KR20230122652A - 3-메틸크로톤산으로부터 이소부텐을 생성시키는 개선된수단 및 방법 - Google Patents

Abstract

(a) 탄소원으로부터 3-메틸크로톤산을 생성시킬 수 있는 미생물을 액체 배지에서 배양함으로써 3-메틸크로톤산을 생성시켜 이를 액체 배지에 축적시키는 단계; (b) (i) FMN 프레닐 트랜스퍼라제와 결합된 FMN-의존성 데카복실라제를 발현하는 미생물을, 단계 (a)에서 수득한 3-메틸크로톤산을 함유하는 액체 배지와 함께 인큐베이션하고/하거나 (ii) FMN 프레닐 트랜스퍼라제와 결합된 FMN-의존성 데카복실라제를, 단계 (a)에서 수득한 3-메틸크로톤산을 함유하는 액체 배지와 함께 인큐베이션함으로써, 단계 (a)에서 수득한 액체 배지에 함유된 3-메틸크로톤산을 이소부텐으로 효소에 의해 전환시키고, 이로써 이소부텐을 생성시키는 단계; 및 (c) 생성된 이소부텐을 회수하는 단계를 포함함을 특징으로 하는, 탄소원으로부터 이소부텐을 생성시키는 방법이 개시되어 있다.

Description

3-메틸크로톤산으로부터 이소부텐을 생성시키는 개선된 수단 및 방법

본 발명은 (a) 탄소원으로부터 3-메틸크로톤산을 생성시킬 수 있는 미생물을 액체 배지에서 배양(culturing)함으로써 3-메틸크로톤산을 생성시켜 이를 액체 배지에 축적시키는 단계; (b) (i) FMN 프레닐 트랜스퍼라제와 결합된 FMN-의존성 데카복실라제를 발현하는 미생물을, 단계 (a)에서 수득한 3-메틸크로톤산을 함유하는 액체 배지와 함께 인큐베이션(incubating)하고/하거나 (ii) FMN 프레닐 트랜스퍼라제와 결합된 FMN-의존성 데카복실라제를, 단계 (a)에서 수득한 3-메틸크로톤산을 함유하는 액체 배지와 함께 인큐베이션함으로써, 단계 (a)에서 수득한 액체 배지에 함유된 3-메틸크로톤산을 이소부텐으로 효소에 의해 전환시키고, 이로써 상기 이소부텐을 생성시키는 단계; 및 (c) 생성된 이소부텐을 회수하는 단계를 포함함을 특징으로 하는, 탄소원으로부터 이소부텐을 생성시키는 방법에 관한 것이다.

현재 많은 수의 화합물이 석유 화학 제품에서 파생된다. 알켄(예컨대, 에틸렌, 프로필렌, 상이한 부텐 또는 펜텐)은 예를 들어 폴리프로필렌 또는 폴리에틸렌을 생성시키기 위해 플라스틱 산업에서, 또한 화학 산업 및 연료의 다른 영역에서 사용된다. 부틸렌은 4가지 형태로 존재하는데, 그 중 하나인 이소부텐(이소부틸렌이라고도 함)은 자동차 연료용 노킹-방지 첨가제인 메틸-3급-부틸-에터(MTBE)의 조성물에 들어간다. 이소부텐은 또한 이소옥텐을 생성시키는 데에도 사용될 수 있으며, 이소옥텐은 다시 이소옥탄(2,2,4-트리메틸펜탄)으로 환원될 수 있는데; 옥탄가가 매우 높은 이소옥탄은 이른바 "가솔린" 엔진에 가장 우수한 연료이다. 이소부텐과 같은 알켄은 현재 석유 제품의 촉매적 크래킹(cracking)에 의해(또는 헥센의 경우, 석탄 또는 가스로부터 피셔-트롭쉬 공정의 파생 공정에 의해) 생성된다. 따라서, 생산 비용은 유가와 밀접한 관련이 있다. 더욱이, 촉매적 크래킹은 때때로 공정 복잡성과 생산 비용을 증가시키는 상당한 기술적 어려움과 관련된다.

지구화학적 순환과 조화를 이루는 지속 가능한 산업 운영의 맥락에서 이소부텐과 같은 알켄의 생물학적 경로에 의한 생산이 요구된다. 발효 및 증류 공정이 이미 식품 가공 산업에 존재한 바와 같이, 1세대 바이오 연료는 에탄올의 발효 생성으로 구성되었다. 2세대 바이오 연료의 생산은 특히 장쇄 알코올(부탄올 및 펜탄올), 테르펜, 선형 알칸 및 지방산의 생성을 비롯하여 탐색 단계에 있다. 두 개의 최근 리뷰는 이 분야의 연구에 대한 일반적인 개요를 제공한다: 래디기나(Ladygina) 등[Process Biochemistry 41 (2006), 1001] 및 와켓(Wackett)[Current Opinions in Chemical Biology 21 (2008), 187].

효모 로도토룰라 미누타(Rhodotorula minuta)에 의한 이소발레레이트의 이소부텐으로의 전환이 기재된 바 있다{후지이(Fujii) 등[Appl. Environ. Microbiol. 54 (1988), 583]}.

고거티(Gogerty) 등[Appl. Environm. Microbiol. 76 (2010), 8004-8010] 및 반 리우웬(van Leeuwen) 등[Appl. Microbiol. Biotechnol. 93 (2012), 1377-1387]은 효소적 전환에 의한 아세토아세틸-CoA로부터의 이소부텐의 생성을 기재하고 있으며, 여기에서 제안된 경로의 마지막 단계는 메발로네이트 디포스페이트 데카복실라제의 사용에 의한 3-하이드록시-3-메틸부티르산[또한 3-하이드록시이소발레레이트(HIV)라고도 함]의 전환이다. 3-하이드록시-3-메틸부티르산으로부터 이소부텐을 생성시키기 위한 이 반응은 WO 2010/001078 호에도 기재되어 있으며, 이는 일반적으로 생물학적 공정을 통해 알켄을 생성시키는 방법, 특히 3-하이드록시알카노에이트 유형의 분자로부터 말단 알켄(특히 프로필렌, 에틸렌, 1-부틸렌, 이소부틸렌 또는 이소아밀렌)을 생성시키는 방법을 기재한다.

WO 2012/052427 호는 또한 생물학적 공정을 통해 알켄을 생성시키는 방법을 기재하고 있으며, 구체적으로는 3-하이드록시알카노에이트 유형의 분자로부터 알켄(예를 들어, 프로필렌, 에틸렌, 1-부틸렌, 이소부틸렌 또는 이소아밀렌)을 생성시키는 방법을 기재하고 있다. 이와 관련하여, 3-하이드록시-3-메틸부티르산으로부터 이소부텐을 생성시키는 반응은 WO 2012/052427 호에도 기재되어 있다.

WO 2016/042012 호는 상기 3-하이드록시-3-메틸부티르산의 제조 방법을 기재한다. 구체적으로, WO 2016/042012 호에는 3-메틸크로토닐-CoA를 3-메틸크로톤산으로 효소에 의해 전환시키는 단계 및 이렇게 생성된 3-메틸크로톤산을 3-하이드록시-3-메틸부티르산으로 효소에 의해 추가 전환시키는 단계를 포함하는, 3-하이드록시-3-메틸부티르산을 생성시키는 방법이 기재되어 있다.

고거티 등(전게서) 및 반 리우웬 등(전게서)은 3-메틸크로토닐-CoA의 3-하이드록시-3-메틸부티릴-CoA를 거치는 전환에 의해 3-하이드록시-3-메틸부티르산의 생성이 달성되는 것으로 제안한다. 재생 가능한 자원으로부터 이소부텐을 생성시키는 방법의 효율성 및 가변성을 추가로 개선하기 위해, 3-메틸크로톤산(또한 3-메틸-2-부텐산, 3,3-디메틸아크릴산 또는 세네시오산으로도 칭함)의 이소부텐으로의 효소적 전환을 포함하는 이소부텐의 제조 방법을 제공함으로써, 이소부텐 및 그의 전구체를 제공하는 다른 경로를 개발하였다.

특히, WO 2017/085167 호에는 3-메틸크로톤산의 이소부텐으로의 효소적 전환을 포함하는 이소부텐의 제조 방법이 기재되어 있으며, 여기에서 3-메틸크로톤산의 이소부텐으로의 효소적 전환은 FMN 프레닐 트랜스퍼라제와 결합된 FMN-의존성 데카복실라제를 사용함으로써 달성되며, 이 때 상기 FMN 프레닐 트랜스퍼라제는 디메틸알릴 포스페이트(DMAP)를 사용하는 플라빈 보조인자(FMN 또는 FAD)의 플라빈-유래 보조인자로의 프레닐화를 촉진하는데, 이러한 효소는 궁극적으로 이소부텐의 생성을 유도하는 경로에서 인위적으로 구현되었다. 또한, WO 2017/085167 호에는 (a) 3-메틸크로토닐-CoA의 3-메틸크로톤산으로의 효소적 전환에 의해 3-메틸크로톤산을 제공하거나, 또는 (b) 3-하이드록시이소발레레이트(HIV)의 3-메틸크로톤산으로의 효소적 전환에 의해 3-메틸크로톤산을 제공함을 추가로 포함하는 방법이 기재되어 있다.

WO 2017/085167 호는 또한 3-메틸크로토닐-CoA로부터 3-메틸크로톤산을 거쳐 또는 3-하이드록시이소발레레이트(HIV)로부터 3-메틸크로톤산을 거쳐 이소부텐을 생성시키기 위해 개발된 이 방법이 많은 생화학 반응에 사용되는 대사의 중심 성분이자 중요한 핵심 분자인 아세틸-CoA에서 출발하는 이소부텐 생성 경로에 삽입될 수 있다고 기재하고 있다. 해당 반응은 도 1에 개략적으로 도시된다.

WO 2018/206262 호에는, DMAP 대신 디메틸알릴 피로포스페이트(DMAPP)가 사용되는 경우 FMN 프레닐 트랜스퍼라제와 결합된 FMN-의존성 데카복실라제를 사용함으로써 3-메틸크로톤산을 효소에 의해 이소부텐으로 전환시킨다고 기재되어 있다.

또한, WO 2018/206262 호는 FMN 프레닐 트랜스퍼라제와 결합된 FMN-의존성 데카복실라제를 사용함으로써 달성되는 3-메틸크로톤산의 이소부텐으로의 효소적 전환을 기재하는데, 여기에서 상기 FMN 프레닐 트랜스퍼라제는 디메틸알릴 포스페이트(DMAP) 및/또는 디메틸알릴 피로포스페이트(DMAPP)를 사용하는 플라빈 보조인자(FMN 또는 FAD)의 프레닐화(이는 아세틸-CoA에서 이소부텐으로의 상기 전체 대사 경로의 핵심 단계임)를 촉진한다. 이 핵심 단계에서는, 디메틸알릴 포스페이트(DMAP) 및/또는 디메틸알릴 피로포스페이트(DMAPP)의 가용성(availability) 및 플라빈 보조인자 FMN의 가용성이 제한 요인이지만, WO 2018/206262 호에서는 프레닐화된 플라빈 보조인자(FMN 또는 FAD)의 효율적인 생합성을 보장하기 위하여 디메틸알릴 포스페이트(DMAP) 및/또는 디메틸알릴 피로포스페이트(DMAPP)의 풀(pool)/양을 증가시킴으로써 개선된 방법이 기재되어 있다.

또한, WO 2020/188033 호는 이소부텐 생성에 사용되는 세포에서 높은 아세틸-CoA 풀을 제공 및 유지함으로써 이소부텐의 수율을 증가시킨다는 개념을 기반으로 하며, 여기에서 아세틸-CoA 풀은 세포에 의한 판토테네이트의 증가된 흡수 및/또는 판토테네이트의 CoA로의 증가된 전환을 보장함으로써 높게 유지된다. 따라서, WO 2020/188033 호는 특히 아세틸-CoA를 이소부텐으로 효소에 의해 전환시킬 수 있는 재조합 유기체 또는 미생물을 기재하며, (A) 상기 유기체 또는 미생물에서: (i) 아세틸-CoA는 효소에 의해 아세토아세틸-CoA로 전환되고, (ii) 아세토아세틸-CoA는 효소에 의해 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA로 전환되고, (iii) 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA는 효소에 의해 3-메틸글루타코닐-CoA로 전환되며, (iv) 3-메틸글루타코닐-CoA는 3-메틸크로토닐-CoA로 효소에 의해 전환되고, (v) 상기 3-메틸크로토닐-CoA는 (a) 3-메틸크로토닐-CoA를 3-메틸크로톤산으로 효소에 의해 전환한 다음 이를 효소에 의해 상기 이소부텐으로 추가로 전환함으로써, 또는 (b) 3-메틸크로토닐-CoA를 3-하이드록시-3-메틸부티릴-CoA로 효소에 의해 전환한 다음, 이를 효소에 의해 3-하이드록시-3-메틸부티르산으로 추가로 전환시키고, 이어서 이를 3-포스포녹시-3-메틸부티르산으로 추가로 효소에 의해 전환시킨 후, 이를 상기 이소부텐으로 추가로 효소에 의해 전환시킴으로써 이소부텐으로 전환되며; (B) 상기 재조합 유기체 또는 미생물은 (i) 판토테네이트의 증가된 흡수; 및/또는 (ii) 판토테네이트의 CoA로의 증가된 전환으로 인해 유도되는 유기체 또는 미생물에 비해 증가된 조효소 A(CoA)의 풀을 갖는다.

또한, WO 2014/086780 호는 액체 발효 배지에서 유기체를 배양하는 것을 포함하는, 탄화수소 화합물, 바람직하게는 이소부텐을 생성시키기 위한 발효 방법을 기재하고 있으며, 여기에서 상기 유기체는 효소적 경로에 의해 원하는 탄화수소 화합물을 생성시키고, 상기 효소적 경로는 기상으로 증발되는 중간체를 포함하며, 상기 중간체는 기상으로부터 회수되어 액체 발효 배지 내로 재도입된다.

또한, WO 2014/086781 호는 탄화수소, 바람직하게는 이소부텐의 발효적 생성 방법을 기재하고 있는데, 여기에서는 탄화수소를 생성시키는 미생물을 발효기의 액체 발효 배지에서 배양하며, 산소를 포함하는 유입 가스를 발효기 내로 공급하고, 발효기에 도입되기 전에 유입 가스의 총 압력은 약 1.5바(bar) 내지 약 15바(약 150kPa 내지 약 1500kPa)이며, 탄화수소는 발효 배출 가스에서 기체 상태로 얻어지며, 발효 배출 가스 중 산소의 농도는 약 10부피% 미만으로 제어된다.

상기 기재된 바와 같이, 생물학적 시스템 및 발효 공정/발효기에서 효소적 전환에 의해(이로써, 재생 가능한 자원이 원료로서 사용될 수 있음) 이소부텐을 생성시키기 위한 다양한 접근법이 선행 기술에 기재되어 있으나, 특히 수율 및/또는 안전성을 높이고 상업적으로 더 매력적으로 만들기 위해 이러한 (발효) 방법의 효율성, 유효성 및 안전성에 대해 여전히 개선이 필요하다.

본 발명은 제 1 양태에서 (a) 탄소원으로부터 3-메틸크로톤산을 생성시킬 수 있는 미생물을 액체 배지에서 배양함으로써 3-메틸크로톤산을 생성시켜 이를 액체 배지에 축적시키는 단계; (b) (i) FMN 프레닐 트랜스퍼라제와 결합된 FMN-의존성 데카복실라제를 발현하는 미생물을, 단계 (a)에서 수득한 3-메틸크로톤산을 함유하는 액체 배지와 함께 인큐베이션하고/하거나 (ii) FMN 프레닐 트랜스퍼라제와 결합된 FMN-의존성 데카복실라제를, 단계 (a)에서 수득한 3-메틸크로톤산을 함유하는 액체 배지와 함께 인큐베이션함으로써, 단계 (a)에서 수득한 액체 배지에 함유된 3-메틸크로톤산을 이소부텐으로 효소에 의해 전환시키고, 이로써 상기 이소부텐을 생성시키는 단계; 및 (c) 생성된 이소부텐을 회수하는 단계를 포함함을 특징으로 하는, 탄소원으로부터 이소부텐을 생성시키는 방법을 제공함으로써 이러한 요구를 충족시킨다.

제 2 양태에서, 본 발명은 (a) 탄소원으로부터 3-메틸크로톤산을 생성시킬 수 있는 미생물을 액체 배지에서 배양함으로써 3-메틸크로톤산을 생성시켜 이를 액체 배지에 축적시키는 단계; (b) 바람직하게는 180℃ 내지 400℃에서, 단계 (a)에서 수득한 액체 배지에 함유된 3-메틸크로톤산을 이소부텐으로 열화학적으로 전환시키는 단계; 및 (c) 생성된 이소부텐을 회수하는 단계를 포함함을 특징으로 하는, 탄소원으로부터 이소부텐을 생성시키는 방법을 제공한다.

지금까지 고려된 바와 같이, 3-메틸크로톤산(본원에서는 때때로 프레네이트라고도 함)으로부터 이소부텐을 생성시키는 발효 방법은 이소부텐을 생성시킬 수 있는 미생물을 사용하는 통상적인 발효 방법을 기반으로 한다. 통상적인 발효 조건에서 기상 화합물로서 생성되는 이소부텐은 다양한 가스의 혼합물(이는 배양(cultivation) 동안 배양 통기에 사용되는 유입 가스의 일부이거나 또는 배양 동안 생성됨)인 배양 배출 가스의 일부로서 회수된다. 이러한 조건 하에서, 배양의 배출 가스 중 이소부텐의 백분율은 일반적으로 약 3 내지 7몰%의 양에 도달하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 배출 가스로부터 이소부텐을 원하는 순도로 정제하기 위해서는 상당한 시간과 노력이 필요하다.

본 발명자들은 놀랍게도, 먼저 3-메틸크로톤산이 발효 동안 탄소원으로부터 생성되어 배지에 축적되고(이소부텐으로 직접 전환되지 않음) 3-메틸크로톤산이 배지에 축적된 후에야 3-메틸크로톤산이 이후 별도의 반응에서 이소부텐으로 전환됨을 보장한다는 면에서, 3-메틸크로톤산을 생성시키는 효소적 반응 및 후속하는 3-메틸크로톤산의 이소부텐으로의 효소적 전환이 분리된다면, 3-메틸크로톤산에서 이소부텐으로의 생물학적 전환을 포함하는 발효 방법의 배출 가스 중 이소부텐의 양/백분율이 극적으로 증가될 수 있다는 것을 발견하였다. 3-메틸크로톤산을 이소부텐으로 전환하는 제 2 단계는 단순화된 조건에서 달성될 수 있고 발효 조건의 유지를 필요로 하지 않는다. 이 제 2 단계에서는 3-메틸크로톤산의 전환을 허용하는 효소 또는 그러한 효소를 생성시키는 미생물의 세포를 축적된 3-메틸크로톤산과 접촉시키는 것으로 충분하다. 축적된 3-메틸크로톤산 및 효소/미생물을 함유하는 용액의 단순한 인큐베이션이 3-메틸크로톤산을 이소부텐으로 매우 효율적으로 전환시키고 배양 반응의 배출 가스 중 이소부텐의 백분율을 매우 높게 만드는 것으로 밝혀졌다. 또한, 3-메틸크로톤산이 이소부텐으로 전환되는 인큐베이션 단계가 가스 공급이 전혀 없거나 매우 낮은 용기에서 수행된다면 유리한 것으로 밝혀졌다.

하기 실시예에 나타낸 바와 같이, 청구된 방법은 3-메틸크로톤산(프레네이트)을 이소부텐으로 효율적으로 전환시켜 이소부텐을 효율적으로 생성시킬 수 있게 한다. 또한, 실시예는 3-메틸크로톤산의 이소부텐으로의 전환에 이용되는 인큐베이션 단계 동안 가스 공급이 낮게 유지되거나(즉, < 0.1vvm) 가스가 공급되지 않을 때(0vvm), 생성되는 이소부텐(IBN) 농도가 배출 가스에서 특히 높음을 보여준다. 따라서, 이소부텐을 원하는 순도로 정제하기가 더 용이하다.

실시예에 나타낸 바와 같이, 3-메틸크로톤산이 이소부텐으로 전환되는 인큐베이션 단계 동안 낮은 가스 공급 조건을 이용하는 경우에는, 이소부텐 및 CO₂(이는 3-메틸크로톤산의 이소부텐으로의 효소적 탈카복실화 동안 생성됨)가 높은 농도로 생성되고, 실제로 인큐베이션 단계 동안 가스 공급을 극도로 낮게 유지하는 경우에는 기본적으로 CO₂와 이소부텐만 생성된다.

3-메틸크로톤산에 대해 언급할 때마다, 그의 탈양성자화된 카복실레이트 이온 형태(즉, COO^- 형태, 즉 3-메틸크로토네이트)와 그의 양성자화된 산성 형태(즉, COOH 형태, 다시 말해 메틸크로톤산) 둘 다를 의미한다. 실제로, 그의 형태는 용액의 pH에 따라 달라지며, 따라서 3-메틸크로톤산의 정의는 두 형태, 즉 3-메틸크로토네이트 뿐만 아니라 3-메틸크로톤산을 호환적으로 나타낸다.

염 형태, 즉 3-메틸크로토네이트로서 존재하는 경우, 바람직한 양이온은 Na⁺, Ca²⁺, Mg²⁺, K⁺ 또는 NH⁴⁺이다.

본 발명에 따른 방법은 단계 (a)에서 (a) 탄소원으로부터 3-메틸크로톤산을 생성시킬 수 있는 미생물을 액체 배지에서 배양함으로써 3-메틸크로톤산을 생성시켜 이를 액체 배지에 축적시킴을 포함한다.

이 문맥에서 사용되는 "배양"이라는 용어는 세포를 액체 배지에 유지함으로써 세포를 생명력 있게 유지하고 원하는 생성물(들)의 생성에 요구되는 효소를 생성시킬 수 있게 함을 의미한다. 바람직하게는, 용어 "배양"은 미생물 세포의 번식, 증식 및 세포 분열을 허용하는 조건 하에서 미생물 세포를 생육시킴으로써 액체 배지 중 세포의 수를 증가시킴을 포함한다. 따라서, 용어 "배양"은 세포의 생존뿐만 아니라 탄소원을 3-메틸크로톤산으로 전환시키기 위해 세포에 요구되는 대사 과정의 발생을 허용하는 배양 조건에서 미생물을 유지하는 것을 의미한다. 이러한 조건은 일반적으로 배지에서 탄소원을 세포에 제공하고, 배지를 진탕시키고, 요구되는 대사 전환(및 필요한 경우 미생물의 생육)이 일어나도록 허용하는 값으로 배지의 온도를 유지하며, 세포의 생존 및 대사 활동을 가능하게 하는 공기 또는 가스 혼합물을 배양되는 세포에 공급하는 것을 포함한다.

따라서, 이 문맥에서 사용되는 "배양"이라는 용어는 "발효", 즉 바람직하게는 효소의 작용을 통해 유기 기질에서 화학적 변화를 일으키는 대사 과정으로 이해되어야 하며, 따라서 생성물이 미생물의 천연 또는 유전적으로 변형된 대사를 통해 생육 기질로부터 합성되고 대사 중간체에 의해 달성되는 과정을 가리킨다. 따라서, 배양이라는 용어는 배양되는 세포의 대사, 생육 및 생존을 가능하게 한다. 더욱이, 이를 가능하게 하기 위해 배양 단계는 탄소원 및 에너지원(예를 들어, 글루코스 및 산소의 형태)이 존재할 것을 요구한다.

일반적으로, 본 발명에 따른 방법의 배양 단계 (a)는 단계 (a)에서 사용되는 특정 미생물에 적합화된 배지 및 배양 조건과 함께 당업계에 잘 알려진 수단(예컨대, 발효기 및 그의 장비) 및 방법을 사용하는 고전적인 발효 방법의 관점에서 수행될 수 있다.

용어 "탄소원으로부터 3-메틸크로톤산을 생성시킬 수 있는 미생물"은 적합한 조건에서 배양될 때 각각의 탄소원을 3-메틸크로톤산으로 전환시킬 수 있는 효소를 발현할 수 있고 따라서 배양 동안 탄소원으로부터 3-메틸크로톤산을 생성시키는 미생물을 가리킨다.

탄소원으로부터 3-메틸크로톤산을 효소에 의해 생성시키는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 각각의 효소적 전환을 촉진시킬 수 있는 (재조합) 미생물이 기재된 바 있다. 원칙적으로, 탄소원을 3-메틸크로톤산으로 전환시킬 수 있는 임의의 미생물이 본 발명의 방법의 단계 (a)에서 사용될 수 있다.

예로서(이들로 한정되지 않음), 탄소원에서 출발하는 3-메틸크로톤산으로의 효소적 전환의 가능한 개별 단계를 하기에 추가로 기재한다. 또한, 바람직한 실시양태에서, 추가 예로서(이들로 한정되지 않음), 중심 대사산물인 아세틸-CoA 및 추가로 3-메틸크로톤산을 발생시키는 탄소원으로부터 출발하는 효소적 전환의 가능한 개별 단계가 하기에 추가로 기재된다.

또한, "탄소원으로부터 3-메틸크로톤산을 생성시킬 수 있는 미생물"이라는 용어는 본 발명의 맥락에서 이러한 미생물이 적용된 배양 조건 하에서 생성된 3-메틸크로톤산을 다른 화합물(구체적으로는 이소부텐)로 추가로 대사 또는 전환하지 않거나 또는 실질적인 한도까지 추가로 대사 또는 전환하지 않는다는 것을 의미한다. 이 용어는 특히 미생물이 배양 단계 (a) 동안 생성된 3-메틸크로톤산을 이소부텐으로 전환시키지 않는다는 것을 의미한다. 이는 본 발명에 따른 방법의 단계 (a)에서 사용되는 미생물이 3-메틸크로톤산을 이소부텐으로 전환시킬 수 있는 효소를 코딩하는 유전 정보를 포함하지 않아 이 반응을 촉진시킬 수 있는 효소를 생성시킬 수 없다는 사실에 기인한다.

다르게는, 단계 (a)에서 사용되는 미생물이 3-메틸크로톤산을 이소부텐으로 전환시킬 수 있는 효소를 코딩하는 유전 정보를 포함하지만 단계 (a)에서 사용되는 배양 조건 하에서 이 효소를 발현하지 않는 미생물일 수 있다. 예를 들어, 상응하는 효소를 코딩하는 유전자는, 활성이 조절될 수 있고 단계 (a)에서 사용되는 배양 조건 하에서 불활성인 프로모터의 제어 하에 놓일 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법의 단계 (a)에서 사용되는 미생물은 3-메틸크로톤산을 이소부텐으로 전환시킬 수 있는 효소를 코딩하는 유전자를 포함하지 않는 미생물이다.

그러나, 본 발명의 방법의 단계 (a)에서는 원칙적으로 3-메틸크로톤산을 이소부텐으로 전환시킬 수 있는 효소(예를 들어, FMN 프레닐 트랜스퍼라제와 결합된 FMN-의존성 데카복실라제)를 코딩하는 유전자를 자연적으로 포함하지만 3-메틸크로톤산을 이소부텐으로 전환시키는 이 효소의 활성이 낮아서 배양 단계 (a) 동안 임의의 실질적인 전환이 일어나지 않는 미생물을 사용할 수도 있다.

본 발명에 따른 방법의 단계 (a)의 배양 동안 미생물에 의해 생성되는 3-메틸크로톤산은 배지에 축적된다.

따라서, 단계 (a)의 배양은 탄소원이 3-메틸크로톤산으로 전환되어 배지에 축적될 수 있도록 하기에 충분한 시간 동안 수행된다. 바람직하게는, 배양은 배지에 제공된 탄소원이 세포에 의해 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상 또는 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 더 바람직하게는 80% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 90% 이상, 또는 95% 이상, 특히 바람직하게는 99% 이상 대사될 때까지(즉, 배지로부터 결핍될 때까지) 수행된다.

"축적된다"는 것은 단계 (a)에서 미생물에 의해 생성되는 3-메틸크로톤산이 주로 배지에 존재하고 단계 (a)에서 배양되는 동안 그의 농도가 증가함을 의미한다. 바람직하게는, 3-메틸크로톤산의 농도가 더 이상 증가하지 않을 때까지 배양한다.

또한 바람직하게는, 단계 (a)의 배양은 5g/l 이상, 더 바람직하게는 10g/l 이상, 더욱 더 바람직하게는 20g/l 이상, 훨씬 더 바람직하게는 40g/l 이상의 3-메틸크로톤산 농도가 액체 배지에서 달성될 때까지 수행된다.

본 발명의 방법의 단계 (a)에서 3-메틸크로톤산이 목적하는 만큼 배지에 축적되면, 미생물 배양을 중단한다. 배양 중단은 세균의 성장을 유지하기 위해 발효 방법에 사용되는 조치가 중단됨을 의미한다.

탄소원 소비량이 적고/적거나(바람직하게는, 0.03g 탄소원/g DCW(세포 건조 중량)/시간 미만) 3-메틸크로톤산 생성 속도가 낮을 때(바람직하게는 0.01g 3-메틸크로톤산/g DCW/시간 미만), 배양을 중단하는 것이 바람직하다.

탄소원 소비 및 3-메틸크로톤산 생성은 각각 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 HPLC에 의해 측정될 수 있다.

또한, 바람직하지 않은 부산물(예를 들어, 아세트산, 락트산과 같은 유기산, 또는 에탄올과 같은 알코올)이 배지에 축적되기 시작할 때, 배양을 바람직하게 중단할 수 있다. 배양물 중의 부산물의 축적은 당업계에 공지된 방법(예를 들어, HPLC 또는 GC 분석)에 의해 측정될 수 있다.

바람직하게는, 통기 및/또는 탄소원의 제공을 종료함으로써 배양을 중단할 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 방법의 배양 단계 (a)가 끝나면, 축적된 3-메틸크로톤산 및 이를 생성시키기 위해 사용된 미생물을 포함하는 액체 배지가 얻어진다. 이 액체 배지를 이후에 본 발명에 따른 방법의 인큐베이션 단계 (b)에서 사용한다.

본 발명에 따른 방법의 단계 (b)에 따라, 단계 (a)에서 생성되고 액체 배지에 함유된 3-메틸크로톤산을 후속적으로 이소부텐으로 효소에 의해 전환시킨다.

이 단계는, 미생물 배양을 필요로 하지 않고, 단계 (a)에서 생성된 3-메틸크로톤산을, 3-메틸크로톤산을 이소부텐으로 전환시킬 수 있는 효소(특히, FMN 프레닐 트랜스퍼라제와 결합된 FMN-의존성 데카복실라제) 또는 그러한 효소를 생성시키는 미생물(미생물의 미리 생육시킨 배양물)과 함께 간단히 인큐베이션함으로써 달성될 수 있다. 이 단계 (b)에서 배양시키지 않는다는 것은 예를 들어 일반적으로 더 이상의 영양분을 첨가하지 않는다는 것을 의미한다. 인큐베이션은 단지 기질(3-메틸크로톤산)과 효소(단리된 효소의 형태 또는 예비 배양되고 효소를 합성한 미생물의 형태)를 접촉시키고 3-메틸크로톤산의 이소부텐으로의 효소적 전환을 허용하는 제어된 반응 조건(예컨대, 온도 및 pH 값) 하에서 인큐베이션하기만 하면 된다.

단계 (a)의 배양은 상기한 바와 같이 중단시킬 수 있지만, 3-메틸크로톤산을 함유하는 액체 배지를 FMN 프레닐 트랜스퍼라제와 결합된 FMN-의존성 데카복실라제를 발현하는 세포 또는 FMN 프레닐 트랜스퍼라제와 결합된 FMN-의존성 데카복실라제와 함께 합침으로써 인큐베이션을 시작할 수 있다.

따라서, 본 발명의 방법의 단계 (b)에서 사용되는 "인큐베이션"이라는 용어는 반드시 미생물(이 단계에서 사용되는 경우)이 활력을 유지하도록 요구하는 것은 아니다. "인큐베이션"이라는 용어는 또한 단계 (b)에서 사용되는 미생물의 추가적인 증식/생육을 반드시 포함하는 것은 아니다. 본 발명의 관점에서 "인큐베이션"는 바람직하게는 3-메틸크로톤산을 이소부텐으로 전환시킬 수 있는 최적의 온도, 습도 및 기타 조건 하에서 각각 원하는 효소를 발현하는 미생물 및 효소를 활성 상태로 유지하는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명의 관점에서 "인큐베이션"는 단계 (a)의 "배양"/"발효"와는 달리 본질적으로 3-메틸크로톤산의 이소부텐으로의 전환만을 가리키며, 3-메틸크로톤산의 이소부텐으로의 전환에 필요한 미생물의 증식/생육 및/또는 개별 효소의 생성이 반드시 필요한 것은 아니다. 따라서, 본 발명의 방법의 단계 (b)의 "인큐베이션"에서, 3-메틸크로톤산의 이소부텐으로의 전환에 필요한 미생물의 증식/생육 및/또는 개별 효소의 생성(어쨌든 포함되거나 요구되는 경우)은 3-메틸크로톤산의 이소부텐으로의 실제 전환과는 물리적으로 분리된다. 대조적으로, 상기 "배양"에서는, 탄소원에서 3-메틸크로톤산으로의 단계들이 아래에서 더 자세히 기재되는 바와 같이 연결된다.

본 발명에 따른 방법의 인큐베이션 단계 (b)는 단계 (a)에서 생성된 3-메틸크로톤산을 함유하는 용액 및 3-메틸크로톤산을 이소부텐으로 전환시키는 효소 또는 이 효소를 발현하는 미생물을 포함하는 용기에서 수행된다.

용기는 용기 외부로의 가스 흐름 및 임의적으로는 용기 내부로의 가스 흐름을 제어할 수 있도록 폐쇄 시스템으로 설계된다.

용기는 또한 인큐베이션 단계 (b) 동안 용기에 함유된 용액을 진탕시키기 위한 수단 또는 온도를 제어하기 위한 수단을 구비할 수 있다.

이론에 구속되지 않으면서, 진탕은 3-메틸크로톤산을 함유하는 용액을 세포/효소와 혼합시키고, 따라서 용액에서 세포 및/또는 효소 및 3-메틸크로톤산을 균등하게 분포시킨다. 더욱이, 진탕은 이소부텐과 같은 기체 성분이 용액에서 기상으로 빠져나가는 것을 촉진할 수 있다.

유리하게는, 바람직한 실시양태에서, 용기는 pH 조절 시스템 및/또는 용기 내 액체 배지의 pH를 조절/조정하는 데 사용되는 산 저장 탱크로의 연결부를 포함한다. 예를 들어, 황산 또는 인산을 사용하여 pH를 조절/조정할 수 있다.

또 다른 바람직한 실시양태에서는, 인큐베이션 단계 (b) 동안 3-메틸크로톤산(또는 이의 염)의 (농축된) 용액, 바람직하게는 3-메틸크로톤산(이는 본 발명에 따른 방법의 단계 (a)에 따라 생성되었음)을 용기에 공급할 수 있다. 용액에 3-메틸크로톤산을 공급하는 가능한 방법은 아래에 기재된다. 인큐베이션 단계 (b) 동안 용기에 3-메틸크로톤산을 공급함으로써, 예를 들어 배지 내 3-메틸크로톤산의 농도를 이소부텐으로의 효율적인 전환을 허용하는 원하는 수준으로 유지할 수 있다. 따라서, 이러한 실시양태에서는, 배지 내의 3-메틸크로톤산의 농도를 모니터링하고(예를 들어, 항상 또는 미리 결정된 시간 간격으로) 추가의 3-메틸크로톤산을 배지에 공급함으로써 농도를 원하는 농도로 조정할 수 있다.

본 발명의 한 실시양태에서, 인큐베이션 단계 (b)는 폐쇄 시스템으로 설계되고 유출구를 통한 가스의 제어된 유출만을 허용하는(가스의 유입은 허용하지 않음) 용기에서 수행된다. 해당 용기는 도 4의 상부에 개략적으로 도시되어 있다. 따라서, 이러한 실시양태에서는 외부로부터의 가스 공급이 없고, 상기 방법은 가스 공급이 없는 용기에서 수행된다. 이 경우, 인큐베이션 단계 (b) 동안 생성된 가스(이소부텐 포함)는 가스의 유출을 허용하는 유출구를 통해 배출 가스로서 포획된다. 따라서, 이러한 폐쇄 시스템에서, 본 발명의 단계 (b)의 인큐베이션 동안 생성된 가스는 유입 가스로 상응하는 가스 부피를 재보충하지 않고 용기로부터 회수될 수 있다. 즉, 인큐베이션 동안 가스(이소부텐 포함)가 생성되면, 이러한 생성으로 인해 용기 내 압력이 증가한다. 일정한 압력을 유지하기 위해 유출구를 통해 용기로부터 가스를 회수할 수 있다.

따라서, 그러한 상황에서, 용기는 폐쇄 시스템(가스 유출구와는 별도)이고. 용기 내의 압력은 바람직하게는 증가하지 않는 방식으로(즉, 유출구를 통한 가스 유출을 허용함으로써) 제어된다.

첨부된 실시예에서는 인큐베이션 단계 (b) 동안 가스 공급이 전혀 없는 이러한 인큐베이션이 매우 높은 함량의 이소부텐을 갖는 가스의 생성으로 이어짐을 보여준다.

다른 실시양태에서는, 폐쇄 시스템으로서 설계되지만 제어된 가스 유출 및 제어된 가스 유입을 허용하는 용기에서 인큐베이션 단계 (b)를 수행한다. 그러한 실시양태에서는, 유입 가스를 제어된 방식으로 시스템에 제공할 수 있고, 이소부텐을 함유하는 인큐베이션에 의해 생성된 가스를 시스템 밖으로 밀어내기 위해 유입 가스를 사용할 수 있다. 해당 용기는 도 4의 하부에 개략적으로 도시되어 있다.

따라서, 유입 가스(예를 들어, 아래에서 더욱 상세하게 설명되는 바와 같이 질소, 공기 등과 같은)가 제어된 방식으로 공급될 수 있는 유입구가 있다. 또한, 가스 유출을 허용하는 유출구가 있다.

이러한 상황에서 유입 가스(가스 공급)의 유동(flux)은 낮은 속도로 유지되는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 유동은 0.1vvm(분당 용기 부피) 미만의 속도로 유지된다.

단위 "vvm"("분당 용기 부피"를 의미함)은 당업자에게 공지되어 있다. 단위 "vvm"은 기준 조건(101.325kPa, 0℃)에서 분당 액체 발효 배지의 부피당 유입 가스 흐름의 부피이며, 용기에서 쉽게 조정될 수 있다. 상응하는 장치는 당업자에게 공지되어 있다.

바람직한 실시양태에서, 가스 공급은 > 0.0 내지 0.1vvm, > 0.0 내지 0.09vvm, > 0.0 내지 0.08vvm, > 0.0 내지 0.07vvm, > 0.0 내지 0.06vvm, > 0.0 내지 0.05vvm, > 0.0 내지 0.04vvm, > 0.0 내지 0.03vvm, > 0.0 내지 0.02vvm, 또는 > 0.0 내지 0.01vvm의 범위이다. 보다 바람직한 실시양태에서, 가스 공급은 > 0.0 내지 0.05vvm 범위이다.

더욱 바람직한 실시양태에서, 가스 공급은 < 0.09vvm, < 0.08vvm, < 0.07vvm, < 0.06vvm, < 0.05vvm, < 0.04vvm, < 0.03vvm, < 0.02vvm, < 0.01vvm 또는 < 0.005vvm이다. 보다 바람직한 실시양태에서, 가스 공급은 < 0.05vvm이다.

특히 바람직한 실시양태에서, 가스 공급은 < 0.1vvm이다. 다른 특히 바람직한 실시양태에서, 가스 공급은 < 0.05vvm이다. 다른 특히 바람직한 실시양태에서, 가스 공급은 < 0.02vvm이다.

가스는 용액으로의 유입구를 통해 용기에 공급될 수 있다(예컨대, 용액을 통해 가스를 취입함으로써). 다르게는, 가스를 용기의 기상에 공급할 수도 있다.

바람직하게는, 용기의 바닥으로부터 스파저(sparger)를 사용하여(예를 들어, 용액을 통해 가스를 "취입"함으로써) 용기 내의 용액에 유입 가스를 제공한다.

첨부된 실시예에서는, 인큐베이션 단계 (b) 동안 가스를 적게 공급하면서 인큐베이션하면 이소부텐 함량이 매우 높은 가스가 생성됨을 보여준다. 구체적으로, 실시예는 인큐베이션 단계가 기체 공급이 없거나 적은 상태에서 수행될 때, CO₂와 이소부텐이 고농도로 생성되며, 실제로는 기본적으로 CO₂와 이소부텐만 생성됨을 보여준다. 결과적으로, 아래에서 더 자세히 설명하는 바와 같이 용기로부터의 유출 가스는 기본적으로 산소가 존재하지 않으면서 주로 CO₂와 이소부텐으로 또는 심지어 CO₂와 이소부텐만으로(존재할 수 있는 미량의 다른 가스는 제외) 구성된다.

따라서, 본 발명의 방법은 이소부텐의 제조 동안 생성된 유출 가스의 연소 위험을 없애거나 적어도 크게 감소시킬 수 있다는 점에서 또한 유리하다. 그러므로, 가스 공급이 없거나 가스 공급이 낮은 수준으로 제어되는 경우, 유출 가스 중 산소는 약 10부피% 미만, 따라서 연소에 필요한 이소부텐의 최소 산소 농도(MOC) 미만이다. 따라서, 본 발명의 방법은 또한 이소부텐 생성의 안전성을 향상시키고 회수되는 유출 가스의 후속 처리를 용이하게 한다.

유입 가스는 바람직하게는 공기, 불활성 가스, 여러 가스의 혼합물 또는 공기와 불활성 가스의 혼합물이며, 이 때 상기 불활성 가스는 바람직하게는 질소, 헬륨, 아르곤, 네온, CO₂ 및 이들 가스의 혼합물로부터 선택된다.

또한, 질소(또는 다른 불활성 가스)가 가스 공급에 사용되는 경우, 이는 시스템을 불활성화시킬 수 있다(이로써, 연소 및/또는 폭발 위험을 방지/감소시킴).

본 발명에 따른 방법의 인큐베이션 단계 (b)는 이소부텐이 기체 상태이고 용액으로부터 증발하도록 하는 조건 하에서 수행된다. 도 9에는, 순수한 이소부텐에 있어서 증기압과 온도 사이의 상관관계를 나타내는 그래프가 도시되어 있다. 곡선 아래에서 이소부텐은 기체인 반면, 이소부텐은 곡선 위에서 액체이다.

따라서, 3-메틸크로톤산의 이소부텐으로의 효소적 전환에 적용되는 온도(보통 30℃ 내지 40℃; 일반적으로는 약 37℃) 및 대기압에서, 생성되는 이소부텐은 가스 형태로 생성된다. 당업자는 생성된 이소부텐을 기체 상태로 만들기 위해 적절한 조건(용기의 온도 및/또는 압력 조정 측면에서)을 쉽게 선택할 수 있다.

이어, 기상으로 증발하는 생성된 이소부텐을 본 발명에 따른 방법의 단계 (c)에 따라 회수한다. 회수는 용액에서 증발하고 이소부텐을 함유하는 가스의 회수를 포함한다. 이어서, 당업자에게 잘 알려진 방법에 따라 이소부텐을 추가로 정제할 수 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 방법의 인큐베이션 단계 (b)는 3-메틸크로톤산을 함유하는 액체 배지를 3-메틸크로톤산을 이소부텐으로 전환시킬 수 있는 효소 또는 그러한 효소를 발현하는 미생물과 함께 인큐베이션하는 것을 포함한다.

단계 (a)에 따른 배양 중단 후, 단계 (b)로의 이행은 상이한 방식으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 단계 (a) 후 생성된 배지를 그대로(축적된 3-메틸크로톤산 및 이의 생성에 사용된 미생물의 세포를 함유함) 취하고 인큐베이션 단계 (b)에서 사용되는 효소 및/또는 미생물과 합칠 수 있다. 이러한 상황에서는, 단계 (a)에서 사용된 세포를 배지로부터 분리하지 않는다. 단계 (b)에 필요한 효소 및/또는 미생물을 단순히 첨가함으로써 단계 (a)의 배양과 동일한 용기에서 인큐베이션 단계 (b)를 수행할 수 있다. 바람직한 실시양태에서는, 단계 (b)에 필요한 효소 및/또는 미생물을 단순히 첨가하고, 당업계에 공지된 상응하는 일상적인 조치를 취하여 온도, pH, 진탕력 및/또는 산소 농도를 제어함으로써, 단계 (b)의 인큐베이션, 즉 효소적 전환에 최적인 조건을 적용함에 의해, 단계 (a)의 배양과 동일한 용기에서 인큐베이션 단계 (b)를 수행할 수 있다. 그러나, 단계 (a)의 배양을 중단한 후 수득한 배지를 상이한 용기로 옮기는 것이 바람직하다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 단계 (a)의 배양을 중단한 후 수득한 3-메틸크로톤산을 함유하는 액체 배지를 단계 (b) 전에 미생물로부터 분리하는 단계를 포함한다. 액체 배지로부터 미생물을 분리하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 액체에서 미생물을 분리하기 위해 원심분리를 이용할 수 있다. 일단 분리되면, 3-메틸크로톤산을 함유하는 액체 배지를 본 발명의 방법의 인큐베이션 단계 (b)에 적용될 수 있다.

위에서 개시된 바와 같이, 제 2 양태에서, 본 발명은 (a) 탄소원으로부터 3-메틸크로톤산을 생성시킬 수 있는 미생물을 액체 배지에서 배양함으로써 3-메틸크로톤산을 생성시켜 이를 액체 배지에 축적시키는 단계; (b) 바람직하게는 180℃ 내지 400℃에서, 단계 (a)에서 수득한 액체 배지에 함유된 3-메틸크로톤산을 이소부텐으로 열화학적으로 전환시키는 단계; 및 (c) 생성된 이소부텐을 회수하는 단계를 포함함을 특징으로 하는, 탄소원으로부터 이소부텐을 생성시키는 방법을 제공한다.

단계 (b)에서는, 단계 (a)에서 수득한 액체 배지에 함유된 3-메틸크로톤산을 이소부텐으로 열화학적으로 전환시킨다. 바람직하게는, 상기 열화학적 전환을 180℃ 내지 400℃에서 수행한다.

당업계에 공지된 절차에 따라 3-메틸크로톤산을 이소부텐 및 이산화탄소로 효율적으로 전환시킬 수 있다. 바람직하게는, 3-메틸크로톤산을 180℃ 내지 400℃, 바람직하게는 230℃ 내지 350℃에서 가열한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서는, 비등(boiling) 반응기, 교반식 탱크 반응기 또는 관형 반응기에서 열화학적 전환을 수행한다. 다른 바람직한 실시양태에서는, 0 내지 30바, 바람직하게는 10 내지 30바에서 열화학적 전환을 수행한다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 본 발명의 방법의 단계 (a)에서 생성된 3-메틸크로톤산을 본 발명의 방법의 단계 (b) 전에 액체 배지로부터 단리 또는 정제하는 단계를 포함한다. 액체 배지로부터 3-메틸크로톤산을 단리, 정제, 추출 또는 분리하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 3-메틸크로톤산을 예컨대 농축시키거나(예를 들어, 액체 배지로부터 수분 함량을 제거함으로써), 또는 바람직하게는 잠재적으로 잔류하는 당 및 존재할 수 있는 기타 화합물을 제거함으로써 (부분적으로) 정제할 수 있다. 그에 덧붙여 또는 그와는 달리, 당 업계에 공지되어 있는 방법을 적용함으로써, 3-메틸크로톤산을 100g/l 이상, 더 바람직하게는 150g/l 이상, 훨씬 더 바람직하게는 200g/l 이상, 더욱 바람직하게는 250g/l 이상의 3-메틸크로톤산 농도까지 농축 및/또는 정제시킬 수 있다. 바람직하게는, 3-메틸크로톤산을 나트륨염 또는 칼륨염 형태로 회수한다.

다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 본 발명의 방법의 단계 (a)에서 생성된 3-메틸크로톤산을 본 발명의 방법의 단계 (b) 전에 액체 배지로부터 정제하는 단계를 포함한다.

상응하는 바람직한 실시양태에서는, 회분식 또는 연속식 액체-액체 추출을 이용하여, 본 발명의 방법의 단계 (a)에서 생성된 3-메틸크로톤산을 본 발명의 방법의 단계 (b) 전에 액체 배지로부터 정제/분리할 수 있다.

3-메틸크로톤산의 액체-액체 추출은 다음과 같이 수행할 수 있다:

표준 액체-고체 분리에 의해 발효액, 즉 본 발명의 관점에서는 액체 배지로부터 세균 및 모든 다른 고형분을 우선적으로 제거한다. 표준 액체-고체 분리는 바람직하게는 원심분리 또는 여과일 수 있다. 이어, 분리된 발효액, 즉 분리된 액체 배지를 산성화시킬 수 있다. 바람직하게는, 산성화는 pH 4.2 미만, 바람직하게는 4.0 미만에서, 보다 바람직하게는 임의의 무기산의 첨가에 의해 이루어진다. 이렇게 산성화된 발효액, 즉 본 발명의 관점에서 액체 배지를 유기 용매, 바람직하게는 알코올(보다 바람직하게는, 2-옥탄올 또는 2-에틸 헥산올), 중질 유기산(보다 바람직하게는, 헵탄산), 케톤(보다 바람직하게는, 메틸 이소부틸 케톤 또는 메틸 에틸 케톤), 중질 알칸(보다 바람직하게는, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 탄소를 함유함 또는 이들의 혼합물)과 혼합할 수 있다. 이러한 혼합은 일련의 교반식 탱크 반응기에서 또는 당업계에 공지된 임의의 기술(예를 들어, 동시 진탕에 의해 또는 진탕 없이)의 연속식 액체-액체 추출 칼럼에서 이루어질 수 있다. 유기상을 회수하여 증류할 수 있다. 용매를 증류액에서 회수할 수 있고, 3-메틸크로톤산을 잔류물에서 회수할 수 있다. 다르게는, 3-메틸크로톤산을 추가로 증류하여 증류액에서 회수할 수도 있다.

또 다른 바람직한 실시양태에서는, 또한 3-메틸크로톤산 및 단계 (a)에서 배양된 미생물을 함유하는 본 발명의 단계 (a)의 배양에서 수득된 액체 배지로부터 상술한 3-메틸크로톤산의 액체-액체 추출을 바로 수행할 수 있다.

바람직하게는 배양 용기 또는 발효기에서 이를 수행할 수 있다.

바람직한 실시양태에서는, 용매, 바람직하게는 중질 알칸(8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16개의 탄소를 함유함 또는 이들의 혼합물)을 배양 또는 발효 개시시에 또는 배양 또는 발효 동안 배양기 또는 발효기로 보낼 수 있다. 생성된 혼합물을 배양기 또는 발효기에서 지속적으로 빼낼 수 있다. pH를 바람직하게는 4.2 미만으로 산성화(감소)시켜, 3-메틸크로톤산의 용매로의 이동을 향상시킬 수 있다. 두 상 모두 디켄터로 보낼 수 있다. 분리된 유기상을 증류기로 보내고, 여전히 미생물을 함유하고 있는 수상을 배양기 또는 발효기로 다시 보낼 수 있다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 정제/추출은 또한 배양기 또는 발효기 외부에서 이루어질 수 있다. 이러한 실시양태에서는, 배양 또는 발효를 표준 방식으로 수행하고, 발효액(즉, 본 발명의 관점에서 단계 (a)의 액체 배지)을 배양기 또는 발효기로부터 연속적으로 빼낼 수 있다. 이 스트림(즉, 배양기 또는 발효기로부터 연속적으로 배출되는 본 발명의 관점에서의 단계 (a)의 액체 배지)을 당업계에 공지된 임의의 무기산으로, 바람직하게는 4.2 미만의 pH로 산성화시키는 것이 바람직하다. 다르게는, 이를 산성화시킬 수 없다. 스트림(즉, 배양기 또는 발효기로부터 연속적으로 배출되는 본 발명의 관점에서의 단계 (a)의 액체 배지)을 일련의 교반식 탱크에서 또는 상기 기재된 액체-액체 추출 칼럼에서 용매(바람직하게는, 동일한 중질 알칸)와 혼합할 수 있다. 유기상을 회수하고 증류기로 보내어, 한편으로는 3-메틸크로톤산을 회수하고 다른 한편으로는 용매를 회수한다.

바람직하게는, 전술한 액체-액체 추출에서는, 바이오-유래 용매, 보다 바람직하게는 이소도데칸 또는 2-옥탄올을 사용한다.

본 발명의 방법에 있어서, 본 발명의 단계 (a)에서 수득한 3-메틸크로톤산을 함유하는 액체 배지와 함께 FMN 프레닐 트랜스퍼라제와 결합된 FMN-의존성 데카복실라제를 발현하는 미생물을 인큐베이션하는 인큐베이션 단계 (b)(i)에서는, 상기 미생물이 액체 배지 중 현탁 배양액(자유롭게 부유한다는 점에서)으로서 존재할 수 있다. 다르게는, 미생물을 고정화시킬 수 있다. 고정화는 적합한 담체, 표면 및/또는 지지 물질 상에서 이루어질 수 있다. 적합한 담체, 표면 및/또는 지지 물질 뿐만 아니라 고정화 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 마틴스(Martins) 등은 상응하는 지지 물질 및 고정화 방법을 검토한다[African Journal of Biotechnology 12(28):441-4418 (2013)].

본 발명의 방법에서, 단계 (a)에서 수득한 3-메틸크로톤산을 함유하는 액체 배지와 함께 FMN 프레닐 트랜스퍼라제와 결합된 FMN-의존성 데카복실라제를 인큐베이션하는 인큐베이션 단계 (b)(ii)에서, 상기 효소(들)는 액체 배지에서 용액에(자유롭게 떠다닌다는 관점에서) 존재할 수 있다. 다르게는, 상기 효소(들)를 고정화시킬 수 있다. 고정화는 적합한 담체, 표면 및/또는 지지 물질 상에 이루어질 수 있다. 적합한 담체, 표면 및/또는 지지 물질 뿐만 아니라 효소의 고정화 방법은 당업자에게 공지되어 있다[예를 들어, 모하마드(Mohamad) 등, Biotechnology & Biotechnological Equipment 29(2), 2015, 205-220 참조].

용액에 함유된 3-메틸크로톤산이 이소부텐으로 전환될 수 있는 조건 하에서 인큐베이션 단계 (b)를 수행한다. 이러한 조건은 전환에 사용되는 유기체 또는 효소의 유형에 따라 달라지며, 통상의 조치를 이용하여 당업자에 의해 적합화될 수 있다.

이소부텐의 생성을 가능하게 하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션을 수행한다. 인큐베이션 동안 용액 중 3-메틸크로톤산의 농도를 모니터링할 수 있다. 바람직하게는, 3-메틸크로톤산의 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 98% 이상이 이소부텐으로 전환될 때까지 인큐베이션을 수행한다.

인큐베이션을 중단한 후, 용액을 세포/효소로부터 분리하고 방법의 단계 (a)로 다시 도입할 수 있다. 바람직하게는, 방법의 단계 (a)에 재도입하기 전에 용액을 멸균시킨다. 단계 (b)에서 사용된 세포 또는 효소를 재순환시켜 다른 라운드의 단계 (b)에서 사용할 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 탄소원으로부터 3-메틸크로톤산을 생성시킬 수 있는 미생물을 이용하는 본 발명의 배양 단계 (a)에서는, 상기 탄소원을 3-메틸크로톤산으로 효소에 의해 전환시키기 전에 아세틸-CoA로 대사시킬 수 있는 미생물을 사용한다. 상응하는 효소적 전환 및 미생물, 바람직하게는 탄소원을 아세틸-CoA로 대사시킬 수 있는 재조합 미생물, 및 3-메틸크로톤산으로의 추가적인 효소적 전환은 하기에 더 상세히 기재되어 있다.

그러나, 본 발명의 방법이 3-메틸크로톤산으로의 효소적 전환 전에 상기 탄소원을 아세틸-CoA로 대사시킬 수 있는 상응하는 미생물의 사용으로 한정되는 것은 아니다. 하기에 더 상세히 설명되는 바와 같이, 탄소원으로부터 3-메틸크로톤산을 생성시킬 수 있는 (재조합) 미생물이 있으며, 이 때 이들 미생물에서의 대사는 중간체로서 아세틸-CoA의 형성을 필요로 하지 않는다.

또한, 탄소원으로부터 3-메틸크로톤산을 생성시킬 수 있는 미생물을 사용하는 본 발명의 배양 단계 (a)에서 C1-고정 미생물 또는 미생물의 조합, 바람직하게는 C1-고정 미생물의 조합을 사용하는 것도 생각할 수 있다.

C1-고정 미생물은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 WO 2020/188033 호에 기재되어 있으며, 이의 내용은 본원에 참조로 포함된다.

바람직한 실시양태에서, 미생물, 바람직하게는 상기 정의된 바와 같은 C1-고정 미생물은 하나보다 많은 당을 소비할 수 있는 미생물이다. 바람직하게는, 상기 하나보다 많은 당은 글루코스, 프럭토스, 수크로스, 자일로스, 글리세롤, 전분, 에탄올, 락트산, 아세트산 및/또는 만노스를 포함한다. 보다 바람직한 실시양태에서, 미생물, 바람직하게는 C1-고정 미생물은 글루코스, 프럭토스, 수크로스, 자일로스, 글리세롤, 전분, 에탄올, 락트산, 아세트산 및 만노스로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상의 당을 소비할 수 있는 미생물이다. 글루코스, 프럭토스, 수크로스, 자일로스, 글리세롤, 전분, 에탄올, 락트산, 아세트산 및/또는 만노스를 소비할 수 있는 유기체 및/또는 미생물은 자연적으로 발생하며 당업계에 공지되어 있다.

바람직한 실시양태에서, 미생물, 바람직하게는 C1-고정 미생물은 CO 및/또는 합성가스를 소비할 수 있는 유기체이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 미생물, 바람직하게는 C1-고정 미생물은 H₂뿐만 아니라 CO 및/또는 CO₂의 혼합물을 소비할 수 있는 유기체이다.

또 다른 실시양태에서, 상기 미생물은 글루코스, 프럭토스, 수크로스, 자일로스, 글리세롤, 전분, 에탄올, 락트산, 아세트산, 만노스 및/또는 CO(또는 합성가스)를 소비할 수 있도록 유전적으로 변형되고/되거나, 글루코스, 프럭토스, 수크로스, 자일로스, 글리세롤, 전분, 에탄올, 락트산, 아세트산, 만노스 및/또는 CO(또는 합성가스)를 소비하는 미생물의 능력을 증가시키기 위해 유전적으로 변형된다. 상응하는 유전적 변형은 당업계에 공지되어 있다.

다른 바람직한 실시양태에서, 미생물, 바람직하게는 C1-고정 미생물은 포스포트랜스퍼라제 수송 시스템(PTS)을 통해 당을 소비할 수 있는 미생물이다.

바람직한 실시양태에서, 미생물, 바람직하게는 C1-고정 미생물은 비-포스포트랜스퍼라제 수송 시스템(non-PTS)을 통해 당을 소비할 수 있는 유기체이다.

바람직한 실시양태에서, 탄소원으로부터 3-메틸크로톤산을 생성시킬 수 있는 미생물을 이용하는 본 발명의 배양 단계 (a)에서, 상기 탄소원은 글루코스, 프럭토스, 수크로스, 자일로스, 글리세롤, 전분, 에탄올, 락트산, 아세트산 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 배양 단계 (a)에서, 사용되는 미생물은 재조합 미생물이다. 상응하는 재조합 미생물은 하기에 더 상세히 기재된다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 배양 단계 (a)에서, 사용되는 미생물은 FMN 프레닐 트랜스퍼라제와 결합된 FMN-의존성 데카복실라제의 발현 및/또는 활성이 감소/감쇠되거나 또는 상기 (재조합) 미생물이 단계 (a)에 따라 배양될 때 FMN 프레닐 트랜스퍼라제와 결합된 FMN-의존성 데카복실라제를 발현하지 않는 미생물, 바람직하게는 재조합 미생물이다.

상기 개시한 바와 같이, 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 단계 (a)의 3-메틸크로톤산을 함유하는 액체 배지를 단계 (b) 전에 미생물로부터 분리하는 단계를 포함한다. 이렇게 분리된 미생물을 반드시 폐기할 필요는 없다. 사실상, 바람직한 실시양태에서는, 액체 배지로부터 분리된 상기 미생물을 재순환시켜 본 발명의 방법의 단계 (a)로 재도입할 수 있다. 상응하는 재순환은 도 3에 개략적으로 도시되어 있다.

또 다른 바람직한 실시양태에서는, 단계 (b)(i)에서 사용되는 미생물을, 본 발명의 방법의 전환 단계 (b)(i) 전에 적합한 조건 하에 적합한 액체 배지에서 미리 배양한다. 이론에 얽매이지 않으면서, 상응하는 예비-배양 단계는 미생물(및 따라서 목적하는 효소적 전환에 요구되는 효소)의 수 및/또는 밀도를 증가시키는 특정 정도까지 미생물을 증식 및 농축시키는 효과를 갖는다. 적합한 액체 배지 및 적합한 조건은 당업자에게 공지되어 있고 하기에 더 상세히 기재되어 있다.

1g/l 이상, 더욱 바람직하게는 5g/l 이상, 가장 바람직하게는 10g/l 이상의 세포 밀도(리터당 건조 세포 중량으로 표현됨)를 달성하기 위하여, 단계 (b)(i)에서 사용되는 미생물을 바람직하게는 3-메틸크로톤산을 함유하는 용액에 첨가한다. 상기 개시한 바와 같이, 바람직하게는 세포의 추가 증식을 뒷받침하지 않는 조건 하에서 인큐베이션 단계 (b)(i)을 수행한다. 바람직하게는, 세포의 추가적인 증식을 뒷받침하지 않아 인큐베이션 동안 세포 밀도가 기본적으로 일정하게 유지되거나 약간의 증가(바람직하게는 20% 이하, 더욱 바람직하게는 10% 이하)만을 보이도록 하는 조건하에서 상기 인큐베이션 단계 (b)(i)을 바람직하게 수행한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서는, 세포의 추가적인 증식을 뒷받침하지 않아 인큐베이션 동안 세포 밀도가 기본적으로 일정하게 유지되거나 약간의 감소(바람직하게는 20% 이하, 더욱 바람직하게는 10% 이하)만을 보이도록 하는 조건하에서 상기 인큐베이션 단계 (b)(i)을 바람직하게 수행한다. 세포 밀도의 감소는 예를 들어 세포(의 일부)의 용해 시, 예를 들어 액체 배지의 pH를 조정할 때 (산성) 용액(들)을 첨가함으로써 인큐베이션 동안 액체 배지의 부피를 증가시킬 시 발생할 수 있다.

세포 밀도의 감소는 예를 들어 본 명세서에서 상기 및 하기 기재된 바와 같이 인큐베이션 단계 (b) 동안 용기에 3-메틸크로톤산을 공급할 때 용기에 3-메틸크로톤산을 첨가하여 용액 중 바이오매스/세포를 희석시킴으로써 발생될 수도 있다.

상기 개시된 바와 같이, 본 발명의 방법은 인큐베이션 단계 (b)에서, FMN 프레닐 트랜스퍼라제와 결합된 FMN-의존성 데카복실라제를 발현하는 미생물을 본 발명의 방법의 단계 (a)에서 수득된 3-메틸크로톤산을 함유하는 액체 배지와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 다르게는, 본 발명의 방법은 인큐베이션 단계 (b)에서, FMN 프레닐 트랜스퍼라제와 결합된 FMN-의존성 데카복실라제를 본 발명의 방법의 단계 (a)에서 수득한 3-메틸크로톤산을 함유하는 액체 배지와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 바람직한 실시양태에서는, 두 경우 모두, 본 발명의 방법의 상기 단계 (b)의 완료 후, 상기 액체 배지를 회수할 수 있고, 임의적으로 멸균시킬 수 있으며, 본 발명의 방법의 단계 (a)로 재도입할 수 있다. 상응하는 재순환은 도 3에 개략적으로 도시되어 있다.

다른 바람직한 실시양태에서는, 기재된 회수된 액체 배지에 존재하는 미생물(즉, FMN 프레닐 트랜스퍼라제와 결합된 FMN-의존성 데카복실라제를 발현하는 미생물)을 상기 액체 배지로부터 제거하고 본 발명의 방법의 생물전환 단계 (b)(i)으로 재도입한다. 상응하는 재순환은 도 3에 개략적으로 도시되어 있다.

또 다른 바람직한 실시양태에서는, 회수된 이소부텐을 후속적으로 정제 및/또는 농축시킨다.

본 발명의 관점에서 정제 또는 부분 정제는 바람직하게는 존재할 수 있는 잠재적으로 남아있는 다른 화합물(이소부텐 외의 성분)의 (부분 또는 전체) 제거를 의미한다.

본 발명의 관점에서 농축은 기상 또는 액상에서 이소부텐의 농도 증가를 의미한다.

이소부텐을 정제 및/또는 농축시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 당업계에 공지된 기술, 예를 들어 물리적 흡수, 반응성 흡수, 흡착, 응축, 극저온 기술, 및/또는 막-기반 분리를 이용하여, 이소부텐을 본 발명의 방법의 인큐베이션 단계 (b)의 배출 가스로부터 회수 또는 단리시킬 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법의 단계 (a) 및/또는 단계 (b)에서 사용되는 미생물(들), 바람직하게는 재조합 미생물(들)은 세균, 효모, 진균 또는 조류이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 미생물은 세균, 예를 들어 대장균이다. 상응하는 적합한 미생물, 바람직하게는 재조합 미생물은 하기에 더 상세히 기재된다.

단계 (a)에 따라 탄소원으로부터 3-메틸크로톤산을 효소에 의해 생성시킴

상기 언급된 바와 같이, 탄소원으로부터의 3-메틸크로톤산의 효소적 생성 방법은 당업계에 공지되어 있고, 각각의 효소적 전환을 촉진할 수 있는 (재조합) 유기체 및 미생물이 기재된 바 있다; 예를 들어 WO 2017/085167 호, WO 2018/206262 호 및 WO 2020/188033 호를 참조한다(이들의 내용은 본원에 참고로 인용됨).

단지 예로서, 이들로 한정되지 않으면서, 중간 대사산물인 아세틸-CoA를 발생시키는 탄소원으로부터 시작하는 효소적 전환 및 그의 3-메틸크로톤산으로의 추가적인 전환의 가능한 개별 단계가 기재된다.

아세틸-CoA(아세틸 보조효소 A)는 모든 유기체에 존재하는 중심 대사산물이며, 단백질, 탄수화물 및 지질 대사에서 많은 생화학 반응에 참여한다. 아세틸-CoA는 예를 들어 해당과정을 통한 탄소원의 분해 및 β-산화를 통한 지방산의 분해에 의해 CoA가 아세틸-CoA로 아세틸화될 때 생성된다.

따라서, 지방산, 특히 탄소원으로부터 생성되는 아세틸-CoA는 모든 유기체에 존재하는 중심 대사산물이므로, 그의 생성에 대해서는 본원에 기재하지 않는다.

하기에서는, 이들로 한정되지 않으면서, 예를 들어 아세틸-CoA로부터 3-메틸크로톤산을 생성시킬 수 있는 미생물 뿐만 아니라 아세틸-CoA의 3-메틸크로톤산으로의 효소적 전환의 가능한 개별 단계가 요약된다. 상응하는 효소적 전환 및 미생물은 예를 들어 WO 2017/085167 호, WO 2018/206262 호 및 WO 2020/188033 호에 기재되어 있으며, 이들의 내용은 본원에 참조로 포함된다.

상이한 가능한 경로를 통해 3-메틸크로톤산을 생성시키는 방법이 기재되었다(개요에 대해서는 도 1 및 도 2 참조). 이러한 경로 및 효소적 전환을 이용하는 방법뿐만 아니라 재조합 유기체 및 미생물은 특히 WO 2010/001078 호, WO 2012/052427 호, WO 2017/085167 호, WO 2018/206262 호 및 WO 2020/188033 호(본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.

그러나, 본 발명의 방법의 단계 (a)에서는, 이들 반응뿐만 아니라 원칙적으로 선행 기술 문서 WO 2017/085167 호, WO 2018/206262 호, WO 2010/001078 호, WO 2012/052427 호 및 WO 2016/042012호에 기재된 바와 같은 아세틸-CoA의 3-메틸크로톤산으로의 전환을 위한 임의의 다른 경로를 이용할 수 있다.

또한, 본 발명의 방법의 단계 (a)에서, 상기 3-메틸크로톤산은 탄소원 또는 질소원으로부터 피루베이트 및 류신을 거쳐 티오에스터, 즉 3-메틸크로토닐-CoA로서 생성될 수도 있다. 상응하는 생합성 경로 및 3-메틸크로토닐-CoA를 생성시킬 수 있는 미생물은 리(Li) 등의 문헌[Angew. Chem. Int. Ed. (2013) 52:1304]에 기재되어 있으며; 특히 도 1을 참조한다.

생성된 3-메틸크로톤산의 티오에스터, 즉 3-메틸크로토닐-CoA는 선행 기술에 기재된 바와 같이 효소적 전환에 의해 3-메틸크로톤산으로 추가로 전환될 수 있다.

특히 본원에 기재된 경로의 개별적인 전환을 위한 효소의 바람직한 실시양태에 관한 이들 문헌의 개시내용은 그 전체가 참고로 본원에 포함된다. 따라서, 바람직한 실시양태에서는, 개별적인 효소적 전환과 관련하여 이들 선행 기술 문헌에 기재된 바람직한 실시양태로부터 선택된 효소를 사용하는 것이 바람직하다. 따라서, 각각 WO 2017/085167 호, WO 2018/206262 호, WO 2010/001078 호, WO 2012/052427 호, WO 2016/042012 호 및 리 등의 문헌[Angew. Chem. Int. Ed. (2013) 52:1304]에 기재된 바와 같이 본 발명의 방법의 단계 (a)의 효소적 전환에도 동일하게 적용된다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법의 단계 (a)에서는, 아세틸-CoA로부터 출발하여 이를 후속적으로 효소에 의해 아세토아세틸-CoA로 전환시키고 이를 이후에 효소에 의해 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA로 전환시킨 다음 이를 후속적으로 효소에 의해 3-메틸글루타코닐-CoA로 전환시키고 이를 후속적으로 효소에 의해 3-메틸크로토닐-CoA로 전환시킨 후 이를 이후에 효소에 의해 3-메틸크로톤산으로 전환시키는 경로에 의해, 3-메틸크로톤산을 생성시킨다(예를 들어, 개요에 대해서는 도 2 참조). 상응하는 방법, 효소적 전환 뿐만 아니라 이들 경로 및 효소적 전환을 이용하는 재조합 유기체 및 미생물이 상기 인용된 선행 기술 문헌에 기재되어 있다. 특히 상기 바람직한 경로(즉, 아세틸-CoA로부터 출발하여 아세토아세틸-CoA, 이어 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA, 이어 3-메틸글루타코닐-CoA, 이어 3-메틸크로토닐-CoA를 거쳐 3-메틸크로톤산으로 전환됨)를 위한 효소의 바람직한 실시양태와 관련된 이들 문헌의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 따라서, 이 가능한 바람직한 경로에 관한 바람직한 실시양태에서는, 각각의 효소적 전환과 관련하여 이들 선행 문헌에 기재된 바람직한 실시양태로부터 선택되는 효소를 사용하는 것이 바람직하다. 따라서, 상기 종래 기술 문헌에 기재된 바와 같이 본 발명의 방법의 단계 (a)의 효소적 전환에도 동일하게 적용된다.

상기 언급된 바와 같이, 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 배양 단계 (a)에서, 상기 단계 (a)에서 사용되는 상기 미생물은 FMN 프레닐 트랜스퍼라제와 결합된 FMN-의존성 데카복실라제(바람직하게는, 3-메틸크로톤산을 이소부텐으로 효소에 의해 전환시킬 수 있는 FMN-의존성 데카복실라제)의 활성이 감소/감쇠된 미생물, 바람직하게는 재조합 미생물이다. FMN 프레닐 트랜스퍼라제와 결합된 FMN-의존성 데카복실라제(바람직하게는, 3-메틸크로톤산을 이소부텐으로 효소에 의해 전환시킬 수 있는 FMN-의존성 데카복실라제)의 활성이 감소/감쇠된 상응하는 미생물이, 이렇게 생성된 3-메틸크로톤산의 대사를 피하고 따라서 3-메틸크로톤산의 상기 액체 배지에서의 축적을 허용하기 때문에, 상기 미생물을 사용하는 것이 유리하다.

따라서, FMN 프레닐 트랜스퍼라제와 결합된 FMN-의존성 데카복실라제(바람직하게는, 3-메틸크로톤산을 이소부텐으로 효소에 의해 전환시킬 수 있는 FMN-의존성 데카복실라제)의 활성이 감소/감쇠된 미생물은 FMN 프레닐 트랜스퍼라제와 결합된 FMN-의존성 데카복실라제를 자연적으로 발현하지 않는 미생물이거나, 또는 각각의 효소의 활성이 완전히 제거되거나 또는 상응하는 변형되지 않은 미생물에 비해 활성이 감소/감쇠되도록 변형, 특히 유전적으로 변형된 미생물이다.

FMN 프레닐 트랜스퍼라제와 결합된 FMN-의존성 데카복실라제(바람직하게는, 3-메틸크로톤산을 이소부텐으로 효소에 의해 전환시킬 수 있는 FMN-의존성 데카복실라제)를 자연적으로 발현하지 않는 상응하는 미생물은 당업계에 공지되어 있다.

바람직한 실시양태에서, 변형되지 않은 유기체 또는 미생물과 비교하여 FMN 프레닐 트랜스퍼라제와 결합된 FMN-의존성 데카복실라제(바람직하게는, 3-메틸크로톤산을 이소부텐으로 효소에 의해 전환시킬 수 있는 FMN-의존성 데카복실라제)의 활성이 감소/감쇠된 미생물은 바람직하게는 변형되지 않은 미생물과 비교하여 각각의 효소 활성의 감소/감쇠가 상기 불활성화 또는 감소를 초래하는 미생물의 유전적 변형에 의해 달성되는 미생물을 지칭한다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 재조합 미생물은 변형되지 않은 미생물과 비교하여 FMN 프레닐 트랜스퍼라제와 결합된 FMN-의존성 데카복실라제의 활성을 감소시킴으로써 감소/감쇠된 FMN 프레닐 트랜스퍼라제와 결합된 FMN-의존성 데카복실라제(바람직하게는, 3-메틸크로톤산을 이소부텐으로 효소에 의해 전환시킬 수 있는 FMN-의존성 데카복실라제)를 갖는 재조합 미생물이다. 바람직하게는, 이러한 감소는 미생물의 유전적 변형에 의해 달성된다. 예를 들어, 프로모터 및/또는 효소의 무작위적인 돌연변이유발 또는 부위-지정 돌연변이유발 및 원하는 특성을 갖는 프로모터 및/또는 효소의 후속 선택에 의해, 또는 상기 기재된 바와 같은 상보적 뉴클레오티드 서열 또는 RNAi 효과에 의해, 이를 달성할 수 있다.

본 발명의 맥락에서, "감소된 활성"은 유전적으로 변형된 미생물에서 효소, 특히 FMN 프레닐 트랜스퍼라제와 결합된 FMN-의존성 데카복실라제의 활성이 변형되지 않은 상응하는 미생물보다 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상, 더 바람직하게는 30% 또는 50% 이상, 더욱 더 바람직하게는 70% 또는 80% 이상, 특히 바람직하게는 90% 이상 또는 100% 더 낮음을 의미한다. FMN 프레닐 트랜스퍼라제와 결합된 FMN-의존성 데카복실라제의 감소된 효소 활성을 측정하기 위한 분석법은 당업계에 공지되어 있다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 미생물은 FMN 프레닐 트랜스퍼라제와 결합된 FMN-의존성 데카복실라제(바람직하게는 3-메틸크로톤산을 이소부텐으로 효소에 의해 전환시킬 수 있는 FMN-의존성 데카복실라제)의 활성을 갖지 않는 미생물이다. 이는 바람직하게는 그러한 미생물이 FMN 프레닐 트랜스퍼라제와 결합된 FMN-의존성 데카복실라제의 활성을 자연적으로 갖지 않음을 의미한다. 이는 그러한 미생물이 FMN 프레닐 트랜스퍼라제와 결합된 FMN-의존성 데카복실라제의 활성을 갖는 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 그의 게놈에 자연적으로 함유하지 않음을 의미한다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 미생물은 아세틸-CoA의 누출을 피하여 최종적으로 3-메틸크로톤산으로 전환되는 아세틸-CoA의 세포 내 농도를 증가시키기 위해 유전적으로 변형된 유기체이다. 아세틸-CoA의 세포내 농도를 증가시키는 유전적 변형은 당업계에 공지되어 있다. 바람직하게는 하기 유전자를 결실시키거나 불활성화시킴으로써 이러한 미생물을 유전적으로 변형시킬 수 있다:

ΔackA(아세테이트 키나제), Δldh(락테이트 데하이드로게나제), ΔadhE(알코올 데하이드로게나제), ΔfrdB 및/또는 ΔfrdC(푸마레이트 리덕타제 및 푸마레이트 데하이드로게나제).

바람직한 실시양태에서는, 아세틸-CoA의 수율, 풀 및/또는 유동이 증가되는 방법을 이용한다. 증가된 아세틸-CoA 풀을 갖는 상응하는 방법뿐만 아니라 재조합 유기체 및 미생물은 선행 기술, 예를 들어 WO 2013/007786 호, WO 2020/021051 호 및 WO 2020/188033 호에 기재되어 있으며, 그 내용은 본원에 참조로 포함된다.

바람직한 실시양태에서는, 예를 들어 WO 2013/007786 호, WO 2020/021051 호 및 WO 2020/188033 호(이들의 내용은 본원에 참조로 인용됨)에 기재된 바와 같이 포스포케톨라제(PKT) 활성을 갖는 재조합 유기체 또는 미생물을 이용함으로써 아세틸-CoA의 수율, 풀 및/또는 유동을 증가시킨다.

단계 (b)에 따라 3-메틸크로톤산을 이소부텐으로 효소에 의해 전환시킴

상기 개시된 바와 같이, 본 발명의 방법의 인큐베이션 단계 (b)(i) 또는 (b)(ii)에서는, FMN 프레닐 트랜스퍼라제와 결합된 FMN-의존성 데카복실라제 또는 이러한 효소를 발현하는 미생물을 사용하고, 본 발명의 단계 (a)에서 수득한 3-메틸크로톤산을 함유하는 액체 배지와 함께 인큐베이션한다.

원칙적으로는, FMN 프레닐 트랜스퍼라제와 결합된 임의의 FMN-의존성 데카복실라제(또는 이를 발현하는 미생물)를 본 발명에 따른 방법의 단계 (b)에서 사용할 수 있다. 3-메틸크로톤산을 이소부텐으로 전환시키기 위한 이러한 효소의 용도는 선행 기술, 예를 들어 WO 2017/085167 호, WO 2018/206262 호 및 WO 2020/188033 호(본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.

하기에는, 3-메틸크로톤산의 이소부텐으로의 효소적 전환이 가능한 FMN 프레닐 트랜스퍼라제와 결합된 FMN-의존성 데카복실라제를 사용하는 3-메틸크로톤산의 이소부텐으로의 효소적 전환이 기재된다. 본 발명의 관점에서 FMN 프레닐 트랜스퍼라제와 결합된 FMN-의존성 데카복실라제가 언급될 때마다, 인용의 편의를 위해 "프레닐화된 FMN-의존성 데카복실라제"라고 더 정확하게 언급할 수도 있다.

3-메틸크로톤산의 이소부텐으로의 효소적 전환은 도 1의 단계 I에 개략적으로 도시되어 있다. FMN 프레닐 트랜스퍼라제와 결합된 FMN-의존성 데카복실라제를 사용함으로써, 탈카복실화에 의해 이 전환을 달성할 수 있다. "탈카복실화"는 일반적으로 카복실기를 제거하고 이산화탄소(CO₂)를 방출하는 화학 반응이다.

FMN 프레닐 트랜스퍼라제와 결합된 FMN-의존성 데카복실라제를 사용하여 3-메틸크로톤산을 이소부텐으로 효소에 의해 전환시키는 것은, 두 효소, 즉 변형된 플라빈 보조인자를 제공하는 결합된 FMN 프레닐 트랜스퍼라제와 FMN-의존성 데카복실라제(3-메틸크로톤산의 이소부텐으로의 실제 탈카복실화를 촉진시킴)에 의해 촉진되는 2개의 연속 단계의 반응을 기반으로 한다.

플라빈 보조인자는 바람직하게는 FMN 또는 FAD일 수 있다. FMN(플라빈 모노뉴클레오티드; 리보플라빈-5'-포스페이트라고도 함)은 리보플라빈 키나제 효소에 의해 리보플라빈(비타민 B2)에서 생성되는 생체분자이며 다양한 반응의 보결분자 그룹으로서 기능한다. FAD(플라빈 아데닌 디뉴클레오티드)는 산화환원 보조인자, 보다 구체적으로는 대사에서의 몇 가지 중요한 반응에 관여하는 보결분자 그룹이다.

따라서, 3-메틸크로톤산의 이소부텐으로의 전환에서, 제 1 단계에서는, 플라빈 보조인자(FMN 또는 FAD)를 (변형된) 플라빈-유래 보조인자로 변형시킨다. 상기 FMN 프레닐 트랜스퍼라제에 의해 이 변형이 촉진된다. FMN 프레닐 트랜스퍼라제는 플라빈 보조인자(FMN 또는 FAD)의 플라빈 고리를 (변형된) 프레닐화된 플라빈 보조인자로 프레닐화시킨다. 보다 구체적으로, FMN 프레닐 트랜스퍼라제는 디메틸알릴 포스페이트(DMAP) 또는 디메틸알릴 피로포스페이트(DMAPP)를 사용하여 플라빈 보조인자(FMN 또는 FAD)를 플라빈-유래 보조인자로 프레닐화시키는 것을 촉진한다.

제 2 단계에서는, 1,3-쌍극자 첨가 환화(cycloaddition) 기반 메커니즘을 통해 상기 FMN-의존성 데카복실라제에 의해 3-메틸크로톤산의 이소부텐으로의 실제 전환을 촉진시키며, 이 때 상기 FMN-의존성 데카복실라제는 결합된 FMN 프레닐 트랜스퍼라제에 의해 제공되는 프레닐화된 플라빈 보조인자(FMN 또는 FAD)를 사용한다.

바람직한 실시양태에서, 플라빈 보조인자(FMN 또는 FAD)를 (변형된) 플라빈-유래 보조인자(디메틸알릴 포스페이트(DMAP) 또는 디메틸알릴 피로포스페이트(DMAPP) 이용)로 변형시키는 상기 FMN 프레닐 트랜스퍼라제는 페닐아크릴산 데카복실라제(PAD)-유형 단백질, 또는 원핵생물에서 유비퀴논 생합성에 관여하는 효소인 밀접하게 관련된 원핵생물 효소 UbiX이다.

대장균에서, 단백질 UbiX(3-옥타프레닐-4-하이드록시벤조에이트 카복시-리아제라고도 함)는 유비퀴논 생합성의 제 3 단계에 관여하는 것으로 나타났다.

바람직한 실시양태에서, 플라빈 보조인자(FMN 또는 FAD)의 상응하는 (변형된) 플라빈-유래 보조인자로의 변형은 FMN-함유 단백질 페닐아크릴산 데카복실라제(PAD)에 의해 촉진된다. 플라빈 보조인자(FMN 또는 FAD)를 상응하는 변형된 플라빈-유래 보조인자로 변형시키는 데 관여하는 효소는 처음에 데카복실라제(EC 4.1.1.-)로 주석이 달렸다. 일부 페닐아크릴산 데카복실라제(PAD)는 현재 플라빈 프레닐 트랜스퍼라제로서 EC 2.5.1.-로 주석이 달려 있다. 플라빈 프레닐 트랜스퍼라제에 대해 본원에 기재된 효소 반응을 촉진시킬 수 있는 효소는 또한 최근에 플라빈 프레닐 트랜스퍼라제로서 EC 2.5.1.129로 주석이 달렸다.

보다 바람직한 실시양태에서, 3-메틸크로톤산의 이소부텐으로의 전환에는 플라빈 보조인자(FMN 또는 FAD)를 상응하는 (변형된) 플라빈-유래 보조인자로 변형시키는 FMN 프레닐 트랜스퍼라제로서 페닐아크릴산 데카복실라제(PAD)-유형 단백질이 사용되며, 이 때 상기 페닐아크릴산 데카복실라제(PAD)-유형 단백질은 칸디다 알비칸스(Candida albicans)(Uniprot 수탁 번호 Q5A8L8), 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger)(Uniprot 수탁 번호 A3F715), 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)(Uniprot 수탁 번호 P33751) 또는 크립토코쿠스 가티(Cryptococcus gattii)(Uniprot 수탁 번호 E6R9Z0)로부터 유래된다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 플라빈 보조인자(FMN 또는 FAD)의 상응하는 (변형된) 플라빈-유래 보조인자로의 변형은 UbiX로도 불리는 FMN-함유 단백질 3-옥타프레닐-4-하이드록시벤조에이트 카복시-리아제(처음에는 EC 4.1.1.-로 주석이 달렸음)에 의해 촉진된다. 위에서 언급한 바와 같이, 플라빈 보조인자(FMN 또는 FAD)를 상응하는 변형된 플라빈-유래 보조인자로 변형시키는 데 관여하는 효소는 처음에 데카복실라제로 주석이 달렸다. 일부 페닐아크릴산 데카복실라제(PAD)는 현재 플라빈 프레닐 트랜스퍼라제로서 EC 2.5.1.-로 주석이 달려 있다. 상기 언급한 바와 같이, 플라빈 프레닐 트랜스퍼라제에 대해 본원에 기재된 효소 반응을 촉진시킬 수 있는 효소는 또한 최근에 플라빈 프레닐 트랜스퍼라제로서 EC 2.5.1.129로 주석이 달렸다.

보다 바람직한 실시양태에서는, 3-메틸크로톤산의 이소부텐으로의 전환에는 플라빈 보조인자(FMN 또는 FAD)를 상응하는 (변형된) 플라빈-유래 보조인자로 변형시키는 FMN 프레닐 트랜스퍼라제로서 3-옥타프레닐-4-하이드록시벤조에이트 카복시-리아제(UbiX라고도 함)가 사용되는데, 여기에서 상기 3-옥타프레닐-4-하이드록시벤조에이트 카복시-리아제(UbiX라고도 함)는 대장균(Uniprot 수탁 번호 P0AG03), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)(Uniprot 수탁 번호 A0A086WXG4), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)(Uniprot 수탁 번호 A0A072ZCW8) 또는 엔테로박터(Enterobacter) 종 DC4(Uniprot 수탁 번호 W7P6B1)로부터 유래된다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 플라빈 보조인자(FMN 또는 FAD)의 상응하는 (변형된) 플라빈-유래 보조인자로의 변형은 각각 kpdB 및 ecdB에 의해 코딩된 대장균(UniProt 수탁 번호 A0A023LDW3 및 UniProt 수탁 번호 P69772)으로부터 유래된 Ubx-유사 플라빈 프레닐 트랜스퍼라제, 및 kpdB에 의해 코딩된 클렙시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae)(UniProt 수탁 번호 Q462H4)에서 유래된 UbiX-유사 플라빈 프레닐 트랜스퍼라제에 의해 촉진된다.

다른 바람직한 실시양태에서, 플라빈 보조인자(FMN 또는 FAD)의 상응하는 (변형된) 플라빈-유래 보조인자로의 변형은 플라빈 프레닐 트랜스퍼라제에 의해 촉진된다.

위에서 언급한 바와 같이, 실제 탈카복실화, 즉 3-메틸크로톤산의 이소부텐으로의 전환은 1,3-쌍극자 첨가 환화 기반 메커니즘을 통해 FMN-의존성 데카복실라제에 의해 촉진되며, 여기에서 상기 FMN-의존성 데카복실라제는 상기 기재된 결합된 FMN 프레닐 트랜스퍼라제중 임의의 것에 의해 제공되는 프레닐화된 플라빈 보조인자(FMN 또는 FAD)를 사용한다.

바람직한 실시양태에서, 3-메틸크로톤산의 이소부텐으로의 탈카복실화를 촉진하는 상기 FMN-의존성 데카복실라제는 페룰산 데카복실라제(FDC)에 의해 촉진된다. 페룰산 데카복실라제(FDC)는 효소 부류 EC 4.1.1.-에 속한다.

훨씬 더 바람직한 실시양태에서, 3-메틸크로톤산의 이소부텐으로의 전환에는 사카로마이세스 세레비지아에(Uniprot 수탁 번호 Q03034), 엔테로박터 종(Uniprot 수탁 번호 V3P7U0), 바실러스 푸밀루스(Bacillus pumilus)(Uniprot 수탁 번호 Q45361), 아스퍼질러스 니거(Uniprot 수탁 번호 A2R0P7) 또는 칸디다 두블리니엔시스(Candida dubliniensis)(Uniprot 수탁 번호 B9WJ66)로부터 유래되는 페룰산 데카복실라제(FDC)가 사용된다.

다른 더 바람직한 실시양태에서, 3-메틸크로톤산의 이소부텐으로의 전환에는 프로토카테추에이트 데카복실라제(EC 4.1.1.63)가 사용된다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 PCA 데카복실라제는 클렙시엘라 뉴모니아에(Uniprot 수탁 번호 B9AM6), 렙토링비아(Leptolyngbya) 종(Uniprot 수탁 번호 A0A0S3U6D8), 또는 파스콜락토박테리움(Phascolarctobacterium) 종(Uniprot 수탁 번호 R6IIV6)으로부터 유래되는 PCA 데카복실라제이다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 3-메틸크로톤산의 이소부텐으로의 탈카복실화를 촉진하는 상기 FMN-의존성 탈카복실라아제는 상기 페룰산 데카복실라제(FDC)와 밀접하게 관련된 효소, 즉 3-폴리프레닐-4-하이드록시벤조에이트 데카복실라제(또한 UbiD라고도 함)이다. 3-폴리프레닐-4-하이드록시벤조에이트 데카복실라제는 EC 4.1.1.-로서 분류되는 UbiD 데카복실라제 계열에 속한다.

보다 바람직한 실시양태에서, 3-메틸크로톤산의 이소부텐으로의 전환에는 히포크레아 아트로비리디스(Hypocrea atroviridis)(UniProt 수탁 번호 G9NLP8), 스파에룰리나 무시바(Sphaerulina musiva)(UniProt 수탁 번호 M3DF95), 페네실리눔 레퀘포르티(Penecillinum requeforti)(UniProt 수탁 번호 W6QKP7), 푸사리움 옥시스포룸 아종 리코페르시시(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici)(UniProt 수탁 번호 W9LTH3), 사카로마이세스 쿠드리압제비(Saccharomyces kudriavzevii)(UniProt 수탁 번호 J8TRN5), 사카로마이세스 세레비지아에, 아스퍼질러스 파라시티쿠스(Aspergillus parasiticus), 칸디다 알비칸스, 그로스마니아 클라비게라(Grosmannia clavigera), 대장균(Uniprot 수탁 번호 P0AAB4), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)(Uniprot 수탁 번호 D5DTL4), 메타노써모박터(Methanothermobacter) 종 CaT2(Uniprot 수탁 번호 T2GKK5), 마이코박테리움 켈로나에(Mycobacterium chelonae) 1518(Uniprot 수탁 번호 X8EX86) 또는 엔테로박터 클로아카에(Enterobacter cloacae)(Uniprot 수탁 번호 V3DX94)로부터 유래되는 3-폴리프레닐-4-하이드록시벤조에이트 데카복실라제(UbiD)가 사용된다.

다른 더 바람직한 실시양태에서, 3-메틸크로톤산의 이소부텐으로의 전환에는 스트렙토마이세스(Streptomyces) 종(UniProt 수탁 번호 A0A0A8EV26)에서 유래된 UbiD-유사 데카복실라제가 사용된다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법의 인큐베이션 단계 (b)(i)에서는, 그러한 효소(들)를 과발현하고/하거나 더 높은 효소 활성 또는 더 높은 기질 특이성과 같은 개선된 특성을 나타내는 그러한 효소(들)를 발현하는 FMN 프레닐 트랜스퍼라제와 결합된 FMN-의존성 데카복실라제를 발현하는 미생물을 사용한다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법의 인큐베이션 단계 (b)(ii)에서는, 그러한 효소(들)를 과발현하는 미생물을 이용하여 생성된 FMN 프레닐 트랜스퍼라제와 결합된 FMN-의존성 데카복실라제를 사용하고/하거나, 더 높은 효소 활성 또는 더 높은 기질 특이성과 같은 개선된 특성을 나타내는 효소(들)를 사용한다. 이러한 개선된 특성을 나타내는 상응하는 재조합 미생물 및 효소(들)는 선행 기술, 예를 들어 WO 2018/206262 호에 기재되어 있다. 특히 이러한 효소(들)의 과발현 및/또는 더 높은 효소 활성 또는 더 높은 기질 특이성과 같은 개선된 특성을 나타내는 이러한 효소(들)에 관한 이 문헌의 개시내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다.

본 발명은 또한 3-메틸크로톤산으로부터 또는 3-메틸크로톤산과 밀접하게 관련된 화합물로부터 이소부텐을 생성시키는 다른 방법을 고려한다.

예를 들어, 한 실시양태에서는, 본 발명에 따른 전술한 방법의 배양 단계 (a)를 생략하고, 3-메틸크로톤산의 이소부텐으로의 효율적인 전환이 가능하도록 공기-공급이 제어되는 상기 인큐베이션 단계 (b)에 3-메틸크로톤산(이의 생성 방법에 관계없이)을 사용하는 것이 고려될 수 있다.

따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 배양 단계 (a)를 생략하고 3-메틸크로톤산을 인큐베이션 단계 (b)에서 사용되는 용기에 (직접) 공급하는 본 발명에 따른 방법에 관한 것이다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 용기 내 액체 배지에 3-메틸크로톤산을 공급하는 단계; 및 (b) (i) 단계 (a)에서 수득된 3-메틸크로톤산을 함유하는 액체 배지와 함께 FMN 프레닐 트랜스퍼라제와 결합된 FMN-의존성 데카복실라제를 발현하는 미생물을 인큐베이션하고/하거나 (ii) 단계 (a)에서 수득한 3-메틸크로톤산을 함유하는 액체 배지와 함께 FMN 프레닐 트랜스퍼라제와 결합된 FMN-의존성 데카복실라제를 인큐베이션함으로써, 액체 배지에 함유된 3-메틸크로톤산을 이소부텐으로 효소에 의해 전환시키고, 이로써 상기 이소부텐을 생성시키는 단계; 및 (c) 생성된 이소부텐을 회수하는 단계를 포함함을 특징으로 하는, 3-메틸크로톤산으로부터 이소부텐을 생성시키는 방법에 관한 것이며, 이 때 (a) 가스 공급 없이 상기 용기에서, 또는 (b) 유입 가스를 사용하여 < 0.1vvm(분당 용기 부피)의 가스를 공급하면서 상기 용기에서, 상기 단계 (b)의 인큐베이션을 수행한다.

"용기 내 액체 배지에 3-메틸크로톤산을 공급"이라는 용어는 인큐베이션 단계 (b)가 수행되어야 하는 용기 내의 액체 배지에 3-메틸크로톤산을 제공함을 의미한다. 먼저 용기에 인큐베이션이 수행되어야 하는 액체 배지를 제공한 다음 3-메틸크로톤산을 원하는 농도로 상기 배지에 첨가함으로써, 또는 3-메틸크로톤산을 이미 함유하는 배지를 용기에 제공함으로써, 이를 수행할 수 있다. 3-메틸크로톤산의 전환을 달성하기 위해 사용되는 미생물/효소는, 3-메틸크로톤산을 제공하기 전에, 3-메틸크로톤산을 제공한 후에 또는 동시에 첨가할 수 있다. 또한, 인큐베이션 단계 (b) 동안 3-메틸크로톤산을 용기의 배지에 공급할 수 있다. 이는 연속식으로 또는 회분식으로 수행할 수 있다. 이러한 방식으로, 예를 들어 이소부텐으로의 효율적인 전환을 허용하는 원하는 수준으로 배지 내 3-메틸크로톤산의 농도를 유지할 수 있다. 따라서, 이러한 실시양태에서는, 배지 내 3-메틸크로톤산의 농도를 모니터링하고(예를 들어, 계속 또는 미리 결정된 시간 간격으로), 추가적인 3-메틸크로톤산을 배지에 공급함으로써 농도를 목적하는 농도로 조정할 것으로 예상된다.

인큐베이션 단계 (b)에 대한 추가의 바람직한 실시양태에 관해서는, 본 발명의 제 1 양태와 관련하여 상기 기재된 바와 동일한 내용이 적용된다.

또 다른 대안에서, 본 발명은 또한 단계 (a)에서 3-메틸크로톤산이 생성되지 않고 3-메틸크로톤산의 수화된 형태(즉, 3-하이드록시-3-메틸부티르산(3-하이드록시이소발레르산, HIV)으로도 알려짐)가 생성되는 상기 기재된 방법에 관한 것이다.

다른 가능한 경로를 통해 3-하이드록시-3-메틸부티르산을 생성시키는 방법이 기재되었다(개요는 도 2 참조). 이러한 경로 및 효소적 전환을 이용하는 방법뿐만 아니라 재조합 유기체 및 미생물은 예를 들어 WO 2012/052427 호, WO 2017/085167 호 및 WO 2016/042012 호에 기재되어 있다.

특히 3-하이드록시-3-메틸부티르산으로 이어지는 본원에 기재된 경로의 개별 전환을 위한 효소의 바람직한 실시양태에 관한 이들 문헌의 개시내용은 그 전체가 참조로 본원에 포함된다. 따라서, 바람직한 실시양태에서는, 각각의 효소적 전환과 관련하여 이들 선행 기술 문헌에 기재된 바람직한 실시양태로부터 선택되는 효소를 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 다른 방법에서는, 일단 3-하이드록시-3-메틸부티르산을 단계 (a)에서 생성시키고, 인큐베이션 단계 (b)는 바람직하게는 열화학적 전환에 의해, 이를 3-메틸크로톤산으로 탈수시킴으로써(예시를 위해 도 2 참조), 이렇게 생성된 3-하이드록시-3-메틸부티르산으로부터 3-메틸크로톤산을 생성시킴을 포함한다. 동일한 단계 (b)에서, 이렇게 생성된 3-메틸크로톤산을 이후 상기 기재된 바와 같이 이소부텐으로 전환시킨다.

또 다른 바람직한 실시양태에서는, 단계 (a)에서 수득한 액체 배지에 함유된 3-메틸크로톤산의 이소부텐으로의 열화학적 전환에 대해 상기 개시된 바와 같이, 상기 대안에서는 3-메톡시크로톤산 대신 3-하이드록시-3-메틸부티르산으로 필요한 부분을 약간 수정하여, 단계 (a)에서 수득한 액체 배지에 함유된 상기 3-하이드록시-3-메틸부티르산을 바람직하게는 180℃ 내지 400℃에서 이소부텐으로 열화학적으로 전환시킨다.

따라서, 상응하는 단계 (b)에서는, 단계 (a)에서 수득한 액체 배지에 함유된 3-하이드록시-3-메틸부티르산을 이소부텐으로 열화학적으로 전환시킨다. 바람직하게는, 180℃ 내지 400℃에서 상기 열화학적 변환을 수행한다.

당업계에 공지된 절차에 따라 3-하이드록시-3-메틸부티르산을 이소부텐 및 이산화탄소로 효율적으로 전환시킬 수 있다. 바람직하게는, 3-하이드록시-3-메틸부티르산을 180℃ 내지 400℃, 바람직하게는 230℃ 내지 350℃에서 가열한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서는, 비등 반응기, 교반식 탱크 반응기 또는 관형 반응기에서 열화학적 전환을 수행한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 열화학적 변환은 0 내지 30바, 바람직하게는 10 내지 30바에서 수행한다.

바람직하게는, 3-하이드록시-3-메틸부티르산을 기체 형태인 이소부텐, 물 및 이산화탄소로 전환시킨다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 단계 (a)에서 3-메틸크로톤산을 생성시키지 않고 3-하이드록시-3-메틸부티르산의 포스포릴화된 형태(즉, 3-포스포녹시-3-메틸부티르산; 3-포스포녹시이소발레르산(PIV)으로도 알려짐)를 생성시키는 상기 방법에 관한 것이다.

다른 가능한 경로를 통해 3-포스포녹시-3-메틸부티르산을 생성시키는 방법이 기재되어 있다(개요는 도 2 참조). 이러한 경로 및 효소적 전환을 이용하는 방법뿐만 아니라 재조합 유기체 및 미생물이 예를 들어 WO 2012/052427 호, WO 2017/085167 호 및 WO 2016/042012 호에 기재되어 있다.

특히 3-포스포녹시-3-메틸부티르산으로 이어지는 본원에 기재된 경로의 개별 전환을 위한 효소의 바람직한 실시양태에 관한 이들 문헌의 개시내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 따라서, 바람직한 실시양태에서는, 각각의 효소적 전환과 관련하여 이들 선행 기술 문헌에 기재된 바람직한 실시양태로부터 선택된 효소를 사용하는 것이 바람직하다.

그러한 대체 방법에서는, 일단 3-포스포녹시-3-메틸부티르산을 단계 (a)에서 생성시킨 후, 인큐베이션 단계 (b)는 바람직하게는 3-포스포녹시-3-메틸부티르산의 탈포스포릴화(여기에서 가수분해는 -OH 결합의 형성을 유도함)에 의해(예시를 위해 도 2 참조), 이렇게 생성된 3-포스포녹시-3-메틸부티르산으로부터 3-하이드록시-3-메틸부티르산을 생성시킴을 포함하며, 여기에서 단계 (b)는 바람직하게는 열화학적 전환에 의해, 이를 3-메틸크로톤산으로 탈수시킴으로써, 이렇게 생성된 3-하이드록시-3-메틸부티르산으로부터 3-메틸크로톤산을 생성시킴을 포함한다.

동일한 단계 (b)에서는, 이렇게 생성된 3-메틸크로톤산을 이후 상기 기재된 바와 같이 이소부텐으로 전환시킨다.

다르게는, 이러한 대체 방법에서는, 일단 단계 (a)에서 3-포스포녹시-3-메틸부티르산을 생성시킨 후, 인큐베이션 단계 (b)는 바람직하게는 탈포스포릴화 및 동시에 이루어지는 이중 결합 형성에 의해, 이렇게 생성된 3-포스포녹시-3-메틸부티르산으로부터 3-메틸크로톤산을 직접 생성시킴을 포함한다.

동일한 단계 (b)에서는, 이렇게 생성된 3-메틸크로톤산을 이후 상기 기재된 바와 같이 이소부텐으로 전환시킨다.

추가적인 대체 실시양태에서, 본 발명은 단계 (a)에서 3-메틸크로톤산을 생성시키지 않고 3-메틸크로톤산의 수화된 형태(즉, 3-하이드록시-3-메틸부티르산(3-하이드록시이소발레르산, HIV)으로도 알려짐) 및 3-하이드록시-3-메틸부티르산의 포스포릴화된 형태(즉, 3-포스포녹시-3-메틸부티르산; 3-포스포녹시이소발레르산(PIV)으로도 알려짐)를 생성시키는 상기 방법에 관한 것이다.

이러한 대체 방법에서는, 일단 3-하이드록시-3-메틸부티르산을 단계 (a)에서 생성시킨 후, 인큐베이션 단계 (b)는 상기 기재된 바와 같이 이렇게 생성된 3-하이드록시-3-메틸부티르산으로부터 3-메틸크로톤산을 생성시킴을 포함한다. 동일한 단계 (b)에서는, 이렇게 생성된 3-메틸크로톤산을 이후 상기 기재된 바와 같이 이소부텐으로 전환시킨다.

더욱이, 이러한 대체 방법에서는, 일단 3-포스포녹시-3-메틸부티르산을 단계 (a)에서 생성시킨 후, 인큐베이션 단계 (b)는 이렇게 생성된 3-포스포녹시-3-메틸부티르산으로부터 3-하이드록시-3-메틸부티르산을 생성시키고 또한 추가로 상기 기재된 바와 같이 3-메틸크로톤산을 생성시킴을 포함하고/하거나, 상기 기재된 바와 같이 이렇게 생성된 3-포스포녹시-3-메틸부티르산으로부터 3-메틸크로톤산을 직접 생성시킴을 포함한다. 동일한 단계 (b)에서는, 이렇게 생성된 3-메틸크로톤산을 이후 상기 기재된 바와 같이 이소부텐으로 전환시킨다.

위에서 언급한 바와 같이, 본 발명에 따른 방법은 생체내 이소부텐의 대규모 생산, 특히 상업적 생산에 특히 유용하다. 본 발명은 지금까지 얻을 수 없었던 다량의 이소부텐을 상업적으로 또한 비용-효율적으로 생성시키기 위한 새로운 수단 및 방법을 기재한다. 이어, 생성된 다량의 이소부텐을 상업적 환경에서 추가로 전환시켜, 예를 들어 다량의 드롭-인(drop-in) 가솔린(예컨대, 이소옥탄, ETBE, MTBE), 제트-연료, 화장품, 화학 물질(예컨대, 메타크릴산), 폴리이소부텐 또는 부틸 고무를 생성시킬 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 발효 용기 또는 시험관내에서 이소부텐의 "대규모 생산", "상업적 생산" 및 "생물 가공(bioprocessing)"은 100리터 이상, 바람직하게는 400리터 이상의 용량, 보다 바람직하게는 1,000리터 이상의 생산 규모, 더욱 바람직하게는 5,000리터 이상의 생산 규모로 수행된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "다량"은 미생물에서 고유하게 생성될 수 있는 미량을 구체적으로 배제한다.

도 1은 아세틸-CoA에서 3-메틸크로톤산을 거쳐 이소부텐을 생성시키기 위한 인위적인 경로를 도시한다. 또한, 경로 동안 발생할 수 있는 대사산물의 효소적 재순환이 단계 Xa, Xb, XI 및 XII에 도시되어 있다.
도 2는 아세틸-CoA로부터 3-메틸크로토닐-CoA를 거쳐 이소부텐을 생성시키기 위한 인위적인 주요 경로 및 3-메틸크로토닐-CoA로부터 3-메틸크로톤산을 거쳐 이소부텐으로의 가능한 경로를 도시하는데, 특정 단계에 대해 상응하는 효소가 표시되어 있다.
도 3은 대규모 플랜트의 공정 다이어그램을 보여준다. IBN: 이소부텐.
도 4는 각각 "가스 공급 없이"(위쪽 도면) 및 "유입 가스를 사용하여 < 0.1vvm(분당 용기 부피)으로 가스를 공급하면서"(아래쪽 도면) 인큐베이션하기 위한 용기를 개략적으로 도시한다.
도 5는 N₂, CO₂ 및 이소부텐(IBN)과 관련하여 시간 경과에 따른 배출 가스의 조성을 보여준다.
도 6은 이소부텐(IBN) 및 3-메틸크로톤산 소비 속도를 나타낸다.
도 7은 IBN 총 생성량을 나타내며, 100%의 3-메틸크로톤산이 이소부텐(IBN)으로 전환됨을 보여준다.
도 8은 1vvm으로 가스를 공급하면서 인큐베이션하는 경우와 비교하여, 각각 가스를 공급하지 않으면서 또한 < 0.1vvm(분당 용기 부피)으로 가스를 공급하면서 인큐베이션하는 동안 고농도의 IBN 및 CO₂가 생성됨을 보여준다.
도 9는 용기에서 이소부텐이 가스 상태인 온도와 압력 사이의 상관관계를 보여준다. 곡선 위에서 이소부텐은 액체이다. 곡선 아래에서 이소부텐은 기체 상태이다.

본 명세서에는 특허 출원을 비롯한 다수의 문헌이 인용된다. 이들 문서의 개시 내용은(본 발명의 특허 가능성과 관련이 있는 것으로 간주되지는 않지만) 그 전체가 참조로 포함된다. 보다 구체적으로, 모든 참조 문서는 각각의 개별 문서가 참조로 포함되도록 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 참조로 포함된다.

이제, 단지 예시적이며 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되지는 않는 하기 실시예를 참조하여 본 발명을 기재한다.

실시예

실시예 1 : 15L 반응기에서 2단계 공정에 의한 이소부텐 생성

제 1 단계: 아세틸-CoA로부터 3-메틸크로톤산의 생체 내 생성

본 실시예는 외인성 유전자를 발현하는 재조합 대장균 균주에 의한 3-메틸크로톤산의 생성(이로써, 3-메틸크로톤산 경로를 구성함)을 보여준다.

대부분의 미생물과 마찬가지로, 대장균은 글루코스를 아세틸-CoA로 전환시킨다. 이 연구에서 아세틸-CoA를 3-메틸크로톤산으로 전환시키기(도 2) 위해 사용된 효소는 다음과 같이 요약된다.

대장균에서 3-메틸크로톤산 생합성 경로의 발현

하기 유전자를 대장균에서의 발현을 위해 코돈-최적화하였으며 진아트(GeneArt)[라이프 테크놀로지즈(Life Technologies)]에 의해 합성하였다:

- 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum)(Uniprot 수탁 번호 Q6LD78)으로부터의 thl

- 슈도모나스 종(Uniprot 수탁 번호 K9NHK2)으로부터의 ech(에노일 CoA 히드라타제)

- 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)(Uniprot 수탁 번호 P54874)로부터의 mvaS

- 믹소코쿠스 한수푸스(Myxococcus hansupus)(Uniprot 수탁 번호 AKQ65711.1 및 AKQ65710.1)로부터의 글루타코네이트 CoA 트랜스퍼라제의 2개의 서브유닛을 코딩하는 aibA 및 aibB.

- 대장균(균주 K12)(Uniprot 수탁 번호 P77781)으로부터의 menI

pSC101의 복제 기점을 포함하는 발현 벡터(참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC320470/)를, FDC1 유전자의 통합을 제외하고는 WO 2017/085167 호, 실시예 12에 기재된 절차에 따라 하기 유전자의 발현을 위해 사용하였다: mvaS, Ech, aibA, aibB, ydiI. 시퀀싱에 의해 재조합 pGBE13786 플라스미드를 확인하였다.

클로스트리디움 아세토부틸리쿰으로부터의 th1 유전자를 ssrS 유전자좌로 통합함으로써 균주 MG1655를 변형시켰다. 생성된 균주(GBI19077)를 전기 수용성으로 만들고 pGBE13786으로 형질전환시켰다.

형질전환된 세포, 균주 SB1429를 LB 플레이트에 도말하고 테트라사이클린을 공급하였다. 플레이트를 30℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 하기에 기재되는 바와 같은 예비-배양액을 제조하기 위하여, 단리된 콜로니를 사용하였다.

3-메틸크로톤산의 생성

15g/L 효모 추출물, 50mM 글루탐산나트륨, 4mM 황산마그네슘, 5mM 황산나트륨, 10mM 황산암모늄, 25mM 인산이수소칼륨 및 25mM 인산수소이나트륨을 함유하는 배지 6L를 15L 용기에 채우고, 121℃에서 20분간 멸균시켰다. 냉각 후, 필터 멸균된 비타민을 티아민의 경우 0.6mM 및 판토텐산칼슘의 경우 5mM의 최종 농도로 첨가하였다. 필터 멸균된 미량 금속도 염화철 III 10μM, 염화칼슘 4μM, 염화망간 2μM, 황산아연 2μM, 염화구리 0.4μM 및 몰리브덴산나트륨 0.4μM의 최종 농도로 첨가하였다. 그런 다음, 필터 멸균된 글루코스를 최종 농도 1g/L로 첨가하였다.

회분식 배지에 더하여, 2개의 유가(fed batch) 용액을 제조하였다. 첫 번째는 필터 멸균된 300g/L 효모 추출물 용액이었다. 두 번째는 5g/L 황산마그네슘 칠수화물, 10mM 글루탐산나트륨 및 미량 금속을 50μM 염화철 III, 20μM 염화칼슘, 10μM 염화망간, 10μM 황산아연, 2μM 염화구리 및 2μM 몰리브덴산나트륨의 최종 농도로 또한 함유하는 700g/L 글루코스 용액이었다.

30℃에서 50mM 글루탐산나트륨 및 테트라사이클린을 함유하는 LB 배지에서 미리 생육시킨 균주(SB1429)의 예비-배양액 500mL를 배지에 접종하였다. 온도를 32℃에서 30시간 동안 유지한 다음 34℃까지 높였다. 폭기를 0.77vvm으로 설정하였고, 용존 산소 포화도를 5%로 유지하도록 진탕을 조절하였다.

6시간 배양 후, 400mL의 효모 추출물 용액을 18시간에 걸쳐 연속적으로 첨가하였다. 병행하여, 배양을 시작한지 8시간 후에 글루코스 유가를 시작하였고, 22시간 동안 시간당 건조 세포 중량 g당 0.1g 글루코스로 특정 공급 속도를 유지하였다.

이어, 특정 공급 속도를 먼저 0.25g/g/h로 증가시켰고, 나중에는 배지에서 낮은 수준의 글루코스와 아세테이트를 유지하도록 조정하였다. 3-메틸크로톤산 생성을 HPLC로 모니터링하였고, 원하는 생성물 대신 아세트산이 축적되기 시작하면 발효를 중단시켰다.

발효가 중단되었을 때 20g/L보다 많은 3-메틸크로톤산이 생성되었다. 이어, 배지를 원심분리에 의해 정화시키고 실시예 2에서도 마찬가지로 제 2 단계에서 사용하였다.

제 2 단계: 3-메틸크로톤산으로부터의 이소부텐 생성

pSC101 유도 벡터(참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC320470/)를 사용하여, 스트렙토마이세스 종 769(UniProt 수탁 번호 A0A0A8EV26)로부터의 프레닐화된 FMN-의존성 3-메틸크로톤산 데카복실라제(FDC) 및 클렙시엘라 뉴모니아에(kpdB; UniProt 수탁 번호 Q462H4)에서 유래된 Ubx-유사 플라빈 프레닐 트랜스퍼라제의 돌연변이를 발현시켰다. 구축된 플라스미드로 대장균 MG1655 세포를 형질전환시키고, 탄소원으로서 글루코스를 사용하여 효모 추출물과 무기 염을 함유하는 풍부한(rich) 배지에서 새로 수득한 균주 SB1505의 세포를 약 35g/l의 세포 밀도까지 생육시켰다. 세포를 원심분리에 의해 수집하고 250g/L의 농도로 상청액에 재현탁시키고 사용 전 최대 3주 동안 4℃에서 유지시켰다.

15L 반응기에 3-메틸크로토네이트가 함유된 배지 12L를 채우고 800RPM으로 진탕시켰다. 온도는 37℃로 설정하였고 pH는 20% 인산으로 6.3으로 조절하였다. 용기를 스파저를 통해 질소로 통기시켜 반응기의 헤드 스페이스(약 3L)로부터 공기를 플러싱하고 압력을 0.5바로 조절하였다. 유출 가스를 분석하였고, 산소가 더 이상 검출되지 않을 때 질소 가스 공급을 0.017vvm으로 설정하였다. 균주 MB 106의 농축된 세포 1L를 용기에 첨가하여 이소부텐 생성을 개시하였다.

이 때, 3-메틸크로톤산의 농도는 231mM이었다.

시간 경과에 따른 배출 가스의 조성이 도 5에 도시되어 있다.

배지에서 3-메틸크로톤산이 더 이상 검출되지 않을 때, 이소부텐의 생성을 중단시켰다.

실시예 2 : 1L 반응기에서 3-메틸크로톤산으로부터의 이소부텐의 생성

하기 조건 하에 1L 용기에서 인큐베이션 단계를 수행하였다:

매개변수	값
세포(MB106)의 농도	11g/L
온도	37℃
pH	6.5
교반	1000rpm
유입 가스의 특성	N2
유입 유속	유출 가스 중 O2 농도가 0.1% 미만이 될 때까지 1vvm, 이후 - 1vvm - 또는 0.05vvm - 또는 0vvm(이 용기의 경우, 7.5시간 인큐베이션 후, 실험이 끝날 때까지 유입 유속을 0.05vvm으로 조정하였다)

인큐베이션 배지는 다음과 같이 구성되었다:

제품	최종 농도
황산나트륨(Na2SO4)	0.71g/L
황산암모늄((NH4)2SO4)	1.3375g/L
인산이수소칼륨(KH2PO4)	3.4g/L
인산수소이나트륨(Na2HPO4)	4.45g/L
3-메틸크로톤산(실시예 1 참조)	20g/L

유출 가스(IBN, CO₂) 및 3-메틸크로톤산 소비를 시간 경과에 따라 모니터링하였다.

그 결과가 도 6[이소부텐(IBN) 및 3-메틸크로톤산 소비 속도를 나타냄], 도 7[IBN 총 생성 및 3-메틸크로톤산 100%가 이소부텐(IBN)으로 전환됨을 나타냄] 및 도 8(1vvm으로 가스를 공급하면서 배양한 경우와 비교하여, 각각 가스 공급 없이 또한 < 0.1vvm으로 가스를 공급하면서 배양하는 동안 고농도의 IBN 및 CO₂가 생성됨을 보여줌)에 도시된다.

요약:

가스 공급이 낮거나(0.05vvm) 가스 공급이 없을 때(0vvm), IBN 농도가 높고(따라서, 정제하기 쉬움), 연소/폭발 위험이 없는 것으로 밝혀졌다.

실시예 3 : 3-메틸크로톤산 정제, 공정 1

실시예 1에 기재된 조건에 따라 15리터 발효기를 작동시켰다. 원심분리에 의해 바이오매스를 제거하여, 3-메틸크로토네이트 29g/L의 상청액 10.8L를 수득하였다. 이어서, 증발 단계 전에 pH가 pH 3.5로 조정될 때까지 98% 황산 270g을 첨가함으로써, 생성된 상청액을 산성화시켰다.

80℃의 가열 온도, 10℃의 냉각 온도 및 150밀리바의 압력에서 회전 증발기 R300[부치(Buchi)]을 사용하여 증발을 수행하였다. 3-메틸크로톤산의 결정을 응축기에서 회수하였다. 이들을 물로 세척하여 제거하고 증류액과 혼합하였다. 잔류물이 점성이 될 때까지 증발을 수행하였다. 24.5g/L의 3-메틸크로톤산을 함유하는 증류액 11.7kg을 회수하였다.

그 다음, pH를 9.1로 조정하기 위하여 600g의 3M-수산화나트륨을 증류액에 첨가하였다. 잔류물에 고체가 나타날 때까지 80℃의 가열 온도, 10℃의 냉각 온도 및 150밀리바의 압력에서 증발을 수행하였다. 35중량%의 3-메틸크로톤산나트륨 900g을 회수하였다.

20% 황산 488g과 80% 황산 11g을 첨가하여 3-메틸크로톤산을 침전시켰다. 슬러리를 부흐너(Buchner) 깔때기 상에서 여과하여, 3-메틸크로톤산 57중량%의 습윤 고체 488g을 수득하였다.

실시예 4 : 3-메틸크로톤산 정제, 공정 2

실시예 1에 기재된 조건에 따라 15리터 발효기를 작동시켰다. 원심분리에 의해 바이오매스를 제거하여, 3-메틸크로노테이트 27.3g/L의 상청액 7.1L를 수득하였다. 그런 다음, 204g의 3M-수산화나트륨을 첨가함으로써 알칼리화를 수행하여, pH를 pH 9.0으로 조정하였다.

80℃의 가열 온도, 10℃의 냉각 온도 및 150밀리바의 압력에서 회전 증발기 R300(부치)을 사용하여 증발을 수행하였다. 고체가 잔류물에 나타날 때까지 증발을 수행하였다. 3-메틸크로톤산 117g/L를 함유하는 증류액 1.4kg을 회수하였다.

증류액을 10℃로 냉각시키고 부흐너 깔때기 상에서 여과하였다.

그 다음, pH를 3.78로 조정하기 위해 165g의 98%-황산을 잔류물에 첨가하였다. 고체가 잔류물에 나타날 때까지 80℃의 가열 온도, 10℃의 냉각 온도, 150밀리바의 압력에서 증발을 수행하였다. 35중량%의 3-메틸크로톤산나트륨 900g을 회수하여, 3-메틸크로톤산 52중량%의 습윤 고체 146g을 수득하였다.

실시예 5 : 3-메틸크로톤산 정제, 공정 3

200mL들이 유리 재킷 교반 셀(cell)에 21g/L 3-메틸크로토네이트를 함유하는 40mL의 정화된 배양액(실시예 1에 따라 수득함)을 도입하였다. 이어서, 98% 황산을 첨가하여 배양액을 pH=2로 산성화시켰다. 그런 다음, 용매 40mL를 1/1 부피%/부피% 비로 셀에 첨가하였다. 이 실험에서는 하기 용매를 시험하였다:

○ 2-옥탄올(CAS 번호: 123-96-6)

○ 이소도데칸(IDD, CAS 번호: 31807-55-3)

○ 헵탄산(CAS 번호: 111-14-8)

○ 4-메틸-2-펜타논(CAS 번호: 108-10-1)

셀의 온도를 20℃로 설정하고 혼합물을 2시간 동안 격렬하게 교반하였다. 이어서, 교반을 중단하고, 16시간 동안 2개의 액상이 형성되도록 하였다. 마지막으로, 각 상을 개별적으로 회수하고 칭량하였다.

그런 다음, 각 상을 다음과 같이 분석하였다:

○ 수성 상을 하기와 같이 분석하였다:

■ LC-RID: 3-메틸크로톤산의 정량

■ 200℃에서 건조 질량

○ 유기 상을 다음과 같이 분석하였다:

■ 칼 피셔(Karl Fisher): 수분 정량

■ 200℃에서 건조 질량

측정된 분배 계수(K)는 다음 표에 나와 있다:

용매	K(3-메틸크로톤산)
2-옥탄올/정화된 배양액	28.9
IDD/정화된 배양액	2.6
헵탄산/정화된 배양액	26.6
MIBK/정화된 배양액	25.8

이는 시험된 네 가지 용매가 발효액으로부터의 3-메틸크로톤산의 액체-액체 추출에 효율적으로 사용될 수 있음을 보여준다.

3-메틸크로톤산 2.5중량%, 아세트산 1.1중량%의 정화된 발효액 1kg으로부터 3-메틸크로톤산을 추출하였다. 1kg의 2-옥탄올을 첨가하고 16시간 동안 교반하였다. 경사분리 후, 유기상의 질량은 1.03kg이었다. 조성은 97.1중량% 2-옥탄올, 2.3중량% 프렌산, 0.5중량% 아세트산, 0.02중량% 물이었다. 21개의 이론적인 플레이트가 있는 배치 칼럼에서 100바의 압력 및 2의 환류 비로 이 혼합물을 증류시켰다. 제 1 분획은 2-옥탄올, 아세트산 및 물을 함유하였고; 이들의 조성은 증류 칼럼 상부에서 2-옥탄올만 회수될 때까지 시간에 따라 변하였다. 증류 칼럼 중간에서 온도가 상승하면(프렌산도 증발했음을 나타냄), 환류비가 5까지 향상되었다. 35% 2-옥탄올과 65% 프렌산을 함유하는 중간 분획을 회수하였다. 다음 분획은 99.9%의 프렌산 4.9g으로 이루어졌다.

실시예 6 : 3-메틸크로톤산의 이소부텐으로의 열 전환

상기 실시예 3 내지 5에서 수득한 3-메틸크로톤산을 70℃로 용융시키고, 교반식 탱크 반응기, 관형 반응기로 보낸다. 반응기는 최소 220℃의 온도와 10 내지 30바의 압력에서 작동된다. 3-메틸크로톤산을 기체 형태의 이소부텐과 이산화탄소로 전환시킨다.

실시예 7 : 3-메틸크로톤산의 이소부텐으로의 열 전환

3-메틸크로톤산을 100℃에서 용융시키고 지속적으로 펌핑한다. 이를 85℃까지 예열시키고 22g/h의 유속으로 반응기로 보낸다. 반응기는 2mm의 유리 비드를 포함하는 관형 반응기(280mL - 1인치 직경)이다. 반응기 압력은 15바이고 온도는 290℃이다. 반응기 후에, 두 개의 액체 트랩(물 및 에탄올과 물로 연속적으로 제조됨)을 추가하여 가스가 액체를 통과하도록 한다. 115분 실행 후, 샘플을 분석한다. CO₂에 대한 이소부텐 비는 65(GC 상에서의 면적비)로 측정되어, 3-메틸크로톤산 대 이소부텐 수율이 95%임을 보여준다. 트랩에 수집된 액체를 GC-MS에 의해 분석하는데 미량의 불순물만 나타난다. 일부 3-메틸크로톤산이 반응기에 남아 있어, 이소부텐으로의 전환율이 100% 미만임을 설명한다.

실시예 8 : 3-메틸크로톤산의 이소부텐으로의 열 전환

3-메틸크로톤산을 100℃에서 용융시키고 지속적으로 펌핑한다. 이를 85℃까지 예열하고 22g/h의 유속으로 반응기로 보낸다. 반응기는 2mm의 유리 비드를 함유하는 관형 반응기(280mL - 1인치 직경)이다. 반응기 압력은 25바이고 온도는 290℃이다. 반응기 후에, 두 개의 액체 트랩(물 및 에탄올과 물로 연속적으로 제조됨)을 추가하여, 기체가 액체를 통과하도록 한다. 70분 실행 후, 샘플을 분석한다. 3-메틸크로톤산 대 이소부텐 수율은 101%로 측정된다. 트랩에 수집된 액체를 GC-MS에 의해 분석하면 미량의 불순물만 나타난다. 일부 3-메틸크로톤산을 반응기에서 회수한다.

실시예 9 : 아세틸-CoA로부터의 3-하이드록시-3-메틸부티르산 생성

본 실시예는 외인성 유전자를 발현하는 재조합 대장균 균주에 의한 3-하이드록시-3-메틸부티르산의 생성을 보여주어, 3-하이드록시-3-메틸부티르산 경로를 구성한다.

대부분의 미생물과 마찬가지로, 대장균은 글루코스를 아세틸-CoA로 전환시킨다. 아세틸-CoA를 3-하이드록시-3-메틸부티르산으로 전환(도 2)시키기 위해 이 연구에 사용된 효소는 다음과 같이 요약된다.

9.1 대장균에서 3-하이드록시-3-메틸부티르산 생합성 경로의 발현

하기 유전자를 대장균에서의 발현을 위해 코돈-최적화시켰으며 진아트(라이프 테크놀로지즈)에 의해 합성하였다:

- 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Uniprot 수탁 번호 P45359)으로부터의 thl

- 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis)(Uniprot 수탁 번호 P54874)로부터의 mvaS

- 믹소코쿠스 한수푸스(Uniprot 수탁 번호 A0A0H4WQB1 및 A0A0H4WWJ4)로부터의 글루타코네이트 CoA 트랜스퍼라제의 2개의 서브유닛을 코딩하는 aibA 및 aibB.

- 대장균(균주 K12)(Uniprot 수탁 번호 P0AGG2)으로부터의 tesB

- 믹소코쿠스 잔투스(Myxococcus xanthus)(Uniprot 수탁 번호 Q1D5Y4)로부터의 liuC

pSC101의 복제 기점을 함유하는 발현 벡터(참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC320470/)를, 한편으로는 FDC1 유전자의 통합 및 다른 한편으로는 liuC 유전자에 의한 ech 유전자의 치환을 제외하고는 WO 2017/085167 호, 실시예 12에 기재된 절차에 따라 하기 유전자의 발현을 위해 사용하였다: mvaS, Ech, aibA, aibB , menI, liuC. 시퀀싱에 의해 재조합 pGB 5550 플라스미드를 확인하였다(SEQ ID NO:1).

클로스트리디움 아세토부틸리쿰으로부터의 thl 유전자를 ssrS 유전자좌로 통합함으로써 균주 MG1655를 변형시켰다.

아세틸-CoA가 아세테이트로 전환되는 것을 감소시키기 위해 ackA, pta 및 poxB 유전자의 결실을 수행하였다. 락테이트 생성을 줄이기 위해 유전자 ldhA도 결실시켰다. 생성된 균주(GBI19706)를 전기 수용성으로 만들고 플라스미드 pGB 5550으로 형질전환시켰다.

형질전환된 세포, 균주 SB1653을 LB 플레이트에 도말하고 스펙티노마이신을 공급하였다. 플레이트를 30℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 하기 기재된 바와 같이 단리된 콜로니를 사용하여 예비-배양액을 제조하였다.

9.2 유가 모드에서의 3-하이드록시-3-메틸부티르산의 생성

5g/L 효모 추출물, 10g/L 트립톤, 50mM 글루탐산나트륨, 4mM 황산마그네슘, 5mM 황산나트륨, 10mM 황산암모늄, 25mM 인산이수소칼륨 및 25mM 인산수소이나트륨을 함유하는 배지 0.5L를 1L 용기에 채우고, 121℃에서 20분 동안 멸균시켰다. 냉각 후 필터 멸균된 비타민을 티아민의 경우 0.6mM, 판토텐산칼슘의 경우 5mM의 최종 농도로 첨가하고, 필터 멸균된 스펙티노마이신 50mg/L도 배지에 도입하였다. 필터 멸균된 미량 금속도 10μM 염화철 III, 4μM 염화칼슘, 2μM 염화망간, 2μM 황산아연, 0.4μM 염화구리 및 0.4μM 몰리브덴산나트륨의 최종 농도로 첨가하였다. 그런 다음, 필터 멸균된 글루코스를 최종 농도 1g/L로 첨가하였다.

회분식 배지에 덧붙여, 2개의 유가 용액을 준비하였다. 첫 번째는 필터 멸균된 250g/L 효모 추출물 용액이었다. 두 번째는 5g/L 황산마그네슘 칠수화물, 20g/l 글루탐산나트륨 및 미량 금속을 50μM 염화철 III, 20μM 염화칼슘, 10μM 염화망간, 10μM 황산아연, 2μM 염화구리 및 2μM 몰리브덴산나트륨의 최종 농도로 함유하는 600g/L 글루코스 용액이었다.

30℃에서 50mM 글루탐산나트륨 및 50mg/L 스펙티노마이신을 함유하는 LB 배지에서 이전에 생육시킨 균주 SB1653의 예비-배양액 500mL를 배지에 접종하였다. 온도를 32℃에서 30시간 동안 유지한 다음 34℃까지 높였다. 폭기를 2vvm으로 설정하였고, 용존 산소 포화도를 5%로 유지하도록 진탕을 조절하였다. pH는 6.5로 조절하였다.

배양 8시간, 12시간, 16시간 후, 효모 추출물 용액을 각각 10mL씩 첨가하였다. 병행하여, 배양을 시작한지 8시간 후에 글루코스 유가를 시작하였고, 특정 공급 속도를 22시간 동안 시간당 건조 세포 중량 g당 0.08g 글루코스로 유지시켰다.

그런 다음, 공급 속도를 증가시켜 4g/l/h 글루코스를 전달하고, 나중에 배지에서 낮은 수준의 글루코스와 아세테이트를 유지하도록 조정하였다. 3-하이드록시-3-메틸부티르산 생성을 HPLC로 모니터링하고, 원하는 생성물 대신 아세트산이 축적되기 시작하면 발효를 중단시켰다.

발효가 중단되었을 때, 80g/L보다 많은 3-하이드록시-3-메틸부티르산이 생성되었다.

9.3 반연속 모드에서의 3-하이드록시-3-메틸부티르산의 생성

15g/L 효모 추출물, 13.4g/l 글루탐산나트륨, 2.2g/l 황산마그네슘, 0.85g/l 인산이수소칼륨 및 1.1g/l 인산수소이나트륨을 함유하는 배지 0.5L를 1L 용기에 채우고, 121℃에서 20분 동안 멸균시켰다. 냉각 후, 필터 멸균된 비타민을 티아민의 경우 0.6mM, 판토텐산칼슘의 경우 5mM의 최종 농도로 첨가하고, 필터 멸균된 스펙티노마이신 50mg/L도 배지에 도입하였다. 필터 멸균된 미량 금속도 10μM 염화철 III, 4μM 염화칼슘, 2μM 염화망간, 2μM 황산아연 및 0.4μM 염화구리의 최종 농도로 첨가하였다. 그런 다음, 필터 멸균된 글루코스를 최종 농도 5g/L로 첨가하였다.

회분식 배지에 덧붙여, 2개의 유가 용액을 제조하였다. 첫 번째는 필터 멸균된 600g/L 글루코스 용액이었다. 두 번째는 0.85g/l 인산이수소칼륨, 1.1g/l 인산수소이나트륨, 2g/L 황산마그네슘 칠수화물, 50μM 염화철 III, 20μM 염화칼슘, 10μM 염화망간, 10μM 황산아연 및 2μM 염화구리를 함유하는 식염수 용액이었다. 배양액의 부피를 약 0.5리터로 유지하면서 세포를 재순환시키기 위하여, 또한 3-하이드록시-3-메틸부티르산을 함유하는 투과액을 수득하기 위하여, 1L 용기를 비바플로우(vivaflow) 200 PES(200cm², 0.2μ) 모듈[사토리어스(Sartorius)]에 연결하였다.

30℃에서 50mM 글루탐산나트륨 및 스펙티노마이신을 함유하는 LB 배지에서 미리 생육시킨 균주(SB1653)의 예비-배양액 500mL를 배지에 접종하였다. 온도를 32 ℃로 유지시켰다. 폭기는 0.5vvm으로 설정하였고, 진탕은 용존 산소 포화도를 5%로 유지하도록 조절하였다. 30% 암모니아 용액과 5M 인산을 사용하여 pH를 7.5로 조절하였다.

배양 7.5시간 후 5g/l의 글루코스를 첨가하였다. 그런 다음, 배양 9시간 후 3g/l/h의 글루코스를 7시간 동안 가하였다. 배양 16시간 후, 시간당 건조 세포 중량 g당 0.3g 글루코스의 특정 공급을 가하였다.

3-하이드록시-3-메틸부티르산 생성을 HPLC로 모니터링하였고, 발효가 중단되었을 때 12L보다 많은 3-하이드록시-3-메틸부티르산 용액이 생성되었다.

실시예 10 : 농축에 의한 3-하이드록시-3-메틸부티르산(HMB)의 정제

실시예 9.2에 기재된 바와 같이 수득되고 48g의 3-하이드록시-3-메틸부티르산(HMB)을 함유하는 배양액 590ml를 원심분리하였다. 상청액을 회수하고 진한 황산으로 pH 3.3으로 만들었다. 그런 다음, 50℃에서 20밀리바의 압력 하에 부치 300 증발기를 사용하여, 산성화된 배양액을 90ml까지 농축시켰다. 농축액을 원심분리하여 고형분을 제거하고, 상청액을 유사한 방식으로 다시 증발시켜 35ml의 부피로 만들었다. 이 새로운 농축액도 원심분리하고, 최종적으로 HMB 18g(684g/L)을 함유하는 균질한 상청액 26ml를 회수하였다.

실시예 11 : 액체 추출에 의한 3-하이드록시-3-메틸부티르산(HMB)의 정제

실시예 9.3에 기재된 바와 같이 수득되고 177g의 3-하이드록시-3-메틸부티르산(HMB) 및 약 153g의 아세트산을 함유하는 pH 7.6의 투과액 11.9L를, 80℃에서 180밀리바의 압력하에 부치 300 증발기를 사용하여 1.7L로 농축시켰다. 진한 황산을 사용하여 농축액을 pH 3.84로 만든 다음, 먼저 MIBK(메틸 이소부틸 케톤) 1.3L로, 이어 1.1L로 2회 추출하였다. 2개의 MIBK 층을 합치고, 부치 300 증발기를 사용하여 85℃에서 처음에는 150밀리바의 압력하에, 또한 작업 종료 시에는 10밀리바까지 압력을 낮추어 증발시켰다. HMB 93g 및 아세트산 10g을 함유하는 액상(132g) 125ml를 회수하였다.

SEQUENCE LISTING <110> Global Bioenergies <120> Improved means and methods for producing isobutene from 3-methylcrotonic acid <130> AD3993 PCT S3 <150> EP 20 215 872.1 <151> 2020-12-21 <160> 1 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 10770 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant pGB 5550 plasmid <400> 1 ctcactactt tagtcagttc cgcagtatta caaaaggatg tcgcaaacgc tgtttgctcc 60 tctacaaaac agaccttaaa accctaaagg cttaagtagc accctcgcaa gctcgggcaa 120 atcgctgaat attccttttg tctccgacca tcaggcacct gagtcgctgt ctttttcgtg 180 acattcagtt cgctgcgctc acggctctgg cagtgaatgg gggtaaatgg cactacaggc 240 gccttttatg gattcatgca aggaaactac ccataataca agaaaagccc gtcacgcttc 300 tcagggcgtt ttatggcggg tctgctatgt ggtgctatct gactttttgc tgttcagcag 360 ttcctgccct ctgattttcc agtctgaccc tagtcaaggc cttaagtgag tcgtattacg 420 gactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc 480 gccttgcagc acatccccct ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc 540 gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg gcgaatggcg cctgatgcgg tattttctcc 600 ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgcc cggggaacta tagtttaaac ttttcaatga 660 attcatttaa gcggccgcat caattctaga atttaaatag tcaaaagcct ccgaccggag 720 gcttttgact gacctattga caattaaagg ctaaaatgct ataattccac taatagaaat 780 aattttgttt aactttaggt ctctatcgta agaaggagat atacatatga aagaagtggt 840 gattgccagc gcagttcgta ccgcaattgg tagctatggt aaaagcctga aagatgttcc 900 ggcagttgat ctgggtgcaa ccgcaattaa agaagcagtt aaaaaagccg gtattaaacc 960 ggaagatgtg aacgaagtta ttctgggtaa tgttctgcaa gcaggtctgg gtcagaatcc 1020 ggcacgtcag gcctcgttta aagcaggtct gccggttgaa attccggcaa tgaccattaa 1080 caaagtttgt ggtagcggtc tgcgtaccgt tagcctggca gcacagatta tcaaagccgg 1140 tgatgcagat gttattattg ccggtggtat ggaaaatatg agccgtgcac cgtatctggc 1200 aaataatgca cgttggggtt atcgtatggg taatgccaaa tttgtggatg agatgattac 1260 cgatggtctg tgggatgcct ttaatgatta tcacatgggt attaccgcag agaatattgc 1320 agaacgttgg aatattagcc gtgaagaaca ggatgaattt gcactggcaa gccagaaaaa 1380 agcagaagaa gcaattaaaa gcggtcagtt caaagatgaa attgtgccgg ttgttatcaa 1440 aggtcgtaaa ggtgaaaccg ttgttgatac cgatgaacat ccgcgttttg gtagcaccat 1500 tgaaggtctg gcaaaactga aaccggcatt caaaaaagat ggcaccgtta ccgcaggtaa 1560 tgcaagcggt ctgaatgatt gtgcagcagt tctggttatt atgagcgcag aaaaagcaaa 1620 agaactgggt gttaaaccgc tggcaaaaat tgtgagctat ggtagtgccg gtgttgatcc 1680 ggcaattatg ggttatggtc cgttttatgc aaccaaagca gcaattgaaa aagcaggttg 1740 gaccgttgat gaactggatc tgattgaaag caatgaagca tttgcagcac agagcctggc 1800 agttgcaaaa gacctgaaat tcgatatgaa taaagtgaat gtgaatggcg gtgcaattgc 1860 cctgggtcat ccgattggtg caagcggtgc acgtattctg gttaccctgg ttcatgcaat 1920 gcagaaacgt gatgcaaaaa aaggtctggc caccctgtgt attggtggtg gtcagggcac 1980 cgcaattctg ctggaaaaat gctaataagc ttgaaggaga tataatgacc attggtattg 2040 ataaaatcag ctttttcgtg cctccgtact atattgatat gaccgcactg gccgaagcac 2100 gtaatgttga tccgggtaaa tttcatattg gtattggtca ggatcagatg gccgttaatc 2160 cgattagcca ggatattgtt acctttgcag caaatgcagc agaagcaatt ctgaccaaag 2220 aagataaaga ggccattgat atggttattg ttggcaccga aagcagcatt gatgaaagca 2280 aagcagcagc agttgttctg catcgtctga tgggtattca gccgtttgca cgtagctttg 2340 aaattaaaga agcatgttac ggagcaaccg caggtctgca actggcaaaa aatcatgttg 2400 cactgcatcc ggataaaaaa gttctggttg ttgcagcaga tattgccaaa tatggtctga 2460 atagcggtgg tgaaccgacc cagggtgccg gtgcagttgc aatgctggtt gcaagcgaac 2520 cgcgtattct ggcactgaaa gaagataatg ttatgctgac ccaggatatt tatgattttt 2580 ggcgtccgac cggtcatccg tatccgatgg ttgatggtcc gctgagcaat gaaacctata 2640 ttcagagctt tgcacaggtg tgggatgaac ataaaaaacg taccggtctg gatttcgcag 2700 attatgatgc actggcattt catatcccgt ataccaaaat gggtaaaaaa gcactgctgg 2760 ccaaaattag cgatcagacc gaagccgaac aagaacgcat tctggcacgt tatgaagaaa 2820 gcattgttta tagccgtcgt gtgggtaatc tgtataccgg tagcctgtat ctgggtctga 2880 ttagcctgct ggaaaatgca accaccctga ccgcaggtaa tcagattggt ctgtttagct 2940 atggtagcgg tgccgttgca gaatttttca caggtgaact ggttgcaggt tatcagaatc 3000 atctgcaaaa agaaacccat ctggcactgc tggataatcg taccgaactg agcattgcag 3060 aatatgaagc aatgtttgca gaaaccctgg ataccgatat tgatcagacc ctggaagatg 3120 aactgaaata tagcattagc gccattaata acaccgtgcg tagctatcgt aactaataag 3180 gtagaaggag atataatgcc ggaatttaaa gttgatgcac gtggtccgat tgaaatctgg 3240 accattgatg gtgaaagccg tcgtaatgca attagccgtg caatgctgaa agaactgggt 3300 gaactggtta cccgtgttag cagcagccgt gatgttcgtg cagttgttat taccggtgcc 3360 ggtgataaag cattttgtgc cggtgccgat ctgaaagaac gtgcaacaat ggccgaagat 3420 gaagttcgtg catttctgga tggtctgcgt cgtacctttc gtgcaattga aaaaagcgat 3480 tgcgttttta ttgcagccat taatggtgcc gcactgggtg gtggcaccga actggcactg 3540 gcatgtgatc tgcgtgttgc agcaccggca gcagaactgg gtctgaccga agttaaactg 3600 ggcattattc cgggtggtgg tggtacacag cgtctggcac gtctggttgg tccgggtcgt 3660 gcaaaagacc tgattctgac cgcacgtcgt attaatgcag cagaagcatt tagcgttggt 3720 ctggcaaatc gtctggcacc ggaaggtcat ctgctggcag ttgcctatgg tctggcagaa 3780 agcgttgttg aaaatgcacc gattgcagtt gcaaccgcaa aacatgcaat tgatgaaggc 3840 accggtctgg aactggatga tgcactggca ctggaactgc gtaaatatga agaaattctg 3900 aaaaccgaag atcgcctgga aggtctgcgt gcatttgcag aaaaacgtgc accggtttat 3960 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10680 atttaaagct gttcaccatg aacagatcga caatgtaacg catgcaccga gcgcagcgag 10740 tcagtgagcg aggaagcgga acagcgcctg 10770

Claims (10)

1. (a) 탄소원으로부터 3-메틸크로톤산을 생성시킬 수 있는 미생물을 액체 배지에서 배양(culturing)함으로써 3-메틸크로톤산을 생성시켜 이를 액체 배지에 축적시키는 단계;
   (b) (i) FMN 프레닐 트랜스퍼라제와 결합된 FMN-의존성 데카복실라제를 발현하는 미생물을, 단계 (a)에서 수득한 3-메틸크로톤산을 함유하는 액체 배지와 함께 인큐베이션하고/하거나
   (ii) FMN 프레닐 트랜스퍼라제와 결합된 FMN-의존성 데카복실라제를, 단계 (a)에서 수득한 3-메틸크로톤산을 함유하는 액체 배지와 함께 인큐베이션함으로써,
   단계 (a)에서 수득한 액체 배지에 함유된 3-메틸크로톤산을 이소부텐으로 효소에 의해 전환켜 이소부텐을 생성시키는 단계; 및
   (c) 생성된 이소부텐을 회수하는 단계
   를 포함함을 특징으로 하는, 탄소원으로부터 이소부텐을 생성시키는 방법으로서, 이 때 상기 탄소원으로부터 이소부텐을 생성시키는 방법이,
   (a) 탄소원으로부터 3-메틸크로톤산을 생성시킬 수 있는 미생물을 액체 배지에서 배양함으로써 3-메틸크로톤산을 생성시켜 이를 액체 배지에 축적시키는 단계;
   (b) 바람직하게는 180℃ 내지 400℃에서, 단계 (a)에서 수득한 액체 배지에 함유된 3-메틸크로톤산을 이소부텐으로 열화학적으로 전환시키는 단계; 및
   (c) 생성된 이소부텐을 회수하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 단계 (b)의 인큐베이션을,
   (a) 가스 공급이 없는 용기, 또는
   (b) 유입 가스를 사용하여 < 0.1vvm(분당 용기 부피)의 가스 공급이 있는 용기에서 수행하는 방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   상기 단계 (a)의 3-메틸크로톤산을 함유하는 액체 배지를 단계 (b) 전에 미생물로부터 분리하는 방법.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
   제 1 항에 따른 단계 (b) 전에 액체 배지로부터 3-메틸크로톤산을 단리 또는 정제하는 방법.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
   유입 가스가 공기, 불활성 가스, 또는 공기와 불활성 가스의 혼합물이고, 상기 불활성 가스가 바람직하게는 질소, 헬륨, 아르곤, 네온, CO₂ 및 이들 가스의 혼합물로부터 선택되는 방법.
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 탄소원이 3-메틸크로톤산으로의 효소적 전환 전에 아세틸-CoA로 대사되는 방법.
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 탄소원이 글루코스, 프럭토스, 수크로스, 자일로스, 글리세롤, 전분, 에탄올, 락트산, 아세트산 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
   제 1 항의 단계 (b)(i)에 사용되는 미생물을, 제 1 항의 전환 단계 (b)(i) 전에 적합한 조건 하에 적합한 액체 배지에서 예비-배양하는 방법.
9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 방법이 회수된 이소부텐을 정제/농축시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 미생물이 세균, 효모, 진균 또는 조류인 방법.