 1.3.1.44)，优选地其中所述能够还原碳-碳双键的NADH或NADPH依赖性酶(EC 1.3.1)是反式-2-烯酰基辅酶A还原酶(EC 1.3.1.44)和/或烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(NADH依赖性)(EC 1.3.1.9)，优选地其中所述能够还原碳-碳双键的NADH或NADPH依赖性酶(EC 1.3.1)是反式-2-烯酰基辅酶A还原酶(EC 1.3.1.44)。
在某些实施方式中，重组生物体或微生物中所述酶的水平和/或活性与其所来源于的生物体或微生物相比增加。酶的水平和/或活性增加可以如本文所述来实现。在某些实施方式中，核酸处于启动子的控制下。在某些实施方式中，核酸和/或启动子是异源来源的。在某些实施方式中，启动子不是核酸的天然启动子。在某些实施方式中，包含启动子的核酸被整合到基因组中和/或位于染色体外元件上，例如质粒上。在某些实施方式中，重组生物体或微生物是能够产生3-甲基巴豆酸和/或异丁烯的生物体，例如本文所公开的生物体中的任何一种生物体。此外，重组生物体或微生物可包含导致巴豆酸库减少的一种或多种附加修饰，如本文所述。
减少巴豆酰基-[酰基载体蛋白]至巴豆酸的转化
代替用上述策略中的任何一种策略引导代谢通量远离巴豆酸，还可以通过直接减少从巴豆酰基-[酰基载体蛋白]至巴豆酸的代谢通量来减少重组生物体或微生物中巴豆酸的产生。为此，优选的是将降低一种或多种可催化将巴豆酰基-[酰基载体蛋白]转化成巴豆酸的内源酶的表达水平和/或活性。
在具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的重组生物体或微生物，其中巴豆酰基-[酰基载体蛋白]至巴豆酸的转化减少是由于所述生物体或微生物中硫酯水解酶(EC3.1.2)的水平降低和/或活性降低。
也就是说，重组生物体或微生物可以具有降低水平的任何能够将巴豆酰基-[酰基载体蛋白]转化成巴豆酸的EC 3.1.2.-类的酶。替代地或另外，可以在重组生物体或微生物中降低任何能够将巴豆酰基-[酰基载体蛋白]转化成巴豆酸的EC 3.1.2.-类的酶的活性。
在具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的重组生物体或微生物，其中硫酯水解酶(EC 3.1.2)是棕榈酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.2)、酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)或1,4-二羟基-2-萘酰基-辅酶A水解酶(EC 3.1.2.28)。
在大肠杆菌中，硫酯水解酶(EC 3.1.2)由基因paaY编码。因此，在某个实施方式中，本发明的生物体或微生物是具有降低的水平和/或活性的paaY基因的基因产物的大肠杆菌。paaY基因的核酸序列提供于SEQ ID NO:36中。在某些实施方式中，如SEQ ID NO:36所示的核酸序列可以在根据本发明的生物体或微生物中缺失。在某些实施方式中，与如SEQID NO:36所示的核酸序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的序列同一性的核酸序列可以在根据本发明的生物体或微生物中缺失。在某些实施方式中，如SEQ IDNO:36所示的核酸序列的一部分可以在根据本发明的生物体或微生物中缺失。也就是说，包含如SEQ ID NO:36所示的核酸序列的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、100个、150个、200个、250个、300个、400个、500个核苷酸的连续段可以在本发明的生物体或微生物中缺失。
来自大肠杆菌的paaY(SEQ ID NO:36)：
另一种硫酯水解酶(EC 3.1.2)由基因paaI在大肠杆菌中编码。因此，在某个实施方式中，本发明的生物体或微生物是具有降低的水平和/或活性的paaI基因的基因产物的大肠杆菌。paaI基因的核酸序列提供于SEQ ID NO:37中。在某些实施方式中，如SEQ ID NO:37所示的核酸序列可以在根据本发明的生物体或微生物中缺失。在某些实施方式中，与如SEQ ID NO:37所示的核酸序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的序列同一性的核酸序列可以在根据本发明的生物体或微生物中缺失。在某些实施方式中，如SEQID NO:37所示的核酸序列的一部分可以在根据本发明的生物体或微生物中缺失。也就是说，包含如SEQ ID NO:37所示的核酸序列的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、100个、150个、200个、250个、300个、400个核苷酸的连续段可以在本发明的生物体或微生物中缺失。
来自大肠杆菌的paaI(SEQ ID NO:37)：
在大肠杆菌中，棕榈酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.2)由基因tesA编码。因此，在某个实施方式中，本发明的生物体或微生物是具有降低的水平和/或活性的tesA基因的基因产物的大肠杆菌。tesA基因的核酸序列提供于SEQ ID NO:38中。在某些实施方式中，如SEQ IDNO:38所示的核酸序列可以在根据本发明的生物体或微生物中缺失。在某些实施方式中，与如SEQ ID NO:38所示的核酸序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的序列同一性的核酸序列可以在根据本发明的生物体或微生物中缺失。在某些实施方式中，如SEQID NO:38所示的核酸序列的一部分可以在根据本发明的生物体或微生物中缺失。也就是说，包含如SEQ ID NO:38所示的核酸序列的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、100个、150个、200个、250个、300个、400个、500个、600个核苷酸的连续段可以在本发明的生物体或微生物中缺失。
来自大肠杆菌的tesA(SEQ ID NO:38)：
另一种棕榈酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.2)由基因yciA在大肠杆菌中编码。因此，在某个实施方式中，本发明的生物体或微生物是具有降低的水平和/或活性的yciA基因的基因产物的大肠杆菌。yciA基因的核酸序列提供于SEQ ID NO:39中。在某些实施方式中，如SEQ ID NO:39所示的核酸序列可以在根据本发明的生物体或微生物中缺失。在某些实施方式中，与如SEQ ID NO:39所示的核酸序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的序列同一性的核酸序列可以在根据本发明的生物体或微生物中缺失。在某些实施方式中，如SEQ ID NO:39所示的核酸序列的一部分可以在根据本发明的生物体或微生物中缺失。也就是说，包含如SEQ ID NO:39所示的核酸序列的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、100个、150个、200个、250个、300个、350个核苷酸的连续段可以在本发明的生物体或微生物中缺失。
来自大肠杆菌的yciA(SEQ ID NO:39)：
另一种棕榈酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.2)由基因entH在大肠杆菌中编码。因此，在某个实施方式中，本发明的生物体或微生物是具有降低的水平和/或活性的entH基因的基因产物的大肠杆菌。entH基因的核酸序列提供于SEQ ID NO:40中。在某些实施方式中，如SEQ ID NO:40所示的核酸序列可以在根据本发明的生物体或微生物中缺失。在某些实施方式中，与如SEQ ID NO:40所示的核酸序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的序列同一性的核酸序列可以在根据本发明的生物体或微生物中缺失。在某些实施方式中，如SEQ ID NO:40所示的核酸序列的一部分可以在根据本发明的生物体或微生物中缺失。也就是说，包含如SEQ ID NO:40所示的核酸序列的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个核苷酸的连续段可以在本发明的生物体或微生物中缺失。
来自大肠杆菌的entH(SEQ ID NO:40)：
在大肠杆菌中，酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)由基因tesB编码。因此，在某个实施方式中，本发明的生物体或微生物是具有降低的水平和/或活性的tesB基因的基因产物的大肠杆菌。tesB基因的核酸序列提供于SEQ ID NO:41中。在某些实施方式中，如SEQ IDNO:41所示的核酸序列可以在根据本发明的生物体或微生物中缺失。在某些实施方式中，与如SEQ ID NO:41所示的核酸序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的序列同一性的核酸序列可以在根据本发明的生物体或微生物中缺失。在某些实施方式中，如SEQID NO:41所示的核酸序列的一部分可以在根据本发明的生物体或微生物中缺失。也就是说，包含如SEQ ID NO:41所示的核酸序列的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、100个、150个、200个、250个、300个、400个、500个、600个、700个、800个核苷酸的连续段可以在本发明的生物体或微生物中缺失。
来自大肠杆菌的tesB(SEQ ID NO:41)：
另一种酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)由基因fadM在大肠杆菌中编码。因此，在某个实施方式中，本发明的生物体或微生物是具有降低的水平和/或活性的fadM基因的基因产物的大肠杆菌。fadM基因的核酸序列提供于SEQ ID NO:42中。在某些实施方式中，如SEQ ID NO:42所示的核酸序列可以在根据本发明的生物体或微生物中缺失。在某些实施方式中，与如SEQ ID NO:42所示的核酸序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的序列同一性的核酸序列可以在根据本发明的生物体或微生物中缺失。在某些实施方式中，如SEQ ID NO:42所示的核酸序列的一部分可以在根据本发明的生物体或微生物中缺失。也就是说，包含如SEQ ID NO:42所示的核酸序列的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、100个、150个、200个、250个、300个、350个核苷酸的连续段可以在本发明的生物体或微生物中缺失。
来自大肠杆菌的fadM(SEQ ID NO:42)：
在大肠杆菌中，1,4-二羟基-2-萘酰基-辅酶A水解酶(EC 3.1.2.28)由基因menI(也称为ydiI)编码。因此，在某个实施方式中，本发明的生物体或微生物是具有降低的水平和/或活性的menI基因的基因产物的大肠杆菌。menI基因的核酸序列提供于SEQ ID NO:43中。在某些实施方式中，如SEQ ID NO:43所示的核酸序列可以在根据本发明的生物体或微生物中缺失。在某些实施方式中，与如SEQ ID NO:43所示的核酸序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的序列同一性的核酸序列可以在根据本发明的生物体或微生物中缺失。在某些实施方式中，如SEQ ID NO:43所示的核酸序列的一部分可以在根据本发明的生物体或微生物中缺失。也就是说，包含如SEQ ID NO:43所示的核酸序列的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、100个、150个、200个、250个、300个、400个核苷酸的连续段可以在本发明的生物体或微生物中缺失。
来自大肠杆菌的menI(SEQ ID NO:43)：
如上文更详细描述的，降低根据本发明的重组生物体或微生物中由上述基因中的任何基因编码的酶的水平可以通过使所述基因的编码序列完全或部分缺失或通过缺失/修饰所述基因的一种或多种调控元件来实现。或者，在根据本发明的重组生物体或微生物中由上述基因中的任何基因编码的酶的活性可以通过向所述基因中引入失活突变或通过添加所述酶的抑制剂来降低。
减少巴豆酰辅酶A至巴豆酸的转化
代替用上述策略中的任何一种策略引导代谢通量远离巴豆酸，还可以通过直接减少从巴豆酰辅酶A至巴豆酸的代谢通量来减少重组生物体或微生物中巴豆酸的产生。例如，已知大肠杆菌中的硫酯水解酶YdiI可以将巴豆酰辅酶A转化成巴豆酸。
因此，优选的是将降低一种或多种可催化将巴豆酰辅酶A转化成巴豆酸的内源酶的表达水平和/或活性。
也就是说，本发明涉及根据本发明的重组生物体或微生物，其中巴豆酰辅酶A至巴豆酸的转化减少是由于所述生物体或微生物中硫酯水解酶(EC 3.1.2)的水平降低和/或活性降低。
也就是说，重组生物体或微生物可以具有降低水平的任何能够将巴豆酰辅酶A转化成巴豆酸的EC 3.1.2.-类的酶。替代地或另外，可以在重组生物体或微生物中降低任何能够将巴豆酰辅酶A转化成巴豆酸的EC 3.1.2.-类的酶的活性。
在具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的重组生物体或微生物，其中硫酯水解酶(EC 3.1.2)是棕榈酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.2)、酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)或1,4-二羟基-2-萘酰基-辅酶A水解酶(EC 3.1.2.28)。
优选地，所述重组生物体或微生物具有降低的水平和/或降低的活性的酶YdiI(MenI)。因此，在某个实施方式中，本发明的生物体或微生物是具有降低的水平和/或活性的menI基因的基因产物的大肠杆菌。menI基因的核酸序列提供于SEQ ID NO:42中。在某些实施方式中，如SEQ ID NO:42所示的核酸序列可以在根据本发明的生物体或微生物中缺失。在某些实施方式中，与如SEQ ID NO:42所示的核酸序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的序列同一性的核酸序列可以在根据本发明的生物体或微生物中缺失。在某些实施方式中，如SEQ ID NO:42所示的核酸序列的一部分可以在根据本发明的生物体或微生物中缺失。也就是说，包含如SEQ ID NO:42所示的核酸序列的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、100个、150个、200个、250个、300个、400个核苷酸的连续段可以在本发明的生物体或微生物中缺失。
在另一优选实施方式中，本发明的生物体或微生物是具有降低的水平和/或活性的yciA基因的基因产物的大肠杆菌。yciA基因的核酸序列提供于SEQ ID NO:39中。在某些实施方式中，如SEQ ID NO:39所示的核酸序列可以在根据本发明的生物体或微生物中缺失。在某些实施方式中，与如SEQ ID NO:39所示的核酸序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的序列同一性的核酸序列可以在根据本发明的生物体或微生物中缺失。在某些实施方式中，如SEQ ID NO:39所示的核酸序列的一部分可以在根据本发明的生物体或微生物中缺失。也就是说，包含如SEQ ID NO:39所示的核酸序列的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、100个、150个、200个、250个、300个、350个核苷酸的连续段可以在本发明的生物体或微生物中缺失。
在又一优选实施方式中，本发明的生物体或微生物是具有降低的水平和/或活性的tesB基因的基因产物的大肠杆菌。tesB基因的核酸序列提供于SEQ ID NO:41中。在某些实施方式中，如SEQ ID NO:41所示的核酸序列可以在根据本发明的生物体或微生物中缺失。在某些实施方式中，与如SEQ ID NO:41所示的核酸序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的序列同一性的核酸序列可以在根据本发明的生物体或微生物中缺失。在某些实施方式中，如SEQ ID NO:41所示的核酸序列的一部分可以在根据本发明的生物体或微生物中缺失。也就是说，包含如SEQ ID NO:41所示的核酸序列的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、100个、150个、200个、250个、300个、400个、500个、600个、700个、800个核苷酸的连续段可以在本发明的生物体或微生物中缺失。
必须指出的是，硫酯水解酶的活性在某些生产过程中是必不可少的。例如，硫酯水解酶YdiI(MenI)通常用于从乙酰辅酶A产生异丁烯。然而，其他过程，例如1,3-丁二烯的生产，不需要硫酯水解酶活性来如异丁烯生产一样将3-甲基巴豆酰辅酶A转化成3-甲基巴豆酸。例如，降低YdiI(MenI)的水平和/或活性可以允许减少用于例如生产1,3-丁二烯的重组生物体或微生物中的巴豆酸库。因此，应当理解的是，通过减少巴豆酰辅酶A至巴豆酸的转化来减少重组生物体或微生物中的巴豆酸库是任选的，并且可以仅应用于不需要表达用于将3-甲基巴豆酰辅酶A转化成3-甲基巴豆酸的硫酯水解酶(例如YdiI)的重组生物体或微生物中。
替代地或另外，可以降低另外的硫酯水解酶的水平和/或活性。例如，如本文其他地方所公开的，可以降低大肠杆菌硫酯水解酶PaaY(由SEQ ID NO:36编码)、PaaI(由SEQ IDNO:37编码)、TesA(由SEQ ID NO:38编码)、YciA(由SEQ ID NO:39编码)、EntH(由SEQ IDNO:40编码)、TesB(由SEQ ID NO:41编码)或FadM(由SEQ ID NO:42编码)的水平和/或活性。
在某些实施方式中，通过降低内源硫酯水解酶(EC 3.1.2)，特别是内源棕榈酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.2)、酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)和/或1,4-二羟基-2-萘酰基-辅酶A水解酶(EC 3.1.2.28)的水平和/或活性，来减少巴豆酰辅酶A至巴豆酸的转化和/或巴豆酰基-[酰基载体蛋白]至巴豆酸的转化。
在某些实施方式中，本发明涉及一种重组生物体或微生物，其特征在于降低的水平和/或活性的内源硫酯水解酶(EC 3.1.2)，优选地其中所述内源硫酯水解酶(EC 3.1.2)是棕榈酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.2)、酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)和/或1,4-二羟基-2-萘酰基-辅酶A水解酶(EC 3.1.2.28)，优选地其中所述内源性硫酯水解酶(EC 3.1.2)是酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)。在某些实施方式中，内源硫酯水解酶(EC 3.1.2)是yciA(SEQ ID NO:39)或其同源物。在某些实施方式中，内源硫酯水解酶(EC 3.1.2)是tesB(SEQID NO:41)或其同源物。
应当理解的是，所述酶的水平和/或活性将与本发明的重组生物体或微生物所来源于的生物体或微生物中的水平和/或活性进行比较。可以如本文所述实现酶的水平和/或活性的降低。在某些实施方式中，编码酶的内源核酸被部分或完全缺失或替换。在某些实施方式中，通过在编码所述酶的核酸中引入一个或多个突变来降低内源酶的活性。在某些实施方式中，重组生物体或微生物是能够产生3-甲基巴豆酸和/或异丁烯的生物体，例如本文所公开的生物体中的任何一种生物体。此外，重组生物体或微生物可包含导致巴豆酸库减少的一种或多种附加修饰，如本文所述。
在某些实施方式中，本发明的重组生物体或微生物具有降低的水平和/或活性的一种或多种内源硫酯水解酶(EC 3.1.2)、特别是内源棕榈酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.2)、酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)和/或1,4-二羟基-2-萘酰基-辅酶A水解酶(EC 3.1.2.28)；以及一种或多种附加修饰，所述一种或多种附加修饰导致
(i)巴豆酰辅酶A至丁酰辅酶A的转化增加；和/或丁酰辅酶A至丁酸的转化增加；
(ii)巴豆酰辅酶A至3-羟基丁酰辅酶A的转化增加；和/或3-羟基丁酰辅酶A至3-羟基丁酸的转化增加；
(iii)巴豆酰基-[酰基载体蛋白]至丁酰基[酰基载体蛋白]的转化增加；和/或
(iv)巴豆酸至巴豆酰辅酶A的转化增加；
如本文所述。
也就是说，在某些实施方式中，本发明的重组生物体或微生物包含：
a)降低的水平和/或活性的一种或多种内源硫酯水解酶(EC 3.1.2)、特别是内源棕榈酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2)、酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.2)和/或1,4-二羟基-2-萘酰基-辅酶A水解酶(EC 3.1.2.28)；以及
b)增加的水平和/或活性的一种或多种能够还原碳-碳双键的NADH或NADPH依赖性酶(EC 1.3.1)和/或能够还原碳-碳双键的黄素依赖性酶(EC 1.3.8)，特别地其中所述能够还原碳-碳双键的NADH或NADPH依赖性酶(EC 1.3.1)是巴豆酰辅酶A还原酶(EC 1.3.1.86)、反式-2-烯酰基辅酶A还原酶(EC 1.3.1.44)或烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(EC1.3.1.9)，并且其中所述能够还原碳-碳双键的黄素依赖性酶(EC 1.3.8)是短链酰基辅酶A脱氢酶(EC 1.3.8.1)。
在优选的实施方式中，本发明的重组生物体或微生物包含：
a)降低的水平和/或活性的酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)；以及
b)增加的水平和/或活性的反式-2-烯酰基辅酶A还原酶(EC 1.3.1.44)和/或烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(EC 1.3.1.9)。
在特别优选的实施方式中，本发明的重组生物体或微生物来源于大肠杆菌并且包含：
a)降低的水平和/或活性的酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)，其中所述酰基辅酶A硫酯酶2是来自大肠杆菌的YciA或TesB；以及
b)增加的水平和/或活性的反式-2-烯酰基辅酶A还原酶(EC 1.3.1.44)和/或烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(EC 1.3.1.9)。
优选地，反式-2-烯酰基辅酶A还原酶(EC 1.3.1.44)是来自齿垢密螺旋体的FabV或任何其他合适的反式-2-烯酰基辅酶A还原酶，并且烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(EC1.3.1.9)是来自大肠杆菌的FabI或任何其他合适的烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶。
在特别优选的实施方式中，本发明的重组生物体或微生物来源于大肠杆菌并且包含：
a)降低的水平和/或活性的酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)，优选地其中所述酰基辅酶A硫酯酶2是来自大肠杆菌的YciA；以及
b)增加的水平和/或活性的反式-2-烯酰基辅酶A还原酶(EC 1.3.1.44)和/或烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(EC 1.3.1.9)，优选地其中所述反式-2-烯酰基辅酶A还原酶(EC1.3.1.44)是来自齿垢密螺旋体的FabV并且其中所述烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(EC1.3.1.9)是来自大肠杆菌的FabI。
在特别优选的实施方式中，本发明的重组生物体或微生物来源于大肠杆菌并且包含：
a)降低的水平和/或活性的酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)，优选地其中所述酰基辅酶A硫酯酶2是来自大肠杆菌的YciA；以及
b)增加的水平和/或活性的反式-2-烯酰基辅酶A还原酶(EC 1.3.1.44)，优选地其中所述反式-2-烯酰基辅酶A还原酶(EC 1.3.1.44)是来自齿垢密螺旋体的FabV。
在特别优选的实施方式中，本发明的重组生物体或微生物来源于大肠杆菌并且包含：
a)降低的水平和/或活性的酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)，优选地其中所述酰基辅酶A硫酯酶2是来自大肠杆菌的TesB；以及
b)增加的水平和/或活性的反式-2-烯酰基辅酶A还原酶(EC 1.3.1.44)和/或烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(EC 1.3.1.9)，优选地其中所述反式-2-烯酰基辅酶A还原酶(EC1.3.1.44)是来自齿垢密螺旋体的FabV并且其中所述烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(EC1.3.1.9)是来自大肠杆菌的FabI。
在特别优选的实施方式中，本发明的重组生物体或微生物来源于大肠杆菌并且包含：
a)降低的水平和/或活性的酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)，优选地其中所述酰基辅酶A硫酯酶2是来自大肠杆菌的TesB；以及
b)增加的水平和/或活性的烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(EC 1.3.1.9)，优选地其中所述烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(EC 1.3.1.9)是来自大肠杆菌的FabI。
在某些实施方式中，所述重组生物体或微生物具有
a)降低的水平和/或活性的一种或多种内源硫酯水解酶(EC 3.1.2)、优选地内源棕榈酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.2)、酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)和/或1,4-二羟基-2-萘酰基-辅酶A水解酶(EC 3.1.2.28)，更优选地酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)；以及
b)增加的水平和/或活性的一种或多种水裂合酶(EC 4.2.1)，特别地其中所述水裂合酶(EC 4.2.1)是短链烯酰基辅酶A水合酶(EC 4.2.1.150)、3-羟基丁酰辅酶A脱水酶(EC 4.2.1.55)或烯酰辅酶A水合酶(EC 4.2.1.17)。
在某些实施方式中，本发明的重组生物体或微生物包含：
a)降低的水平和/或活性的一种或多种内源硫酯水解酶(EC 3.1.2)、优选地内源棕榈酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.2)、酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)和/或1,4-二羟基-2-萘酰基-辅酶A水解酶(EC 3.1.2.28)，更优选地酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)；以及
b)增加的水平和/或活性的一种或多种能够还原碳-碳双键的NADH或NADPH依赖性酶(EC 1.3.1)，特别地其中所述能够还原碳-碳双键的NADH或NADPH依赖性酶(EC 1.3.1)是烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(NADH依赖性)(EC 1.3.1.9)、烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(NADPH依赖性)(EC 1.3.1.104)、烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(NADPH依赖性、Re特异性)(EC 1.3.1.39)、烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(NADPH依赖性、Si特异性)(EC1.3.1.10)，和/或反式-2-烯酰基辅酶A还原酶(NAD+)(EC 1.3.1.44)。
在某些实施方式中，所述重组生物体或微生物具有
a)降低的水平和/或活性的一种或多种内源硫酯水解酶(EC 3.1.2)、优选地内源棕榈酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.2)、酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)和/或1,4-二羟基-2-萘酰基-辅酶A水解酶(EC 3.1.2.28)，更优选地酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)；以及
b)增加的水平和/或活性的一种或多种辅酶A转移酶(EC 2.8.3)，优选地其中所述辅酶A转移酶是乙酸辅酶A转移酶(EC 2.8.3.8)、酸性硫醇连接酶(EC 6.2.1)，优选地其中所述酸性硫醇连接酶(EC 6.2.1)是中链酰基辅酶A连接酶(EC 6.2.1.2)、苯甲酸酯辅酶A连接酶(EC 6.2.1.25)、4-羟基苯甲酸酯辅酶A连接酶(EC 6.2.1.27)、4-羟基丁酸酯辅酶A连接酶(EC 6.2.1.40)或巯基丙酸甲酯(MMPA)辅酶A(CoA)连接酶(EC 6.2.1.44)、酸性激酶(EC 2.7.2)，优选地其中所述酸性激酶(EC 2.7.2)是丁酸激酶(EC 2.7.2.7)、和/或磷酸酰基转移酶(EC 2.3.1)，优选地其中所述磷酸酰基转移酶(EC 2.3.1)是磷酸丁酰转移酶(EC2.3.1.19)。
直接将巴豆酸转化成巴豆酰辅酶A
上面已经讨论了减少巴豆酸代谢通量的策略。然而，根据本发明的重组生物体或微生物中的巴豆酸库也可以通过直接将巴豆酸转化成另一种分子来减少。例如，可以通过将巴豆酸转化成巴豆酰辅酶A来减少重组生物体或微生物中的巴豆酸库。然后所产生的巴豆酰辅酶A可以进一步转化成丁酰辅酶A或3-羟基丁酰辅酶A，如本文所讨论。
为了实现巴豆酸至巴豆酰辅酶A的转化，可以过表达编码有效地将巴豆酸转化成巴豆酰辅酶A的酶的基因。所述酶可以是如本文所讨论的异源酶或内源酶，并且可以进一步经遗传工程化以改善巴豆酸至巴豆酰辅酶A的转化。
在具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的重组生物体或微生物，其中所述巴豆酸至巴豆酰辅酶A的转化增加是由于所述生物体或微生物中辅酶A转移酶(EC 2.8.3)和/或酸性硫醇连接酶(EC 6.2.1)和/或酸性激酶(EC 2.7.2)和/或磷酸酰基转移酶(EC2.3.1)的水平和/或活性增加。
也就是说，所述重组生物体或微生物可以过表达任何能够将巴豆酸转化成巴豆酰辅酶A的EC 2.8.3类、6.2.1类、2.3.1类和/或2.7.2类的酶。
在具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的重组生物体或微生物，其中辅酶A转移酶(EC 2.8.3)是乙酸辅酶A转移酶或(EC 2.8.3.8)。
催化将巴豆酸转化成巴豆酰辅酶A的酶可以是任何有效催化将巴豆酸转化成巴豆酰辅酶A的EC 2.8.3类的酶。然而，在优选实施方式中，辅酶A转移酶可以是乙酸辅酶A转移酶或丁酰辅酶A:乙酸辅酶A转移酶(EC 2.8.3.8)。
在某些实施方式中，催化将巴豆酸转化成巴豆酰辅酶A的酶可以是乙酸辅酶A转移酶(EC 2.8.3.8)。乙酸辅酶A转移酶的非限制性示例是来自钩虫贪铜菌(Cupriavidusnecator)的YdiF(Pct)。然而，乙酸辅酶A转移酶已在其他生物体中描述。来自钩虫贪铜菌的YdiF(Pct)的氨基酸序列(Uniprot登录号：Q0K874)如SEQ ID NO:9所示。
在某些实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码与SEQ ID NO:9所示的多肽具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多肽的核酸序列。在其他实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码具有源自SEQ ID NO:9所示的多肽的至少100个、200个、300个、400个或500个氨基酸的连续段的核酸序列。
在某些实施方式中，催化将巴豆酸转化成巴豆酰辅酶A的酶可以是丁酸:乙酰辅酶A转移酶(EC 2.8.3.8)。丁酸:乙酰辅酶A转移酶的非限制性示例是来自沃氏共养单胞菌沃氏亚种的Swol_1932和Swol_0436。然而，丁酸:乙酰辅酶A转移酶已在其他生物体中描述。来自沃氏共养单胞菌沃氏亚种的Swol_1932的氨基酸序列(Uniprot登录号：Q0AVM5)如SEQ IDNO:10所示。来自沃氏共养单胞菌沃氏亚种的Swol_0436的氨基酸序列(Uniprot登录号：Q0AZT0)如SEQ ID NO:11所示。
在某些实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11所示的多肽具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多肽的核酸序列。在其他实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码具有源自SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11所示的多肽的至少100个、200个、300个、350个或400个氨基酸的连续段的核酸序列。
在具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的重组生物体或微生物，其中所述酸性硫醇连接酶(EC 6.2.1)是中链酰基辅酶A连接酶(EC 6.2.1.2)、苯甲酸酯辅酶A连接酶(EC 6.2.1.25)、4-羟基苯甲酸酯辅酶A连接酶(EC 6.2.1.27)、4-羟基丁酸酯辅酶A连接酶(EC 6.2.1.40)、或巯基丙酸甲酯(MMPA)辅酶A(CoA)连接酶(EC 6.2.1.44)。
催化将巴豆酸转化成巴豆酰辅酶A的酶可以是任何有效催化将巴豆酸转化成巴豆酰辅酶A的EC 6.2.1类的酶。然而，在优选的实施方式中，酸性硫醇连接酶可以是中链酰基辅酶A连接酶(EC 6.2.1.2)、苯甲酸酯辅酶A连接酶(EC 6.2.1.25)、4-羟基苯甲酸酯辅酶A连接酶(EC 6.2.1.27)、4-羟基丁酸酯辅酶A连接酶(EC 6.2.1.40)、或巯基丙酸甲酯(MMPA)辅酶A(CoA)连接酶(EC 6.2.1.44)。
在某些实施方式中，催化将巴豆酸转化成巴豆酰辅酶A的酶可以是4-羟基苯甲酸酯辅酶A连接酶/苯甲酸酯辅酶A连接酶(EC 6.2.1.25和EC 6.2.1.27)。4-羟基苯甲酸酯辅酶A连接酶/苯甲酸酯辅酶A连接酶(EC 6.2.1.25和EC 6.2.1.27)的非限制性示例由来自酸养互营菌(Syntrophus aciditrophicus)(菌株SB)的基因SYN_02896编码。由来自酸养互营菌(菌株SB)的基因SYN_02896编码的4-羟基苯甲酸酯辅酶A连接酶/苯甲酸酯辅酶A连接酶(EC 6.2.1.25和EC 6.2.1.27)的氨基酸序列(Uniprot登录号：Q2LRH0)如SEQ ID NO:55所示。
来自酸养互营菌(菌株SB)的SYN_02896(SEQ ID NO:55)：
在某些实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码与SEQ ID NO:55所示的多肽具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多肽的核酸序列。在其他实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码具有源自SEQ ID NO:55所示的多肽的至少200个、300个、400个或500个氨基酸的连续段的核酸序列。
4-羟基苯甲酸酯辅酶A连接酶/苯甲酸酯辅酶A连接酶(EC 6.2.1.25和EC6.2.1.27)的另一非限制性示例由来自酸养互营菌(菌株SB)的基因SYN_02898编码。由来自酸养互营菌(菌株SB)的基因SYN_02898编码的4-羟基苯甲酸酯辅酶A连接酶/苯甲酸酯辅酶A连接酶(EC 6.2.1.25和EC 6.2.1.27)的氨基酸序列(Uniprot登录号：Q2LRH7)如SEQ IDNO:56所示。
来自酸养互营菌(菌株SB)的SYN_02898(SEQ ID NO:56)：
在某些实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码与SEQ ID NO:56所示的多肽具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多肽的核酸序列。在其他实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码具有源自SEQ ID NO:56所示的多肽的至少200个、300个、400个或500个氨基酸的连续段的核酸序列。
在某些实施方式中，催化将巴豆酸转化成巴豆酰辅酶A的酶可以是中链酰基辅酶A连接酶(EC 6.2.1.2)。所述中链酰基辅酶A连接酶(EC 6.2.1.2)的非限制性示例由来自铜绿假单胞菌的基因PA3924编码。由来自铜绿假单胞菌的基因PA3924编码的中链酰基辅酶A连接酶(EC 6.2.1.2)的氨基酸序列(Uniprot登录号：Q9HX89)如SEQ ID NO:57所示。
来自铜绿假单胞菌的PA3924(SEQ ID NO:57)：
在某些实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码与SEQ ID NO:57所示的多肽具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多肽的核酸序列。在其他实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码具有源自SEQ ID NO:57所示的多肽的至少200个、300个、400个或500个氨基酸的连续段的核酸序列。
在某些实施方式中，催化将巴豆酸转化成巴豆酰辅酶A的酶可以是4-羟基丁酸酯辅酶A连接酶(EC 6.2.1.40)。所述4-羟基丁酸酯辅酶A连接酶(EC 6.2.1.40)的非限制性示例由来自嗜中性热棒菌(嗜中性热变形菌)的基因Tneu_0420编码。由来自嗜中性热棒菌的基因Tneu_0420编码的4-羟基丁酸酯辅酶A连接酶的氨基酸序列(Uniprot登录号：B1YBY4)如SEQ ID NO:44所示。
来自嗜中性热棒菌的Tneu_0420(SEQ ID NO:44)：
在某些实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码与SEQ ID NO:44所示的多肽具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多肽的核酸序列。在其他实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码具有源自SEQ ID NO:44所示的多肽的至少200个、300个、400个、500个或600个氨基酸的连续段的核酸序列。
在某些实施方式中，催化将巴豆酸转化成巴豆酰辅酶A的酶可以是巯基丙酸甲酯(MMPA)辅酶A(CoA)连接酶(EC 6.2.1.44)。巯基丙酸甲酯(MMPA)辅酶A(CoA)连接酶的非限制性示例由以下基因编码：来自遍在远洋杆菌(Pelagibacter ubique)的基因SAR11_0248、来自帕氏鲁杰氏菌(Ruegeria pomeroyi)的SPO0677、来自帕氏鲁杰氏菌的SPO2045、来自蓝湖鲁杰氏菌(Ruegeria lacuscaerulensis)的SL1157_1815、来自蓝湖鲁杰氏菌的SL1157_2728、来自铜绿假单胞菌的PA4198或来自泰国伯克霍尔德氏菌(Burkholderiathailandensis)的BTH_I2141。
由来自遍在远洋杆菌的基因SAR11_0248编码的巯基丙酸甲酯(MMPA)辅酶A(CoA)连接酶的氨基酸序列(Uniprot登录号：Q4FP19)如SEQ ID NO:45所示。
由来自帕氏鲁杰氏菌的基因SPO0677编码的巯基丙酸甲酯(MMPA)辅酶A(CoA)连接酶的氨基酸序列(Uniprot登录号：Q5LVM3)如SEQ ID NO:46所示。
由来自帕氏鲁杰氏菌的基因SPO2045编码的巯基丙酸甲酯(MMPA)辅酶A(CoA)连接酶的氨基酸序列(Uniprot登录号：Q5LRT0)如SEQ ID NO:47所示。
由来自蓝湖鲁杰氏菌的基因SL1157_1815编码的巯基丙酸甲酯(MMPA)辅酶A(CoA)连接酶的氨基酸序列(Uniprot登录号：D0CV95)如SEQ ID NO:48所示。
由来自蓝湖鲁杰氏菌的基因SL1157_2728编码的巯基丙酸甲酯(MMPA)辅酶A(CoA)连接酶的氨基酸序列(Uniprot登录号：D0CPY8)如SEQ ID NO:49所示。
由来自铜绿假单胞菌的基因PA4198编码的巯基丙酸甲酯(MMPA)辅酶A(CoA)连接酶的氨基酸序列(Uniprot登录号：Q9HWI3)如SEQ ID NO:50所示。
由来自泰国伯克霍尔德氏菌的基因BTH_I2141编码的巯基丙酸甲酯(MMPA)辅酶A(CoA)连接酶的氨基酸序列(Uniprot登录号：Q2SWN7)如SEQ ID NO:51所示。
来自遍在远洋杆菌的SAR11_0248(SEQ ID NO:45)：
来自帕氏鲁杰氏菌的SPO0677(SEQ ID NO:46)：
来自帕氏鲁杰氏菌的SPO2045(SEQ ID NO:47)：
来自蓝湖鲁杰氏菌的SL1157_1815(SEQ ID NO:48)：
来自蓝湖鲁杰氏菌的SL1157_2728(SEQ ID NO:49)：
来自铜绿假单胞菌的PA4198(SEQ ID NO:50)：
来自泰国伯克霍尔德氏菌的BTH_I2141(SEQ ID NO:51)：
在某些实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码与SEQ ID NO:45至SEQ ID NO:51所示的多肽具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多肽的核酸序列。在其他实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码具有源自SEQ ID NO:45至SEQ ID NO:51所示的多肽中的任一多肽的至少100个、200个、300个、400个或500个氨基酸的连续段的核酸序列。
在具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的重组生物体或微生物，其中所述磷酸酰基转移酶(EC 2.3.1)是磷酸丁酰转移酶(EC 2.3.1.19)和/或其中所述酸性激酶(EC2.7.2)是丁酸激酶(EC 2.7.2.7)。
催化将巴豆酸转化成巴豆酰辅酶A的酶可以是任何有效催化将巴豆酸转化成巴豆酰辅酶A的EC 2.3.1类和2.7.2类的酶或酶组合。也就是说，巴豆酸至巴豆酰辅酶A的转化可以由具有磷酸酰基转移酶和酸激酶活性的单一酶催化。或者，巴豆酸至巴豆酰辅酶A的转化可以通过磷酸酰基转移酶和酸性激酶的组合来催化。在优选的实施方式中，磷酸酰基转移酶(EC 2.3.1)可以是磷酸丁酰转移酶(EC 2.3.1.19)并且酸性激酶(EC 2.7.2)可以是丁酸激酶(EC 2.7.2.7)。
在某些实施方式中，参与巴豆酸至巴豆酰辅酶A的转化的酶可以是磷酸丁酰转移酶(EC 2.3.1.19)。磷酸丁酰转移酶的非限制性示例是来自丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)的Ptb。然而，磷酸酰基转移酶已在其他生物体中描述。来自丙酮丁醇梭菌的Ptb的氨基酸序列(Uniprot登录号：P58255)如SEQ ID NO:15所示。
在某些实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码与SEQ ID NO:15所示的多肽具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多肽的核酸序列。在其他实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码具有源自SEQ ID NO:15所示的多肽的至少50个、100个、150个、200个或250个氨基酸的连续段的核酸序列。
在某些实施方式中，参与巴豆酸至巴豆酰辅酶A的转化的酶可以是丁酸激酶(EC2.7.2.7)。丁酸激酶的非限制性示例是来自丙酮丁醇梭菌的Buk。然而，丁酸激酶已在其他生物体中描述。来自丙酮丁醇梭菌的Buk的氨基酸序列(Uniprot登录号：Q45829)如SEQ IDNO:16所示。
在某些实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码与SEQ ID NO:16所示的多肽具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多肽的核酸序列。在其他实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物包含编码具有源自SEQ ID NO:16所示的多肽的至少100个、150个、200个、250个或300个氨基酸的连续段的核酸序列。
在某些实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物编码磷酸酰基转移酶和酸性激酶。在某些实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物编码磷酸丁酰转移酶和丁酸激酶。在某些实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物编码来自丙酮丁醇梭菌的Ptb和Buk或上文已定义的其任何序列变体或衍生物。
在某些实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物的特征在于巴豆酸至巴豆酰辅酶A的转化增加，优选地通过上文所公开的策略中的任何策略，以及通过增加巴豆酰辅酶A至丁酰辅酶A和/或3-羟基丁酰辅酶A的转化。
也就是说，在某些实施方式中，本发明的重组生物体或微生物包含：
a)增加的水平和/或活性的一种或多种辅酶A转移酶(EC 2.8.3)，优选地其中所述辅酶A转移酶是乙酸辅酶A转移酶(EC 2.8.3.8)、酸性硫醇连接酶(EC 6.2.1)，优选地其中所述酸性硫醇连接酶(EC 6.2.1)是中链酰基辅酶A连接酶(EC 6.2.1.2)、苯甲酸酯辅酶A连接酶(EC 6.2.1.25)、4-羟基苯甲酸酯辅酶A连接酶(EC 6.2.1.27)、4-羟基丁酸酯辅酶A连接酶(EC 6.2.1.40)或巯基丙酸甲酯(MMPA)辅酶A(CoA)连接酶(EC 6.2.1.44)、酸性激酶(EC 2.7.2)，优选地其中所述酸性激酶(EC 2.7.2)是丁酸激酶(EC 2.7.2.7)、和/或磷酸酰基转移酶(EC 2.3.1)，优选地其中所述磷酸酰基转移酶(EC 2.3.1)是磷酸丁酰转移酶(EC2.3.1.19)；以及
b)增加的水平和/或活性的一种或多种能够还原碳-碳双键的NADH或NADPH依赖性酶(EC 1.3.1)和/或能够还原碳-碳双键的黄素依赖性酶(EC 1.3.8)，优选地其中所述能够还原碳-碳双键的NADH或NADPH依赖性酶(EC 1.3.1)是巴豆酰辅酶A还原酶(EC 1.3.1.86)、反式-2-烯酰基辅酶A还原酶(EC 1.3.1.44)或烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(EC1.3.1.9)，并且其中所述能够还原碳-碳双键的黄素依赖性酶(EC 1.3.8)是短链酰基辅酶A脱氢酶(EC 1.3.8.1)。
在另一实施方式中，本发明的重组生物体或微生物包含：
a)增加的水平和/或活性的一种或多种辅酶A转移酶(EC 2.8.3)，优选地其中所述辅酶A转移酶是乙酸辅酶A转移酶(EC 2.8.3.8)、酸性硫醇连接酶(EC 6.2.1)，优选地其中所述酸性硫醇连接酶(EC 6.2.1)是中链酰基辅酶A连接酶(EC 6.2.1.2)、苯甲酸酯辅酶A连接酶(EC 6.2.1.25)、4-羟基苯甲酸酯辅酶A连接酶(EC 6.2.1.27)、4-羟基丁酸酯辅酶A连接酶(EC 6.2.1.40)或巯基丙酸甲酯(MMPA)辅酶A(CoA)连接酶(EC 6.2.1.44)、酸性激酶(EC 2.7.2)，优选地其中所述酸性激酶(EC 2.7.2)是丁酸激酶(EC 2.7.2.7)、和/或磷酸酰基转移酶(EC 2.3.1)，优选地其中所述磷酸酰基转移酶(EC 2.3.1)是磷酸丁酰转移酶(EC2.3.1.19)；以及
b)增加的水平和/或活性的一种或多种水裂合酶(EC 4.2.1)，优选地其中所述水裂合酶(EC 4.2.1)是短链烯酰基辅酶A水合酶(EC 4.2.1.150)、3-羟基丁酰辅酶A脱水酶(EC 4.2.1.55)或烯酰辅酶A水合酶(EC 4.2.1.17)。
在某些实施方式中，根据本发明的重组生物体或微生物的特征在于巴豆酸至巴豆酰辅酶A的转化增加，优选地通过上文所公开的策略中的任何策略，以及通过减少巴豆酰辅酶A至巴豆酸的转化。
也就是说，在某些实施方式中，本发明的重组生物体或微生物包含：
a)增加的水平和/或活性的一种或多种辅酶A转移酶(EC 2.8.3)，优选地其中所述辅酶A转移酶是乙酸辅酶A转移酶(EC 2.8.3.8)、酸性硫醇连接酶(EC 6.2.1)，优选地其中所述酸性硫醇连接酶(EC 6.2.1)是中链酰基辅酶A连接酶(EC 6.2.1.2)、苯甲酸酯辅酶A连接酶(EC 6.2.1.25)、4-羟基苯甲酸酯辅酶A连接酶(EC 6.2.1.27)、4-羟基丁酸酯辅酶A连接酶(EC 6.2.1.40)或巯基丙酸甲酯(MMPA)辅酶A(CoA)连接酶(EC 6.2.1.44)、酸性激酶(EC 2.7.2)，优选地其中所述酸性激酶(EC 2.7.2)是丁酸激酶(EC 2.7.2.7)、和/或磷酸酰基转移酶(EC 2.3.1)，优选地其中所述磷酸酰基转移酶(EC 2.3.1)是磷酸丁酰转移酶(EC2.3.1.19)；以及
b)降低的水平和/或活性的一种或多种内源硫酯水解酶(EC 3.1.2)，优选地其中所述内源硫酯水解酶(EC 3.1.2)是内源棕榈酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.2)、酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)和/或1,4-二羟基-2-萘酰基-辅酶A水解酶(EC 3.1.2.28)，更优选地其中所述内源硫酯水解酶(EC 3.1.2)是酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)。
乙酰辅酶A至异丁烯的酶促转化
在本发明中，优选的是生物体或微生物能够产生异丁烯，优选地从乙酰辅酶A产生异丁烯。如上所述，巴豆酸已经令人惊讶地被鉴定为抑制通过阿魏酸脱羧酶将3-甲基巴豆酸转化成异丁烯，尽管其3-甲基巴豆酸脱羧酶活性以及底物巴豆酸和3-甲基巴豆酸的结构之间的非常接近性得到了广泛的进化和改进。
已经描述了用于经由3-甲基巴豆酸从3-甲基巴豆酰辅酶A生产异丁烯或经由3-甲基巴豆酸从3-羟基异戊酸盐(HIV)生产异丁烯的方法(概述参见图1)。利用这些途径和酶促转化的方法以及重组生物体和微生物尤其描述于WO 2017/085167、WO 2018/206262和WO2020/188033中。
在下文中，更详细地描述了如分别在现有技术WO 2017/085167、WO 2018/206262、WO2010/001078、WO2012/052427和WO 2016/042012中所述并且如图1示意性所示的个别酶促转化的主要反应。
然而，本发明不限于这些主要反应，还涉及如现有技术文件WO 2017/085167、WO2018/206262、WO2010/001078、WO2012/052427和WO 2016/042012中所述的用于将乙酰辅酶A转化成异丁烯的个别步骤的所有其他路线。这些文件的公开内容，特别是关于用于这些文件中所述的途径的个别转化的酶的优选实施方式的公开内容，全文以引用方式并入。因此，在优选的实施方式中，优选的是结合相应的酶促转化使用选自这些现有技术文件中所述的优选实施方式的酶。因此，这同样适用于如下所述的本发明的酶促转化，如已经分别在WO2017/085167、WO 2018/206262、WO2010/001078、WO2012/052427和WO 2016/042012中所阐述的。
乙酰辅酶A至乙酰乙酰辅酶A的酶促转化
根据本发明，乙酰辅酶A至乙酰乙酰辅酶A的转化可以通过不同的途径实现。一种可能性是首先将乙酰辅酶A转化成丙二酰辅酶A(如图1所示的步骤XIV)，然后进一步将所述丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A缩合成乙酰乙酰辅酶A(如图1所示的步骤XV)。另一种可能性是在单个酶促反应中直接将两个乙酰辅酶A分子缩合成乙酰乙酰辅酶A(如图1所示的步骤XIII)。
乙酰辅酶A至丙二酰辅酶A的酶促转化优选地使用乙酰辅酶A羧化酶(EC 6.4.1.2)(如图1中所示的步骤XIV)。这种自然发生的反应利用ATP将CO2固定在乙酰辅酶A上，从而产生丙二酰辅酶A。
此外，丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A酶促缩合成所述乙酰乙酰辅酶A优选地使用乙酰乙酰辅酶A合酶(EC 2.3.1.194)(如图1所示的步骤XV)。这是一种自然发生的反应，并且在脱羧反应中缩合丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A。
或者，乙酰辅酶A酶促转化成所述乙酰乙酰辅酶A由单一酶促反应组成，在所述单一酶促反应中通过将两个乙酰辅酶A分子酶促缩合成乙酰乙酰辅酶A，乙酰辅酶A直接转化成乙酰乙酰辅酶A。优选地，这种酶促转化是通过利用乙酰辅酶A乙酰基转移酶(EC2.3.1.9)来实现的。这种反应是自然发生的反应(如图1所示的步骤XIII)。
乙酰乙酰辅酶A至3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A的酶促转化
乙酰乙酰辅酶A至3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A的酶促转化是将乙酰乙酰辅酶A和乙酰辅酶A酶促缩合成所述3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(参见图1的步骤IX)。
这种缩合优选地使用3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶(也称为HMG-辅酶A合酶)。HMG-辅酶A合酶被分类为EC 2.3.3.10(以前，HMG-辅酶A合酶已被分类为EC 4.1.3.5，但已转移至EC 2.3.3.10)。术语“HMG-辅酶A合酶”是指能够催化其中乙酰辅酶A与乙酰乙酰辅酶A缩合以形成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-辅酶A)的反应的任何酶。HMG-辅酶A合酶是甲羟戊酸途径的一部分。已经确定了几种用于合成异戊烯焦磷酸酯(IPP)的途径，即甲羟戊酸途径和2-C-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸酯/1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸酯(MEP/DOXP)途径。HMG-辅酶A合酶催化乙酰辅酶A与乙酰乙酰辅酶A的生物克莱森缩合，并且是酰基缩合酶超家族的成员，所述酰基缩合酶超家族包括β-酮硫解酶、脂肪酸合酶(β-酮酰基载体蛋白合酶)和聚酮合酶。
3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A至3-甲基戊烯二酰辅酶A的酶促转化
3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A至3-甲基戊烯二酰辅酶A的酶促转化是天然发生的酶促脱水反应，并且其被例如分类为3-甲基戊二酰基-辅酶A水合酶(EC 4.2.1.18)的酶催化。因此3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A至3-甲基戊烯二酰辅酶A的酶促转化优选地利用3-甲基戊二酰基-辅酶A水合酶(EC 4.2.1.18)(如图1所示的步骤VIII)。
3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A至3-甲基戊烯二酰辅酶A的转化也可以通过利用3-羟基-3-甲基戊二酰基-辅酶A脱水酶活性来实现，所述脱水酶活性已在例如黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)中鉴定出并且其由liuC基因编码(Li等人，Angew.Chem.Int.Ed.52(2013),1304-1308)。来源于黄色粘球菌的3-羟基-3-甲基戊二酰基-辅酶A脱水酶的Uniprot登录号为Q1D5Y4。
3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A至3-甲基戊烯二酰辅酶A的酶促转化也可以通过使用3-羟基酰基-辅酶A脱水酶或烯酰辅酶A水合酶来实现。3-羟基酰基-辅酶A脱水酶和烯酰辅酶A水合酶催化相同的反应，与此同时这些酶中的一种酶的名称表示对应反应的一个方向，而另一个名称表示逆反应。由于反应是可逆的，因此两种酶名称都可以使用。3-羟基酰基-辅酶A脱水酶和烯酰辅酶A水合酶属于分类为EC 4.2.1的酶。
3-甲基戊烯二酰辅酶A至3-甲基巴豆酰辅酶A的酶促转化
3-甲基戊烯二酰辅酶A至3-甲基巴豆酰辅酶A的转化可以通过不同的酶催化，例如通过使用(i)甲基巴豆酰辅酶A羧基酶(EC 6.4.1.4)；或(ii)香叶酰辅酶A羧基酶(EC6.4.1.5)(如图1的步骤VII所示)。
在另一优选实施方式中，3-甲基戊烯二酰辅酶A经由脱羧转化成3-甲基巴豆酰辅酶A是由3-甲基戊烯二酰辅酶A，例如由liuB基因编码的黄色粘球菌的3-甲基戊烯二酰辅酶A脱羧酶催化的。这种基因编码具有两个亚基AibA和AibB的酶(Li等人，Angew.Chem.Int.Ed.52(2013),1304-1308)。
经由3-甲基巴豆酸将3-甲基巴豆酰辅酶A酶促转化成异丁烯
3-甲基巴豆酰辅酶A至3-甲基巴豆酸的转化可以例如以不同的方式实现，例如通过下文中描述且如图1中所示的三种替代酶促路线(如图1所示的步骤VIa、步骤VIb或步骤VIc)。
因此，3-甲基巴豆酰辅酶A至3-甲基巴豆酸的酶促转化可以通过以下方式实现：
(a)单一酶促反应，其中3-甲基巴豆酰辅酶A直接转化成3-甲基巴豆酸，优选通过使用辅酶A转移酶(EC 2.8.3.-)，优选地丙酸:乙酸-辅酶A转移酶(EC 2.8.3.1)、乙酸辅酶A转移酶(EC 2.8.3.8)或琥珀酰辅酶A:乙酸辅酶A转移酶(EC 2.8.3.18)(如图1所示的步骤VIa)；
(b)单一酶促反应，其中3-甲基巴豆酰辅酶A直接转化成3-甲基巴豆酸，优选地通过使用硫酯水解酶(EC 3.1.2)，优选地乙酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.1)、ADP依赖性短链酰基辅酶A水解酶(EC 3.1.2.18)或酰基辅酶A水解酶(EC 3.1.2.20)(如图1所示的步骤VIb)；或者
(c)两个酶促步骤，所述两个酶促步骤包括
(i)首先将3-甲基巴豆酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酰磷酸盐；以及
(ii)然后将由此获得的3-甲基巴豆酰磷酸盐酶促转化成所述3-甲基巴豆酸(如图1所示的步骤VIc)。
关于(c)，3-甲基巴豆酰辅酶A至3-甲基巴豆酸的酶促转化是通过两个酶促步骤实现的，所述两个酶促步骤包括(i)首先将3-甲基巴豆酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酰磷酸；以及(ii)然后将由此获得的3-甲基巴豆酰磷酸酶促转化成所述3-甲基巴豆酸。
3-甲基巴豆酰辅酶A至3-甲基巴豆酰磷酸盐的转化可以例如通过使用磷酸丁酰转移酶(EC 2.3.1.19)或磷酸乙酰转移酶(EC 2.3.1.8)来实现。
3-甲基巴豆酰磷酸盐至3-甲基巴豆酸的转化可以例如通过使用被分类为EC2.7.2.-的酶，即磷酸转移酶来实现。此类酶使用羧基作为受体。因此，3-甲基巴豆酰磷酸盐至3-甲基巴豆酸的转化可以例如通过使用具有羧基基团作为受体的酶(EC 2.7.2.-)来实现。在优选的实施方式中，3-甲基巴豆酰磷酸盐至3-甲基巴豆酸的转化通过使用丙酸激酶(EC 2.7.2.15)、乙酸激酶(EC 2.7.2.1)、丁酸激酶(EC 2.7.2.7)或支链脂肪酸激酶(EC2.7.2.14)来实现。
如上所述，3-甲基巴豆酰辅酶A至3-甲基巴豆酸的转化还可以通过两种替代转化来实现，其中3-甲基巴豆酰辅酶A直接转化成3-甲基巴豆酸。
优选地，在一个实施方式中，通过利用属于硫酯水解酶家族的酶(在下文中称为硫酯酶(EC 3.1.2.-))水解3-甲基巴豆酰辅酶A的硫酯键以形成3-甲基巴豆酸，将3-甲基巴豆酰辅酶A直接转化成3-甲基巴豆酸；如图1所示的步骤VIb。
硫酯酶(TE；也称为硫酯水解酶)是被分类为EC 3.1.2的酶。目前，硫酯酶被分类为EC 3.1.2.1至EC 3.1.2.30，而尚未分类/未分类的TE被分组为属于EC 3.1.2.-的酶。Cantu等人(Protein Science 19(2010),1281-1295)描述了存在在一级结构方面彼此无关的23个硫酯酶家族。然而，假设同一家族的所有成员具有基本上相同的三级结构。硫酯酶水解羰基基团与硫原子之间的硫酯键。
在优选的实施方式中，根据本发明用于将3-甲基巴豆酰辅酶A转化成3-甲基巴豆酸的硫酯酶选自由以下组成的组：
-乙酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.1)；
-棕榈酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.2)；
-3-羟基异丁酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.4)；
-油酰基-[酰基载体蛋白]水解酶(EC 3.1.2.14)；
-ADP依赖性短链酰基辅酶A水解酶(EC 3.1.2.18)；
-ADP依赖性中链酰基辅酶A水解酶(EC 3.1.2.19)；
-1,4-二羟基-2-萘酰基辅酶A水解酶(EC 3.1.2.28)；和
-酰基辅酶A水解酶(EC 3.1.2.20)。
在更优选的实施方式中，根据本发明使用的硫酯酶/硫酯水解酶(EC 3.1.2.-)是乙酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.1)、ADP依赖性短链酰基辅酶A水解酶(EC 3.1.2.18)、1,4-二羟基-2-萘酰基辅酶A水解酶(EC 3.1.2.28)和酰基辅酶A水解酶(EC 3.1.2.20)。
在替代实施方式中，3-甲基巴豆酰辅酶A被直接转化为3-甲基巴豆酸，优选地通过使用属于辅酶A转移酶家族的酶(EC 2.8.3.-)，所述酶能够将3-甲基巴豆酰辅酶A的辅酶A基团转移至羧酸(如图1所示的步骤VIa)。
辅酶A转移酶存在于所有血统的生物体中。大多数辅酶A转移酶属于两个众所周知的酶家族(在下文称为家族I和家族II)，并且存在已在细菌的厌氧代谢途径中鉴定出的第三家族。描述不同家族的评论可以在Heider(FEBS Letters 509(2001),345-349)中找到。
优选地，根据本发明用于将3-甲基巴豆酰辅酶A直接转化成3-甲基巴豆酸的辅酶A转移酶选自由以下组成的组：
-丙酸:乙酸-辅酶A转移酶(EC 2.8.3.1)；
-乙酸辅酶A转移酶(EC 2.8.3.8)；和
-丁酸乙酰乙酸辅酶A转移酶(EC 2.8.3.9)。
在更优选的实施方式中，辅酶A转移酶(EC 2.8.3.-)是丙酸:乙酸-辅酶A转移酶(EC 2.8.3.1)、乙酸辅酶A转移酶(EC 2.8.3.8)和琥珀酰辅酶A:乙酸辅酶A转移酶(EC2.8.3.18)。
表1和表2中列出了用于实现乙酰辅酶A至异丁烯的转化的示例性酶组合。
表1
表2
用于提供3-甲基巴豆酸的替代途径
如上所述，3-甲基巴豆酸(其然后进一步酶促转化成异丁烯，如下文进一步详细描述)可以通过以下方式从乙酰辅酶A酶促提供：将乙酰辅酶A酶促转化成乙酰乙酰辅酶A(如图1所示的步骤XIV、步骤XV，步骤XIII)、将乙酰乙酰辅酶A酶促转化成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(图1的步骤IX)、将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A酶促转化成3-甲基戊烯二酰辅酶A(图1的步骤VIII)、将3-甲基戊烯二酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酰辅酶A(图1的步骤VII)以及将3-甲基巴豆酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酸。
在替代途径中，根据本发明，3-甲基巴豆酸可以通过另一种可能的途径从乙酰辅酶A提供。在这种途径中，乙酰辅酶A被酶促转化成乙酰乙酰辅酶A，如上所述。
根据这种替代路线，乙酰乙酰辅酶A然后酶促转化成乙酰乙酸盐(图1的步骤Va或Vb)，乙酰乙酸盐进一步酶促转化成丙酮(图1的步骤IV)，丙酮进一步酶促转化成3-羟基异戊酸盐(HIV)(图1的步骤III)，所述3-羟基异戊酸盐然后进一步酶促转化成所述3-甲基巴豆酸。
下面更详细地描述了这种替代途径的个别酶促步骤。
乙酰乙酰辅酶A至乙酰乙酸盐的酶促转化
乙酰乙酰辅酶A至乙酰乙酸盐的转化可以通过两种不同的路线实现。一种可能性是通过将乙酰乙酰辅酶A的辅酶A硫酯水解为乙酰乙酸盐而将乙酰乙酰辅酶A转化成乙酰乙酸盐(如图1所示的步骤Va)。在另一更优选的方面中，乙酰乙酰辅酶A的辅酶A基团被转移到乙酸盐上，导致乙酰乙酸盐和乙酰辅酶A的形成(如图1所示的步骤Vb)。
如上所述，在一个方面中，乙酰乙酰辅酶A的辅酶A硫酯被水解以产生乙酰乙酸盐。根据本发明的这个方面，乙酰乙酰辅酶A至乙酰乙酸盐的酶促转化是通过优选地利用天然催化这种反应的乙酰乙酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.11)实现的。
如上所述，在另一种更优选的可能性中，乙酰乙酰辅酶A的辅酶A基团转移到乙酸盐上，从而导致乙酰乙酸盐和乙酰辅酶A的形成。根据本发明的这种可能性，乙酰乙酰辅酶A至乙酰乙酸盐的酶促转化是通过优选地利用能够将乙酰乙酰辅酶A的辅酶A基团转移到乙酸盐上的酶来实现的。
优选地，能够将乙酰乙酰辅酶A的辅酶A基团转移到乙酸盐上的酶属于辅酶A转移酶家族(EC 2.8.3.-)。
因此，本发明涉及一种通过使用能够将乙酰乙酰辅酶A的辅酶A基团转移到乙酸盐上的酶，优选地辅酶A转移酶(EC 2.8.3.-)将乙酰乙酰辅酶A酶促转化成乙酰乙酸盐的方法。可用于本发明的方法的催化将乙酰乙酰辅酶A转化成乙酰乙酸盐的酶的优选示例是被分类为乙酸辅酶A转移酶(EC 2.8.3.8)的酶。
乙酰乙酸盐至丙酮的酶促转化
乙酰乙酸盐至丙酮的转化示意性地示出在图1的步骤IV中。这种反应是脱羧反应并且是能够产生丙酮的生物体(即梭菌属(Clostridia)生物体)中自然发生的反应。根据本发明，乙酰乙酸盐至所述丙酮的转化优选地使用乙酰乙酸盐脱羧酶(EC 4.1.1.4)。
丙酮和乙酰辅酶A酶促缩合成3-羟基异戊酸盐(HIV)
丙酮和乙酰辅酶A缩合成所述3-羟基异戊酸盐(HIV)示意性地示出在图1的步骤III中。这种缩合优选地使用能够催化丙酮的桥氧基(即C＝O)基团的碳原子与乙酰辅酶A，特别是乙酰辅酶A的甲基之间共价键的形成的酶。根据这种反应方案，丙酮的桥氧基基团作为亲电试剂进行反应，并且乙酰辅酶A的甲基基团作为亲核试剂进行反应。
能够将丙酮和乙酰辅酶A酶促缩合成3-羟基异戊酸盐(HIV)的酶是本领域已知的并且已经例如描述于WO 2011/032934中。
优选地，用于将丙酮和乙酰辅酶A酶促缩合成3-羟基异戊酸盐(HIV)的酶是具有HMG辅酶A合酶(EC 2.3.3.10)和/或PksG蛋白的活性的酶和/或具有C-C键裂解/缩合裂解酶的活性的酶(优选地分类为异丙基苹果酸合酶(EC 2.3.3.13)、高柠檬酸合酶(EC2.3.3.14)或4-羟基-2-酮戊酸醛缩酶(EC 4.1.3.39)的酶)，例如HMG辅酶A裂解酶(EC4.1.3.4)。
3-羟基异戊酸盐(HIV)至3-甲基巴豆酸的酶促转化
3-羟基异戊酸盐(HIV)至3-甲基巴豆酸的酶促转化示意性地示出在图1的步骤II中。这种转化优选地利用催化β-羟基酸(即，例如，3-羟基异戊酸盐(HIV))脱水成α,β-不饱和酸(即，例如，3-甲基巴豆酸)的酶。术语“脱水”通常是指涉及H2O的去除的反应。优选地，此类酶属于氢水裂合酶家族(EC 4.2.-.-)。
被分类为EC 4.2.-.-(即水裂合酶)的此类酶的优选示例是：
乌头酸酶(EC 4.2.1.3)；
延胡索酸酶(EC 4.2.1.2)；和
烯酰辅酶A水合酶/脱水酶(EC 4.2.1.17)。
3-甲基巴豆酸至异丁烯的酶促转化
3-甲基巴豆酸至异丁烯的酶促转化示意性地示出在图1的步骤I中)。这种转化可以通过利用与FMN异戊二烯基转移酶相关联的异戊二烯化FMN依赖性脱羧酶进行脱羧来实现。“脱羧”通常是去除羧基基团并释放二氧化碳(CO2)的化学反应。
利用与FMN异戊二烯基转移酶相关联的异戊二烯化FMN依赖性脱羧酶将3-甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯依赖于由两种酶催化的两个连续步骤的反应，所述两种酶即异戊烯基化的FMN依赖性脱羧酶(催化将3-甲基巴豆酸至异丁烯的实际脱羧)以及提供经修饰的黄素辅因子的相关联的FMN异戊二烯基转移酶。
所述黄素辅因子可优选地是FMN或FAD。FMN(黄素单核苷酸；也称为核黄素-5'-磷酸盐)是一种由酶核黄素激酶从核黄素(维生素B2)产生的生物分子，并且用作各种反应的辅基。FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸)是一种参与代谢中的几个重要反应的氧化还原辅因子，更具体地辅基。
因此，在3-甲基巴豆酸至异丁烯的转化中，在第一步骤中，将黄素辅因子((FMN或FAD)修饰成(经修饰的)黄素衍生的辅因子。这种修饰由所述FMN异戊二烯基转移酶催化。FMN异戊二烯基转移酶将黄素辅因子(FMN或FAD)的黄素环异戊烯化为(经修饰的)异戊烯基化的黄素辅因子。更具体地，FMN异戊二烯基转移酶催化利用磷酸二甲基烯丙酯(DMAP)或焦磷酸二甲基烯丙酯(DMAPP)将黄素辅因子(FMN或FAD)异戊烯化成黄素衍生的辅因子。
在第二步骤中，3-甲基巴豆酸至异丁烯的实际转化由所述异戊烯基化的FMN依赖性脱羧酶经由基于1,3-偶极环加成的机制催化，其中所述异戊烯基化的FMN依赖性脱羧酶使用由相关联的FMN异戊二烯基转移酶提供的异戊烯基化的黄素辅因子(FMN或FAD)。
在优选的实施方式中，将黄素辅因子(FMN或FAD)修饰成(经修饰的)黄素衍生辅因子(利用磷酸二甲基烯丙酯(DMAP)或焦磷酸二甲基烯丙酯(DMAPP))的所述FMN异戊二烯基转移酶是苯基丙烯酸脱羧酶(PAD)型蛋白质，或密切相关的原核酶UbiX(一种参与原核生物中的泛醌生物合成的酶)。
在大肠杆菌中，蛋白质UbiX(也称为3-八异戊二烯基-4-羟基苯甲酸酯羧裂酶)已被证明参与泛醌生物合成的第三步骤。
在优选的实施方式中，黄素辅因子(FMN或FAD)修饰成对应的(经修饰的)黄素衍生辅因子由含有FMN的蛋白质苯丙烯酸脱羧酶(PAD)催化。参与将黄素辅因子(FMN或FAD)修饰为对应经修饰的黄素衍生辅因子的酶最初被注释为脱羧酶(EC 4.1.1.-)。一些苯基丙烯酸脱羧酶(PAD)现在被注释为黄素异戊二烯基转移酶EC 2.5.1.-。能够催化本文所述的黄素异戊二烯基转移酶的酶促反应的酶最近也被注释为黄素异戊二烯基转移酶EC 2.5.1.129。
在更优选的实施方式中，3-甲基巴豆酸至异丁烯的转化利用苯基丙烯酸脱羧酶(PAD)型蛋白质作为FMN异戊二烯基转移酶，所述FMN异戊二烯基转移酶将黄素辅因子(FMN或FAD)修饰成对应的(经修饰的)黄素衍生的辅因子，其中所述苯基丙烯酸脱羧酶(PAD)型蛋白质来源于白色念珠菌(Candida albicans)(Uniprot登录号Q5A8L8)、黑曲霉(Aspergillus niger)(Uniprot登录号A3F715)、酿酒酵母(Uniprot登录号P33751)或格特隐球菌(Cryptococcus gattii)(Uniprot登录号E6R9Z0)。
在另一优选的实施方式中，黄素辅因子(FMN或FAD)修饰成对应的(经修饰的)黄素衍生的辅因子是由含有FMN的蛋白质3-八异戊二烯基-4-羟基苯甲酸酯羧裂酶(也称为UbiX(最初注释为EC 4.1.1.)催化的。如上所述，参与将黄素辅因子(FMN或FAD)修饰成对应经修饰的黄素衍生的辅因子的酶最初被注释为脱羧酶。一些苯基丙烯酸脱羧酶(PAD)现在被注释为黄素异戊二烯基转移酶EC 2.5.1.-。
如上所述，能够催化本文所述的黄素异戊二烯基转移酶的酶促反应的酶最近也被注释为黄素异戊二烯基转移酶EC 2.5.1.129。
在更优选的实施方式中，3-甲基巴豆酸至异丁烯的转化利用3-八异戊二烯基-4-羟基苯甲酸酯羧裂酶(也称为UbiX)作为FMN异戊二烯基转移酶，其将黄素辅因子(FMN或FAD)修饰成对应的(经修饰的)黄素衍生的辅因子，其中所述3-八异戊二烯基-4-羟基苯甲酸酯羧裂酶(也称为UbiX)来源于大肠杆菌(Uniprot登录号P0AG03)、枯草芽孢杆菌(Uniprot登录号A0A086WXG4)、铜绿假单胞菌(Uniprot登录号A0A072ZCW8)或肠杆菌属种属(Enterobacter sp.)DC4(Uniprot登录号W7P6B1)。
在另一优选实施方式中，将黄素辅因子(FMN或FAD)修饰成对应的(经修饰的)黄素衍生的辅因子是由分别由kpdB和ecdB编码的来源于大肠杆菌的Ubx样黄素异戊二烯基转移酶(分别为UniProt登录号A0A023LDW3和UniProt登录号P69772)和由kpdB编码的来源于肺炎克雷伯氏菌的Ubx样黄素异戊烯基转移酶(UniProt登录号Q462H4)催化的。
在另一优选实施方式中，黄素辅因子(FMN或FAD)修饰成对应的(经修饰的)黄素衍生的辅因子是由黄素异戊二烯基转移酶催化的。
如上所述，实际的脱羧，即3-甲基巴豆酸至异丁烯的转化，是由异戊二烯化的FMN依赖性脱羧酶经由基于1,3-偶极环加成的机制催化的，其中所述异戊烯基化的FMN依赖性脱羧酶使用由任何上述相关联的FMN异戊二烯基转移酶提供的异戊烯基化的黄素辅因子(FMN或FAD)。
在优选的实施方式中，所述异戊烯基化的FMN依赖性脱羧酶催化3-甲基巴豆酸脱羧成异丁烯由阿魏酸脱羧酶(FDC)催化。阿魏酸脱羧酶(FDC)属于酶类别EC 4.1.1.-。
在甚至更优选的实施方式中，3-甲基巴豆酸至异丁烯的转化利用来源于酿酒酵母(Uniprot登录号Q03034)、肠杆菌属种属(Uniprot登录号V3P7U0)、短小芽孢杆菌(Uniprot登录号Q45361)、黑曲霉(Uniprot登录号A2R0P7)或都柏林念珠菌(Candida dubliniensis)(Uniprot登录号B9WJ66)的阿魏酸脱羧酶(FDC)。
在另一更优选的实施方式中，3-甲基巴豆酸至异丁烯的转化利用原儿茶酸脱羧酶(EC 4.1.1.63)。
在本发明的优选实施方式中，本发明的方法中所采用的PCA脱羧酶是来源于肺炎克雷伯氏菌(Uniprot登录号B9AM6)、细鞘丝藻属种属(Leptolyngbya sp.)(Uniprot登录号A0A0S3U6D8)、或考拉杆菌属种属(Phascolarctobacterium sp.)(Uniprot登录号R6IIV6)的PCA脱羧酶。
在另一优选实施方式中，所述催化将3-甲基巴豆酸脱羧为异丁烯的异戊烯基化的FMN依赖性脱羧酶是与上述阿魏酸脱羧酶(FDC)密切相关的酶，即3-聚异戊二烯基-4-羟基苯甲酸酯脱羧酶(也称为UbiD)。3-聚异戊二烯基-4-羟基苯甲酸酯脱羧酶属于分类为EC4.1.1.-的UbiD脱羧酶家族。
在更优选的实施方式中，3-甲基巴豆酸至异丁烯的转化利用3-聚异戊二烯基-4-羟基苯甲酸酯脱羧酶(UbiD)，其来源于深绿肉座菌(UniProt登录号G9NLP8)、Sphaerulinamusiva(UniProt登录号M3DF95)、娄地青霉(Penecillum requeforti)(UniProt登录号W6QKP7)、番茄专化型尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici)(UniProt登录号W9LTH3)、库德里亚夫酵母(Saccharomyces kudriavzevii)(UniProt登录号J8TRN5)、酿酒酵母、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)、白色念珠菌、Grosmannia clavigera、大肠杆菌(Uniprot登录号P0AAB4)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)(Uniprot登录号D5DTL4)、嗜热甲烷杆菌种属(Methanothermobacter sp.)CaT2(Uniprot登录号T2GKK5)、龟分枝杆菌(Mycobacterium chelonae)1518(Uniprot登录号X8EX86)或阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)(Uniprot登录号V3DX94)。
在另一更优选的实施方式中，3-甲基巴豆酸至异丁烯的转化利用来源于链霉菌属种属(Streptomyces sp)(UniProt登录号A0A0A8EV26)的UbiD样脱羧酶。
在甚至更优选的实施方式中，来源于链霉菌属种属的UbiD样脱羧酶是包含SEQ IDNO:52的氨基酸序列或与SEQ ID NO:52至少n％同一性的序列的酶，其中n是10与100之间的整数，优选地10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，并且其中所述酶具有将3-甲基巴豆酸转化为异丁烯的酶促活性。
链霉菌属种属UbiD(SEQ ID NO:52)
在另一更优选的实施方式中，3-甲基巴豆酸至异丁烯的转化利用来源于弗氏耶尔森菌的UbiD样脱羧酶(Yersinia frederiksenii)(Uniprot登录号：A0A0T9UUQ9)。
在甚至更优选的实施方式中，来源于弗氏耶尔森菌的UbiD样脱羧酶是包含SEQ IDNO:53的氨基酸序列或与SEQ ID NO:53至少n％同一性的序列的酶，其中n是10与100之间的整数，优选地10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，并且其中所述酶具有将3-甲基巴豆酸转化为异丁烯的酶促活性。
弗氏耶尔森菌UbiD(SEQ ID NO:53)
优选地，来源于弗氏耶尔森菌的UbiD样脱羧酶已经遗传工程化以增加3-甲基巴豆酸至异丁烯的转化。
也就是说，在具体的实施方式中，来源于弗氏耶尔森菌的UbiD样脱羧酶可以是经工程化的酶，所述经工程化的酶在将3-甲基巴豆酸转化为异丁烯方面相较于其所来源于的对应酶具有改进的活性并且具有如SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:53具有至少55％序列同一性的氨基酸序列。
具体地，在选自如SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列中的由位置7、17、27、33、35、45、46、48、51、140、144、183、184、185、222、227、284、285、286、287、288、289、290、292、321、322、327、329、330、331、337、338、355、365、378、380、384、387、388、389、391、392、393、394、395、419、424、425、428、429、431、432、434、436、437、438、439、443、444、446、447、448、449、451、453、457、458、459、460、462、464、465、467、468、470和471组成的组的位置处或与这些位置中的任一位置相对应的位置处的一个或多个氨基酸残基可以被另一个氨基酸残基取代或缺失，或者其中已在这些位置中的一个或多个位置处实现插入。
对3-甲基巴豆酸具有改善的活性的来源于弗氏耶尔森菌的UbiD样脱羧酶的特定突变变体提供于EP 21 16 6368.7中，该文献全部以引用方式并入本文。
优选地，来源于弗氏耶尔森菌的的经工程化的UbiD样脱羧酶包含下表3中列出的突变中的任何突变。改进的变体的列表在下表3中呈现。相对于野生型酶描述了活性的增加(“+”代表活性的低增加，并且“++++”代表活性的高度增加)。突变描述如下：R387A意指387位处的野生型氨基酸精氨酸(R)被丙氨酸(A)取代；dG462意指462位处的野生型氨基酸甘氨酸(G)被缺失；i443aR意指443位处氨基酸后已插入了精氨酸(R)(如果插入第二氨基酸，则会用i443b注释)。表3中的所有氨基酸位置均相对于SEQ ID NO:53给出。
表3
关于序列同一性的确定，以下应适用：当所比较的序列不具有相同长度时，同一性程度是指较短序列中与较长序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，或者是指较长序列中与较短序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。优选地，它是指较短序列中与较长序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。序列同一性的程度可以根据本领域熟知的方法使用优选合适的计算机算法(例如CLUSTAL)来确定。
当使用Clustal分析方法来确定特定序列是否与参考序列例如至少60％同一时，可以使用默认设置，或者设置优选如下：对于氨基酸序列比较，矩阵：blosum 30；开放空位罚分：10.0；延长空位惩罚：0.05；延迟发散：40；空位分离距离：8。对于核苷酸序列比较，延伸空位罚分优选设置为5.0。
在优选的实施方式中，ClustalW2用于氨基酸序列的比较。在成对比较/比对的情况下，优选选择以下设置：蛋白质权重矩阵：BLOSUM 62；空位开放：10；空位延伸：0.1。在多重比较/比对的情况下，优选选择以下设置：蛋白质权重矩阵：BLOSUM 62；空位开放：10；空位延伸：0.2；空位距离：5；没有末端空位。
优选地，在序列的整个长度上计算同一性程度。
增加生物体或微生物中的辅酶A库
在WO 2020/188033中已经公开了增加辅酶A(CoA)库可以导致异丁烯产量增加。在WO 2020/188033中，由于以下原因实现了CoA库的增加：
(i)增加的泛酸盐摄入；和/或
(ii)增加的泛酸至CoA的转化。
因此，根据本发明的重组生物体或微生物可以通过增加泛酸盐的摄入和/或通过增加泛酸至CoA的转化来进一步改进。用于实现增加的泛酸盐摄入和/或增加的泛酸至CoA的转化的转运蛋白和酶公开于WO 2020/188033中，该专利完全以引用方式并入本文。
生物体或微生物
在本发明中，所述生物体可以是任何生物体，优选地适合于在工业规模的生物技术过程中使用的任何生物体。优选地，所述生物体是可用于异丁烯或其前体分子3-甲基巴豆酸的工业规模生物技术生产的生物体。更优选地，根据本发明的生物体是微生物。
在本发明的上下文中，术语“微生物”是指细菌以及真菌，例如酵母，并且还指藻类和古细菌。在一个优选的实施方式中，微生物是细菌。原则上可以使用任何细菌。待用于本发明的优选细菌是芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、发酵单胞菌属(Zymomonas)或埃希氏菌属(Escherichia)的细菌。在特别优选的实施方式中，细菌属于埃希氏菌属，并且甚至更优选地属于大肠杆菌物种。在另一优选的实施方式中，细菌属于恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)物种或运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)物种或谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)物种或枯草芽孢杆菌物种。还可以采用嗜极细菌，例如嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)，或来自梭菌科(Clostridiae)的厌氧细菌。
在另一特别优选的实施方式中，微生物是能够使用一氧化碳(CO)和包含CO的气态底物(例如合成气)作为碳源和能量的微生物。合成气(Syngas/synthesis gas)是CO和CO2以及H2的混合物。因此，在特别优选的实施方式中，微生物是固定C1的微生物。如上所述，能够利用CO并将其转化为乙酰辅酶A的对应天然存在的(或经遗传修饰的)微生物是本领域已知的。这些生物体通常被称为产乙酸微生物(有时也称为一氧化碳营养型产乙酸微生物)并且在本文中被称为“固定C1的微生物”。这些微生物利用Wood-Ljungdahl途径来固定CO并将所述CO转化为乙酰辅酶A。此类微生物的示例属于梭菌科并且例如描述于WO 2009/094485；WO 2012/05905；WO 2013/180584；US2011/0236941；PNAS107(29):13087-13092(2010)；Current Opinion in Biotechnology 23:364-381(2012)；Applied and EnvironmentalMicrobiology 77(15):5467-5475(2011)中。固定C1的微生物的使用在WO 2020/188033中进行了广泛讨论，该专利的全部内容并入本文。
在另一优选的实施方式中，所述微生物是真菌，更优选地酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、梭菌属(Clostridium)或毕赤酵母属(Pichia)，并且甚至更优选地酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、黑曲霉、里氏木霉(Trichoderma reesei)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、Pichia torula或Pichia utilis物种的真菌。
在另一实施方式中，本发明利用表达至少一种用于如上所述的根据本发明的转化的酶的光合微生物。优选地，微生物是光合细菌或微藻。在另外的实施方式中，所述微生物是藻类，更优选地属于硅藻纲(diatomeae)的藻类。
还可以想到根据本发明使用微生物的组合，其中不同的微生物表达如上所述的不同的酶。
在优选的实施方式中，本发明的生物体，优选地微生物，是能够消耗CO和/或合成气的生物体。在另一优选的实施方式中，本发明的生物体，优选地微生物，是能够消耗CO和/或CO2以及H2的混合物的生物体。
在另一实施方式中，所述生物体和/或微生物经遗传修饰以便能够消耗葡萄糖、果糖、木糖、甘露糖和/或CO(或合成气)和/或经遗传修饰以便增加生物体的和/或微生物的消耗葡萄糖、果糖、木糖、甘露糖和/或CO(或合成气)的能力。对应的遗传修饰是本领域已知的。
在另一优选的实施方式中，本发明的生物体，优选地微生物，是能够通过磷酸转移酶转运系统(PTS)消耗糖的生物体。
在优选的实施方式中，本发明的生物体，优选地微生物，是能够通过非磷酸转移酶转运系统(非PTS)消耗糖的生物体。
能够通过磷酸转移酶转运系统(PTS)和/或通过非磷酸转移酶转运系统(非PTS)消耗糖的生物体和/或微生物是本领域已知的。
在另一实施方式中，所述生物体和/或微生物经遗传修饰以便能够通过磷酸转移酶转运系统(PTS)或通过非磷酸转移酶转运系统(非PTS)消耗糖。在另一优选的实施方式中，所述生物体和/或微生物经遗传修饰以增加生物体和/或微生物的通过磷酸转移酶转运系统(PTS)或通过非磷酸转移酶转运系统(非PTS)消耗糖的能力。对应的遗传修饰是本领域已知的。
在另一优选的实施方式中，本发明的生物体，优选地微生物是具有减弱或失活的磷酸转移酶转运系统(PTS)的生物体。这种生物体，优选地微生物，可以优选通过所述磷酸转移酶转运系统(PTS)的基因的缺失或失活来进行遗传修饰。对应的遗传修饰是本领域已知的。
在另一优选的实施方式中，本发明的生物体，优选地微生物，是具有增强的用于糖摄入的非磷酸转移酶转运系统(非PTS)的生物体。此类生物体，优选地微生物，可优选地通过过表达所述用于糖摄入的非磷酸转移酶转运系统(非PTS)的基因进行遗传修饰。对应的遗传修饰是本领域已知的。
在另一优选的实施方式中，本发明的生物体，优选地微生物，是具有减少的或失活的磷酸转移酶转运系统(PTS)和增强的用于糖摄入的非磷酸转移酶转运系统(非PTS)的生物体。
在另一优选的实施方式中，本发明的生物体，优选地微生物，是能够通过非磷酸转移酶转运系统(非PTS)消耗蔗糖的生物体。
在另一优选的实施方式中，本发明的生物体，优选地微生物，是消耗蔗糖的生物体，其中所述生物体，优选地所述微生物已经通过引入非磷酸转移酶转运系统(非PTS)的至少一个基因进行遗传修饰。不受理论的束缚，此类生物体和/或微生物已经通过引入选自由来自大肠杆菌W的cscA、cscB和cscK组成的组的基因而被遗传修饰(M.Bruschi等人，Biotechnology Advances 30(2012)1001-1010)。
在另一优选的实施方式中，本发明的生物体，优选地微生物，是已经遗传修饰以具有减少或失活的磷酸转移酶转运系统(PTS)和选自由galP、glk和glf组成的组的至少一种基因的过表达的生物体。
在优选的实施方式中，本发明的生物体，优选地微生物，是经遗传修饰以避免泄漏乙酰辅酶A，从而增加乙酰辅酶A的细胞内浓度的生物体。导致乙酰辅酶A的细胞内浓度增加的遗传修饰是本领域已知的。此类生物体，优选地微生物，可以优选地通过使以下基因缺失或失活来进行遗传修饰：ΔackA(乙酸激酶)、Δldh(乳酸脱氢酶)、ΔadhE(乙醇脱氢酶)、ΔfrdB和/或ΔfrdC(富马酸还原酶和富马酸脱氢酶)。
在另一实施方式中，本发明的方法包括以(细胞)培养物的形式，优选地以液体细胞培养物的形式提供本发明的生物体，优选地微生物的步骤；在合适的条件下在发酵器(通常也称为生物反应器)中培养所述生物体，优选地微生物的随后步骤；并且进一步包括实行如本文所述的本发明的方法的酶促转化的步骤。合适的发酵罐或生物反应器装置和发酵条件是本领域技术人员已知的。生物反应器或发酵器是指本领域已知的支持生物活性环境的任何制造或工程化的装置或系统。因此，生物反应器或发酵器可以是其中进行涉及生物体，优选地微生物和/或生化活性物质的化学/生化反应(如本发明的方法)的容器。在生物反应器或发酵器中，这种过程可以是需氧的或厌氧的。这些生物反应器通常是圆柱形的，并且大小范围从升到立方米，并且往往由不锈钢制成。在这方面，不受理论的束缚，发酵器或生物反应器可以以适合于在例如分批培养、补料分批培养、灌注培养或恒化培养培养生物体，优选地微生物的方式设计，所有这些方式都是本领域公知的。
培养基可以是任何适合培养相应生物体或微生物的培养基。当通过利用生物体或微生物进行时，根据本发明的方法可以例如设计为连续发酵培养方法或分批培养或本领域技术人员已知的任何合适的培养方法。
3-甲基巴豆酸和/或异丁烯的生产
在具体的实施方式中，本发明涉及一种用于生产3-甲基巴豆酸和/或异丁烯的方法，所述方法包括在合适的条件下在合适的培养基中培养根据本发明的重组生物体或微生物的步骤。
也就是说，根据本发明的生物体或微生物可以在用于生产异丁烯的工业过程中使用。在某些实施方式中，用于合成异丁烯的所有酶促步骤将在本发明的生物体或微生物中进行。在此类实施方式中，生物体或微生物优选地包含阿魏酸脱羧酶，所述阿魏酸脱羧酶催化将3-甲基巴豆酸转化成异丁烯。
或者，异丁烯可以通过两步法生产。也就是说，根据本发明的生物体或微生物可以用于生产前体分子3-甲基巴豆酸。所生产的3-甲基巴豆酸在生物转化反应中体内或体外转化成异丁烯。
也就是说，在具体实施方式中，本发明涉及一种用于生产异丁烯的方法，所述方法包括以下步骤：a)通过在合适的条件下在合适的培养基中培养本发明的重组生物体或微生物来生产3-甲基巴豆酸；以及b)在体内或体外将所述产生的3-甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯。
在优选的实施方式中，根据本发明的方法还包括回收由所述方法产生的异丁烯的步骤。例如，当通过发酵表达必要的酶/转运蛋白的对应生物体或微生物在体内进行根据本发明的方法时，可以通过本领域技术人员已知的方法从发酵废气中回收异丁烯。
如上所述，根据本发明的重组生物体和微生物以及方法特别可用于异丁烯的体内大规模生产，特别是可用于商业生产。本发明描述了商业地且经济有效地生产迄今为止尚不可获得的大量异丁烯的新颖手段和方式。所生成的大量异丁烯然后可以在商业环境中进一步转化，以生产大量的例如即用型汽油(例如异辛烷、ETBE、MTBE)、喷气燃料、化妆品、化学品，例如甲基丙烯酸、聚异丁烯、或丁基橡胶。如本文所用，以大于至少100升，优选地大于至少400升，或更优选地生产规模为1,000升或更大，甚至更优选地生产规模为5,000升或更大的能力在发酵反应器中或体外进行异丁烯的“大规模生产”、“商业生产”和“生物加工”。如本文所用，“大量”明确排除可能在生物体或微生物中固有地产生的痕量。
例如，在优选的实施方式中，根据本文所述的方法的连续培养物的产率为至少约0.2克异丁烯/升/天、至少约0.3克异丁烯/升/天、至少约0.4克异丁烯/升/天、至少约0.5克异丁烯/升/天、至少约0.6克异丁烯/升/天、至少约0.7克异丁烯/升/天、至少约0.8克异丁烯/升/天、或至少约1.0克异丁烯/升/天。在另外的实施方式中，根据本文所述的方法的连续培养物的产率在约0.3克异丁烯/升/天与约1.0克异丁烯/升/天之间、在约0.4克异丁烯/升/天与约1.0克异丁烯/升/天之间、以及在约0.5克异丁烯/升/天与约1.0克异丁烯/升/天之间。在其他特定实施方式中，根据本文所述的方法的连续培养物的产率在约0.5克异丁烯/升/天至约0.75克异丁烯/升/天之间。在其他特定实施方式中，根据本文所述的方法的连续培养物的产率在约0.5克异丁烯/升/天与约1.5克异丁烯/升/天之间。
在另外的实施方式中，根据本文所述的方法的分批培养物的产率是在分批培养中至少约2克/升、在分批培养中至少约5克/升、在分批培养中至少约10克/升，并且在分批培养中至少约15克/升。在一些实施方式中，根据本文所述的方法的分批培养物的产率是在分批培养中在约2克/升与约5克/升之间，在分批培养中在约5克/升与约10克/升之间，并且还更优选地在分批培养中在约10克/升与约20克/升之间。在其他特定实施方式中，根据本文所述的方法的分批培养物的产率在约2.4克/升与约4.8克/升之间，并且优选地在分批培养中在约4.8克/升与约9.4克/升之间，并且还更优选地在分批培养中在约9.4克/升与约18.6克/升之间。
其他烯烃的生产
在本发明内，重组生物体或微生物优选地用于生产异丁烯，其中3-甲基巴豆酸在最终反应步骤中通过酶阿魏酸脱羧酶(FDC)转化成异丁烯。然而，本领域中已知FDC可用于生产其他烯烃。
例如，Mori等人(Direct 1,3-butadiene biosynthesis in Escherichia colivia a tailored ferulic acid decarboxylase mutant,Nature Communications第12卷，文章编号：2195(2021))公开了使用FDC从顺式,顺式-粘康酸和戊二烯酸进行1,3-丁二烯生物合成生产。如本文所示，巴豆酸和2-己烯酸可以抑制野生型和高度工程化的FDC变体两者，很可能即使在痕量的巴豆酸和/或2-己烯酸的存在下也会显著抑制涉及FDC变体的活性的其他生物技术过程，例如1,3-丁二烯的生产。因此，根据本发明的重组生物体或微生物可以用作基于FDC的烯烃生产的通用平台。
因此，在具体实施方式中，本发明涉及一种重组生物体或微生物，所述重组生物体或微生物由于以下中的至少一者而与其所来源于的生物体或微生物相比具有减少的巴豆酸库：
(i)巴豆酰辅酶A至丁酰辅酶A的转化增加；和/或丁酰辅酶A至丁酸的转化增加；
(ii)巴豆酰辅酶A至3-羟基丁酰辅酶A的转化增加；和/或3-羟基丁酰辅酶A至3-羟基丁酸的转化增加；
(iii)巴豆酸至巴豆酰辅酶A的转化增加；
(iv)巴豆酰基-[酰基载体蛋白]至丁酰基[酰基载体蛋白]的转化增加；
(v)巴豆酰基-[酰基载体蛋白]至巴豆酸的转化减少；和/或
(vi)巴豆酰辅酶A至巴豆酸的转化减少；
其中所述微生物的重组生物体编码阿魏酸脱羧酶。
FDC可以是本文已公开的用于生产异丁烯的FDC变体中的任何一种FDC变体。此外，FDC可以是来自黑曲霉(An FDC)或酿酒酵母(sc FDC)的FDC或其任何突变变体。具体地，FDC可以是已经由Mori等人(参见上面的引文)公开的用于生产1,3-丁二烯的AnFDC或ScFDC的任何变体。
在具体实施方式中，本发明涉及一种重组生物体或微生物，所述重组生物体或微生物由于以下中的至少一者而与其所来源于的生物体或微生物相比具有减少的巴豆酸库：
(i)巴豆酰辅酶A至丁酰辅酶A的转化增加；和/或丁酰辅酶A至丁酸的转化增加；
(ii)巴豆酰辅酶A至3-羟基丁酰辅酶A的转化增加；和/或3-羟基丁酰辅酶A至3-羟基丁酸的转化增加；
(iii)巴豆酸至巴豆酰辅酶A的转化增加；
(iv)巴豆酰基-[酰基载体蛋白]至丁酰基[酰基载体蛋白]的转化增加；
(v)巴豆酰基-[酰基载体蛋白]至巴豆酸的转化减少；和/或
(vi)巴豆酰辅酶A至巴豆酸的转化减少；
其中重组生物体或微生物用于生产烯烃。
在具体实施方式中，本发明涉及一种重组生物体或微生物，所述重组生物体或微生物由于以下中的至少一者而与其所来源于的生物体或微生物相比具有减少的巴豆酸库：
(i)巴豆酰辅酶A至丁酰辅酶A的转化增加；和/或丁酰辅酶A至丁酸的转化增加；
(ii)巴豆酰辅酶A至3-羟基丁酰辅酶A的转化增加；和/或3-羟基丁酰辅酶A至3-羟基丁酸的转化增加；
(iii)巴豆酸至巴豆酰辅酶A的转化增加；
(iv)巴豆酰基-[酰基载体蛋白]至丁酰基[酰基载体蛋白]的转化增加；
(v)巴豆酰基-[酰基载体蛋白]至巴豆酸的转化减少；和/或
(vi)巴豆酰辅酶A至巴豆酸的转化减少；
其中所述生物体或微生物能够产生阿魏酸脱羧酶的底物。
烯烃可以是可以用野生型或工程化的FDC变体生产的任何烯烃。在具体的实施方式中，烯烃是异丁烯。在另一实施方式中，烯烃是1,3-丁二烯。应当注意的是，重组生物体或微生物不一定需要包含编码FDC的基因。也就是说，重组生物体或微生物还可以用于生产烯烃的前体，然后在后续步骤中通过FDC将所述前体转化成烯烃。因此，重组生物体或微生物可以仅用于烯烃生产过程的特定部分。
例如，根据本发明的重组生物体或微生物可以用于生产前体分子3-甲基巴豆酸或顺式,顺式-粘康酸或戊二烯酸。在根据本发明的重组生物体或微生物中产生这些前体将使作为副产物的巴豆酸和/或2-己烯酸的形成最小化。因此，发酵液可以直接用于通过FDC生产对应的烯烃。
在某些实施方式中，1,3-丁二烯通过以下方式获得：
(i)将磷酸烯醇丙酮酸盐和赤藓糖-4-磷酸盐酶促转化成3-脱氧-D-庚酮酸-7-磷酸盐，
(ii)将3-脱氧-D-庚酮酸-7-磷酸盐酶促转化成3-脱氢莽草酸盐，
(iii)将3-脱氢莽草酸盐酶促转化成原儿茶酸，
(iv)将原儿茶酸酶促转化成儿茶酚，
(v)将儿茶酚酶促转化成顺式,顺式-粘康酸；
(vi)将顺式,顺式-粘康酸酶促转化成(Z)-戊二烯酸盐；以及
(vii)将(Z)-戊二烯酸盐酶促转化成1,3-丁二烯。
优选地，顺式,顺式-粘康酸至(Z)-戊二烯酸盐的转化和(Z)-戊二烯酸盐至1,3-丁二烯的转化由阿魏酸脱羧酶催化。在某些实施方式中，阿魏酸脱羧酶是如由Mori等人所公开的工程化的AnFDC或ScFDC。
在具体实施方式中，本发明涉及一种重组生物体或微生物，所述重组生物体或微生物由于至少以下而与其所来源于的生物体或微生物相比具有减少的巴豆酸库：
(i)巴豆酰辅酶A至丁酰辅酶A的转化增加；和/或丁酰辅酶A至丁酸的转化增加；
(ii)巴豆酰辅酶A至3-羟基丁酰辅酶A的转化增加；和/或3-羟基丁酰辅酶A至3-羟基丁酸的转化增加；
(iii)巴豆酸至巴豆酰辅酶A的转化增加；
(iv)巴豆酰辅酶A至巴豆酸的转化减少；
(v)巴豆酰基-[酰基载体蛋白]至丁酰基[酰基载体蛋白]的转化增加；和/或
(vi)巴豆酰基-[酰基载体蛋白]至巴豆酸的转化减少；
其中所述重组生物体或微生物能够将磷酸烯醇丙酮酸盐和赤藓糖-4-磷酸盐转化成1,3-丁二烯，其中在所述微生物中：
(i)磷酸烯醇丙酮酸盐和赤藓糖-4-磷酸盐酶促转化成3-脱氧-D-庚酮酸-7-磷酸盐，
(ii)3-脱氧-D-庚酮酸-7-磷酸盐酶促转化成3-脱氢莽草酸盐，
(iii)3-脱氢莽草酸盐酶促转化成原儿茶酸，
(iv)原儿茶酸酶促转化成儿茶酚，
(v)儿茶酚酶促转化成顺式,顺式-粘康酸；
(vi)顺式,顺式-粘康酸酶促转化成(Z)-戊二烯酸盐；并且
(vii)(Z)-戊二烯酸盐酶促转化成1,3-丁二烯。
优选地，磷酸烯醇丙酮酸盐在糖酵解期间从葡萄糖-6-磷酸盐获得，并且赤藓糖-4-磷酸盐在戊糖-6-磷酸盐途径期间从葡萄糖-6-磷酸盐获得。
实施方式列表
1.一种重组生物体或微生物，所述重组生物体或微生物由于以下中的至少一者而与其所来源于的生物体或微生物相比具有减少的巴豆酸库：
(i)巴豆酰辅酶A至丁酰辅酶A的转化增加；和/或丁酰辅酶A至丁酸的转化增加；
(ii)巴豆酰辅酶A至3-羟基丁酰辅酶A的转化增加；和/或3-羟基丁酰辅酶A至3-羟基丁酸的转化增加；
(iii)巴豆酸至巴豆酰辅酶A的转化增加；
(iv)巴豆酰基-[酰基载体蛋白]至丁酰基[酰基载体蛋白]的转化增加；
(v)巴豆酰基-[酰基载体蛋白]至巴豆酸的转化减少；和/或
(vi)巴豆酰辅酶A至巴豆酸的转化减少。
2.根据实施方式1所述的重组生物体或微生物，其中所述重组生物体或微生物是重组微生物。
3.根据实施方式1或2所述的重组生物体或微生物，其中所述重组微生物是真菌或细菌。
4.根据实施方式3所述的重组生物体或微生物，其中所述细菌是大肠杆菌。
5.根据实施方式1至4中任一项所述的重组生物体或微生物，其中所述巴豆酰辅酶A至丁酰辅酶A的转化增加是由于所述生物体或微生物中至少一种能够还原碳-碳双键的酶(EC 1.3)的水平和/或活性增加。
6.根据实施方式5所述的重组生物体或微生物，其中所述能够还原碳-碳双键的酶(EC 1.3)是NADH或NADPH依赖性的(EC 1.3.1)或黄素依赖性的(EC 1.3.8)。
7.根据实施方式5或6所述的重组生物体或微生物，其中所述能够还原碳-碳双键的NADH或NADPH依赖性酶(EC 1.3.1)是巴豆酰辅酶A还原酶(EC 1.3.1.86)、反式-2-烯酰基辅酶A还原酶(EC 1.3.1.44)和/或烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(EC 1.3.1.9)。
8.根据实施方式7所述的重组生物体或微生物，其中
(i)所述反式-2-烯酰基辅酶A还原酶(EC 1.3.1.44)是来自齿垢密螺旋体的FabV；
(ii)所述巴豆酰辅酶A还原酶(EC 1.3.1.86)是来自山丘链霉菌的Ccr；和/或
(iii)所述烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(EC 1.3.1.9)是来自大肠杆菌的FabI。
9.根据实施方式5或6所述的重组生物体或微生物，其中所述能够还原碳-碳双键的黄素依赖性酶(EC 1.3.8)是短链酰基辅酶A脱氢酶(EC 1.3.8.1)。
10.根据实施方式9所述的重组生物体或微生物，其中所述短链酰基辅酶A脱氢酶(EC 1.3.8.1)是来自埃氏巨型球菌的短链酰基辅酶A脱氢酶；和/或来自发酵氨基酸球菌的具有电子转移黄素蛋白(Etf)的丁酰辅酶A脱氢酶(Bcd)。
11.根据实施方式1至10中任一项所述的重组生物体或微生物，其中丁酰辅酶A至丁酸的转化增加是由于所述生物体体或微生物中的硫酯水解酶(EC 3.1.2)、辅酶A转移酶(EC 2.8.3)、酸性硫醇连接酶(EC 6.2.1)、磷酸酰基转移酶(EC 2.3.1)和/或酸性激酶(EC2.7.2)的水平和/或活性增加。
12.根据实施方式11所述的重组生物体或微生物，其中所述硫酯水解酶(EC3.1.2)是1,4-二羟基-2-萘酰基-辅酶A水解酶(EC 3.1.2.28)和/或酰基辅酶A硫酯酶2(EC3.1.2.20)。
13.根据实施方式12所述的重组生物体或微生物，其中
(i)所述1,4-二羟基-2-萘酰基-辅酶A水解酶(EC 3.1.2.28)是来自大肠杆菌的MenI；和/或
(ii)所述酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)是来自大肠杆菌的TesB。
14.根据实施方式11所述的重组生物体或微生物，其中所述辅酶A转移酶(EC2.8.3)是乙酸辅酶A转移酶和/或丁酰辅酶A:乙酸辅酶A转移酶(EC 2.8.3.8)。
15.根据实施方式14所述的重组生物体或微生物，其中
(i)所述乙酸辅酶A转移酶(EC 2.8.3.8)是来自钩虫贪铜菌的YdiF(Pct)；和/或
(ii)所述丁酸:乙酰辅酶A转移酶(EC 2.8.3.8)由来自沃氏共养单胞菌沃氏亚种的Swol_1932或Swol_0436编码。
16.根据实施方式11所述的重组生物体或微生物，其中所述酸性硫醇连接酶(EC6.2.1)是乙酸辅酶A连接酶(形成ADP)(EC 6.2.1.13)。
17.根据实施方式16所述的重组生物体或微生物，其中所述乙酸辅酶A连接酶(形成ADP)(EC 6.2.1.13)由来自橙色绿屈挠菌的基因Caur_3920和/或来自痢疾变形虫的基因EHI_178960编码和/或其中所述乙酸辅酶A连接酶(形成ADP)(EC 6.2.1.13)是来自肠贾第虫(兰氏贾第鞭毛虫)的蛋白质Q9Y1N2。
18.根据实施方式11所述的重组生物体或微生物，其中所述磷酸酰基转移酶(EC2.3.1)是磷酸丁酰转移酶(EC 2.3.1.19)和/或其中所述酸性激酶(EC 2.7.2)是丁酸激酶(EC 2.7.2.7)。
19.根据实施方式18所述的重组生物体或微生物，其中
(i)所述磷酸丁酰转移酶(EC 2.3.1.19)是来自丙酮丁醇梭菌的Ptb；和/或
(ii)所述丁酸激酶(EC 2.7.2.7)是来自丙酮丁醇梭菌的Buk。
20.根据实施方式1至19中任一项中任一项所述的重组生物体或微生物，其中所述巴豆酰辅酶A至3-羟基丁酰辅酶A的转化增加是由于所述生物体或微生物中的水裂合酶(EC4.2.1)的水平和/或活性增加。
21.根据实施方式20所述的重组生物体或微生物，其中所述氢裂合酶(EC 4.2.1)是短链烯酰基辅酶A水合酶(EC 4.2.1.150)、3-羟基丁酰辅酶A脱水酶(EC 4.2.1.55)和/或烯酰辅酶A水合酶(EC 4.2.1.17)。
22.根据实施方式21所述的重组生物体或微生物，其中
(i)所述短链烯酰辅酶A水合酶(EC 4.2.1.150)是来自红色亚栖热菌、勤奋金属球菌或丙酮丁醇梭菌的短链烯酰基辅酶A水合酶；
(ii)所述3-羟基丁酰辅酶A脱水酶(EC 4.2.1.55)是来自和平铁古球菌的3-羟基丁酰辅酶A脱水酶；和/或
(iii)所述烯酰辅酶A水合酶(EC 4.2.1.17)是来自褐家鼠的烯酰辅酶A水合酶。
23.根据实施方式1至22中任一项所述的重组生物体或微生物，其中所述3-羟基丁酰辅酶A至3-羟基丁酸的转化增加是由于所述生物体或微生物中的硫酯水解酶(EC 3.1.2)的水平和/或活性增加。
24.根据实施方式23所述的重组生物体或微生物，其中所述硫酯水解酶(EC3.1.2)是棕榈酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.2)和/或酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)。
25.根据实施方式24所述的重组生物体或微生物，其中
(i)所述棕榈酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.2)是来自深海发光杆菌的棕榈酰辅酶A水解酶；和/或
(ii)所述酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)是来自大肠杆菌的TesB或YciA。
26.根据实施方式1至25中任一项所述的重组生物体或微生物，其中所述巴豆酸至巴豆酰辅酶A的转化增加是由于所述生物体或微生物中的辅酶A转移酶(EC 2.8.3)和/或酸性硫醇连接酶(EC 6.2.1)和/或酸性激酶(EC 2.7.2)和/或磷酸酰基转移酶(EC 2.3.1)的水平和/或活性增加。
27.根据实施方式26所述的重组生物体或微生物，其中所述辅酶A转移酶(EC2.8.3)是乙酸辅酶A转移酶(EC 2.8.3.8)。
28.根据实施方式27所述的重组生物体或微生物，其中
(i)所述乙酸辅酶A转移酶(EC 2.8.3.8)是来自钩虫贪铜菌的YdiF(Pct)；并且
(ii)所述丁酸:乙酰辅酶A转移酶(EC 2.8.3.8)由来自沃氏共养单胞菌沃氏亚种的Swol_1932或Swol_0436编码。
29.根据实施方式26所述的重组生物体或微生物，其中所述酸性硫醇连接酶(EC6.2.1)是中链酰基辅酶A连接酶(EC 6.2.1.2)、4-羟基苯甲酸酯辅酶A连接酶/苯甲酸酯辅酶A连接酶(EC 6.2.1.25和6.2.1.27)、4-羟基丁酸酯辅酶A连接酶(EC 6.2.1.40)或巯基丙酸甲酯(MMPA)辅酶A(CoA)连接酶(EC 6.2.1.44)。
30.根据实施方式29所述的重组生物体或微生物，其中
(i)所述中链酰基辅酶A连接酶(EC 6.2.1.2)由来自铜绿假单胞菌的基因PA3924编码，
(ii)所述4-羟基苯甲酸酯辅酶A连接酶/苯甲酸酯辅酶A连接酶(EC 6.2.1.25和6.2.1.27)由来自酸养互营菌(菌株SB)的基因SYN_02896或来自酸养互营菌(菌株SB)的基因SYN_02898编码，
(iii)所述4-羟基丁酸酯辅酶A连接酶(EC 6.2.1.40)由来自嗜中性热棒菌(嗜中性热变形菌)的基因Tneu_0420编码；和/或
(iv)所述巯基丙酸甲酯(MMPA)辅酶A(CoA)连接酶(EC 6.2.1.44)由来自遍在远洋杆菌的基因SAR11_0248；或由来自帕氏鲁杰氏菌的基因SPO0677；或由来自帕氏鲁杰氏菌的基因SPO2045；或由来自蓝湖鲁杰氏菌的基因SL1157_1815；或由来自蓝湖鲁杰氏菌的基因SL1157_2728或由来自铜绿假单胞菌的基因PA4198；或由来自泰国伯克霍尔德氏菌的基因BTH_I2141编码。
31.根据实施方式26所述的重组生物体或微生物，其中所述磷酸酰基转移酶(EC2.3.1)是磷酸丁酰转移酶(EC 2.3.1.19)和/或其中所述酸性激酶(EC 2.7.2)是丁酸激酶(EC 2.7.2.7)。
32.根据实施方式31所述的重组生物体或微生物，其中
(i)所述磷酸丁酰转移酶(EC 2.3.1.19)是来自丙酮丁醇梭菌的Ptb；和/或
(ii)所述丁酸激酶(EC 2.7.2.7)是来自丙酮丁醇梭菌的Buk。
33.根据实施方式1至32中任一项所述的重组生物体或微生物，其中所述巴豆酰基-[酰基载体蛋白]至丁酰基[酰基载体蛋白]的转化增加是由于所述生物体或微生物中的NADH或NADPH依赖性烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(EC 1.3.1)的水平和/或活性增加，特别地其中所述NADH或NADPH依赖性烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(EC 1.3.1)是烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(NADH依赖性)(EC 1.3.1.9)、烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(NADPH依赖性)(EC 1.3.1.104)、烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(NADPH依赖性、Re特异性)(EC 1.3.1.39)、烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(NADPH依赖性、Si特异性)(EC 1.3.1.10)、和/或反式-2-烯酰基辅酶A还原酶(NAD+)(EC 1.3.1.44)。
34.根据实施方式33所述的重组生物体或微生物，其中所述NADH或NADPH依赖性烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶是来自大肠杆菌的FabI(EC 1.3.1.9和EC 1.3.1.104)、来自枯草芽孢杆菌的FabI(EC 1.3.1.9)、来自枯草芽孢杆菌的FabL(EC 1.3.1.104)、来自金黄色葡萄球菌的FabI(EC 1.3.1.39)、来自牙龈卟啉单胞菌的FabK(EC 1.3.1.10和EC1.3.1.39)、来自肺炎链球菌的FabK(EC 1.3.1.10)、来自酿酒酵母的ETR1(EC 1.3.1.104)、来自鼻疽伯克霍尔德氏菌的FabV(EC 1.3.1.9和EC 1.3.1.44)、来自铜绿假单胞菌的FabV(EC 1.3.1.9和EC 1.3.1.44)、来自霍乱弧菌的FabV(EC 1.3.1.9和EC 1.3.1.44)、来自齿垢密螺旋体的FabV(EC 1.3.1.44)、来自铜绿假单胞菌的FabI(EC 1.3.1.9)、和/或来自鼻疽伯克霍尔德氏菌的FabI(EC 1.3.1.9)。
35.根据实施方式5至34中任一项所述的重组生物体或微生物，其中所述酶水平的增加是通过从重组启动子和/或从改进的核糖体结合位点表达编码相应酶的基因来实现的。
36.根据实施方式5至35中任一项所述的重组生物体或微生物，其中所述酶的活性增加是由于编码所述相应酶的所述基因中的一个或多个激活突变。
37.根据实施方式1至36中任一项所述的重组生物体或微生物，其中所述巴豆酰基-[酰基载体蛋白]和/或巴豆酰辅酶A至巴豆酸的转化减少是由于所述生物体或微生物中的硫酯水解酶(EC 3.1.2)的水平降低和/或活性降低。
38.根据实施方式37所述的重组生物体或微生物，其中所述硫酯水解酶(EC3.1.2)是棕榈酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.2)、酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)和/或1,4-二羟基-2-萘酰基-辅酶A水解酶(EC 3.1.2.28)。
39.根据实施方式38所述的重组生物体或微生物，其中
(i)所述硫酯水解酶(EC 3.1.2)是来自大肠杆菌的PaaY或PaaI；
(ii)所述棕榈酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.2)是来自大肠杆菌的TesA、YciA或EntH；
(iii)所述酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)是来自大肠杆菌的TesB或FadM；和/或
(iv)所述1,4-二羟基-2-萘酰基-辅酶A水解酶(EC 3.1.2.28)是来自大肠杆菌的MenI。
40.根据实施方式37至39中任一项所述的重组生物体或微生物，其中所述酶水平降低是由于
(i)所述生物体或微生物中编码所述相应酶的基因的完全或部分缺失；和/或
(ii)所述生物体或微生物中编码所述相应酶的基因的调控元件中的缺失或失活突变。
41.根据实施方式37至40中任一项所述的重组生物体或微生物，其中所述酶活性降低是由于
(i)所述生物体或微生物中编码所述相应酶的基因的失活突变；和/或
(ii)所述相应酶的抑制剂的添加。
42.根据权利要求1至41中任一项所述的重组生物体或微生物，
其中所述巴豆酰辅酶A至丁酰辅酶A的转化增加是由于反式-2-烯酰基辅酶A还原酶(EC 1.3.1.44)和/或烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(EC 1.3.1.9)的水平和/或活性增加；和/或
其中所述巴豆酰基-[酰基载体蛋白]和/或巴豆酰辅酶A至巴豆酸的转化减少是由于所述生物体或微生物中的硫酯水解酶(EC 3.1.2)的水平降低和/或活性降低。
43.根据权利要求42所述的重组生物体或微生物，其中所述硫酯水解酶(EC3.1.2)是棕榈酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.2)或酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)。
44.根据实施方式1至43中任一项所述的重组生物体或微生物，所述重组生物体或微生物进一步编码阿魏酸脱羧酶。
45.根据实施方式44所述的重组生物体或微生物，其中所述阿魏酸脱羧酶催化由对应的羧酸形成烯烃。
46.根据权利要求1至45中任一项所述的重组生物体或微生物，其中所述生物体或微生物能够产生阿魏酸脱羧酶的底物。
47.根据实施方式1至46中任一项所述的重组生物体或微生物，其中所述生物体或微生物能够
(i)将乙酰辅酶A酶促转化为3-甲基巴豆酸和/或异丁烯；和/或
(ii)将3-甲基巴豆酸酶促转化为异丁烯；和/或
(iii)将顺式,顺式-粘康酸酶促转化为1,3-丁二烯；和/或
(iv)将戊二烯酸酶促转化为1,3-丁二烯。
48.根据实施方式47所述的重组生物体或微生物，其中所述将乙酰辅酶A转化为3-甲基巴豆酸包括以下步骤：
(i)将乙酰辅酶A酶促转化为乙酰乙酰辅酶A，
(ii)将所述产生的乙酰乙酰辅酶A酶促转化为3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A，
(iii)将所述产生的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A酶促转化为3-甲基戊烯二酰辅酶A，
(iv)将所述产生的3-甲基戊烯二酰辅酶A酶促转化为3-甲基巴豆酰辅酶A，以及
(v)将所述产生的3-甲基巴豆酰辅酶A酶促转化为3-甲基巴豆酸。
49.根据实施方式48所述的重组生物体或微生物，其中所述重组生物体或微生物能够将所述产生的3-甲基巴豆酸酶促转化为异丁烯。
50.根据实施方式49所述的重组生物体或微生物，其中所述3-甲基巴豆酸至异丁烯的转化是由阿魏酸脱羧酶催化的。
51.根据实施方式1至50中任一项所述的重组生物体或微生物用于生产烯烃的用途。
52.根据实施方式51所述的用途，其中所述烯烃由阿魏酸脱羧酶产生。
53.根据实施方式51或52所述的用途，其中所述烯烃是异丁烯或1,3-丁二烯。
54.一种用于生产3-甲基巴豆酸和/或异丁烯的方法，所述方法包括在合适的条件下在合适的培养基中培养根据实施方式48至50中任一项所定义的重组生物体或微生物的步骤。
55.一种生产异丁烯的方法，所述方法包括以下步骤：
a)通过在合适的条件下在合适的培养基中培养根据实施方式48至50中任一项所定义的重组生物体或微生物来生产3-甲基巴豆酸；以及
b)将所述产生的3-甲基巴豆酸酶促转化为异丁烯。
56.根据实施方式55所述的方法，其中所述3-甲基巴豆酸至异丁烯的转化是由阿魏酸脱羧酶催化的。
附图说明
图1示出了经由3-甲基巴豆酸从乙酰辅酶A生产异丁烯的人工途径。此外，在步骤Xa、Xb、XI和XII中示出了该途径期间可能发生的代谢物的酶促再循环。
图2示出了已经进化来特异性使3-甲基巴豆酸脱羧的FDC变体在与巴豆酸结合时不能经历环消除步骤，从而导致所述酶的不可逆抑制。
图3(A)经由改进的甲羟戊酸途径生成异丁烯的路线。先前发表的甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(MVD)和甲羟戊酸-3-激酶(M3K)经由3-羟基异戊酸产生异丁烯。与UbiX共表达的Fdc1催化将3-甲基巴豆酸脱羧以得到异丁烯。(B)使用3-甲基巴豆酸和具有共轭R基团的常见Fdc底物的Fdc脱羧反应机制。首先，底物与prFMN亚胺离子的1,3-偶极环加成导致第一吡咯烷环加合物Int1。脱羧和开环形成非环状烯烃加合物Int2。通过保守的谷氨酸残基进行质子化产生第二吡咯烷环加合物Int3，之后进行环消除以得到产物。
图4：TaFdc野生型定向进化成具有优异的异丁烯产量的TaFdcV。
图5：(A)TaFdc野生型和TaFdcV活性位点在两个取向上的重叠(用虚线分隔)。TaFdc(B)和TaFdcV(C)结合口袋的比较。可移动的L449和E292门控活性位点的进入，并且Q448W突变缩小活性位点的进入。
图6：巴豆酸(A)和3-甲基巴豆酸(B)在与使用Vina对接建模的TaFdc野生型(绿色)重叠的TaFdcV(蓝色)的活性位点处结合。(C)与AnFdc野生型重叠的TaFdcV(蓝色)和TaFdc野生型(绿色)与α-氟代肉桂酸(PDB:4ZAB)复合，展示了M405残基与苯环之间的冲突。
图7：(A)TaFdcV在与2-丁酸一起孵育之前和之后的紫外-可见光光谱。(B)TaFdcV与2-丁酸孵育后脱盐的ESI-MS光谱，显示形成了prFMN-丁酸加合物[M+H]＝607.18。(C)TaFdcV与prFMN-丁酸加合物(7NF1[10.2210/pdb7NF1/pdb])的晶体结构。(D)TaFdcV原样和与巴豆酸一起孵育时的紫外-可见光光谱。(E)TaFdcV与巴豆酸一起孵育(和脱盐)的ESI-MS光谱，显示形成脱羧prFMN-巴豆酸加合物[M-H]-＝565.21和痕量的prFMN-巴豆酸与羧酸基团[M-H]-＝609.20。TaFdcV prFMN-巴豆酸加合物(7NF2[10.2210/pdb7NF2/pdb])的F晶体结构。
图8：TaFdcV与巴豆酸A的动力学—添加巴豆酸后380nm处的prFMN峰逐渐分裂。B—所观察到的环加合物形成速率基于用1mM、10mM、20mM、40mM和50mM的巴豆酸测量的380nm峰的减少，显示出线性关系。
图9：TaFdcV与(A)AnFdc野生型；(B)AnFdcI和(C)AnFdcII晶体结构(根据AnFdc的AnFdc变体残基编号)的重叠。
图10：使用纯化酶进行3-甲基巴豆酸酯脱羧测定，比较通过GC检测的在2小时和4小时内由均具有N末端His标签的TaFdc变体(野生型，I、II、V)和AnFdc变体(野生型，I、II)产生的异丁烯产量。10mM的3-甲基巴豆酸酯和0.3mg/mL的酶。
图11：使用纯化酶进行3-甲基巴豆酸酯脱羧测定，比较通过GC检测的在2h和4h内使用10mM的3-甲基巴豆酸酯和0.3mg/mL的酶由均具有N末端His标签的TaFdc变体和AnFdc变体产生的异丁烯产量。增加倍数对比如图10所示。
图12：比较使用大肠杆菌细胞裂解物时的异丁烯体外生产水平。将等量的从分别表达干热嗜酸古菌(Picrophilus torridus)甲羟戊酸3-激酶(PtM3K)、酿酒酵母甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(ScMDD)或深绿木霉(T.atroviride)FdcI/V(与UbiX组合)的细胞获得的裂解物分别与50mM的HIV(3-羟基异戊酸盐)/ATP、PIV(3-膦酰氧基-异戊酸盐)/ADP或3-甲基巴豆酸酯一起孵育。在37℃(深灰色)和50℃(浅灰色)下孵育4h后，使用GC分析气相的异丁烯含量。在这些条件下，Ta FdcV介导的异丁烯水平在37℃时超过最高PtM3K/ScMDD水平约50倍。最高的TaFdcV异丁烯转化率是所提供的底物的约11.5％。
图13：(A)用于基于Int3中含有巴豆酸的TaFdcV的晶体结构进行DFT计算的TaFdcV活性位点模型。星号表示固定的原子。(B)TaFdcV晶体结构与巴豆酸加合物的重叠以及3-甲基巴豆酸过渡态和环消除产物异丁烯的DFT优化模型。(C)TaFdcV晶体结构与巴豆酸加合物的重叠以及巴豆酸过渡态和环消除产物丙烯的DFT优化模型。
图14：3-甲基巴豆酸(A)和巴豆酸(B)分别从Int3由TaFdcV转化为异丁烯和丙烯的势能(kJ mol-1)景观的等高线图，预计的过渡态标记为X；(C)3-甲基巴豆酸和巴豆酸的经零点能量校正的势能(kJ mol-1)方案，其中Int3设置为0并且预计的近似过渡态表示为双剑号；(D)Int3与3-甲基巴豆酸(Cα-C1和Cβ-C4a键长分别为和 )和巴豆酸(Cα-C1和Cβ-C4a键长分别为和)的产物之间的经DFT优化的过渡态的重叠。
图15：用于引导代谢通量远离巴豆酸的策略。
图16：用于耗竭巴豆酸库的策略。
图17：在15L生物反应器中培养基中具有fabV过表达的菌株(染色体和pSC载体)中的MCA和CA产量(F2250)。
图18：在1L生物反应器中培养基中具有yciA缺失的菌株的MCA和CA产量(F2253)。
图19：在1L生物反应器中培养基中具有yciA缺失和fabV过表达的菌株的MCA和CA产量(F2255)。
图20：在1L生物反应器中培养基中仅具有fabI过表达的菌株的MCA和CA产量(F2226)。
图21：在1L生物反应器中培养基中具有tesB缺失和fabI过表达的菌株的MCA和CA产量(F2221)。
图22：来自在具有fabV过表达(在染色体中和在pSC载体中，参见实施例2A)的菌株中产生的MCA的IBN体积生产率(F2262)。
图23：来自在具有fabV过表达(在染色体中和在pSC载体中，参见实施例2A)的菌株中产生的MCA的总IBN产量(F2262)。
图24：培养基中具有fabV过表达(在染色体中)的(从蔗糖)产生IBN的菌株的巴豆酸(CA)产量(F2238)。
图25：具有fabV过表达(在染色体中)的菌株从蔗糖的IBN体积生产率(F2238)。
图26：具有fabV过表达(在染色体中)的菌株中从蔗糖的总IBN产量(F2238)。
图27：使用酸性辅酶A连接酶和FabV将巴豆酸转化成丁酰辅酶A。
图28：使用辅酶A转移酶和FabV将巴豆酸转化成丁酰辅酶A。
实验实施例
实施例1：巴豆酸作为阿魏酸脱羧酶抑制剂的鉴定
无可辩驳的有害环境影响和化石燃料储量的枯竭已经推动了大量研究以寻求石化产品(包括气态烯烃异丁烯)生产的可持续替代品。由于良好的反应性，异丁烯被广泛用作燃料添加剂、橡胶、塑料和多种精细化学品的结构单元。每年生产，主要通过蒸汽裂解原油生产了超过1000万吨异丁烯。在20世纪80年代首次检测到微生物生产的较低异丁烯水平。最近，报道了经由使用甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(MVD)来使3-羟基异戊酸脱羧的改进的甲羟戊酸盐(MVA)途径的异丁烯产量(图3A)。进一步的研究强调了使用甲羟戊酸3激酶(M3K，干热嗜酸古菌)的更有效途径，所述甲羟戊酸3激酶通过不稳定的磷酸化中间体催化异丁烯的形成。所报道的最高全细胞异丁烯生产率507pmol min-1g细胞-1是使用用M3K工程化的大肠杆菌达到的，然而，这仍然是经济可行的水平的约10倍低。这种缓慢的转化可以通过替代路线来超越，所述替代路线为例如通过硫酯酶与非氧化脱羧酶的组合将甲基巴豆酰辅酶A更直接地转化成异丁烯。异戊烯基化的黄素(prFMN)依赖性阿魏酸脱羧酶(Fdc)催化一系列具有扩展共轭的丙烯酸的可逆非氧化(脱)羧化。最近，最终证明可逆的1,3-偶极环加成机制支持黑曲霉Fdc(AnFdc)中的催化。首先，底物的环加成产生环加合物Int1(图3B)。脱羧与开环同时发生，以形成Int2。在CO2与E282交换后，E282质子化产生环加合物Int3，所述环加合物Int3通过环消除释放产物。由底物R基团与酶残基之间的冲突介导的环加合物菌株是确保可逆的1,3-偶极环加成的关键]。最近的研究已表明，AnFdc的合理工程化可以扩大底物范围至包括芳香族底物，例如萘甲酸。然而，在更广泛的UbiD酶家族中很少报道缺乏延伸共轭的丙烯酸底物。可论证地，最接近3-甲基巴豆酸的天然UbiD底物是反式脱水甲羟戊酸5-磷酸盐(tAHMP)，其由来自超嗜热古菌敏捷气热菌(Aeropyrum pernix)的UbiD脱羧酶以替代甲羟戊酸途径脱羧。3-甲基巴豆酸和tAHMP均含有次级β碳并且缺乏延伸共轭，然而，tAHMP中的磷酸基团可能有助于环加合物中间体中的菌株操纵。
在此，本发明人报告了通过用3-甲基巴豆酸定向进化Fdc脱羧活性以产生异丁烯的发现和优化。本发明人试图了解缺乏延伸共轭和体积的底物可如何被Fdc脱羧。本发明人讨论了通过定向进化进化出的深绿木霉Fdc(TaFdc)的活性和选择性增加的结构基础。令人惊讶的是，优化的变体仍然无法使巴豆酸脱羧，表明在底物为3-甲基巴豆酸的情况下，单个附加甲基基团在环消除过程中起关键作用。使用计算研究来合理化3-甲基取代对产物形成的影响。
Fdc同源物的初步筛选
初步体内筛选测试了在大肠杆菌中与UbiX(大肠杆菌K-12)共表达的15种UbiD同源物的通过气相色谱法检测的3-甲基巴豆酸至异丁烯的转化。与其他同源物相比，TaFdc表现出超过两倍的异丁烯产量(表4)，并且采用定向进化方法来生成TaFdc变体，所述TaFdc变体具有优异的异丁烯生产活性和相对于肉桂酸的3-甲基巴豆酸选择性(图4)。具有T405M突变的TaFdcI，是异丁烯显著增加的第一变体。经过4轮进化产生的TaFdcV具有11个突变：E25N、N31G、G305A、D351R、K377H、AQ6P402V、F404Y、T405M、T429A、V445P和Q448W。
表4：Fdc变体的野生型3-甲基巴豆酸脱羧活性的初步体内筛选。Fdc与UbiX在pETDuet质粒中共表达，其中Fdc在MCS1(具有N末端6His标签)中并且UbiX在MCS2中。
TaFdc和TaFdcV的表征
使TaFdc野生型和带有N末端六组氨酸标签的TaFdcV与大肠杆菌K-12UbiX在大肠杆菌中共表达，并用Ni-NTA树脂纯化。两种纯化蛋白的紫外-可见光光谱在380nm处表现出明显的峰，被认为对应于辅因子活性形式prFMN亚胺离子。ESI-MS证实两种酶变体中均存在prFMN亚胺离子。380nm峰的形状和辅因子含量(通过280nm和380nm处的吸光度的比率评定)因批次而异。
TaFdc显示出对肉桂酸和山梨酸的脱羧活性，其中速率kobs分别＝7.2±0.3s和3.2±0.3s(针对380:280nm比率为0.067的批次报告的)。这些值与针对AnFdc报告的值相当。相比之下，TaFdcV变体显示出受损的对山梨酸的活性(kobs＝0.33±0.03s)，并且未检测到对肉桂酸的活性。当暴露在光下时，与黑暗中保存的酶相比，TaFdc山梨酸脱羧活性逐渐劣化，半衰期为1h。这与如前所述的Fdc光敏度一致。在用405nm LED灯照射后，TaFdc和TaFdcV的紫外-可见光吸收光谱中的特征性380nm峰不可逆地分裂为365nm和425nm处的峰。
TaFdc和TaFdcV两者与3-甲基巴豆酸一起孵育触发了蛋白质紫外-可见光光谱的变化，以显露出在340nm和425nm处的峰，表明了在周转条件下积累的共价底物:prFMN加合物。在脱盐步骤后，光谱返回到分离时的380nm单一特征，证实未与3-甲基巴豆酸形成长寿命的抑制性共价复合物。将80μmol的TaFdcV与10mM的3-甲基巴豆酸一起孵育导致了对应的紫外-可见光谱的完全迁移。相比之下，野生型TaFdc需要与50mM的3-甲基巴豆酸长时间一起孵育才能实现全光谱转换，表明了野生型酶的明显更高的KD和/或加合物形成率。
脱盐样品的ESI-MS谱显示出与prFMN亚胺离子和推定的Int3 prFMN与3-甲基巴豆酸的环加合物两者对应的峰。这可能是由于一小部分的3-甲基巴豆酸保持作为Int3与prFMN结合，表明Int3消除是限速步骤，或者一部分的Int3物质已不可逆地异构化为更稳定的构象。
为了评定缺乏扩展共轭的丙烯酸的活性范围，将TaFdc和TaFdcV与反式-2-戊烯酸和反式-2-己烯酸一起孵育，所述化合物反式-2-戊烯酸和反式-2-己烯酸先前已被报道经历了某种AnFdc介导的脱羧。紫外-可见光吸收光谱表明，TaFdc结合了两种酸，而TaFdcV变体偏好较小的戊烯酸，并且需要更高的浓度才能完全结合己烯酸。同与3-甲基巴豆酸一起孵育的样品相比，与戊烯酸或己烯酸一起孵育的样品的紫外-可见光光谱不受脱盐步骤的影响，表明戊烯酸和己烯酸不可逆地与TaFdc/TaFdcV结合。定量GC测定表明由AnFdc从己烯酸生产戊烯仅限于单次周转。
TaFdc和TaFdcV的晶体结构揭露了突变对底物结合口袋的影响
为了了解TaFdcV突变如何帮助异丁烯生产，分别以和的分辨率解析TaFdc和TaFdcV的晶体结构。野生型和变异晶体结构的重叠显示关键残基F447、Q200和E287-R183-E292的催化网络不受突变的影响(图5A)。T405M突变位于活性位点处，朝向prFMN尿嘧啶环上方的空间延伸，而Q448W和F404Y突变位于来自活性位点的第二个壳中。E292残基侧链占据“上”构象和“下”构象，而弱电子密度表明了L449侧链具有高度迁移率。可移动的E292和L449门控活性位点的进入(图5B)，而TaFdcV中的Q448W突变使结合口袋变窄(图5C)。T405M和Q448W突变可能通过增强底物/活性位点形状互补性、阻止接取更大的底物来增加对TaFdcV中3-甲基巴豆酸的选择性(图6)。虽然TaFdc和TaFdcV晶体结构的比较揭露了进化酶选择性增加的基础，但目前尚不清楚为什么3-甲基巴豆酸可以从Int3产生异丁烯。
与抑制剂形成稳定的环加合物
研究了巴豆酸和2-丁炔酸对TaFdcV的影响，以确定增加3-甲基巴豆酸周转率的突变是否也会影响对相关化合物的活性。TaFdcV与2-丁炔酸和巴豆酸一起孵育导致紫外-可见光光谱中380nm prFMN峰的常见分裂(图7A和图7D)，与3-甲基巴豆酸类似。然而，正如之前用戊烯酸和己烯酸时观察到的，光谱在脱盐后没有恢复，表明形成了共价抑制加合物。用TaFdc时也观察到了类似的趋势，然而需要在更高抑制剂浓度下孵育才能驱动紫外-可见光光谱的变化。
在添加巴豆酸后，紫外-可见光光谱在几分钟内发生逐渐偏移，从而允许估计加合物形成速率(图8A)。关于巴豆酸，所观察到的速率仍然是一阶的，其中在所测试的最高浓度(50mM)下kobs＝0.34±0.03min(图8B)。相比之下，紫外-可见光光谱的类似偏移在添加底物3-甲基巴豆酸后在几秒钟内并且在显著更低的3-甲基巴豆酸浓度下迅速发生。这表明巴豆酸加合物的形成受到较高KD和/或较慢环加成速率的阻碍。
ESI-MS和共结晶研究证实，TaFdcV 2-丁炔酸加合物作为Int1停滞，而TaFdcV巴豆酸加合物经历脱羧以在Int3物质处停滞(图7)。即使在1个月大的晶体中，也未检测到Int1与2-丁炔酸的脱羧。
具有三个点突变的AnFdcII与TaFdcV具有相同的活性位点构象
为了进一步了解活性位点的架构如何影响3-甲基巴豆酸的脱羧，在AnFdc中引入了来自TaFdcV的对应关键突变。AnFdc已被建立为模型系统，因为事实上它很容易产生原子分辨率的晶体结构。研究了两种变体：AnFdc T395M(AnFdcI)和三重突变体AnFdc T395MR435P P438W(AnFdcII)。AnFdc野生型和TaFdcV晶体结构的重叠揭露了，与AnFdc中的对应Y394相比，二级壳中TaFdcV中的Y404残基向下偏移(图9A)。与野生型相比，AnFdcI变体中的Y394残基不受影响(图9B)。相比之下，AnFdcII变体的活性位点与Y394和M395的构象中TaFdcV的活性位点相匹配(图9C)。
如所预期的，AnFdcI和AnFdcII都不具有对肉桂酸的活性，这可能是由于底物苯环与M395之间的冲突。虽然在2h时的孵育中通过紫外-可见光光谱无法检测到AnFdc野生型中巴豆酸的结合，但是从紫外-可见光光谱可以明显看出，突变体AnFdcI和AnFdcII都很容易与抑制剂结合，表明了增加的对较小底物的选择性。
TaFdcII具有与TaFdcV可比的异丁烯生产活性
纯化选定的TaFdc变体(野生型、TaFdcI(即T405M、TaFdcV、TaFdcII)和AnFdc变体(野生型、AnFdcI、AnFdcII)并测定异丁烯产量。TaFdcII(F404Y、T405M、V445P、Q448W)是通过基于TaFdc野生型、TaFdcV和AnFdcII的结构分析进行合理设计创建的。孵育2h和4h后获得的异丁烯滴度的比较揭露了，与野生型酶相比，TaFdcI和AnFdcI产生4-9倍的异丁烯量。AnFdcII和TaFdcII的附加突变导致异丁烯产量分别大幅进一步增加18倍和81倍(图10)。令人惊讶的是，用TaFdcII获得的体外滴度略高于所获得的对应TaFdcV水平(图11)。因此，TaFdcII中的4个点突变(F404Y、T405M、V445P、Q448W)和AnFdcII中的3个点突变(T395M、R435P、P438W)创建了与TaFdcV相同的活性位点结构(图9)，似乎在很大程度上负责与野生型TaFdc和AnFdc相比增加的异丁烯活性。
虽然AnFdc野生型被包含在最初的UbiD筛选中，但是AnFdc野生型的体内活性与TaFdc相比是90倍低。因此，AnFdc尽管具有与TaFdc可比的体外活性，但并未被选择用于进一步定向进化。不同且较低的体内活性可能归因于代谢物(例如苯乙醛)的AnFdc特异性抑制。
使用来自表达TaFdc变体的细胞与表达MVD和/或M3K的细胞的粗细胞裂解物对体外异丁烯生产水平进行的初步比较揭露了：与MVD/M3K水平相比，观察到TaFdcV增加了约50倍(图12)。这表明，与先前描述的酶系统相比，进化的TaFdcV在催化脱羧步骤方面要优越得多。
计算研究揭露了异丁烯生产的机理基础
令人好奇的是，巴豆酸与3-甲基巴豆酸之间发生的单个甲基差异决定了所述化合物是进化的Fdc变体的底物还是抑制剂。附加甲基基团对Int3环消除的显著影响表明这个步骤可能经由通过附加超共轭效应稳定化的阳离子或自由基β碳行进。使用密度泛函理论(DFT)活性位点‘簇’模型(图13)来研究为什么与巴豆酸相比，TaFdcV会使3-甲基巴豆酸脱羧并消除3-甲基巴豆酸。
通过改变Cα–C1和Cβ–C4a键长，计算了巴豆酸和3-甲基巴豆酸两者将Int3环消除成非共价产物复合物的势能面(图14)。这些表明3-甲基巴豆酸经历了更加异步的消除，其中过渡态Cα–C1和Cβ–C4a键长分别为和相比之下对于巴豆酸来说分别为和这与同巴豆酸相比，3-甲基巴豆酸的C与prFMN之间发生的电荷分离增加有关(表5和表6)，可能受到3-甲基巴豆酸情况下的附加超共轭的影响。与使用3-甲基巴豆酸时从Int3的异丁烯释放相比，来自巴豆酸Int3环加合物的丙烯释放更吸热高约8kJ mol-1，并且能垒高19kJ mol-1。如果两种反应的活化熵相似，则过渡态能量差异转化为在293K下从Int3释放丙烯的速率较慢为约2200，这解释了在所测试的条件下缺乏巴豆酸周转。
表5：使用3-甲基巴豆酸的DFT模型的自然电荷分析
表6：使用巴豆酸的DFT模型的自然电荷分析
UbiD酶对prFMN依赖性(脱)羧的限制
TaFdc至TaFdcV的定向进化导致了对3-甲基巴豆酸的活性显著增加。令人惊讶的是，进化的突变体仍然无法将巴豆酸转化成对应的丙烯。这与之前旨在扩展AnFdc底物库以包括(杂)芳族化合物的研究形成对比。在这种情况下，针对杂芳族双环化合物的活性的进化产生了能够转化甚至萘甲酸的广泛特异性变体。因此，3-甲基巴豆酸可能代表了对真正的UbiD底物的限制，表明prFMN依赖性催化需要的不仅仅是α,β-不饱和丙烯酸(即仲C碳)来产生可逆的环消除。
事实上，巴豆酸很容易与(进化的)Fdc形成不可逆加合物，所述不可逆加合物行进到产物形成之前的最后一步。在较小的底物(例如(3-甲基)巴豆酸)的情况下，酶诱导的菌株作为优化能量景观的工具的范围很小。在这种情况下，异丁烯的环消除似乎在环境条件下可行，而丙烯生产则不然。计算研究提供了这些观察结果背后的基本原理，表明从Int3的丙烯释放速率减慢了约2200倍。因此，异丁烯生产的进一步优化和丙烯生产Fdc变体的未来进化将需要关注碳氢化合物消除步骤的能量学。
方法
体内异丁烯测定
在96孔板(DW96，2.2mL孔，用箔片密封)上进行体内筛选。TaFdc和其他UbiD同源物与UbiX(大肠杆菌，K-12)在大肠杆菌(BL21、DE3)中的petDuet载体(MCS1中为UbiD，并且MCS2中为UbiX)中共表达。通过气相色谱法从顶部空间检测来自0.4mL反应混合物与10mM3-甲基巴豆酸的异丁烯产量。GC方法由以下组成：将100μL顶部空间以分流比10注入RTX-1柱(15m，内径0.32mm，膜厚5μm，来自RESTEK 10178-111)，使用氮气作为载气(1mL/min流率)。将烘箱温度保持在100℃，并且将进样器和检测器维持在250℃。使用来自Messer的标准品将异丁烯校准为1000ppm、5000ppm和10,000ppm。
诱变
点突变(TaFdcI、TaFdcII、AnFdcI、AnFdcII)是使用来自New England Biolabs的Q5诱变试剂盒生成的。引物是用NEBaseChanger(New England Biolabs)设计的。通过测序(Eurofins)证实了点突变的存在。
蛋白表达
按照制造商的方案(Novagen)将含有深绿木霉Fdc(具有N末端6-组氨酸亲和标签)和UbiX(大肠杆菌，K-12)的基因的pETDuet-1载体转化到BL21(DE3)感受态细胞中。将菌落接种到Lysogeny培养液(补充有100μg/mL氨苄青霉素)中，并在37℃下振荡过夜孵育。将5mL的LB培养物接种到1L的补充有100μg/mL氨苄青霉素的Terrific培养液(TB，Formedium)中。将培养物在37℃下振荡孵育，直至光密度为0.6-0.8。用0.4mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导细胞并补充0.5mM MnCl2。将培养物在18℃下振荡孵育24h。通过离心(10min，8939×g)收获细胞并冷冻。
蛋白质纯化
向冷冻细胞补充不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物(Roche Applied Science)、溶菌酶、DNA酶和RNA酶(Sigma)，并重悬(50mM HEPES、300mM KCl，pH6.8)。通过冰上超声处理(Bandelin Sonoplus超声仪，TT13/F2尖端，30％功率，并开启20s/关闭40s，持续15min)裂解细胞并离心(1h，174,000-185,500×g，Beckman Optima LE-80k超速离心机，Ti50.2转子)。将无细胞提取物加载到Ni-NTA树脂上，用4倍柱体积的40mM咪唑缓冲液(40mM咪唑、50mM HEPES、300mM KCl，pH6.8)洗涤，并用250mM咪唑缓冲液(250mM咪唑、50mM HEPES、300mM KCl，pH 6.8)洗脱为多个1mL级分。将含有蛋白质的级分合并并脱盐到25mM HEPES、150mM KCl，pH 6.8中。通过用箔覆盖并使用黑色埃彭道夫管来最小化对光线的暴露。
环加合物形成
将TaFdcV(500μL，0.45mM蛋白质，25mM HEPES，150mM KCl，pH 6.8)与巴豆酸或2-丁炔酸一起孵育。prFMN-巴豆酸环加合物的形成之后是紫外-可见光光谱法，并且添加附加的酸直至完全转化(380nm峰完全消失)。将蛋白质脱盐至25mM HEPES、150mM KCl，pH 6.8，并铺板进行晶体试验。
结晶和X射线结构测定
通过坐滴蒸气扩散执行结晶。在4℃下筛选25mM HEPES、150mM KCl，pH 6.8中的0.3μL的1mg/mL TaFdcV和0.3μL的储库溶液，导致在BCS板中从分子维度获得了许多命中(hit)。种子储备用于在BCS板中再现TaFdc野生型晶体和与2-丁酸和巴豆酸的共晶体。将晶体用PEG200冷冻保护并在液氮中快速冷冻。使AnFdc野生型和变体在0.2M硫氰酸钾、Bis-Tris丙烷6.5、20％w/v PEG 3350中在4℃下结晶。在钻石光束线处收集衍射数据并使用CCP4套件版本7.1进行处理。使用Phaser MR版本2.8.3来用4ZA4[https://doi.org/10.2210/pdb4ZA4/pdb]作为模型执行分子替换。使用REFMAC5进行细化并在COOT版本0.9.5中进行手动重建。用AceDRG生成配体定义和坐标。
比较TaFdc变体和AnFdc变体的体外异丁烯测定
所有变体均在具有pETDuet质粒的BL21(DE3)细胞中生长，所述质粒具有在第一个多克隆位点中的Fdc变体(N末端6-His标签)和在第二多克隆位点处的UbiX(未标记，来自大肠杆菌K12的野生型)。细胞在ZYM-5052自诱导培养基中生长(30℃下达6h，之后18℃下达24h)。将Fdc变体用Protino Ni-IDA柱纯化并在-80℃下(在50mM Tris-HCl pH 7.5、1mMMnCl2、20mM NaCl、200mM KCl、10％甘油中)存储。
在50mM Tris-HCl pH 7.5、1mM MnCl2、20mM NaCl、200mM KCl中用10mM3-甲基巴豆酸和0.3mg/mL酶在DW384平板(每孔40μL，用箔片密封)中一式三份地建立3-甲基巴豆酸盐的脱羧。2h和4h后通过气相色谱法从顶部空间测量异丁烯产量。
比较TaFdc、ScMVD和PtM3K的体外异丁烯测定
使等量的含有空pETDuet(作为对照)或以下质粒之一的大肠杆菌细胞：pETDuetTaFdc_UbiX、pETDuet TaFdcV_UbiX、pETDuet PtM3K(干热嗜酸古菌(P.torridus)甲羟戊酸3-激酶，Uniprot：Q6KZB1)、pETDuet ScMVD(酿酒酵母MVD，Uniprot：P32377)或pETDuetPtM3K-ScMVD，在50mM Tris-HCl pH 7.5、20mM KCl、2mM MgCl2、1g/L溶菌酶、0.03g/L DNA酶中于37℃下裂解1h。将总共150μL的裂解液转移至2mL GC小瓶中，并添加MgCl2(10mM最终浓度)。添加底物至终浓度为50mM并且总体积为200μL，所述底物由3-羟基异戊酸盐/ATP、3-膦酰氧基-异戊酸盐/ADP或3-巴豆酸甲酯组成。在37℃或50℃下孵育4h后，通过在90℃下孵育5min使反应混合物失活。如上所述进行气相的GC分析以确定所产生的异丁烯水平。所有反应均一式两份进行。
DFT计算
基于具有巴豆酸作为Int3加合物结合的TaFdcV晶体结构来建立具有巴豆酸AQ7(365个原子)和3-甲基巴豆酸(368个原子)的TaFdcV活性位点簇模型，并用具有Becke-Johnson阻尼的Grimme色散的D3版本以及使用可极化连续介质模型[25]的ε＝5.7的通用可极化连续介质在B3LYP/6-31G(d,p)理论水平下进行建模。Cα-C1键和Cβ-C4a键对于任何单个DFT优化都是固定的，并且底物释放使用Gaussian 09修订版D.01进行建模。通过每次将一个键延长产生由约900个经DFT优化的模型(针对3-甲基巴豆酸)组成的3D能量景观。
实施例2：用减少的巴豆酸(CA)库进行从乙酰辅酶A体内产生3-甲基巴豆酸(MCA)
这个实施例显示了通过表达外源基因的重组大肠杆菌菌株生产3-甲基巴豆酸，从而构成3-甲基巴豆酸途径。
与大多数微生物一样，大肠杆菌将葡萄糖转化成乙酰辅酶A。本研究中用于将乙酰辅酶A转化成3-甲基巴豆酸的酶总结如下。
3-甲基巴豆酸生物合成途径在大肠杆菌中的表达
以下基因针对在大肠杆菌中表达进行密码子优化并由GeneArt(LifeTechnologies)合成：
-来自丙酮丁醇梭菌的thl(硫解酶)(Uniprot登录号P45359)
-来自粟酒裂殖酵母的mvaS(羟甲基戊二酰辅酶A合酶)(Uniprot登录号P54874)
-来自假单胞菌属种属的ech(烯酰辅酶A水合酶)(Uniprot登录号K9NHK2)
-编码来自Myxococcus hansupus的3-甲基戊二酸辅酶A脱羧酶的两个亚基的aibA和aibB(Uniprot登录号A0A0H4WQB1和A0A0H4WWJ4)
-来自大肠杆菌(K12菌株)的menI(ydiI)(1,4-二羟基-2-萘酰基辅酶A水解酶)(Uniprot登录号P77781)
使用含有pSC101复制起点的表达载体(参考：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC320470/)来根据WO2017/085167，实施例12中所述的工序表达以下基因：mvaS、ech、aibA、aibB、ydiI，不同之处在于FDC1(UbiD样)基因的整合，并且对于thl(硫解酶)表达，通过将来自丙酮丁醇梭菌的thl基因整合到ssrs基因座中来修饰菌株MG1655。
用于减少巴豆酸库的遗传修饰
为了减少这种产生3-甲基巴豆酸的菌株中的巴豆酸库，在染色体(基因组编辑：基因缺失、基因整合)或表达载体(基因克隆)中进行附加遗传修饰。Datsenko和Wanner(Datsenko KA,Wanner BL.One-step inactivation of chromosomal genes inEscherichia coli K-12using PCR products.Proc Natl Acad Sci U S A.2000年6月6日；97(12):6640-5.doi:10.1073/pnas.120163297.PMID:10829079；PMCID:PMC18686.)描述了基因组编辑方法。用II型限制酶进行DNA克隆。
单独的A/FabV过表达：
对于这个实施例2A，将来自齿垢密螺旋体的fabV(EC 1.3.1.44)(Uniprot登录号：Q73Q47)在用限制性消化线性化的整合载体转化后整合到大肠杆菌MG1655的mgsA基因座中。如Datsenko和Wanner所描述，整合载体含有条件复制起点(oriRγ)，需要反式作用π蛋白(pir基因产物)进行复制(例如EC100D pir+细胞，Lucigen)。整合载体包含通过连续克隆步骤装配的以下部分，并在此按5'至3'顺序叙述：
-同源1DNA序列(用于重组)：染色体中mgsA基因上游的987bp(包含mgsA启动子)
-PN25组成型启动子
-mgsA截短基因(mgsA基因的最后459bp，包含终止密码子)
-RBST7(核糖体结合位点)
-来自齿垢密螺旋体的fabV(EC 1.3.1.44)(Uniprot登录号：Q73Q47)，针对大肠杆菌中的表达进行了密码子优化，并且由GeneArt(Life Technologies)合成
-PN25终止子
-FRT-SpecR-FRT(选择盒，可使用含有重组酶翻转酶FLP的pCP20质粒切除)
-同源2DNA序列(用于重组)：染色体中mgsA基因下游的891bp(包含helD基因的3'端，其与mgsA基因方向相反)
为了进一步增加fabV表达，将该基因的额外拷贝克隆到表达载体pSC101中，该载体具有P7组成型启动子、RBST7核糖体结合位点和PN25终止子。所得到的具有减少的巴豆酸(CA)库的产生3-甲基巴豆酸(MCA)菌株在15L生物反应器中的发酵n°F2250中进行测试。
单独的B/YciA缺失：
对于这个实施例2B，使来自大肠杆菌的yciA(EC 3.1.2.20)(Uniprot登录号：P0A8Z0)在用侧接有可切除选择盒(FRT-抗生素抗性基因-FRT)的包含50bp同源序列(用于重组)的PCR产物转化后在染色体中被缺失，如Datsenko和Wanner所述。所得到的具有减少的巴豆酸(CA)库的产生3-甲基巴豆酸(MCA)菌株在1L生物反应器中的发酵n°F2253中进行测试。
C/FabV过表达和yciA缺失
对于这个实施例2C，将来自齿垢密螺旋体的fabV(EC 1.3.1.44)(Uniprot登录号：Q73Q47)克隆到具有P7组成型启动子、RBST7核糖体结合位点和PN25终止子的表达载体pSC101中，并且使来自大肠杆菌(EC 3.1.2.20)的yciA(Uniprot登录号：P0A8Z0)在染色体中被缺失(参见实施例1B)。将所得到的具有减少的巴豆酸(CA)库的产生3-甲基巴豆酸(MCA)的菌株在1L生物反应器中在发酵n°F2255中进行测试。
单独的D/FabI过表达
对于这个实施例2D，将来自大肠杆菌的fabI(EC 1.3.1.9和EC 1.3.1.104)(Uniprot登录号：P0AEK4)克隆到包含经修饰的多克隆位点(pUC18 MCS)的pUC18(NewEngland Biolabs)的经修饰版本(WO 2013/007786)中，并从lac启动子表达。用这种附加表达载体转化具有pSC101表达载体的产生3-甲基巴豆酸(MCA)菌株以实现fabI过表达，这赋予重组菌株氨苄青霉素抗性。这是在1L生物反应器中的发酵n°F2226中测试的。所得的产生3-甲基巴豆酸(MCA)的菌株显示出巴豆酸(CA)库的10倍减少，以及3-甲基巴豆酸(MCA)的产量的3倍减少。
E/FabI过表达和tesB缺失
对于这个实施例2E，将来自大肠杆菌的fabI(EC 1.3.1.9和EC 1.3.1.104)(Uniprot登录号：P0AEK4)克隆到包含经修饰的多克隆位点(pUC18 MCS)的pUC18(NewEngland Biolabs)的经修饰版本(WO 2013/007786)中，并从lac启动子表达。
使来自大肠杆菌的tesB(EC 3.1.2.20)(Uniprot登录号：P0AGG2)在用侧接有可切除选择盒(FRT-抗生素抗性基因-FRT)的包含50bp同源序列(用于重组)的PCR产物转化后在染色体中被缺失，如Datsenko和Wanner所述。
使用附加表达载体转化具有tesB缺失的产生3-甲基巴豆酸(MCA)的菌株，以实现fabI过表达。这是在1L生物反应器中在发酵n°F2221中测试的。与参考菌株相比，所得菌株显示出相似的3-甲基巴豆酸(MCA)产量，但具有减少的巴豆酸(CA)库。因此，当两种遗传修饰(fabI过表达和tesB缺失)共同使用时，观察到了有益的效应。
对于每个实施例，所得菌株均变成电感受态的并用对应的质粒转化。
然后将转化的细胞铺板在LB平板上(含有适当的抗生素)，并将平板在30℃下孵育过夜。如下所述，使用分离的菌落来制备预培养物。
15L生物反应器(实施例2A，F2250)中3-甲基巴豆酸的生产及其纯化
向15L容器中装入7.5L含有15g/L酵母提取物、50mM谷氨酸钠、6.25mM磷酸二氢钾和6.25mM磷酸氢二钠的培养基，并在121℃下灭菌20分钟。在冷却后，以10μM氯化铁、4μM氯化钙、2μM氯化锰、2μM硫酸锌和0.4μM氯化铜的终浓度添加经过滤灭菌的痕量金属。然后以5g/L的终浓度添加经过滤灭菌的葡萄糖。
除了分批培养基之外，还制备了由600g/L葡萄糖溶液组成的分批补料溶液。
用500mL的先前在含有50mM谷氨酸钠、34g/l七水合硫酸镁和10mg/l四环素的LB培养基中于30℃下生长的菌株的预培养物接种该培养基。将温度保持在32℃达10小时，然后升至34℃。以相同的方式，首先用5M磷酸和30％氨将pH调节至7.2持续10小时，然后调节至7.6。通气量设定为每分钟4升，并调节搅动以将溶氧维持在20％的饱和度。在培养7小时、8小时、9小时后三次添加5g/l葡萄糖。
培养开始10h后开始葡萄糖分批补料。调整初始进料速率以递送4.5g/l/h葡萄糖，然后在10h后线性降低以递送3.5g/l/h。在新的24小时时段后，将进料速率再次线性降低以递送2g/l/h葡萄糖。在此之后调节葡萄糖的进料速率以将葡萄糖维持在约1g/l至3g/l的低水平。
在培养64h后停止发酵。然后通过离心澄清培养基并用于纯化3-巴豆酸甲酯，如WO2022/136207中所述。简言之，通过添加98％硫酸酸化所得上清液，直至pH调节至pH 3.5。然后使用旋转蒸发器R300(Buchi)在80℃的加热温度、10℃的冷却温度和150毫巴的压力下进行蒸发。在冷凝器上回收3-甲基巴豆酸晶体。通过用水洗涤将它们去除并与馏出物混合。进行蒸发直至残余物变得粘稠。回收含有3-甲基巴豆酸的馏出物。然后将3M氢氧化钠添加到馏出物中，以将pH调节至值9.1。将所获得的3-甲基巴豆酸钠溶液在80℃的加热温度、10℃的冷却温度和150毫巴的压力下蒸发，直到达到接近3M的产物浓度。
将浓缩液通过HPLC进行分析(Hiplex柱，40℃，流动相为0.8mL/min的5mM硫酸)，并且其组成如下表中所报告：
| 参考菌株 | 具有fabV过表达的菌株 | |
| 3-巴豆酸甲酯(M) | 2.9 | 3.3 |
| 乙酸盐(M) | 0.89 | 0.83 |
| 巴豆酸盐(μM) | 1289 | 41 |
在1L生物反应器中生产3-甲基巴豆酸(实施例2B，F2253；实施例2C，F2255；实施例
D，F2226；实施例2E，F2221)
向1L容器中加入0.5L培养基，所述培养基含有15g/L酵母提取物、71.6mM谷氨酸钠、6.2mM磷酸二氢钾、7.8mM磷酸氢二钠、80μL/L消泡剂(Struktol J673，Schill undSeilacher)和痕量金属(以为10μM氯化铁、4μM氯化钙、2μM氯化锰、2μM硫酸锌、0.4μM氯化铜的终浓度添加)并在121℃下灭菌20分钟。冷却后，添加终浓度为5g/L的经过滤灭菌的葡萄糖(除了分批培养基之外，还制备含600g/L的经过滤灭菌的葡萄糖的补料分批溶液)。
向培养基接种30mL的OD600＝0.5的预培养物(在合适时，之前在30℃下在含有50mM谷氨酸钠、300mM硫酸镁、10mg/L四环素和100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中生长)。
在整个培养过程中，用含5M磷酸的酸溶液和含10M氢氧化钠的碱溶液调节培养基的pH。
对于培养的前9小时，将温度保持在32℃，将pH调节在pH 7.2，将通气量设置为0.25L/min，调节搅动以将溶氧维持在15％饱和度，并且在t＝6h、t＝7h和t＝8h处添加5g/L的葡萄糖(3×5g/L)。在t＝9h时，将温度升高至高达34℃，将pH调节至pH 7.6并添加3g/l葡萄糖。将葡萄糖的进料速率设置为5.5g/l/h持续6h，然后在24h内降低至达到2g/l/h。还调整葡萄糖的进料速率以避免培养基中葡萄糖(1-3g/L)和乙酸的积累。
通过HPLC(Hiplex柱，40℃，流动相为0.8mL/min的5mM硫酸)监测培养基中3-甲基巴豆酸和巴豆酸的浓度。当乙酸而不是所需产物开始积累时，发酵停止。
实施例3：用减少的巴豆酸(CA)库从3-甲基巴豆酸进行3-甲基巴豆酸(MCA)至异丁烯(IBN)的生物转化
这个实施例显示通过表达允许从3-甲基巴豆酸生产异丁烯的外源基因的重组大肠杆菌菌株生产异丁烯：
以下基因针对在大肠杆菌中表达进行密码子优化并由GeneArt(LifeTechnologies)合成：
-来自弗氏耶尔森菌的FDC1(阿魏酸脱羧酶)(Uniprot登录号A0A0T9UUQ9)
-来自肺炎克雷伯氏菌的kpdB(UbiX样黄素异戊二烯基转移酶)(Uniprot登录号Q462H4)
使用含有pSC101复制起点的表达载体(参考：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC320470/)来表达所述基因。
将大肠杆菌MG1655细胞用构建的质粒转化，并在含有酵母提取物和矿物盐以及作为碳源的葡萄糖的丰富培养基上生长至细胞密度为约35g/L。通过离心收集细胞，并以100g/L的浓度重悬于上清液中，并在使用前在4℃下保存至多3周。
向一升生物反应器装入37.5ml的100g/L细胞浓缩物和262.5ml水。将温度设定为37℃，并将搅动设置为400rpm。通过喷雾器用氮气对容器进行通风，以从生物反应器的顶部空间冲洗掉空气。分析出口气体，并且当不再检测到氧气时，将氮气供应量设置为每分钟0.3升。向生物反应器进给在实施例2A中获得的3-甲基巴豆酸钠浓缩物溶液(F2250)(参见上文)。调节进料速率以递送7.1毫摩尔/小时的3-甲基巴豆酸钠，只要3-巴豆酸酯不在培养液中累积即可，然后逐渐降低进料速率以维持培养液中3-甲基巴豆酸钠的浓度低于50mM。用30％磷酸将pH调节至6.5。每小时至少4次测量废气组成，以计算异丁烯的产量。3-巴豆酸甲酯(MCA)生物转化为异丁烯进行172h。
所得生物转化的异丁烯体积生产率(g/L/h)显示在实施例3A(图22)中，并且异丁烯总产量(g/L)显示在实施例3B(图23；F2262)中。
实施例4：从具有减少的巴豆酸(CA)库的菌株进行从乙酰辅酶A体内产生异丁烯(IBN)
这个实施例显示了通过表达外源基因的重组大肠杆菌菌株直接生产异丁烯，从而构成异丁烯途径。
与大多数微生物一样，大肠杆菌将葡萄糖转化成乙酰辅酶A。本研究中用于将乙酰辅酶A转化成异丁烯的酶总结如下。
异丁烯生物合成途径在大肠杆菌中的表达
以下基因针对在大肠杆菌中表达进行密码子优化并由GeneArt(LifeTechnologies)合成：
-来自丙酮丁醇梭菌的thl(硫解酶)(Uniprot登录号P45359)
-来自粪肠球菌的mvaS(羟甲基戊二酰辅酶A合酶)(Uniprot登录号Q835L4)
-来自假单胞菌属种属的ech(烯酰辅酶A水合酶)(Uniprot登录号K9NHK2)
-编码来自Myxococcus hansupus的3-甲基戊二酸辅酶A脱羧酶的两个亚基的aibA和aibB(Uniprot登录号A0A0H4WQB1和A0A0H4WWJ4)
-来自大肠杆菌(K12菌株)的menI(ydiI)(1,4-二羟基-2-萘酰基辅酶A水解酶)(Uniprot登录号P77781)
-来自链霉菌属种属769的FDC1(阿魏酸脱羧酶)(Uniprot登记号A0A0A8EV26)
根据WO2017/085167，实施例12中所述的工序，使用含有pSC101复制起点的表达载体(参考：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC320470/)来表达以下基因：mvaS、ech、aibA、aibB、ydiI、FDC1。
将来自粪肠球菌的mvaS基因和来自大肠杆菌(菌株K12)的UbiX(Uniprot登录号P0AG03)的附加拷贝克隆到包含经修饰的多克隆位点(pUC18 MCS)的pUC18(New EnglandBiolabs)的经修饰版本(WO 2013/007786)中，并从lac启动子表达。
通过将来自丙酮丁醇梭菌的thl基因整合到ssrS基因座中来修饰菌株MG1655，并且将来自大肠杆菌W的蔗糖操纵子cscAKB整合到zwf基因座中以利用蔗糖作为碳源。
进行遗传修饰以减少巴豆酸产量并增加异丁烯产量
为了减少产生异丁烯的菌株中巴豆酸产量，在染色体中进行附加的遗传修饰。如实施例2A中所述，将来自齿垢密螺旋体的FabV(EC 1.3.1.44)(Uniprot登录号：Q73Q47)整合到大肠杆菌的mgsA基因座中。
将所得菌株变成电感受态的并用两种表达载体转化。然后将转化的细胞铺板在含有10mg/L四环素和100mg/L氨苄青霉素的LB平板上，并将平板在30℃下孵育过夜。如下所述，使用分离的菌落来制备预培养物。
在1L生物反应器中从蔗糖生产异丁烯(F2238)
向1L容器中加入0.5L的含有5g/L酵母提取物、10g/L胰蛋白胨、50mM L谷氨酸一水合钠、5mM硫酸钠、10mM硫酸铵、25mM一盐基磷酸钾、31.3mM磷酸二氢钠、80μL/L消泡剂(Struktol J673，Schill und Seilacher)的培养基并在121℃下灭菌20分钟。在冷却后，加入经过滤灭菌的溶液以获得以下终浓度：4mM硫酸镁、1X痕量金属溶液(50μM氯化铁III、20μM氯化钙、10μM氯化锰、10μM硫酸锌、2μM氯化钴II、2μM氯化铜、2μM氯化镍II、2μM钼酸钠、2μM亚硒酸钠、2μM硼酸)、10mg/L四环素、100mg/L氨苄青霉素、0.2g/L盐酸硫胺素、1.2g/L泛酸钙、5g/L甘油、1g/L蔗糖。还制备经过滤灭菌的补料分批溶液(700g/L蔗糖、107mM L-谷氨酸一水合钠、4.15mM硫酸镁、10X痕量金属溶液)。
向培养基接种50mL的OD600＝0.5的预培养物(之前在30℃下在含有50mM L-谷氨酸单水合物、10mg/L四环素、100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中生长)。
在整个培养过程中，用含5M磷酸的酸溶液和含30％氢氧化铵的碱溶液调节培养基的pH。
对于培养的前40小时，将温度保持在32℃，将pH调节在pH 6.5，将通气量设置为1L/min，并调节搅动以将溶氧维持在15％饱和度。在生长期期间，还在t＝12h、t＝14h、t＝16h、t＝18h、t＝20h、t＝22h、t＝24h和t＝26h时添加5g/L的酵母提取物。在t＝12h时，补料分批溶液的指数补料以0.1g蔗糖/g DCW/h开始，在t＝40h时处达到0.35g蔗糖/g DCW/h。在t＝40h，将温度升至34℃，并调节搅动以将溶氧维持在5％饱和度。使补料分批溶液的进料保持在0.35g蔗糖/g DCW/h达8小时，然后在16小时后减少以达到0.25g蔗糖/g DCW/h。还调整补料速率以避免培养基中蔗糖(<2g/L)的积累。
通过质谱法测量气相中异丁烯的产量，并通过HPLC监测培养基中巴豆酸的浓度(Hiplex柱，在40℃下，流动相为0.8mL/min的5mM硫酸)。
结果(F2238)
通过将来自齿垢密螺旋体的fabV(EC 1.3.1.44)(Uniprot登录号：Q73Q47)整合到大肠杆菌的产生异丁烯的菌株的mgsA基因座中，在培养基中不再检测到巴豆酸(实施例4A；图24)，并且异丁烯生产可以维持较长时段(实施例4B；图25)，这增加了异丁烯总产量(实施例4C；图26)。
实施例5：将巴豆酸(CA)转化为巴豆酰辅酶A的酶的鉴定
使用两种酶将巴豆酸(CA)转化为巴豆酰辅酶A：
1/EC 6.2.1:酸性硫醇连接酶
这种酶类别催化从羧酸盐和硫醇供体(例如辅酶A或[酰基载体蛋白])以消耗一个核苷三磷酸分子(例如ATP)为代价形成硫酯键：
羧酸盐+NTP+辅酶A→酰基辅酶A+NMP+二磷酸盐
羧酸盐+NTP+辅酶A→酰基辅酶A+NDP+磷酸盐(例如形成ADP)
羧酸盐+NTP+[酰基载体蛋白]→酰基-[酰基载体蛋白]+NMP+二磷酸盐
羧酸盐+NTP+[酰基载体蛋白]→酰基-[酰基载体蛋白]+NDP+磷酸盐(例如形成ADP)
使用以下三种酸辅酶A连接酶将巴豆酸(CA)转化成巴豆酰辅酶A：来自酸养互营菌的两种酸辅酶A连接酶(Uniprot：Q2LRH0(SEQ ID NO:55)和Q2LRH7(SEQ ID NO:56))(KungJW,Seifert J,von Bergen M,Boll M.Cyclohexanecarboxyl-coenzyme A(CoA)andcyclohex-1-ene-1-carboxyl-CoA dehydrogenases,two enzymes involved in thefermentation of benzoate and crotonate in Syntrophus aciditrophicus.JBacteriol.2013年7月；195(14):3193-200.doi:10.1128/JB.00322-13.)和来自铜绿假单胞菌的酸辅酶A连接酶(Uniprot:Q9HX89；SEQ ID NO:57)(Hokamura A,Wakida I,MiyaharaY,Tsuge T,Shiratsuchi H,Tanaka K,Matsusaki H.Biosynthesis of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyalkanoates)by recombinant Escherichia coli fromglucose.J Biosci Bioeng.2015年9月；120(3):305-10.doi:10.1016/j.jbiosc.2015.01.022.)。
SEQ ID NO:55：
>tr|Q2LRH0|Q2LRH0_SYNAS 4-羟基苯甲酸酯--辅酶A连接酶/苯甲酸酯--辅酶A连接酶OS＝酸养互营菌(Syntrophus aciditrophicus)(菌株SB)OX＝56780GN＝SYN_02896PE＝4SV＝1
SEQ ID NO:56：
>tr|Q2LRH7|Q2LRH7_SYNAS 4-羟基苯甲酸酯--辅酶A连接酶/苯甲酸酯--辅酶A连接酶OS＝酸养互营菌(Syntrophus aciditrophicus)(菌株SB)OX＝56780GN＝SYN_02898PE＝4SV＝1
SEQ ID NO:57：
>tr|Q9HX89|Q9HX89_PSEAE可能的中链酰基辅酶A连接酶OS＝铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(菌株ATCC 15692/DSM 22644/CIP 104116/JCM 14847/LMG12228/1C/PRS101/PAO1)OX＝208964GN＝PA3924 PE＝4SV＝1
2/EC 2.8.3：辅酶A转移酶
这种酶催化辅酶A从一种羧酸盐到另一种羧酸盐的可逆转移。当乙酰辅酶A用作辅酶A供体时，反应如下：
羧酸盐+乙酰辅酶A→酰基辅酶A+乙酸盐
使用来自富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)的辅酶A转移酶(Uniprot：Q0K874；SEQ ID NO:9)将巴豆酸(CA)转化为巴豆酰辅酶A，其中乙酰辅酶A作为辅酶A供体(Lindenkamp N,Schürmann M,Steinbüchel A.A propionate CoA-transferase ofRalstonia eutropha H16 with broad substrate specificity catalyzing the CoAthioester formation of various carboxylic acids.Appl MicrobiolBiotechnol.2013年9月；97(17):7699-709.doi:10.1007/s00253-012-4624-9.电子版2012年12月19日，PMID:23250223。)
SEQ ID NO:9：
>tr|Q0K874|Q0K874_CUPNH乙酸辅酶A转移酶YdiF OS＝钩虫贪铜菌(Cupriavidusnecator)(菌株ATCC 17699/DSM 428/KCTC 22496/NCIMB 10442/H16/Stanier 337)OX＝381666GN＝pct PE＝3SV＝1
带有N末端6His标签的酶的克隆
这些酶的序列针对在大肠杆菌中表达进行密码子优化并由GeneArt(LifeTechnologies)合成。
将多核苷酸序列单独克隆到pET-25b(+)(Novagen)表达载体中，该表达载体的5'端具有编码6-His纯化标签的多核苷酸标签。
通过亲和色谱(Ni-NTA)纯化经6His标记的酶
通过亲和色谱(Ni-NTA)从BL21(DE3)细胞的细菌培养物中纯化酶，所述细胞含有克隆到pET-25b(+)(Novagen)表达载体中的基因，所述载体的5'端带有编码6-His纯化标签的多核苷酸标签。
酸辅酶A连接酶的表征(实施例5A；图27)
使用来自齿垢密螺旋体的纯化的FabV(EC 1.3.1.44)(Uniprot登录号：Q73Q47)(用于将巴豆酰辅酶A转化成丁酰辅酶A)，通过偶联测定将酸辅酶A连接酶作为纯化的酶进行测试。反应如下进行：50μg/ml的酸辅酶A连接酶和100μg/ml的FabV与含有100mM Tris-HCl pH 7.5、20mM NaCl、100mM KCl、2mM MgCl2、1mM巴豆酸(TCI chemicals)、1mM ATP(Sigma-Aldrich)、1mM辅酶A(Sigma-Aldrich)和1mM NADH(Sigma-Aldrich)的缓冲溶液一起在34℃在水浴中孵育18h，并用乙腈终止反应。以1mM巴豆酰辅酶A作为底物的阳性对照表明，在这些条件下，FabV可以将所述底物全部转化为丁酰辅酶A。所产生的丁酰辅酶A(Sigma-Aldrich)和所消耗的巴豆酸(TCI chemicals)通过HPLC和校准曲线进行定量。将样品在30℃下进样到Zorbax SB-Aq柱(Agilent)上并用8.4mM H2SO4和乙腈梯度洗脱。
辅酶A转移酶的表征(实施例5B；图28)
使用来自齿垢密螺旋体的纯化的FabV(EC 1.3.1.44)(Uniprot登录号：Q73Q47)(用于将巴豆酰辅酶A转化成丁酰辅酶A)，通过偶联测定将辅酶A转移酶作为纯化的酶进行测试。反应如下进行：50μg/ml的辅酶A转移酶和100μg/ml的FabV与含有100mM Tris-HCl pH7.5、20mM NaCl、100mM KCl、2mM MgCl2、1mM巴豆酸(TCI chemicals)、1mM乙酰辅酶A(Sigma-Aldrich)和1mM NADH(Sigma-Aldrich)的缓冲溶液一起在34℃在水浴中孵育18h，并用乙腈终止反应。以1mM巴豆酰辅酶A作为底物的阳性对照表明，在这些条件下，FabV可以将所述底物全部转化为丁酰辅酶A。所产生的丁酰辅酶A(Sigma-Aldrich)和所消耗的巴豆酸(TCI chemicals)通过HPLC和校准曲线进行定量。将样品在30℃下进样到Zorbax SB-Aq柱(Agilent)上并用8.4mM H2SO4和乙腈梯度洗脱。
Claims (49)
1.一种重组生物体或微生物，所述重组生物体或微生物由于以下中的至少一者而与其所来源于的生物体或微生物相比具有减少的巴豆酸库：
(i)巴豆酰辅酶A至丁酰辅酶A的转化增加；和/或丁酰辅酶A至丁酸的转化增加；
(ii)巴豆酰辅酶A至3-羟基丁酰辅酶A的转化增加；和/或3-羟基丁酰辅酶A至3-羟基丁酸的转化增加；
(iii)巴豆酸至巴豆酰辅酶A的转化增加；
(iv)巴豆酰基-[酰基载体蛋白]至丁酰基[酰基载体蛋白]的转化增加；
(v)巴豆酰基-[酰基载体蛋白]至巴豆酸的转化减少；和/或
(vi)巴豆酰辅酶A至巴豆酸的转化减少。
2.根据权利要求1所述的重组生物体或微生物，其中所述重组生物体或微生物是重组微生物；特别地其中所述重组微生物是真菌或细菌；特别地其中所述细菌是大肠杆菌。
3.根据权利要求1或2所述的重组生物体或微生物，其中所述巴豆酰辅酶A至丁酰辅酶A的转化增加是由于所述生物体或微生物中的至少一种能够还原碳-碳双键的酶(EC 1.3)的水平和/或活性增加，特别地其中所述能够还原碳-碳双键的酶(EC 1.3)是NADH或NADPH依赖性的(EC 1.3.1)或黄素依赖性的(EC 1.3.8)。
4.根据权利要求3所述的重组生物体或微生物，其中所述能够还原碳-碳双键的NADH或NADPH依赖性酶(EC 1.3.1)是巴豆酰辅酶A还原酶(EC 1.3.1.86)、反式-2-烯酰基辅酶A还原酶(EC 1.3.1.44)和/或烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(EC 1.3.1.9)。
5.根据权利要求4所述的重组生物体或微生物，其中
(i)所述反式-2-烯酰基辅酶A还原酶(EC 1.3.1.44)是来自齿垢密螺旋体的FabV；
(ii)所述巴豆酰辅酶A还原酶(EC 1.3.1.86)是来自山丘链霉菌的Ccr；和/或
(iii)所述烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(EC 1.3.1.9)是来自大肠杆菌的FabI。
6.根据权利要求3所述的重组生物体或微生物，其中所述能够还原碳-碳双键的黄素依赖性酶(EC 1.3.8)是短链酰基辅酶A脱氢酶(EC 1.3.8.1)。
7.根据权利要求6所述的重组生物体或微生物，其中所述短链酰基辅酶A脱氢酶(EC1.3.8.1)是来自埃氏巨型球菌的短链酰基辅酶A脱氢酶；和/或来自发酵氨基酸球菌的具有电子转移黄素蛋白(Etf)的丁酰辅酶A脱氢酶(Bcd)。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的重组生物体或微生物，其中丁酰辅酶A至丁酸的转化增加是由于所述生物体体或微生物中的硫酯水解酶(EC 3.1.2)、辅酶A转移酶(EC2.8.3)、酸性硫醇连接酶(EC 6.2.1)、磷酸酰基转移酶(EC 2.3.1)和/或酸性激酶(EC2.7.2)的水平和/或活性增加。
9.根据权利要求8所述的重组生物体或微生物，其中所述硫酯水解酶(EC 3.1.2)是1,4-二羟基-2-萘酰基-辅酶A水解酶(EC 3.1.2.28)和/或酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)。
10.根据权利要求9所述的重组生物体或微生物，其中
(i)所述1,4-二羟基-2-萘酰基-辅酶A水解酶(EC 3.1.2.28)是来自大肠杆菌的MenI；和/或
(ii)所述酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)是来自大肠杆菌的TesB。
11.根据权利要求8所述的重组生物体或微生物，其中所述辅酶A转移酶(EC 2.8.3)是乙酸辅酶A转移酶和/或丁酰辅酶A:乙酸辅酶A转移酶(EC 2.8.3.8)。
12.根据权利要求11所述的重组生物体或微生物，其中
(i)所述乙酸辅酶A转移酶(EC 2.8.3.8)是来自钩虫贪铜菌的YdiF(Pct)；和/或
(ii)所述丁酸:乙酰辅酶A转移酶(EC 2.8.3.8)由来自沃氏共养单胞菌沃氏亚种的Swol_1932或Swol_0436编码。
13.根据权利要求8所述的重组生物体或微生物，其中所述酸性硫醇连接酶(EC 6.2.1)是乙酸辅酶A连接酶(形成ADP)(EC 6.2.1.13)。
14.根据权利要求13所述的重组生物体或微生物，其中所述乙酸辅酶A连接酶(形成ADP)(EC 6.2.1.13)由来自橙色绿屈挠菌的基因Caur_3920和/或来自痢疾变形虫的基因EHI_178960编码和/或其中所述乙酸辅酶A连接酶(形成ADP)(EC 6.2.1.13)是来自肠贾第虫(兰氏贾第鞭毛虫)的蛋白质Q9Y1N2。
15.根据权利要求8所述的重组生物体或微生物，其中所述磷酸酰基转移酶(EC 2.3.1)是磷酸丁酰转移酶(EC 2.3.1.19)和/或其中所述酸性激酶(EC 2.7.2)是丁酸激酶(EC2.7.2.7)。
16.根据权利要求15所述的重组生物体或微生物，其中
(i)所述磷酸丁酰转移酶(EC 2.3.1.19)是来自丙酮丁醇梭菌的Ptb；和/或
(ii)所述丁酸激酶(EC 2.7.2.7)是来自丙酮丁醇梭菌的Buk。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的重组生物体或微生物，其中所述巴豆酰辅酶A至3-羟基丁酰辅酶A的转化增加是由于所述生物体或微生物中的水裂合酶(EC 4.2.1)的水平和/或活性增加。
18.根据权利要求17所述的重组生物体或微生物，其中所述氢裂合酶(EC 4.2.1)是短链烯酰基辅酶A水合酶(EC 4.2.1.150)、3-羟基丁酰辅酶A脱水酶(EC 4.2.1.55)和/或烯酰辅酶A水合酶(EC 4.2.1.17)。
19.根据权利要求18所述的重组生物体或微生物，其中
(i)所述短链烯酰辅酶A水合酶(EC 4.2.1.150)是来自红色亚栖热菌、勤奋金属球菌或丙酮丁醇梭菌的短链烯酰基辅酶A水合酶；
(ii)所述3-羟基丁酰辅酶A脱水酶(EC 4.2.1.55)是来自和平铁古球菌的3-羟基丁酰辅酶A脱水酶；和/或
(iii)所述烯酰辅酶A水合酶(EC 4.2.1.17)是来自褐家鼠的烯酰辅酶A水合酶。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的重组生物体或微生物，其中所述3-羟基丁酰辅酶A至3-羟基丁酸的转化增加是由于所述生物体或微生物中的硫酯水解酶(EC 3.1.2)的水平和/或活性增加。
21.根据权利要求20所述的重组生物体或微生物，其中所述硫酯水解酶(EC 3.1.2)是棕榈酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.2)和/或酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)。
22.根据权利要求21所述的重组生物体或微生物，其中
(i)所述棕榈酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.2)是来自深海发光杆菌的棕榈酰辅酶A水解酶；和/或
(ii)所述酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)是来自大肠杆菌的TesB或YciA。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的重组生物体或微生物，其中所述巴豆酸至巴豆酰辅酶A的转化增加是由于所述生物体或微生物中的辅酶A转移酶(EC 2.8.3)和/或酸性硫醇连接酶(EC 6.2.1)和/或酸性激酶(EC 2.7.2)和/或磷酸酰基转移酶(EC 2.3.1)的水平和/或活性增加。
24.根据权利要求23所述的重组生物体或微生物，其中所述辅酶A转移酶(EC 2.8.3)是乙酸辅酶A转移酶(EC 2.8.3.8)。
25.根据权利要求24所述的重组生物体或微生物，其中
(i)所述乙酸辅酶A转移酶(EC 2.8.3.8)是来自钩虫贪铜菌的YdiF(Pct)；和/或
(ii)所述丁酸:乙酰辅酶A转移酶(EC 2.8.3.8)由来自沃氏共养单胞菌沃氏亚种的Swol_1932或Swol_0436编码。
26.根据权利要求23所述的重组生物体或微生物，其中所述酸性硫醇连接酶(EC6.2.1)是中链酰基辅酶A连接酶(EC 6.2.1.2)、4-羟基苯甲酸酯辅酶A连接酶/苯甲酸酯辅酶A连接酶(EC 6.2.1.25和6.2.1.27)、4-羟基丁酸酯辅酶A连接酶(EC 6.2.1.40)和/或巯基丙酸甲酯(MMPA)辅酶A(CoA)连接酶(EC 6.2.1.44)。
27.根据权利要求26所述的重组生物体或微生物，其中
(i)所述中链酰基辅酶A连接酶(EC 6.2.1.2)由来自铜绿假单胞菌的基因PA3924编码，
(ii)所述4-羟基苯甲酸酯辅酶A连接酶/苯甲酸酯辅酶A连接酶(EC 6.2.1.25和6.2.1.27)由来自酸养互营菌(菌株SB)的基因SYN_02896或来自酸养互营菌(菌株SB)的基因SYN_02898编码，
(iii)所述4-羟基丁酸酯辅酶A连接酶(EC 6.2.1.40)由来自嗜中性热棒菌(嗜中性热变形菌)的基因Tneu_0420编码；和/或
(iv)所述巯基丙酸甲酯(MMPA)辅酶A(CoA)连接酶(EC 6.2.1.44)由来自遍在远洋杆菌的基因SAR11_0248；或由来自帕氏鲁杰氏菌的基因SPO0677；或由来自帕氏鲁杰氏菌的基因SPO2045；或由来自蓝湖鲁杰氏菌的基因SL1157_1815；或由来自蓝湖鲁杰氏菌的基因SL1157_2728或由来自铜绿假单胞菌的基因PA4198；或由来自泰国伯克霍尔德氏菌的基因BTH_I2141编码。
28.根据权利要求25所述的重组生物体或微生物，其中所述磷酸酰基转移酶(EC2.3.1)是磷酸丁酰转移酶(EC 2.3.1.19)和/或其中所述酸性激酶(EC 2.7.2)是丁酸激酶(EC 2.7.2.7)。
29.根据权利要求28所述的重组生物体或微生物，其中
(i)所述磷酸丁酰转移酶(EC 2.3.1.19)是来自丙酮丁醇梭菌的Ptb；和/或
(ii)所述丁酸激酶(EC 2.7.2.7)是来自丙酮丁醇梭菌的Buk。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的重组生物体或微生物，其中所述巴豆酰基-[酰基载体蛋白]至丁酰基[酰基载体蛋白]的转化增加是由于所述生物体或微生物中的NADH或NADPH依赖性烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(EC 1.3.1)的水平和/或活性增加，特别地其中所述NADH或NADPH依赖性烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(EC 1.3.1)是烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(NADH依赖性)(EC 1.3.1.9)、烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(NADPH依赖性)(EC 1.3.1.104)、烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(NADPH依赖性、Re特异性)(EC1.3.1.39)、烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(NADPH依赖性、Si特异性)(EC 1.3.1.10)、和/或反式-2-烯酰基辅酶A还原酶(NAD+)(EC 1.3.1.44)。
31.根据权利要求30所述的重组生物体或微生物，其中所述NADH或NADPH依赖性烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶是来自大肠杆菌的FabI(EC 1.3.1.9和EC 1.3.1.104)、来自枯草芽孢杆菌的FabI(EC 1.3.1.9)、来自枯草芽孢杆菌的FabL(EC 1.3.1.104)、来自金黄色葡萄球菌的FabI(EC 1.3.1.39)、来自牙龈卟啉单胞菌的FabK(EC 1.3.1.10和EC1.3.1.39)、来自肺炎链球菌的FabK(EC 1.3.1.10)、来自酿酒酵母的ETR1(EC 1.3.1.104)、来自鼻疽伯克霍尔德氏菌的FabV(EC 1.3.1.9和EC 1.3.1.44)、来自铜绿假单胞菌的FabV(EC 1.3.1.9和EC 1.3.1.44)、来自霍乱弧菌的FabV(EC 1.3.1.9和EC 1.3.1.44)、来自齿垢密螺旋体的FabV(EC 1.3.1.44)、来自铜绿假单胞菌的FabI(EC 1.3.1.9)、和/或来自鼻疽伯克霍尔德氏菌的FabI(EC 1.3.1.9)。
32.根据权利要求3至31中任一项所述的重组生物体或微生物，其中所述酶水平的增加是通过从重组启动子和/或从改进的核糖体结合位点表达编码相应酶的基因来实现的；和/或其中所述酶的活性增加是由于编码所述相应酶的所述基因中的一个或多个激活突变。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的重组生物体或微生物，其中所述巴豆酰基-[酰基载体蛋白]和/或巴豆酰辅酶A至巴豆酸的转化减少是由于所述生物体或微生物中的硫酯水解酶(EC 3.1.2)的水平降低和/或活性降低。
34.根据权利要求33所述的重组生物体或微生物，其中所述硫酯水解酶(EC 3.1.2)是棕榈酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.2)、酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)和/或1,4-二羟基-2-萘酰基-辅酶A水解酶(EC 3.1.2.28)。
35.根据权利要求34所述的重组生物体或微生物，其中
(i)所述硫酯水解酶(EC 3.1.2)是来自大肠杆菌的PaaY或PaaI；
(ii)所述棕榈酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.2)是来自大肠杆菌的TesA、YciA或EntH；
(iii)所述酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)是来自大肠杆菌的TesB或FadM；和/或
(iv)所述1,4-二羟基-2-萘酰基-辅酶A水解酶(EC 3.1.2.28)是来自大肠杆菌的MenI。
36.根据权利要求33至35中任一项所述的重组生物体或微生物，其中所述酶水平的降低是由于
(i)所述生物体或微生物中编码所述相应酶的基因的完全或部分缺失；和/或
(ii)所述生物体或微生物中编码所述相应酶的基因的调控元件中的缺失或失活突变；和/或
其中所述酶活性降低是由于
(i)所述生物体或微生物中编码所述相应酶的基因的失活突变；和/或
(ii)所述相应酶的抑制剂的添加。
37.根据权利要求1至36中任一项所述的重组生物体或微生物，
其中所述巴豆酰辅酶A至丁酰辅酶A的转化增加是由于反式-2-烯酰基辅酶A还原酶(EC1.3.1.44)和/或烯酰基-[酰基载体蛋白]还原酶(EC 1.3.1.9)的水平和/或活性增加；和/或
其中所述巴豆酰基-[酰基载体蛋白]和/或巴豆酰辅酶A至巴豆酸的转化减少是由于所述生物体或微生物中的硫酯水解酶(EC 3.1.2)的水平降低和/或活性降低。
38.根据权利要求37所述的重组生物体或微生物，其中所述硫酯水解酶(EC 3.1.2)是棕榈酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.2)或酰基辅酶A硫酯酶2(EC 3.1.2.20)。
39.根据权利要求1至38中任一项所述的重组生物体或微生物，所述重组生物体或微生物进一步编码阿魏酸脱羧酶；特别地其中所述阿魏酸脱羧酶催化由对应的羧酸形成烯烃。
40.根据权利要求1至39中任一项所述的重组生物体或微生物，其中所述生物体或微生物能够产生阿魏酸脱羧酶的底物。
41.根据权利要求1至40中任一项所述的重组生物体或微生物，其中所述生物体或微生物能够
(i)将乙酰辅酶A酶促转化为3-甲基巴豆酸和/或异丁烯；和/或
(ii)将3-甲基巴豆酸酶促转化为异丁烯；和/或
(iii)将顺式,顺式-粘康酸酶促转化为1,3-丁二烯；和/或
(iv)将戊二烯酸酶促转化为1,3-丁二烯。
42.根据权利要求41所述的重组生物体或微生物，其中所述将乙酰辅酶A转化为3-甲基巴豆酸包括以下步骤：
(i)将乙酰辅酶A酶促转化为乙酰乙酰辅酶A，
(ii)将所述产生的乙酰乙酰辅酶A酶促转化为3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A，
(iii)将所述产生的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A酶促转化为3-甲基戊烯二酰辅酶A，
(iv)将所述产生的3-甲基戊烯二酰辅酶A酶促转化为3-甲基巴豆酰辅酶A，以及
(v)将所述产生的3-甲基巴豆酰辅酶A酶促转化为3-甲基巴豆酸。
43.根据权利要求42所述的重组生物体或微生物，其中所述重组生物体或微生物能够将所述产生的3-甲基巴豆酸酶促转化为异丁烯。
44.根据权利要求43所述的重组生物体或微生物，其中所述3-甲基巴豆酸至异丁烯的转化是由阿魏酸脱羧酶催化的。
45.根据权利要求1至44中任一项所述的重组生物体或微生物用于生产烯烃的用途，特别地其中所述烯烃是异丁烯或1,3-丁二烯。
46.根据权利要求45所述的用途，其中所述烯烃由阿魏酸脱羧酶产生。
47.一种用于生产3-甲基巴豆酸和/或异丁烯的方法，所述方法包括在合适的条件下在合适的培养基中培养根据权利要求42至44中任一项所定义的重组生物体或微生物的步骤。
48.一种生产异丁烯的方法，所述方法包括以下步骤：
a)通过在合适的条件下在合适的培养基中培养根据权利要求42至44中任一项所定义的重组生物体或微生物来生产3-甲基巴豆酸；以及
b)将所述产生的3-甲基巴豆酸酶促转化为异丁烯。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述3-甲基巴豆酸至异丁烯的转化是由阿魏酸脱羧酶催化的。
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