JP6148619B2 - 3−ヒドロキシアルカン酸の組合わせ酵素変換によるアルケンの製造 - Google Patents
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Description
WO 2010/001078には、デカルボキシラーゼ活性をもつ酵素で3−ヒドロキシアルカン酸を酵素変換することによりアルケンを製造するための方法が記載されている。そのような方法は、石油製品の使用を避けてプラスチックおよび燃料の製造コストを低下させるのに役立ち、かつ炭素を固体形態で貯蔵できることにより地球環境にかなりの影響をもつ可能性があるので、有利である。WO 2010/001078に記載されている方法は3−ヒドロキシアルカノエートを酵素変換することによるアルケンの製造を可能にするが、特にそれを工業目的に適したものにするためにそのプロセスの効率に関してなお改善が求められている。本出願はこの要求に対処する。
(i)3−ヒドロキシアルカノエートを対応する3−ホスホノキシアルカノエートに変換する活性を有する第1酵素;および
(ii)第1酵素と異なる第2酵素であって、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を有する酵素。
1. 酵素なし、0mM ATP;
2. 2mg/mlの酵素、0mM ATP;
3. 酵素なし、10mM ATP;
4. 2mg/mlの酵素、10mM ATP。
Cn+1H2n+2O3
(1<n<7)に相当し、共通モチーフとしての3−ヒドロキシプロピオネート(図1)および場合により1または2個のアルキル置換基を炭素3上に含む分子を表わす。そのアルキル残基またはアルキル基は直鎖状または分枝状であってよい。本明細書中で用いる用語“アルコイル”と“アルキル”は同じ意味をもち、互換性がある。同様に、用語“残基”と“基”は同じ意味をもち、互換性がある。メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル基はそれらのアルキル基の例である。炭素3は、2個のアルキル置換基が異なる場合はキラル中心になる。2形態のうち一方、たとえばR形が自然界で産生する主形態であったとしても、この定義には2つのキラル形態が含まれる。3−ヒドロキシアルカノエートの例を図3に提示する。場合により、アルキル置換基が炭素2上に付加されてもよく、その場合はそれもキラルとなる(2個のアルキル置換基が異なる場合)。同様に、本発明における3−ヒドロキシアルカノエート基質の立体構造にはすべての立体異性体が含まれる。好ましい態様において、3−ヒドロキシアルカノエートは3−ヒドロキシプロピオネートに相当するか、あるいは3−ヒドロキシプロピオネートのバリアントもしくは誘導体に相当し、その際、炭素3上の2個の水素原子のうち1個もしくは2個が炭素原子と水素原子だけから構成されるモチーフにより置換され、それらの置換基の炭素原子数は1から5まで、好ましくは1から3までであり、たとえばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチルまたはイソブチルである。本明細書中で用いる添字“オエート(oate)”は、互換性をもってカルボキシレートイオン(COO−)またはカルボン酸(COOH)のいずれかを表わすことができる。それはエステルを表わすためには用いられない。具体的態様において、3−ヒドロキシアルカノエートは次式により示される:HO−CO−CH2−C(R1)(R2)−OHまたはO−−CO−CH2−C(R1)(R2)−OH。
Cn+1H2n+3O6P
(1<n<7)に相当し、共通モチーフとしての3−ホスホノキシプロピオネートおよび場合により1または2個のアルキル置換基を炭素3上に含む分子を表わす。
本明細書中で用いる“炭素源”は、本発明による生物が基質として利用できるいずれかの炭素化合物を表わす。その用語には、グルコースもしくは他のいずれかのヘキソース、キシロースもしくは他のいずれかのペントース、ポリオール、たとえばグリセロール、ソルビトールもしくはマンニトール、またはポリマー、たとえばデンプン、セルロースもしくはヘミセルロース、またはポリ−3−ヒドロキシアルカノエート、たとえばポリ−3−ヒドロキシブチレートが含まれる。それは、微生物の増殖を可能にするいずれかの基質、たとえばホルメートであってもよい。生物が光合成を行なうことができる場合には、それはCO2であってもよい。
本明細書中で用いる“相同性”は、2配列間の同一性パーセントにより測定した2配列間に類似性があることを表わす。好ましい態様において、用語“相同性”は、配列同一性を意味する。
− “エチレン”は、エテンを表わすために用いられる;
− “プロピレン”は、プロペンを表わすために用いられる;
− “ブチレン”は、ブテンを表わすために用いられる;
− “イソブチレン”は、2−メチルプロペンまたはイソブテンを表わすために用いられる;
− “アミレン”は、ペンテンを表わすために用いられる;
− “イソアミレン”は、2−メチル−ブタ−1−エンまたはイソペンテンを表わすために用いられる;
− “プロピオネート”は、プロパン酸またはプロパノエートイオンを表わすために用いられる;
− “ブチレート”は、ブタン酸またはブタノエートイオンを表わすために用いられる;
− “バレレート”は、ペンタン酸またはペンタノエートイオンを表わすために用いられる。
(i)3−ヒドロキシアルカノエートを対応する3−ホスホノキシアルカノエートに変換する活性を有する第1酵素;および
(ii)第1酵素と異なる第2酵素であって、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を有する酵素。
好ましい1態様において、前記の(i)および(ii)に述べた酵素は、NCBIまたは同等のエンジンによりCOG3407ドメインをもつとみなされる酵素である。
(A)SEQ ID NO:1に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:1に示すアミノ酸配列と少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ヒドロキシアルカノエートを対応する3−ホスホノキシアルカノエートに変換する活性を示し、それがSEQ ID NO:1に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ高さであるタンパク質;
(B)SEQ ID NO:2に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:2に示すアミノ酸配列と少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ヒドロキシアルカノエートを対応する3−ホスホノキシアルカノエートに変換する活性を示し、それがSEQ ID NO:2に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ高さであるタンパク質;
(C)SEQ ID NO:3に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:3に示すアミノ酸配列と少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ヒドロキシアルカノエートを対応する3−ホスホノキシアルカノエートに変換する活性を示し、それがSEQ ID NO:3に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ高さであるタンパク質;および
(D)SEQ ID NO:4に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:4に示すアミノ酸配列と少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ヒドロキシアルカノエートを対応する3−ホスホノキシアルカノエートに変換する活性を示し、それがSEQ ID NO:4に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ高さであるタンパク質。
本発明による方法のさらに他の好ましい態様において、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を有する第2酵素(ii)は、下記のものからなる群から選択される:
(a)SEQ ID NO:5に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:5に示すアミノ酸配列と少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、それがSEQ ID NO:5に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ高さであるタンパク質;
(b)SEQ ID NO:6に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:6に示すアミノ酸配列と少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、それがSEQ ID NO:6に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ高さであるタンパク質;
(c)SEQ ID NO:7に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:7に示すアミノ酸配列と少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、それがSEQ ID NO:7に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ高さであるタンパク質;
(d)SEQ ID NO:8に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:8に示すアミノ酸配列と少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、それがSEQ ID NO:8に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ高さであるタンパク質;
(e)SEQ ID NO:9に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:9に示すアミノ酸配列と少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、それがSEQ ID NO:9に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ高さであるタンパク質;
(f)SEQ ID NO:10に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:10に示すアミノ酸配列と少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、それがSEQ ID NO:10に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ高さであるタンパク質;
(g)SEQ ID NO:11に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:11に示すアミノ酸配列と少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、それがSEQ ID NO:11に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ高さであるタンパク質;
(h)SEQ ID NO:12に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:12に示すアミノ酸配列と少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、それがSEQ ID NO:12に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ高さであるタンパク質;
(i)SEQ ID NO:13に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:13に示すアミノ酸配列と少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、それがSEQ ID NO:13に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ高さであるタンパク質;
(j)SEQ ID NO:14に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:14に示すアミノ酸配列と少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、それがSEQ ID NO:14に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ高さであるタンパク質;および
(k)SEQ ID NO:15に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:15に示すアミノ酸配列と少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、それがSEQ ID NO:15に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ高さであるタンパク質。
− 3−ヒドロキシプロピオネートを、3−ホスホノキシプロピオネートを経てエチレンに変換する;または
− 3−ヒドロキシブチレートを、3−ホスホノキシブチレートを経てプロピレンに変換する;または
− 3−ヒドロキシバレレートを、3−ホスホノキシバレレートを経て1−ブチレンに変換する;または
3−ヒドロキシ−3−メチルブチレート(または3−ヒドロキシイソバレレート)を、3−ホスホノキシ−3−メチルブチレート(3−ホスホノキシイソバレレート)を経てイソブチレンに変換する;または
3−ヒドロキシ−3−メチルバレレートを、3−ホスホノキシ−3−メチルバレレートを経てイソアミレンに変換する。
特定の態様において、本方法は、微生物を標準培養条件(30〜37℃、1気圧で、その細菌を好気性増殖させることができる発酵槽内において)または非標準条件(たとえば、好熱生物の培養条件に対応する高温)で培養することを伴う。
さらに、同様に本発明による方法について前記に述べた他の好ましい態様に関して、アルケンを3−ホスホノキシアルカノエートから製造するための方法に同じものが適用される。
(i)3−ヒドロキシアルカノエートを対応する3−ホスホノキシアルカノエートに変換する活性を有する第1酵素;および
(ii)第1酵素と異なる第2酵素であって、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を有する酵素。
本発明の他の観点および利点を以下の実施例に記載する;それらは説明のために提示され、限定のためのものではない。
実施例1:MDPデカルボキシラーゼライブラリーのクローニング、発現および精製
真核、原核および古細菌にわたるジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ(MDPデカルボキシラーゼ)ファミリーの代表的なものをコードする55遺伝子のライブラリーを構築し、試験して、イソブテン(IBN)産生を改善するための最も活性な候補を同定した。
メバロン酸二リン酸(MDP)デカルボキシラーゼEC 4.1.1.33をコードする遺伝子を、真核遺伝子の場合はpET 25bベクター(Novagen)内に、原核遺伝子の場合はpET 22b(Novagen)内にクローニングした。一続きの6ヒスチジンコドンをメチオニン開始コドンの後に挿入して、精製のためのフアィニティータグを付与した。コンピテント大腸菌BL21(DE3)細胞(Novagen)を、これらのベクターで熱ショック法に従って形質転換した。これらの形質転換細胞を、振とうしながら(160rpm)、ZYM−5052自動誘導培地(Studier FW, Prot.Exp.Pur. 41, (2005), 207-234)において6時間、37℃で増殖させ、28℃で一夜(約16時間)タンパク質発現を続けた。細胞を4℃、10,000rpmで20分間の遠心により採集し、ペレットを−80℃で凍結した。
200mlの培養細胞からのペレットを氷上で融解し、5mlのNa2HPO4 pH8(300mMのNaCl、5mMのMgCl2および1mMのDTTを含有)に再懸濁した。20μlのリゾナーゼ(lysonase)(Novagen)を添加した。細胞を室温で10分間インキュベートし、次いで氷上に戻して20分間おいた。3×15秒間の音波処理により細胞溶解を完了した。細菌抽出物を次いで4℃、10,000rpmで20分間の遠心により澄明にした。澄明にした細菌溶解物をPROTINO−1000 Ni−TEDカラム(Macherey−Nagel)に装填して、6−Hisタグ付きタンパク質を吸着させた。カラムを洗浄し、目的とする酵素を4mlの50mM Na2HPO4 pH8(300mMのNaCl、5mMのMgCl2、1mMのDTT、250mMのイミダゾールを含有)で溶離した。溶出液を次いで濃縮し、Amicon Ultra−4 10kDaフィルターユニット(Millipore)で脱塩し、0.25mlの50mM Tris−HCl pH7.4(0.5mMのDTTおよび5mMのMgCl2を含有)に再懸濁した。タンパク質濃度をブラッドフォード(Bradford)法により定量した。こうして精製したタンパク質の純度は40%から90%までの範囲であった。
MDPデカルボキシラーゼを相補アッセイにより評価した。ピクロフィルス・トリダス(P. torridus)MDPデカルボキシラーゼを、ライブラリーからの各被験酵素と一緒にインキュベートした。
50mM Tris HCl pH7,0
10mM MgCl2
20mM KCl
40mM ATP
50mM 3−ヒドロキシイソバレレート(HIV)
pHを7.0に調整した。
候補1:
寄託番号Genbank : CAI97800
寄託番号SwissProt/TrEMBL : Q1GAB2
生物:ラクトバチルス・デルブリュッキイ亜種ブルガリカス(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)ATCC 11842
候補2:
寄託番号Genbank : AAC50440.1
寄託番号SwissProt/TrEMBL : P53602.1
生物:ヒト(Homo sapiens)
候補3:
寄託番号Genbank : ABV09606
寄託番号SwissProt/TrEMBL : A8AUU9
生物:ストレプトコッカス・ゴルドニイ(Streptococcus gordonii)株Challis 亜株CH1
イソブテンの最高産生は、ストレプトコッカス・ゴルドニイ由来の精製MDPデカルボキシラーゼでみられた。
ストレプトコッカス・ゴルドニイMDPデカルボキシラーゼ濃度の影響を下記の条件下で評価した:
50mM Tris HCl pH7,0
10mM MgCl2
20mM KCl
40mM ATP
50mM 3−ヒドロキシイソバレレート(HIV)
pHを7.0に調整した。
実施例4:ストレプトコッカス・ゴルドニイMDPデカルボキシラーゼホモログのライブラリーのスクリーニング
NCBIが提供するBLASTオンラインプログラムを用いて、非重複(non redundant)タンパク質配列データベースに対比して配列を検索し、ストレプトコッカス・ゴルドニイ酵素に対する高い配列類似性(>40%の同一性)をもつ酵素のリストを作成した。得られたリストには18の候補が含まれていた。
HIVからのIBN産生に付随するADPの放出を、ピルビン酸キナーゼ/乳酸デヒドロゲナーゼ連結アッセイにより定量した(図10)。ピクロフィルス・トリダス、サーモプラズマ・アシドフィラム、ストレプトコッカス・インファンタリウス、ストレプトコッカス・ミチスに由来するMDPデカルボキシラーゼを、それらがHIVをリン酸化してADPを放出する能力について評価した。
50mM Tris HCl pH7,0
10mM MgCl2
100mM KCl
5mM ATP
0,2mM NADH
0,5mM ホスホエノールピルベート
3U/ml 乳酸デヒドロゲナーゼ
1,5U/ml ピルビン酸キナーゼ
0〜50mM 3−ヒドロキシイソバレレート(HIV)
pHを7.0に調整した。
ピクロフィルス・トリダス門(P. torridus phylum)由来およびストレプトコッカス属由来のMDPデカルボキシラーゼは、HIVの存在下で再現性のあるADP産生増大を生じた。図11は、ピクロフィルス・トリダス酵素について収集したデータに対応するミカエリス−メンテン(Michaelis-Menten)プロットの例を示す。動力学的パラメーターを次表に示す。
実施例6:2種類の酵素を組み合わせることによる3−ヒドロキシイソバレレートからのイソブテン産生
目的とする酵素反応を下記の条件下で実施した:
50mM Tris HCl pH7,5
10mM MgCl2
20mM KCl
40mM ATP
50mM HIV
pHを7.5に調整した。
1mlの気相を採集し、FID検出器およびCP SilicaPlotカラム(Varian)を備えたHP5890ガスクロマトグラフ(HP)に注入した。市販のイソブテンを基準として用いた。
実施例7:3−ホスホノキシイソバレレート(PIV)からのイソブテン産生に対するATPの効果
化合物3−ホスホノキシイソバレレート(PIV)を、3−ヒドロキシイソバレレートから図13に示したスキームに従ってSYNTHEVAL(フランス)により化学合成した。
50mM Tris HCl pH7,5
10mM MgCl2
20mM KCl
0mM ATP(アッセイNo.1およびNo.2)
10mM ATP(アッセイNo.3およびNo.4)
25mM 3−ホスホノキシイソバレレート
pHを7.5に調整した。
1mlの気相を採集し、FID検出器およびCP SilicaPlotカラム(Varian)を備えたVarian 430−GCガスクロマトグラフに注入した。市販のイソブテンを基準として用いた。
実施例8:3−ホスホノキシイソバレレート(PIV)からのイソブテン産生の動力学的パラメーター
イソブテン産生の動力学的パラメーターを下記の条件下で測定した:
50mM Tris HCl pH7,5
10mM MgCl2
50mM KCl
40mM ATP
0〜100mM 3−ホスホノキシイソバレレート
pHを7.5に調整した。
ある態様において、本発明は以下であってもよい。
[態様1]下記の(i)および(ii)により3−ヒドロキシアルカノエートをアルケンに変換することを含むことを特徴とする、アルケンの製造方法:
(i)3−ヒドロキシアルカノエートを対応する3−ホスホノキシアルカノエートに変換する活性を有する第1酵素;および
(ii)第1酵素と異なる第2酵素であって、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を有する酵素。
[態様2](i)3−ヒドロキシアルカノエートを対応する3−ホスホノキシアルカノエートに変換する活性を有する第1酵素が、
(A)SEQ ID NO:1に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:1に示すアミノ酸配列と少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ヒドロキシアルカノエートを対応する3−ホスホノキシアルカノエートに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:1に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ高さであるタンパク質;
(B)SEQ ID NO:2に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:2に示すアミノ酸配列と少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ヒドロキシアルカノエートを対応する3−ホスホノキシアルカノエートに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:2に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ高さであるタンパク質;
(C)SEQ ID NO:3に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:3に示すアミノ酸配列と少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ヒドロキシアルカノエートを対応する3−ホスホノキシアルカノエートに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:3に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ高さであるタンパク質;および
(D)SEQ ID NO:4に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:4に示すアミノ酸配列と少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ヒドロキシアルカノエートを対応する3−ホスホノキシアルカノエートに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:4に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ高さであるタンパク質、
からなる群より選択される、態様1に記載の方法。
[態様3](ii)3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を有する第2酵素が、
(a)SEQ ID NO:5に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:5に示すアミノ酸配列と少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:5に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ高さであるタンパク質;
(b)SEQ ID NO:6に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:6に示すアミノ酸配列と少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:6に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ高さであるタンパク質;
(c)SEQ ID NO:7に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:7に示すアミノ酸配列と少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:7に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ高さであるタンパク質;
(d)SEQ ID NO:8に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:8に示すアミノ酸配列と少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:8に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ高さであるタンパク質;
(e)SEQ ID NO:9に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:9に示すアミノ酸配列と少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:9に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ高さであるタンパク質;
(f)SEQ ID NO:10に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:10に示すアミノ酸配列と少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:10に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ高さであるタンパク質;
(g)SEQ ID NO:11に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:11に示すアミノ酸配列と少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:11に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ高さであるタンパク質;
(h)SEQ ID NO:12に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:12に示すアミノ酸配列と少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:12に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ高さであるタンパク質;
(i)SEQ ID NO:13に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:13に示すアミノ酸配列と少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:13に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ高さであるタンパク質;
(j)SEQ ID NO:14に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:14に示すアミノ酸配列と少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:14に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ高さであるタンパク質;
(k)SEQ ID NO:15に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:15に示すアミノ酸配列と少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:15に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ高さであるタンパク質、
からなる群より選択される、態様1または2に記載の方法。
[態様4]3−ヒドロキシプロピオネートをエチレンに変換する工程を含む、態様1〜3のいずれか1に記載の方法。
[態様5]3−ヒドロキシブチレートをプロピレンに変換する工程を含む、態様1〜3のいずれか1に記載の方法。
[態様6]3−ヒドロキシバレレートを1−ブチレンに変換する工程を含む、態様1〜3のいずれか1に記載の方法。
[態様7]3−ヒドロキシ−3−メチルブチレートをイソブチレンに変換する工程を含む、態様1〜3のいずれか1に記載の方法。
[態様8]3−ヒドロキシ−3−メチルバレレートをイソアミレンに変換する工程を含む、態様1〜3のいずれか1に記載の方法。
[態様9]変換工程をインビトロで無細胞系において実施することを特徴とする、態様1〜8のいずれか1に記載の方法。
[態様10]方法を、態様1に記載の(i)および(ii)に定める酵素を産生する微生物の存在下で実施することを特徴とする、態様1〜9のいずれか1に記載の方法。
[態様11]態様1に記載の(i)および(ii)に定める酵素を産生する多細胞生物の使用を特徴とする、態様1〜10のいずれか1に記載の方法。
[態様12]反応物から排出するガス状アルケンを採集する工程を含む、態様1〜11のいずれか1に記載の方法。
[態様13]少なくとも2つの酵素を産生し、1つの酵素が(i)から選択され、他の酵素が(ii)から選択され、(i)および(ii)が下記の通りである、多細胞生物または微生物: (i)3−ヒドロキシアルカノエートを対応する3−ホスホノキシアルカノエートに変換する活性を有する第1酵素;および
(ii)第1酵素と異なる第2酵素であって、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を有する酵素。
[態様14]態様13に記載の微生物、適切な培養培地、および3−ヒドロキシアルカノエート化合物または該微生物により3−ヒドロキシアルカノエート化合物に変換されることができる炭素源を含む、組成物。
[態様15]3−ヒドロキシアルカノエートからアルケン化合物を製造するための、1つの酵素が下記の(i)から選択されかつ他の酵素が下記の(ii)から選択される少なくとも2つの酵素の組合わせの使用、または態様13に記載の微生物の使用、または態様14に記載の組成物の使用であって、(i)および(ii)が下記の通りである使用:
(i)3−ヒドロキシアルカノエートを対応する3−ホスホノキシアルカノエートに変換する活性を有する第1酵素;および
(ii)第1酵素と異なる第2酵素であって、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を有する酵素。
[態様16](i)3−ヒドロキシアルカノエートを対応する3−ホスホノキシアルカノエートに変換する活性を有する第1酵素が、
(A)SEQ ID NO:1に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:1に示すアミノ酸配列と少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ヒドロキシアルカノエートを対応する3−ホスホノキシアルカノエートに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:1に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ高さであるタンパク質;
(B)SEQ ID NO:2に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:2に示すアミノ酸配列と少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ヒドロキシアルカノエートを対応する3−ホスホノキシアルカノエートに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:2に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ高さであるタンパク質;
(C)SEQ ID NO:3に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:3に示すアミノ酸配列と少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ヒドロキシアルカノエートを対応する3−ホスホノキシアルカノエートに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:3に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ高さであるタンパク質;および
(D)SEQ ID NO:4に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:4に示すアミノ酸配列と少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ヒドロキシアルカノエートを対応する3−ホスホノキシアルカノエートに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:4に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ高さであるタンパク質、
からなる群より選択される、態様14に記載の使用。
[態様17](ii)3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を有する第2酵素が、
(a)SEQ ID NO:5に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:5に示すアミノ酸配列と少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:5に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ高さであるタンパク質;
(b)SEQ ID NO:6に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:6に示すアミノ酸配列と少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:6に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ高さであるタンパク質;
(c)SEQ ID NO:7に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:7に示すアミノ酸配列と少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:7に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ高さであるタンパク質;
(d)SEQ ID NO:8に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:8に示すアミノ酸配列と少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:8に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ高さであるタンパク質;
(e)SEQ ID NO:9に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:9に示すアミノ酸配列と少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:9に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ高さであるタンパク質;
(f)SEQ ID NO:10に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:10に示すアミノ酸配列と少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:10に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ高さであるタンパク質;
(g)SEQ ID NO:11に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:11に示すアミノ酸配列と少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:11に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ高さであるタンパク質;
(h)SEQ ID NO:12に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:12に示すアミノ酸配列と少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:12に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ高さであるタンパク質;
(i)SEQ ID NO:13に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:13に示すアミノ酸配列と少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:13に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ高さであるタンパク質;
(j)SEQ ID NO:14に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:14に示すアミノ酸配列と少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:14に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ高さであるタンパク質;および
(k)SEQ ID NO:15に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:15に示すアミノ酸配列と少なくとも15%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:15に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ高さであるタンパク質、
からなる群より選択される、態様15または16に記載の使用。
[態様18]脱カルボキシル化および脱リン酸化を介して変換を触媒することができる酵素の使用により、3−ホスホノキシアルカノエートを対応するアルケンに酵素的に変換する工程を含む、アルケンの製造方法。
[態様19]方法を、ATP、dATP、ADP、AMP、ATP以外のNTP、dNTPまたはピロホスフェートを補助基質として用いて実施することを特徴とする、態様1〜12のいずれか1または態様18に記載の方法。
Claims (10)
- 下記の(i)および(ii)により3−ヒドロキシアルカノエートをアルケンに変換することを含むことを特徴とする、アルケンの製造方法:
(i)3−ヒドロキシアルカノエートを対応する3−ホスホノキシアルカノエートに変換する活性を有する第1のメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ;および
(ii)第1のメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼと異なる第2のメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼであって、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を有するメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ
であって、3−ヒドロキシアルカノエートが3−ヒドロキシイソバレレートであり、
(i)3−ヒドロキシアルカノエートを対応する3−ホスホノキシアルカノエートに変換する活性を有する第1のメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼが、
(A)SEQ ID NO:1に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:1に示すアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ヒドロキシアルカノエートを対応する3−ホスホノキシアルカノエートに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:1に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ強さであるタンパク質;
(B)SEQ ID NO:2に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:2に示すアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ヒドロキシアルカノエートを対応する3−ホスホノキシアルカノエートに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:2に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ強さであるタンパク質;
(C)SEQ ID NO:3に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:3に示すアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ヒドロキシアルカノエートを対応する3−ホスホノキシアルカノエートに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:3に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ強さであるタンパク質;および
(D)SEQ ID NO:4に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:4に示すアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ヒドロキシアルカノエートを対応する3−ホスホノキシアルカノエートに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:4に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ強さであるタンパク質、
からなる群より選択され、
(ii)3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を有する第2のメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼが、
(a)SEQ ID NO:5に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:5に示すアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:5に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ強さであるタンパク質;
(b)SEQ ID NO:6に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:6に示すアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:6に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ強さであるタンパク質;
(c)SEQ ID NO:7に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:7に示すアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:7に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ強さであるタンパク質;
(d)SEQ ID NO:8に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:8に示すアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:8に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ強さであるタンパク質;
(e)SEQ ID NO:9に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:9に示すアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:9に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ強さであるタンパク質;
(f)SEQ ID NO:10に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:10に示すアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:10に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ強さであるタンパク質;
(g)SEQ ID NO:11に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:11に示すアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:11に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ強さであるタンパク質;
(h)SEQ ID NO:12に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:12に示すアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:12に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ強さであるタンパク質;
(i)SEQ ID NO:13に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:13に示すアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:13に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ強さであるタンパク質;
(j)SEQ ID NO:14に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:14に示すアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:14に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ強さであるタンパク質;
(k)SEQ ID NO:15に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:15に示すアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:15に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ強さであるタンパク質、
からなる群より選択される、前記製造方法。 - 3−ヒドロキシ−3−メチルブチレートをイソブチレンに変換する工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 変換工程をインビトロで無細胞系において実施することを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。
- 方法を、請求項1に記載の(i)および(ii)に定めるメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼを産生する微生物の存在下で実施することを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1に記載の(i)および(ii)に定めるメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼを産生する多細胞生物の使用を特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 反応物から排出するガス状アルケンを採集する工程を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも2つのメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼを産生し、1つのメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼが(i)から選択され、他のメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼが(ii)から選択され、(i)および(ii)が下記の通りである、多細胞生物または微生物:
(i)3−ヒドロキシアルカノエートを対応する3−ホスホノキシアルカノエートに変換する活性を有する第1のメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ;および
(ii)第1のメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼと異なる第2のメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼであって、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を有するメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ
であって、前記少なくとも2つのメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼが、その多細胞生物または微生物に関してヘテロロガスである、前記多細胞生物または微生物。 - 請求項7に記載の微生物、適切な培養培地、および3−ヒドロキシアルカノエート化合物または該微生物により3−ヒドロキシアルカノエート化合物に変換されることができる炭素源を含む、組成物。
- 3−ヒドロキシアルカノエートからアルケン化合物を製造するための、1つのメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼが下記の(i)から選択されかつ他のメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼが下記の(ii)から選択される少なくとも2つのメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼの組合わせの使用、または請求項7に記載の微生物の使用、または請求項8に記載の組成物の使用であって、(i)および(ii)が下記の通りである使用:
(i)3−ヒドロキシアルカノエートを対応する3−ホスホノキシアルカノエートに変換する活性を有する第1のメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ;および
(ii)第1のメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼと異なる第2のメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼであって、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を有するメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ
であって、3−ヒドロキシアルカノエートが3−ヒドロキシイソバレレートであり、
(i)3−ヒドロキシアルカノエートを対応する3−ホスホノキシアルカノエートに変換する活性を有する第1のメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼが、
(A)SEQ ID NO:1に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:1に示すアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ヒドロキシアルカノエートを対応する3−ホスホノキシアルカノエートに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:1に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ強さであるタンパク質;
(B)SEQ ID NO:2に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:2に示すアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ヒドロキシアルカノエートを対応する3−ホスホノキシアルカノエートに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:2に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ強さであるタンパク質;
(C)SEQ ID NO:3に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:3に示すアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ヒドロキシアルカノエートを対応する3−ホスホノキシアルカノエートに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:3に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ強さであるタンパク質;および
(D)SEQ ID NO:4に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:4に示すアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ヒドロキシアルカノエートを対応する3−ホスホノキシアルカノエートに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:4に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ強さであるタンパク質、
からなる群より選択され、
(ii)3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を有する第2のメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼが、
(a)SEQ ID NO:5に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:5に示すアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:5に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ強さであるタンパク質;
(b)SEQ ID NO:6に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:6に示すアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:6に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ強さであるタンパク質;
(c)SEQ ID NO:7に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:7に示すアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:7に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ強さであるタンパク質;
(d)SEQ ID NO:8に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:8に示すアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:8に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ強さであるタンパク質;
(e)SEQ ID NO:9に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:9に示すアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:9に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ強さであるタンパク質;
(f)SEQ ID NO:10に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:10に示すアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:10に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ強さであるタンパク質;
(g)SEQ ID NO:11に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:11に示すアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:11に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ強さであるタンパク質;
(h)SEQ ID NO:12に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:12に示すアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:12に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ強さであるタンパク質;
(i)SEQ ID NO:13に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:13に示すアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:13に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ強さであるタンパク質;
(j)SEQ ID NO:14に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:14に示すアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:14に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ強さであるタンパク質;および
(k)SEQ ID NO:15に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはSEQ ID NO:15に示すアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、3−ホスホノキシアルカノエートをアルケンに変換する活性を示し、該活性がSEQ ID NO:15に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の対応する活性と少なくとも同じ強さであるタンパク質、
からなる群より選択される、前記使用。 - 方法を、ATP、dATP、ADP、AMP、ATP以外のNTP、dNTPまたはピロホスフェートを補助基質として用いて実施することを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
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