BR112018009774B1 - Método para a produção de isobuteno, organismo ou microorganismo recombinante e seu uso, uso de uma enzima e composição - Google Patents

Método para a produção de isobuteno, organismo ou microorganismo recombinante e seu uso, uso de uma enzima e composição Download PDF

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Abstract

MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE ISOBUTENO, ORGANISMO OU MICROORGANISMO RECOMBINANTE E SEU USO, USO DE UMA ENZIMA E COMPOSIÇÃO. Trata-se de métodos para a produção de isobuteno que compreende a conversão enzimática de ácido 3- metilcrotônico em isobuteno, em que o dito ácido 3-metilcrotônico é obtido pela conversão enzimática de 3-metilcrotonil-CoA em ácido 3-metilcrotônico ou em que o dito ácido 3-metilcrotônico é obtido pela conversão enzimática de 3-hidroxiisovalerato (HIV) em ácido 3-metilcrotônico. É descrito que a conversão enzimática de ácido 3-metilcrotônico em isobuteno pode ser, por exemplo, alcançada fazendo-se uso de uma ácido 3-metilcrotônico decarboxilase, preferencialmente uma decarboxilase dependente de FMN associada a uma prenil transferase de FMN, uma aconitato decarboxilase (EC 4.1.1.6), uma metilcrotonil-CoA carboxilase (EC 6.4.1.4) ou uma geranoil-CoA carboxilase (EC 6.4.1.5).

Description

[001] A presente invenção refere-se a métodos para a produção de isobuteno que compreende a conversão enzimática de ácido 3-metilcrotônico em isobuteno em que o dito ácido 3-metilcrotônico é obtido pela conversão enzimática de 3- metilcrotonil-CoA em ácido 3-metilcrotônico ou em que o dito ácido 3-metilcrotônico é obtido pela conversão enzimática de 3-hidroxiisovalerato (HIV) em ácido 3- metilcrotônico. A conversão enzimática de ácido 3-metilcrotônico em isobuteno pode ser, por exemplo, alcançada fazendo uso de uma ácido 3-metilcrotônico decarboxilase, preferencialmente uma decarboxilase dependente de FMN associada a uma prenil transferase de FMN, uma aconitato decarboxilase (EC 4.1.1.6), uma metilcrotonil-CoA carboxilase (EC 6.4.1.4), ou uma geranoil-CoA carboxilase (EC 6.4.1.5). Adicionalmente, o dito 3-metilcrotonil-CoA pode ser obtido pela conversão enzimática de 3-metilglutaconil-CoA em 3-metilcrotonil-CoA.
[002] Um número grande de compostos químicos é presentemente derivado de produtos petroquímicos. Alquenos (como etileno, propileno, os butenos diferentes, ou de outro modo os pentenos, por exemplo) são usados na indústria de plástico, por exemplo, para produzir polipropileno ou polietileno, e em outras áreas da indústria química e a de combustíveis.
[003] O butileno existe em quatro formas, uma da qual isobuteno (também denominado isobutileno), entra na composição de metil-terc-butil-éter (MTBE), um aditivo antidetonante para combustível de automóvel. Isobuteno também pode ser usado para produzir isoocteno que, por sua vez, pode ser reduzido a isooctano (2,2,4- trimetilpentano); a classificação de octano muito alta de isooctano torna o mesmo o melhor combustível para os chamados motores “à gasolina”. Alquenos como isobuteno são presentemente produzidos por craqueamento catalítico de produtos de petróleo (ou por um derivado do processo de Fischer-Tropsch no caso de hexeno, de carvão ou gás). Os custos de produção são, portanto, fortemente ligados ao preço de óleo. Além disso, o craqueamento catalítico é associado algumas vezes a dificuldades técnicas consideráveis que aumentam a complexidade de processo e custos de produção.
[004] A produção por uma via biológica de alquenos, como isobuteno, é necessária no contexto de uma operação industrial sustentável em harmonia com ciclos geoquímicos. A primeira geração de biocombustíveis consistiu na produção fermentativa de etanol, visto que processos de fermentação e destilação já existiam na indústria de processamento de alimentos. A produção de biocombustíveis de segunda geração está em uma fase exploratória, a qual abrange em particular a produção de álcoois de cadeia longa (butanol e pentanol), terpenos, alcanos lineares e ácidos graxos. Duas revisões recentes fornecem uma vista geral de pesquisa nesse campo: Ladygina et al. (Process Biochemistry 41 (2006), 1.001) e Wackett (Current Opinions in Chemical Biology 21 (2008), 187).
[005] A conversão de isovalerato para isobuteno pela levedura Rhodotorula minuta foi descrita (Fujii et al. (Appl. Environ. Microbiol. 54 (1988), 583)), mas a eficácia dessa reação, menos do que 1 milionésimo por minuto, ou cerca de 1 por 1.000 por dia, está longe de permitir uma aplicação industrial. O mecanismo de reação foi elucidado por Fukuda et al. (BBRC 201 (1994), 516) e envolve uma enzima de citocromo P450 que descarboxila isovalerato por redução de um grupo oxoferrila FeV=O. A biossíntese em larga escala de isobuteno por essa via parece altamente desfavorável, visto que necessitaria da síntese e degradação de uma molécula de leucina para formar uma molécula de isobuteno. Adicionalmente, a enzima que catalisa a reação usa heme como cofator, levando a si mesmo de modo insatisfatório à expressão recombinante em bactérias e à melhora de parâmetros de enzima. Por todas essas razões, parece bem improvável que essa via possa servir como base para exploração industrial. Outros micro-organismos foram descritos como marginalmente capazes para fornecer isobuteno de produção natural de isovalerato; os rendimentos obtidos são até mesmo mais baixos do que aqueles obtidos com Rhodotorula minuta (Fukuda et al. (Agric. Biol. Chem. 48 (1984), 1679)).
[006] Gogerty et al. (Appl. Environm. Microbiol. 76 (2010), 8.004 a 8.010) e van Leeuwen et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol. 93 (2012), 1.377 a 1.387) descrevem a produção de isobuteno a partir de acetoacetil-CoA por conversões enzimáticas em que a última etapa da via proposta é a conversão de ácido 3-hidroxi-3-metilbutírico (também denominado 3-hidroxiisovalerato (HIV)) fazendo-se uso de uma mevalonato difosfato decarboxilase. Essa reação para a produção de isobuteno a partir de ácido 3-hidroxi-3-metilbutírico é também descrito no documento no WO2010/001078. Em Gogerty et al. (loc. cit.) e em van Leeuwen et al. (loc. cit.) a produção de ácido 3- hidroxi-3-metilbutírico é proposta para ser alcançada pela conversão de 3- metilcrotonil-CoA por meio de 3-hidroxi-3-metilbutiril-CoA. A fim de melhorar adicionalmente a eficácia e a variabilidade de métodos para produzir isobuteno a partir de recursos renováveis, há uma necessidade para rotas alternativas para a provisão de isobuteno e seus precursores.
[007] A presente invenção satisfaz essa demanda fornecendo-se um método para a produção de isobuteno que compreende a conversão enzimática de ácido 3- metilcrotônico (também denominado ácido 3-metil-2-butenóico) para isobuteno.
[008] A conversão enzimática de ácido 3-metilcrotônico em isobuteno é uma reação de descarboxilação. Uma descarboxilação é uma reação química que remove um grupo carboxila e libera dióxido de carbono (CO2).
[009] A descarboxilação de ácido 3-metilcrotônico já foi sugerida no documento no US-A1-2009/0092975 embora não exista evidência experimental para essa conversão. No documento no US-A1 -2009/0092975, uma sequência de ácido nucleico chamada PAD1 derivada de Saccharomyces cerevisiae é descrita e é revelada para codificar uma enzima de descarboxilação. Essa enzima é sugerida para ser útil como um marcador selecionável em um organismo recombinante enquanto é descrito que um “ácido fraco” pode ser usado como o agente de seleção. O ácido 3-metilcrotônico é mencionado, dentre muitos, como um “ácido fraco” potencial.
[010] Entretanto, foi constatado apenas posteriormente que o PAD1 acima, na realidade, não estabelece a atividade de decarboxilase.
[011] De fato, os genes ubiD e ubiX bacterianos ou os genes fdc1 e pad1 eucarióticos homólogos foram implicados na descarboxilação reversível não oxidativa. A ação combinada de ácido fenilacríclico decarboxilase (PAD) e ácido ferúlico decarboxilase (FDC) é considerada como essencial para a descarboxilação de ácido fenilacrílico em Saccharomyces cerevisiae (J. Biosci. Bioeng. 109, (2010), 564 a 569; AMB Express, 5:12 (2015) 1 a 5; ACS Chem. Biol. 10 (2015), 1.137 a 1.144).
[012] Recentemente, a família de enzima acima descrita como ácido fenilacrílico decarboxilase (PAD) foi caracterizada como uma FMN prenil-transferase e não mais como uma decarboxilase. Foi mostrado que Fdc1 (mas não PAD) é somente responsável pela atividade de decarboxilase reversível e que necessita de um tipo novo de cofator, a saber, uma flavina prenilada sintetizada pela proteína UbiX (ou Pad1) associada. Desse modo, a atividade enzimática real dessa enzima PAD foi identificada como a transformação de um cofator de mononucleotídeo de flavina (FMN) com uma porção química de prenila (de di-metil-alil-fosfato ou pirofosfato chamada DMAP ou DMAPP).
[013] Consequentemente, em contraste à ideia da técnica anterior, a decarboxilase real é a ácido ferúlico decarboxilase (FDC) em associação com o FMN modificado (FMN prenilado). Esse mecanismo da ácido ferúlico decarboxilase (FDC) em associação com o FMN modificado (FMN prenilado) (o último mencionado fornecido pela enzima PAD) foi recentemente descrito e envolve um mecanismo enzimático surpreendente, isto é, uma descarboxilação de ácido α,β-insaturado por meio de uma cicloadição 1,3-dipolar. Além disso, a estrutura dessa FDC decarboxilase foi recentemente elucidada (Nature 522 (2015), 497 a 501; Nature, 522 (2015), 502 a 505; Appl. Environ. Microbiol. 81 (2015), 4.216 a 4.223).
[014] O uso da família acima de enzimas foi anteriormente descrito para a conversão de ácido carboxílico α-β insaturado em alquenos terminais no documento no US-A1-2009/0092975 conforme mencionado acima enquanto o documento no WO2012/018624 é direcionado a micro-organismos e métodos para a biossíntese de aromáticos, 2,4-pentadienoato e 1,3-butadieno e o documento no WO2013/028519 é direcionado a micro-organismos e métodos para produzir 2,4-pentadienoato, butadieno, propileno, 1,3-butanodiol e álcoois relacionados.
[015] Além disso, o documento no WO2013/186215 descreve um método para preparar um alqueno monoinsaturado que compreende colocar um ácido carboxílico monoinsaturado alifático em contato com um polipeptídeo Fdc1 e um polipeptídeo Pad1. Entretanto, no documento no WO2013/186215, tanto o polipeptídeo Fdc1 quanto o polipeptídeo Pad1 são classificados como enzimas que têm uma atividade de decarboxilase.
[016] Em contraste, na presente invenção, as enzimas acima são artificialmente implantadas em uma via que leva finalmente à produção de isobuteno. Desse modo, em um aspecto principal, a presente invenção se refere a um método para a produção de isobuteno que compreende a conversão enzimática de ácido 3-metilcrotônico em isobuteno (a etapa I conforme mostrado na Figura 1), em que o dito método compreende adicionalmente (a) fornecer o ácido 3-metilcrotônico pela conversão enzimática de 3- metilcrotonil-CoA em ácido 3-metilcrotônico (etapas VIa, VIb ou VIc conforme mostrado na Figura 1), ou (b) fornecer o ácido 3-metilcrotônico pela conversão enzimática de 3- hidroxiisovalerato (HIV) em ácido 3-metilcrotônico (etapa II conforme mostrado na Figura 1).
[017] Preferencialmente, a conversão enzimática de ácido 3-metilcrotônico em isobuteno é alcançada fazendo uso de uma ácido 3-metilcrotônico decarboxilase.
[018] O método para a produção de isobuteno a partir de 3-metilcrotonil-CoA por meio de ácido 3-metilcrotônico ou a partir de 3-hidroxiisovalerato (HIV) por meio de ácido 3-metilcrotônico pode ser incorporado em uma via para a produção de isobuteno que começa a partir de acetil-CoA que é um componente central e uma molécula chave importante no metabolismo usada em muitas reações bioquímicas. As reações correspondentes são esquematicamente mostradas na Figura 1.
[019] Portanto, a presente invenção também se refere a vias que começam a partir de acetil-CoA e levam ao ácido 3-metilcrotônico (que é, então, finalmente convertido em isobuteno) por meio de duas vias alternativas que são esquematicamente mostradas na Figura 1 e serão explicadas em mais detalhes adicionais abaixo.
AS ROTAS PARA A CONVERSÃO ENZIMÁTICA A PARTIR DE ACETIL- COA EM ISOBUTENO POR MEIO DE ACETOACETIL-COA E ÁCIDO 3- METILCROTÔNICO A CONVERSÃO ENZIMÁTICA DE ÁCIDO 3-METILCROTÔNICO EM ISOBUTENO: ETAPA I CONFORME MOSTRADO NA FIGURA 1
[020] A conversão enzimática de ácido A3-metilcrotônico em isobuteno é esquematicamente mostrada na Figura 2B.
[021] De acordo com a presente invenção, a conversão enzimática de ácido 3- metilcrotônico (também denominado ácido 3-metil-2-butenóico ou ácido 3,3-dimetil- acrílico) em isobuteno (também denominado isobutileno ou 2-metil-propeno) pode ser alcançada por uma descarboxilação. “Descarboxilação” é geralmente uma reação química que remove um grupo carboxila e libera dióxido de carbono (CO2).
[022] A conversão enzimática de ácido 3-metilcrotônico em isobuteno pode ser preferencialmente alcançada fazendo-se uso de uma ácido 3-metilcrotônico decarboxilase. De acordo com a presente invenção, uma ácido 3-metilcrotônico decarboxilase é uma enzima que tem capacidade para converter ácido 3- metilcrotônico em isobuteno em uma reação de descarboxilação.
[023] Em modalidades preferidas, a ácido 3-metilcrotônico decarboxilase é selecionada a partir do grupo que consiste em: (i) uma decarboxilase dependente de FMN associada a uma prenil transferase de FMN; ou (ii) uma aconitato decarboxilase (EC 4.1.1.6); ou (iii) uma metilcrotonil-CoA carboxilase (EC 6.4.1.4); ou (iv) uma geranoil-CoA carboxilase (EC 6.4.1.5).
[024] Desse modo, de acordo com um aspecto, a conversão enzimática de ácido 3-metilcrotônico em isobuteno pode ser preferencialmente alcançada fazendo-se uso de uma ácido 3-metilcrotônico decarboxilase, em que a dita ácido 3-metilcrotônico decarboxilase é uma decarboxilase dependente de FMN associada a uma prenil transferase de FMN.
[025] A conversão enzimática de ácido 3-metilcrotônico em isobuteno que utiliza uma decarboxilase dependente de FMN associada a uma prenil transferase de FMN depende em uma reação de duas etapas consecutivas catalisadas pelas duas enzimas, isto é, a decarboxilase dependente de FMN (catalisar a descarboxilação real de ácido 3-metilcrotônico em isobuteno) com uma prenil transferase de FMN associada que fornece o cofator flavina modificado. O cofator flavina pode ser preferencialmente FMN ou FAD. FMN (mononucleotídeo de flavina; também denominado riboflavina-5‘-fosfato) é uma biomolécula produzida a partir de riboflavina (vitamina B2) pela enzima riboflavina quinase e funciona como grupo prostético de várias reações. FAD (dinucleotídeo de flavina adenina) é um cofator redox, mais especificamente um grupo prostético, envolvido em diversas reações importantes em metabolismo.
[026] Desse modo, na conversão de ácido 3-metilcrotônico em isobuteno, em uma primeira etapa, um cofator flavina (FMN ou FAD) é modificado para um cofator derivado de flavina (modificado). Essa modificação é catalisada pela dita prenil transferase de FMN. A prenil transferase de FMN prenila o anel de flavina do cofator flavina (FMN ou FAD) em um cofator flavina prenilado (modificado). Essa reação é esquematicamente ilustrada na Figura 2A.
[027] Em uma segunda etapa, a conversão real de ácido 3-metilcrotônico em isobuteno é catalisada pela dita decarboxilase dependente de FMN por meio de um mecanismo com base em cicloadição 1,3-dipolar em que a dita decarboxilase dependente de FMN usa o cofator flavina prenilado (FMN ou FAD) fornecido pela prenil transferase de FMN associada. Essa reação é esquematicamente ilustrada na Figura 2B.
[028] Em uma modalidade preferida, a dita prenil transferase de FMN que modifica o cofator flavina (FMN ou FAD) em um cofator derivado de flavina (modificado) é uma proteína de tipo ácido fenilacrílico decarboxilase (PAD), ou a enzima procariótica aproximadamente relacionada UbiX, uma enzima que é envolvida em uma biossíntese de ubiquinona em procariotas.
[029] Em Escherichia coli, uma proteína UbiX (também denominada 3-octaprenil- 4-hidroxibenzoato carboxi-liase) foi mostrada como envolvida na terceira etapa de biossíntese de ubiquinona.
[030] Além disso, o knockout da proteína homóloga em levedura (Pad1) demonstrou conferir sensibilidade ao ácido fenilacrílico, o que mostra que essa enzima funciona como uma ácido fenilacrílico decarboxilase. As cepas de E. coli também contêm, além de UbiX, um segundo parálogo nomeado Pad1. Sua sequência de aminoácidos mostra 52% de identidade com UbiX e identidade de sequência levemente mais alta a ácido fenilacrílico decarboxilase Pad1 de Saccharomyces cerevisiae. Apesar de sua similaridade de sequência mais alta com Pad1 de levedura, Pad1 de E. coli não parece ter atividade de ácido fenilacrílico decarboxilase. Sua função é desconhecida, Pad1 pode remover o grupo carboxilato de derivados de ácido benzoico, mas não de ácidos fenólicos substituídos.
[031] Desse modo, em uma modalidade preferida, a modificação de um cofator flavina (FMN ou FAD) no cofator derivado de flavina correspondente (modificado) é catalisada pela proteína ácido fenilacrílico decarboxilase que contém FMN (PAD). As enzimas envolvidas na modificação do cofator flavina (FMN ou FAD) para o cofator derivado de flavina modificado correspondente foram inicialmente anotadas como decarboxilases (EC 4.1.1.-). Algumas ácido fenilacrílico decarboxilases (PAD) são anotadas agora como flavina prenil transferases como EC 2.5.1.-.
[032] Em uma modalidade mais preferida, a conversão de ácido 3-metilcrotônico em isobuteno faz uso de uma proteína de tipo ácido fenilacrílico decarboxilase (PAD) como a prenil transferase de FMN que modifica um cofator flavina (FMN ou FAD) para o cofator derivado de flavina correspondente (modificado), em que a dita proteína de tipo ácido fenilacrílico decarboxilase (PAD) é derivada de Candida albicans (número de acesso Uniprot Q5A8L8), Aspergillus niger (número de acesso Uniprot A3F715), Saccharomyces cerevisiae (número de acesso Uniprot P33751) ou Cryptococcus gattii (número de acesso Uniprot E6R9Z0).
[033] Em uma modalidade preferida, a proteína de tipo ácido fenilacrílico decarboxilase (PAD) empregado no método da presente invenção é uma proteína de tipo ácido fenilacrílico decarboxilase (PAD) derivada de Candida albicans (número de acesso Uniprot Q5A8L8; SEQ ID NO:40), Aspergillus niger (número de acesso Uniprot A3F715; SEQ ID NO:41), Saccharomyces cerevisiae (número de acesso Uniprot P33751; SEQ ID NO:42) ou Cryptococcus gattii (número de acesso Uniprot E6R9Z0; SEQ ID NO:43) que tem a sequência de aminoácidos conforme mostrado na SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42 e SEQ ID NO:43, respectivamente.
[034] Em uma modalidade preferida da presente invenção, a proteína de tipo ácido fenilacrílico decarboxilase (PAD) é uma enzima que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 40 a 43 ou uma sequência que é pelo menos n % idêntica a qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 40 a 43 com n sendo um número inteiro entre 10 e 100, preferencialmente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 e em que a enzima tem a atividade enzimática de modificar um cofator flavina (FMN ou FAD) no cofator derivado de flavina correspondente (modificado).
[035] Em relação à determinação de identidade de sequência, o seguinte deve ser aplicado: Quando as sequências que são comparadas não têm o mesmo comprimento, o grau de identidade se refere à porcentagem de resíduos de aminoácido na sequência mais curta que são idênticos a resíduos de aminoácido na sequência mais longa ou à porcentagem de resíduos de aminoácido na sequência mais longa que são idênticos a resíduos de aminoácido na sequência mais curta. Preferencialmente, as mesmas se referem à porcentagem de resíduos de aminoácido na sequência mais curta que são idênticos aos resíduos de aminoácido na sequência mais longa. O grau de identidade de sequência pode ser determinado de acordo com métodos bem conhecidos na técnica com o uso de algoritmos de computador preferencialmente adequados, como CLUSTAL.
[036] Durante o uso do método de análise Clustal para determinar se uma sequência particular é, por exemplo, pelo menos 60% idêntica a uma sequência de referência, as definições padrão podem ser usadas ou as definições são preferencialmente conforme o seguinte: Matriz: blosum 30; Penalidade de lacuna aberta: 10,0; Penalidade de lacuna estendida: 0,05; Divergência de intervalo: 40; Distância de separação de lacuna: 8 para comparações de sequências de aminoácido. Para as comparações de sequência de nucleotídeo, a Penalidade de lacuna estendida é preferencialmente definida para 5,0.
[037] Em uma modalidade preferida, ClustalW2 é usado para a comparação de sequências de aminoácidos. No caso de comparações/alinhamentos em pares, as definições a seguir são preferencialmente escolhidas: Matriz de peso de proteína: BLOSUM 62; lacuna aberta: 10; extensão de lacuna: 0,1. No caso de comparações/alinhamentos múltiplos, as definições a seguir são preferencialmente escolhidas: Matriz de peso de proteína: BLOSUM 62; lacuna aberta: 10; extensão de lacuna: 0,2; distância de lacuna: 5; nenhuma lacuna final.
[038] Preferencialmente, o grau de identidade é calculado pelo comprimento completo da sequência.
[039] Os resíduos de aminoácido localizados em uma posição correspondente a uma posição conforme indicado abaixo no presente documento na sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma dentre as SEQ ID NOs:40 a 43 podem ser identificados pela pessoa versada na técnica por métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, tais resíduos de aminoácido podem ser identificados alinhando-se a sequência em questão com a sequência mostrada em qualquer uma dentre as SEQ ID NOs:40 a 43 e identificando-se as posições que correspondem às posições indicadas acima de qualquer uma dentre SEQ ID NOs:40 a 43. O alinhamento pode ser feito com meios e métodos conhecidos pela pessoa versada na técnica, por exemplo, usando-se um algoritmo de computador conhecido, como o método de Lipman-Pearson (Science 227 (1985), 1.435) ou o algoritmo CLUSTAL. É preferido que, em tal alinhamento, a homologia máxima seja atribuída aos resíduos de aminoácido conservados presentes nas sequências de aminoácidos.
[040] Em uma modalidade preferida, ClustalW2 é usado para a comparação de sequências de aminoácidos. No caso de comparações em pares/alinhamentos, as definições a seguir são preferencialmente escolhidas: Matriz de peso de proteína: BLOSUM 62; lacuna aberta: 10; extensão de lacuna: 0,1. No caso de comparações/alinhamentos múltiplos, as definições a seguir são preferencialmente escolhidas: Matriz de peso de proteína: BLOSUM 62; lacuna aberta: 10; extensão de lacuna: 0,2; distância de lacuna: 5; nenhuma lacuna final.
[041] Preferencialmente, o grau de identidade é calculado pelo comprimento completo da sequência.
[042] Em outra modalidade preferida, a modificação de um cofator flavina (FMN ou FAD) para o cofator derivado de flavina correspondente (modificado) é catalisada pela proteína 3-octaprenil-4-hidroxibenzoato carboxi-liase que contém FMN também denominada UbiX (inicialmente anotada como EC 4.1.1.-). Conforme mencionado acima, as enzimas envolvidas na modificação do cofator flavina (FMN ou FAD) para o cofator derivado de flavina modificado correspondente foram inicialmente anotadas como decarboxilases. Algumas ácido fenilacrílico decarboxilases (PAD) são notadas agora como flavina prenil transferases como EC 2.5.1.-.
[043] Em uma modalidade mais preferida, a conversão de ácido 3-metilcrotônico em isobuteno faz uso de uma 3-octaprenil-4-hidroxibenzoato carboxi-liase (também denominada UbiX) como a prenil transferase de FMN que modifica o cofator flavina (FMN ou FAD) para o cofator derivado de flavina correspondente (modificado) em que a dita 3-octaprenil-4-hidroxibenzoato carboxi-liase (também denominada UbiX) é derivada de Escherichia coli (número de acesso Uniprot P0AG03), Bacillus subtilis (número de acesso Uniprot A0A086WXG4), Pseudomonas aeruginosa (número de acesso Uniprot A0A072ZCW8) ou Enterobacter sp. DC4 (número de acesso Uniprot W7P6B1).
[044] Em uma modalidade ainda mais preferida, a 3-octaprenil-4-hidroxibenzoato carboxi-liase (também denominada UbiX) empregada no método da presente invenção é uma 3-octaprenil-4-hidroxibenzoato carboxi-liase (também denominada UbiX) derivada de Escherichia coli (número de acesso Uniprot P0AG03; SEQ ID NO:44), Bacillus subtilis (número de acesso Uniprot A0A086WXG4; SEQ ID NO:45), Pseudomonas aeruginosa (número de acesso Uniprot A0A072ZCW8; SEQ ID NO:46) ou Enterobacter sp. DC4 (número de acesso Uniprot W7P6B1; SEQ ID NO:47) que tem a sequência de aminoácidos conforme mostrado na SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46 e SEQ ID NO:47, respectivamente.
[045] Em uma modalidade preferida da presente invenção, a 3-octaprenil-4- hidroxibenzoato carboxi-liase é uma enzima que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 44 a 47 ou uma sequência que é pelo menos n % idêntica a qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 40 a 47 com n sendo um número inteiro entre 10 e 100, preferencialmente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 44, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 e em que a enzima tem a atividade enzimática de modificar um cofator flavina (FMN ou FAD) no cofator derivado de flavina correspondente (modificado). Em relação à determinação da identidade de sequência, as mesmas aplicações foram apresentadas acima.
[046] Em outra modalidade preferida, a modificação de um cofator flavina (FMN ou FAD) para o cofator derivado de flavina correspondente (modificado) é catalisada por uma flavina prenil transferase.
[047] Conforme mencionado acima, a descarboxilação real, isto é, a conversão de ácido 3-metilcrotônico em isobuteno é catalisada por uma decarboxilase dependente de FMN por meio de um mecanismo com base em cicloadição 1,3-dipolar em que a dita decarboxilase dependente de FMN usa o cofator flavina prenilado (FMN ou FAD) fornecido por qualquer uma das prenil transferases de FMN associadas descritas acima.
[048] Em uma modalidade preferida, a dita decarboxilase dependente de FMN que catalisa a descarboxilação de ácido 3-metilcrotônico para isobuteno é catalisada por uma ácido ferúlico decarboxilase (FDC). Ácido ferúlico decarboxilases (FDC) pertencem à classe de enzima EC 4.1.1.-.
[049] Em uma modalidade ainda mais preferida, a conversão de ácido 3- metilcrotônico em isobuteno faz uso de ácido ferúlico decarboxilases (FDC) que são derivadas de Saccharomyces cerevisiae (número de acesso Uniprot Q03034), Enterobacter sp. (número de acesso Uniprot V3P7U0), Bacillus pumilus (número de acesso Uniprot Q45361), Aspergillus niger (número de acesso Uniprot A2R0P7) ou Candida dubliniensis (número de acesso Uniprot B9WJ66).
[050] Em uma modalidade preferida, as ácido ferúlico decarboxilases (FDC) empregadas no método da presente invenção são ácido ferúlico decarboxilases (FDC) derivadas de Saccharomyces cerevisiae (número de acesso Uniprot Q03034; SEQ ID NO:48), Enterobacter sp. (número de acesso Uniprot V3P7U0; SEQ ID NO:49), Bacillus pumilus (número de acesso Uniprot Q45361; SEQ ID NO:50), Aspergillus niger (número de acesso Uniprot A2R0P7; SEQ ID NO:51) ou Candida dubliniensis (número de acesso Uniprot B9WJ66; SEQ ID NO:52) que têm a sequência de aminoácidos conforme mostrado na SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51 e SEQ ID NO:52, respectivamente.
[051] Em outra modalidade mais preferida, a conversão de ácido 3-metilcrotônico em isobuteno faz uso de uma protocatecuato decarboxilase (EC 4.1.1.63).
[052] Desse modo, em uma modalidade preferida, a conversão de ácido 3- metilcrotônico em isobuteno é catalisada por uma protocatecuato (PCA) decarboxilase (EC 4.1.1.63). PCA decarboxilases (também denominadas AroY) são conhecidas por catalisar a reação a seguir, isto é, a conversão enzimática de protocatecuato (PCA) em catecol (Johnson et al., Metabolic Engineering Communications 3 (2016), 111):
[053] Essa enzima ocorre em uma variedade de organismos e foi, por exemplo, descrita em Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Rhodopseudomonas sp. e Sedimentibacter hidroxibenzoicus.
[054] Em uma modalidade preferida da presente invenção, a PCA decarboxilase empregada no método da presente invenção é uma PCA decarboxilase que é derivada de Klebsiella pneumoniae (número de acesso Uniprot B9AM6), Leptolyngbya sp. (número de acesso Uniprot A0A0S3U6D8), ou Phascolarctobacterium sp. (número de acesso Uniprot R6IIV6).
[055] Em uma modalidade preferida, a PCA decarboxilase empregada no método da presente invenção é uma enzima derivada de Klebsiella pneumonia (SEQ ID NO:78), Leptolyngbya sp. (SEQ ID NO:80), ou Phascolarctobacterium sp. (SEQ ID NO:81).
[056] Em uma modalidade preferida da presente invenção, a PCA decarboxilase é uma enzima que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 78, 80 e 81 ou uma sequência que é pelo menos n % idêntica a qualquer um dentre SEQ ID NOs: 78, 80 e 81 com n como um número inteiro entre 10 e 100, preferencialmente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 e em que a enzima tem a atividade enzimática de converter ácido 3-metilcrotônico em isobuteno. Em relação à determinação da identidade de sequência, as mesmas aplicações foram apresentadas acima.
[057] Em uma modalidade preferida da presente invenção, a ácido ferúlico decarboxilase (FDC) é uma enzima que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 48 a 52 ou uma sequência que é pelo menos n % idêntica a qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 48 a 52 com n como um número inteiro entre 10 e 100, preferencialmente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 e em que a enzima tem a atividade enzimática de converter ácido 3-metilcrotônico em isobuteno. Em relação à determinação da identidade de sequência, as mesmas aplicações foram apresentadas acima.
[058] Em outra modalidade preferida, a dita decarboxilase dependente de FMN que catalisa a descarboxilação de ácido 3-metilcrotônico em isobuteno é uma enzima que é aproximadamente relacionada à ácido ferúlico decarboxilase acima (FDC), a saber, uma 3-poliprenil-4-hidroxibenzoato decarboxilase (também denominada UbiD). 3-poliprenil-4-hidroxibenzoato decarboxilase pertence à família de UbiD decarboxilase classificada como EC:4.1.1.-.
[059] Em uma modalidade mais preferida, a conversão de ácido 3-metilcrotônico em isobuteno faz uso de uma 3-poliprenil-4-hidroxibenzoato decarboxilase (UbiD) que é derivada de Hypocrea atroviridis (Número de acesso UniProt G9NLP8), Sphaerulina musiva (Número de acesso UniProt M3DF95), Penecillinum requeforti (Número de acesso UniProt W6QKP7), Fusarium oxisporum f. sp. lycopersici (Número de acesso UniProt W9LTH3), Saccharomyces kudriavzevii (Número de acesso UniProt J8TRN5), Saccaromyces cerevisiae, Aspergillus parasiticus, Candida albicans, Grosmannia clavigera, Escherichia coli (número de acesso Uniprot P0AAB4), Bacillus megaterium (número de acesso Uniprot D5DTL4), Methanothermobacter sp. CaT2 (número de acesso Uniprot T2GKK5), Mycobacterium chelonae 1518 (número de acesso Uniprot X8EX86) ou Enterobacter cloacae (número de acesso Uniprot V3DX94).
[060] Em uma modalidade ainda mais preferida, a 3-poliprenil-4-hidroxibenzoato decarboxilase (UbiD) empregada no método da presente invenção é uma 3-poliprenil- 4-hidroxibenzoato decarboxilase (UbiD) derivada de Escherichia coli (número de acesso Uniprot P0AAB4; SEQ ID NO:53), Bacillus megaterium (número de acesso Uniprot D5DTL4; SEQ ID NO:54), Methanothermobacter sp. CaT2 (número de acesso Uniprot T2GKK5; SEQ ID NO:55) Mycobacterium chelonae 1518 (número de acesso Uniprot X8EX86; SEQ ID NO:56), Hypocrea atroviridis (SEQ ID NO:57), Sphaerulina musiva (SEQ ID NO:58), Penecillinum requeforti (SEQ ID NO:59), Fusarium oxisporum f. sp. lycopersici (SEQ ID NO:60), Saccharomyces kudriavzevii (SEQ ID NO:61), Saccaromyces cerevisiae (SEQ ID NO:62), Aspergillus parasiticus (SEQ ID NO:63), Candida albicans (SEQ ID NO:64), Grosmannia clavigera (SEQ ID NO:65) ou Enterobacter cloacae (SEQ ID NO:79) que tem a sequência de aminoácidos conforme mostrado na SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, e SEQ ID NO:79, respectivamente.
[061] Em uma modalidade preferida da presente invenção a 3-poliprenil-4- hidroxibenzoato decarboxilase (UbiD) é uma enzima que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 53 a 65 ou a sequência que é pelo menos n % idêntica a qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 53 a 65 e SEQ ID NO:79 com n como um número inteiro entre 10 e 100, preferencialmente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 e em que a enzima tem a atividade enzimática de converter ácido 3-metilcrotônico em isobuteno. Em relação à determinação da identidade de sequência, as mesmas aplicações foram apresentadas acima.
[062] Conforme mencionado acima, em outro aspecto, a ácido 3-metilcrotônico decarboxilase pode ser preferencialmente uma aconitato decarboxilase (EC 4.1.1.6). A decarboxilase não necessita da associação com uma prenil transferase de FMN visto que foi descrita para as decarboxilases acima e, consequentemente, não necessita da provisão de um cofator prenilado.
[063] Desse modo, em uma modalidade preferida, a conversão de ácido 3- metilcrotônico em isobuteno é catalisada por uma aconitato decarboxilase (EC 4.1.1.6). As aconitato decarboxilases (EC 4.1.1.6) foram descritas por catalisar a reação a seguir:
[064] Essa enzima ocorre em uma variedade de organismos, e foi, por exemplo, descrita em Aspergillus itaconicus, Aspergillus terreus, Homo sapiens e Mus musculus. Em uma modalidade preferida, a aconitato decarboxilase (EC 4.1.1.6) empregada no método da presente invenção na conversão de ácido 3-metilcrotônico em isobuteno é a aconitase decarboxilase derivada de Aspergillus terreus (número de acesso UniProt B3IUN8), Homo sapiens (número de acesso UniProt A6NK06) ou Mus musculus (número de acesso UniProt P54987).
[065] Em uma modalidade preferida, a aconitato decarboxilase (EC 4.1.1.6) empregada no método da presente invenção na conversão de ácido 3-metilcrotônico em isobuteno é uma aconitato decarboxilase derivada de Aspergillus terreus (SEQ ID NO:66).
[066] Em uma modalidade preferida da presente invenção, a aconitato decarboxilase é uma enzima que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66 ou uma sequência que é pelo menos n % idêntica a SEQ ID NO: 66 com n como um número inteiro entre 10 e 100, preferencialmente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 e em que a enzima tem a atividade enzimática de converter ácido 3-metilcrotônico em isobuteno. Em relação à determinação da identidade de sequência, as mesmas aplicações foram apresentadas acima.
[067] Conforme mencionado acima, em outro aspecto, a ácido 3-metilcrotônico decarboxilase pode ser preferencialmente uma metilcrotonil-CoA carboxilase (EC 6.4.1.4). A decarboxilase não necessita da associação com uma prenil transferase de FMN visto que foi descrita para as decarboxilases acima e, consequentemente, não necessita da provisão de um cofator prenilado.
[068] Desse modo, em uma modalidade preferida, a conversão de ácido 3- metilcrotônico em isobuteno é catalisada por uma metilcrotonil-CoA carboxilase (EC 6.4.1.4). Metilcrotonil-CoA carboxilases foram descritas por catalisar a reação a seguir: , isto é, a carboxilação, mas os mesmos podem ser usados para catalisar a reação de descarboxilação. Metilcrotonil-CoA carboxilases ocorrem em uma variedade de organismos, incluindo organismos eucarióticos e procarióticos, como plantas, animais, fungos e bactérias. A enzima foi, por exemplo, descrita em Daucus carota, Glycine max, Hordeum vulgare, Pisum sativum, Solanum lycopersicum, Solanum tuberosum, Zea mays, Arabidopsis sp., Lens culinaris, Homo sapiens, Bos taurus, Rattus norvegicus, Mus musculus, Pagrus major, Emericella nidulans, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas citronellolis, Pseudomonas amygdali, Acidaminococcus fermentans, Escherichia coli, Mycobacterium sp. e Achromobacter sp.
[069] Em uma modalidade preferida, a metilcrotonil-CoA carboxilase (EC 6.4.1.4) empregada no método da presente invenção na conversão de ácido 3-metilcrotônico em isobuteno é uma metilcrotonil-CoA carboxilase derivada de Pseudomonas amygdali (SEQ ID NO:67).
[070] Em uma modalidade preferida da presente invenção, a metilcrotonil-CoA carboxilase é uma enzima que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 67 ou uma sequência que é pelo menos n % idêntica a SEQ ID NO: 67 com n como um número inteiro entre 10 e 100, preferencialmente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 e em que a enzima tem a atividade enzimática de converter ácido 3-metilcrotônico em isobuteno. Em relação à determinação da identidade de sequência, as mesmas aplicações foram apresentadas acima.
[071] Em outra modalidade preferida, a metilcrotonil-CoA carboxilase (EC 6.4.1.4) empregada no método da presente invenção na conversão de ácido 3- metilcrotônico em isobuteno é uma metilcrotonil-CoA carboxilase derivada de Myxcoxoccus xanthus. Em Myxococcus xanthus, o gene liuB codifica uma enzima que tem as duas subunidades AibA e AibB (Li et al., Angew. Chem. Int. Ed. 52 (2013), 1.304 a 1.308). A metilcrotonil-CoA carboxilase derivada de Myxcoxoccus xanthus é uma enzima heterodimérica que é anotada como subunidades de glutaconil-CoA transferase A e B (SEQ ID NOs: 100 e 101).
[072] Em uma modalidade preferida da presente invenção, a metilcrotonil-CoA carboxilase é uma enzima que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 100 ou 101, uma sequência que é pelo menos n % idêntica a SEQ ID NO: 100 ou 101 com n como um número inteiro entre 10 e 100, preferencialmente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 e em que a enzima tem a atividade enzimática de converter ácido 3-metilcrotônico em isobuteno. Em relação à determinação da identidade de sequência, as mesmas aplicações foram apresentadas acima.
[073] Conforme mencionado acima, em outro aspecto, o ácido 3-metilcrotônico decarboxilase pode ser preferencialmente uma geranoil-CoA carboxilase (EC 6.4.1.5). A decarboxilase não necessita da associação com uma prenil transferase de FMN visto que foi descrita para as decarboxilases acima e, consequentemente, não necessita da provisão de um cofator prenilado.
[074] Desse modo, em outra modalidade preferida, a conversão de ácido 3- metilcrotônico por meio de descarboxilação em isobuteno é catalisada por uma geranoil-CoA carboxilase (EC 6.4.1.5). Geranoil-CoA carboxilases catalisam naturalmente a reação a seguir:
[075] A enzima ocorre em eucariotas e procariotas, como plantas e bactérias. A enzima foi, por exemplo, descrita em Daucus carota, Glycine max, Zea mays, Pseudomonas sp., Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas citronellolis e Pseudomonas mendocina.
[076] Em outro aspecto, a ácido 3-metilcrotônico decarboxilase pode ser preferencialmente uma 6-metilsalicilato decarboxilase (EC 4.1.1.52).
[077] Desse modo, em outra modalidade preferida, a conversão de ácido 3- metilcrotônico por meio de descarboxilação em isobuteno é catalisada por uma 6- metilsalicilato decarboxilase (EC 4.1.1.52). 6-metilsalicilato decarboxilases (EC 4.1.1.52) catalisam naturalmente a reação a seguir:
[078] A enzima ocorre em uma variedade de organismos, em particular, em eucariotas e procariotas, como bactérias e fungos. A enzima foi, por exemplo, descrita em Aspergillus clavatus (Número de acesso UniProt T1PRE6), Penicillium griseofulvum e Valsa friesii.
[079] Em uma modalidade preferida, a 6-metilsalicilato decarboxilase (EC 4.1.1.52) empregada no método da presente invenção na conversão de ácido 3- metilcrotônico por meio de descarboxilação em isobuteno é uma 6-metilsalicilato decarboxilase derivada de Aspergillus clavatus (SEQ ID NO:68).
[080] Em uma modalidade preferida da presente invenção, a 6-metilsalicilato decarboxilase é uma enzima que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68 ou uma sequência que é pelo menos n % idêntica a SEQ ID NO: 68 com n como um número inteiro entre 10 e 100, preferencialmente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 e em que a enzima tem a atividade enzimática de converter ácido 3-metilcrotônico por meio de descarboxilação em isobuteno. Em relação à determinação da identidade de sequência, as mesmas aplicações foram apresentadas acima.
[081] Em outro aspecto, a ácido 3-metilcrotônico decarboxilase pode ser preferencialmente uma 2-oxo-3-hexenodioato decarboxilase (EC 4.1.1.77).
[082] Desse modo, em outra modalidade preferida, a conversão de ácido 3- metilcrotônico por meio de descarboxilação em isobuteno é catalisada por uma 2-oxo- 3-hexenodioato decarboxilase (EC 4.1.1.77). 2-oxo-3-hexenodioato decarboxilases (EC 4.1.1.77) catalisam naturalmente a reação a seguir:
[083] A enzima ocorre em uma variedade de organismos, em particular, em procariotas, como bactérias. A enzima foi, por exemplo, descrita em Bordetella sp., Cupriavidus nexator, Geobacillus stearothermophilus (Número de acesso UniProt B0VXM8), Pseudomonas putida e Ralstonia pickettii.
[084] Em uma modalidade preferida, a 2-oxo-3-hexenodioato decarboxilase (EC 4.1.1.77) empregada no método da presente invenção na conversão de ácido 3- metilcrotônico por meio de descarboxilação em isobuteno é uma 2-oxo-3- hexenodioato decarboxilase derivada de Geobacillus stearothermophilus (SEQ ID NO:69).
[085] Em uma modalidade preferida da presente invenção, a 2-oxo-3- hexenodioato decarboxilase é uma enzima que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 ou uma sequência que é pelo menos n % idêntica a SEQ ID NO: 69 com n como um número inteiro entre 10 e 100, preferencialmente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 e em que a enzima tem a atividade enzimática de converter ácido 3- metilcrotônico por meio de descarboxilação em isobuteno. Em relação à determinação da identidade de sequência, as mesmas aplicações foram apresentadas acima.
[086] Em outra possibilidade, a ácido 3-metilcrotônico decarboxilase pode ser preferencialmente uma 5-oxopent-3-eno-1,2,5-tricarboxilato decarboxilase (EC 4.1.1.68).
[087] Desse modo, em outra modalidade preferida, a conversão de ácido 3- metilcrotônico por meio de descarboxilação em isobuteno é catalisada por uma 5- oxopent-3-eno-1,2,5-tricarboxilato decarboxilase (EC 4.1.1.68). 5-oxopent-3-eno- 1,2,5-tricarboxilato decarboxilases (EC 4.1.1.68) catalisam naturalmente a reação a seguir:
[088] A enzima foi descrita por ocorrer em procariotas, como bactérias. A enzima foi, por exemplo, descrita em E. coli e Salmonella dublin.
[089] Em uma modalidade preferida, a 5-oxopent-3-eno-1,2,5-tricarboxilato decarboxilase (EC 4.1.1.68) empregada no método da presente invenção na conversão de ácido 3-metilcrotônico por meio de descarboxilação em isobuteno é uma 5-oxopent-3-eno-1,2,5-tricarboxilato decarboxilase derivada de Salmonella dublin (SEQ ID NO:70).
[090] Em uma modalidade preferida da presente invenção, a 5-oxopent-3-eno- 1,2,5-tricarboxilato decarboxilase é uma enzima que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 70 ou uma sequência que é pelo menos n % idêntica a SEQ ID NO: 70 com n como um número inteiro entre 10 e 100, preferencialmente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 e em que a enzima tem a atividade enzimática de converter ácido 3- metilcrotônico por meio de descarboxilação em isobuteno. Em relação à determinação da identidade de sequência, as mesmas aplicações foram apresentadas acima.
A CONVERSÃO ENZIMÁTICA DE 3-HIDROXIISOVALERATO (HIV) EM ÁCIDO 3-METILCROTÔNICO: ETAPA II CONFORME MOSTRADO NA FIGURA 1
[091] O ácido 3-metilcrotônico que é convertido de acordo com o método da presente invenção em isobuteno pode ser fornecido em si por uma reação enzimática.
[092] De acordo com a presente invenção, o ácido 3-metilcrotônico pode ser fornecido por meio de rotas diferentes que são esquematicamente mostradas na Figura 1.
[093] Desse modo, de acordo com uma opção, o ácido 3-metilcrotônico pode ser fornecido, em si, pela conversão enzimática de 3-hidroxiisovalerato (HIV) em ácido 3- metilcrotônico. A conversão enzimática de 3-hidroxiisovalerato (HIV) em ácido 3- metilcrotônico (etapa II conforme mostrado na Figura 1) é esquematicamente ilustrada na Figura 3.
[094] De acordo com a presente invenção, a conversão enzimática de 3- hidroxiisovalerato (HIV) no dito ácido 3-metilcrotônico faz uso preferencialmente de uma enzima que catalisa a desidratação de um e-hidroxiácido (isto é, por exemplo, 3- hidroxiisovalerato (HIV)) e um ácido α,β-insaturado (isto é, por exemplo, ácido 3- metilcrotônico). O termo “desidratação” geralmente se refere a uma reação que envolve a remoção de H2O. As enzimas que catalisam desidratação de 3- hidroxiisovalerato (HIV) são enzimas que catalisam a reação, conforme mostrado na Figura 3. Preferencialmente, tal enzima pertence à família de hidro-liases (EC 4.2.-.).
[095] Os exemplos preferidos de tais enzimas que são classificadas como EC 4.2.-.- (isto é, hidro-liases) são: aconitase (EC 4.2.1.3); fumarase (EC 4.2.1.2); e enoil-CoA hidratase/desidratase (EC 4.2.1.17).
[096] Desse modo, em uma modalidade preferida, a conversão enzimática de 3- hidroxiisovalerato (HIV) em ácido 3-metilcrotônico é alcançada pelo uso de uma aconitase (EC 4.2.1.3). Aconitases (EC 4.2.1.3) (também denominadas aconitase hidratases) são enzimas que catalisam a reação a seguir:
[097] A enzima é conhecida partir de uma variedade de organismos, incluindo organismos eucarióticos e procarióticos, como plantas, animais, fungos e bactérias. A enzima foi, por exemplo, descrita em Acer pseudoplatanus, Advenella kashmirensis, Arabidopsis thaliana, Aspergillus niger, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Bacterioides fragilis, Bos taurus, Caenorhabditis elegans, Citrus elementina, Canis lupus familiaris, Corynebacterium glutamicum, Drosophila melanogaster, E. coli, Glycine max, Helobacter pilori, Homo sapiens, Mus musculus, Mycobacterium tuberculosis, Nicotiana benthamiana, Plasmodium falciparum, Pseudomonas aeruginosa, Rattus norvegicus, Rattus rattus, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomycopsis lipolitica, Salmonella enterica, Sinapis alba, Sinorhizobium meliloti, Solanum tuberosum, Streptomyces aureus, Streptomyces viridochromogenes, Sulfolobus acidocaldarius, Sulfolobus solfataricus, Sus scorfa, Trametes sanguinea, Trypanosoma brucei, Xanthomonas campestris, Xanthomonas euvesicatoria, Yarrowia lipolitica e Zea mays.
[098] Em uma modalidade preferida, a aconitase (EC 4.2.1.3) é de Advenella kashmirensis (número de acesso TrEMBL B3TZE0), Bacterioides fragilis (número de acesso SwissProt Q8RP87), Caenorhabditis elegans (número de acesso SwissProt Q23500), Citrus elementina (número de acesso UniProt D3GQL0, D3GQL1, ou D3GQL2), Drosophila melanogaster (número de acesso SwissProt Q9NFX3 ou Q9NFX2), E. coli (número de acesso SwissProt P36683 ou número de acesso UniProt P25516), Homo sapiens (número de acesso UniProt P21399 ou Q99798), Mus musculus (número de acesso UniProt P28271), Rattus norvegicus (número de acesso UniProt Q9ER34 ou Q63270), Sus scorfa (número de acesso UniProt P16276) ou Trypanosoma brucei (número de acesso SwissProt Q9NJQ8 ou Q9NJQ9).
[099] Em uma modalidade preferida, a aconitase (EC 4.2.1.3) empregada no método da presente invenção na conversão de 3-hidroxiisovalerato (HIV) em ácido 3- metilcrotônico é uma aconitase derivada de E. coli (SEQ ID NO:71).
[0100] Em uma modalidade preferida da presente invenção, a aconitase é uma enzima que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71 ou uma sequência que é pelo menos n % idêntica a SEQ ID NO: 71 com n como um número inteiro entre 10 e 100, preferencialmente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 e em que a enzima tem a atividade enzimática de converter 3-hidroxiisovalerato (HIV) em ácido 3- metilcrotônico. Em relação à determinação da identidade de sequência, as mesmas aplicações foram apresentadas acima.
[0101] Em outra modalidade preferida, a conversão enzimática de 3- hidroxiisovalerato (HIV) em ácido 3-metilcrotônico é alcançada pelo uso de uma fumarase (EC 4.2.1.2). Fumarases (EC 4.2.1.2) (também denominadas fumarase hidratases) são enzimas que catalisam a reação a seguir:
[0102] A enzima é conhecida partir de uma variedade de organismos, incluindo organismos eucarióticos e procarióticos, como plantas, animais, fungos e bactérias. A enzima foi, por exemplo, descrita em Arabidopsis thaliana, Ascaris suum, Azotobacter vinelandii, Brevibacterium flavum, Campilobacter coli, Campilobacter fetus, Campilobacter jejuni, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium glutamicum, Erwinia sp., E. coli, Euglena gracilis, Geobacillus stearothermophilus, Gluconacetobacter diazotrophicus, Heliobacter pilori, Homo sapiens, Leishmania major, Mesembryanthemum crystallinum, Mycobacterium tuberculosis, Pelotomaculum thermopropionicum, Pisum sativum, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pycobaculum neutrophilum, Rattus novegicus, Rhizopus oryzae, Rickettsia prowazekii, Saccharomyces bayanus, Sacchoromyces cerevisiae, Solanum lycopersicum, Solanum tuberosum, Streptomyces coelicolor, Streptomyces lividans, Streptomyces thermovulgaris, Sulfolobus solfataricus, Sus scrofa, Thermus sp., Thermus thermophilus e Zea mays.
[0103] Em uma modalidade preferida, a fumarase (EC 4.2.1.2) é de Arabidopsis thaliana (número de acesso UniProt P93033 ou Q9FI53), Ascaris suum (número de acesso SwissProt Q8NRN8), Corynebacterium glutamicum (número de acesso UniProt P28271), E. coli (P05042), Homo sapiens (número de acesso SwissProt P07954), Mycobacterium tuberculosis (P9WN93), Pycobaculum neutrophilum (número de acesso UniProt B1Y931 ou B1Y932), Rhizopus oryzae (número de acesso UniProt P55250), Rickettsia prowazekii (número de acesso UniProt Q9ZCQ4), Sacchoromyces cerevisiae (número de acesso SwissProt P08417), Streptomyces thermovulgaris (número de acesso SwissProt A5Y6J1) ou Sulfolobus solfataricus (número de acesso UniProt P39461).
[0104] Em uma modalidade preferida, a fumarase (EC 4.2.1.2) empregada no método da presente invenção na conversão de 3-hidroxiisovalerato (HIV) em ácido 3- metilcrotônico é uma fumarase derivada de E. coli (SEQ ID NO:72).
[0105] Em uma modalidade preferida da presente invenção, a fumarase é uma enzima que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 72 ou uma sequência que é pelo menos n % idêntica a SEQ ID NO: 72 com n como um número inteiro entre 10 e 100, preferencialmente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 e em que a enzima tem a atividade enzimática de converter 3-hidroxiisovalerato (HIV) em ácido 3- metilcrotônico. Em relação à determinação da identidade de sequência, as mesmas aplicações foram apresentadas acima.
[0106] Em outra modalidade preferida, a conversão enzimática de 3- hidroxiisovalerato (HIV) em ácido 3-metilcrotônico é alcançada pelo uso de uma enoil- CoA hidratase/desidratase (EC 4.2.1.17). Enoil-CoA hidratases/desidratases (EC 4.2.1.17) catalisam a reação a seguir:
[0107] Enoil-CoA hidratase é uma enzima que hidrata normalmente a ligação dupla entre o segundo e o terceiro átomos de carbono em acil-CoA. Entretanto, também pode ser empregada para catalisar a reação na direção reversa.
[0108] Enoil-CoA hidratases/desidratases (EC 4.2.1.17) também são denominadas 3-hidroxiacil-CoA desidratases e enoil-CoA hidratases. Ambas as enzimas catalisam a mesma reação enquanto o nome de uma dessas enzimas denota uma direção da reação correspondente enquanto o outro nome denota a reação reversa. Visto que a reação é reversível, ambos os nomes de enzima podem ser usados.
[0109] Essa enzima, também conhecida como crotonase, está naturalmente envolvida na metabolização de ácidos graxos para produzir tanto acetil-CoA quanto energia. As enzimas que pertencem a essa classe foram descritas por ocorrer, por exemplo, em rato (Rattus norvegicus), seres humanos (Homo sapiens), camundongo (Mus musculus), javali (Sus scrofa), Bos taurus, E. coli, Clostridium acetobutylicum e Clostridium aminobutyricum. As sequências de nucleotídeo e/ou aminoácidos para tais enzimas foram determinadas, por exemplo, para rato, humanos e Bacillus subtilis e Bacillus anthracis. Em princípio, qualquer enoil-CoA hidratase (EC 4.2.1.17) que pode catalisar a conversão de 3-hidroxiisovalerato (HIV) em ácido 3-metilcrotônico pode ser usada no contexto da presente invenção. Em uma modalidade preferida, a enoil-CoA hidratase é uma enoil-CoA hidratase de Galactomyces reessii (Dhar et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 28 (2002), 81 a 87), uma enoil-CoA hidratase de Bacillus subtilis (Uniprot G4PBC3; SEQ ID NO: 38) ou uma enoil-CoA hidratase de Bacillus anthracis (Uniprot Q81YG6; SEQ ID NO: 39).
[0110] Em uma modalidade preferida, a enoil-CoA hidratase empregada no método da invenção tem uma sequência de aminoácidos, conforme mostrado em qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 38 ou 39 ou mostra uma sequência de aminoácidos que é pelo menos x% homóloga a qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 38 ou 39 e tem a atividade de uma enoil-CoA hidratase com x como um número inteiro entre 30 e 100, preferencialmente 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 em que tal enzima tem capacidade para converter 3-hidroxiisovalerato (HIV) em ácido 3-metilcrotônico, conforme estabelecido acima no presente documento. Em relação à determinação do grau de identidade, as mesmas aplicações foram apresentadas acima.
A CONDENSAÇÃO ENZIMÁTICA DE ACETONA E ACETIL-COA EM 3- HIDROXIISOVALERATO (HIV): ETAPA III CONFORME MOSTRADO NA FIGURA 1
[0111] O 3-hidroxiisovalerato (HIV) que é convertido, de acordo com o método da presente invenção, em ácido 3-metilcrotônico pode ser fornecido em si por uma reação enzimática, a saber, a condensação enzimática de acetona e acetil-CoA no dito 3-hidroxiisovalerato (HIV). A condensação de acetona e acetil-CoA no dito 3- hidroxiisovalerato (HIV) (etapa III conforme mostrado na Figura 1) é esquematicamente ilustrada na Figura 4.
[0112] Desse modo, a presente invenção também se refere a um método para fornecer isobuteno a partir de acetona, sendo que acetona é primeiro condensada com acetil-CoA em 3-hidroxiisovalerato (HIV) que é, então, convertida em ácido 3- metilcrotônico. Adicionalmente, ácido 3-metilcrotônico é, então, convertido em isobuteno, conforme descrito acima no presente documento.
[0113] De acordo com a presente invenção, a condensação de acetona e acetil- CoA em 3-hidroxiisovalerato (HIV) faz preferencialmente o uso de uma enzima que tem capacidade para catalisar a formação de uma ligação covalente entre o átomo de carbono do grupo oxo (isto é, o C=O) de acetona e acetil-CoA, em particular, o grupo metila de acetil-CoA. De acordo com esse esquema de reação, o grupo oxo de acetona reage como um eletrófilo e o grupo metila de acetil-CoA reage como um nucleófilo. A reação geral da conversão de acetona e acetil-CoA é mostrada na Figura 4. As enzimas que têm capacidade para condensar enzimaticamente acetona e acetil- CoA em 3-hidroxiisovalerato (HIV) são conhecidas na técnica e foram, por exemplo, descritas no documento no WO 2011/032934.
[0114] Preferencialmente, a enzima empregada na condensação enzimática de acetona e acetil-CoA em 3-hidroxiisovalerato (HIV) é uma enzima com a atividade de uma HMG CoA sintase (EC 2.3.3.10) e/ou uma proteína PksG e/ou uma enzima com a atividade de uma clivagem de ligação C-C/liase de condensação, como uma HMG CoA liase (EC 4.1.3.4).
[0115] HMG CoA sintase foi descrita para vários organismos.
[0116] Os exemplos de HMG CoA sintases de organismos diferentes são dados em SEQ ID NO: 1 a 16. SEQ ID NO: 1 mostra a sequência da HMG CoA sintase citoplásmica de Caenorhabditis elegans (P54871, banco de gene F25B4.6), SEQ ID NO: 2 mostra a sequência da HMG CoA sintase citoplásmica de Schizosaccharomyces pombe (levedura de fissão; P54874), SEQ ID NO: 3 mostra a sequência da HMG CoA sintase citoplásmica de Saccharomyces cerevisiae (levedura de padaria; P54839, banco de gene CAA65437.1), SEQ ID NO: 4 mostra a sequência da HMG CoA sintase citoplásmica de Arabidopsis thaliana (Arabidopse-do-tale; P54873), SEQ ID NO: 5 mostra a sequência da HMG CoA sintase citoplásmica de Dictyostelium discoideum (Bolor limoso; P54872, banco de gene L2114), SEQ ID NO: 6 mostra a sequência da HMG CoA sintase citoplásmica de Blattella germanica (Barata-germânica; P54961, banco de gene X73679), SEQ ID NO: 7 mostra a sequência da HMG CoA sintase citoplásmica de Gallus gallus (Galinha; P23228, banco de gene CHKHMGCOAS), SEQ ID NO: 8 mostra a sequência da HMG CoA sintase citoplásmica de Homo sapiens (Ser humano; Q01581, banco de gene X66435), SEQ ID NO: 9 mostra a sequência da HMG CoA sintase mitocondrial de Homo sapiens (Ser humano; P54868, banco de gene X83618), SEQ ID NO: 10 mostra a sequência da HMG CoA sintase mitocondrial de Dictyostelium discoideum (Bolor limoso; Q86HL5, banco de gene XM_638984), SEQ ID NO: 11 mostra a sequência da HMG CoA sintase de Staphylococcus epidermidis (Q9FD76), SEQ ID NO: 12 mostra a sequência da HMG CoA sintase de Lactobacillus fermentum (B2GBL1), SEQ ID NO: 13 mostra a sequência da HMG CoA sintase de Hyperthermus butilicus (A2BMY8), SEQ ID NO: 14 mostra a sequência da HMG CoA sintase de Chloroflexus aggregans (B8G795), SEQ ID NO: 15 mostra a sequência da HMG CoA sintase de Lactobacillus delbrueckii (Q1GAH5) e SEQ ID NO: 16 mostra a sequência da HMG CoA sintase de Staphylococcus haemolyticus Q4L958 (diferença I98>V em comparação com proteína de tipo selvagem).
[0117] Em uma modalidade preferida da presente invenção, a HMG CoA sintase é uma enzima que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1 a 16 ou a sequência que é pelo menos n % idêntica a qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 1 a 16 e que tem a atividade de uma HMG CoA sintase com n como um número inteiro entre 10 e 100, preferencialmente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99.
[0118] Em relação à determinação de identidade de sequência, as mesmas aplicações foram apresentadas acima.
[0119] Outro exemplo para uma proteína que pode ser usada na condensação de acetona e acetil-CoA em 3-hidroxiisovalerato é uma proteína PksG. No contexto da presente aplicação, o termo “proteína PksG” ou “uma proteína/enzima que tem a atividade de uma proteína PksG” se refere a qualquer enzima que pode catalisar a reação que é naturalmente catalisada pela proteína PksG, isto é, a transferência de - CH2COO- a partir de acetil-S-AcpK (Ac-S-AcpK) para um intermediário de cetotioéster policétido ligado a um dentre os domínios de tiolação da proteína PksL. Isso é uma reação que é análoga àquela catalisada por HMG CoA sintase com a diferença de que o acetil-tioéster da porção química de fosfopanteteila é ligado a uma proteína carreadora em vez de a uma parte da Coenzima A. Embora a proteína PksG na reação que catalisa naturalmente transfira o grupo acetila a partir de acetil-S-AcpK para um aceitante, foi mostrado anteriormente que a proteína PksG também pode efetuar a reação que é normalmente catalisada por HMG CoA sintase, isto é, a síntese de HMG CoA que começa a partir de acetoacetil CoA e acetil CoA.
[0120] Os exemplos de proteínas PksG são dados em SEQ ID NO: 17 e 18. Preferencialmente, a proteína PksG é uma enzima que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos n % idêntica a SEQ ID NO: 17 ou 18 e que tem a atividade de uma proteína PksG com n como um número inteiro entre 10 e 100, preferencialmente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99.
[0121] SEQ ID NO: 17 mostra a sequência de aminoácidos da proteína PksG de Bacillus subtilis (P40830) e SEQ ID NO: 18 mostra a sequência de aminoácidos da proteína PksG de Mycobacterium marinum (B2HGT6).
[0122] Em relação à determinação do grau de identidade de sequência, o mesmo se aplica ao que foi estabelecido acima em conexão com HMG CoA sintase.
[0123] Os exemplos de “clivagem de ligação C-C/liases de condensação” em particular incluem enzimas que são classificadas como isopropilmalato sintase (EC 2.3.3.13), como homocitrato sintase (EC 2.3.3.14) ou como 4-hidroxi-2-cetovalerato aldolase (EC 4.1.3.39). Isopropilmalato sintase catalisa a reação a seguir: acetil-CoA + 3-metil-2-oxobutanoato + H2O (2S)-2-isopropilmalato + CoA. Os exemplos para tais enzimas são a enzima correspondente de Brucella abortus (cepa 2308; Q2YRT1) e a enzima correspondente de Hahella chejuensis (cepa KCTC 2396; Q2SFA7).
[0124] Uma homocitrato sintase (EC 2.3.3.14) é uma enzima que catalisa a reação química acetil-CoA + H2O + 2-oxoglutarato (R)-2-hidroxibutano-1,2,4-tricarboxilato + CoA. A 4-hidroxi-2-cetovalerato aldolase catalisa a reação química 4-hidroxi-2- oxopentanoato acetaldeído + piruvato.
[0125] Os exemplos para enzimas classificadas como “HMG CoA liase” ou “uma proteína/enzima que tem a atividade de uma HMG CoA liase” no número de EC de EC 4.1.3.4, são dados em SEQ ID NOs: 19 a 25. SEQ ID NO: 19 mostra a sequência da HMG CoA liase de Zea mays (Número de acesso B6U7B9, banco de gene ACG45252), SEQ ID NO: 20 mostra a sequência da HMG CoA liase de Danio rerio (Brachydanio rerio; A8WG57, banco de gene BC154587), SEQ ID NO: 21 mostra a sequência da HMG CoA liase de Bos taurus (número de acesso Uniprot Q29448) e SEQ ID NO: 22 mostra a sequência da HMG CoA liase de Homo sapiens (mitocondrial, número de acesso Uniprot P35914, banco de gene HUMHYMEGLA), SEQ ID NO: 23 mostra a sequência da HMG CoA liase de Pseudomonas putida (Q88H25), SEQ ID NO: 24 mostra a sequência da HMG CoA liase de Acinetobacter baumannii (B7H4C6) e SEQ ID NO: 25 mostra a sequência da HMG CoA liase de Thermus thermophilus (Q72IH0).
[0126] Em uma modalidade preferida da presente invenção, a HMG CoA liase é uma enzima que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 19 a 25 ou a sequência que é pelo menos n % idêntica a qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 19 a 25 e que tem a atividade de uma HMG CoA liase com n como um número inteiro entre 10 e 100, preferencialmente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99.
[0127] Em relação à determinação do grau de identidade de sequência, o mesmo se aplica ao que foi estabelecido acima em conexão com HMG CoA sintase.
A CONVERSÃO ENZIMÁTICA DE ACETOACETATO EM ACETONA: ETAPA IV CONFORME MOSTRADO NA FIGURA 1
[0128] A acetona que é convertida de acordo com o método da presente invenção em 3-hidroxiisovalerato (HIV) pode ser fornecida por uma reação enzimática, a saber, a conversão enzimática de acetoacetato em acetona. A conversão de acetoacetato em acetona (etapa IV conforme mostrado na Figura 1) é esquematicamente ilustrada na Figura 5. Essa reação é uma reação de descarboxilação e é uma reação de ocorrência natural em organismos com capacidade para produzir acetona, isto é, organismos do gênero Clostridia.
[0129] Desse modo, a presente invenção também se refere a um método para produzir isobuteno a partir de acetoacetato no qual acetoacetato é convertido primeiro para acetona que é, então, condensada com acetil-CoA em 3-hidroxiisovalerato (HIV) que é, então, convertida em ácido 3-metilcrotônico, conforme descrito acima no presente documento. Adicionalmente, o dito ácido 3-metilcrotônico é, então, convertido em isobuteno, conforme descrito acima no presente documento.
[0130] De acordo com a presente invenção, a conversão de acetoacetato na dita acetona faz preferencialmente o uso de uma acetoacetato decarboxilase (EC 4.1.1.4). As sequências de nucleotídeo de diversos organismos que codificam essa enzima são conhecidas na técnica, por exemplo, o gene adc de Clostridium acetobutylicum (números de acesso Uniprot P23670 e P23673), Clostridium beijerinckii (Clostridium MP; Q9RPK1), Clostridium pasteurianum (número de acesso Uniprot P81336), Bradyrhizobium sp. (cepa BTAi1 / ATCC BAA-1182; número de acesso Uniprot A5EBU7), Burkholderia mallei (ATCC 10399 A9LBS0), Burkholderia mallei (número de acesso Uniprot A3MAE3), Burkholderia mallei FMH A5XJB2, Burkholderia cenocepacia (número de acesso Uniprot A0B471), Burkholderia ambifaria (número de acesso Uniprot Q0b5P1), Burkholderia phytofirmans (número de acesso Uniprot B2T319), Burkholderia spec. (número de acesso Uniprot Q38ZU0), Clostridium botulinum (número de acesso Uniprot B2TLN8), Ralstonia pickettii (número de acesso Uniprot B2UIG7), Streptomyces nogalater (número de acesso Uniprot Q9EYI7), Streptomyces avermitilis (número de acesso Uniprot Q82NF4), Legionella pneumophila (número de acesso Uniprot Q5ZXQ9), Lactobacillus salivarius (número de acesso Uniprot Q1WVG5), Rhodococcus spec. (número de acesso Uniprot Q0S7W4), Lactobacillus plantarum (número de acesso Uniprot Q890G0), Rhizobium leguminosarum (número de acesso Uniprot Q1M911), Lactobacillus casei (número de acesso Uniprot Q03B66), Francisella tularensis (número de acesso Uniprot Q0BLC9), Saccharopolispora erythreae (número de acesso Uniprot A4FKR9), Korarchaeum cryptofilum (número de acesso Uniprot B1L3N6), Bacillus amyloliquefaciens (número de acesso Uniprot A7Z8K8), Cochliobolus heterostrophus (número de acesso Uniprot Q8NJQ3), Sulfolobus islandicus (número de acesso Uniprot C3ML22) e Francisella tularensis subespécie holarctica (cepa OSU18).
[0131] Em uma modalidade preferida, a acetoacetato decarboxilase empregada no método da presente invenção na conversão de acetoacetato em acetona é uma acetoacetato decarboxilase (EC 4.1.1.4) derivada de Clostridium acetobutylicum (números de acesso Uniprot P23670 e P23673).
A CONVERSÃO ENZIMÁTICA DE ACETOACETIL-COA EM ACETOACETATO: ETAPA VA E ETAPA VB CONFORME MOSTRADO NA FIGURA 1
[0132] O acetoacetato que é convertido de acordo com o método da presente invenção em acetona pode ser fornecido em si por uma reação enzimática, a saber, a conversão enzimática de acetoacetil-CoA em acetoacetato. A conversão de acetoacetil-CoA em acetoacetato pode ser alcançada por duas rotas diferentes. Uma possibilidade é a conversão de acetoacetil-CoA em acetoacetato hidrolisando-se o CoA tioéster de acetoacetil-CoA em acetoacetato. Essa reação (etapa Va conforme mostrado na Figura 1) é esquematicamente ilustrada na Figura 6. Em outro aspecto mais preferido, o grupo CoA de acetoacetil-CoA é transferido em acetato, resultando na formação de acetoacetato e acetil-CoA. Essa reação (etapa Vb conforme mostrado na Figura 1) é esquematicamente ilustrada na Figura 7.
[0133] Desse modo, a presente invenção também se refere a um método para produzir isobuteno a partir de acetoacetil-CoA no qual acetoacetil-CoA é primeiro convertido em acetoacetato que é, então, convertido em acetona que é, então, condensada com acetil-CoA em 3-hidroxiisovalerato (HIV) que é, então, convertido em ácido 3-metilcrotônico, conforme descrito acima no presente documento. Adicionalmente, o dito ácido 3-metilcrotônico é, então, convertido em isobuteno, conforme descrito acima no presente documento.
[0134] Conforme mencionado, em um aspecto, o CoA tioéster de acetoacetil-CoA é hidrolisado para resultar em acetoacetato. De acordo com esse aspecto da presente invenção, a conversão enzimática de acetoacetil-CoA em acetoacetato é alcançada fazendo-se preferencialmente o uso de uma acetoacetil-CoA hidrolase (EC 3.1.2.11) que catalisa naturalmente essa reação.
[0135] Acetoacetil-CoA hidrolases (EC 3.1.2.11) catalisam a reação a seguir:
[0136] Essa enzima é conhecida a partir de vários organismos e foi, por exemplo, descrita em organismos eucarióticos. A enzima foi, por exemplo, descrita em Bos taurus, Columba livia, Gallus gallus, Homo sapiens, Mus musculus, Oncorhynchus mykiss, Oryctolagus cuniculus, ou Rattus norvegicus. Desse modo, em uma modalidade preferida, a enzima é do gênero selecionado a partir do grupo que consiste em Bos, Columba, Gallus, Mus, Oncorhynchus, Oryctolagus e Rattus. Em uma modalidade mais preferida, a enzima é da espécie selecionada a partir do grupo que consiste em Bos taurus, Columba livia, Gallus gallus, Homo sapiens, Mus musculus, Oncorhynchus mykiss, Oryctolagus cuniculus, ou Rattus norvegicus. Bos taurus, Columba livia, Gallus gallus, Homo sapiens, Mus musculus, Oncorhynchus mykiss, Oryctolagus cuniculus, e Rattus norvegicus.
[0137] Conforme mencionado em outra possibilidade mais preferida, o grupo CoA de acetoacetil-CoA é transferido em acetato, resultando na formação de acetoacetato e acetil-CoA. De acordo com essa possibilidade da presente invenção, a conversão enzimática de acetoacetil-CoA em acetoacetato é alcançada fazendo-se uso preferencialmente de uma enzima que tem capacidade para transferir o grupo CoA de acetoacetil-CoA em acetato.
[0138] Preferencialmente, tal enzima com capacidade para transferir o grupo CoA de acetoacetil-CoA em acetato pertence à família de CoA transferases (EC 2.8.3.-).
[0139] Desse modo, a presente invenção se refere a um método para a conversão enzimática de acetoacetil-CoA em acetoacetato fazendo-se uso de uma enzima com capacidade para transferir o grupo CoA de acetoacetil-CoA em acetato, preferencialmente uma CoA transferase (EC 2.8.3.-). Um exemplo preferido de uma enzima que catalisa a conversão de acetoacetil-CoA em acetoacetato que pode ser empregada no método da presente invenção é uma enzima classificada como uma acetato CoA transferase (EC 2.8.3.8).
[0140] Acetato CoA transferases (EC 2.8.3.8) catalisam a reação a seguir:
[0141] Acetato CoA transferases (EC 2.8.3.8) são conhecidas a partir de vários organismos, por exemplo, a partir de E. coli no qual são codificadas pelos genes atoD e atoA (números de acesso UniProt P76458 e P76459). Uma acetato CoA transferase também é conhecida a partir de Clostrtidium acetobutylicum na qual é codificada pelo gene ctfAB. Desse modo, em uma modalidade preferida da invenção, uma acetato CoA transferase (EC 2.8.3.8) é usada para a conversão de acetoacetil-CoA em acetoacetato que é derivado de E. coli e que é codificado pelos genes atoD e atoA (números de acesso UniProt P76458 e P76459) ou que é derivado de Clostrtidium acetobutylicum e que é codificado pelo gene ctfAB.
A CONVERSÃO ENZIMÁTICA DE 3-METILCROTONIL-COA EM ÁCIDO 3-METILCROTÔNICO: ETAPA VI CONFORME MOSTRADO NA FIGURA 1
[0142] A ácido 3-metilcrotônico pode ser fornecido por outra rota possível que é descrita a seguir.
[0143] Desse modo, em outra modalidade, o ácido 3-metilcrotônico que é convertido em isobuteno pode ser fornecido em si por outra reação enzimática, a saber, a conversão enzimática de 3-metilcrotonil-CoA em ácido 3-metilcrotônico. A conversão de 3-metilcrotonil-CoA em ácido 3-metilcrotônico (etapa VI conforme mostrado na Figura 1) é esquematicamente ilustrada na Figura 8.
[0144] A conversão de 3-metilcrotonil-CoA em ácido 3-metilcrotônico pode ser, por exemplo, alcançada de maneiras diferentes, por exemplo, por três rotas enzimáticas alternativas descritas a seguir e conforme mostrado na Figura 1 (etapa VIa, etapa VIb ou etapa VIc conforme mostrado na Figura 1).
[0145] Desse modo, a conversão enzimática de 3-metilcrotonil-CoA em ácido 3- metilcrotônico pode ser alcançada por (a) uma reação enzimática única na qual 3-metilcrotonil-CoA é diretamente convertida em ácido 3-metilcrotônico, preferencialmente fazendo-se uso de uma CoA transferase (EC 2.8.3.-), preferencialmente uma propionato:acetato-CoA transferase (EC 2.8.3.1), uma acetato CoA-transferase (EC 2.8.3.8) ou uma succinil-CoA:acetato CoA-transferase (EC 2.8.3.18) (etapa VIa conforme mostrado na Figura 1); (b) uma reação enzimática única na qual 3-metilcrotonil-CoA é diretamente convertida em ácido 3-metilcrotônico, preferencialmente fazendo-se uso de uma tioéster hidrolase (EC 3.1.2.-), preferencialmente uma acetil-CoA hidrolase (EC 3.1.2.1), uma acil-CoA hidrolase de cadeia curta dependente de ADP (EC 3.1.2.18) ou uma acil-CoA hidrolase (EC 3.1.2.20) (etapa VIb conforme mostrado na Figura 1); ou (c) duas etapas enzimáticas que compreendem (i) primeiro converter enzimaticamente 3-metilcrotonil-CoA em fosfato de 3- metilcrotonila; e (ii) então, converter enzimaticamente o fosfato de 3-metilcrotonila obtido desse modo no dito ácido 3-metilcrotônico (etapa VIc conforme mostrado na Figura 1).
[0146] Desse modo, uma possibilidade de uma conversão de duas etapas de 3- metilcrotonil-CoA por meio de fosfato de 3-metilcrotonila em ácido 3-metilcrotônico. Duas outras opções envolvem uma conversão direta de 3-metilcrotonil-CoA em ácido 3-metilcrotônico. Essas três opções serão discutidas a seguir.
[0147] Consequentemente, em uma modalidade, a conversão enzimática de 3- metilcrotonil-CoA em ácido 3-metilcrotônico é alcançada por duas etapas enzimáticas que compreendem (i) primeiro converter enzimaticamente 3-metilcrotonil-CoA em fosfato de 3-metilcrotonila; e (ii) então converter enzimaticamente o fosfato de 3- metilcrotonila obtido desse modo no dito ácido 3-metilcrotônico (conforme mostrado na etapa VIc da Figura 1). A reação correspondente é esquematicamente mostrada na Figura 11.
[0148] A conversão de 3-metilcrotonil-CoA em fosfato de 3-metilcrotonila pode ser, por exemplo, alcançada pelo uso de uma fosfato butiriltransferase (EC 2.3.1.19) ou uma fosfato acetiltransferase (EC 2.3.1.8).
[0149] Fosfato butiriltransferase (EC 2.3.1.19) catalisa naturalmente a reação a seguir
[0150] Foi descrito por Wiesenborn et al. (Appl. Environ. Microbiol. 55 (1989), 317 a 322) e por Ward et al. (J. Bacteriol. 181 (1999), 5.433 a 5.442) que fosfato butiriltransferases (EC 2.3.1.19) pode usar vários substratos além de butiril coenzima A (butiril-CoA), em particular, acetil-CoA, propionil-CoA, isobutiril-CoA, valeril-CoA e isovaleril-CoA.
[0151] A enzima foi descrita para ocorrer em vários organismos, em particular, em bactérias e em protozoários. Em uma modalidade, a enzima é do protozoário Dasytricha ruminantium. Em uma modalidade preferida, a fosfato butiriltransferase é uma fosfato butiriltransferase de uma bactéria, preferencialmente a partir de uma bactéria do gênero Bacillus, Butyrivibrio, Enterococcus ou Clostridium, mais preferencialmente Enterococcus ou Clostridium, e até mais preferencialmente de Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Butyrivibrio fibrisolvens, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Clostridium butíricum, Clostridium kluyveri, Clostridium saccharoacetobutilicum, Clostridium sprorogenes ou Enterococcus faecalis. Com máxima preferência, a enzima é de Clostridium acetobutylicum, em particular, a enzima codificada pelo gene ptb (número de acesso Uniprot F0K6W0; Wiesenborn et al. (Appl. Environ. Microbiol. 55 (1989), 317 a 322)) ou de Enterococcus faecalis (número de acesso Uniprot K4YRE8; Ward et al. (J. Bacteriol. 181 (1999), 5.433 a 5.442)).
[0152] Em uma modalidade preferida, a conversão de 3-metilcrotonil-CoA em fosfato de 3-metilcrotonila é alcançada fazendo-se uso de uma fosfato butiriltransferase de Clostridium acetobutylicum, preferencialmente de cepa ATCC 824 de Clostridium acetobutylicum. A sequência de aminoácidos da dita proteína é mostrada em SEQ ID NO: 26.
[0153] Obviamente, não é possível usar uma enzima que mostra exatamente esse aminoácido de SEQ ID NO:26. Também é possível usar uma enzima que compreende uma sequência que é pelo menos 60% idêntica à sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 26. Preferencialmente, a identidade de sequência é pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 80%, 85% ou 90%, até mais preferencialmente 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% e particularmente preferida em pelo menos 99% com SEQ ID NO:26 e a enzima tem a atividade enzimática de converter 3-metilcrotonil-CoA em fosfato de 3-metilcrotonila. Em relação à determinação da identidade de sequência, as mesmas aplicações foram apresentadas acima.
[0154] Em outra modalidade preferida, a conversão de 3-metilcrotonil-CoA em fosfato de 3-metilcrotonila é alcançada fazendo-se uso de uma fosfato butiriltransferase de Bacillus subtilis, preferencialmente de Bacillus subtilis que tem o Número de acesso UniProt P54530. A sequência de aminoácidos da dita proteína é mostrada em SEQ ID NO: 73.
[0155] Em uma modalidade preferida da presente invenção, a fosfato butiriltransferase é uma enzima que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 73 ou uma sequência que é pelo menos n % idêntica a SEQ ID NO: 73 com n como um número inteiro entre 10 e 100, preferencialmente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 e em que a enzima tem a atividade enzimática de converter 3-metilcrotonil-CoA em fosfato de 3- metilcrotonila. Em relação à determinação da identidade de sequência, as mesmas aplicações foram apresentadas acima.
[0156] Em outra modalidade preferida, a conversão de 3-metilcrotonil-CoA em fosfato de 3-metilcrotonila é alcançada fazendo-se uso de uma fosfato butiriltransferase de Enterococcus faecalis, preferencialmente de Enterococcus faecalis que tem o Número de acesso UniProt S4BZL5. A sequência de aminoácidos da dita proteína é mostrada em SEQ ID NO: 74.
[0157] Em uma modalidade preferida da presente invenção, a fosfato butiriltransferase é uma enzima que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 74 ou uma sequência que é pelo menos n % idêntica a SEQ ID NO: 74 com n como um número inteiro entre 10 e 100, preferencialmente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 e em que a enzima tem a atividade enzimática de converter 3-metilcrotonil-CoA em fosfato de 3- metilcrotonila. Em relação à determinação da identidade de sequência, as mesmas aplicações foram apresentadas acima.
[0158] Fosfato acetiltransferase (EC 2.3.1.8) catalisa naturalmente a reação a seguir
[0159] Foi descrito por Veit et al. (J. Biotechnol.140 (2009), 75 a 83) que fosfato acetiltransferase também pode usar butiril-CoA ou propionil-CoA como um substrato.
[0160] Os números de acesso para essa família de enzima no banco de dados InterPro são IPR012147 e IPR002505, "http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/IPR002505" (http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/IPR012147 http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/IPR002505) Também consultar http://pfam.sanger.ac.uk/family/PF01515
[0161] A enzima foi descrita em uma variedade de organismos, em particular, bactérias e fungos. Desse modo, em uma modalidade preferida, a enzima é uma enzima de uma bactéria, preferencialmente do gênero Escherichia, Chlorogonium, Clostridium, Veillonella, Methanosarcina, Corynebacterium, Ruegeria, Salmonella, Azotobacter, Bradorhizobium, Lactobacillus, Moorella, Rhodopseudomonas, Sinorhizobium, Streptococcus, Thermotoga ou Bacillus, mais preferencialmente da espécie Escherichia coli, Chlorogonium elongatum, Clostridium kluyveri, Clostridium acetobutylicum, Clostridium acidurici, Veillonella parvula, Methanosarcina thermophila, Corynebacterium glutamicum, Ruegeria pomeroyi, Salmonella enterica, Azotobacter vinelandii, Bradyrhizobium japonicum, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus sanfranciscensis, Moorella thermoacetica, Rhodopseudomonas palustris, Sinorhizobium meliloti, Streptococcus pyogenes, Thermotoga maritima ou Bacillus subtilis. Em outra modalidade preferida, a enzima é uma enzima de um fungo, preferencialmente do gênero Saccharomyces, mais preferencialmente da espécie Saccharomyces cerevisiae.
[0162] Em uma modalidade preferida, a conversão de 3-metilcrotonil-CoA em fosfato de 3-metilcrotonila é alcançada fazendo-se uso de uma fosfato acetiltransferase de Corynebacterium glutamicum, preferencialmente da cepa ATCC 13032 de Corynebacterium glutamicum. A sequência de aminoácidos da dita proteína é mostrada em SEQ ID NO: 27.
[0163] Obviamente, não é possível usar uma enzima que mostra exatamente esse aminoácido de SEQ ID NO:27. Também é possível usar uma enzima que compreende uma sequência que é pelo menos 60% idêntica à sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 27. Preferencialmente, a identidade de sequência é pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 80%, 85% ou 90%, até mais preferencialmente 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% e particularmente preferida em pelo menos 99% com SEQ ID NO:27 e a enzima tem a atividade enzimática de converter 3-metilcrotonil-CoA em fosfato de 3-metilcrotonila. Em relação à determinação da identidade de sequência, as mesmas aplicações foram apresentadas acima.
[0164] A conversão de fosfato de 3-metilcrotonila em ácido 3-metilcrotônico pode ser, por exemplo, alcançada fazendo-se uso de uma enzima que é classificada como EC 2.7.2.-, isto é, uma fosfotransferase. Tais enzimas usam um grupo carbóxi como aceitante. Desse modo, a conversão de fosfato de 3-metilcrotonila em ácido 3- metilcrotônico pode ser, por exemplo, alcançada fazendo-se uso de uma enzima com um grupo carbóxi como aceitante (EC 2.7.2.-). Em uma modalidade preferida, a conversão de fosfato de 3-metilcrotonila em ácido 3-metilcrotônico é alcançada pelo uso de uma propionato quinase (EC 2.7.2.15), uma acetato quinase (EC 2.7.2.1), uma butirato quinase (EC 2.7.2.7) ou uma ácido graxo quinase de cadeia ramificada (EC 2.7.2.14).
[0165] Butirato quinases (EC 2.7.2.7) catalisam naturalmente a reação a seguir
[0166] Foi descrito, por exemplo, por Hartmanis (J. Biol. Chem. 262 (1987), 617 a 621) que butirato quinase pode usar vários substratos além de butirato, por exemplo, valerato, isobutirato, isovalerato e acetato de vinila. A enzima foi descrita em uma variedade de organismos, em particular, bactérias. Em uma modalidade preferida, a enzima é de uma bactéria, preferencialmente de uma bactéria do gênero Clostridium, Butyrivibrio, Thermotoga ou Enterococcus. Clostridium é preferido. Mais preferencialmente, a enzima é de uma bactéria da espécie Clostridium acetobutylicum, Clostridium proteoclasticum, Clostridium tyrobutíricum, Clostridium butíricum, Clostridium pasteurianum, Clostridium tetanomorphum, Butyrivibrio firbrosolvens, Butyrivibrio hungatei, Thermotoga maritime ou Enterococcus durans. Clostridium acetobutylicum é preferido. Para esse organismo, duas butirato quinases foram descritas: butirato quinase 1 (número de acesso Uniprot: Q45829) e butirato quinase II (número de acesso Uniprot: Q97II19).
[0167] Em outra modalidade preferida, a conversão de fosfato de 3-metilcrotonila em ácido 3-metilcrotônico é alcançada fazendo-se uso de uma butirato quinase de Lactobacillus, preferencialmente de Lactobacillus casei (Número de acesso UniProt K0N529) ou uma butirato quinase de Geobacillus, preferencialmente de Geobacillus sp. (Número de acesso UniProt L8A0E1). A sequência de aminoácidos dessas proteínas é mostrada em SEQ ID NO:75 e SEQ ID NO:76, respectivamente.
[0168] Em uma modalidade preferida da presente invenção, a butirato quinase é uma enzima que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 75 ou 76 ou uma sequência que é pelo menos n % idêntica a SEQ ID NO: 75 ou 76 com n como um número inteiro entre 10 e 100, preferencialmente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 e em que a enzima tem a atividade enzimática de converter fosfato de 3-metilcrotonila em ácido 3- metilcrotônico. Em relação à determinação da identidade de sequência, as mesmas aplicações foram apresentadas acima.
[0169] As quinases de ácido graxo de cadeia ramificada (EC 2.7.2.14) catalisam naturalmente a reação a seguir em que “alquila” pode ser 2-metilbutanoato, butanoato, isobutanoato, pentanoato ou propionato. A última reação com propionato foi descrita para uma ácido graxo quinase de cadeia ramificada de um spirochaete (J. Bacteriol. 152 (1982), 246 a 254).
[0170] Essa enzima foi descrita por ocorrer em várias bactérias. Desse modo, em uma modalidade preferida, a enzima é uma enzima de uma bactéria, preferencialmente do gênero Spirochaeta ou Thermotoga, mais preferencialmente Thermotoga maritime.
[0171] Propionato quinases (EC 2.7.2.15) que catalisam naturalmente as reações a seguir
[0172] Essa enzima foi descrita por ocorrer em várias bactérias, em particular, Enterobacteriacea. Desse modo, em uma modalidade preferida, a enzima é uma enzima de uma bactéria, preferencialmente do gênero Salmonella ou Escherichia, mais preferencialmente da espécie Salmonella enterica, Salmonella typhimurium ou Escherichia coli.
[0173] Em uma modalidade preferida, a conversão de fosfato de 3-metilcrotonila em ácido 3-metilcrotônico é alcançada fazendo-se uso de uma propionato quinase de Salmonella typhimurium, preferencialmente de cepa ATCC 700720 de Salmonella typhimurium. A sequência de aminoácidos da dita proteína é mostrada em SEQ ID NO: 28.
[0174] Obviamente, não é possível usar uma enzima que mostra exatamente esse aminoácido de SEQ ID NO:28. Também é possível usar uma enzima que compreende uma sequência que é pelo menos 60% idêntica à sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 28. Preferencialmente, a identidade de sequência é pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 80%, 85% ou 90%, até mais preferencialmente 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% e particularmente preferida pelo menos 99% com SEQ ID NO:28 e a enzima tem a atividade enzimática de converter fosfato de 3-metilcrotonila em ácido 3-metilcrotônico. Em relação à determinação da identidade de sequência, as mesmas aplicações foram apresentadas acima.
[0175] Em outra modalidade preferida, a conversão de fosfato de 3-metilcrotonila em ácido 3-metilcrotônico é alcançada fazendo-se uso de uma propionato quinase de Escherichia coli, preferencialmente de cepa K12 de Escherichia coli. A sequência de aminoácidos da dita proteína é mostrada em SEQ ID NO: 29.
[0176] Obviamente, não é possível usar uma enzima que mostra exatamente esse aminoácido de SEQ ID NO:29. Também é possível usar uma enzima que compreende uma sequência que é pelo menos 60% idêntica à sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 29. Preferencialmente, a identidade de sequência é pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 80%, 85% ou 90%, até mais preferencialmente 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% e particularmente preferida pelo menos 99% com SEQ ID NO:29 e a enzima tem a atividade enzimática de converter fosfato de 3-metilcrotonila em ácido 3-metilcrotônico. Em relação à determinação da identidade de sequência, as mesmas aplicações foram apresentadas acima.
[0177] Acetato quinases (EC 2.7.2.1) catalisam naturalmente a reação a seguir
[0178] Essa enzima foi descrita por ocorrer em vários organismos, em particular, bactérias e eucariotas. Em uma modalidade preferida, a enzima é de uma bactéria, preferencialmente de uma bactéria do gênero Methanosarcina, Cryptococcus, Ethanoligenens, Propionibacterium, Roseovarius, Streptococcus, Salmonella, Acholeplasma, Acinetobacter, Ajellomyces, Bacillus, Borrelia, Chaetomium, Clostridium, Coccidioides, Coprinopsis, Cryptococcus, Cupriavidus, Desulfovibrio, Enterococcus, Escherichia, Ethanoligenes, Geobacillus, Helicobacter, Lactobacillus, Lactococcus, Listeria, Mesoplasma, Moorella, Mycoplasma, Oceanobacillus, Propionibacterium, Rhodospeudomonas, Roseovarius, Salmonella, Staphylococcus, Thermotoga ou Veillonella, mais preferencialmente de uma bactéria da espécie Methanosarcina thermophila, Cryptococcus neoformans, Ethanoligenens harbinense, Propionibacterium acidipropionici, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus enterica, Streptococcus pyogenes, Acholeplasma laidlawii, Acinetobacter calcoaceticus, Ajellomyces capsulatus, Bacillus subtilis, Borrelia burgdorferi, Chaetomium globosum, Clostridium acetobutylicum, Clostridium thermocellum, Coccidioides immitis, Coprinopsis cinerea, Cryptococcus neoformans, Cupriavidus necator, Desulfovibrio vulgaris, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Ethanoligenes harbinense, Geobacillus stearothermophilus, Helicobacter pilori, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus sanfranciscensis, Lactococcus lactis, Listeria monocytogenes, Mesoplasma florum, Methanosarcina acetivorans, Methanosarcina mazei, Moorella thermoacetica, Mycoplasma pneumoniae, Oceanobacillus iheyensis, Propionibacterium freudenreichii, Propionibacterium acidipropionici, Rhodospeudomonas palustris, Salmonella enteric, Staphylococcus aureus, Thermotoga maritime ou Veillonella parvula.
[0179] Em outra modalidade preferida, a enzima é uma enzima de um fungo, preferencialmente de um fungo do gênero Aspergillus, Gibberella, Hypocrea, Magnaporthe, Phaeosphaeria, Phanerochaete, Phytophthora, Sclerotinia, Uncinocarpus, Ustilago ou Neurospora até mais preferencialmente de um fungo da espécie Aspergillus fumigates, Aspergillus nidulans, Gibberella zeae, Hypocrea jecorina, Magnaporthe grisea, Phaeosphaeria nodorum, Phanerochaete chrysosporium, Phytophthora ramorum, Phytophthora sojae, Sclerotinia sclerotiorum, Uncinocarpus reesii, Ustilago maydis ou Neurospora crassa.
[0180] Em uma modalidade preferida adicional, a enzima é uma enzima de uma planta ou uma alga, preferencialmente do gênero Chlamydomonas, até mais preferencialmente da espécie Chlamydomonas reinhardtii.
[0181] Em outra modalidade, a enzima é de um organismo do gênero Entamoeba, mais preferencialmente da espécie Entamoeba histolytica.
[0182] As famílias de enzima mencionadas acima adequadas para a conversão de 3-metilcrotonil-CoA em fosfato de 3-metilcrotonila demonstraram ser relacionadas em evolução e conter assinaturas de sequência comuns. Essas assinaturas são referidas e descritas no banco de dados Prosite: http://prosite.expasy.org/cgi-bin/prosite/nicedoc.pl?PS01075
[0183] Gao et al. (FEMS Microbiol. Lett. 213 (2002), 59 a 65) já descreveu células de E. coli geneticamente modificadas que foram transformadas, inter alia, com o gene ptb e o gene buk de Clostridium acetobutylicum que codifica uma fosfato butiriltransferase (EC 2.3.1.19) e uma butirato quinase (EC 2.7.2.7), respectivamente. Essas células de E. coli demonstraram poder produzir ácido D-(-)-3-hidroxibutírico (3HB).
[0184] Conforme mencionado acima, a conversão de 3-metilcrotonil-CoA em ácido 3-metilcrotônico também pode ser alcançada por duas conversões alternativas em que 3-metilcrotonil-CoA é diretamente convertida em ácido 3-metilcrotônico.
[0185] Preferencialmente, em uma modalidade, 3-metilcrotonil-CoA é diretamente convertida em ácido 3-metilcrotônico hidrolisando-se a ligação de tioéster de 3- metilcrotonil-CoA em ácido 3-metilcrotônico fazendo-se uso de uma enzima que pertence à família de tioéster hidrolases (nas tioesterases denominadas a seguir (EC 3.1.2.-)). Essa reação é esquematicamente mostrada na Figura 10.
[0186] Os exemplos por tioéster hidrolases preferidas (EC 3.1.2.-) são uma acetil- CoA hidrolase (EC 3.1.2.1), uma acil-CoA hidrolase de cadeia curta dependente de ADP (EC 3.1.2.18) e uma acil-CoA hidrolase (EC 3.1.2.20) (etapa VIb conforme mostrado na Figura 1).
[0187] Em uma modalidade alternativa, 3-metilcrotonil-CoA é diretamente convertido em ácido 3-metilcrotônico, preferencialmente fazendo-se uso de uma enzima que pertence à família de CoA-transferases (EC 2.8.3.-). Essa reação é esquematicamente mostrada na Figura 9.
[0188] Os exemplos de CoA transferases preferidas (EC 2.8.3.-) são uma propionato:acetato-CoA transferase (EC 2.8.3.1), uma acetato CoA-transferase (EC 2.8.3.8) e a succinil-CoA:acetato CoA-transferase (EC 2.8.3.18) (etapa VIa conforme mostrado na Figura 1).
[0189] Tioesterases (TEs; também denominadas tioéster hidrolases) são enzimas que são classificadas como EC 3.1.2. Atualmente, as tioesterases são classificadas como EC 3.1.2.1 a EC 3.1.2.30 enquanto TEs que não são classificadas ainda/não classificadas são agrupadas como enzimas que pertencem a EC 3.1.2.-. Cantu et al. (Protein Science 19 (2010), 1.281 a 1.295) descreve que há 23 famílias de tioesterases que são não relacionadas entre si em relação à estrutura primária. Entretanto, supõe-se que todos os membros da mesma família têm essencialmente a mesma estrutura terciária. As tioesterases hidrolisam a ligação de tioéster entre um grupo carbonila e um átomo de enxofre.
[0190] Em uma modalidade preferida, uma tioesterase empregada em um método de acordo com a presente invenção para converter 3-metilcrotonil-CoA em ácido 3- metilcrotônico é selecionada a partir do grupo que consiste em: - acetil-CoA hidrolase (EC 3.1.2.1); - palmitoil-CoA hidrolase (EC 3.1.2.2); - 3-hidroxiisobutiril-CoA hidrolase (EC 3.1.2.4); - oleoil-[acil-carreador-proteína] hidrolase (EC 3.1.2.14); - acil-CoA hidrolase de cadeia curta dependente de ADP (EC 3.1.2.18); - acil-CoA hidrolase de cadeia média dependente de ADP (EC 3.1.2.19); e - acil-CoA hidrolase (EC 3.1.2.20).
[0191] Desse modo, em uma modalidade preferida, a conversão direta de 3- metilcrotonil-CoA em ácido 3-metilcrotônico é alcançada fazendo-se uso de uma acetil-CoA hidrolase (EC 3.1.2.1). Acetil-CoA hidrolases são enzimas que catalisam a reação a seguir:
[0192] Essa enzima ocorre em uma variedade de organismos, incluindo organismos eucarióticos e procarióticos, como plantas, animais, fungos e bactérias. A enzima foi, por exemplo, descrita em Rattus norvegicus (número de acesso Uniprot: Q99NB7), Mus musculus, Sus scrofa, Bos taurus, Gallus gallus, Platyrrhini, Ovis aries, Mesocricetus auratus, Ascaris suum, Homo sapiens (número de acesso Uniprot: Q8WYK0), Pisum sativum, Cucumis sativus, Panicus sp., Ricinus communis, Solanum tuberosum, Spinacia oleracea, Zea mays, Glycine max, Saccharomyces cerevisiae, Neurospora crassa, Candida albicans, Trypanosoma brucei brucei, Trypanosoma cruzi, Trypanosoma dionisii, Trypanosoma vespertilionis, Crithidia fasciculate, Clostridium aminovalericum, Acidaminococcus fermaentans, Bradyrhizobium japonicum e Methanosarcina barkeri.
[0193] Em outra modalidade preferida, a conversão direta de 3-metilcrotonil-CoA em ácido 3-metilcrotônico é alcançada fazendo-se uso de uma palmitoil-CoA hidrolase (EC 3.1.2.2). Palmitoil-CoA hidrolases são enzimas que catalisam a reação a seguir:
[0194] Essa enzima ocorre em uma variedade de organismos, incluindo organismos eucarióticos e procarióticos, como plantas, animais, fungos e bactérias. A enzima foi, por exemplo, descrita em Arabidopsis thaliana (número de acesso Uniprot: Q8GYW7), Pisum sativum, Spinacia oleracea, Bumilleriopsis filiformis, Eremosphaera viridis, Mougeotia scalaris, Euglena gracilis, Rhodotorula aurantiaca, Saccharaomyces cerevisiae, Candida rugosa, Caenorhabditis elegans, Mus musculus (número de acesso Uniprot: P58137), Homo sapiens, Platyrrhini, Bos taurus, Canis lupus familiaris, Sus scrofa, Cavia procellus, Columba sp., Cricetulus griseus, Mesocricetus auratus, Drosophila melanogaster, Rattus norvegicus, Oryctolagus cuniculus, Gallus gallus, Anas platyrhynchos, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium phlei, Mycobacterium smegmatis, Acinetobacter colcaceticus, Haemophilus influenza, Helicobacter pilori, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Rhodobacter shpaeroides, Streptomyces coelicolor, Streptomyces venezuelae e E. coli.
[0195] Em uma modalidade preferida adicional, a conversão direta de 3- metilcrotonil-CoA em ácido 3-metilcrotônico é alcançada fazendo-se uso de uma 3- hidroxiisobutiril-CoA hidrolase (EC 3.1.2.4). 3-hidroxiisobutiril-CoA hidrolases são enzimas que catalisam a reação a seguir:
[0196] Essa enzima ocorre em uma variedade de organismos, incluindo organismos eucarióticos e procarióticos, como plantas, animais, fungos e bactérias. A enzima foi, por exemplo, descrita em Arabidopsis thaliana, Homo sapiens, Canus lupus familiaris, Rattus norvegicus, Bacillus cereus, Pseudomonas fluorescens e Pseudomonas aeruginosa.
[0197] Ainda em outra modalidade preferida, a conversão direta de 3-metilcrotonil- CoA em ácido 3-metilcrotônico é alcançada fazendo-se uso de uma oleoil-[acil- carreador-proteína]hidrolase (EC 3.1.2.14). Oleoil-[acil-carreador-proteína]hidrolases são enzimas que catalisam a reação a seguir: oleoil-[acil-carreador-proteína] + H2O → oleato + [acil-carreador-proteína]
[0198] Essa enzima ocorre em uma variedade de plantas e bactérias. A enzima foi, por exemplo, descrita em Arabidopsis thaliana, Allium ampeloprasum, Curcurbita moschata, Cuphea calophylla, Cuphea hookeriana, Cuphea lanceolata, Cuphea wrightii, Umbellularia californica, Coriandrum sativum, Spinacia oleracea, Elaeis sp., Elaeis guineensis, Glycine max, Persea americana, Pisum sativum, Sinapis alba, Ulmus americana, Zea mays, Brassica juncea, Brassica napus, Brassica rapa subespécie campestris, Jatropha curcas, Ricinus communis, Cinnamomum camphorum, Macadamia tetraphylla, Magnifera indica, Madhuca longifolia, Populus tomentosa, Chimonanthus praecox, Gossypium hirsutum, Diploknema butiracea, Helianthus annuus e Streptococcus pyogenes.
[0199] Ainda em outra modalidade preferida a conversão direta de 3-metilcrotonil- CoA em ácido 3-metilcrotônico é alcançada fazendo-se uso de uma acil-CoA hidrolase de cadeia curta dependente de ADP (EC 3.1.2.18). Acil-CoA hidrolases de cadeia curta dependentes de ADP são enzimas que catalisam a reação a seguir:Essa enzima ocorre em uma variedade de animais e foi, por exemplo, descrita em Mus musculus, Rattus norvegicus e Mesocricetus auratus. Ainda em outra modalidade preferida a conversão direta de 3-metilcrotonil- CoA em ácido 3-metilcrotônico é alcançada fazendo-se uso de uma acil-CoA hidrolase de cadeia média dependente de ADP (EC 3.1.2.19). Acil-CoA hidrolases de cadeia média dependentes de ADP são enzimas que catalisam a reação a seguir: uma acil-CoA + H2O → um carboxilato + CoA
[0200] Essa enzima ocorre em uma variedade de animais e foi, por exemplo, descrita em Rattus norvegicus e Mesocricetus auratus.
[0201] Em uma modalidade preferida adicional, a conversão direta de 3- metilcrotonil-CoA em ácido 3-metilcrotônico é alcançada fazendo-se uso de uma acil- CoA hidrolase (EC 3.1.2.20). Acil-CoA hidrolases são enzimas que catalisam a reação a seguir: uma acil-CoA + H2O → um carboxilato + CoA
[0202] Essa enzima ocorre em uma variedade de organismos, incluindo organismos eucarióticos e procarióticos, como plantas, animais, fungos e bactérias. A enzima foi, por exemplo, descrita em Arabidopsis thaliana, Rhodotorula aurantiaca, Bumilleriopsis filiformis, Eremosphaera viridis, Euglena gracilis, Mus musculus, Rattus norvegicus, Homo sapiens, Sus, scrofa, Bos taurus, Cais lupus familiaris, Cavia porcellus, Cricetus griseus, Drosophila melanogaster, Anas platyrhynchos, Gallus gallus, Caenorhabditis elegans, Saccharomyces cerevisia, Candida rugosa, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Xanthomonas campestris, Streptomyces sp., Streptomyces coelicolor, Alcaligenes faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Amycolatopsis mediterranei, Acinetobacter calcoaceticus, Helicobacter pilori, Rhodobacter spaeroides e Mycobacterium phlei. Em uma modalidade preferida, uma acil-CoA hidrolase é uma enzima de Escherichia coli, de Pseudomonas putida ou de Haemophilus influenza, mais preferencialmente, a enzima YciA de E. coli ou seu homólogo aproximadamente relacionado HI0827 de Haemophilus influenza (Zhuang et al., Biochemistry 47 (2008), 2.789 a 2.796). A enzima YciA de Haemophilus influenza é descrita por catalisar a hidrólise de propionil- CoA em ácido propiônico (Zhuang et al., Biochemistry 47 (2008), 2.789 a 2.796). Em outra modalidade preferida, a acetil-CoA hidrolase é uma enzima de Homo sapiens (UniProt: Q9NPJ3) que é descrita por hidrolisar propionil-CoA (Cao et al., Biochemistry 48 (2009), 1.293 a 1.304).
[0203] As enzimas particularmente preferidas são a enzima YciA de acil-CoA hidrolase da cepa R2866 de Haemophilus influenza (SEQ ID NO: 30) e a enzima acetil-CoA hidrolase de Homo sapiens (UniProt: Q9NPJ3; SEQ ID NO:31) descritas acima. Prefere-se, também, as enzimas acil-CoA tioéster hidrolase de E. coli (Uniprot P0A8Z0; SEQ ID NO: 32), acil-CoA tioesterase 2 de E. coli (Uniprot P0AGG2; SEQ ID NO: 33) e acil-CoA tioesterase II de Pseudomonas putida (Uniprot Q88DR1; SEQ ID NO: 34). A tioesterase TesB de E.coli K12 (uniprot :P0AGG2) é particularmente preferida, visto que essa enzima já é descrita por catalisar de modo eficaz essa reação em E. coli para a biossíntese de ácido propiônico (Tseng e Prather, P.N.A.S. 2012, 109(44), páginas 17.925 a 17.930).
[0204] Em outra modalidade preferida, a acil-CoA hidrolase é uma enzima derivada da família de 1,4-diidroxi-2-naftoil-CoA hidrolases. As enzimas dessa família de 1,4-diidroxi-2-naftoil-CoA hidrolases são conhecidas por catalisar a reação a seguir: 1,4-diidroxi-2-naftoil-CoA + H2O → 1,4-diidroxi-2-naftoato + CoA
[0205] Essas enzimas também são frequentemente denominadas Ydil tioesterases. As enzimas dessa família ocorrem em uma variedade de organismos e foram, por exemplo, descritas em Escherichia coli e Salmonella enterica.
[0206] Desse modo, particularmente, as acil-CoA hidrolases particularmente preferidas para a conversão enzimática de 3-metilcrotonil-CoA em ácido 3- metilcrotônico da presente invenção são enzimas que pertencem à família de f 1,4- diidroxi-2-naftoil-CoA hidrolases, mais preferencialmente a 1,4-diidroxi-2-naftoil-CoA hidrolase derivada de Escherichia coli (SEQ ID NO:82) ou a 1,4-diidroxi-2-naftoil-CoA hidrolase derivada de Salmonella enterica (SEQ ID NO:83).
[0207] Em uma modalidade particularmente preferida, a acil-CoA hidrolase empregada no método da invenção tem uma sequência de aminoácidos conforme mostrado em qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 30 a 34 e SEQ ID NOs:82 e 83 ou mostra uma sequência de aminoácidos que é pelo menos x% homóloga a qualquer um dentre SEQ ID NOs: 30 a 34 e SEQ ID NOs:82 e 83 e tem a atividade de uma acil- CoA hidrolase com x como um número inteiro entre 30 e 100, preferencialmente 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 em que tal enzima tem capacidade para catalisar a conversão de 3-metilcrotonil-CoA em ácido 3-metilcrotônico. Em relação à determinação da identidade de sequência, as mesmas aplicações foram apresentadas acima.
[0208] Conforme descrito acima, a conversão direta de 3-metilcrotonil-CoA em ácido 3-metilcrotônico também pode ser alcançada fazendo-se uso de uma enzima que é classificada como uma CoA-transferase (EC 2.8.3.-) com capacidade para transferir o grupo CoA de 3-metilcrotonil-CoA para um ácido carboxílico.
[0209] CoA-transferases são encontradas em organismos de todas as linhas de descendência. A maior parte das CoA-transferases pertencem a duas famílias de enzima bem conhecidas (denominadas a seguir como famílias I e II) e existe uma terceira família que foi identificada em vias metabólicas anaeróbicas de bactérias. Uma revisão que descreve as famílias diferentes pode ser encontrada em Heider (FEBS Letters 509 (2001), 345 a 349).
[0210] A família I contém, por exemplo, as CoA-transferases a seguir: Para 3-oxo ácidos: enzimas classificadas em EC 2.8.3.5 ou EC 2.8.3.6; Para ácidos graxos de cadeia curta: enzimas classificadas em EC 2.8.3.8 ou EC 2.8.3.9;
[0211] Para succinato: succinil-CoA:acetato CoA-transferases, isto é, enzimas classificadas em EC 2.8.3.18 (também consultar Mullins et al., Biochemistry 51(2012), 8422 a 8434; Mullins et al., J. Bacteriol. 190 (2006), 4933 a 4940).
[0212] A maioria das enzimas de família I usa naturalmente succinil-CoA ou acetil- CoA como doadores de CoA. Essas enzimas contêm duas subunidades dissimilares em estados de agregação diferentes. Dois motivos de sequência de aminoácidos conservados foram identificados: Entrada PS01273 de Prosites (http://prosite.expasy.org/cgi- bin/prosite/prosite-search-ac?PDOC00980) COA_TRANSF_1, PS01273; assinatura 1 de Coenzima A transferases (PATTERN) Padrão de consenso: [DN]-[GN]-x(2)-[LIVMFA](3)-G-G-F-x(3)-G-x-P e Entradas PS01273 de Prosites (http://prosite.expasy.org/cgi- bin/prosite/prosite-search-ac?PDOC00980) COA_TRANSF_2, PS01274; assinatura 2 de Coenzima A transferases (PATTERN) Padrão de consenso: [LF]-[HQ]-S-E-N-G-[LIVF](2)-[GA] E (ácido glutâmico) é um resíduo de sítio ativo.
[0213] A família II de CoA-transferases consiste nas α-subunidades homodiméricas de citrato liase (EC 2.8.3.10) e citramalato liase (EC 2.8.3.11). Essas enzimas catalisam a transferência de proteína carreadora de acila (ACP) que contém um derivado covalentemente ligado a CoA. Foi mostrado que tais enzimas também aceitam CoA-tioéster livre in vitro, como acetil-CoA, propionil-CoA, butiril-CoA no caso de citrato liase (Dimroth et al., Eur. J. Biochem. 80 (1977), 479 a 488) e acetil-CoA e succinil-CoA no caso de citramalato liase (Dimroth et al., Eur. J. Biochem. 80 (1977), 469 a 477).
[0214] De acordo com Heider (loc. cit.), a família III de CoA-transferases consiste em formil-CoA: oxalato CoA-transferase, succinil-CoA:(R)-benzilsuccinato CoA- transferase, (E)-cinamoil-CoA:(R)-fenilactato CoA-transferase e butirobetainil- CoA:(R)-carnitina CoA-transferase. Um membro adicional da família III é succinil- CoA:L-malato CoA-transferase cuja função em fixação de CO2 autotrófica de Chloroflexus aurantiacus é ativar L-malato para o seu tioéster de CoA com succinil- CoA como o doador de CoA Friedman S. et al. J. Bacteriol. 188 (2006), 2.646 a 2.655). As sequências de aminoácidos da CoA-tranferase dessa família mostram apenas um grau baixo de identidade de sequência com aquelas famílias I e II. Essas CoA- transferases ocorrem em procariotas e eucariotas.
[0215] Em uma modalidade preferida, a CoA-transferase empregada em um método de acordo com a presente invenção é uma CoA-transferase que pertence à família I ou II, conforme descrito acima no presente documento.
[0216] Preferencialmente, a CoA-transferase empregada em um método de acordo com a presente invenção para a conversão direta de 3-metilcrotonil-CoA em ácido 3-metilcrotônico é selecionada a partir do grupo que consiste em: - propionato:acetato-CoA transferase (EC 2.8.3.1); - acetato CoA-transferase (EC 2.8.3.8); e - butirato-acetoacetato CoA-transferase (EC 2.8.3.9).
[0217] Desse modo, em uma modalidade preferida, a conversão direta de 3- metilcrotonil-CoA em ácido 3-metilcrotônico é alcançada fazendo-se uso de uma acetato CoA-transferase (EC 2.8.3.8). Acetato CoA-transferases são enzimas que catalisam a reação a seguir:
[0218] Essa enzima ocorre em uma variedade de bactérias e foi, por exemplo, descrita em Anaerostipes caccae, Eubacterium hallii, Faecalibacterium prausnitzii, Roseburia hominis, Roseburia intestinalis, Coprococcus sp. e Escherichia coli.
[0219] Em outra modalidade preferida, a conversão direta de 3-metilcrotonil-CoA em ácido 3-metilcrotônico é alcançada fazendo-se uso de uma butirato-acetoacetato CoA-transferase (EC 2.8.3.9). Butirato-acetoacetato CoA-transferase são enzimas que catalisam a reação a seguir:
[0220] Essa enzima ocorre em uma variedade de organismos, incluindo organismos eucarióticos e procarióticos, como animais e bactérias. A enzima foi, por exemplo, descrita em Bos taurus, Clostridium sp. e Escherichia coli.
[0221] Em outra modalidade preferida, a conversão direta de 3-metilcrotonil-CoA em ácido 3-metilcrotônico é alcançada fazendo-se uso de uma propionato:acetato- CoA transferase (EC 2.8.3.1). Propionato:acetato-CoA transferases são enzimas que catalisam a reação a seguir:
[0222] Essa enzima ocorre em uma variedade de organismos, incluindo organismos procarióticos e a enzima foi, por exemplo, descrita em Clostridium kluyveri, Clostridium propionicum, Clostridium propionicum JCM1430, Cupriavidus necator e Emericella nidulans.
[0223] Em outra modalidade preferida, a conversão direta de 3-metilcrotonil-CoA em ácido 3-metilcrotônico é alcançada fazendo-se uso de uma succinil-CoA:acetato- CoA transferase (EC 2.8.3.18). Succinil-CoA:acetato CoA-transferases são enzimas que catalisam a reação a seguir:
[0224] Essa enzima ocorre em uma variedade de organismos, incluindo organismos procarióticos, e a enzima foi, por exemplo, descrita em Acetobacter aceti, Trichomonas vaginalis, Tritrichomonas foetus, Tritrichomonas foetus ATCC 30924 e Trypanosoma brucei.
[0225] Em outra modalidade preferida, a conversão direta de 3-metilcrotonil-CoA em ácido 3-metilcrotônico é alcançada fazendo-se uso de uma CoA-transferase derivada de Megasphaera sp. (número de acesso Uniprot S7HFR5), uma enzima que pertence às CoA-transferases (EC 2.8.3.-) conforme definido acima no presente documento.
[0226] Em uma modalidade preferida, a CoA-transferase empregada no método da presente invenção é uma CoA-transferase derivada de Megasphaera sp. (número de acesso Uniprot S7HFR5; SEQ ID NO:84).
[0227] Em uma modalidade preferida da presente invenção, a CoA-transferase é uma enzima que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 84 ou uma sequência que é pelo menos n % idêntica a SEQ ID NO: 84 com n como um número inteiro entre 10 e 100, preferencialmente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 e em que a enzima tem a atividade enzimática de converter 3-metilcrotonil-CoA em ácido 3-metilcrotônico. Em relação à determinação da identidade de sequência, as mesmas aplicações foram apresentadas acima.
A CONVERSÃO ENZIMÁTICA DE 3-METILCROTONIL-COA EM ÁCIDO 3-METILCROTÔNICO: UMA ROTA ALTERNATIVA À ETAPA VI DESCRITA ACIMA
[0228] Em outra modalidade preferida, a conversão de 3-metilcrotonil-CoA em ácido 3-metilcrotônico é alcançada por uma rota alternativa em que 3-metilcrotonil- CoA é primeiro convertido enzimaticamente em 3-metilbutiril-CoA que é, então, enzimaticamente convertido para ácido 3-metilbutírico que é, então, finalmente convertido para ácido 3-metilcrotônico. Essa conversão alternativa de 3-metilcrotonil- CoA em ácido 3-metilcrotônico por meio de 3-metilbutiril-CoA e ácido 3-metilbutírico é esquematicamente ilustrada na Figura 32.
[0229] Consequentemente, a presente invenção se refere a um método para produzir isobuteno a partir de 3-metilcrotonil-CoA no qual 3-metilcrotonil-CoA é primeiro enzimaticamente convertido em 3-metilbutiril-CoA que é, então, enzimaticamente convertido em ácido 3-metilbutírico que é, então, convertido em ácido 3-metilcrotônico que é, então, adicionalmente convertido em isobuteno conforme descrito acima no presente documento.
[0230] A primeira conversão enzimática, isto é, a conversão de 3-metilcrotonil- CoA em 3-metilbutiril-CoA, é uma reação de dessaturação, isto é, redução da ligação dupla C=C de 3-metilcrotonil-CoA em 3-metilbutiril-CoA. A conversão enzimática de 3-metilcrotonil-CoA em 3-metilbutiril-CoA, isto é, a redução da ligação dupla em 3- metilcrotonil-CoA pode, por exemplo, ser alcançada empregando-se uma enzima classificada como EC 1.3._._. As enzimas classificadas como EC 1.3._._ são oxidorredutases que atuam no grupo CH-CH de uma molécula doadora. Essa subclasse contém enzimas que catalisam de modo reversível a conversão de uma ligação simples carbono-carbono em uma ligação dupla carbono-carbono entre dois átomos de carbono. As subclasses de EC 1.3 são classificadas dependendo do aceitante. Em uma modalidade preferida, a enzima é uma enzima que é classificada como EC 1.3._._ e que usa NADH ou NADPH como cofator.
[0231] Em uma modalidade particularmente preferida, a enzima é uma enzima que usa NADPH como um cofator. Em uma modalidade preferida, a enzima é selecionada a partir do grupo que consiste em: - acil-CoA desidrogenase (NADP+) (EC 1.3.1.8); - enoil-[acil-carreador-proteína]redutase (NADPH, específica de Si) (EC 1.3.1.10) ; - cis-2-enoil-CoA redutase (NADPH) (EC 1.3.1.37); - trans-2-enoil-CoA redutase (NADPH) (EC 1.3.1.38); - enoil-[acil-carreador-proteína]redutase (NADPH, específica de Re) (EC 1.3.1.39); - crotonil-CoA redutase (EC 1.3.1.86).
[0232] Desse modo, em uma modalidade preferida, a conversão de 3-metilcrotonil- CoA em 3-metilbutiril-CoA é alcançada fazendo-se uso de uma acil-CoA desidrogenase (NADP+) (EC 1.3.1.8). Acil-CoA desidrogenases são enzimas que catalisam a reação a seguir:
[0233] Essa enzima ocorre em uma variedade de organismos, incluindo organismos eucarióticos e procarióticos, como plantas, animais, fungos e bactérias. A enzima foi, por exemplo, descrita em Bos, taurus, Rattus novegicus, Mus musculus, Columba sp., Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana, Allium ampeloprasum, Euglena gracilis, Candida albicans, Streptococcus collinus, Rhodobacter sphaeroides e Mycobacterium smegmatis.
[0234] Em uma modalidade preferida adicional, a conversão de 3-metilcrotonil- CoA em 3-metilbutiril-CoA é alcançada fazendo-se uso de uma enoil-[acil-carreador- proteína]redutase (NADPH, específica de Si) (EC 1.3.1.10). Enoil-[acil-carreador- proteína]redutases (NADPH, específica de Si) são enzimas que catalisam a reação a seguir:
[0235] Essa enzima ocorre em uma variedade de organismos, incluindo organismos eucarióticos e procarióticos, como plantas, fungos e bactérias. A enzima foi, por exemplo, descrita em Carthamus tinctorius, Candida tropicalis, Saccharomyces cerevisiae, Streptococcus collinus, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Porphyromonas gingivalis, Escherichia coli e Salmonella enterica.
[0236] Em uma modalidade preferida adicional, a conversão de 3-metilcrotonil- CoA em 3-metilbutiril-CoA é alcançada fazendo-se uso de uma cis-2-enoil-CoA redutase (NADPH) (EC 1.3.1.37). Cis-2-enoil-CoA redutases (NADPH) são enzimas que catalisam a reação a seguir:
[0237] Essa enzima foi descrita por ocorrer em Escherichia coli.
[0238] Em uma modalidade preferida adicional, a conversão de 3-metilcrotonil- CoA em 3-metilbutiril-CoA é alcançada fazendo-se uso de uma trans-2-enoil-CoA redutase (NADPH) (EC 1.3.1.38). Trans-2-enoil-CoA redutases (NADPH) são enzimas que catalisam a reação a seguir:
[0239] Essa enzima ocorre em uma variedade de organismos, incluindo organismos eucarióticos e procarióticos, como plantas, animais e bactérias. A enzima foi, por exemplo, descrita em Homo sapiens, Rattus norvegicus, Mus musculus, Cavia porcellus, Caenorhabditis elegans, Phalaenopsis amabilis, Gossypium hirsutum, Mycobacterium tuberculosis, Streptococcus collinu e Escherichia coli.
[0240] Em uma modalidade preferida adicional, a conversão de 3-metilcrotonil- CoA em 3-metilbutiril-CoA é alcançada fazendo-se uso de uma enoil-[acil-carreador- proteína]redutase (NADPH, específica de Re) (EC 1.3.1.39). Enoil-[acil-carreador- proteína]redutases (NADPH, específica de Re) são enzimas que catalisam a reação a seguir:
[0241] Essa enzima ocorre em uma variedade de organismos, incluindo organismos eucarióticos e procarióticos, como animais e bactérias. A enzima foi, por exemplo, descrita em Gallus gallus, Pombos, Rattus norvegicus, Cavia porcellus, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis e Porphyromonas gingivalis.
[0242] Em uma modalidade preferida adicional, a conversão de 3-metilcrotonil- CoA em 3-metilbutiril-CoA é alcançada fazendo-se uso de uma crotonil-CoA redutase (EC 1.3.1.86). Crotonil-CoA redutases são enzimas que catalisam a reação a seguir:
[0243] Essa enzima ocorre em uma variedade de organismos, incluindo organismos eucarióticos e procarióticos, como animais, fungos e bactérias. A enzima foi, por exemplo, descrita em Bos taurus, Salinospora tropica, Clostridium difficile, Streptomyces collinus, Streptomyces cinnamonensis e Streptomyces hygroscopicus.
[0244] A segunda conversão enzimática, isto é, a conversão de 3-metilbutiril-CoA em ácido 3-metilbutírico, pode ser alcançada por conversões enzimáticas diferentes. Uma possibilidade é a conversão direta por meio de uma reação de hidrólise. Outra possibilidade é a conversão direta por meio de uma reação catalisada por uma CoA- transferase e uma terceira possibilidade é uma conversão de duas etapas por meio de fosfato de 3-metilbutirila.
[0245] Desse modo, de acordo com a presente invenção, a conversão enzimática de 3-metilbutiril-CoA em ácido 3-metilbutírico é alcançada por (a) uma reação enzimática única na qual 3-metilbutiril-CoA é diretamente convertida em ácido 3-metilbutírico, preferencialmente fazendo-se uso de uma CoA transferase (EC 2.8.3.-), preferencialmente uma propionato:acetato-CoA transferase (EC 2.8.3.1), uma acetato CoA-transferase (EC 2.8.3.8) ou uma succinil-CoA:acetato CoA-transferase (EC 2.8.3.18); (b) uma reação enzimática única na qual 3-metilbutiril-CoA é diretamente convertida em ácido 3-metilbutírico, preferencialmente fazendo-se uso de uma tioéster hidrolase (EC 3.1.2.-), preferencialmente uma acetil-CoA hidrolase (EC 3.1.2.1), uma acil-CoA hidrolase de cadeia curta dependente de ADP (EC 3.1.2.18) ou uma acil-CoA hidrolase (EC 3.1.2.20); ou (c) duas etapas enzimáticas que compreendem (i) primeiro converter enzimaticamente 3-metilbutiril-CoA em fosfato de 3- metilbutirila; e (ii) então, converter enzimaticamente o fosfato de 3-metilbutirila obtido desse modo no dito ácido 3-metilbutírico.
[0246] Em relação às modalidades preferidas para a CoA transferase (EC 2.8.3.), a propionato:acetato-CoA transferase (EC 2.8.3.1), a acetato CoA-transferase (EC 2.8.3.8) ou uma succinil-CoA:acetato CoA-transferase (EC 2.8.3.18), a tioéster hidrolase (EC 3.1.2.-), a acetil-CoA hidrolase (EC 3.1.2.1), a acil-CoA hidrolase de cadeia curta dependente de ADP (EC 3.1.2.18), a acil-CoA hidrolase (EC 3.1.2.20), a enzima com capacidade para converter 3-metilbutiril-CoA em fosfato de 3-metilbutirila e a enzima com capacidade para converter fosfato de 3-metilbutirila no dito ácido 3- metilbutírico, o mesmo se aplica conforme estabelecido acima em conexão com a conversão enzimática da etapa VIa, etapa VIb e etapa VIc de acordo com a invenção.
[0247] A terceira conversão enzimática, isto é, a conversão de ácido 3- metilbutírico em ácido 3-metilcrotônico pode ser, por exemplo, alcançada por uma 2- enoato redutase (EC 1.3.1.31). 2-enoato redutases são enzimas que catalisam naturalmente a reação a seguir:
[0248] Essa enzima ocorre em uma variedade de organismos, incluindo organismos eucarióticos e procarióticos, como animais, fungos e bactérias. A enzima foi, por exemplo, descrita em Cichorium intybus, Marchantia polimorpha, Solanum lycopersicum, Absidia glauca, Kluyveromyces lactis, Penicillium citrinum; Rhodosporidium, Saccharomyces cerevisiae, Clostridium kluyveri, Clostridium bifermentans, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium ghonii, Clostridium mangenotii, Clostridium oceanicum, Clostridium sordellii, Clostridium sporogenes, Clostridium sticklandii, Clostridium tyrobutíricum, Achromobacter sp., Burkholderia sp., Gluconobacter oxydans, Lactobacillus casei, Pseudomonas putida, Shewanella sp., Yersinia bercovieri, Bacillus subtilis, Moorella thermoacetica e Peptostreptococcus anaerobius. A enoato redutase de Clostridiae foi descrita, por exemplo, em Tischler et al. (Eur. J. Bioche. 97 (1979), 103 a 112).
A CONVERSÃO ENZIMÁTICA DE 3-METILGLUTACONIL-COA EM 3- METILCROTONIL-COA: ETAPA VII CONFORME MOSTRADO NA FIGURA 1
[0249] A 3-metilcrotonil-CoA que é convertida de acordo com o método da presente invenção em ácido 3-metilcrotônico de acordo com qualquer um dos métodos descritos acima (e adicionalmente convertida de acordo com o método da presente invenção em isobuteno de acordo com qualquer um dos métodos descritos acima) pode ser fornecida em si por uma reação enzimática, a saber, a conversão enzimática de 3-metilglutaconil-CoA em 3-metilcrotonil-CoA. A conversão de 3- metilglutaconil-CoA em 3-metilcrotonil-CoA é esquematicamente ilustrada na Figura 12.
[0250] Consequentemente, a presente invenção se refere a um método para produzir isobuteno a partir de 3-metilglutaconil-CoA no qual 3-metilglutaconil-CoA é primeiro convertido em 3-metilcrotonil-CoA que é, então, adicionalmente convertido em ácido 3-metilcrotônico que é, então, adicionalmente convertido em isobuteno conforme descrito acima no presente documento.
[0251] A conversão de 3-metilglutaconil-CoA em 3-metilcrotonil-CoA pode ser catalisada por enzimas diferentes. De acordo com a presente invenção, a conversão de 3-metilglutaconil-CoA no dito 3-metilcrotonil-CoA faz uso preferencialmente de (i) uma metilcrotonil-CoA carboxilase (EC 6.4.1.4); ou (ii) uma geranoil-CoA carboxilase (EC 6.4.1.5) (conforme mostrado na etapa VII da Figura 1).
[0252] Metilcrotonil-CoA carboxilases (EC 6.4.1.4) e geranoil-CoA carboxilases (EC 6.4.1.5), assim como enzimas preferidas dessas classes de enzima já foram descritas acima. Consequentemente, em relação a essas enzimas, o mesmo se aplica à conversão de 3-metilglutaconil-CoA em 3-metilcrotonil-CoA conforme estabelecido acima.
[0253] Em outra modalidade preferida, a conversão de 3-metilglutaconil-CoA por meio de descarboxilação em 3-metilcrotonil-CoA é catalisada por uma 3- metilglutaconil-CoA decarboxilase, por exemplo, uma 3-metilglutaconil-CoA decarboxilase de Myxococcus xanthus codificada pelo gene liuB. Esse gene codifica uma enzima que tem as duas subunidades AibA e AibB (Li et al., Angew. Chem. Int. Ed. 52 (2013), 1.304 a 1.308).
[0254] Essa enzima já foi descrita acima como uma metilcrotonil-CoA carboxilase derivada de Myxcoxoccus xanthus no contexto de conversão de ácido 3-metilcrotônico em isobuteno.
[0255] A mesma enzima derivada de Myxococcus xanthus codificada pelo gene liuB que tem as duas subunidades AibA e AibB (Li et al., Angew. Chem. Int. Ed. 52 (2013), 1.304 a 1.308) foi descrita acima com referência a SEQ ID NOs: 100 e 101 e também pode ser usada para a conversão de 3-metilglutaconil-CoA por meio de descarboxilação em 3-metilcrotonil-CoA.
[0256] Em uma modalidade preferida da presente invenção, a 3-metilglutaconil- CoA decarboxilase é uma enzima que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 100 ou uma sequência que é pelo menos n % idêntica a SEQ ID NO: 100 com n como um número inteiro entre 10 e 100, preferencialmente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 e em que a enzima tem a atividade enzimática de converter 3-metilglutaconil-CoA em 3- metilcrotonil-CoA. Em relação à determinação da identidade de sequência, o mesmo se aplica conforme estabelecido acima. Em outra modalidade preferida da presente invenção, a 3-metilglutaconil-CoA decarboxilase é uma enzima que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 101 ou uma sequência que é pelo menos n % idêntica a SEQ ID NO: 101 com n como um número inteiro entre 10 e 100, preferencialmente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 e em que a enzima tem a atividade enzimática de converter 3-metilglutaconil-CoA em 3-metilcrotonil-CoA. Em relação à determinação da identidade de sequência, as mesmas aplicações foram apresentadas acima.
[0257] Em outra modalidade preferida da presente invenção, a 3-metilglutaconil- CoA decarboxilase é uma enzima heterodimérica que compreende uma combinação da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 100 e 101 ou uma sequência que é pelo menos n % idêntica a SEQ ID NO: 100 e 101 com n como um número inteiro entre 10 e 100, preferencialmente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 e em que a enzima tem a atividade enzimática de converter 3-metilglutaconil-CoA em 3-metilcrotonil-CoA. Em relação à determinação da identidade de sequência, as mesmas aplicações foram apresentadas acima.
A CONVERSÃO ENZIMÁTICA DE 3-HIDROXI-3-METILGLUTARIL-COA EM 3-METILGLUTACONIL-COA: ETAPA VIII CONFORME MOSTRADO NA FIGURA 1
[0258] A 3-metilglutaconil-CoA que é convertida em 3-metilcrotonil-CoA pode ser fornecida em si por uma reação enzimática, a saber, a conversão enzimática de 3- hidroxi-3-metilglutaril-CoA em 3-metilglutaconil-CoA; consultar Figura 13.
[0259] Consequentemente, a presente invenção também se refere a um método para produzir isobuteno a partir de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA em que 3-hidroxi-3- metilglutaril-CoA é primeiro convertido em 3-metilglutaconil-CoA que é, então, convertido em 3-metilcrotonil-CoA que é, então, adicionalmente convertida em ácido 3-metilcrotônico que é, então, adicionalmente convertido em isobuteno conforme descrito acima no presente documento.
[0260] De acordo com a presente invenção, a conversão enzimática de 3-hidroxi- 3-metilglutaril-CoA em 3-metilglutaconil-CoA é uma reação de desidratação enzimática que ocorre naturalmente, e que é catalisada, por exemplo, por enzimas classificadas como 3-metilglutaconil-coenzima A hidratase (EC 4.2.1.18). Consequentemente, a conversão enzimática de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA em 3- metilglutaconil-CoA faz uso preferencialmente de uma 3-metilglutaconil-coenzima A hidratase (EC 4.2.1.18) (conforme mostrado na etapa VIII da Figura 1).
[0261] 3-metilglutaconil-coenzima A hidratases são enzimas que catalisam a reação a seguir:
[0262] Essa enzima ocorre em uma variedade de organismos, incluindo organismos eucarióticos e procarióticos, como plantas, animais e bactérias. A enzima foi, por exemplo, descrita em Catharantus roseus, Homo sapiens, Bos taurus, Ovis aries, Acinetobacter sp., Myxococcus sp. e Pseudomonas putida. Em uma modalidade preferida, a 3-metilglutaconil-coenzima A hidratase é uma enzima de Myxococcus sp., e até mais preferencialmente uma enzima que tem uma sequência de aminoácidos conforme mostrado na SEQ ID NO: 35 ou mostra uma sequência de aminoácidos que é pelo menos x% homóloga à SEQ ID NO: 35 e tem a atividade de a 3-metilglutaconil- coenzima A hidratase com x como um número inteiro entre 30 e 100, preferencialmente 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 em que tal enzima tem capacidade para converter 3-hidroxi-3- metilglutaril-CoA em 3-metilglutaconil-CoA conforme estabelecido acima no presente documento. Em relação à determinação do grau de identidade, as mesmas aplicações foram apresentadas acima.
[0263] A conversão de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA em 3-metilglutaconil-CoA também pode ser alcançada fazendo-se uso de uma atividade de 3-hidroxi-3- metilglutaril-coenzima A desidratase que foi identificada, por exemplo, em Myxococcus xanthus e que é codificada pelo gene liuC (Li et al., Angew. Chem. Int. Ed. 52 (2013), 1.304 a 1.308). A 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A desidratase derivada de Myxococcus xanthus tem o número de acesso Uniprot Q1D5Y4.
[0264] Desse modo, em uma modalidade preferida, a 3-hidroxi-3-metilglutaril- coenzima A desidratase empregada no método da presente invenção é uma enzima derivada de Myxococcus xanthus (número de acesso Uniprot Q1D5Y4; SEQ ID NO:98).
[0265] Em uma modalidade preferida da presente invenção, a 3-hidroxi-3- metilglutaril-coenzima A desidratase é uma enzima que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:98 ou uma sequência que é pelo menos n % idêntica à SEQ ID NO:98 com n como um número inteiro entre 10 e 100, preferencialmente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 e em que a enzima tem a atividade enzimática de converter 3-hidroxi-3- metilglutaril-CoA em 3-metilglutaconil-CoA. Em relação à determinação da identidade de sequência, as mesmas aplicações foram apresentadas acima.
[0266] A conversão enzimática de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA em 3- metilglutaconil-CoA também pode ser alcançada fazendo-se uso de uma 3-hidroxiacil- CoA desidratase ou uma enoil-CoA hidratase. 3-hidroxiacil-CoA desidratases e enoil- CoA hidratases catalisam a mesma reação enquanto o nome de uma dessas enzimas denota uma direção da reação correspondente enquanto o outro nome denota a reação reversa. Visto que a reação é reversível, ambos os nomes de enzima podem ser usados.
[0267] 3-hidroxiacil-CoA desidratases e enoil-CoA hidratases pertencem a enzimas classificadas como EC 4.2.1.-.
[0268] 3-hidroxiacil-CoA desidratases e enoil-CoA hidratases foram, por exemplo, identificadas em Pseudomonas sp., Acinetobacter baumanii (número de acesso Uniprot A0A0D5YDD4), Pseudomonas aeruginosa (número de acesso Uniprot Q9HZV7), Marinobacter santoriniensis (número de acesso Uniprot M7CV63), Pseudomonas knackmussii, Pseudomonas pseudoalcaligenes (número de acesso Uniprot L8MQT6), Pseudomonas flexibilis e Alcanivorax dieselolei, assim como em Ustilago maydis (número de acesso Uniprot Q4PEN0), Bacillus sp. GeD10 (número de acesso Uniprot N1LWG2) e em Labilithrix luteola (número de acesso Uniprot A0A0K1PN19).
[0269] Em uma modalidade preferida, a 3-hidroxiacil-CoA desidratase/enoil-CoA hidratase empregada no método da presente invenção para a conversão de 3-hidroxi- 3-metilglutaril-CoA em 3-metilglutaconil-CoA é uma enzima derivada de Pseudomonas sp. (SEQ ID NO:85), Acinetobacter baumanii (número de acesso Uniprot A0A0D5YDD4; SEQ ID NO:86), Pseudomonas aeruginosa (número de acesso Uniprot Q9HZV7; SEQ ID NO:87), Marinobacter santoriniensis (número de acesso Uniprot Q9HZV7; SEQ ID NO:88), Pseudomonas knackmussii (SEQ ID NO:89), Pseudomonas pseudoalcaligenes (número de acesso Uniprot L8MQT6; SEQ ID NO:90), Pseudomonas flexibilis (SEQ ID NO:91), Alcanivorax dieselolei (SEQ ID NO:92), Ustilago maydis (número de acesso Uniprot Q4PEN0; SEQ ID NO:95), Bacillus sp. GeD10 (número de acesso Uniprot N1LWG2; SEQ ID NO:96) ou Labilithrix luteola (número de acesso Uniprot A0A0K1PN19; SEQ ID NO:97).
[0270] Em uma modalidade preferida da presente invenção, a 3-hidroxiacil-CoA desidratase/enoil-CoA hidratase é uma enzima que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 85 a 92 e SEQ ID NOs: 95 a 97 ou uma sequência que é pelo menos n % idêntica a qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 85 a 92 e SEQ ID NOs: 95 a 97 com n como um número inteiro entre 10 e 100, preferencialmente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 e em que a enzima tem a atividade enzimática de converter 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA em 3-metilglutaconil- CoA. Em relação à determinação da identidade de sequência, as mesmas aplicações foram apresentadas acima.
A CONVERSÃO ENZIMÁTICA DE ACETOACETIL-COA EM 3-HIDROXI- 3-METILGLUTARIL-COA: ETAPA IX CONFORME MOSTRADO NA FIGURA 1
[0271] A 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA que é convertida em 3-metilglutaconil-CoA pode ser fornecida em si por uma reação enzimática, a saber, a condensação enzimática de acetoacetil-CoA e acetil-CoA em 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA; consultar Figura 14.
[0272] Consequentemente, a presente invenção também se refere a um método para produzir isobuteno a partir de acetoacetil-CoA e acetil-CoA em que acetoacetil- CoA e acetil-CoA são primeiro condensados em 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA que é, então, convertido em 3-metilglutaconil-CoA que é, então, convertido em 3- metilcrotonil-CoA que é, então, adicionalmente convertido em ácido 3-metilcrotônico que é, então, adicionalmente convertido em isobuteno conforme descrito acima no presente documento.
[0273] De acordo com a presente invenção, a condensação enzimática de acetoacetil-CoA e acetil-CoA em 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA faz uso preferencialmente de uma 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA sintase (consultar etapa IX da Figura 1).
[0274] A condensação de acetil-CoA e acetoacetil-CoA é uma reação que é naturalmente catalisada pela enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA sintase (também denominada HMG-CoA sintase). Desse modo, preferencialmente, a condensação de acetil-CoA e acetoacetil-CoA em 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA faz uso de uma 3- hidroxi-3-metilglutaril-CoA sintase (também denominada HMG-CoA sintase). HMG- CoA sintases são classificadas em EC 2.3.3.10 (anteriormente, HMG-CoA sintase foi classificada como EC 4.1.3.5, mas foi transferida para EC 2.3.3.10). O termo “HMG- CoA sintase” se refere a qualquer enzima que pode catalisar a reação, em que acetil- CoA condensa com acetoacetil-CoA para formar 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (HMG- CoA) (consultar Figura 14). HMG-CoA sintase é parte da via de mevalonato. Duas vias foram identificadas para a síntese de pirofosfato de isopentenila (IPP), isto é, a via de mevalonato e a via de gliceraldeído 3-fosfato-piruvato. HMG-CoA sintase catalisa a condensação biológica de Claisen de acetil-CoA com acetoacetil-CoA e é um membro de uma superfamília de enzimas de condensação de acila que incluem beta-cetotiolases, ácido graxo sintases (proteína carreadora beta-cetoacil sintase) e policétido sintases.
[0275] HMG-CoA sintase foi descrita para vários organismos. Adicionalmente, as sequências de aminoácidos e ácido nucleico que codificam HMG-CoA sintases a partir de várias fontes estão disponíveis. Geralmente, as sequências compartilham apenas um grau baixo de identidade de sequência geral. Por exemplo, as enzimas de Staphylococcus ou Streptococcus mostram apenas cerca de 20% de identidade com aquelas de HMG-CoA sintase humana e aviária. Em algumas fontes, é relatado que as HMG-CoA sintases bacterianas e suas contrapartes animais exibem apenas cerca de 10% de identidade de sequência geral (Sutherlin et al., J. Bacteriol. 184 (2002), 4.065 a 4.070). Entretanto, os resíduos de aminoácido envolvidos na acetilação e reações de condensação são conservados dentre HMG-CoA sintases bacterianas e eucarióticas (Campobasso et al., J. Biol. Chem. 279 (2004), 44.883 a 44.888). A estrutura tridimensional de três enzimas de HMG-CoA sintase foi determinada e os aminoácidos cruciais para a reação enzimática são, em princípio, bem caracterizadas (Campobasso et al., loc. cit.; Chun et al., J. Biol.Chem. 275 (2000), 17.946 a 17.953; Nagegowda et al., Biochem. J. 383 (2004), 517 a 527; Hegardt, Biochem. J. 338 (1999), 569 a 582). Em eucariotas, há duas formas da HMG-CoA sintase, isto é, uma forma citosólica e uma forma mitocondrial. A forma citosólica tem um papel chave na produção de colesterol e outros isoprenoides e a forma mitocondrial é envolvida na produção de corpos de cetona.
[0276] Em princípio, qualquer enzima de HMG-CoA sintase pode ser usada no contexto da presente invenção, em particular, de organismos procarióticos ou eucarióticos.
[0277] As HMG-CoA sintases procarióticas são descritas, por exemplo, a partir de Staphylococcus aureus (Campobasso et al., loc. cit.; número de acesso Uniprot Q9FD87), Staphylococcus epidermidis (número de acesso Uniprot Q9FD76), Staphylococcus haemolyticus (número de acesso Uniprot Q9FD82), Enterococcus faecalis (Sutherlin et al., loc. cit.; número de acesso Uniprot Q9FD71; SEQ ID NO:99), Enterococcus faecium (número de acesso Uniprot Q9FD66), Streptococcus pneumonia (número de acesso Uniprot Q9FD56), Streptococcus pyogenes (número de acesso Uniprot Q9FD61) e Methanobacterium thermoautotrophicum (número de acesso AE000857), Borrelia burgdorferi (número de acesso NCBI BB0683). As HMG- CoA sintases adicionais são, por exemplo, descritas no documento no WO 2011/032934. Uma HMG-CoA sintase preferida é a enzima de Schizosaccharomyces pombe (Uniprot P54874). Em uma modalidade particularmente preferida, a HMG-CoA sintase empregada no método da invenção tem uma sequência de aminoácidos conforme mostrado na SEQ ID NO: 36 ou SEQ ID NO:99 ou mostra uma sequência de aminoácidos que é pelo menos x% homóloga à SEQ ID NO: 36 ou SEQ ID NO:99 e tem a atividade de uma HMG-CoA sintase com x como um número inteiro entre 30 e 100, preferencialmente 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 em que tal enzima tem capacidade para catalisar a condensação de acetil-CoA e acetoacetil-CoA em 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA. Em relação à determinação do grau de identidade, as mesmas aplicações foram apresentadas acima.
A CONVERSÃO ENZIMÁTICA DE ACETIL-COA EM ACETOACETIL- COA: ETAPAS XIII, XIV E XV CONFORME MOSTRADO NA FIGURA 1
[0278] A acetoacetil-CoA que é convertida em 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA ou que é convertida em acetoacetato pode ser fornecida em si por uma reação enzimática, a saber, a conversão enzimática de acetil-CoA em acetoacetil-CoA.
[0279] De acordo com a presente invenção, a conversão de acetil-CoA no dito acetoacetil-CoA pode ser alcançada por rotas diferentes. Uma possibilidade é converter primeiro acetil-CoA em malonil-CoA (etapa XIV conforme mostrado na Figura 1) e, então, condensar adicionalmente a dita malonil-CoA e acetil-CoA em acetoacetil-CoA (etapa XV conforme mostrado na Figura 1). Outra possibilidade é condensar diretamente em uma reação enzimática única duas moléculas de acetil- CoA em acetoacetil-CoA (etapa XIII conforme mostrado na Figura 1). Essas reações são esquematicamente mostradas na Figura 15 (etapa XIII), Figura 16 (etapa XIV) e Figura 17 (etapa XV), respectivamente.
[0280] Desse modo, a presente invenção também se refere a um método para produzir isobuteno a partir de acetil-CoA no qual acetil-CoA é primeiro convertido em acetoacetil-CoA por qualquer uma das rotas mencionadas acima que é, então, condensado com acetil-CoA em 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA que é, então, convertido em 3-metilglutaconil-CoA que é, então, convertido em 3-metilcrotonil-CoA que é, então, adicionalmente convertido em ácido 3-metilcrotônico que é, então, adicionalmente convertido em isobuteno conforme descrito acima no presente documento.
[0281] Além disso, a presente invenção também se refere a um método para produzir isobuteno a partir de acetil-CoA em que acetil-CoA é primeiro convertido em acetoacetil-CoA por qualquer uma das rotas mencionadas acima que é, então, convertido em acetoacetato que é, então, convertido em acetona que é, então, condensada com acetil-CoA em 3-hidroxiisovalerato (HIV) que é, então, convertida em ácido 3-metilcrotônico, conforme descrito acima no presente documento. Adicionalmente, o dito ácido 3-metilcrotônico é, então, adicionalmente convertido em isobuteno, conforme descrito acima no presente documento.
[0282] De acordo com a presente invenção, a conversão enzimática de acetil-CoA em malonil-CoA faz preferencialmente o uso de uma acetil-CoA carboxilase (EC 6.4.1.2) (etapa XIV conforme mostrado na Figura 1). Essa reação de ocorrência natural fixa CO2 em acetil-CoA que utiliza ATP que resulta em malonil-CoA. As enzimas classificadas como acetil-CoA carboxilases (EC 6.4.1.2) catalisam a reação a seguir:
[0283] Além disso, de acordo com a presente invenção, a condensação enzimática de malonil-CoA e acetil-CoA no dito acetoacetil-CoA faz preferencialmente o uso de uma acetoacetil-CoA sintase (EC 2.3.1.194) (etapa XV conforme mostrado na Figura 1). Isso é uma reação de ocorrência natural e condensa malonil-CoA e acetil-CoA em uma reação de descarboxilação. Enzimas classificadas como acetoacetil-CoA sintases (EC 2.3.1.194) catalisam a conversão enzimática de acetil-CoA e malonil- CoA em acetoacetil-CoA de acordo com a reação a seguir. acetil-CoA + malonil-CoA → acetoacetil-CoA + CoA +CO2
[0284] Essa reação é catalisada por uma enzima chamada acetoacetil-CoA sintase (EC 2.3.1.194). O gene que codifica essa enzima foi identificado no agrupamento de gene de via de mevalonato para produção de terpenoide em uma Cepa CL190 de Streptomyces sp. Gram positiva isolada do solo (Okamura et al., PNAS USA 107 (2010), 11.265 a 11.270, 2010). Além disso, uma via biossintética com o uso dessa enzima para produção de acetoacetil-CoA foi recentemente desenvolvida em E. coli (Matsumoto K et al., Biosci. Biotechnol. Biochem, 75 (2011), 364 a 366).
[0285] Alternativamente, a conversão enzimática de acetil-CoA no dito acetoacetil- CoA consiste em uma reação enzimática única na qual acetil-CoA é diretamente convertida em acetoacetil-CoA pela condensação enzimática de duas moléculas de acetil-CoA em acetoacetil-CoA. Preferencialmente, a conversão enzimática de acetil- CoA em acetoacetil-CoA é alcançada fazendo-se uso de uma acetil-CoA acetiltransferase (EC 2.3.1.9).
[0286] Desse modo, acetoacetil-CoA pode ser produzida a partir de acetil-CoA, por exemplo, conforme descrito no documento no WO 2013/057194. Portanto, de acordo com a presente invenção, acetil-CoA pode ser, por exemplo, convertida em acetoacetil-CoA pela reação a seguir:
[0287] Essa reação é uma reação de ocorrência natural e é catalisada por enzimas chamadas acetil-CoA C-acetiltransferases que são classificadas como EC 2.3.1.9. As enzimas que pertencem a essa classe e catalisam a conversão mostrada acima de duas moléculas de acetil-CoA em acetoacetil-CoA e CoA ocorrem em organismos de todos os reinos, isto é, plantas, animais, fungos, bactérias etc. e foram extensivamente descritos na literatura. As sequências de nucleotídeo e/ou aminoácidos para tais enzimas foram determinadas para uma variedade de organismos, como Homo sapiens, Arabidopsis thaliana, E. coli, Bacillus subtilis, Clostridium acetobutylicum e Candida, entre outros. Em princípio, qualquer acetil-CoA C-acetiltransferase (EC 2.3.1.9) pode ser usada no contexto da presente invenção. Em uma modalidade preferida, a enzima é uma acetil-CoA acetiltransferase de Clostridium acetobutylicum (Uniprot P45359). Em uma modalidade particularmente preferida, a acetil-CoA acetiltransferase empregada no método da invenção tem uma sequência de aminoácidos conforme mostrado na SEQ ID NO: 37 ou mostra uma sequência de aminoácidos que é pelo menos x% homóloga á SEQ ID NO: 37 e tem a atividade de uma acetil-CoA acetiltransferase com x como um número inteiro entre 30 e 100, preferencialmente 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 em que tal enzima tem capacidade para converter acetil-CoA em acetoacetil-CoA conforme estabelecido acima no presente documento.
[0288] Em relação à determinação do grau de identidade, as mesmas aplicações foram apresentadas acima.
A RECICLAGEM ENZIMÁTICA DE METABÓLITOS QUE OCORRE NA VIA DA PRESENTE INVENÇÃO: ETAPAS XA, XB, XI E XII CONFORME MOSTRADO NA FIGURA 1
[0289] O método descrito acima da presente invenção para produzir isobuteno a partir de acetil-CoA pode ser abastecido por uma ou mais dentre as reações a seguir, conforme mostrado na etapa Xa, etapa Xb, etapa XI e etapa XII da Figura 18.
[0290] Essas etapas se referem a bioconversões que podem ocorrer concomitantemente a qualquer um dos métodos descritos acima para produzir isobuteno.
[0291] Desse modo, a presente invenção se refere a qualquer um dos métodos descritos acima para produzir isobuteno a partir de ácido 3-metilcrotônico (ou a partir de qualquer um dentre os intermediários descritos acima nas vias descritas a partir de acetil-CoA em isobuteno) em que adicionalmente a) 3-hidroxiisovalerato (HIV) é enzimaticamente convertido em ácido 3- metilcrotônico com uma transferência concomitante de CoA a parir de 3-metilcrotonil- CoA em 3-hidroxiisovalerato (HIV) para resultar em 3-hidroxiisovaleril-CoA (etapa Xa, conforme esquematicamente mostrado na Figura 19); e/ou b) 3-hidroxiisovalerato (HIV) é enzimaticamente convertido em 3- hidroxiisovaleril-CoA (etapa Xb, conforme esquematicamente mostrado na Figura 20); e/ou c) 3-hidroxiisovaleril-CoA é enzimaticamente convertido em 3-metilcrotonil- CoA (etapa XI, conforme esquematicamente mostrado na Figura 21); e/ou d) 3-hidroxiisovalerato (HIV) é enzimaticamente convertido em 3- hidroxiisovaleril-CoA (etapa XII conforme esquematicamente mostrado na Figura 22).
[0292] Essas reações que serão descritas em mais detalhes a seguir, podem ocorrer concomitantemente a qualquer um dos métodos descritos acima para produzir isobuteno são benéficas por diversas razões. Primeiro, sabe-se que a hidratação de uma enoil-CoA (como, por exemplo, 3-metilcrotonil-CoA) é uma reação favorecida in vivo em um meio aquoso. Consequentemente, as reações acima representam possibilidades que permitem direcionar o fluxo metabólico para o precursor de isobuteno, isto é, ácido 3-metilcrotônico, até mesmo no caso de a via “vazar” para a direção de 3-hidroxiisovalerato (HIV) e/ou 3-hidroxiisvaleril-CoA. Segundo, as conversões acima envolvem beneficamente a conservação de energia em uma ligação de tioéster CoA por meio de uma transferência de um grupo tioéster.
A CONVERSÃO ENZIMÁTICA DE 3-HIDROXIISOVALERATO (HIV) EM ÁCIDO 3-METILCROTÔNICO COM UMA TRANSFERÊNCIA CONCOMITANTE DE COA DE 3-METILCROTONIL-COA EM 3-HIDROXIISOVALERATO (HIV) PARA RESULTAR EM 3-HIDROXIISOVALERIL-COA CONFORME MOSTRADO NA ETAPA XA DA FIGURA 18
[0293] Desse modo, em um primeiro aspecto, o ácido 3-metilcrotônico que é convertido em isobuteno pode ser fornecido por uma reação enzimática em que 3- hidroxiisovalerato (HIV) é enzimaticamente convertido em ácido 3-metilcrotônico com uma transferência concomitante de CoA de 3-metilcrotonil-CoA para 3- hidroxiisovalerato (HIV) para resultar em 3-hidroxiisovaleril-CoA (etapa Xa conforme mostrado na Figura 18). Essa reação é esquematicamente ilustrada na Figura 19.
[0294] Desse modo, a presente invenção também se refere a um método para produzir isobuteno a partir de 3-hidroxiisovalerato (HIV) em que 3-hidroxiisovalerato (HIV) é enzimaticamente convertido em ácido 3-metilcrotônico com uma transferência concomitante de CoA de 3-metilcrotonil-CoA em 3-hidroxiisovalerato (HIV) para resultar em 3-hidroxiisovaleril-CoA. Adicionalmente, o ácido 3-metilcrotônico produzido desse modo é, então, enzimaticamente convertido em isobuteno, conforme descrito acima no presente documento.
[0295] Além disso, a presente invenção também se refere a um método para produzir ácido 3-metilcrotônico e 3-hidroxiisovaleril-CoA de 3-hidroxiisovalerato (HIV) e de 3-metilcrotonil-CoA em que 3-hidroxiisovalerato (HIV) é enzimaticamente convertido em ácido 3-metilcrotônico com uma transferência concomitante de CoA de 3-metilcrotonil-CoA em 3-hidroxiisovalerato (HIV) para resultar em 3-hidroxiisovaleril- CoA.
[0296] De acordo com a presente invenção, a conversão de 3-hidroxiisovalerato (HIV) e 3-metilcrotonil-CoA em ácido 3-metilcrotônico e 3-hidroxiisovaleril-CoA em que 3-hidroxiisovalerato (HIV) é enzimaticamente convertido em ácido 3-metilcrotônico com uma transferência concomitante de CoA de 3-metilcrotonil-CoA em 3- hidroxiisovalerato (HIV) para resultar em 3-hidroxiisovaleril-CoA faz preferencialmente o uso de uma enzima que é classificada como uma CoA-transferase (EC 2.8.3.-) com capacidade para transferir o grupo CoA de 3-metilcrotonil-CoA para um ácido carboxílico, isto é, 3-hidroxiisovalerato (HIV).
[0297] CoA-transferases (EC 2.8.3.-), assim como enzimas preferidas dessa classe de enzima já foram descritas acima. Consequentemente, em relação a essas enzimas, o mesmo se aplica à conversão de 3-hidroxiisovalerato (HIV) e 3- metilcrotonil-CoA em ácido 3-metilcrotônico e 3-hidroxiisovaleril-CoA conforme estabelecido acima.
[0298] Preferencialmente, a CoA-transferase empregada em um método de acordo com a presente invenção na conversão enzimática de 3-hidroxiisovalerato (HIV) em ácido 3-metilcrotônico com a transferência concomitante de CoA de 3- metilcrotonil-CoA em 3-hidroxiisovalerato (HIV) para resultar em 3-hidroxiisovaleril- CoA é uma CoA-transferase selecionada a partir do grupo que consiste em: - propionato:acetato-CoA transferase (EC 2.8.3.1); - acetato CoA-transferase (EC 2.8.3.8); e - butirato-acetoacetato CoA-transferase (EC 2.8.3.9).
[0299] Propionato:acetato-CoA transferases (EC 2.8.3.1), acetato CoA- transferases (EC 2.8.3.8) e butirato-acetoacetato CoA-transferases (EC 2.8.3.9), assim como enzimas preferidas dessas classes de enzima já foram descritas acima. Consequentemente, em relação a essas enzimas, o mesmo se aplica à conversão de 3-hidroxiisovalerato (HIV) e 3-metilcrotonil-CoA em ácido 3-metilcrotônico e 3- hidroxiisovaleril-CoA ]conforme estabelecido acima.
A CONVERSÃO ENZIMÁTICA DE 3-HIDROXIISOVALERATO (HIV) EM 3-HIDROXIISOVALERIL-COA CONFORME MOSTRADO NA ETAPA XB DA FIGURA 18
[0300] Além de ou em alternativa aos métodos descritos acima (etapa Xa), o 3- hidroxiisovaleril-CoA também pode ser fornecido por uma conversão enzimática de 3- hidroxiisovalerato no dito 3-hidroxiisovaleril-CoA (etapa Xb conforme mostrado na Figura 18). Nessa reação, 3-hidroxiisovalerato reage com uma acil-CoA para resultar em 3-hidroxiisovaleril-CoA e um ácido. Essa reação é esquematicamente ilustrada na Figura 19.
[0301] Preferencialmente, a dita acil-CoA é acetil-CoA.
[0302] Desse modo, a presente invenção também se refere a um método para produzir 3-hidroxiisovaleril-CoA a partir de 3-hidroxiisovalerato (HIV), em que 3- hidroxiisovalerato reage com um acil-CoA, preferencialmente com acetil-CoA, para resultar em 3-hidroxiisovaleril-CoA e um respectivo ácido.
[0303] Preferencialmente, essa conversão é alcançada fazendo-se uso de uma enzima que é classificada como uma CoA-transferase (EC 2.8.3.-). Em relação às modalidades preferidas da dita CoA-transferase (EC 2.8.3.-) no contexto da etapa Xb, o mesmo se aplica, mutatis mutandis, conforme estabelecido acima em relação às CoA-transferases (EC 2.8.3.-) na conversão enzimática de 3-hidroxiisovalerato (HIV) em ácido 3-metilcrotônico com uma transferência concomitante de CoA de 3- metilcrotonil-CoA em 3-hidroxiisovalerato (HIV) para resultar em 3-hidroxiisovaleril- CoA (etapa Xa conforme mostrado na Figura 18).
A CONVERSÃO ENZIMÁTICA DE 3-HIDROXIISOVALERIL-COA EM 3- METILCROTONIL-COA CONFORME MOSTRADO NA ETAPA XI DA FIGURA 18
[0304] Além de ou em alternativa aos métodos descritos acima (etapa VII), o 3- metilcrotonil-CoA pode ser fornecido por uma reação enzimática, em que 3- hidroxiisovaleril-CoA é enzimaticamente convertido em 3-metilcrotonil-CoA (etapa XI conforme mostrado na Figura 18). Essa reação reversível é uma reação de desidratação, em que 3-hidroxiisovaleril-CoA é desidratada em 3-metilcrotonil-CoA e é esquematicamente ilustrada na Figura 21.
[0305] Desse modo, a presente invenção também se refere a um método para produzir isobuteno a partir de 3-hidroxiisovaleril-CoA em que 3-hidroxiisovaleril-CoA é primeiro enzimaticamente convertido em 3-metilcrotonil-CoA em que 3-metilcrotonil- CoA é convertido de modo enzimaticamente adicional em ácido 3-metilcrotônico de acordo com qualquer um dentre os métodos descritos acima. Adicionalmente, o ácido 3-metilcrotônico produzido desse modo é, então, enzimaticamente convertido em isobuteno, conforme descrito acima no presente documento.
[0306] De acordo com a presente invenção, a conversão enzimática de 3- hidroxiisovaleril-CoA em 3-metilcrotonil-CoA faz preferencialmente o uso de (i) uma enoil-CoA hidratase (EC 4.2.1.17); (ii) uma enoil-CoA hidratase de cadeia longa (EC 4.2.1.74); (iii) uma 3-hidroxipropionil-CoA desidratase (EC 4.2.1.116); (iv) uma 3-hidroxibutiril-CoA desidratase (EC 4.2.1.55); (v) uma 3-hidroxioctanoil-[acil-proteína carreadora-] desidratase (EC 4.2.1.59); (vi) uma crotonil-[acil-proteína carreadora-] hidratase (EC 4.2.1.58); (vii) uma 3-hidroxidecanoil-[acil-proteína carreadora-] desidratase (EC 4.2.1.60); (viii) uma 3-hidroxidecanoil-[acil-proteína carreadora-] desidratase (EC 4.2.1.61); ou (ix) uma 3-metilglutaconil-CoA hidratase (EC 4.2.1.18).
[0307] Em uma modalidade preferida do método de acordo com a invenção, a conversão de 3-hidroxiisovaleril-CoA em 3-metilcrotonil-CoA é alcançada pelo uso de uma enoil-CoA hidratase (EC 4.2.1.17). Enoil-CoA hidratases (EC 4.2.1.17), assim como enzimas preferidas dessa classe de enzima, já foram descritas acima. Consequentemente, em relação a essas enzimas, o mesmo se aplica à conversão de 3-hidroxiisovaleril-CoA em 3-metilcrotonil-CoA, conforme estabelecido acima.
[0308] Em outra modalidade preferida do método de acordo com a invenção, a conversão de 3-hidroxiisovaleril-CoA em 3-metilcrotonil-CoA é alcançada pelo uso de uma enoil-CoA hidratase de cadeia longa (EC 4.2.1.74). Enoil-CoA hidratases de cadeia longa (EC 4.2.1.74) catalisam a reação a seguir:
[0309] Essa enzima pertence à família de liases, especificamente as hidro-liases, que clivam as ligações de carbono-oxigênio. O nome sistemático dessa classe de enzima é (3S)-3-hidroxiacil-CoA hidro-liase. Essa enzima também é chamada enoil coenzima A hidratase de cadeia longa e participa no alongamento de ácido graxo em mitocôndrias e metabolismo de ácido graxo. Essa enzima ocorre em vários organismos, por exemplo, em Rattus norvegicus (Wu et al., Org. Lett. 10 (2008), 2.235 a 2.238), Sus scrofa e Cavia porcellus (Fong e Schulz, J. Biol. Chem. 252 (1977), 542 a 547; Schulz, Biol. Chem. 249 (1974), 2.704 a 2.709) e em princípio qualquer enoil- CoA hidratase de cadeia longa que pode catalisar a conversão de 3-hidroxiisovaleril- CoA em 3-metilcrotonil-CoA pode ser empregado no método da invenção.
A CONVERSÃO ENZIMÁTICA DE 3-HIDROXIISOVALERATO (HIV) EM 3-HIDROXIISOVALERIL-COA CONFORME MOSTRADO NA ETAPA XII DA FIGURA 18
[0310] Além de ou em alternativa aos métodos descritos acima (etapa Xa ou etapa Xb), o 3-hidroxiisovaleril-CoA também pode ser fornecido por uma conversão enzimática de 3-hidroxiisovalerato (HIV) no dito 3-hidroxiisovaleril-CoA (etapa XII conforme mostrado na Figura 18). Essa reação geral em que a coenzima A (CoASH) é fixada é esquematicamente ilustrada na Figura 22.
[0311] Desse modo, a presente invenção também se refere a um método para produzir isobuteno a partir de 3-hidroxiisovalerato (HIV) em que 3-hidroxiisovalerato (HIV) é primeiro convertido em 3-hidroxiisovaleril-CoA em que 3-hidroxiisovaleril-CoA é, então, enzimaticamente convertido em 3-metilcrotonil-CoA em que 3-metilcrotonil- CoA é convertido de modo enzimaticamente adicional em ácido 3-metilcrotônico de acordo com qualquer um dentre os métodos descritos acima. Adicionalmente, o ácido 3-metilcrotônico produzido desse modo é, então, enzimaticamente convertido em isobuteno, conforme descrito acima no presente documento.
[0312] Além disso, a presente invenção também se refere a um método para produzir 3-hidroxiisovaleril-CoA a partir de 3-hidroxiisovalerato (HIV).
[0313] De acordo com a presente invenção, a conversão enzimática de 3- hidroxiisovalerato (HIV) em 3-hidroxiisovaleril-CoA faz preferencialmente o uso de uma enzima que pertence à família de ligases que formam uma ligação de carbono- enxofre (EC 6.2.1.-). A reação geral da conversão enzimática de 3-hidroxiisovalerato (HIV) em 3-hidroxiisovaleril-CoA em que a coenzima A (CoASH) é fixada pode ser catalisada por uma enzima que pertence à família de ligases que forma uma ligação de carbono-enxofre (EC 6.2.1.-) por meio de dois mecanismos alternativos. Em uma primeira reação alternativa, uma acil-AMP é gerada como um intermediário antes de a coenzima A ser fixada conforme esquematicamente ilustrado na Figura 23.
[0314] Em uma segunda reação alternativa, uma acil-fosfato é gerada como um intermediário antes de a coenzima A ser fixada conforme esquematicamente ilustrado na Figura 24.
[0315] As enzimas que pertencem à família de ligases que formam uma ligação de carbono-enxofre (EC 6.2.1.-) que têm capacidade para converter enzimaticamente 3-hidroxiisovalerato (HIV) em 3-hidroxiisovaleril-CoA, em que um intermediário de acil- AMP (isto é, o intermediário de adenilato de acila, monofosfato de 3-hidroxiisovaleril- adenosina) é gerado antes da coenzima A ser coenzima A fixada (CoASH), compartilham motivos estruturais comuns que são referenciados no InterPro (InterPro44.0; Versão de 25 de setembro de 2013) como InterPro IPR020845, ligação de AMP, sítio conservado (http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/IPR020845) e IPR000873 (http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/IPR000873). O número de acesso para essas enzimas no banco de dados Pfam é PF00501.
[0316] Em relação à primeira reação alternativa (em que uma acil-AMP é gerada como um intermediário antes da coenzima A ser fixada conforme esquematicamente ilustrado na Figura 23), os exemplos que pertencem à família acima de ligases que forma uma ligação de carbono-enxofre (EC 6.2.1.-) que têm capacidade para converter enzimaticamente 3-hidroxiisovalerato (HIV) em 3-hidroxiisovaleril-CoA em que um intermediário de acil-AMP (isto é, o intermediário de adenilato de acila, monofosfato de 3-hidroxiisovaleril-adenosina) é gerado antes da coenzima A ser coenzima A fixada (CoASH) e que pode ser usada no método para produzir 3- hidroxiisovaleril-CoA a partir de 3-hidroxiisovalerato (HIV) são resumidos na Tabela A a seguir: TABELA A: COA LIGASES (EC 6.2.1.-) COM CAPACIDADE PARA CONVERTER ENZIMATICAMENTE 3-HIDROXIISOVALERATO (HIV) EM 3- HIDROXIISOVALERIL-COA QUE ENVOLVE UM ADENILATO DE ACILA COMO UM INTERMEDIÁRIO
[0317] Em uma modalidade preferida, a conversão enzimática de 3- hidroxiisovalerato (HIV) em 3-hidroxiisovaleril-CoA por meio de um intermediário de adenilato de acila pode ser, por exemplo, alcançada pelo uso de uma butanoato:CoA ligase (formação de AMP) (EC 6.2.1.2). Butanoato:CoA ligases são enzimas que catalisam a reação a seguir: ATP + um carboxilato + CoA → AMP + difosfato + um acil-CoA
[0318] Essas enzimas participam no metabolismo de butanoato. A ocorrência dessas enzimas foi descrita para vários organismos, incluindo procariotas e eucariotas, em particular, bactérias, algas, fungos, plantas e animais, por exemplo for Methanobacterium formicum, Streptomyces coelicolor, Mycobacterium avium, Penicillium chrysogenum, Paecilomyces variotii, Pseudomonas aeruginosa, Dictyostelium discoideum, Cavia porcellus, Ovis aries, Sus scrofa, Bos taurus, Mus musculus, Rattus norvegicus, e Homo sapiens.
[0319] Em uma modalidade preferida, a conversão enzimática de 3- hidroxiisovalerato (HIV) em 3-hidroxiisovaleril-CoA por meio de um intermediário de adenilato de acila é alcançada fazendo-se uso de uma butanoato:CoA ligase (formação de AMP) (EC 6.2.1.2) derivada de Methanobacterium formicum. A sequência de aminoácidos da dita proteína é mostrada em SEQ ID NO: 77.
[0320] Em uma modalidade preferida da presente invenção, a butanoato:CoA ligase (formação de AMP) é uma enzima que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 77 ou uma sequência que é pelo menos n % idêntica a SEQ ID NO: 77 com n como um número inteiro entre 10 e 100, preferencialmente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 e em que a enzima tem a atividade enzimática de converter 3- hidroxiisovalerato (HIV) em 3-hidroxiisovaleril-CoA. Em relação à determinação da identidade de sequência, as mesmas aplicações foram apresentadas acima.
[0321] Em relação à segunda reação alternativa (em que um fosfato de acila é gerado como um intermediário antes da coenzima A ser fixada conforme esquematicamente ilustrado na Figura 24), os exemplos que pertencem à família acima de ligases que forma uma ligação de carbono-enxofre (EC 6.2.1.-) que têm capacidade para converter enzimaticamente 3-hidroxiisovalerato (HIV) em 3- hidroxiisovaleril-CoA em que um intermediário de fosfato de acila (isto é, o intermediário de fosfato de acila, fosfato de 3-hidroxiisovalerila) é gerado antes da coenzima A ser coenzima A fixada (CoASH) e que pode ser usada no método para produzir 3-hidroxiisovaleril-CoA a partir de 3-hidroxiisovalerato (HIV) são resumidos na Tabela B a seguir:TABELA B: COA LIGASES (EC 6.2.1.-) COM CAPACIDADE PARA CONVERTER ENZIMATICAMENTE 3-HIDROXIISOVALERATO (HIV) EM 3- HIDROXIISOVALERIL-COA QUE ENVOLVE UM FOSFATO DE ACILA COMO UM INTERMEDIÁRIO
A ROTA ALTERNATIVA PARA A CONVERSÃO ENZIMÁTICA DE ACETIL-COA EM ISOBUTENO POR MEIO DE 3-METIL-3-BUTENOIL-COA E ÁCIDO 3-METIL-3-BUTENÓICO
[0322] Em uma alternativa ao citado acima, a presente invenção também se refere a um método para a produção de isobuteno por meio de uma rota alternativa conforme também mostrado na Figura 1 em que isobuteno é produzido pela conversão enzimática de ácido 3-metil-3-butenóico em isobuteno. Desse modo, a presente invenção fornece um método para a produção de isobuteno que compreende a conversão enzimática de ácido 3-metil-3-butenóico em isobuteno. Preferencialmente, a conversão enzimática de ácido 3-metil-3-butenóico em isobuteno é alcançada fazendo-se uso de uma ácido 3-metil-3-butenóico decarboxilase.
[0323] De acordo com essa rota alternativa, a presente invenção não apenas se refere a um método para a produção de isobuteno de ácido 3-metil-3-butenóico. Em vez disso, conforme destacado em mais detalhes adicionais abaixo, essa conversão é preferencialmente incorporada em uma via para a produção de isobuteno que começa a partir de acetil-CoA que é um componente central e uma molécula-chave importante em metabolismo usado em muitas reações bioquímicas.
[0324] Portanto, a presente invenção também se refere a uma via que começa a partir de acetil-CoA em que duas moléculas de acetil-CoA são enzimaticamente condensados em acetoacetil-CoA. Alternativamente, acetil-CoA é enzimaticamente convertido em malonil-CoA que pode ser, então, convertida no dito acetoacetil-CoA pela condensação enzimática de malonil-CoA e acetil-CoA no dito acetoacetil-CoA.
[0325] Adicionalmente, o acetoacetil-CoA produzido desse modo pode ser enzimaticamente convertido em ácido 3-metil-3-butenóico (que é, então, finalmente convertido em isobuteno) por meio da via brevemente resumida a seguir.
[0326] Nessa via, o acetoacetil-CoA produzido desse modo pode ser convertido de modo enzimaticamente adicional em 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA. Além disso, o 3- hidroxi-3-metilglutaril-CoA produzido desse modo pode ser convertido de modo enzimaticamente adicional em 3-metilglutaconil-CoA. Adicionalmente, o 3- metilglutaconil-CoA produzido desse modo pode ser enzimaticamente convertido em 3-metil-3-butenoil-CoA. Adicionalmente, o 3-metil-3-butenoil-CoA produzido desse modo pode ser adicionalmente convertido em uma reação enzimática subsequente em ácido 3-metil-3-butenóico (que pode ser finalmente convertido em isobuteno, conforme descrito acima e adicionalmente abaixo).
A CONVERSÃO ENZIMÁTICA DE ÁCIDO 3-METIL-3-BUTENÓICO EM ISOBUTENO: ETAPA XVI CONFORME MOSTRADO NA FIGURA 1
[0327] De acordo com a presente invenção, a conversão enzimática de ácido 3- metil-3-butenóico em isobuteno pode ser alcançada por uma descarboxilação. “Descarboxilação” é geralmente uma reação química que remove um grupo carboxila e libera dióxido de carbono (CO2); consultar Figura 25.
[0328] A conversão enzimática de ácido 3-metil-3-butenóico em isobuteno pode ser preferencialmente alcançada fazendo-se uso de uma ácido 3-metil-3-butenóico decarboxilase. De acordo com a presente invenção, uma ácido 3-metil-3-butenóico decarboxilase é uma enzima com capacidade para converter ácido 3-metil-3- butenóico em isobuteno.
[0329] Em modalidades preferidas, a ácido 3-metil-3-butenóico decarboxilase é selecionada a partir do grupo que consiste em: (i) uma decarboxilase dependente de FMN associada a uma prenil transferase de FMN; ou (ii) uma aconitato decarboxilase (EC 4.1.1.6); ou (iii) uma metilcrotonil-CoA carboxilase (EC 6.4.1.4); ou (iv) uma geranoil-CoA carboxilase (EC 6.4.1.5); ou (v) uma protocatecuato (PCA) decarboxilase (EC 4.1.1.63).
[0330] Em outras modalidades preferidas, a ácido 3-metil-3-butenóico decarboxilase é selecionada a partir do grupo que consiste em: 6-metilsalicilato decarboxilase (EC 4.1.1.52), 2-oxo-3-hexenodioato decarboxilase (EC 4.1.1.77) e 5- oxopent-3-eno-1,2,5-tricarboxilato decarboxilase (EC 4.1.1.68).
[0331] Em relação à modalidade supracitada, para a decarboxilase dependente de FMN associada a uma prenil transferase de FMN, a aconitato decarboxilase (EC 4.1.1.6), a metilcrotonil-CoA carboxilase (EC 6.4.1.4), a geranoil-CoA carboxilase (EC 6.4.1.5), a protocatecuato (PCA) decarboxilase (EC 4.1.1.63), a 6-metilsalicilato decarboxilase (EC 4.1.1.52), a 2-oxo-3-hexenodioato decarboxilase (EC 4.1.1.77) e a 5-oxopent-3-eno-1,2,5-tricarboxilato decarboxilase (EC 4.1.1.68), o mesmo se aplica, conforme estabelecido acima, em conexão com outros métodos da presente invenção.
A CONVERSÃO ENZIMÁTICA DE 3-METIL-3-BUTENOIL-COA EM ÁCIDO 3-METIL-3-BUTENÓICO: ETAPAS XVIIA, XVIIB OU XVIIC CONFORME MOSTRADO NA FIGURA 1
[0332] O ácido 3-metil-3-butenóico pode ser fornecido em si por uma reação enzimática, a saber, a conversão enzimática de 3-metil-3-butenoil-CoA em ácido 3- metil-3-butenóico; consultar Figura 26.
[0333] Consequentemente, a presente invenção se refere a um método para produzir isobuteno a partir de 3-metil-3-butenoil-CoA em que 3-metil-3-butenoil-CoA é primeiro convertido em ácido 3-metil-3-butenóico que é, então, adicionalmente convertido em isobuteno, conforme descrito acima no presente documento.
[0334] De acordo com a presente invenção, a conversão de 3-metil-3-butenoil- CoA em ácido 3-metil-3-butenóico pode ser, por exemplo, alcançada por três rotas enzimáticas alternativas diferentes, isto é, por: (a) uma reação enzimática única (consultar Figura 27) em que 3-metil-3- butenoil-CoA é diretamente convertido em ácido 3-metil-3-butenóico, preferencialmente fazendo-se uso de uma CoA transferase (EC 2.8.3.-), preferencialmente uma propionato:acetato-CoA transferase (EC 2.8.3.1), uma acetato CoA-transferase (EC 2.8.3.8) ou uma succinil-CoA:acetato CoA-transferase (EC 2.8.3.18); (b) uma reação enzimática única (consultar Figura 28) em que 3-metil-3- butenoil-CoA é diretamente convertido em ácido 3-metil-3-butenóico, preferencialmente fazendo-se uso de uma tioéster hidrolase (EC 3.1.2.-), preferencialmente acetil-CoA hidrolase (EC 3.1.2.1), uma acil-CoA hidrolase de cadeia curta dependente de ADP (EC 3.1.2.18) ou uma acil-CoA hidrolase (EC 3.1.2.20); ou (c) duas etapas enzimáticas (consultar Figura 29) que compreendem (i) primeiro converter enzimaticamente 3-metil-3-butenoil-CoA em 3-metil- 3-butenoil fosfato, preferencialmente fazendo-se uso de uma fosfato butiriltransferase (EC 2.3.1.19) ou uma fosfato acetiltransferase (EC 2.3.1.8); e (ii) então, converter enzimaticamente o fosfato de 3-metil-3-butenoila obtido desse modo no dito ácido 3-metil-3-butenóico, preferencialmente fazendo-se uso de uma fosfotransferase com um grupo carbóxi como aceitante (EC 2.7.2.-), preferencialmente uma propionato quinase (EC 2.7.2.15), uma acetato quinase (EC 2.7.2.1), uma butirato quinase (EC 2.7.2.7) ou uma quinase de ácido graxo de cadeia ramificada (EC 2.7.2.14).
[0335] Em relação às modalidades supracitadas, para a CoA transferase (EC 2.8.3.-), a propionato:acetato-CoA transferase (EC 2.8.3.1), a acetato CoA-transferase (EC 2.8.3.8), a succinil-CoA:acetato CoA-transferase (EC 2.8.3.18), a tioéster hidrolase (EC 3.1.2.-), a acetil-CoA hidrolase (EC 3.1.2.1), a acil-CoA hidrolase de cadeia curta dependente de ADP (EC 3.1.2.18), a acil-CoA hidrolase (EC 3.1.2.20), a fosfato butiriltransferase (EC 2.3.1.19), a fosfato acetiltransferase (EC 2.3.1.8), a fosfotransferase com um grupo carbóxi como aceitante (EC 2.7.2.-), a propionato quinase (EC 2.7.2.15), a acetato quinase (EC 2.7.2.1), a butirato quinase (EC 2.7.2.7) e a ácido graxo de cadeia ramificado quinase (EC 2.7.2.14), o mesmo se aplica, conforme estabelecido acima, em conexão com os outros métodos da presente invenção.
A CONVERSÃO ENZIMÁTICA DE 3-METILGLUTACONIL-COA EM 3- METIL-3-BUTENOIL-COA: ETAPA XVIII CONFORME MOSTRADO NA FIGURA 1
[0336] O 3-metil-3-butenoil-CoA pode fornecido em si por uma reação enzimática, a saber, a conversão enzimática de 3-metilglutaconil-CoA em 3-metil-3-butenoil-CoA; consultar Figura 30.
[0337] Consequentemente, a presente invenção se refere a um método para produzir isobuteno a partir de 3-metil-3-butenoil-CoA em que 3-metilglutaconil-CoA é primeiro convertido em 3-metil-3-butenoil-CoA que é, então, adicionalmente convertido em ácido 3-metil-3-butenóico que é, então, adicionalmente convertido em isobuteno conforme descrito acima no presente documento.
[0338] Além disso, a presente invenção se refere a um método para produzir 3- metil-3-butenoil-CoA convertendo-se 3-metilglutaconil-CoA em 3-metil-3-butenoil- CoA.
[0339] De acordo com a presente invenção, a conversão de 3-metilglutaconil-CoA em 3-metil-3-butenoil-CoA pode ser preferencialmente alcançada fazendo-se uso de (a) (i) uma metilcrotonil-CoA carboxilase (EC 6.4.1.4); ou (ii) uma geranoil- CoA carboxilase (EC 6.4.1.5), (b) um domínio N-terminal de CurF a partir de proteína multifuncional de Lynbya majuscula ou uma 3-metilglutaconil-CoA decarboxilase, preferencialmente uma 3-metilglutaconil-CoA decarboxilase de Myxococcus xanthus codificada pelo gene liuB; ou (c) uma enzima da família 4-oxalocrotonato decarboxilase.
[0340] Em relação ás modalidades supracitadas, para a metilcrotonil-CoA carboxilase (EC 6.4.1.4), a geranoil-CoA carboxilase (EC 6.4.1.5) e a 3-metilglutaconil- CoA decarboxilase, preferencialmente a 3-metilglutaconil-CoA decarboxilase de Myxococcus xanthus codificada pelo gene liuB, o mesmo se aplica, conforme estabelecido acima, em conexão com os outros métodos da presente invenção.
[0341] Em uma modalidade preferida a conversão de 3-metilglutaconil-CoA por meio de descarboxilação em 3-metil-3-butenoil-CoA é catalisada por um domínio N- terminal de CurF a partir de proteína multifuncional de Lynbya majuscula. O domínio N-terminal de CurF de proteína multifuncional de Lynbya majuscula é um domínio de uma policétido sintase (PKS)/não ribossomato peptídeo sintase (NRPS) da proteína multifuncional de CurF de Lyngbya majuscula. Esse domínio N-terminal de CurF foi classificado como uma proteína que pertence à superfamília de crotonase estudando- se a estrutura cristalina e catalisa naturalmente a descarboxilação de 3- metilglutaconil-ACP (Proteína Carreadora de Acila) em 3-metil-crotonil-ACP. ACP é similar a CoA visto que ambas as moléculas têm uma porção química de fosfopanteteína em comum (conforme mostrado na Figura 31). Além disso, tanto ACP quanto CoA podem formar um tioéster com um ácido biológico (J. Biol. Chem. 289: 35.957 a 35.963 (2007) e Chemistry & Biology 11:817 a 833 (2004)).
[0342] Em outra modalidade preferida, a conversão de 3-metilglutaconil-CoA por meio de descarboxilação em 3-metil-3-butenoil-CoA é catalisada por uma enzima da família de 4-oxalocrotonato decarboxilase (EC 4.1.1.77).
[0343] 4-oxalocrotonato decarboxilases (EC 4.1.1.77) catalisam a reação a seguir:
[0344] Essa enzima é conhecida a partir de vários organismos e foi, por exemplo, descrita em Bortetella sp., Cupriavidus nector, Geobacillus stearothermophilus, Pseudomonas putida e Ralstonia pickettii. Desse modo, em uma modalidade preferida, a 4-oxalocrotonato decarboxilase usada para a conversão de 3- metilglutaconil-CoA por meio de descarboxilação em 3-metil-3-butenoil-CoA é uma 4- oxalocrotonato decarboxilase derivada de gênero Bortetella, Cupriavidus, Geobacillus, Pseudomonas pr Ralstonia, mais preferencialmente da espécie Bortetella sp., Cupriavidus nector, Geobacillus stearothermophilus, Pseudomonas putida ou Ralstonia pickettii. Em uma modalidade ainda mais preferida, a 4- oxalocrotonato decarboxilase usada para a conversão de 3-metilglutaconil-CoA por meio de descarboxilação em 3-metil-3-butenoil-CoA é a 4-oxalocrotonato decarboxilase de Geobacillus stearothermophilus (Número de acesso UniProt B0VXM8).
[0345] Em uma modalidade preferida, a 4-oxalocrotonato decarboxilase empregada no método da presente invenção na conversão de 3-metilglutaconil-CoA por meio de descarboxilação em 3-metil-3-butenoil-CoA é derivada de Geobacillus stearothermophilus e tem uma sequência de aminoácidos conforme mostrado SEQ ID NO:69.
[0346] Em uma modalidade preferida da presente invenção, a 4-oxalocrotonato decarboxilase é uma enzima que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 ou uma sequência que é pelo menos n % idêntica a SEQ ID NO: 69 com n como um número inteiro entre 10 e 100, preferencialmente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 e em que a enzima tem a atividade enzimática de converter 3-metilglutaconil-CoA por meio de descarboxilação em 3-metil-3-butenoil-CoA. Em relação à determinação da identidade de sequência, as mesmas aplicações foram apresentadas acima.
A CONVERSÃO ENZIMÁTICA DE 3-HIDROXI-3-METILGLUTARIL-COA EM 3-METILGLUTACONIL-COA: ETAPA VIII CONFORME MOSTRADO NA FIGURA 1
[0347] A 3-metilglutaconil-CoA que pode ser convertida em 3-metil-3-butenoil- CoA, de acordo com qualquer um dos métodos descritos acima, pode ser fornecida em si por uma reação enzimática, a saber, a conversão enzimática de 3-hidroxi-3- metilglutaril-CoA em 3-metilglutaconil-CoA.
[0348] Consequentemente, a presente invenção também se refere a um método para produzir isobuteno a partir de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA em que 3-hidroxi-3- metilglutaril-CoA é primeiro convertido em 3-metilglutaconil-CoA que é, então, convertido em 3-metil-3-butenoil-CoA que é, então, adicionalmente convertido em ácido 3-metil-3-butenóico que é, então, adicionalmente convertido em isobuteno conforme descrito acima no presente documento.
[0349] De acordo com a presente invenção, a conversão enzimática de 3-hidroxi- 3-metilglutaril-CoA em 3-metilglutaconil-CoA é uma reação de desidratação enzimática que ocorre naturalmente, e que é catalisada, por exemplo, por enzimas classificadas como 3-metilglutaconil-coenzima A hidratase (EC 4.2.1.18). Consequentemente, a conversão enzimática de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA em 3- metilglutaconil-CoA faz uso preferencialmente de uma 3-metilglutaconil-coenzima A hidratase (EC 4.2.1.18).
[0350] Em relação à modalidade supracitada, para as enzimas classificadas como 3-metilglutaconil-coenzima A hidratase (EC 4.2.1.18), o mesmo se aplica conforme estabelecido acima em conexão com os outros métodos da presente invenção.
A CONVERSÃO ENZIMÁTICA DE ACETOACETIL-COA EM 3-HIDROXI- 3-METILGLUTARIL-COA: ETAPA IX CONFORME MOSTRADO NA FIGURA 1
[0351] A 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA pode ser fornecida em si por uma reação enzimática, a saber, a condensação enzimática de acetoacetil-CoA e acetil-CoA em 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA que já foi descrita em detalhes acima.
[0352] Consequentemente, a presente invenção também se refere a um método para produzir isobuteno a partir de acetoacetil-CoA e acetil-CoA em que acetoacetil- CoA e acetil-CoA são primeiro condensados em 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA que é, então, convertido em 3-metilglutaconil-CoA que é, então, convertido em 3-metil-3- butenoil-CoA que é, então, adicionalmente convertido em ácido 3-metil-3-butenóico que é, então, adicionalmente convertido em isobuteno conforme descrito acima no presente documento.
A CONVERSÃO ENZIMÁTICA DE ACETIL-COA EM ACETOACETIL- COA: ETAPA XIII, ETAPA XIV E ETAPA XV CONFORME MOSTRADO NA FIGURA 1
[0353] A acetoacetil-CoA pode ser fornecida em si por uma reação enzimática, a saber, a conversão enzimática de acetil-CoA em acetoacetil-CoA por meio de diversas rotas diferentes que já foram descritas em detalhes acima.
[0354] Desse modo, a presente invenção também se refere a um método para produzir isobuteno a partir de acetil-CoA em que acetil-CoA é primeiro convertido em acetoacetil-CoA por qualquer uma das rotas mencionadas acima que é, então, condensado com acetil-CoA em 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA que é, então, convertido em 3-metilglutaconil-CoA que é, então, convertido em 3-metil-3-butenoil-CoA que é, então, adicionalmente convertido em ácido 3-metil-3-butenóico que é, então, adicionalmente convertido em isobuteno conforme descrito acima no presente documento.
[0355] Resumindo a rota alternativa para a conversão enzimática de acetil-CoA em isobuteno por meio de 3-metil-3-butenoil-CoA e ácido 3-metil-3-butenóico, conforme destacado acima, a presente invenção também se refere às modalidades a seguir, conforme caracterizado pelos itens a seguir 1 a 26: 1. Um método para a produção de isobuteno que compreende a conversão enzimática de ácido 3-metil-3-butenóico em isobuteno. 2. O método do item 1, em que a conversão enzimática de ácido 3-metil-3- butenóico em isobuteno é alcançada fazendo-se uso de uma ácido 3-metil-3- butenóico decarboxilase. 3. O método do item 2, em que a ácido 3-metil-3-butenóico decarboxilase é: (i) uma decarboxilase dependente de FMN associada a uma prenil transferase de FMN; ou (ii) uma aconitato decarboxilase (EC 4.1.1.6); ou (iii) uma metilcrotonil-CoA carboxilase (EC 6.4.1.4); ou (iv) uma geranoil-CoA carboxilase (EC 6.4.1.5); ou (v) uma protocatecuato (PCA) decarboxilase (EC 4.1.1.63). 4. O método do item 1 ou 2 que compreende adicionalmente fornecer o ácido 3-metil-3-butenóico pela conversão enzimática de 3-metil-3-butenoil-CoA em ácido 3-metil-3-butenóico. 5. O método do item 4, em que a conversão enzimática de 3-metil-3- butenoil-CoA em ácido 3-metil-3-butenóico é alcançada por (a) uma reação enzimática única em que 3-metil-3-butenoil-CoA é diretamente convertido em ácido 3-metil-3-butenóico fazendo-se uso de uma CoA transferase (EC 2.8.3.-), preferencialmente uma propionato:acetato-CoA transferase (EC 2.8.3.1), uma acetato CoA-transferase (EC 2.8.3.8) ou uma succinil-CoA:acetato CoA-transferase (EC 2.8.3.18); (b) uma reação enzimática única em que 3-metil-3-butenoil-CoA é diretamente convertido em ácido 3-metil-3-butenóico fazendo-se uso de uma tioéster hidrolase (EC 3.1.2.-), preferencialmente acetil-CoA hidrolase (EC 3.1.2.1), uma acil- CoA hidrolase de cadeia curta dependente de ADP (EC 3.1.2.18) ou uma acil-CoA hidrolase (EC 3.1.2.20); (c) duas etapas enzimáticas que compreendem (i) primeiro converter enzimaticamente 3-metil-3-butenoil-CoA em fosfato de 3-metil-3-butenoila; e (ii) então, converter enzimaticamente o fosfato de 3-metil-3-butenoila obtido desse modo no dito ácido 3-metil-3-butenóico. 6. O método do item 5(c), em que a conversão enzimática do dito 3-metil- 3-butenoil-CoA em 3-metil-3-butenoil fosfato é alcançada fazendo-se uso de uma fosfato butiriltransferase (EC 2.3.1.19) ou uma fosfato acetiltransferase (EC 2.3.1.8) e a conversão enzimática do dito fosfato de 3-metil-3-butenoila no dito ácido 3-metil-3- butenóico é alcançada fazendo-se uso de uma fosfotransferase com um grupo carbóxi como aceitante (EC 2.7.2.-), preferencialmente uma propionato quinase (EC 2.7.2.15), uma acetato quinase (EC 2.7.2.1), uma butirato quinase (EC 2.7.2.7) ou uma ácido graxo de cadeia ramificada quinase (EC 2.7.2.14). 7. O método de qualquer um dos itens 1 a 4 que compreende adicionalmente fornecer 3-metil-3-butenoil-CoA pela conversão enzimática de 3- metilglutaconil-CoA em 3-metil-3-butenoil-CoA. 8. O método do item 7, em que a conversão enzimática de 3-metilglutaconil- CoA em 3-metil-3-butenoil-CoA é alcançada fazendo-se uso de (a) (i) uma metilcrotonil-CoA carboxilase (EC 6.4.1.4); ou (ii) uma geranoil- CoA carboxilase (EC 6.4.1.5), (b) um domínio N-terminal de CurF a partir de proteína multifuncional de Lynbya majuscula ou uma 3-metilglutaconil-CoA decarboxilase, preferencialmente uma 3-metilglutaconil-CoA decarboxilase de Myxococcus xanthus codificada pelo gene liuB; ou (c) uma enzima da família 4-oxalocrotonato decarboxilase. 9. O método de qualquer um dos itens 1 a 8 que compreende adicionalmente fornecer 3-metilglutaconil-CoA pela conversão enzimática de 3- hidroxi-3-metilglutaril-CoA em 3-metilglutaconil-CoA. 10. O método do item 9, em que a conversão enzimática de 3-hidroxi-3- metilglutaril-CoA em 3-metilglutaconil-CoA é alcançada fazendo-se uso de uma 3- metilglutaconil-coenzima A hidratase (EC 4.2.1.18), uma 3-hidroxiacil-CoA desidratase (EC 4.2.1.-) ou uma enoil-CoA hidratase (EC 4.2.1.-).. 11. O método de qualquer um dos itens 1 a 10, que compreende adicionalmente fornecer o 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA pela condensação enzimática de acetoacetil-CoA e acetil-CoA em 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA. 12. O método do item 11, em que a condensação enzimática de acetoacetil- CoA e acetil-CoA em 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA é alcançada fazendo-se uso de uma 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA sintase. 13. O método de qualquer um dos itens 1 a 12 que compreende adicionalmente fornecer o acetoacetil-CoA pela conversão enzimática de acetil-CoA em acetoacetil-CoA que compreende: (a) duas etapas enzimáticas que compreendem (i) primeiro a conversão enzimática de acetil-CoA em malonil-CoA; e (ii) então, condensar enzimaticamente o malonil-CoA obtido desse modo e acetil-CoA no dito acetoacetil-CoA; ou (b) uma reação enzimática única na qual duas moléculas de acetil-CoA são diretamente condensadas em acetoacetil-CoA. 14. O método do item 13(a)(i), em que a conversão enzimática de acetil- CoA em malonil-CoA é alcançada fazendo-se uso de uma acetil-CoA carboxilase (EC 6.4.1.2). 15. O método do item 13(a)(ii), em que a condensação enzimática de malonil-CoA e acetil-CoA no dito acetoacetil-CoA é alcançada fazendo-se uso de uma acetoacetil-CoA sintase (EC 2.3.1.194). 16. O método do item 13(b), em que a condensação enzimática direta de duas moléculas de acetil-CoA em acetoacetil-CoA é alcançada fazendo-se uso de uma acetil-CoA C-acetiltransferase (EC 2.3.1.9). 17. Um organismo ou micro-organismo recombinante que expressa (i) uma enzima, conforme definido em qualquer um dos itens 1 a 3; e (ii) uma enzima, conforme definido em qualquer um dos itens 4 a 6. 18. O organismo ou micro-organismo recombinante do item 17 que expressa adicionalmente uma enzima, conforme definido no item 7 ou 8. 19. O organismo ou micro-organismo recombinante do item 18 que expressa adicionalmente uma enzima, conforme definido no item 9 ou 10. 20. O organismo ou micro-organismo recombinante do item 19 que expressa adicionalmente uma enzima, conforme definido no item 11 ou 12. 21. O organismo ou micro-organismo recombinante do item 20 que expressa adicionalmente uma enzima, conforme definido no item 13 ou 8. 22. O organismo ou micro-organismo recombinante do item 21 que expressa adicionalmente uma enzima, conforme definido em qualquer um dos itens 14 a 16. 23. Uso de um organismo ou micro-organismo recombinante, conforme definido em qualquer um dos itens 17 a 22 para a produção de isobuteno. 24. O uso de um organismo ou micro-organismo recombinante do item 23, em que o dito organismo ou micro-organismo recombinante expressa uma enzima que catalisa a conversão enzimática de ácido 3-metil-3-butenóico em isobuteno. 25. Uso de uma enzima que catalisa a conversão enzimática de ácido 3- metil-3-butenóico em isobuteno para a produção de isobuteno a partir de ácido 3-metil- 3-butenóico. 26. Uma composição que compreende ácido 3-metil-3-butenóico e um organismo ou micro-organismo recombinante, conforme definido em qualquer um dos itens 17 a 22; ou ácido 3-metil-3-butenóico e uma enzima, conforme definido em qualquer um dos itens 1 a 16.
[0356] Um método de acordo com a presente invenção pode ser executado in vitro ou in vivo. Uma reação in vitro é entendida como uma reação na qual nenhuma célula é empregada, isto é, uma reação acelular. Desse modo, in vitro significa preferencialmente em um sistema livre de célula. O termo “in vitro” em uma modalidade significa na presença de enzimas isoladas (ou sistemas de enzima que compreendem opcionalmente os cofatores possivelmente necessários). Em uma modalidade, as enzimas empregadas no método são usadas em forma purificada.
[0357] Para executar o método in vitro, os substratos para a reação e as enzimas são incubados sob condições (tampão, temperatura, cossubstratos, cofatores, etc.) que permite que as enzimas sejam ativas e a conversão enzimática ocorra. Permite- se que a reação proceda por um tempo suficiente para produzir o respectivo produto. A produção dos respectivos produtos pode ser medida por métodos conhecidos na técnica, como cromatografia gasosa possivelmente ligada à detecção de espectrometria de massa.
[0358] As enzimas podem estar em qualquer forma adequada que permite que a reação enzimática ocorra. As mesmas podem ser purificadas ou parcialmente purificadas ou na forma de extratos celulares brutos ou extratos parcialmente purificados. Também é possível que as enzimas sejam imobilizadas em um carreador adequado.
[0359] Em outra modalidade, o método de acordo com a invenção é executado em cultura, na presença de um organismo, preferencialmente um micro-organismo, que produz as enzimas descritas acima para as conversões dos métodos de acordo com a presente invenção, conforme descrito acima no presente documento. Um método que emprega um micro-organismo para executar um método de acordo com a invenção é denominado um método “in vivo”. É possível usar um micro-organismo que produz naturalmente as enzimas descritas acima para as conversões dos métodos de acordo com a presente invenção ou um micro-organismo que foi geneticamente modificado para que expresse (incluindo superexpressar) uma ou mais de tais enzimas. Desse modo, o micro-organismo pode ser um micro-organismo projetado que expressa enzimas descritas acima para as conversões dos métodos de acordo com a presente invenção, isto é, que tem em seu genoma uma sequência de nucleotídeo que codifica tais enzimas e que foi modificada para superexpressar as mesmas. A expressão pode ocorrer de modo constitutivo ou de uma maneira induzida ou regulada.
[0360] Em outra modalidade, o micro-organismo pode ser um micro-organismo que foi geneticamente modificado pela introdução de uma ou mais moléculas de ácido nucleico que contêm sequências de nucleotídeo que codificam uma ou mais enzimas descritas acima para as conversões dos métodos de acordo com a presente invenção. A molécula de ácido nucleico pode ser integrada de modo estável ao genoma do micro-organismo ou pode estar presente de maneira extracromossômica, por exemplo, em um plasmídeo.
[0361] Tal micro-organismo geneticamente modificado pode ser, por exemplo, um micro-organismo que não expressa naturalmente as enzimas descritas acima para as conversões dos métodos de acordo com a presente invenção e que foi geneticamente modificado para expressar tais enzimas ou um micro-organismo que expressa naturalmente tais enzimas e que foi geneticamente modificado, por exemplo, transformado com um ácido nucleico, por exemplo, um vetor, que codifica a respectiva enzima (ou enzimas), e/ou inserção de um promotor na frente da sequência de nucleotídeo endógena que codifica a enzima a fim de aumentar a respectiva atividade no dito micro-organismo.
[0362] Entretanto, a invenção exclui preferencialmente os micro-organismos de ocorrência natural, conforme encontrados em natureza, que expressam uma enzima, conforme descrito acima, em níveis em que existem em natureza. Em vez disso, o micro-organismo da presente invenção e empregado em um método da presente invenção é preferencialmente um micro-organismo de ocorrência não natural, que foi geneticamente modificado para expressar (incluindo superexpressão) uma enzima exógena da invenção que não existe normalmente em seu genoma ou foi projetada para superexpressar uma enzima exógena.
[0363] Desse modo, as enzimas e (micro)organismos empregados em conexão com a presente invenção são preferencialmente enzimas ou (micro)organismos de ocorrência não natural, isto é, são enzimas ou (micro)organismos que diferem de modo significativo das enzimas ou micro-organismo de ocorrência natural e que não ocorrem em natureza. Em relação às enzimas, as mesmas são preferencialmente variantes de enzimas de ocorrência natural que não ocorrem como tais em natureza. Tais variantes incluem, por exemplo, mutantes, em particular, preparados por métodos biológicos moleculares, que mostram propriedades melhoradas, como uma atividade de enzima mais alta, especificidade de substrato mais alta, resistência à temperatura mais alta e semelhantes. Em relação aos (micro)organismos, os mesmos são preferencialmente organismos geneticamente modificados conforme descrito acima no presente documento que diferem de organismos de ocorrência natural devido a uma modificação genética. Os organismos geneticamente modificados são organismos que não ocorrem naturalmente, isto é, que não podem ser encontrados em natureza, e que diferem substancialmente de organismos de ocorrência natural devido à introdução de uma molécula de ácido nucleico estranha.
[0364] Superexpressando-se uma enzima exógena ou endógena, conforme descrito acima no presente documento, a concentração da enzima é substancialmente mais alta do que o que é encontrado em natureza, que pode, então, forçar de modo inesperado a reação da presente invenção que usa uma não natural para a respectiva enzima. Preferencialmente, a concentração da enzima superexpressada é pelo menos 5%, 10%, 20%, 30% ou 40% da proteína de célula hospedeira total.
[0365] Um substrato “não natural” é entendido como uma molécula que não é atuada pela respectiva enzima em natureza, mesmo que possa coexistir realmente no micro-organismo juntamente com a enzima endógena. Esse substrato “não natural” não é convertido pelo micro-organismo em natureza visto que outros substratos são preferidos (por exemplo, o “substrato natural”). Desse modo, a presente invenção contempla utilizar um substrato não natural com as enzimas descritas acima em um ambiente não encontrado em natureza.
[0366] Desse modo, também é possível no contexto da presente invenção que o micro-organismo seja um micro-organismo que não tem naturalmente a respectiva atividade de enzima, mas que é geneticamente modificado de modo a compreender uma sequência de nucleotídeo que permite a expressão de uma enzima correspondente. De modo similar, o micro-organismo também pode ser um microorganismo que tem naturalmente a respectiva atividade de enzima, mas que é geneticamente modificado de modo a intensificar tal atividade, por exemplo, pela introdução de uma sequência de nucleotídeo exógena que codifica uma enzima correspondente ou pela introdução de um promotor para o gene endógeno que codifica a enzima para aumentar a produção endógena até níveis superexpressados (não naturais).
[0367] Se um micro-organismo for usado, o qual expressa naturalmente uma enzima correspondente, é possível modificar tal micro-organismo para que a respectiva atividade seja superexpressada no micro-organismo. Isso pode ser, por exemplo, alcançado efetuando-se mutações na região promotora do gene correspondente ou introdução de um promotor de expressão alta de modo a levar a um promotor que garante uma expressão mais alta do gene. Alternativamente, também possível realizar mutação do gene como tal, de modo a levar a uma enzima que mostra uma atividade mais alta.
[0368] Usando-se micro-organismos que expressam enzimas descritas acima para as conversões dos métodos de acordo com a presente invenção, é possível executar os métodos de acordo com a invenção diretamente no meio de cultura, sem a necessidade de separar ou purificar as enzimas.
[0369] Em uma modalidade, o organismo empregado em um método de acordo com a invenção é um micro-organismo que foi geneticamente modificado para conter uma molécula de ácido nucleico estranha que codifica pelo menos uma enzima descrita acima para as conversões dos métodos de acordo com a presente invenção. O termo “estranho” ou “exógeno” nesse contexto significa que a molécula de ácido nucleico não ocorre naturalmente no dito micro-organismo. Isso significa que não ocorre na mesma estrutura ou na mesma localização no micro-organismo. Em uma modalidade preferida, a molécula de ácido nucleico estranha é uma molécula recombinante que compreende um promotor e uma sequência de codificação que codifica a respectiva enzima na qual o promotor que aciona a expressão da sequência de codificação é heterólogo em relação à sequência de codificação. “Heterólogo” nesse contexto significa que o promotor não é o que aciona naturalmente a expressão da dita sequência de codificação, mas é um promotor que aciona naturalmente a expressão de uma sequência de codificação diferente, isto é, é derivado de outro gene, ou é um promotor sintético ou um promotor quimérico. Preferencialmente, o promotor é um promotor heterólogo ao micro-organismo, isto é, um promotor que naturalmente não ocorre no respectivo micro-organismo. Até mais preferencialmente, o promotor é um promotor induzível. Os promotores para acionar a expressão em tipos diferentes de organismos, em particular, em micro-organismos, são bem conhecidos pela pessoa versada na técnica.
[0370] Em uma modalidade adicional, a molécula de ácido nucleico é estranha para o micro-organismo, em que a enzima codificada não é endógena para o microorganismo, isto é, não é naturalmente expressada pelo micro-organismo quando o mesmo não é geneticamente modificado. Em outras palavras, a enzima codificada é heteróloga em relação ao micro-organismo. A molécula de ácido nucleico estranha pode estar presente no micro-organismo na forma extracromossômica, por exemplo, como um plasmídeo, ou integrada de modo estável no cromossomo. Uma integração estável é preferida. Desse modo, a modificação genética pode consistir, por exemplo, na integração do gene (ou genes) correspondente que codifica a enzima (ou enzimas) para o cromossomo, ou na expressão da enzima (ou enzimas) de um plasmídeo que contém um promotor a montante da sequência de codificação de enzima, em que o promotor e sequência de codificação se originam preferencialmente de organismos diferentes, ou qualquer outro método conhecido por uma pessoa versada na técnica.
[0371] O termo “micro-organismo” no contexto da presente invenção se refere a bactérias, assim como a fungos, como leveduras, e também a algas e archaea. Em uma modalidade preferida, o micro-organismo é uma bactéria. Em princípio, qualquer bactéria pode ser usada. As bactérias preferidas a serem empregadas no processo, de acordo com a invenção, são bactérias do gênero Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Pseudomonas, Zymomonas ou Escherichia. Em uma modalidade particularmente preferida, a bactéria pertence ao gênero Escherichia e até mais preferida para a espécie Escherichia coli. Em outra modalidade preferida, a bactéria pertence à espécie Pseudomonas putida ou à espécie Zymomonas mobilis ou à espécie Corynebacterium glutamicum ou à espécie Bacillus subtilis.
[0372] Também é possível empregar uma bactéria extremofílica, como Thermus thermophilus, ou bactérias anaeróbicas da família Clostridiae.
[0373] Em outra modalidade preferida, o micro-organismo é um fungo, mais preferencialmente um fungo do gênero Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Aspergillus, Trichoderma, Kluyveromyces ou Pichia e até mais preferencialmente da espécie Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Aspergillus niger, Trichoderma reesei, Kluyveromyces marxianus, Kluyveromyces lactis, Pichia pastoris, Pichia torula ou Pichia utilis.
[0374] Em outra modalidade, o método de acordo com a invenção faz uso de um micro-organismo fotossintético que expressa pelo menos uma enzima para a conversão de acordo com a invenção, conforme descrito acima. Preferencialmente, o micro-organismo é uma bactéria fotossintética, ou uma microalga. Em uma modalidade adicional, o micro-organismo é uma alga, mais preferencialmente uma alga que pertence às diatomáceas.
[0375] Também é concebível o uso no método, de acordo com a invenção, de uma combinação de micro-organismos, em que micro-organismos diferentes expressam enzimas diferentes, conforme descrito acima. A modificação genética de micro-organismos para expressar uma enzima de interesse também será adicionalmente descrita em detalhes abaixo.
[0376] Em uma modalidade preferida, o método da presente invenção faz uso de um organismo, preferencialmente um micro-organismo, que é geneticamente modificado a fim de evitar o vazamento de acetil-CoA, assim aumentando a concentração intracelular de acetil-CoA. As modificações genéticas que levam a um aumento na concentração intracelular de acetil-CoA são conhecidas na técnica. Sem se atrelar à teoria, tal organismo, preferencialmente um micro-organismo, pode ser preferencialmente modificado geneticamente deletando ou desativando-se os genes a seguir:
[0377] ΔackA (acetato quinase), Δldh (lactato desidrogenase), ΔadhE (álcool desidrogenase), ΔfrdB e/ou ΔfrdC (fumarato redutase e fumarato desidrogenase).
[0378] Alternativamente, ou além de qualquer uma das deleções acima, o organismo ou micro-organismo pode ser geneticamente modificado superexpressando-se o gene panK/coaA que codifica Pantothenate quinase, assim aumentando o grupamento intracelular CoA/acetil-CoA.
[0379] Essas modificações que evitam o vazamento de acetil-CoA são conhecidas na técnica e organismos modificados correspondentes foram usados em métodos para a bioconversão de álcool isoamílico exógeno em acetato de isoamila por uma cepa de E. coli que expressa ATF2 (Metab. Eng. 6 (2004), 294 a 309).
[0380] Em outra modalidade, o método da invenção compreende etapa de fornecer o organismo, preferencialmente o micro-organismo que porta a respectiva atividade ou atividades de enzima na forma de uma cultura (de célula), preferencialmente na forma de uma cultura de célula líquida, uma etapa subsequente de cultivar o organismo, preferencialmente o micro-organismo em um fermentador (também frequentemente denominado biorreator) sob condições adequadas que permitem a expressão da respectiva enzima e que compreende adicionalmente a etapa de efetuar uma conversão enzimática de um método da invenção, conforme descrito acima no presente documento. O fermentador ou dispositivos de biorreator adequados e condições de fermentação são conhecidos pela pessoa versada na técnica. Um biorreator ou um fermentador se refere a qualquer dispositivo fabricado ou projetado ou sistema conhecido na técnica que suporta um ambiente biologicamente ativo. Desse modo, um biorreator ou um fermentador pode ser um recipiente no qual um produto químico/bioquímico semelhante ao método da presente invenção é executado, o que envolve organismos, preferencialmente microorganismos e/ou substâncias bioquimicamente ativas, isto é, a enzima (ou enzimas) descrita acima derivada de tais organismos ou organismos que porta a enzima (ou enzimas) descrita acima. Em um biorreator ou um fermentador, esse processo pode ser aeróbico ou anaeróbico. Esses biorreatores são comumente cilíndricos, e podem estar na faixa em tamanho de litros a metros cúbicos, e são feitos frequentemente de aço inoxidável. Em relação a isso, sem se atrelar à teoria, o fermentador ou biorreator pode ser projetado de maneira que seja adequado para cultivar os organismos, preferencialmente micro-organismos, em, por exemplo, uma cultura de batelada, cultura de batelada alimentada, cultura de perfusão ou cultura de quimiostato, todos os quais são geralmente conhecidos na técnica.
[0381] O meio de cultura pode ser qualquer meio de cultura adequado para cultivar o respectivo organismo ou micro-organismo.
[0382] Em uma modalidade preferida, o método de acordo com a presente invenção também compreende a etapa de recuperar o isobuteno produzido pelo método. Por exemplo, se o método de acordo com a presente invenção é executado in vivo fermentando-se um micro-organismo correspondente que expressa as enzimas necessárias, o isobuteno pode ser recuperado a partir do gás de combustão de fermentação por métodos conhecidos pela pessoa versada na técnica.
[0383] Em uma modalidade preferida, a presente invenção se refere a um método conforme descrito acima no presente documento em que um micro-organismo, conforme descrito acima no presente documento, é empregado, em que o micro-organismo tem capacidade para converter enzimaticamente que converte ácido 3- metilcrotônico em isobuteno, em que o dito método compreende cultivar o micro-organismo em um meio de cultura.
[0384] As enzimas usadas no método de acordo com a invenção podem ser enzimas de ocorrência natural ou enzimas que são derivadas de enzimas de ocorrência natural, por exemplo, pela introdução de mutações ou outras alterações que, por exemplo, alteram ou melhoram a atividade enzimática, a estabilidade, etc.
[0385] Os métodos para modificar e/ou melhorar as atividades enzimáticas desejadas de proteínas são bem conhecidos pela pessoa versada na técnica e incluem, por exemplo, mutagênese aleatória ou mutagênese sítio-dirigida e seleção subsequente de enzimas que têm as propriedades desejadas ou abordagens da chamada “evolução direcionada”.
[0386] Por exemplo, para modificação genética em células procarióticas, uma molécula de ácido nucleico que codifica uma enzima correspondente pode ser introduzida em plasmídeos que permitem mutagênese ou modificação de sequência por recombinação de sequências de DNA. Os métodos padrão (consultar Sambrook e Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, EUA) permitem que trocas de base sejam realizadas ou sequências naturais ou sintéticas sejam adicionadas. Os fragmentos de DNA podem ser ligados usando-se adaptadores e ligantes complementares aos fragmentos. Além disso, as medidas de projeção que fornecem sítios de restrição adequados ou removem DNA excedente ou sítios de restrição podem ser usados. Nesses casos, em que inserções, deleções ou substituições são possíveis, mutagênese in vitro, “reparo de iniciador”, restrição ou ligação pode ser usado. Em geral, uma análise de sequência, análise de restrição e outros métodos de bioquímica e biologia molecular são executados como métodos de análise. As variantes de enzima resultantes são, então, testadas pela atividade desejada, por exemplo, atividade enzimática, com um ensaio conforme descrito acima e em particular por sua atividade de enzima aumentada.
[0387] Conforme descrito acima, o micro-organismo empregado em um método da invenção ou contido na composição da invenção pode ser um micro-organismo que foi geneticamente modificado pela introdução de uma molécula de ácido nucleico que codifica uma enzima correspondente. Desse modo, em uma modalidade preferida, o micro-organismo é um micro-organismo recombinante que foi geneticamente modificado para ter uma atividade aumentada de pelo menos uma enzima descrita acima para as conversões do método de acordo com a presente invenção. Isso pode ser alcançado, por exemplo, transformando-se o micro-organismo com um ácido nucleico que codifica uma enzima correspondente. Uma descrição detalhada de modificação genética de micro-organismos será dada adicionalmente abaixo. Preferencialmente, a molécula de ácido nucleico introduzida no micro-organismo é uma molécula de ácido nucleico que é heteróloga em relação ao micro-organismo, isto é, não ocorre naturalmente no dito micro-organismo.
[0388] No contexto da presente invenção, uma “atividade aumentada” significa que a expressão e/ou a atividade de uma enzima no micro-organismo geneticamente modificado é pelo menos 10%, preferencialmente pelo menos 20%, mais preferencialmente pelo menos 30% ou 50%, até mais preferencialmente pelo menos 70% ou 80% e de modo particularmente preferencial pelo menos 90% ou 100% mais alto do que o micro-organismo não modificado correspondente. Em modalidades ainda mais preferidas, o aumento em expressão e/ou atividade pode ser pelo menos 150%, pelo menos 200% ou pelo menos 500%. Em modalidades particularmente preferidas, a expressão é pelo menos 10 vezes, mais preferencialmente pelo menos 100 vezes e até mais preferencialmente pelo menos 1.000 vezes mais alta do que o micro-organismo não modificado correspondente.
[0389] O termo expressão/atividade “aumentada” também cobre a situação na qual o micro-organismo não modificado correspondente não expressa uma enzima correspondente para que a expressão/atividade correspondente no micro-organismo não modificado seja zero. Preferencialmente, a concentração da enzima superexpressada é pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, ou 40% da proteína de célula hospedeira total.
[0390] Os métodos para medir o nível de expressão de uma dada proteína em uma célula são bem conhecidos pela pessoa versada na técnica. Em uma modalidade, a medição do nível de expressão é feita medindo-se a quantidade da proteína correspondente. Os métodos correspondentes são bem conhecidos pela pessoa versada na técnica e incluem Western Blot, ELISA etc. Em outra modalidade, a medição do nível de expressão é feita medindo-se a quantidade do RNA correspondente. Os métodos correspondentes são bem conhecidos pela pessoa versada na técnica e incluem, por exemplo, Northern Blot.
[0391] No contexto da presente invenção, o termo “recombinante” significa que o micro-organismo é geneticamente modificado de modo a conter uma molécula de ácido nucleico que codifica uma enzima, conforme definido acima em comparação com um micro-organismo de tipo selvagem ou não modificado. Uma molécula de ácido nucleico que codifica uma enzima conforme definido acima pode ser usada sozinha ou como parte de um vetor.
[0392] As moléculas de ácido nucleico podem compreender adicionalmente as sequências de controle de expressão ligadas de modo operacional ao polinucleotídeo compreendido na molécula de ácido nucleico. O termo “ligado de modo operativo” ou "ligado de modo operacional", conforme usado ao longo da presente descrição, se refere a uma ligação entre uma ou mais sequências de controle de expressão e a região de codificação no polinucleotídeo a ser expresso de tal maneira que a expressão seja alcançada sob condições compatíveis com a sequência de controle de expressão.
[0393] A expressão compreende a transcrição da sequência de DNA heteróloga, preferencialmente em um mRNA traduzível. Os elementos reguladores que garantem a expressão em fungos, assim como em bactérias, são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Os mesmos abrangem promotores, aprimoradores, sinais de terminação, sinais de direcionamento e semelhantes. Os exemplos são dados adicionalmente abaixo em conexão com explicações em relação aos vetores.
[0394] Os promotores para uso em conexão com a molécula de ácido nucleico podem ser homólogos ou heterólogos em relação à sua origem e/ou em relação ao gene a ser expressado. Os promotores adequados são, por exemplo, promotores que levam a si mesmos à expressão constitutiva. Entretanto, os promotores que são apenas ativados em um ponto no tempo determinado por influências externas também podem ser usados. Os promotores artificiais e/ou quimicamente induzíveis podem ser usados nesse contexto.
[0395] Os vetores podem compreender adicionalmente a expressão de sequências de controle ligadas de modo operacional aos ditos polinucleotídeos contidos nos vetores. Essas sequências de controle de expressão podem ser adequadas para garantir a transcrição e a síntese de um RNA traduzível em bactérias ou fungos.
[0396] Além disso, é possível inserir mutações diferentes nos polinucleotídeos por métodos usuais em biologia molecular (consultar, por exemplo, Sambrook e Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, EUA), levando à síntese de polipeptídeos que têm possivelmente as propriedades biológicas modificadas. A introdução de mutações de ponto é concebível em posições nas quais uma modificação da sequência de aminoácidos, por exemplo, influencia a atividade biológica ou a regulagem do polipeptídeo.
[0397] Além disso, os mutantes que possuem um substrato modificado ou especificidade de produto podem ser preparados. Preferencialmente, tais mutantes mostram uma atividade aumentada. Alternativamente, os mutantes podem ser preparados pela atividade catalítica da qual é abolida sem perder atividade de ligação de substrato.
[0398] Adicionalmente, a introdução de mutações nos polinucleotídeos que codificam uma enzima conforme definido acima permitem que a taxa de expressão de gene e/ou a atividade das enzimas codificadas pelos ditos polinucleotídeos sejam reduzidas ou aumentadas.
[0399] Para modificar geneticamente as bactérias ou fungos, os polinucleotídeos que codificam uma enzima, conforme definido acima, ou partes dessas moléculas podem ser introduzidos em plasmídeos que permitem mutagênese ou modificação de sequência por recombinação de sequências de DNA. Os métodos padrão (consultar Sambrook e Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, EUA) permitem que trocas de base sejam realizadas ou sequências naturais ou sintéticas sejam adicionadas. Os fragmentos de DNA podem ser conectados entre si aplicando-se adaptadores e ligantes aos fragmentos. Além disso, as medidas de projeção que fornecem sítios de restrição adequados ou removem DNA excedente ou sítios de restrição podem ser usados. Nesses casos, em que inserções, deleções ou substituições são possíveis, mutagênese in vitro, “reparo de iniciador”, restrição ou ligação pode ser usado. Em geral, uma análise de sequência, análise de restrição e outros métodos de bioquímica e biologia molecular são executados como métodos de análise.
[0400] Desse modo, de acordo com a presente invenção, um micro-organismo recombinante pode ser produzido modificando-se geneticamente fungos ou bactérias que compreendem introduzir os polinucleotídeos descritos acima, moléculas de ácido nucleico ou vetores em um fungo ou bactéria.
[0401] O polinucleotídeo que codifica a respectiva enzima é expresso de modo a levar à produção de um polipeptídeo que tem qualquer uma das atividades descritas acima. Uma vista geral de sistemas de expressão diferentes é, por exemplo, contido em Methods in Enzymology 153 (1987), 385 a 516, em Bitter et al. (Methods in Enzymology 153 (1987), 516 a 544) e em Sawers et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 46 (1996), 1 a 9), Billman-Jacobe (Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 500 a 504), Hockney (Trends in Biotechnology 12 (1994), 456 a 463), Griffiths et al., (Methods in Molecular Biology 75 (1997), 427 a 440). Uma vista geral de sistemas de expressão de levedura é, por exemplo, dada por Hensing et al. (Antonie van Leuwenhoek 67 (1995), 261 a 279), Bussineau et al. (Developments in Biological Standardization 83 (1994), 13 a 19), Gellissen et al. (Antonie van Leuwenhoek 62 (1992), 79 a 93, Fleer (Current Opinion in Biotechnology 3 (1992), 486 a 496), Vedvick (Current Opinion in Biotechnology 2 (1991), 742 a 745) e Buckholz (Bio/Technology 9 (1991), 1.067 a 1.072).
[0402] Os vetores de expressão foram amplamente descritos na literatura. Como regra, os mesmos não contêm apenas um gene de marcador de seleção e uma origem de replicação que garante replicação no hospedeiro selecionado, como também um promotor bacteriano ou viral, e na maioria dos casos um sinal de terminação para transcrição. Entre o promotor e o sinal de terminação está, em geral, pelo menos um sítio de restrição ou um poliligante que possibilita a inserção de uma sequência de DNA de codificação. A sequência de DNA que controla naturalmente a transcrição do gene correspondente pode ser usada como a sequência promotora, se for ativa no organismo hospedeiro selecionado. Entretanto, essa sequência também pode ser trocada por outras sequências promotoras. É possível usar promotores que garantem a expressão constitutiva do gene e promotores induzíveis que permitem um controle deliberado da expressão do gene. As sequências de promotor bacteriano e viral que possuem essas propriedades são descritas em detalhes na literatura. As sequências reguladoras para a expressão em micro-organismos (por exemplo, E. coli, S. cerevisiae) são suficientemente descritas na literatura. Os promotores que permitem uma expressão particularmente alta de uma sequência a jusante são, por exemplo, o promotor T7 (Studier et al., Methods in Enzymology 185 (1990), 60 a 89), lacUV5, trp, trp-lacUV5 (DeBoer et al., em Rodriguez e Chamberlin (Eds), Promoters, Structure and Function; Praeger, Nova Iorque, (1982), 462 a 481; DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA (1983), 21 a 25), lp1, rac (Boros et al., Gene 42 (1986), 97 a 100). Os promotores induzíveis são preferencialmente usados para a síntese de polipeptídeos. Esses promotores levam frequentemente aos rendimentos de polipeptídeo mais altos do que os promotores constitutivos. A fim de obter uma quantidade otimizada de polipeptídeo, um processo de dois estágios é frequentemente usado. Primeiro, as células hospedeiras são cultivadas sob condições otimizadas até uma densidade de célula relativamente alta. Na segunda etapa, a transcrição é induzida dependendo do tipo de promotor usado. Em relação a isso, um promotor tac é particularmente adequado, o qual pode ser induzido por lactose ou IPTG (=isopropil-β-D- tiogalactopiranosida) (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 21 a 25). Os sinais de terminação para transcrição também são descritos na literatura.
[0403] A transformação da célula hospedeira com um polinucleotídeo ou vetor, conforme descrito acima, pode ser executada por métodos padrão, conforme, por exemplo, descrito em Sambrook e Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, EUA; Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990. A célula hospedeira é cultivada em meios de nutriente que satisfazem as necessidades da célula hospedeira particular usada, em particular, em relação ao valor de pH, temperatura, concentração salina, aeração, antibióticos, vitaminas, elementos-traço, etc.
OS ORGANISMOS RECOMBINANTES OU MICRO-ORGANISMOS QUE EXPRESSAM ENZIMAS DA ETAPA I E ETAPA II, E OPCIONALMENTE EXPRESSAM ADICIONALMENTE AS ENZIMAS DA ETAPA III, ETAPA IV E ETAPA V ASSIM COMO OPCIONALMENTE EXPRESSAM ADICIONALMENTE AS ENZIMAS DAS ETAPAS XIII, XIV E XV
[0404] A presente invenção também se refere a um organismo ou microorganismo recombinante que expressa (i) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente o ácido 3-metilcrotônico em isobuteno (etapa I, conforme mostrado na Figura 1); e (ii) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3- hidroxiisovalerato (HIV) em ácido 3-metilcrotônico (etapa II conforme mostrado na Figura 1).
[0405] Em uma modalidade preferida, a enzima com capacidade para converter ácido 3-metilcrotônico em isobuteno e uma ácido 3-metilcrotônico decarboxilase, conforme definido acima no presente documento.
[0406] Mais preferencialmente, a ácido 3-metilcrotônico decarboxilase é (i) uma decarboxilase dependente de FMN associada a uma prenil transferase de FMN; ou (ii) uma aconitato decarboxilase (EC 4.1.1.6); ou (iii) uma metilcrotonil-CoA carboxilase (EC 6.4.1.4); ou (iv) uma geranoil-CoA carboxilase (EC 6.4.1.5); ou (v) uma protocatecuato (PCA) decarboxilase (EC 4.1.1.63) conforme definido acima no presente documento.
[0407] Em outra modalidade preferida, esse organismo ou micro-organismo recombinante é um organismo ou micro-organismo recombinante, em que a ácido 3- metilcrotônico decarboxilase é selecionada a partir do grupo que consiste em: 6- metilsalicilato decarboxilase (EC 4.1.1.52), 2-oxo-3-hexenodioato decarboxilase (EC 4.1.1.77) e 5-oxopent-3-eno-1,2,5-tricarboxilato decarboxilase (EC 4.1.1.68).
[0408] Em relação à ácido 3-metilcrotônico decarboxilase, a decarboxilase dependente de FMN, a prenil transferase de FMN associada, a aconitato decarboxilase (EC 4.1.1.6), a metilcrotonil-CoA carboxilase (EC 6.4.1.4), e a geranoil- CoA carboxilase (EC 6.4.1.5), assim como modalidades preferidas da dita ácido 3- metilcrotônico decarboxilase, dita protocatecuato (PCA) decarboxilase (EC 4.1.1.63), dita decarboxilase dependente de FMN, dita prenil transferase de FMN associada, dita aconitato decarboxilase (EC 4.1.1.6), dita metilcrotonil-CoA carboxilase (EC 6.4.1.4) e dita geranoil-CoA carboxilase (EC 6.4.1.5), assim como a dita 6-metilsalicilato decarboxilase (EC 4.1.1.52), 2-oxo-3-hexenodioato decarboxilase (EC 4.1.1.77) e 5- oxopent-3-eno-1,2,5-tricarboxilato decarboxilase (EC 4.1.1.68), o mesmo se aplica ao organismo ou micro-organismo recombinante conforme estabelecido acima para os métodos de acordo com a presente invenção.
[0409] Em uma modalidade preferida, o organismo ou micro-organismo recombinante que expressa (i) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente ácido 3-metilcrotônico em isobuteno (etapa I conforme mostrado na Figura 1); e (ii) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3- hidroxiisovalerato (HIV) em ácido 3-metilcrotônico (etapa II conforme mostrado na Figura 1) é um organismo ou micro-organismo recombinante, em que a enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-hidroxiisovalerato (HIV) em ácido 3- metilcrotônico é uma hidro-liase (EC 4.2.-.-) conforme definido acima no presente documento, preferencialmente uma aconitase (EC 4.2.1.3), uma fumarase (EC 4.2.1.2) ou uma enoil-CoA hidratase/desidratase (EC 4.2.1.17) conforme definido acima no presente documento.
[0410] Em relação à hidro-liase (EC 4.2.-.-), a aconitase (EC 4.2.1.3), a fumarase (EC 4.2.1.2) e a enoil-CoA hidratase/desidratase (EC 4.2.1.17), assim como as modalidades preferidas da dita hidro-liase (EC 4.2.-.-), dita aconitase (EC 4.2.1.3), dita fumarase (EC 4.2.1.2) e dita enoil-CoA hidratase/desidratase (EC 4.2.1.17), o mesmo se aplica ao organismo ou micro-organismo recombinante conforme estabelecido acima para os métodos de acordo com a presente invenção.
[0411] Em um aspecto adicional, o organismo ou micro-organismo recombinante acima é um organismo ou micro-organismo que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para condensar enzimaticamente acetona e acetil-CoA em 3- hidroxiisovalerato (HIV) (etapa III conforme mostrado na Figura 1). Em uma modalidade preferida, a enzima com capacidade para condensar enzimaticamente acetona e acetil-CoA em 3-hidroxiisovalerato (HIV) é uma HMG CoA sintase (EC 2.3.3.10) ou uma proteína PksG ou uma enzima com a atividade de uma liase de clivagem/condensação de ligação C-C, como uma HMG CoA liase (EC 4.1.3.4) conforme definido acima no presente documento.
[0412] Em relação à HMG CoA sintase (EC 2.3.3.10), a PksG proteína, a enzima com a atividade de uma liase de clivagem/condensação de ligação C-C e a HMG CoA liase (EC 4.1.3.4) assim como as modalidades preferidas das ditas enzimas, o mesmo se aplica ao organismo ou micro-organismo recombinante, conforme estabelecido acima para os métodos de acordo com a presente invenção.
[0413] Em um aspecto adicional, o organismo ou micro-organismo recombinante acima é um organismo ou micro-organismo que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente acetoacetato em acetona (etapa IV conforme mostrado na Figura 1), preferencialmente uma acetoacetato decarboxilase (EC 4.1.1.4) conforme descrito acima no presente documento.
[0414] Em relação à dita enzima com capacidade para converter enzimaticamente acetoacetato em acetona e a dita acetoacetato decarboxilase (EC 4.1.1.4), assim como modalidades preferidas das ditas enzimas, o mesmo se aplica ao organismo ou micro-organismo recombinante, conforme estabelecido acima para os métodos de acordo com a presente invenção.
[0415] Em um aspecto adicional, o organismo ou micro-organismo recombinante acima é um organismo ou micro-organismo que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para converter acetoacetil-CoA em acetoacetato (etapa Va ou Vb conforme mostrado na Figura 1), preferencialmente (i) uma acetoacetil-CoA hidrolase (EC 3.1.2.11); ou (ii) uma enzima que tem capacidade para transferir o grupo CoA de acetoacetil-CoA para acetato conforme descrito acima no presente documento.
[0416] Em uma modalidade preferida, a enzima com capacidade para transferir o grupo CoA de acetoacetil-CoA em acetato é uma CoA transferase (EC 2.8.3.-), preferencialmente uma acetato CoA transferase (EC 2.8.3.8), conforme descrito acima no presente documento.
[0417] Em relação à dita enzima que tem capacidade para converter acetoacetil- CoA em acetoacetato, a dita acetoacetil-CoA hidrolase (EC 3.1.2.11), a dita enzima que tem capacidade para transferir o grupo CoA de acetoacetil-CoA, a CoA transferase (EC 2.8.3.-) e a dita acetato CoA transferase (EC 2.8.3.8), assim como as modalidades preferidas das ditas enzimas, o mesmo se aplica ao organismo ou microorganismo recombinante conforme estabelecido acima para os métodos de acordo com a presente invenção.
[0418] Em um aspecto adicional, o organismo ou micro-organismo recombinante acima é um organismo ou micro-organismo que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente acetil-CoA em acetoacetil-CoA que compreende (a) (i) uma enzima com capacidade para converter acetil-CoA em malonil- CoA (etapa XIV conforme mostrado na Figura 1); e (ii) uma enzima com capacidade para condensar malonil-CoA e acetil-CoA em acetoacetil-CoA (etapa XV conforme mostrado na Figura 1); ou (b) uma enzima com capacidade para condensar diretamente duas moléculas de acetil-CoA em acetoacetil-CoA (etapa XIII conforme mostrado na Figura 1).
[0419] Em uma modalidade preferida, a enzima com capacidade para converter acetil-CoA em malonil-CoA é uma acetil-CoA carboxilase (EC 6.4.1.2), conforme descrito acima no presente documento.
[0420] Em outra modalidade preferida, a enzima com capacidade para condensar malonil-CoA e acetil-CoA em acetoacetil-CoA é uma acetoacetil-CoA sintetase (EC 2.3.1.194), conforme descrito acima no presente documento.
[0421] Em uma modalidade preferida, a enzima com capacidade para condensar duas moléculas de acetil-CoA em acetoacetil-CoA é uma acetil-CoA C- acetiltransferase (EC 2.3.1.9), conforme descrito acima no presente documento.
[0422] Em relação à enzima que tem capacidade para converter acetil-CoA em malonil-CoA, a enzima com capacidade para condensar malonil-CoA e acetil-CoA em acetoacetil-CoA, a acetil-CoA carboxilase (EC 6.4.1.2), a acetoacetil-CoA sintetase (EC 2.3.1.194), a enzima com capacidade para condensar diretamente duas moléculas de acetil-CoA em acetoacetil-CoA e a acetil-CoA C-acetiltransferase (EC 2.3.1.9), assim como as modalidades preferidas das ditas enzimas, o mesmo se aplica ao organismo ou micro-organismo recombinante conforme estabelecido acima para os métodos de acordo com a presente invenção.
ORGANISMOS OU MICRO-ORGANISMOS RECOMBINANTES QUE EXPRESSAM ENZIMAS DA ETAPA I E ETAPA VI, E OPCIONALMENTE EXPRESSAM ADICIONALMENTE AS ENZIMAS DA ETAPA VII, ETAPA VIII E ETAPA IX ASSIM COMO OPCIONALMENTE EXPRESSAM ADICIONALMENTE AS ENZIMAS DAS ETAPAS XIII, XIV E XV
[0423] A presente invenção também se refere a um organismo ou microorganismo recombinante que expressa (i) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente ácido 3-metilcrotônico em isobuteno (etapa I conforme mostrado na Figura 1); e (ii) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3- metilcrotonil-CoA em ácido 3-metilcrotônico (etapa VIa, VIb ou VIc conforme mostrado na Figura 1).
[0424] Em uma modalidade preferida, a enzima com capacidade para converter ácido 3-metilcrotônico em isobuteno é uma ácido 3-metilcrotônico decarboxilase, preferencialmente (i) uma decarboxilase dependente de FMN associada a uma prenil transferase de FMN; ou (ii) uma aconitato decarboxilase (EC 4.1.1.6); ou (iii) uma metilcrotonil-CoA carboxilase (EC 6.4.1.4); ou (iv) uma geranoil-CoA carboxilase (EC 6.4.1.5); ou (v) uma protocatecuato (PCA) decarboxilase (EC 4.1.1.63) conforme definido acima no presente documento.
[0425] Em relação à ácido 3-metilcrotônico decarboxilase, a decarboxilase dependente de FMN, a prenil transferase de FMN associada, a aconitato decarboxilase (EC 4.1.1.6), a metilcrotonil-CoA carboxilase (EC 6.4.1.4), a (v) protocatecuato (PCA) decarboxilase (EC 4.1.1.63) e a geranoil-CoA carboxilase (EC 6.4.1.5), assim como modalidades preferidas das ditas enzimas, o mesmo se aplica ao organismo ou micro-organismo recombinante conforme estabelecido acima para os métodos de acordo com a presente invenção.
[0426] Em uma modalidade preferida, a enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metilcrotonil-CoA em ácido 3-metilcrotônico é (a) uma enzima com capacidade para converter diretamente 3-metilcrotonil- CoA em ácido 3-metilcrotônico em que a dita enzima com capacidade para converter diretamente 3-metilcrotonil-CoA em ácido 3-metilcrotônico é uma CoA transferase (EC 2.8.3.-), preferencialmente uma propionato:acetato-CoA transferase (EC 2.8.3.1), uma acetato CoA-transferase (EC 2.8.3.8) ou uma succinil-CoA:acetato CoA-transferase (EC 2.8.3.18) (etapa VIa conforme mostrado na Figura 1) conforme descrito acima no presente documento; ou (b) uma enzima com capacidade para converter diretamente 3-metilcrotonil- CoA em ácido 3-metilcrotônico em que a dita enzima com capacidade para converter diretamente 3-metilcrotonil-CoA em ácido 3-metilcrotônico é uma tioéster hidrolase (EC 3.1.2.-), preferencialmente acetil-CoA hidrolase (EC 3.1.2.1), uma acil-CoA hidrolase de cadeia curta dependente de ADP (EC 3.1.2.18) ou uma acil-CoA hidrolase (EC 3.1.2.20) (etapa VIb conforme mostrado na Figura 1) conforme descrito acima no presente documento.
[0427] Em outra modalidade preferida, o organismo ou micro-organismo recombinante é um organismo ou micro-organismo recombinante que expressa as duas enzimas a seguir, a saber (c) (i) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3- metilcrotonil-CoA em fosfato de 3-metilcrotonila, conforme descrito acima no presente documento; e (ii) uma enzima com capacidade para converter fosfato de 3-metilcrotonila em ácido 3-metilcrotônico (etapa VIc conforme mostrado na Figura 1) conforme descrito acima no presente documento. Em uma modalidade preferida, a enzima com capacidade para converter 3- metilcrotonil-CoA em fosfato de 3-metilcrotonila é uma fosfato butiriltransferase (EC 2.3.1.19) ou uma fosfato acetiltransferase (EC 2.3.1.8) e a enzima com capacidade para converter fosfato de 3-metilcrotonila em ácido 3-metilcrotônico é uma fosfotransferase com um grupo carbóxi como aceitante (EC 2.7.2.-), preferencialmente uma propionato quinase (EC 2.7.2.15), uma acetato quinase (EC 2.7.2.1), uma butirato quinase (EC 2.7.2.7) ou uma ácido graxo de cadeia ramificada quinase (EC 2.7.2.14) conforme descrito acima no presente documento.
[0428] Em relação às enzimas mencionadas acima, o mesmo se aplica ao organismo ou micro-organismo recombinante, conforme estabelecido acima para os métodos de acordo com a presente invenção.
[0429] Em um aspecto adicional, o organismo ou micro-organismo recombinante acima é um organismo ou micro-organismo que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metilglutaconil-CoA em 3- metilcrotonil-CoA (etapa VII conforme mostrado na Figura 1), preferencialmente (i) uma metilcrotonil-CoA carboxilase (EC 6.4.1.4); ou (ii) uma geranoil-CoA carboxilase (EC 6.4.1.5) conforme descrito acima no presente documento.
[0430] Em relação às ditas enzimas, assim como modalidades preferidas das ditas enzimas, o mesmo se aplica ao organismo ou micro-organismo recombinante, conforme estabelecido acima para os métodos de acordo com a presente invenção.
[0431] Em um aspecto adicional, o organismo ou micro-organismo recombinante acima é um organismo ou micro-organismo que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA em 3- metilglutaconil-CoA (etapa VIII conforme mostrado na Figura 1), preferencialmente uma 3-metilglutaconil-coenzima A hidratase (EC 4.2.1.18), uma 3-hidroxiacil-CoA desidratase (EC 4.2.1.-) ou uma enoil-CoA hidratase (EC 4.2.1.-).
[0432] Em relação à dita enzimas, assim como modalidades preferidas das ditas enzimas, o mesmo se aplica ao organismo ou micro-organismo recombinante, conforme estabelecido acima para os métodos de acordo com a presente invenção.
[0433] Em um aspecto adicional, o organismo ou micro-organismo recombinante acima é um organismo ou micro-organismo que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para condensar enzimaticamente acetoacetil-CoA e acetil-CoA em 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (etapa IX conforme mostrado na Figura 1), preferencialmente uma 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA sintase.
[0434] Em relação à dita enzimas, assim como modalidades preferidas da dita enzima, o mesmo se aplica ao organismo ou micro-organismo recombinante, conforme estabelecido acima para os métodos de acordo com a presente invenção.
[0435] Em um aspecto adicional, o organismo ou micro-organismo recombinante acima que expressa (i) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente ácido 3-metilcrotônico em isobuteno (etapa I conforme mostrado na Figura 1); e (ii) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metilcrotonil-CoA em ácido 3-metilcrotônico (etapa VIa, VIb ou VIc conforme mostrado na Figura 1) (e opcionalmente expressar adicionalmente uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metilglutaconil-CoA em 3-metilcrotonil-CoA e opcionalmente expressar adicionalmente uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-hidroxi3-metilglutaril-CoA em 3-metilgutaconil-CoA e opcionalmente expressar adicionalmente uma enzima com capacidade para condensar enzimaticamente acetoacetil-CoA e acetil-CoA em 3-hidroxi-3-metilglutaril- CoA) é preferencialmente um organismo ou micro-organismo que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente acetil- CoA em acetoacetil-CoA que compreende uma enzima com capacidade para condensar diretamente duas moléculas de acetil-CoA em acetoacetil-CoA (etapa XIII conforme mostrado na Figura 1).
[0436] Em outra modalidade preferida, o organismo ou micro-organismo recombinante é um organismo ou micro-organismo recombinante que expressa as duas enzimas a seguir, a saber (i) uma enzima com capacidade para converter acetil-CoA em malonil-CoA (etapa XIV conforme mostrado na Figura 1); e (ii) uma enzima com capacidade para condensar malonil-CoA e acetil-CoA em acetoacetil-CoA (etapa XV conforme mostrado na Figura 1).
[0437] Em uma modalidade preferida, a enzima com capacidade para converter acetil-CoA em malonil-CoA é uma acetil-CoA carboxilase (EC 6.4.1.2), conforme descrito acima no presente documento.
[0438] Em outra modalidade preferida, a enzima com capacidade para condensar malonil-CoA e acetil-CoA em acetoacetil-CoA é uma acetoacetil-CoA sintetase (EC 2.3.1.194), conforme descrito acima no presente documento.
[0439] Em uma modalidade preferida, a enzima com capacidade para condensar duas moléculas de acetil-CoA em acetoacetil-CoA é uma acetil-CoA C- acetiltransferase (EC 2.3.1.9), conforme descrito acima no presente documento.
[0440] Em relação às enzimas mencionadas acima, assim como as modalidades preferidas das ditas enzimas, o mesmo se aplica ao organismo ou micro-organismo recombinante conforme estabelecido acima para os métodos de acordo com a presente invenção.
ORGANISMOS OU MICRO-ORGANISMOS RECOMBINANTES DA ROTA ALTERNATIVA PARA A CONVERSÃO ENZIMÁTICA DE ACETIL-COA EM ISOBUTENO POR MEIO DE 3-METIL-3-BUTENOIL-COA E ÁCIDO 3-METIL-3- BUTENÓICO: ORGANISMOS OU MICRO-ORGANISMOS RECOMBINANTES QUE EXPRESSAM ENZIMAS DA ETAPA XVI E ETAPA XVII, E OPCIONALMENTE EXPRESSAM ADICIONALMENTE ENZIMAS DA ETAPA XVIII, ETAPA VIII E ETAPA IX ASSIM COMO OPCIONALMENTE EXPRESSAM ADICIONALMENTE ENZIMAS DAS ETAPAS XIII, XIV E XV
[0441] Conforme mencionado acima, em uma alternativa à primeira rota acima para a produção de isobuteno por meio de ácido 3-metilcrotônico, a presente invenção também se refere a um método para a produção de isobuteno por meio de uma rota alternativa em que isobuteno é produzido pela conversão enzimática de ácido 3-metil- 3-butenóico em isobuteno. A seguir, os organismos ou micro-organismos recombinantes dessa rota alternativa para a conversão enzimática de acetil-CoA em isobuteno por meio de 3-metil-3-butenoil-CoA e ácido 3-metil-3-butenóico são descritos.
[0442] A presente invenção também se refere a um organismo ou microorganismo recombinante que expressa (i) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente ácido 3-metil-3-butenóico em isobuteno (etapa XVI conforme mostrado na Figura 1) e (ii) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metil-3-butenoil-CoA em ácido 3-metil-3-butenóico (etapa XVII conforme mostrado na Figura 1).
[0443] Em uma modalidade preferida, a enzima com capacidade para converter enzimaticamente ácido 3-metil-3-butenóico em isobuteno é uma ácido 3-metil-3- butenóico decarboxilase conforme descrito acima no presente documento, mais preferencialmente (i) uma decarboxilase dependente de FMN associada a uma prenil transferase de FMN; ou (ii) uma aconitato decarboxilase (EC 4.1.1.6); ou (iii) uma metilcrotonil-CoA carboxilase (EC 6.4.1.4); ou (iv) uma geranoil-CoA carboxilase (EC 6.4.1.5); ou (v) uma protocatecuato (PCA) decarboxilase (EC 4.1.1.63) conforme descrito acima no presente documento.
[0444] Em outra modalidade preferida, a ácido 3-metil-3-butenóico decarboxilase é selecionada a partir do grupo que consiste em 6-metilsalicilato decarboxilase (EC 4.1.1.52), 2-oxo-3-hexenodioato decarboxilase (EC 4.1.1.77) e 5-oxopent-3-eno- 1,2,5-tricarboxilato decarboxilase (EC 4.1.1.68) conforme descrito acima no presente documento.
[0445] Em relação às enzimas mencionadas acima, assim como modalidades preferidas das ditas enzimas, o mesmo se aplica ao organismo ou micro-organismo recombinante conforme estabelecido acima para os métodos de acordo com a presente invenção.
[0446] Em uma modalidade preferida, a enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metil-3-butenoil-CoA em ácido 3-metil-3-butenóico é (a) uma enzima com capacidade para converter diretamente 3-metil-3- butenoil-CoA em ácido 3-metil-3-butenóico, em que a dita enzima com capacidade para converter diretamente 3-metil-3-butenoil-CoA em ácido 3-metil-3-butenóico é uma CoA transferase (EC 2.8.3.-), preferencialmente uma propionato:acetato-CoA transferase (EC 2.8.3.1), uma acetato CoA-transferase (EC 2.8.3.8) ou uma succinil- CoA:acetato CoA-transferase (EC 2.8.3.18) (etapa XVIIa conforme mostrado na Figura 1) conforme descrito acima no presente documento.
[0447] Em outra modalidade preferida, o organismo ou micro-organismo recombinante é um organismo ou micro-organismo recombinante que expressa as duas enzimas a seguir, a saber (b) uma enzima com capacidade para converter diretamente 3-metil-3- butenoil-CoA em ácido 3-metil-3-butenóico, em que a dita enzima com capacidade para converter diretamente 3-metil-3-butenoil-CoA em ácido 3-metil-3-butenóico é uma tioéster hidrolase (EC 3.1.2.-), preferencialmente acetil-CoA hidrolase (EC 3.1.2.1), uma acil-CoA hidrolase de cadeia curta dependente de ADP (EC 3.1.2.18) ou uma acil-CoA hidrolase (EC 3.1.2.20) (etapa XVIIb conforme mostrado na Figura 1) conforme descrito acima no presente documento; ou (c) (i) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3- metil-3-butenoil-CoA em 3-metil-3-butenoil fosfato; e (11) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metil- 3-butenoil fosfato no dito ácido 3-metil-3-butenóico (etapa XVIIc conforme mostrado na Figura 1) conforme descrito acima no presente documento.
[0448] Em uma modalidade preferida, a enzima com capacidade para converter enzimaticamente o dito 3-metil-3-butenoil-CoA em fosfato de 3-metil-3-butenoila é uma fosfato butiriltransferase (EC 2.3.1.19) ou uma fosfato acetiltransferase (EC 2.3.1.8) e a enzima com capacidade para converter enzimaticamente fosfato de 3- metil-3-butenoila em ácido 3-metil-3-butenóico é uma fosfotransferase com um grupo carbóxi como aceitante (EC 2.7.2.-), preferencialmente uma propionato quinase (EC 2.7.2.15), uma acetato quinase (EC 2.7.2.1), uma butirato quinase (EC 2.7.2.7) ou uma ácido graxo de cadeia ramificada quinase (EC 2.7.2.14) conforme descrito acima no presente documento.
[0449] Em relação às enzimas mencionadas acima, assim como modalidades preferidas das ditas enzimas, o mesmo se aplica ao organismo ou micro-organismo recombinante conforme estabelecido acima para os métodos de acordo com a presente invenção.
[0450] Em um aspecto adicional, o organismo ou micro-organismo recombinante acima é um organismo ou micro-organismo que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metilglutaconil-CoA em 3-metil-3- butenoil-CoA (etapa XVIII conforme mostrado na Figura 1), preferencialmente (a) (i) uma metilcrotonil-CoA carboxilase (EC 6.4.1.4); ou (ii) uma geranoil- CoA carboxilase (EC 6.4.1.5), ou (b) um domínio N-terminal de CurF a partir de proteína multifuncional de Lynbya majuscula ou uma 3-metilglutaconil-CoA decarboxilase, preferencialmente uma 3-metilglutaconil-CoA decarboxilase de Myxococcus xanthus codificada pelo gene liuB; ou (c) uma enzima da família de 4-oxalocrotonato decarboxilase, conforme descrito acima no presente documento.
[0451] Em relação às enzimas mencionadas acima, assim como modalidades preferidas das ditas enzimas, o mesmo se aplica ao organismo ou micro-organismo recombinante conforme estabelecido acima para os métodos de acordo com a presente invenção.
[0452] Em um aspecto adicional, o organismo ou micro-organismo recombinante acima é um organismo ou micro-organismo que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA em 3- metilglutaconil-CoA (etapa VIII conforme mostrado na Figura 1), preferencialmente uma 3-metilglutaconil-coenzima A hidratase (EC 4.2.1.18), uma 3-hidroxiacil-CoA desidratase (EC 4.2.1.-) ou uma enoil-CoA hidratase (EC 4.2.1.-).
[0453] Em relação à enzima mencionada acima, assim como modalidades preferidas da dita enzima, o mesmo se aplica ao organismo ou micro-organismo recombinante conforme estabelecido acima para os métodos de acordo com a presente invenção.
[0454] Em um aspecto adicional, o organismo ou micro-organismo recombinante acima é um organismo ou micro-organismo que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para condensar enzimaticamente acetoacetil-CoA e acetil-CoA em 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (etapa IX conforme mostrado na Figura 1).
[0455] Em uma modalidade preferida, a enzima com capacidade para condensar enzimaticamente acetoacetil-CoA e acetil-CoA em 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA é uma 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA sintase.
[0456] Em relação à enzima supracitada, assim como modalidades preferidas da dita enzima, o mesmo se aplica ao organismo ou micro-organismo recombinante conforme estabelecido acima para os métodos de acordo com a presente invenção.
[0457] Em um aspecto adicional, o organismo ou micro-organismo recombinante acima é um organismo ou micro-organismo que expressa adicionalmente uma enzima ou diversas enzimas com capacidade para converter enzimaticamente acetil-CoA em acetoacetil-CoA.
[0458] Em uma modalidade preferida, o organismo ou micro-organismo recombinante expressa uma combinação de enzimas, a saber (i) uma enzima com capacidade para converter acetil-CoA em malonil-CoA (etapa XIV conforme mostrado na Figura 1); e (ii) uma enzima com capacidade para condensar malonil-CoA e acetil-CoA em acetoacetil-CoA (etapa XV conforme mostrado na Figura 1).
[0459] Em uma modalidade alternativa, o organismo ou micro-organismo recombinante expressa uma enzima com capacidade para condensar diretamente duas moléculas de acetil-CoA em acetoacetil-CoA (etapa XIII conforme mostrado na Figura 1).
[0460] Em relação à primeira modalidade mencionada acima, a enzima com capacidade para converter acetil-CoA em malonil-CoA é preferencialmente uma acetil- CoA carboxilase (EC 6.4.1.2) conforme descrito acima no presente documento.
[0461] Além disso, a enzima com capacidade para condensar malonil-CoA e acetil-CoA em acetoacetil-CoA é uma acetoacetil-CoA sintetase (EC 2.3.1.194) conforme descrito acima no presente documento.
[0462] Em relação à segunda modalidade mencionada acima, a enzima com capacidade para condensar diretamente duas moléculas de acetil-CoA em acetoacetil-CoA é preferencialmente uma acetil-CoA C-acetiltransferase (EC 2.3.1.9), conforme descrito acima no presente documento.
[0463] Em relação às enzimas mencionadas acima, assim como as modalidades preferidas das ditas enzimas, o mesmo se aplica ao organismo ou micro-organismo recombinante conforme estabelecido acima para os métodos de acordo com a presente invenção.
ORGANISMOS OU MICRO-ORGANISMOS RECOMBINANTES QUE EXPRESSAM ENZIMAS DAS VIAS ADICIONAIS/SUPLEMENTARES DAS ETAPAS XA, XB, XI E XII
[0464] Conforme mencionado acima, os métodos descritos acima da presente invenção para produzir isobuteno a partir de acetil-CoA podem ser suplementados por uma ou mais dentre as reações, conforme mostrado na etapa Xa, etapa Xb, etapa XI e etapa XII da Figura 18 e conforme descrito em detalhes acima no presente documento.
[0465] Desse modo, em um aspecto adicional, a presente invenção se refere a qualquer um dentre o organismo ou micro-organismo recombinante descrito acima, em que o organismo ou micro-organismo expressa adicionalmente a) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3- hidroxiisovalerato (HIV) em ácido 3-metilcrotônico com uma transferência concomitante de CoA a partir de 3-metilcrotonil-CoA em 3-hidroxiisovalerato (HIV) para resultar em 3-hidroxiisovaleril-CoA (etapa Xa conforme esquematicamente mostrado na Figura 19); e/ou b) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3- hidroxiisovalerato (HIV) em 3-hidroxiisovaleril-CoA (etapa Xb conforme esquematicamente mostrado na Figura 20); e/ou c) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3- hidroxiisovaleril-CoA em 3-metilcrotonil-CoA (etapa XI conforme esquematicamente mostrado na Figura 21); e/ou d) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3- hidroxiisovalerato (HIV) em 3-hidroxiisovaleril-CoA (etapa XII conforme esquematicamente mostrado na Figura 22) conforme descrito acima no presente documento.
[0466] Em relação às enzimas mencionadas acima, assim como modalidades preferidas das ditas enzimas, o mesmo se aplica ao organismo ou micro-organismo recombinante conforme estabelecido acima para os métodos de acordo com a presente invenção.
[0467] O micro-organismo acima é preferencialmente uma bactéria, uma levedura ou um fungo. Em outra modalidade preferida, o organismo é uma planta ou um animal não humano. Em relação a outras modalidades preferidas da bactéria, organismo ou micro-organismo recombinante, o mesmo se aplica conforme estabelecido acima em conexão com os métodos de acordo com a presente invenção.
[0468] A presente invenção também se refere ao uso de qualquer um dentre os organismos ou micro-organismos recombinantes descritos acima para a produção de isobuteno. Desse modo, a presente invenção se refere adicionalmente ao uso de um organismo ou micro-organismo recombinante para a produção de isobuteno, em que o dito organismo ou micro-organismo recombinante expressa (i) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente ácido 3-metilcrotônico em isobuteno (etapa I conforme mostrado na Figura 1); e (ii) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-hidroxiisovalerato (HIV) em ácido 3-metilcrotônico (etapa II conforme mostrado na Figura 1).
[0469] Em outra modalidade preferida, a presente invenção se refere ao uso de um organismo ou micro-organismo recombinante para a produção de isobuteno, em que o dito organismo ou micro-organismo recombinante expressa (i) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente ácido 3-metilcrotônico em isobuteno (etapa I conforme mostrado na Figura 1); e (ii) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-hidroxiisovalerato (HIV) em ácido 3-metilcrotônico (etapa II conforme mostrado na Figura 1) que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para condensar enzimaticamente acetona e acetil-CoA em 3- hidroxiisovalerato (HIV) (etapa III conforme mostrado na Figura 1).
[0470] Em outra modalidade preferida, a presente invenção se refere ao uso de um organismo ou micro-organismo recombinante para a produção de isobuteno, em que o dito organismo ou micro-organismo recombinante expressa (i) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente ácido 3-metilcrotônico em isobuteno (etapa I conforme mostrado na Figura 1); e (ii) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-hidroxiisovalerato (HIV) em ácido 3-metilcrotônico (etapa II conforme mostrado na Figura 1), que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para condensar enzimaticamente acetona e acetil-CoA em 3- hidroxiisovalerato (HIV) (etapa III conforme mostrado na Figura 1) e que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente acetoacetato em acetona (etapa IV conforme mostrado na Figura 1).
[0471] Em outra modalidade preferida, a presente invenção se refere ao uso de um organismo ou micro-organismo recombinante para a produção de isobuteno, em que o dito organismo ou micro-organismo recombinante expressa (i) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente ácido 3-metilcrotônico em isobuteno (etapa I conforme mostrado na Figura 1); e (ii) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-hidroxiisovalerato (HIV) em ácido 3-metilcrotônico (etapa II conforme mostrado na Figura 1), que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para condensar enzimaticamente acetona e acetil-CoA em 3- hidroxiisovalerato (HIV) (etapa III conforme mostrado na Figura 1), que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente acetoacetato em acetona (etapa IV conforme mostrado na Figura 1) e que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para converter acetoacetil-CoA em acetoacetato (etapa Va ou Vb conforme mostrado na Figura 1).
[0472] Em outra modalidade preferida, a presente invenção se refere ao uso de um organismo ou micro-organismo recombinante para a produção de isobuteno, em que o dito organismo ou micro-organismo recombinante expressa (i) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente ácido 3-metilcrotônico em isobuteno (etapa I conforme mostrado na Figura 1); e (ii) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-hidroxiisovalerato (HIV) em ácido 3-metilcrotônico (etapa II conforme mostrado na Figura 1), que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para condensar enzimaticamente acetona e acetil-CoA em 3- hidroxiisovalerato (HIV) (etapa III conforme mostrado na Figura 1), que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente acetoacetato em acetona (etapa IV conforme mostrado na Figura 1), que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para converter acetoacetil-CoA em acetoacetato (etapa Va ou Vb conforme mostrado na Figura 1) e que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente acetil- CoA em acetoacetil-CoA que compreende (a) (i) uma enzima com capacidade para converter acetil-CoA em malonil-CoA (etapa XIV conforme mostrado na Figura 1); e (ii) uma enzima com capacidade para condensar malonil-CoA e acetil-CoA em acetoacetil-CoA (etapa XV conforme mostrado na Figura 1); ou (b) uma enzima com capacidade para condensar diretamente duas moléculas de acetil-CoA em acetoacetil-CoA (etapa XIII conforme mostrado na Figura 1).
[0473] Em uma modalidade mais preferida, a presente invenção se refere a qualquer um dos usos acima de organismos ou micro-organismos recombinantes para a produção de isobuteno em que o dito organismo ou micro-organismo recombinante expressa uma enzima que catalisa a conversão enzimática de ácido 3-metilcrotônico em isobuteno.
[0474] Em relação às enzimas mencionadas acima, assim como modalidades preferidas das ditas enzimas, o mesmo se aplica ao uso do organismo ou microorganismo recombinante para a produção de isobuteno conforme estabelecido acima para os métodos e organismos ou micro-organismos recombinantes de acordo com a presente invenção.
[0475] A presente invenção se refere adicionalmente o uso de um organismo ou micro-organismo recombinante para a produção de isobuteno, em que o dito organismo ou micro-organismo recombinante expressa (i) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente ácido 3-metilcrotônico em isobuteno (etapa I conforme mostrado na Figura 1); e (ii) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metilcrotonil-CoA em ácido 3-metilcrotônico (etapa VIa, VIb ou VIc conforme mostrado na Figura 1).
[0476] Em outra modalidade preferida, a presente invenção se refere ao uso de um organismo ou micro-organismo recombinante para a produção de isobuteno, em que o dito organismo ou micro-organismo recombinante expressa (i) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente ácido 3-metilcrotônico em isobuteno (etapa I conforme mostrado na Figura 1); e (ii) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metilcrotonil-CoA em ácido 3-metilcrotônico (etapa VIa, VIb ou VIc conforme mostrado na Figura 1) e que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metilglutaconil-CoA em 3- metilcrotonil-CoA (etapa VII conforme mostrado na Figura 1).
[0477] Em outra modalidade preferida, a presente invenção se refere ao uso de um organismo ou micro-organismo recombinante para a produção de isobuteno, em que o dito organismo ou micro-organismo recombinante expressa (i) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente ácido 3-metilcrotônico em isobuteno (etapa I conforme mostrado na Figura 1); e (ii) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metilcrotonil-CoA em ácido 3-metilcrotônico (etapa VIa, VIb ou VIc conforme mostrado na Figura 1), que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metilglutaconil-CoA em 3- metilcrotonil-CoA (etapa VII conforme mostrado na Figura 1) e que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3- hidroxi-3-metilglutaril-CoA em 3-metilglutaconil-CoA (etapa VIII conforme mostrado na Figura 1).
[0478] Em outra modalidade preferida, a presente invenção se refere ao uso de um organismo ou micro-organismo recombinante para a produção de isobuteno, em que o dito organismo ou micro-organismo recombinante expressa (i) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente ácido 3-metilcrotônico em isobuteno (etapa I conforme mostrado na Figura 1); e (ii) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metilcrotonil-CoA em ácido 3-metilcrotônico (etapa VIa, VIb ou VIc conforme mostrado na Figura 1), que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metilglutaconil-CoA em 3- metilcrotonil-CoA (etapa VII conforme mostrado na Figura 1), que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3- hidroxi-3-metilglutaril-CoA em 3-metilglutaconil-CoA (etapa VIII conforme mostrado na Figura 1) e que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para condensar enzimaticamente acetoacetil-CoA e acetil-CoA em 3-hidroxi-3-metilglutaril- CoA (etapa IX conforme mostrado na Figura 1).
[0479] Em outra modalidade preferida, a presente invenção se refere ao uso de um organismo ou micro-organismo recombinante para a produção de isobuteno, em que o dito organismo ou micro-organismo recombinante expressa (i) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente ácido 3-metilcrotônico em isobuteno (etapa I conforme mostrado na Figura 1); e (ii) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metilcrotonil-CoA em ácido 3-metilcrotônico (etapa VIa, VIb ou VIc conforme mostrado na Figura 1), que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metilglutaconil-CoA em 3- metilcrotonil-CoA (etapa VII conforme mostrado na Figura 1), que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3- hidroxi-3-metilglutaril-CoA em 3-metilglutaconil-CoA (etapa VIII conforme mostrado na Figura 1), que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para condensar enzimaticamente acetoacetil-CoA e acetil-CoA em 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (etapa IX conforme mostrado na Figura 1) e que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente acetil-CoA em acetoacetil-CoA que compreende (a) (i) uma enzima com capacidade para converter acetil-CoA em malonil-CoA (etapa XIV conforme mostrado na Figura 1); e (ii) uma enzima com capacidade para condensar malonil-CoA e acetil-CoA em acetoacetil-CoA (etapa XV conforme mostrado na Figura 1); ou (b) uma enzima com capacidade para condensar diretamente duas moléculas de acetil-CoA em acetoacetil-CoA (etapa XIII conforme mostrado na Figura 1).
[0480] Em uma modalidade mais preferida, a presente invenção se refere a qualquer um dos usos acima de organismos ou micro-organismos recombinantes para a produção de isobuteno em que o dito organismo ou micro-organismo recombinante expressa uma enzima que catalisa a conversão enzimática de ácido 3-metilcrotônico em isobuteno.
[0481] Em relação às enzimas mencionadas acima, assim como modalidades preferidas das ditas enzimas, o mesmo se aplica ao uso do organismo ou microorganismo recombinante para a produção de isobuteno conforme estabelecido acima para os métodos e organismos ou micro-organismos recombinantes de acordo com a presente invenção.
[0482] A presente invenção se refere adicionalmente ao uso de um organismo ou micro-organismo recombinante para a produção de isobuteno, em que o dito organismo ou micro-organismo recombinante expressa (i) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente ácido 3-metil-3-butenóico em isobuteno (etapa XVI conforme mostrado na Figura 1) e (ii) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metil-3-butenoil-CoA em ácido 3-metil-3-butenóico (etapa XVII conforme mostrado na Figura 1).
[0483] Em outra modalidade preferida, a presente invenção se refere ao uso de um organismo ou micro-organismo recombinante para a produção de isobuteno, em que o dito organismo ou micro-organismo recombinante expressa (i) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente ácido 3-metil-3-butenóico em isobuteno (etapa XVI conforme mostrado na Figura 1) e (ii) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metil-3-butenoil-CoA em ácido 3-metil-3-butenóico (etapa XVII conforme mostrado na Figura 1) e que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metilglutaconil-CoA em 3- metil-3-butenoil-CoA (etapa XVIII conforme mostrado na Figura 1).
[0484] Em outra modalidade preferida, a presente invenção se refere ao uso de um organismo ou micro-organismo recombinante para a produção de isobuteno, em que o dito organismo ou micro-organismo recombinante expressa (i) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente ácido 3-metil-3-butenóico em isobuteno (etapa XVI conforme mostrado na Figura 1) e (ii) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metil-3-butenoil-CoA em ácido 3-metil-3-butenóico (etapa XVII conforme mostrado na Figura 1), que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metilglutaconil-CoA em 3- metil-3-butenoil-CoA (etapa XVIII conforme mostrado na Figura 1) e que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3- hidroxi-3-metilglutaril-CoA em 3-metilglutaconil-CoA (etapa VIII conforme mostrado na Figura 1).
[0485] Em outra modalidade preferida, a presente invenção se refere ao uso de um organismo ou micro-organismo recombinante para a produção de isobuteno, em que o dito organismo ou micro-organismo recombinante expressa (i) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente ácido 3-metil-3-butenóico em isobuteno (etapa XVI conforme mostrado na Figura 1) e (ii) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metil-3-butenoil-CoA em ácido 3-metil-3-butenóico (etapa XVII conforme mostrado na Figura 1), que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metilglutaconil-CoA em 3- metil-3-butenoil-CoA (etapa XVIII conforme mostrado na Figura 1), que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3- hidroxi-3-metilglutaril-CoA em 3-metilglutaconil-CoA (etapa VIII conforme mostrado na Figura 1) e que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para condensar enzimaticamente acetoacetil-CoA e acetil-CoA em 3-hidroxi-3-metilglutaril- CoA (etapa IX conforme mostrado na Figura 1).
[0486] Em outra modalidade preferida, a presente invenção se refere ao uso de um organismo ou micro-organismo recombinante para a produção de isobuteno, em que o dito organismo ou micro-organismo recombinante expressa (i) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente ácido 3-metil-3-butenóico em isobuteno (etapa XVI conforme mostrado na Figura 1) e (ii) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metil-3-butenoil-CoA em ácido 3-metil-3-butenóico (etapa XVII conforme mostrado na Figura 1), que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metilglutaconil-CoA em 3- metil-3-butenoil-CoA (etapa XVIII conforme mostrado na Figura 1), que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3- hidroxi-3-metilglutaril-CoA em 3-metilglutaconil-CoA (etapa VIII conforme mostrado na Figura 1), que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para condensar enzimaticamente acetoacetil-CoA e acetil-CoA em 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (etapa IX conforme mostrado na Figura 1) e que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente acetil-CoA em acetoacetil-CoA que compreende (a) (i) uma enzima com capacidade para converter acetil-CoA em malonil-CoA (etapa XIV conforme mostrado na Figura 1); e (ii) uma enzima com capacidade para condensar malonil-CoA e acetil-CoA em acetoacetil-CoA (etapa XV conforme mostrado na Figura 1); ou (b) uma enzima com capacidade para condensar diretamente duas moléculas de acetil-CoA em acetoacetil-CoA (etapa XIII conforme mostrado na Figura 1).
[0487] Em uma modalidade mais preferida, a presente invenção se refere a qualquer um dos usos acima de organismos ou micro-organismos recombinantes para a produção de isobuteno em que o dito organismo ou micro-organismo recombinante expressa uma enzima que catalisa a conversão enzimática de ácido 3-metil-3- butenóico em isobuteno.
[0488] Em relação às enzimas mencionadas acima, assim como modalidades preferidas das ditas enzimas, o mesmo se aplica ao uso do organismo ou microorganismo recombinante para a produção de isobuteno conforme estabelecido acima para os métodos e organismos ou micro-organismos recombinantes de acordo com a presente invenção.
[0489] Em um aspecto adicional, a presente invenção se refere ao uso de qualquer um dentre o organismo ou micro-organismo recombinante descrito acima para a produção de isobuteno, em que o organismo ou micro-organismo é um organismo ou micro-organismo que expressa adicionalmente a) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3- hidroxiisovalerato (HIV) em ácido 3-metilcrotônico com uma transferência concomitante de CoA a partir de 3-metilcrotonil-CoA em 3-hidroxiisovalerato (HIV) para resultar em 3-hidroxiisovaleril-CoA (etapa Xa conforme esquematicamente mostrado na Figura 19); e/ou b) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3- hidroxiisovalerato (HIV) em 3-hidroxiisovaleril-CoA (etapa Xb conforme esquematicamente mostrado na Figura 20); e/ou c) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3- hidroxiisovaleril-CoA em 3-metilcrotonil-CoA (etapa XI conforme esquematicamente mostrado na Figura 21); e/ou d) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3- hidroxiisovalerato (HIV) em 3-hidroxiisovaleril-CoA (etapa XII conforme esquematicamente mostrado na Figura 22) conforme descrito acima no presente documento.
[0490] Em relação às enzimas mencionadas acima, assim como modalidades preferidas das ditas enzimas, o mesmo se aplica ao organismo ou micro-organismo recombinante conforme estabelecido acima para os métodos de acordo com a presente invenção.
[0491] A presente invenção se refere adicionalmente ao uso de uma enzima que catalisa a conversão enzimática de ácido 3-metilcrotônico em isobuteno para a produção de isobuteno a partir de ácido 3-metilcrotônico.
[0492] A presente invenção se refere adicionalmente ao uso de (i) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente ácido 3-metilcrotônico em isobuteno (etapa I conforme mostrado na Figura 1); e (ii) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-hidroxiisovalerato (HIV) em ácido 3-metilcrotônico (etapa II conforme mostrado na Figura 1) para a produção de isobuteno.
[0493] Em outra modalidade preferida, a presente invenção se refere ao uso (i) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente ácido 3-metilcrotônico em isobuteno (etapa I conforme mostrado na Figura 1); e (ii) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-hidroxiisovalerato (HIV) em ácido 3- metilcrotônico (etapa II conforme mostrado na Figura 1) e uma enzima com capacidade para condensar enzimaticamente acetona e acetil-CoA em 3- hidroxiisovalerato (HIV) (etapa III conforme mostrado na Figura 1) para a produção de isobuteno.
[0494] Em outra modalidade preferida, a presente invenção se refere ao uso de (i) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente ácido 3-metilcrotônico em isobuteno (etapa I conforme mostrado na Figura 1); e (ii) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-hidroxiisovalerato (HIV) em ácido 3- metilcrotônico (etapa II conforme mostrado na Figura 1), uma enzima com capacidade para condensar enzimaticamente acetona e acetil-CoA em 3- hidroxiisovalerato (HIV) (etapa III conforme mostrado na Figura 1) e uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente acetoacetato em acetona (etapa IV conforme mostrado na Figura 1) para a produção de isobuteno.
[0495] Em outra modalidade preferida, a presente invenção se refere ao uso de (i) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente ácido 3-metilcrotônico em isobuteno (etapa I conforme mostrado na Figura 1); e (ii) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-hidroxiisovalerato (HIV) em ácido 3- metilcrotônico (etapa II conforme mostrado na Figura 1); uma enzima com capacidade para condensar enzimaticamente acetona e acetil-CoA em 3- hidroxiisovalerato (HIV) (etapa III conforme mostrado na Figura 1), uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente acetoacetato em acetona (etapa IV conforme mostrado na Figura 1) e uma enzima com capacidade para converter acetoacetil-CoA em acetoacetato (etapa Va ou Vb conforme mostrado na Figura 1) para a produção de isobuteno.
[0496] Em outra modalidade preferida, a presente invenção se refere ao uso de (i) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente ácido 3-metilcrotônico em isobuteno (etapa I conforme mostrado na Figura 1); e (ii) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-hidroxiisovalerato (HIV) em ácido 3- metilcrotônico (etapa II conforme mostrado na Figura 1); uma enzima com capacidade para condensar enzimaticamente acetona e acetil-CoA em 3- hidroxiisovalerato (HIV) (etapa III conforme mostrado na Figura 1), uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente acetoacetato em acetona (etapa IV conforme mostrado na Figura 1), uma enzima com capacidade para converter acetoacetil-CoA em acetoacetato (etapa Va ou Vb conforme mostrado na Figura 1) e uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente acetil-CoA em acetoacetil-CoA que compreende (a) (i) uma enzima com capacidade para converter acetil-CoA em malonil-CoA (etapa XIV conforme mostrado na Figura 1); e (ii) uma enzima com capacidade para condensar malonil-CoA e acetil-CoA em acetoacetil- CoA (etapa XV conforme mostrado na Figura 1); ou (b) uma enzima com capacidade para condensar diretamente duas moléculas de acetil-CoA em acetoacetil-CoA (etapa XIII conforme mostrado na Figura 1) para a produção de isobuteno.
[0497] Em relação às enzimas mencionadas acima, assim como modalidades preferidas das ditas enzimas, o mesmo se aplica ao uso do organismo ou microorganismo recombinante para a produção de isobuteno conforme estabelecido acima para os métodos e organismos ou micro-organismos recombinantes de acordo com a presente invenção.
[0498] A presente invenção se refere adicionalmente ao uso de (i) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente ácido 3-metilcrotônico em isobuteno (etapa I conforme mostrado na Figura 1); e (ii) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metilcrotonil-CoA em ácido 3-metilcrotônico (etapa VIa, VIb ou VIc conforme mostrado na Figura 1) para a produção de isobuteno.
[0499] Em outra modalidade preferida, a presente invenção se refere ao uso de (i) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente ácido 3-metilcrotônico em isobuteno (etapa I conforme mostrado na Figura 1); e (ii) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metilcrotonil-CoA em ácido 3- metilcrotônico (etapa VIa, VIb ou VIc conforme mostrado na Figura 1) e uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metilglutaconil-CoA em 3- metilcrotonil-CoA (etapa VII conforme mostrado na Figura 1) para a produção de isobuteno.
[0500] Em outra modalidade preferida, a presente invenção se refere ao uso de (i) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente ácido 3-metilcrotônico em isobuteno (etapa I conforme mostrado na Figura 1); e (ii) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metilcrotonil-CoA em ácido 3- metilcrotônico (etapa VIa, VIb ou VIc conforme mostrado na Figura 1); uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metilglutaconil-CoA em 3- metilcrotonil-CoA (etapa VII conforme mostrado na Figura 1) e uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA em 3- metilglutaconil-CoA (etapa VIII conforme mostrado na Figura 1) para a produção de isobuteno.
[0501] Em outra modalidade preferida, a presente invenção se refere ao uso de (i) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente ácido 3-metilcrotônico em isobuteno (etapa I conforme mostrado na Figura 1); e (ii) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metilcrotonil-CoA em ácido 3- metilcrotônico (etapa VIa, VIb ou VIc conforme mostrado na Figura 1); uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metilglutaconil-CoA em 3- metilcrotonil-CoA (etapa VII conforme mostrado na Figura 1); uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA em 3- metilglutaconil-CoA (etapa VIII conforme mostrado na Figura 1) e uma enzima com capacidade para condensar enzimaticamente acetoacetil-CoA e acetil-CoA em 3- hidroxi-3-metilglutaril-CoA (etapa IX conforme mostrado na Figura 1) para a produção de isobuteno.
[0502] Em outra modalidade preferida, a presente invenção se refere ao uso de (i) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente ácido 3-metilcrotônico em isobuteno (etapa I conforme mostrado na Figura 1); e (ii) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metilcrotonil-CoA em ácido 3- metilcrotônico (etapa VIa, VIb ou VIc conforme mostrado na Figura 1); uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metilglutaconil-CoA em 3- metilcrotonil-CoA (etapa VII conforme mostrado na Figura 1); uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA em 3- metilglutaconil-CoA (etapa VIII conforme mostrado na Figura 1); uma enzima com capacidade para condensar enzimaticamente acetoacetil-CoA e acetil-CoA em 3- hidroxi-3-metilglutaril-CoA (etapa IX conforme mostrado na Figura 1) e uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente acetil-CoA em acetoacetil-CoA que compreende (a) (i) uma enzima com capacidade para converter acetil-CoA em malonil-CoA (etapa XIV conforme mostrado na Figura 1); e (ii) uma enzima com capacidade para condensar malonil-CoA e acetil-CoA em acetoacetil-CoA (etapa XV conforme mostrado na Figura 1); ou (b) uma enzima com capacidade para condensar diretamente duas moléculas de acetil-CoA em acetoacetil-CoA (etapa XIII conforme mostrado na Figura 1) para a produção de isobuteno.
[0503] Em relação às enzimas mencionadas acima, assim como modalidades preferidas das ditas enzimas, o mesmo se aplica ao uso do organismo ou microorganismo recombinante para a produção de isobuteno conforme estabelecido acima para os métodos e organismos ou micro-organismos recombinantes de acordo com a presente invenção.
[0504] A presente invenção se refere adicionalmente ao uso de uma enzima que catalisa a conversão enzimática de ácido 3-metil-3-butenóico em isobuteno para a produção de isobuteno a partir de ácido 3-metil-3-butenóico.
[0505] A presente invenção se refere adicionalmente ao uso de (i) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente ácido 3-metil-3-butenóico em isobuteno (etapa XVI conforme mostrado na Figura 1) e (ii) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metil-3-butenoil-CoA em ácido 3-metil- 3-butenóico (etapa XVII conforme mostrado na Figura 1) para a produção de isobuteno.
[0506] Em outra modalidade preferida, a presente invenção se refere ao uso de (i) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente ácido 3-metil-3- butenóico em isobuteno (etapa XVI conforme mostrado na Figura 1) e (ii) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metil-3-butenoil-CoA em ácido 3- metil-3-butenóico (etapa XVII conforme mostrado na Figura 1) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metilglutaconil-CoA em 3-metil-3- butenoil-CoA (etapa XVIII conforme mostrado na Figura 1) para a produção de isobuteno.
[0507] Em outra modalidade preferida, a presente invenção se refere ao uso de (i) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente ácido 3-metil-3- butenóico em isobuteno (etapa XVI conforme mostrado na Figura 1) e (ii) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metil-3-butenoil-CoA em ácido 3- metil-3-butenóico (etapa XVII conforme mostrado na Figura 1), uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metilglutaconil-CoA em 3-metil-3- butenoil-CoA (etapa XVIII conforme mostrado na Figura 1) e uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA em 3- metilglutaconil-CoA (etapa VIII conforme mostrado na Figura 1) para a produção de isobuteno.
[0508] Em outra modalidade preferida, a presente invenção se refere ao uso de (i) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente ácido 3-metil-3- butenóico em isobuteno (etapa XVI conforme mostrado na Figura 1) e (ii) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metil-3-butenoil-CoA em ácido 3- metil-3-butenóico (etapa XVII conforme mostrado na Figura 1); uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metilglutaconil-CoA em 3-metil-3- butenoil-CoA (etapa XVIII conforme mostrado na Figura 1); uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA em 3- metilglutaconil-CoA (etapa VIII conforme mostrado na Figura 1) e uma enzima com capacidade para condensar enzimaticamente acetoacetil-CoA e acetil-CoA em 3- hidroxi-3-metilglutaril-CoA (etapa IX conforme mostrado na Figura 1) para a produção de isobuteno.
[0509] Em outra modalidade preferida, a presente invenção se refere ao uso de (i) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente ácido 3-metil-3- butenóico em isobuteno (etapa XVI conforme mostrado na Figura 1) e (ii) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metil-3-butenoil-CoA em ácido 3- metil-3-butenóico (etapa XVII conforme mostrado na Figura 1); uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metilglutaconil-CoA em 3-metil-3- butenoil-CoA (etapa XVIII conforme mostrado na Figura 1); uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA em 3- metilglutaconil-CoA (etapa VIII conforme mostrado na Figura 1); uma enzima com capacidade para condensar enzimaticamente acetoacetil-CoA e acetil-CoA em 3- hidroxi-3-metilglutaril-CoA (etapa IX conforme mostrado na Figura 1) e uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente acetil-CoA em acetoacetil-CoA que compreende (a) (i) uma enzima com capacidade para converter acetil-CoA em malonil-CoA (etapa XIV conforme mostrado na Figura 1); e (ii) uma enzima com capacidade para condensar malonil-CoA e acetil-CoA em acetoacetil-CoA (etapa XV conforme mostrado na Figura 1); ou (b) uma enzima com capacidade para condensar diretamente duas moléculas de acetil-CoA em acetoacetil-CoA (etapa XIII conforme mostrado na Figura 1) para a produção de isobuteno.
[0510] Em relação às enzimas mencionadas acima, assim como modalidades preferidas das ditas enzimas, o mesmo se aplica ao uso do organismo ou microorganismo recombinante para a produção de isobuteno conforme estabelecido acima para os métodos e organismos ou micro-organismos recombinantes de acordo com a presente invenção.
[0511] Em um aspecto adicional, a presente invenção se refere a qualquer um dos usos acima de enzimas para a produção de isobuteno, em que adicionalmente a) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3- hidroxiisovalerato (HIV) em ácido 3-metilcrotônico com uma transferência concomitante de CoA a partir de 3-metilcrotonil-CoA em 3-hidroxiisovalerato (HIV) para resultar em 3-hidroxiisovaleril-CoA (etapa Xa conforme esquematicamente mostrado na Figura 19); e/ou b) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3- hidroxiisovalerato (HIV) em 3-hidroxiisovaleril-CoA (etapa Xb conforme esquematicamente mostrado na Figura 20); e/ou c) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3- hidroxiisovaleril-CoA em 3-metilcrotonil-CoA (etapa XI conforme esquematicamente mostrado na Figura 21); e/ou d) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3- hidroxiisovalerato (HIV) em 3-hidroxiisovaleril-CoA (etapa XII conforme esquematicamente mostrado na Figura 22) é usada conforme descrito acima no presente documento.
[0512] Em relação às enzimas mencionadas acima, assim como modalidades preferidas das ditas enzimas, o mesmo se aplica ao organismo ou micro-organismo recombinante conforme estabelecido acima para os métodos de acordo com a presente invenção.
[0513] Adicionalmente, a presente invenção se refere a uma composição que compreende ácido 3-metilcrotônico e um organismo ou micro-organismo recombinante, em que o dito organismo ou micro-organismo recombinante expressa (i) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente ácido 3- metilcrotônico em isobuteno (etapa I conforme mostrado na Figura 1); e/ou (ii) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-hidroxiisovalerato (HIV) em ácido 3-metilcrotônico (etapa II conforme mostrado na Figura 1), e/ou que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para condensar enzimaticamente acetona e acetil-CoA em 3-hidroxiisovalerato (HIV) (etapa III conforme mostrado na Figura 1), e/ou que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente acetoacetato em acetona (etapa IV conforme mostrado na Figura 1), e/ou que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para converter acetoacetil-CoA em acetoacetato (etapa Va ou Vb conforme mostrado na Figura 1) e/ou que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente acetil-CoA em acetoacetil-CoA que compreende (a) (i) uma enzima com capacidade para converter acetil-CoA em malonil-CoA (etapa XIV conforme mostrado na Figura 1); e (ii) uma enzima com capacidade para condensar malonil-CoA e acetil-CoA em acetoacetil-CoA (etapa XV conforme mostrado na Figura 1); ou (b) uma enzima com capacidade para condensar diretamente duas moléculas de acetil-CoA em acetoacetil-CoA (etapa XIII conforme mostrado na Figura 1).
[0514] Adicionalmente, a presente invenção se refere a uma composição que compreende ácido 3-metilcrotônico (i) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente ácido 3-metilcrotônico em isobuteno (etapa I conforme mostrado na Figura 1); e/ou (ii) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3- hidroxiisovalerato (HIV) em ácido 3-metilcrotônico (etapa II conforme mostrado na Figura 1); e/ou uma enzima com capacidade para condensar enzimaticamente acetona e acetil-CoA em 3-hidroxiisovalerato (HIV) (etapa III conforme mostrado na Figura 1), e/ou uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente acetoacetato em acetona (etapa IV conforme mostrado na Figura 1), e/ou uma enzima com capacidade para converter acetoacetil-CoA em acetoacetato (etapa Va ou Vb conforme mostrado na Figura 1) e/ou uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente acetil-CoA em acetoacetil-CoA que compreende (a) (i) uma enzima com capacidade para converter acetil-CoA em malonil-CoA (etapa XIV conforme mostrado na Figura 1); e (ii) uma enzima com capacidade para condensar malonil-CoA e acetil-CoA em acetoacetil-CoA (etapa XV conforme mostrado na Figura 1); ou (b) uma enzima com capacidade para condensar diretamente duas moléculas de acetil-CoA em acetoacetil-CoA (etapa XIII conforme mostrado na Figura 1).
[0515] Em relação às enzimas mencionadas acima, assim como modalidades preferidas das ditas enzimas, o mesmo se aplica ao uso do organismo ou microorganismo recombinante para a produção de isobuteno conforme estabelecido acima para os métodos e organismos ou micro-organismos recombinantes de acordo com a presente invenção.
[0516] Adicionalmente, a presente invenção se refere a uma composição que compreende ácido 3-metilcrotônico e um organismo ou micro-organismo recombinante, em que o dito organismo ou micro-organismo recombinante expressa (i) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente ácido 3- metilcrotônico em isobuteno (etapa I conforme mostrado na Figura 1); e/ou (ii) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metilcrotonil-CoA em ácido 3-metilcrotônico (etapa VIa, VIb ou VIc conforme mostrado na Figura 1), e/ou que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metilglutaconil-CoA em 3-metilcrotonil-CoA (etapa VII conforme mostrado na Figura 1), e/ou que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA em 3- metilglutaconil-CoA (etapa VIII conforme mostrado na Figura 1), e/ou que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para condensar enzimaticamente acetoacetil-CoA e acetil-CoA em 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (etapa IX conforme mostrado na Figura 1) e/ou que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente acetil-CoA em acetoacetil-CoA que compreende (a) (i) uma enzima com capacidade para converter acetil-CoA em malonil-CoA (etapa XIV conforme mostrado na Figura 1); e (ii) uma enzima com capacidade para condensar malonil-CoA e acetil-CoA em acetoacetil-CoA (etapa XV conforme mostrado na Figura 1); ou (b) uma enzima com capacidade para condensar diretamente duas moléculas de acetil-CoA em acetoacetil-CoA (etapa XIII conforme mostrado na Figura 1).
[0517] Adicionalmente, a presente invenção se refere a uma composição que compreende ácido 3-metilcrotônico e (i) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente ácido 3-metilcrotônico em isobuteno (etapa I conforme mostrado na Figura 1); e/ou (ii) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3- metilcrotonil-CoA em ácido 3-metilcrotônico (etapa VIa, VIb ou VIc conforme mostrado na Figura 1); e/ou uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metilglutaconil-CoA em 3-metilcrotonil-CoA (etapa VII conforme mostrado na Figura 1); e/ou uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA em 3-metilglutaconil-CoA (etapa VIII conforme mostrado na Figura 1); e/ou uma enzima com capacidade para condensar enzimaticamente acetoacetil-CoA e acetil-CoA em 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (etapa IX conforme mostrado na Figura 1) e/ou uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente acetil-CoA em acetoacetil-CoA que compreende (a) (i) uma enzima com capacidade para converter acetil-CoA em malonil-CoA (etapa XIV conforme mostrado na Figura 1); e (ii) uma enzima com capacidade para condensar malonil- CoA e acetil-CoA em acetoacetil-CoA (etapa XV conforme mostrado na Figura 1); ou (b) uma enzima com capacidade para condensar diretamente duas moléculas de acetil-CoA em acetoacetil-CoA (etapa XIII conforme mostrado na Figura 1).
[0518] Em relação às enzimas mencionadas acima, assim como modalidades preferidas das ditas enzimas, o mesmo se aplica ao uso do organismo ou microorganismo recombinante para a produção de isobuteno conforme estabelecido acima para os métodos e organismos ou micro-organismos recombinantes de acordo com a presente invenção.
[0519] Adicionalmente, a presente invenção se refere a uma composição que compreende ácido 3-metil-3-butenóico e um organismo ou micro-organismo recombinante, em que o dito organismo ou micro-organismo recombinante expressa (i) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente ácido 3-metil-3- butenóico em isobuteno (etapa XVI conforme mostrado na Figura 1) e/ou (ii) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metil-3-butenoil-CoA em ácido 3-metil-3-butenóico (etapa XVII conforme mostrado na Figura 1), e/ou que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metilglutaconil-CoA em 3-metil-3-butenoil-CoA (etapa XVIII conforme mostrado na Figura 1), e/ou que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA em 3- metilglutaconil-CoA (etapa VIII conforme mostrado na Figura 1), e/ou que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para condensar enzimaticamente acetoacetil-CoA e acetil-CoA em 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (etapa IX conforme mostrado na Figura 1) e/ou que expressa adicionalmente uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente acetil-CoA em acetoacetil-CoA que compreende (a) (i) uma enzima com capacidade para converter acetil-CoA em malonil-CoA (etapa XIV conforme mostrado na Figura 1); e (ii) uma enzima com capacidade para condensar malonil-CoA e acetil-CoA em acetoacetil-CoA (etapa XV conforme mostrado na Figura 1); ou (b) uma enzima com capacidade para condensar diretamente duas moléculas de acetil-CoA em acetoacetil-CoA (etapa XIII conforme mostrado na Figura 1).
[0520] Adicionalmente, a presente invenção se refere a uma composição que compreende ácido 3-metil-3-butenóico e (i) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente ácido 3-metil-3-butenóico em isobuteno (etapa XVI conforme mostrado na Figura 1) e/ou (ii) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metil-3-butenoil-CoA em ácido 3-metil-3-butenóico (etapa XVII conforme mostrado na Figura 1); e/ou uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-metilglutaconil-CoA em 3-metil-3-butenoil-CoA (etapa XVIII conforme mostrado na Figura 1); e/ou uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA em 3-metilglutaconil-CoA (etapa VIII conforme mostrado na Figura 1); e/ou uma enzima com capacidade para condensar enzimaticamente acetoacetil-CoA e acetil-CoA em 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (etapa IX conforme mostrado na Figura 1) e/ou uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente acetil-CoA em acetoacetil-CoA que compreende (a) (i) uma enzima com capacidade para converter acetil-CoA em malonil-CoA (etapa XIV conforme mostrado na Figura 1); e (ii) uma enzima com capacidade para condensar malonil- CoA e acetil-CoA em acetoacetil-CoA (etapa XV conforme mostrado na Figura 1); ou (b) uma enzima com capacidade para condensar diretamente duas moléculas de acetil-CoA em acetoacetil-CoA (etapa XIII conforme mostrado na Figura 1) para a produção de isobuteno.
[0521] Em relação às enzimas mencionadas acima, assim como modalidades preferidas das ditas enzimas, o mesmo se aplica ao uso do organismo ou microorganismo recombinante para a produção de isobuteno conforme estabelecido acima para os métodos e organismos ou micro-organismos recombinantes de acordo com a presente invenção.
[0522] Em um aspecto adicional, a presente invenção se refere a qualquer uma das composições descritas acima, em que o organismo ou micro-organismo é um organismo ou micro-organismo que expressa adicionalmente a) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3- hidroxiisovalerato (HIV) em ácido 3-metilcrotônico com uma transferência concomitante de CoA a partir de 3-metilcrotonil-CoA em 3-hidroxiisovalerato (HIV) para resultar em 3-hidroxiisovaleril-CoA (etapa Xa conforme esquematicamente mostrado na Figura 19); e/ou b) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3- hidroxiisovalerato (HIV) em 3-hidroxiisovaleril-CoA (etapa Xb conforme esquematicamente mostrado na Figura 20); e/ou c) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3- hidroxiisovaleril-CoA em 3-metilcrotonil-CoA (etapa XI conforme esquematicamente mostrado na Figura 21); e/ou d) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3- hidroxiisovalerato (HIV) em 3-hidroxiisovaleril-CoA (etapa XII conforme esquematicamente mostrado na Figura 22) conforme descrito acima no presente documento.
[0523] Em um aspecto adicional, a presente invenção relates se refere a qualquer uma dentre as composições descritas acima que compreendem adicionalmente a) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3- hidroxiisovalerato (HIV) em ácido 3-metilcrotônico com uma transferência concomitante de CoA a partir de 3-metilcrotonil-CoA em 3-hidroxiisovalerato (HIV) para resultar em 3-hidroxiisovaleril-CoA (etapa Xa conforme esquematicamente mostrado na Figura 19); e/ou b) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3- hidroxiisovalerato (HIV) em 3-hidroxiisovaleril-CoA (etapa Xb conforme esquematicamente mostrado na Figura 20); e/ou c) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3- hidroxiisovaleril-CoA em 3-metilcrotonil-CoA (etapa XI conforme esquematicamente mostrado na Figura 21); e/ou d) uma enzima com capacidade para converter enzimaticamente 3- hidroxiisovalerato (HIV) em 3-hidroxiisovaleril-CoA (etapa XII conforme esquematicamente mostrado na Figura 22) conforme descrito acima no presente documento.
[0524] Em relação às enzimas mencionadas acima, assim como modalidades preferidas das ditas enzimas, o mesmo se aplica ao organismo ou micro-organismo recombinante conforme estabelecido acima para os métodos de acordo com a presente invenção.
[0525] Figura 1: mostra uma via artificial para produção de isobuteno a partir de acetil-CoA por meio de ácido 3-metilcrotônico. Além disso, a reciclagem enzimática de metabólitos que pode ocorrer durante a via é mostrada nas etapas Xa, Xb, XI e XII.
[0526] Figura 2A: Reação esquemática da prenilação enzimática de um mononucleotídeo de flavina (FMN) no cofator flavina modificado (prenilado) correspondente.
[0527] Figura 2B: Reação esquemática da conversão enzimática de ácido 3- metilcrotônico em isobuteno.
[0528] Figura 3: Reação esquemática da conversão enzimática de 3- hidroxiisovalerato (HIV) em ácido 3-metilcrotônico.
[0529] Figura 4: Reação esquemática da condensação enzimática de acetil-CoA e acetona em 3-hidroxiisovalerato.
[0530] Figura 5: Reação esquemática da conversão enzimática de acetoacetato em acetona.
[0531] Figura 6: Reação esquemática da conversão enzimática de acetoacetil- CoA em acetoacetato hidrolisando-se o CoA tioéster de acetoacetil-CoA que resulta em acetoacetato.
[0532] Figura 7: Reação esquemática da conversão enzimática de acetoacetil- CoA em acetoacetato transferindo-se o grupo CoA de acetoacetil-CoA em acetato, resultando na formação de acetoacetato e acetil-CoA.
[0533] Figura 8: Reação esquemática da conversão enzimática de 3-metilcrotonil- CoA em ácido 3-metilcrotônico.
[0534] Figura 9: Reação esquemática da conversão enzimática de 3-metilcrotonil- CoA em ácido 3-metilcrotônico por meio da etapa VIa conforme mostrado na Figura 1.
[0535] Figura 10: Reação esquemática da conversão enzimática de 3- metilcrotonil-CoA em ácido 3-metilcrotônico por meio da etapa VIb conforme mostrado na Figura 1.
[0536] Figura 11: Reação esquemática da conversão enzimática de 3- metilcrotonil-CoA em ácido 3-metilcrotônico por meio da etapa VIc conforme mostrado na Figura 1.
[0537] Figura 12: Reação esquemática da conversão enzimática de 3- metilglutaconil-CoA em 3-metilcrotonil-CoA.
[0538] Figura 13: Reação esquemática da conversão enzimática de 3-hidroxi-3- metilglutaril-CoA em 3-metilglutaconil-CoA.
[0539] Figura 14: Reação esquemática da condensação enzimática de acetilCoA e acetoacetil-CoA em 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA.
[0540] Figura 15: Reação esquemática da condensação enzimática de duas moléculas de acetil-CoA em acetoacetil-CoA.
[0541] Figura 16: Reação esquemática da conversão enzimática de acetil-CoA em malonil-CoA.
[0542] Figura 17: Reação esquemática da condensação enzimática de malonil- CoA e acetil-CoA em acetoacetil-CoA.
[0543] Figura 18: mostra etapas de reciclagem enzimática de metabólitos (etapas Xa, Xb, XI e XII conforme mostrado também na Figura 1) que podem ocorrer durante a via de produção de isobuteno a partir de acetil-CoA por meio de ácido 3- metilcrotônico.
[0544] Figura 19: Reação esquemática da conversão enzimática de 3- hidroxiisovalerato (HIV) em ácido 3-metilcrotônico com uma transferência concomitante de CoA de 3-metilcrotonil-CoA em 3-hidroxiisovalerato (HIV) para resultar em 3-hidroxiisovaleril-CoA.
[0545] Figura 20: Reação esquemática da conversão enzimática de 3- hidroxiisovalerato (HIV) em 3-hidroxiisovaleril-CoA.
[0546] Figura 21: Reação esquemática da conversão enzimática de 3- hidroxiisovaleril-CoA em 3-metilcrotonil-CoA.
[0547] Figura 22: Reação esquemática da conversão enzimática geral de 3- hidroxiisovalerato (HIV) em 3-hidroxiisovaleril-CoA.
[0548] Figura 23: Reação esquemática da conversão enzimática de 3- hidroxiisovalerato (HIV) em 3-hidroxiisovaleril-CoA por meio de monofosfato de 3- hidroxiisovaleril-adenosina.
[0549] Figura 24: Reação esquemática da conversão enzimática de 3- hidroxiisovalerato (HIV) em 3-hidroxiisovaleril-CoA por meio de fosfato de 3- hidroxiisovalerila.
[0550] Figura 25: Reação esquemática da conversão enzimática de ácido 3-metil- 3-butenóico em isobuteno.
[0551] Figura 26: Reação esquemática da conversão enzimática de 3-metil-3- butenoil-CoA em ácido 3-metil-3-butenóico.
[0552] Figura 27: Reação esquemática da conversão enzimática de 3-metil-3- butenoil-CoA em ácido 3-metil-3-butenóico fazendo-se uso de uma CoA-transferase.
[0553] Figura 28: Reação esquemática da conversão enzimática de 3-metil-3- butenoil-CoA em ácido 3-metil-3-butenóico fazendo-se uso de uma tioéster hidrolase.
[0554] Figura 29: Reação esquemática da conversão enzimática de 3-metil-3- butenoil-CoA em ácido 3-metil-3-butenóico em uma reação de duas etapas por meio de fosfato de 3-metil-3-butenoila.
[0555] Figura 30: Reação esquemática da conversão enzimática de 3- metilglutaconil-CoA em 3-metil-3-butenoil-CoA.
[0556] Figura 31: Estrutura de uma porção química de fosfopanteteína.
[0557] Figura 32: A ilustração esquemática para a conversão de 3-metilcrotonil- CoA em ácido 3-metilcrotônico por meio de 3-metilbutiril-CoA e ácido 3-metilbutírico.
[0558] Figura 33: mostra uma sobreposição de cromatogramas de GC típicos obtidos para o ensaio catalítico de proteína UbiD de Saccharomyces cerevisiae com os controles correspondentes conforme destacado no Exemplo 2.
[0559] Figura 34a: mostra uma sobreposição de cromatogramas de HPLC típicos (análise de 3-metilcrotonil-CoA, ácido 3-metilcrotônico e CoA-SH) obtida para o “Ensaio enzimático” (ensaio A, Exemplo 3) e o “Ensaio livre de enzima” (ensaio H, Exemplo 3). O consumo de 3-metilcrotonil-CoA com produção simultânea de CoA-SH e ácido 3-metilcrotônico foi observado no ensaio enzimático que combina fosfato butiriltransferase com butirato quinase.
[0560] Figura 34b: mostra uma sobreposição de cromatogramas de HPLC típicos (análise de ADP e ATP) obtida para o “Ensaio enzimático” (ensaio A, Exemplo 3) e o “Ensaio livre de enzima” (ensaio H, Exemplo 3). O consumo de ADP com produção simultânea de ATP foi observado no ensaio enzimático que combina fosfato butiriltransferase com butirato quinase.
[0561] Figura 35: mostra os resultados da produção de ácido 3-metilcrotônico e ATP nos ensaios enzimáticos que compreendem fosfato butiriltransferase de Bacillus subtilis combinados com butirato quinases diferentes. Além disso, a produção de ácido 3-metilcrotônico e ATP em ensaios de controle é mostrada.
[0562] Figura 36: mostra os resultados da produção de ácido 3-metilcrotônico e ATP nos ensaios enzimáticos que compreendem fosfato butiriltransferase de Enterococcus faecalis combinados com butirato quinases diferentes. Além disso, a produção de ácido 3-metilcrotônico e ATP em ensaios de controle diferentes é mostrada.
[0563] Figura 37: mostra um exemplo de cromatograma de HPLC típico obtido para o ensaio enzimático com acil-CoA tioesterase II de Pseudomonas putida conforme destacado no Exemplo 5.
[0564] Figura 38: mostra uma sobreposição cromatogramas típicos obtidos para a produção de isobuteno a partir de 3-metilcrotônico em uma cepa de E. coli recombinante que superexpressa proteína de UbiD de Saccharomyces cerevisiae e proteína UbiX de Escherichia coli (cepa A) ou superexpressa proteína UbiD de Saccharomyces cerevisiae sozinha (cepa B) ou que porta um vetor vazio (controle negativo, cepa C).
[0565] Figura 39: mostra uma sobreposição de cromatogramas típicos obtidos para a produção de isobuteno a partir de 3-metilcrotonil-CoA no ensaio enzimático em uma única etapa, conforme destacado no Exemplo 7, e os controles correspondentes.
[0566] Figura 40: mostra cromatogramas para ensaios enzimáticos (a) e ensaios de controle (b). Uma quantidade significante de acetil-CoA e ácido 3-metilcrotônico foi produzida a partir de acetato e 3-metilcrotonil-CoA na presença de CoA transferase (a) enquanto nenhum produto foi observado no ensaio de controle sem enzima (b).
[0567] Figura 41: mostra áreas de pico de 3-metilglutaconil-CoA (MG-CoA) obtidas a partir de análise à base de HPLC.
[0568] Figura 42: A via metabólica para a biossíntese de isobuteno a partir de acetil-CoA por meio de ácido 3-metilcrotônico, implantada em Escherichia coli.
[0569] Neste relatório descritivo, vários documentos incluindo pedidos de patente são citados. A revelação desses documentos, embora não considerada relevante para a patenteabilidade desta invenção, é incorporada à mesma a título de referência em sua totalidade. Mais especificamente, todos os documentos referidos são incorporados a título de referência como se cada documento individual tivesse sido específica e individualmente indicado para ser incorporado a título de referência.
[0570] A invenção será agora descrita a título de referência aos exemplos a seguir que são apenas ilustrativos e não devem ser interpretados como uma limitação do escopo da presente invenção.
EXEMPLOS MÉTODOS E MATERIAIS GERAIS
[0571] Todos os reagentes e materiais usados nas experiências foram obtidos a partir de Sigma-Aldrich Company (St. Louis, MO) a menos que especificado de outro modo. Os materiais e métodos adequados para o crescimento de culturas bacterianas e expressão de proteína são bem conhecidos na técnica.
EXEMPLO 1: SÍNTESE DE GENE, CLONAGEM E EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES
[0572] As sequências das enzimas estudadas foram geradas por concatenação de oligonucleotídeo para se adaptar ao uso de códon de E. coli (os genes foram comercialmente sintetizados por GeneArt®). Uma extensão de 6 códons de histidina foi inserida após o códon de iniciação de metionina fornecer uma etiqueta de afinidade de purificação. O gene sintetizado desse modo foi clonado em um vetor de expressão de pET-25b (+) (vetores foram construídos por GeneArt®). O gene contido por vetor pCAN que codifica a proteína UbiX (proteína parceira de 3-octaprenil-4- hidroxibenzoato carboxi-liase) de Escherichia coli (Número de Acesso Uniprot: P0AG03) foi adquirido a partir de NAIST (Nara Institute of Science and Technology, Japão, coleção ASKA). O vetor fornecido conteve uma extensão de 6 códons de histidina após o códon de iniciação de metionina.
[0573] As células (Novagen) de E. coli BL21 (DE3) competentes foram transformadas com esses vetores de acordo com procedimento de choque térmico padrão. As células transformadas foram cultivadas com agitação (160 rpm) com o uso de meio de autoindução ZYM-5052 (Studier FW, Prot. Exp. Pur. 41, (2005), 207 a 234) por 6h a 30 °C e a expressão de proteína foi continuada a 18°C de um dia para o outro (aproximadamente 16 h). Para a cepa recombinante que superexpressa UbiX de E. coli, 500 μM de Mononucleotídeo de Flavina (FMN) foram adicionados ao meio de crescimento. As células foram coletadas por centrifugação a 4 °C, 10.000 rpm por 20 min e os péletes foram armazenados a -80 °C.
PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNA E CONCENTRAÇÃO
[0574] Os péletes de 200 ml de células cultivadas foram congelados em gelo e ressuspensos em 6 ml de 50 mM de tampão de Tris-HCl a pH 7,5 que contém 100 mM de NaCl no caso da cepa recombinante que superexpressa proteína UbiX e em 6 ml de 50 mM de tampão de Tris-HCl a pH 7,5, 10 mM de MgCl2, 10 mM de imidazol e 5 mM de DTT no caso da cepa recombinante que superexpressa a proteína UbiD. Vinte microlitros de lisonase (Novagen) foram adicionados. As células foram, então, incubadas a 10 min à temperatura ambiente, retornadas em gelo por 20 min e a lise foi completada por sonicação 3 x15 segundos. A proteína UbiX contida por lisado celular foi reservada em gelo. As proteínas UbiD contidas por extratos bacterianos foram, então, clarificadas por centrifugação a 4 °C, 4.000 rpm por 40 min. Os lisados bacterianos clarificados foram carregados em uma coluna PROTINO-2000 Ni-TED (Macherey-Nagel) que permite a adsorção de marcadas por 6-His. As colunas foram lavadas e as enzimas de interesse foram eluídas com 6 ml de 100 mM de tampão de Tris-HCl a pH 7,5 que contém 100 mM de NaCl e 250 mM de imidazol. Eluatos foram, então, concentrados, dessalinizados em unidade de filtro de 10 kDa Amicon Ultra-4 (Millipore) e enzimas foram ressuspensas em 50 mM de tampão de Tris-HCl a pH 7,5, que contém 50 mM de NaCl e 5 mM de DTT.
[0575] A pureza de proteínas purificadas desse modo variou de 80% a 90%, conforme estimado por análise SDS-PAGE. A concentração de proteína foi determinada por medição de 280 nm UV direta no espectrofotômetro NanoDrop 1000 (Thermo Scientific) e por ensaio Bradford (BioRad).
EXEMPLO 2: DESCARBOXILAÇÃO IN VITRO DE ÁCIDO 3- METILCROTÔNICO EM ISOBUTENO CATALISADA POR UMA ASSOCIAÇÃO DE LISADO, QUE CONTÉM PROTEÍNA UBIX, COM PROTEÍNA UBID PURIFICADA.
[0576] 0,5 M de solução de estoque de ácido 3-metilcrotônico foi preparado em água e ajustado a pH 7,0 com 10 M de solução de NaOH.
[0577] Duas proteínas UbiD (Tabela C) foram purificadas de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 1.
[0578] Os ensaios enzimáticos foram executados em frascos de vidro de 2 ml (Interchim) sob as condições a seguir: 50 mM de tampão de Tris-HCl a pH 7,5 20 mM de NaCl 10 mM de MgCl2 5 mM de DTT 50 mM de ácido 3-metilcrotônico 1 mg/ml de proteína UbiD purificada 50 μl de proteína UbiX contida por lisado O volume total dos ensaios foi de 300 μl. Uma série de ensaios de controle foi realizada em paralelo (Tabela C).
[0579] Os frascos foram vedados e incubados por 120 min a 30 °C. Os ensaios foram interrompidos por incubação durante 2 min A 80 °C e o isobuteno formado no intervalo de reação foi analisado por Cromatografia Gasosa (GC) equipada com Detector de Ionização por Chama (FID).
[0580] Para a análise de GC, um ml do gás de intervalo foi separado em um sistema Bruker GC-450 equipado com uma coluna GS-alumina (30 m x 0,53 mm) (Agilent) com o uso de modo isotérmico a 130 °C. O nitrogênio foi usado como gás carreador com uma taxa de fluxo de 6 ml/min.
[0581] O produto de reação enzimática foi identificado por comparação com um padrão de isobuteno. Sob essas condições de GC, o tempo de retenção de isobuteno foi 2,42 min.
[0582] Uma produção significante de isobuteno a partir de ácido 3-metilcrotônico foi observada nos ensaios combinados (proteína UbiD + proteína UbiX). A incubação de lisado que contém proteína UbIX sozinha não resultou em produção de isobuteno. Esses dados indicam que as duas enzimas presentes nos ensaios cooperaram para realizar a descarboxilação de ácido 3-metilcrotônico em isobuteno. Um cromatograma típico obtido no ensaio com proteína UbiD de Saccharomyces cerevisiae é mostrado na Figura 33. TABELA C.
EXEMPLO 3: CONVERSÃO DE 3-METILCROTONIL-COA E ADP EM ÁCIDO 3-METILCROTÔNICO E ATP CATALISADA PELA AÇÃO COMBINADA DE FOSFATO BUTIRILTRANSFERASE DE BACILLUS SUBTILIS E BUTIRATO QUINASE DE LACTOBACILLUS CASEI OU GEOBACILLUS SP.
[0583] As enzimas correspondentes foram obtidas e purificadas de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 1.
[0584] Os ensaios enzimáticos foram conduzidos em um volume de reação total de 0,2 ml
[0585] A mistura de reação padrão conteve: 50 mM de tampão de fosfato de potássio a pH 7,5 4 mM de 3-metilcrotonil-CoA 4 mM de ADP 10 mM de MgCl2 10 mM de NaCl 0,2 mg/ml de fosfato butiriltransferase purificada de Bacillus subtilis (Número de Acesso Uniprot: P54530) 0,2 mg/ml de butirato quinase purificada de Lactobacillus casei (Número de Acesso Uniprot: K0N529) ou Geobacillus sp. (número de acesso Uniprot: L8A0E1). Uma série de controles foi realizada em paralelo (Ensaios C a H, Tabela D).TABELA D
ENSAIOS FORAM INCUBADOS POR 20 MIN COM AGITAÇÃO A 30 °C.
[0586] Após um período de incubação, as reações foram interrompidas aquecendo-se o meio de reação 4 min a 90 °C. As amostras foram centrifugadas, filtradas através de um filtro de 0,22 μm e os sobrenadantes clarificados foram transferidos para um frasco transparente para a análise adicional. O consumo de ADP e 3-metilcrotonil-CoA, e a formação de ATP, ácido 3-metilcrotônico e coenzima A livre (CoA-SH) foi seguido com o uso de métodos à base de HPLC.
ANÁLISE COM BASE EM HPLC DE ADP E ATP
[0587] A análise de HPLC foi realizada com o uso de 1260 Inifinity LC System (Agilent), equipado com módulo de aquecimento de coluna e detector de IR. 2 μl de amostras foram separados em coluna Polaris C18-A (150 x 4,6 mm, 5 μm de tamanho de partícula, temperatura de coluna de 30 °C) com uma taxa de fluxo de fase móvel de 1,5 ml/min. A separação foi realizada com o uso de 8,4 mM de ácido sulfúrico em solução misturada de H2O/MeOH (99/1) (V/V). Nessas condições, o tempo de retenção de ADP e ATP foi de 2,13 min e 2,33 min, respectivamente.
ANÁLISE COM BASE EM HPLC DE 3-METILCROTONIL-COA, ÁCIDO 3-METILCROTÔNICO E COENZIMA A LIVRE (COA-SH)
[0588] A análise de HPLC foi realizada com o uso de 1260 Inifinity LC System (Agilent), equipado com módulo de aquecimento de coluna e detector de UV (260 nm). 1 μl de amostras foram separados em coluna Zorbax SB-Aq (250 x 4,6 mm, 5 μm de tamanho de partícula, temperatura de coluna de 30 °C) com uma taxa de fluxo de fase móvel de 1,5 ml/min. A separação foi realizada com o uso de soluções misturadas A (H2O que contém 8,4 mM de ácido sulfúrico) e B (acetonitrila) em um gradiente linear (0% de B no tempo inicial 0 min^70% de B em 8 min). Nessas condições, o tempo de retenção de 3-metilcrotonil-CoA, ácido 3-metilcrotônico e coenzima A livre (CoASH) foi 5,38 min, 5,73 min e 4,07 min, respectivamente.
[0589] Os cromatogramas típicos obtidos para o ensaio enzimático A e ensaio livre de enzima H são mostrados nas Figuras 34a e 34b.
[0590] Os resultados de análise de HPLC são resumidos na Figura 35.
[0591] Os dados obtidos indicam que 3-metilcrotonil-CoA foi convertido em ácido 3-metilcrotônico com a geração concomitante de ATP a partir de ADP em uma reação de duas etapas, catalisado respectivamente por duas enzimas (ensaios A e B). Desse modo, a conversão ocorreu através da formação do fosfato de 3-metilcrotonila intermediário seguido pela transferência de grupo fosfato a partir desse intermediário em ADP, assim liberando ATP.
[0592] Uma certa quantidade de ácido 3-metilcrotônico foi produzida sem geração simultânea de ATP, quando fosfato butiriltransferase foi usada sozinha (ensaio E). Essa produção se dá devido a uma hidrólise espontânea de fosfato de 3-metilcrotonila gerada pela ação de fosfato butiriltransferase.
[0593] A produção de ácido 3-metilcrotônico foi observada da mesma maneira para os ensaios de controle sem ADP (ensaios C e D). Essa produção também se deu devido a uma hidrólise do fosfato de 3-metilcrotonila gerado pela ação de fosfato butiriltransferase.
EXEMPLO 4: CONVERSÃO DE 3-METILCROTONIL-COA E ADP EM ÁCIDO 3-METILCROTÔNICO E ATP CATALISADA PELA AÇÃO COMBINADA DA FOSFATO BUTIRILTRANSFERASE DE ENTEROCOCCUS FAECALIS E BUTIRATO QUINASE DE LACTOBACILLUS CASEI OU GEOBACILLUS SP.
[0594] As enzimas correspondentes foram obtidas e purificadas de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 1.
[0595] Os ensaios enzimáticos foram conduzidos em um volume de reação tota de 0,2 ml
[0596] A mistura de reação padrão conteve: 50 mM de tampão de fosfato de potássio a pH 7,5 4 mM de 3-metilcrotonil-CoA 4 mM de ADP 10 mM de MgCl2 10 mM de NaCl 0,2 mg/ml de fosfato butiriltransferase purificada de Enterococcus faecalis (Número de Acesso Uniprot: S4BZL5) 0,2 mg/ml de butirato quinase purificada de Lactobacillus casei (Número de Acesso Uniprot: K0N529) ou Geobacillus sp. (Número de Acesso Uniprot: L8A0E1) Uma série de controles foi realizada em paralelo (Ensaios C a H Tabela E). Tabela E
[0597] Ensaios foram incubados por 20 min com agitação a 30 °C.
[0598] Após um período de incubação, as reações foram interrompidas aquecendo-se o meio de reação 4 min a 90 °C. As amostras foram centrifugadas, filtradas através de um filtro de 0,22 μm e os sobrenadantes clarificados foram transferidos para um frasco transparente para análise adicional. O consumo de ADP e 3-metilcrotonil-CoA, e a formação de ATP e ácido 3-metilcrotônico e coenzima A livre (CoA-SH) foram seguidos por análise de HPLC de acordo com os métodos descritos no Exemplo 3.
[0599] Os resultados de análise de HPLC são resumidos na Figura 36.
[0600] Os dados obtidos indicam que 3-metilcrotonil-CoA foi convertido em ácido 3-metilcrotônico com a geração concomitante de ATP a partir de ADP em uma reação de duas etapas, catalisado respectivamente por duas enzimas (ensaios A e B). Desse modo, a conversão ocorreu através da formação do fosfato de 3-metilcrotonila intermediário seguido pela transferência de grupo fosfato a partir desse intermediário em ADP, assim liberando ATP.
[0601] Uma produção significante de ácido 3-metilcrotônico, sem geração simultânea de ATP, foi observada quando fosfato butiriltransferase foi usada sozinha (ensaio E). Essa produção se deu devido a uma hidrólise de fosfato de 3-metilcrotonila gerado pela ação de fosfato butiriltransferase.
[0602] A produção de ácido 3-metilcrotônico foi observada da mesma maneira para os ensaios de controle sem ADP (ensaios C e D). Essa produção também se deu devido a uma hidrólise do fosfato de 3-metilcrotonila gerado pela ação de fosfato butiriltransferase.
EXEMPLO 5: HIDRÓLISE CATALISADA POR ENZIMA DE 3- METILCROTONIL-COA EM ÁCIDO 3-METILCROTÔNICO E COENZIMA A LIVRE.
[0603] O gene que codifica acil-CoA tioesterase II de Pseudomonas putida foi sintetizado de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 1.
[0604] O gene contido por vetor pCAN que codifica acil-CoA tioesterase 2 (TesB) de Escherichia coli foi adquirido a partir de NAIST (Nara Institute of Science and Technology, Japão, coleção ASKA). O vetor fornecido conteve uma extensão de 6 códons de histidina após o códon de iniciação de metionina. As enzimas correspondentes foram produzidas de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 1.
[0605] Os ensaios enzimáticos foram conduzidos em um volume de reação total de 0,2 ml.
[0606] A mistura de reação padrão conteve: 50 mM de HEPES pH 7,0 10 mM de 3-metilcrotonil-CoA 20 mM de MgCl2 20 mM de NaCl 1 mg/ml de tioesterase recombinante purificada.
[0607] Os ensaios de controle foram realizados, nos quais nenhuma enzima foi adicionada, ou nenhum substrato foi adicionado.
[0608] Os ensaios foram incubados por 30 min com agitação a 30° C, as reaçõesforam interrompidas pela adição de 0,1 ml de acetonitrila e as amostras foram, então, analisadas por procedimento com base em HPLC.
ANÁLISE COM BASE EM HPLC DO CONSUMO DE 3-METILCROTONIL- COA E A FORMAÇÃO DE ÁCIDO 3-METILCROTÔNICO E COENZIMA A LIVRE (COA-SH)
[0609] A análise de HPLC foi realizada com o uso de 1260 Inifinity LC System (Agilent), equipado com módulo de aquecimento de coluna e detector de UV (210 nm). 5 μl de amostras foram separados em coluna Zorbax SB-Aq (250 x 4,6 mm, 5 μm de tamanho de partícula, temperatura de coluna de 30 °C) com uma taxa de fluxo de fase móvel de 1,5 ml/min. A separação foi realizada com o uso de soluções misturadas A (H2O que contém 8,4 mM de ácido sulfúrico) e B (acetonitrila) em um gradiente linear (0% de B no tempo inicial 0 min^-70% de B em 8 min). 3-metilcrotonil-CoA comercial, ácido 3-metilcrotônico (Sigma-Aldrich) e CoA-SH (Sigma-Aldrich) foram usados como referências. Nessas condições, o tempo de retenção de coenzima A livre (CoA-SH), 3-metilcrotonil-CoA e ácido 3-metilcrotônico foi 4,05, 5,38 e 5,83 min, respectivamente. Nenhum sinal de ácido 3-metilcrotônico foi observado em ensaios de controle. Ambas as tioesterases estudadas catalisaram a hidrólise de 3-metilcrotonil- CoA com a formação de ácido 3-metilcrotônico. Um exemplo de cromatograma obtido com acil-CoA tioesterase II de Pseudomonas putida é mostrado na Figura 37. A produção de ácido 3-metilcrotônico observada nos ensaios enzimáticos é mostrada na Tabela F. TABELA F
EXEMPLO 6: DESCARBOXILAÇÃO IN VIVO DE ÁCIDO 3- METILCROTÔNICO EM ISOBUTENO CATALISADA POR UMA ASSOCIAÇÃO DE PROTEÍNA UBIX DE ESCHERICHIA COLI E PROTEÍNA UBID DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE.
[0610] O gene que codifica a proteína UbiD de S. cerevisiae (Número de Acesso Uniprot: Q03034) apresentou otimização de códon para expressão em E.coli e foi sintetizado por GeneArt® (Life Technologies). Esse gene estudado foi, então, amplificado por PCR a partir do vetor pMK-RQ (plasmídeo principal fornecido por GeneArt) com o uso de iniciador direto com sítio de restrição NcoI e um iniciador reverso que contém sítio de restrição BamHI. A codificação de gene para proteína UbiX de E.coli (Número de Acesso Uniprot: P0AG03) foi amplificado por PCR com um iniciador direto, contendo sítio de restrição NdeI e um iniciador reverso que contém sítio de restrição KpnI. O vetor pCAN anteriormente descrito (Exemplo 1) serviu como modelo para essa etapa de PCR. Esses dois produtos de PCR obtidos (proteína UbiD e proteína UbiX) foram clonados em vetor de coexpressão pETDuet™-1 (Novagen). O plasmídeo recombinante construído foi verificado por sequenciamento. As células de E. coli BL21(DE3) competentes (Novagen) foram transformadas com esse vetor de acordo com o procedimento de choque térmico padrão e transferidas para placas em placas de ágar LB suplementadas com ampicilina (0,1 mg/ml) (denominada “cepa A”).
[0611] A cepa BL21(DE3) transformada com vetor pET-25b(+), que porta apenas o gene de proteína UbiD de S. cerevisae também foi usada nesse estudo (denominada “cepa B”). A cepa BL21(DE3) transformada com um vetor pET-25b(+) vazio foi usada como um controle negativo nos ensaios subsequentes (denominada “cepa C”).
[0612] Os transformantes únicos foram usados para inocular o meio LB, suplementado com ampicilina, seguido por incubação a 30 °C de um dia para o outro. 1 ml dessa cultura de um dia para o outro foi usado para inocular 300 ml de meio autoindutor ZYM-5052 (Studier FW (2005), citação local). As culturas foram cultivadas por 20 horas a 30 °C e agitação a 160 rpm.
[0613] Um volume de culturas correspondente a OD600 de 30 foi removido e centrifugado. O pélete foi ressuspenso em 30 ml de meio MS (Richaud C., Mengin- Leucreulx D., Pochet S., Johnson EJ., Cohen GN. e Marlière P, The Journal of Biological Chemistry, 268, (1993), 26.827 a 26.835), contendo glicose (45 g/l) e MgSO4 (1 mM) e suplementado com 10 mM de ácido 3-metilcrotônico. Essas culturas foram, então, incubadas em frascos de 160 ml, vedadas com uma tampa de rosca, a 30°C com agitação por 22 h. O valor de pH das culturas foi ajustado a 8,5 após 8 horas de incubação usando-se 30% de NH4OH.
[0614] Após um período de incubação, o isobuteno produzido no intervalo foi analisado por Cromatografia Gasosa (GC) equipada com Detector de Ionização por Chama (FID). Um ml da fase de gás de intervalo foi separado e analisado de acordo com o método descrito no Exemplo 2.
[0615] Nenhum isobuteno foi formado com a cepa de controle C que porta um vetor vazio. A produção mais alta de isobuteno foi observada para a cepa A que superexpressa ambos os genes, proteína UbiD de S. cerevisiae e proteína UbiX de E.coli. Uma produção significante de isobuteno foi observada para a cepa B que superexpressa proteína UbiD sozinha. Desse modo, a UbiX endógena de E.coli pode contribuir provavelmente para ativar a proteína UbiD de S. cerivisae (Figura 38).
EXEMPLO 7: SÍNTESE ENZIMÁTICA EM UMA ÚNICA ETAPA DE ISOBUTENO A PARTIR DE 3-METILCROTONIL-COA CATALISADA POR UMA ASSOCIAÇÃO DE FOSFOTRANSBUTIRILASE DE BACILLUS SUBTILIS, BUTIRATO QUINASE DE GEOBACILLUS SP. E PROTEÍNA UBID DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE.
[0616] Um vetor de coexpressão pETDuet™-1, que porta o gene UbiD de Saccharomyces cerevisiae (Número de Acesso Uniprot Q03034) e o UbiX gene de Escherichia coli (Número de Acesso Uniprot P0AG03) (Exemplo 6), foi usado para produzir e purificar proteína UbiD de acordo com o protocolo descrito no Exemplo 1. A fosfotransbutirilase de Bacillus subtilis e a butirato quinase de Geobacillus sp. foram purificadas conforme descrito no Exemplo 4.
[0617] Os ensaios enzimáticos foram conduzidos em um volume de reação total de 0,3 ml.
[0618] A mistura de reação padrão conteve: 50 mM de Tris-HCl a pH 7,5 10 mM de 3-metilcrotonil-CoA 10 mM de MgCl2 10 mM de NaCl 10 mM de tampão de fosfato de potássio a pH 7,5. 10 mM de ADP 0,02 mg/ml de fosfotransbutirilase purificada a partir de B. subtilis 0,02 mg/ml de butirato quinase purificada a partir de Geobacillus sp. 1 mg/ml de UbiD de S. cerevisiae A catálise foi conduzida a 30 °C durante 18 h.
[0619] Uma série de ensaios de controle foi realizada em paralelo, em que nenhuma proteína UbiD (controle A) ou fosfotransbutirilase (controle B) ou butirato quinase (controle C) foi adicionada ou nenhum substrato foi adicionado (controle D). Após o período de incubação, o isobuteno produzido no intervalo foi analisado por Cromatografia Gasosa (GC) equipada com Detector de Ionização por Chama (FID). Um ml da fase de gás de intervalo foi separado e analisado de acordo com o método descrito no Exemplo 2. Uma sobreposição de cromatograma típico obtida para o ensaio enzimático total, e os controles correspondentes são mostrados na Figura 39.
[0620] A produção mais alta de isobuteno foi observada no ensaio compreendido de fosfotransbutirilase, butirato quinase e proteína UbiD. O ensaio de controle sem fosfotransbutirilase (controle B) e ensaio de controle sem butirato quinase (controle C) também mostrou uma produção significante de isobuteno. Esses resultados podem ser explicados por hidrólise espontânea de 3-metilcrotonil-CoA em ácido 3- metilcrotônico. A produção enzimática de isobuteno a partir de 3-metilcrotonil-CoA pode ser, desse modo, alcançada por três etapas consecutivas, através da formação de fosfato de 3-metilcrotonila e ácido 3-metilcrotônico como intermediários.
EXEMPLO 8: TRIAGEM IN VITRO DAS PROTEÍNAS UBID PARA A DESCARBOXILAÇÃO DE ÁCIDO 3-METILCROTÔNICO EM ISOBUTENO
[0621] Diversos genes que codificam a proteína UbiD apresentaram otimização de códon para a expressão em E.coli e foram sintetizados por GeneArt® (Thermofisher). As enzimas correspondentes foram purificadas de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 1. A lista das enzimas estudadas é mostrada na Tabela G.
[0622] Os ensaios enzimáticos foram executados em frascos de vidro de 2 ml (Interchim) sob as condições a seguir: 50 mM de tampão de Tris-HCl a pH 7,5 20 mM de NaCl 10 mM de MgCl2 1 mM de DTT 50 mM de ácido 3-metilcrotônico 1 mg/ml de proteína UbiD purificada 100 μl de proteína UbiX contida por lisado de E. coli O volume total dos ensaios foi de 300 μl.
[0623] Uma série de ensaios de controle foi realizada em paralelo, em que nenhuma proteína UbiD foi adicionada, ou nenhuma enzima foi adicionada (Tabela G).
[0624] Os frascos foram vedados e incubados por 60 min a 30 °C. Os ensaios foram interrompidos por incubação durante 2 min A 80 °C e o isobuteno formado no intervalo de reação foi analisado por Cromatografia Gasosa (GC) equipada com Detector de Ionização por Chama (FID), de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 2.
[0625] Os resultados da análise de GC são mostrados na Tabela G. Nenhuma produção de isobuteno foi observada em reações de controle. Esses resultados mostram que todas as proteínas UbiD, estudadas sob as condições desse ensaio de triagem, puderam realizar a descarboxilação de ácido 3-metilcrotônico em isobuteno na presença de proteína UbiX contida por lisado de célula de E. coli.TABELA G.
EXEMPLO 9: CONVERSÃO DE 3-METILCROTONIL-COA E ACETATO EM ÁCIDO 3-METILCROTÔNICO E ACETIL-COA CATALISADA POR COENZIMA A TRANSFERASE DE MEGASPHAERA SP.
[0626] A enzima foi produzida e purificada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 1.
[0627] Os ensaios enzimáticos foram conduzidos em um volume de reação total de 0,2 ml
[0628] A mistura de reação padrão conteve: 50 mM de tampão de Tris-HCl a pH 7,5 5 mM de 3-metilcrotonil-CoA 10 mM de acetato de sódio 10 mM de MgCl2 10 mM de NaCl 3 mg/ml de CoA-transferase purificada de Megasphaera sp. (Número de Acesso Uniprot: S7HFR5).
[0629] Os ensaios de controle foram realizados, nos quais nenhuma enzima foi adicionada, ou nenhum 3-metilcrotonil-CoA foi adicionado. Os ensaios foram incubados por 6 h a 30°C. Os ensaios foram interrompidos adicionando-se 100 μl de MeCN no meio. As amostras foram centrifugadas, filtradas através de um filtro de 0,22 μm e os sobrenadantes clarificados foram transferidos para um frasco transparente para a análise com base em HPLC.
[0630] A análise de HPLC foi realizada com o uso de 1260 Inifinity LC System (Agilent), equipado com um módulo de aquecimento de coluna e detector de UV (260 nm). 5 μl de amostras foram separados em coluna Zorbax SB-Aq (250 x 4,6 mm, 5 μm de tamanho de partícula, temperatura de coluna de 30 °C) com uma taxa de fluxo de fase móvel de 1,5 ml/min. A separação foi realizada com o uso de soluções misturadas A (H2O que contém 8,4 mM de ácido sulfúrico) e B (acetonitrila) em um gradiente linear (0% de B no tempo inicial 0 min^-70% de B em 8 min). Nessas condições, o tempo de retenção de 3-metilcrotonil-CoA, ácido 3-metilcrotônico e acetil- CoA foi 5,22 min, 5,70 min e 4,25 min, respectivamente.
[0631] Quantidades significantes de acetil-CoA e ácido 3-metilcrotônico foram observadas no ensaio de enzima enquanto nenhum dos dois compostos foi observado em controle . Quantidades significantes de acetil-CoA e ácido 3-metilcrotônico foram observadas no ensaio de enzima enquanto nenhum desses dois compostos foi formado em ensaios de controle. Cromatogramas típicos para ensaios enzimáticos e de controle são mostrados na Figura 40.
EXEMPLO 10: DESCARBOXILAÇÃO ENZIMÁTICA DE ÁCIDO 3- METILCROTÔNICO EM ISOBUTENO CATALISADA NA PRESENÇA DE UM LISADO QUE CONTÉM PROTEÍNA UBIX E COM DECARBOXILASE PURIFICADA.
[0632] 0,5 M de solução de estoque de ácido 3-metilcrotônico foi preparado em água e ajustado a pH 7,0 com 10 M de solução de NaOH.
[0633] As proteínas codificadas pelo gene aroY e uma proteína anotada como proteína UbiD foram produzidas de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 1.
[0634] Os ensaios enzimáticos foram executados em frascos de vidro de 2 ml (Interchim) sob as condições a seguir: 50 mM de tampão de fosfato de potássio a pH 7,5 20 mM de NaCl 10 mM de MgCl2 5 mM de DTT 50 mM de ácido 3-metilcrotônico 1 mg/ml de proteína AroY ou UbiD purificada 50 μl de proteína UbiX contida por lisado O volume total dos ensaios foi de 300 μl. Uma série de ensaios de controle foi realizada em paralelo (Tabela H).
[0635] Os frascos foram vedados e incubados por 120 min a 30 °C. Os ensaios foram interrompidos por incubação durante 2 min A 80 °C e o isobuteno formado no intervalo de reação foi analisado por Cromatografia Gasosa (GC) equipada com Detector de Ionização por Chama (FID).
[0636] Para a análise de GC, um ml do gás de intervalo foi separado em um sistema Bruker GC-450 equipado com uma coluna GS-alumina (30 m x 0,53 mm) (Agilent) com o uso de modo isotérmico a 130 °C. O nitrogênio foi usado como gás carreador com uma taxa de fluxo de 6 ml/min.
[0637] O produto de reação enzimática foi identificado por comparação com um padrão de isobuteno. Sob essas condições de GC, o tempo de retenção de isobuteno foi 2,42 min.
[0638] Uma produção significante de isobuteno a partir de ácido 3-metilcrotônico foi observada nos ensaios combinados (proteína AroY ou UbiD + proteína UbiX). A incubação de lisado que contém proteína UbiX sozinha não resultou em produção de isobuteno. Esses dados indicam que as proteínas codificadas por gene aroY em associação com proteína UbiX podem catalisar a descarboxilação de ácido 3- metilcrotônico em isobuteno.TABELA H.
EXEMPLO 11: DESIDRATAÇÃO CATALISADA POR ENZIMA DE 3- HIDROXI-3-METILGLUTARIL-COA EM 3-METILGLUTACONIL-COA.
[0639] Os genes que codificam 3-hidroxiacil-CoA desidratases (também denominadas enoil-CoA hidratases, abreviadas a seguir por ECH) (Tabela I) foram sintetizados e as enzimas correspondentes foram adicionalmente produzidas de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 1. A solução de estoque de 20 mM de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA) foi preparada em água. Os ensaios enzimáticos foram conduzidos em volume total de 0,2 ml nas condições a seguir: - 50 mM de tampão de Tris-HCl a pH 7,5 - 100 mM de NaCl - 2 mM de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA) - 0,1 mg/ml de 3-hidroxiacil-CoA desidratase purificada.
[0640] Os ensaios enzimáticos foram iniciados adicionando-se os 20 μl de 20 mM de substrato, foram executados por 10 min a 30 °C e interrompidos adicionando-se 100 μL de acetonitrila no meio de reação. Todos os ensaios enzimáticos foram realizados em duplicata. As amostras foram, então, centrifugadas, filtradas através de um filtro de 0,22 μm e os sobrenadantes clarificados foram transferidos para um frasco transparente para a análise com base em HPLC.
[0641] A análise foi realizada com o uso de 1260 Inifinity LC System (Agilent), equipado com módulo de aquecimento de coluna e detector de UV (260 nm). 5 μl de amostras foram separados em coluna Zorbax SB-Aq (250 x 4,6 mm, 5 μm de tamanho de partícula, temperatura de coluna de 30 °C) com uma taxa de fluxo de fase móvel de 1,5 ml/min. A separação foi realizada com o uso de soluções misturadas A (H2O que contém 8,4 mM de ácido sulfúrico) e B (acetonitrila) em um gradiente linear (0% de B no tempo inicial 0 min^-70% de B em 8 min). Nessas condições, o tempo de retenção de HMG-CoA, 3-metilglutaconil-CoA (MG-CoA) e coenzima A livre foram respectivamente 4,26 min, 4,76 min e 3,96 min. A Figura 41 mostra áreas de pico de 3-metilglutaconil-CoA (MG-CoA) obtidas a partir da análise com base em HPLC. TABELA I.
EXEMPLO 12: MICRO-ORGANISMO PARA A PRODUÇÃO DE ISOBUTENO DE ACETIL-COA POR MEIO DE ÁCIDO 3-METILCROTÔNICO
[0642] Esse exemplo mostra a produção direta de isobuteno por uma cepa de E. coli recombinante que expressa genes exógenos, assim constituindo a via de isobuteno.
[0643] Como a maioria dos organismos, E. coli converte glicose em acetil-CoA. As enzimas usadas nesse estudo para converter acetil-CoA em isobuteno por meio de ácido 3-metilcrotônico (Figura 42) são resumidas na Tabela J. TABELA J
EXPRESSÃO DE VIA BIOSSINTÉTICA DE ISOBUTENO EM E. COLI
[0644] Todos os genes correspondentes apresentaram otimização de códon para a expressão em E.coli e foram sintetizados por GeneArt® (Life Technologies), exceto pelo gene que codifica a proteína UbiX que foi diretamente amplificada a partir de DNA genômico de E.coli MG1655. A versão modificada de pUC18 (New England Biolabs) que contém um Sítio de Clonagem Múltipla modificado (pUC18 MCS) (WO 2013/007786) foi usada para a superexpressão do gene ubiX. Esse plasmídeo conferiu resistência à ampicilina à cepa recombinante. O vetor construído foi nomeado pGB 5796 e a sequência nucleotídica correspondente e indicada na Tabela K.TABELA K
[0645] Um vetor de expressão que contém a origem de replicação pSC foi usado para a expressão dos genes: thlA, MvaS, ppKF707_3831, MXAN_4264/MXAN_4265, FDC1. Esse plasmídeo conferiu resistência à espectinomicina à cepa recombinante. O vetor de construção foi nomeado pGB 5771 e a sequência nucleotídica correspondente e indicada na Tabela L. TABELA L
[0646] Esses plasmídeos pGBE 5771 e pGBE5796 recombinantes foram verificados por sequenciamento.
[0647] A cepa de E. coli MG1655 foi tornada eletrocompetente e foi transformada com pGBE5771 e pGBE5796 ou com os vetores vazios correspondentes (pUC18 MCS e pGB2021) a fim de criar controles negativos. As cepas produzidas desse modo são resumidas na Tabela M.TABELA M
[0648] As células transformadas foram, então, transferidas para placa em placas LB, suplementadas com ampicilina (100 μg/ml) e espectinomicina (100 μg/ml). As placas foram incubadas de um dia para o outro a 30 °C. As colônias isoladas foram usadas para inocular 1,4 ml de meio autoindutor de ZYM-5052 (Studier FW, Prot. Exp. Pur. 41, (2005), 207 a 234) suplementadas com ampicilina, espectinomicina e 0,5 mM de mononucleotídeo de flavina. Essas culturas foram cultivadas por 16 h a 30 °C e agitação de 700 rpm em microplacas de 96 poços profundos. Então, as culturas foram centrifugadas e os péletes foram ressuspensos em 0,4 ml de meio MS (Richaud C., Mengin-Leucreulx D., Pochet S., Johnson EJ., Cohen GN. e Marlière P, The Journal of Biological Chemistry, 268, (1993), 26.827 a 26.835) que contém glicose (45 g/l), e MgSO4 (1 mM). As culturas foram adicionalmente incubadas em microplacas vedadas de 96 poços profundos a 30°C, agitação de 700 rpm por 24 horas. A produção de isobuteno foi interrompida incubando-se as microplacas por 5 min a 80 °C e o isobuteno formado no intervalo de reação foi analisado por Cromatografia Gasosa (GC) equipada com Detector de Ionização por Chama (FID). 100 μL de gases de intervalo a partir de cada reação enzimática são injetados em um sistema de Brucker GC-450 equipado com um Detector de Ionização de Chama (FID). Os compostos presentes em amostras foram separados por cromatografia com o uso de uma coluna GS-alumina (30 m x 0,53 mm) (Agilent) com o uso de modo isotérmico a 130 °C. O nitrogênio foi usado como gás carreador com uma taxa de fluxo de 6 ml/min. Mediante injeção, as áreas de pico de isobuteno foram calculadas; Tabela N.TABELA N

Claims (13)

1. Método para a produção de isobuteno que compreende a conversão enzimática de ácido 3-metilcrotônico em isobuteno, sendo que o dito método é caracterizado por compreender adicionalmente fornecer o ácido 3-metilcrotônico pela conversão enzimática de 3-metilcrotonil-CoA em ácido 3-metilcrotônico, em que a conversão enzimática de ácido 3-metilcrotônico em isobuteno é alcançada fazendo uso de uma ácido 3-metilcrotônico decarboxilase, em que a ácido 3-metilcrotônico decarboxilase é: (i) uma decarboxilase dependente de FMN associada a uma prenil transferase de FMN; ou (ii) uma protocatecuato (PCA) decarboxilase (EC 4.1.1.63), em que a conversão enzimática de 3-metilcrotonil-CoA em ácido 3- metilcrotônico é alcançada por (a) uma reação enzimática única na qual 3-metilcrotonil-CoA é diretamente convertida em ácido 3-metilcrotônico, fazendo-se uso de uma acetato CoA-transferase (EC 2.8.3.8); (b) uma reação enzimática única na qual 3-metilcrotonil-CoA é diretamente convertida em ácido 3-metilcrotônico, fazendo-se uso de uma acil- CoA hidrolase (EC 3.1.2.20); ou (c) duas etapas enzimáticas que compreendem (i) primeiro converter enzimaticamente 3-metilcrotonil-CoA em fosfato de 3-metilcrotonila; e (ii) então, converter enzimaticamente o fosfato de 3- metilcrotonila obtido desse modo no dito ácido 3-metilcrotônico, em que a conversão enzimática do dito 3-metilcrotonil-CoA em fosfato de 3-metilcrotonila é alcançada fazendo-se uso de uma fosfato butiriltransferase (EC 2.3.1.19) e a conversão enzimática do dito fosfato de 3-metilcrotonila no dito ácido 3-metilcrotônico é alcançada fazendo-se uso de uma butirato quinase (EC 2.7.2.7).
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender adicionalmente fornecer 3-metilcrotonil-CoA pela conversão enzimática de 3-metilglutaconil-CoA em 3-metilcrotonil-CoA.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a conversão enzimática de 3-metilglutaconil-CoA em 3-metilcrotonil-CoA ser alcançada fazendo-se uso de (i) uma metilcrotonil-CoA carboxilase (EC 6.4.1.4); ou (ii) uma geranoil-CoA carboxilase (EC 6.4.1.5).
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por compreender adicionalmente fornecer 3-metilglutaconil-CoA pela conversão enzimática de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA em 3-metilglutaconil- CoA.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a conversão enzimática de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA em 3-metilglutaconil-CoA ser alcançada fazendo-se uso de uma 3-metilglutaconil-coenzima A hidratase (EC 4.2.1.18), uma 3-hidroxiacil-CoA desidratase (EC 4.2.1.-) ou uma enoil-CoA hidratase (EC 4.2.1.-).
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por compreender adicionalmente fornecer o 3-hidroxi-3- metilglutaril-CoA pela condensação enzimática de acetoacetil-CoA e acetil-CoA em 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a condensação enzimática de acetoacetil-CoA e acetil-CoA em 3-hidroxi-3- metilglutaril-CoA ser alcançada fazendo-se uso de uma 3-hidroxi-3-metilglutaril- CoA sintase.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por compreender adicionalmente fornecer o acetoacetil-CoA pela conversão enzimática de acetil-CoA em acetoacetil-CoA que compreende: (a) duas etapas enzimáticas que compreendem (i) primeiro, a conversão enzimática de acetil-CoA em malonil- CoA; e (ii) então, condensar enzimaticamente o malonil-CoA obtido desse modo e acetil-CoA no dito acetoacetil-CoA; ou (b) uma reação enzimática única na qual duas moléculas de acetil- CoA são diretamente condensadas em acetoacetil-CoA.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8(a)(i), caracterizado por a conversão enzimática de acetil-CoA em malonil-CoA ser alcançada fazendo-se uso de uma acetil-CoA carboxilase (EC 6.4.1.2).
10. Método, de acordo com a reivindicação 8(a)(ii), caracterizado por a condensação enzimática de malonil-CoA e acetil-CoA no dito acetoacetil-CoA ser alcançada fazendo-se uso de uma acetoacetil-CoA sintase (EC 2.3.1.194).
11. Método, de acordo com a reivindicação 8(b), caracterizado por a condensação enzimática direta de duas moléculas de acetil-CoA em acetoacetil- CoA ser alcançada fazendo-se uso de uma acetil-CoA C-acetiltransferase (EC 2.3.1.9).
12. Uso de um organismo ou micro-organismo recombinante, caracterizado por ser para a produção de isobuteno, em que o dito organismo ou micro-organismo recombinante expressa uma enzima que catalisa a conversão enzimática de ácido 3-metilcrotônico em isobuteno, conforme definida na reivindicação 1.
13. Uso de uma enzima caracterizado por catalisar a conversão enzimática de ácido 3-metilcrotônico em isobuteno, conforme definida na reivindicação 1, para a produção de isobuteno a partir de ácido 3-metilcrotônico.
BR112018009774-8A 2015-11-17 2016-11-17 Método para a produção de isobuteno, organismo ou microorganismo recombinante e seu uso, uso de uma enzima e composição BR112018009774B1 (pt)

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