ES2739248T3

ES2739248T3 - Producción de alquenos mediante conversión enzimática combinada de ácidos 3-hidroxialcanoicos

Info

Publication number: ES2739248T3
Application number: ES11784957T
Authority: ES
Inventors: Philippe Marlière; Marc Delcourt; Maria Anissimova; Richard Tallon
Original assignee: Global Bioenergies SA; Scientist of Fortune SA
Current assignee: Global Bioenergies SA; Scientist of Fortune SA
Priority date: 2010-10-19
Filing date: 2011-10-18
Publication date: 2020-01-29
Anticipated expiration: 2031-10-18
Also published as: CN103261410A; KR20140023250A; SG189185A1; IL225549A; BR112013009078A2; JP2014501495A; WO2012052427A1; US20130316425A1; RU2013122680A; US20160032326A1; RU2609656C2; CN103261410B; CO6731070A2; MX2013004431A; MY156446A; MX353884B; PE20140009A1; EP2630236B1; IL225549A0; EP2630236A1

Abstract

Un procedimiento de produción de alqueno, caracterizado porque comprende la conversión de un 3- hidroxialcanoato en dicho alqueno por (i) una primera enzima que tiene una actividad de conversión del 3-hidroxialcanoato en el correspondiente 3- fosfonoxialcanoato; y (ii) una segunda enzima que es diferente de la primera enzima y que tiene una actividad de conversión de dicho 3- fosfonoxialcanoato en dicho alqueno mediante descarboxilación y desfosforilación.

Description

DESCRIPCIÓN

Producción de alquenos mediante conversión enzimática combinada de ácidos 3-hidroxialcanoicos

La presente invención se refiere a un procedimiento para generar alquenos a través de un proceso biológico. Más específicamente, la invención se refiere a un procedimiento para producir alquenos (por ejemplo, propileno, etileno, 1-butileno, isobutileno o isoamileno) a partir de moléculas del tipo 3-hidroxialcanoato.

Un gran número de compuestos químicos actualmente se derivan de compuestos petroquímicos. Alquenos (tales como etileno, propileno, los diferentes butenos, o si no los pentenos, por ejemplo) se usan en la industria del plástico, por ejemplo, para producir polipropileno o polietileno, y en otras áreas de la industria química y de combustibles. El etileno, el alqueno más simple, se encuentra en el centro de la industria orgánica industrial: es el compuesto orgánico más producido en el mundo. Se usa en particular para producir polietileno, un plástico importante. El etileno también se puede convertir en muchos productos industrialmente útiles mediante la reacción (de oxidación, de halogenación). El propileno tiene un papel igualmente importante: su polimerización da como resultado un material plástico, polipropileno. Las propiedades técnicas de este producto en términos de resistencia, densidad, solidez, deformabilidad, y transparencia son desiguales. La producción mundial de polipropileno ha crecido continuamente desde su invención en 1954.

El butileno existe en cuatro formas, una de las cuales, isobutileno, entra dentro de la composición de metil-terc-butiléter (MTBE), un aditivo antidetonante para combustible de automóvil. El isobutileno también se puede usar para producir isoocteno, el cual a su vez se puede reducir a isooctano (2,2,4-trimetilpentano); el índice muy alto de octano del isooctano lo hace el mejor combustible para los denominados motores de "gasolina".

El amileno, hexeno y hepteno existen en muchas formas según la posición y la configuración del doble enlace. Estos productos tienen aplicaciones industriales reales pero son menos importantes que el etileno, propileno o butenos. Todos estos alquenos actualmente se producen mediante el craqueo catalítico de los productos de petróleo (o mediante un derivado del proceso Fisher-Tropsch en el caso de hexeno, a partir de carbón o gas). Por tanto, su coste está de manera natural indexado al precio del petróleo. Además, el craqueo catalítico a veces está asociado con dificultades técnicas considerables que - incrementan la complejidad del procedimiento y los costes de producción.

Independientemente de las anteriores consideraciones, la bioproducción de plásticos (bioplásticos) es un campo próspero. Este auge está conducido por intereses económicos ligados al precio del petróleo, y mediante consideraciones ambientales que son tanto globales (productos neutros en carbono) como locales (manejo de los desperdicios).

La familia principal de bioplásticos es la de los polihidroxialcanoatos (PHA). Estos son polímeros obtenidos mediante la condensación de moléculas que comprenden tanto un grupo ácido como un grupo alcohol. La condensación tiene lugar mediante esterificación del ácido sobre el alcohol del siguiente monómero. Este enlace éster no es estable como el enlace carbono-carbono directo presente en los polímeros de los plásticos convencionales, lo cual explica porqué los PHA tienen una biodegradabilidad de una pocas semanas a unos pocos meses. La familia de PHA incluye en particular poli-3-hidroxibutirato (PHB), un polímero de 3-hidroxibutirato, y polihidroxibutirato-valerato (PHBV), un polímero alternativo de 3-hidroxibutirato y 3-hidroxivalerato.

PHB se produce de manera natural por algunas cepas de bacterias como Alcaligenes eutrophus y Bacillus megaterium. Se han construido bacterias de laboratorio, como E. coli, que han integrado rutas sintéticas que conducen a PHB o a los PHA en general. El compuesto o su polímero puede, en ciertas condiciones de laboratorio, representar hasta 80 % de la masa bacteriana (Wong MS y col., Biotech. Bioeng.99 (2008), 919-928). En la década de 1980 se intentó la producción a escala industrial de p Hb , pero los costes de producción del compuesto mediante fermentación se consideraron demasiados alto en el momento. Los proyectos que implican la producción directa de estos compuestos en plantas genéticamente modificadas (que han integrado las enzimas claves de la ruta sintética de PHB presente en las bacterias productoras) están en progreso y podrían implicar costes de funcionamiento inferiores.

La producción biológica de alcanos u otras moléculas de hidrocarburo que se pueden usar como combustibles o como precursores de resinas sintéticas es requerida en el contexto de una operación industrial sostenible en armonía con los ciclos geoquímicos. La primera generación de biocombustibles consistió en la producción fermentativa de etanol, ya que los procedimientos de fermentación y destilación ya existían en la industria alimentaria. La producción de biocombustibles de segunda generación está en una fase exploratoria, que abarca en particular la producción de alcoholes de larga cadena (butanol y pentanol), terpenos, alcanos lineales y ácidos grasos. Dos revisiones recientes proporcionan una visión general de la investigación en este campo: Ladygina N y col., Process Biochemistry, 2006, 41:1.001; y Wackett LP, Current Opinions in Chemical Biology, 2008, 21:187.

En la familia química de alqueno, el isopreno (2-metil-1,3-butadieno) es el motivo de terpeno que, a través de la polimerización, conduce a caucho. Se podrían desarrollar otros terpenos, mediante rutas químicas, biológicas o mixtas, como productos utilizables tales como biocombustibles o para fabricar plásticos. La referencia reciente muestra que la ruta de mevalonato (un intermediario clave en la biosíntesis de esteroide en muchos organismos) se podría usar para producir eficazmente productos de la familia del terpeno en las producciones industriales (Withers ST y col., Appl. Environ. Microbiol., 2007, 73:6.277).

La producción de alquenos, en particular alquenos terminales, [etileno mono- o disustituido en la posición 2: H²C=C(R1)(R2)] aparentemente ha sido menos ampliamente investigada. La conversión de isovalerato a isobutileno mediante la levadura Rhodotorula minuta ha sido descrita (Fujii T. y col., Appl. Environ. Microbiol., 1988, 54:583), pero la eficacia de esta reacción, caracterizada por un valor muy bajo del poder catalítico (kcat es 1x10-5 sec-1), es más del que permite una aplicación industrial. El mecanismo de reacción fue elucidado por Fukuda H y col. (BBRC, 1994, 201(2):516) e implica una enzima citocromo P450 que descarboxila el isovalerato mediante reducción de un grupo de oxoferrilo Fev=O. En ningún momento la reacción implica hidroxilación de isovalerato. El isovalerato es también un intermediario en el catabolismo de la leucina. La biosíntesis a gran escala de isobutileno mediante esta ruta parece altamente desfavorable, puesto que requeriría la síntesis y la degradación de una molécula de leucina para formar una molécula de isobutileno. Asimismo, la enzima que cataliza la reacción usa hemo como cofactor, prestándose escasamente a expresión recombinante en bacterias y a mejora de los parámetros enzimáticos. Por todas estas razones, parece muy poco probable que esta ruta de la técnica anterior pueda servir como una base para la explotación industrial. Se ha descrito que otros microorganismos son marginalmente capaces de producir de manera natural isobutileno a partir de isovalerato; los rendimientos obtenidos son incluso inferiores a los obtenidos con Rhodotorula minuta (Fukuda H. y col, Agrie. Biol. Chem., 1984, 48:1.679).

Los mismos estudios también han descrito la producción natural de propileno: muchos microorganismos son capaces de producir propileno, una vez de nuevo con un rendimiento extremadamente bajo. La producción de etileno por plantas se ha conocido durante mucho (Meigh y col, 1960, Nature, 186:902). Según la ruta metabólica elucidada, la metionina es el precursor de etileno (Adams and Yang, PNAS, 1979, 76:170). También se ha descrito la conversión de 2-oxoglutarato (Ladygina N y col., Process Biochemistry2006, 41:1.001). Puesto que la producción de una molécula de dos carbonos de etileno consume un precursor de molécula de cuatro o cinco carbonos, estas rutas parecen materialmente y energéticamente desfavorables para su aplicación industrial.

Por lo tanto, hay una necesidad de procedimientos eficaces para producir alquenos tales como etileno, propileno, 1-butileno, isobutileno, 1-amileno o isoamileno.

El documento WO2010/001078 describe un procedimiento para producir alquenos mediante conversión enzimática de ácidos 3-hidroxialcanoicos con una enzima que tiene la actividad de una descarboxilasa. Tal procedimiento es ventajoso debido a que ayuda a evitar el uso de productos de petróleo, baja los costes de producción de plásticos y combustibles y puede tener un impacto ambiental global considerable permitiendo que el carbono se almacene en forma sólida. Aunque el procedimiento descrito en el documento WO 2010/001078 permite producir alquenos convirtiendo enzimáticamente 3-hidroxialcanoatos, todavía existe una necesidad de mejoras, en particular, en relación a la eficacia del procedimiento para hacerlo adecuado para fines industriales. La presente solicitud aborda esta necesidad.

La presente invención describe un procedimiento para producir compuestos alqueno a partir de un 3-hidroxialcanoato a través de un proceso biológico, en particular un procedimiento enzimático, en el cual dos tipos de enzimas se combinan para incrementar la eficacia de la tasa de producción. Más específicamente, la presente invención se refiere a un procedimiento para producir un alqueno, caracterizado porque comprende la conversión de un 3-hidroxialcanoato en dicho alqueno por

(i) una primera enzima que tiene una actividad de conversión del 3-hidroxialcanoato en el correspondiente 3-fosfonoxialcanoato; y

(ii) una segunda enzima que es diferente de la primera enzima y que tiene una actividad de conversión de dicho 3-fosfonoxialcanoato en dicho alqueno mediante descarboxilación y desfosforilación.

La presente invención también se refiere al uso de al menos dos enzimas, en las que una enzima se selecciona de (i) como se ha especificado anteriormente y la otra enzima se selecciona de (ii) como se ha especificado anteriormente o de un microorganismo que produce dicha combinación de enzimas, para producir un compuesto alqueno a partir de 3-hidroxialcanoato.

La presente invención también se refiere a organismos, preferentemente microorganismos, los cuales producen de manera recombinante al menos dos enzimas, en las que una enzima se selecciona de (i) como se ha especificado anteriormente y la otra enzima se selecciona de (ii) como se ha especificado anteriormente.

Más específicamente, la presente invención se refiere a las realizaciones como se caracterizan en las reivindicaciones. Por lo tanto, se refiere a los siguientes artículos:

1. Un procedimiento para producir alqueno, caracterizado porque comprende la conversión de un 3-hidroxialcanoato en dicho alqueno por

2. El procedimiento del artículo 1 en el que

(i) la primera enzima que tiene una actividad de conversión del 3-hidroxialcanoato en el correspondiente 3-fosfonoxialcanoato se selecciona del grupo que consiste en

(A) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 1 o una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 15 % idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 y que muestra una actividad de conversión del 3-hidroxialcanoato en el correspondiente 3-fosfonoxialcanoato que es al menos tan alta como la correspondiente actividad de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1;

(B) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 2 o una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 15 % idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 y que muestra una actividad de conversión del 3-hidroxialcanoato en el correspondiente 3-fosfonoxialcanoato que es al menos tan alta como la correspondiente actividad de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2;

(C) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 3 o una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 15 % idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3 y que muestra una actividad de conversión del 3-hidroxialcanoato en el correspondiente 3-fosfonoxialcanoato que es al menos tan alta como la correspondiente actividad de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3; y

(D) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 4 o una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 15 % idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4 y que muestra una actividad de conversión del 3-hidroxialcanoato en el correspondiente 3-fosfonoxialcanoato que es al menos tan alta como la correspondiente actividad de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4.

3. El procedimiento del artículo 1 o 2, en el que

(ii) la segunda enzima que tiene una actividad de conversión de dicho 3-fosfonoxialcanoato en dicho alqueno seleccionada del grupo que consiste en

(a) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 5 o una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 15 % idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5 y que muestra una actividad de conversión de dicho 3-fosfonoxialcanoato en dicho alqueno que es al menos tan alta como la correspondiente actividad de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5;

(b) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 6 o una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 15 % idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 6 y que muestra una actividad de conversión de dicho 3-fosfonoxialcanoato en dicho alqueno que es al menos tan alta como la correspondiente actividad de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 6;

(c) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 7 o una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 15 % idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 7 y que muestra una actividad de conversión de dicho 3-fosfonoxialcanoato en dicho alqueno que es al menos tan alta como la correspondiente actividad de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 7;

(d) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 8 o una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 15 % idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 8 y que muestra una actividad de conversión de dicho 3-fosfonoxialcanoato en dicho alqueno que es al menos tan alta como la correspondiente actividad de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 8;

(e) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 9 o una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 15 % idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 9 y que muestra una actividad de conversión de dicho 3-fosfonoxialcanoato en dicho alqueno que es al menos tan alta como la correspondiente actividad de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 9

(f) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 10 o una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 15 % idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 10 y que muestra una actividad de conversión de dicho 3-fosfonoxialcanoato en dicho alqueno que es al menos tan alta como la correspondiente actividad de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 10;

(g) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 11 o una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 15 % idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 11 y que muestra una actividad de conversión de dicho 3-fosfonoxialcanoato en dicho alqueno que es al menos tan alta como la correspondiente actividad de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 11;

(h) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 12 o una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 15 % idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 12 y que muestra una actividad de conversión de dicho 3fosfonoxialcanoato en dicho alqueno que es al menos tan alta como la correspondiente actividad de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 12;

(i) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 13 o una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 15 % idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 13 y que muestra una actividad de conversión de dicho 3-fosfonoxialcanoato en dicho alqueno que es al menos tan alta como la correspondiente actividad de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 13;

(j) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 14 o una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 15 % idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 14 y que muestra una actividad de conversión de dicho 3-fosfonoxialcanoato en dicho alqueno que es al menos tan alta como la correspondiente actividad de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 14; y

(k) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 15 o una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 15 % idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 15 y que muestra una actividad de conversión de dicho 3-fosfonoxialcanoato en dicho alqueno que es al menos tan alta como la correspondiente actividad de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 15.

4. El procedimiento de uno cualquiera de los artículos 1 a 3, que comprende la etapa de conversión de 3-hidroxiproprionato en etileno.

5. El procedimiento de uno cualquiera de los artículos 1 a 3, que comprende la etapa de conversión de 3-hidroxibutirato en propileno.

6. El procedimiento de uno cualquiera de los artículos 1 a 3, que comprende la etapa de conversión de 3-hidroxivalerato en 1 -butileno.

7. El procedimiento de uno cualquiera de los artículos 1 a 3, que comprende la etapa de conversión de 3-hidroxi-3-metilbutirato en isobutileno.

8. El procedimiento de uno cualquiera de los artículos 1 a 3, que comprende la etapa de conversión de 3-hidroxi-3-metilvalerato en isoamileno.

9. El procedimiento de uno cualquiera de los anteriores artículos, caracterizado porque la etapa de conversión se lleva a cabo in vitro, en un sistema exento de células.

10. El procedimiento de uno cualquiera de los artículos 1 a 8 caracterizado porque el procedimiento se lleva a cabo en presencia de un microorganismo que produce de manera recombinante ambas de dichas enzimas como se definen en (i) y (ii) del artículo 1.

11. El procedimiento de uno cualquiera de los artículos 1 a 8, caracterizado por el uso de una planta, célula animal, célula vegetal o microorganismo que produce de manera recombinante ambas de dichas enzimas como se han definido en (i) y (ii) del artículo 1.

12. El procedimiento según uno cualquiera de los artículos anteriores, que comprende una etapa de recolección de alquenos gaseosos que salen de la reacción por desgasificación.

13. Una planta, célula animal, célula vegetal o un microorganismo que produce de manera recombinante al menos dos enzimas, en las que una enzima se selecciona de (i) y la otra enzima se selecciona de (ii), en las que (i) y (ii) son como sigue:

(ii) una segunda enzima que es diferente de la primera enzima y que tiene una actividad de conversión de dicho 3-fosfonoxialcanoato en dicho alqueno.

14. Una composición que comprende el microorganismo del artículo 13, un medio de cultivo adecuado y un compuesto 3-hidroxialcanoato o una fuente de carbono que se puede convertir por el microorganismo a un compuesto 3-hidroxialcanoato.

15. Uso de una combinación de al menos dos enzimas, en las que una enzima se selecciona del siguiente (i) y la otra enzima se selecciona del siguiente (ii) o de un microorganismo del artículo 13 o de una composición del artículo 14, para producir compuestos alqueno a partir de 3-hidroxialcanoatos,

en las que (i) y (ii) son como sigue:

16. El uso del artículo 14, en el que

17. El uso del artículo 15 o 16, en el que

(e) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 9 o una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 15 % idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 9 y que muestra una actividad de conversión de dicho 3-fosfonoxialcanoato en dicho alqueno que es al menos tan alta como la correspondiente actividad de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 9;

(h) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 12 o una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 15 % idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 12 y que muestra una actividad de conversión de dicho 3-fosfonoxialcanoato en dicho alqueno que es al menos tan alta como la correspondiente actividad de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 12;

18. Un procedimiento para producir un alqueno que comprende la etapa de convertir enzimáticamente un 3-fosfonoxialcanoato en el correspondiente alqueno mediante el uso de una enzima que puede catalizar la conversión por descarboxilación y desfosforilación, en el que dicho 3-fosfonoxialcanoato se ha producido por una enzima diferente.

19. El procedimiento de uno cualquiera de los artículos 1 a 12 o el procedimiento del artículo 18, caracterizado porque el procedimiento se lleva a cabo con ATP, dATP, ADP, AMP, un NTP distinto a ATP, un dNTP o pirofosfato como cosustrato.

"3-hidroxialcanoato", como se usa en el presente documento, indica una molécula que responde a la siguiente fórmula general:

Cⁿ⁺¹H²ⁿ⁺²O³

, con 1<n<7, y que comprende 3-hidroxipropionato como un motivo común (Figura 1), y opcionalmente una o dos sustituciones sobre el carbono 3. Dichos restos alquilo o grupos pueden ser lineales o ramificados. Como se usa en el presente documento, Los términos "alcoilo" y "alquilo" tienen el mismo significado y son intercambiables. Asimismo, los términos "resto" y "grupo" tienen el mismo significado y son intercambiables. Los grupos metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo son ejemplos de dichos grupos alquilo. El carbono 3 llega a ser un centro quiral si las dos sustituciones de alquilo son diferentes. La presente definición abarca las dos formas quirales, incluso si una de las dos formas, por ejemplo la forma R, es la forma principal producida de manera natural. Ejemplos de 3-hidroxialcanoatos se presentan en la Figura 3. Opcionalmente, se pueden añadir sustituyentes de alquilo sobre el carbono 2, los cuales luego pueden llegar a ser quirales (si los dos sustituyentes son diferentes). De igual manera, las configuraciones de los sustratos 3-hidroxialcanoato en la presente abarcan todos los estereoisómeros. En una realización preferida, los 3-hidroxialcanoatos corresponden o bien a 3-hidroxipropionato o a variantes o derivados de 3-hidroxipropionato en los que uno de los dos o los dos átomos de hidrógeno portados sobre el carbono 3 se sustituyen por un motivo compuesto únicamente de átomos de carbono e hidrógeno, oscilando el número de átomos de carbono de dichos sustituyentes de 1 a 5, preferentemente de 1 a 3, tales como metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo o isobutilo. El sufijo "oato", como se usa en el presente documento, puede indicar intercambiablemente o bien el ion carboxilato (COO-) o ácido carboxílico (COOH). No se usa para indicar un éster. En una realización particular, los 3-hidroxialcanoatos se representan mediante la siguiente fórmula: HO-CO-CH²-C(R¹)(R²)-OH u O ^'-CO-CH²-C(R¹)(R²)-OH.

El término "3-fosfonoxialcanoato" indica una molécula que responde a la siguiente fórmula general:

Cⁿ⁺¹H²ⁿ⁺³O⁶P

, con 1<n<7, y que comprende 3-fosfonoxipropionato como un motivo común, y opcionalmente una o dos sustituciones alquilo sobre el carbono 3.

El término "alqueno", como se usa en el presente documento, indica moléculas compuestas únicamente de carbono e hidrógeno, que contienen un enlace doble carbono-carbono y que tienen la fórmula química de un hidrocarburo monoinsaturado, CnH²n, en la que n es igual a al menos dos. Preferentemente, n es igual a al menos 3, 4, 5 o 6. Lo más preferentemente n es como mucho 6. Por lo tanto, generalmente, el término "alqueno" se refiere a una molécula que responde a la fórmula CnH²n, con 1<n<7,

En una realización preferida los alquenos están representados mediante la fórmula estructura1H²C=C(R1)(R2) en la que R1 y R2 se seleccionan, independientemente, del grupo que consiste en un átomo de hidrógeno y un radical alquilo lineal o ramificado, de manera que el número total de átomos de carbono en la molécula de alqueno es como mucho 6.

Ejemplos preferidos de compuestos de alqueno según la invención son en particular etileno, propileno, isobutileno, el isoamileno (Figura 4), o si no 1 -butileno y 1-amileno.

"Fuente de carbono", como se usa en el presente documento, indica cualquier compuesto de carbono que se puede usar como sustrato para los organismos según la invención. Dicho término incluye glucosa u cualquier otra hexosa, xilosa o cualquier otra pentosa, polioles tales como glicerol, sorbitol o manitol, o si no polímeros tales como almidón, celulosa o hemicelulosa, o si no poli-3-hidroxialcanoatos como poli-3-hidroxibutirato. Puede ser cualquier sustrato que permite el crecimiento de los microorganismos, tales como formato, por ejemplo. También puede ser CO²en el caso en el que los organismos son capaces de llevar a cabo fotosíntesis.

"Recombinante", como se usa en el presente documento, indica la modificación genética artificial de un organismo, o bien mediante adición, eliminación, o modificación de un gen cromosómico o extracromosómico o motivo regulador tal como promotor, o mediante la fusión de organismos, o mediante la adición de un vector de cualquier tipo, por ejemplo, plasmídico. El término "expresión recombinante" indica la producción de una proteína que implica una modificación genética, preferentemente para producir una proteína de origen exógeno o heterólogo con respecto a su hospedador, es decir, que no se da de manera natural en el hospedador de producción, o para producir una proteína endógena modificada o mutada.

"Sobreexpresión" o "que sobrexpresa", como se usa en el presente documento, indica la expresión recombinante de una proteína en un organismo hospedador, preferentemente que se origina de un organismo diferente de aquel en el que se expresa, incrementada en al menos 10 % y preferentemente 20 %, 50 %, 100 %, 500 % y posiblemente más en comparación con la expresión natural de dicha proteína que se da en dicho organismo hospedador. Esta definición también abarca el caso en el que no hay expresión natural de dicha proteína.

Un "cosustrato" es un compuesto o molécula añadida a la reacción enzimática, para mejorar ciertos parámetros de los mismos, y sobre todo su actividad, siendo dicho producto y el sustrato principal consumidos en cantidades iguales. Por tanto, el cosustrato se debe añadir a la reacción a una concentración comparable a la del sustrato principal. Dependiendo de la enzima, la presencia de un cosustrato puede ser requerida para la reacción enzimática.

Un "cofactor" es un producto añadido a la reacción enzimática, para mejorar ciertos parámetros de la misma, y sobre todo para mejorar su actividad, no siendo dicho producto consumido durante la reacción, y por tanto necesitando solamente ser añadido a una baja concentración, proporcional a la cantidad de enzima, por tanto, siendo dicha concentración referida como "catalítica".

Una "parte" de una secuencia de aminoácidos indica un fragmento que comprende al menos 10, preferentemente al menos 20, 30, 40 o 50 restos de aminoácidos consecutivos de dicha secuencia.

"Homología", como se usa en el presente documento, indica la existencia de una similitud entre dos secuencias medida mediante la identidad en porcentaje entre dichas dos secuencias. En una realización preferida el término "homología" significa identidad de secuencia.

Los compuestos químicos con frecuencia se conocen por varios nombres, oficial o común. En el presente documento, se prefieren los nombres comunes de las moléculas. Por lo tanto:

- "etileno" se usa para indicar eteno

- "propileno" se usa para indicar propeno

- "butileno" se usa para indicar buteno

- "isobutileno" se usa para indicar 2-metilpropeno o isobuteno

- "amileno" se usa para indicar penteno

- "isoamileno" se usa para indicar 2-metil-but-1-eno o isopenteno

- "propionato" se usa para indicar ácido propanoico o el ion propanoato

- "butirato" se usa para indicar ácido butanoico o el ion butanoato

- "valerato" se usa para indicar ácido pentanoico o el ion pentanoato.

(ii) una segunda enzima que es diferente de la primera enzima y que tiene una actividad de conversión de dicho 3-fosfonoxialcanoato en dicho alqueno -mediante descarboxilación y desfosforilación.

Como se ha mencionado anteriormente, el documento WO 2010/001078 describe un procedimiento para producir alquenos mediante conversión enzimática de ácidos 3-hidroxialcanoicos con una enzima que tiene la actividad de una descarboxilasa. Se ha descrito en el documento WO 2010/001078 que generalmente la conversión de un 3-hidroxialcanoato en un alqueno mediante una enzima que tiene una actividad descarboxilasa, por ejemplo, una mevalonato difosfato (MDP) descarboxilasa (E.C. 4.1.1.33) tiene lugar mediante la conversión del 3-hidroxialcanoato en el correspondiente 3-fosfonoxialcanoato el cual a continuación se somete a descarboxilación para dar el correspondiente alqueno. La reacción genérica llevada a cabo por MDP descarboxilasa que usa varios 3-hidroxialcanoatos se representa en la Figura 2B.

Actualmente se ha encontrado que diferentes descarboxilasas, en particular mevalonato difosfato descarboxilasas, catalizan las dos etapas anteriormente mencionadas con diferentes eficacias, es decir, que algunas descarboxilasas catalizan la primera etapa con una mayor eficacia que otras descarboxilasas y que algunas descarboxilasas muestran una preferencia por la segunda etapa, es decir, la etapa de descarboxilación, y que, por tanto, la eficacia de la conversión del 3-hidroxialcanoato en el alqueno como se describe en el documento W o 2010/001078 se puede incrementar significativamente combinando las correspondientes enzimas. Por lo tanto, la presente invención, en particular, se refiere a un procedimiento para alcanzar una mayor eficacia en la producción enzimática de alquenos a partir de 3-hidroxialcanoatos, es decir, un procedimiento para mejorar la eficacia de tal producción enzimática.

El término "una enzima que tiene una actividad de conversión del 3-hidroxialcanoato en el correspondiente 3-fosfonoxialcanoato" significa una enzima que puede fosforilar un 3-hidroxialcanoato en el correspondiente 3-fosfonoxialcanoato. El grupo fosfato viene preferentemente de una molécula ATP.

Esta actividad se puede medir, por ejemplo, como se describe en los Ejemplos adjuntos, en particular el Ejemplo 5. Por lo tanto, una posibilidad es incubar la respectiva enzima con el 3-hidroxialcanoato y ATP y medir la producción de ADP (lo cual refleja la producción del correspondiente 3-fosfonoxialcanoato). Los ensayos para medir la producción de ADP son conocidos por el experto en la técnica. Uno de estos procedimientos es el ensayo de piruvato quinasa/lactato deshidrogenasa descrito en el Ejemplo 5. En este caso el ensayo mide la tasa de disminución de la absorbancia de NADH a 340 nm que es proporcional a la cantidad de ADP. En una realización preferida el término "una enzima que tiene una actividad de conversión del 3-hidroxialcanoato en el correspondiente 3-fosfonoxialcanoato" significa una enzima que puede convertir 3-hidroxiisovalerato y ATP en 3-fosfonoxialcanoato y ADP. Incluso más preferentemente tal enzima puede catalizar la reacción de conversión del 3-hidroxialcanoato en el correspondiente 3-fosfonoxialcanoato, preferentemente la reacción de conversión de 3-hidroxiisovalerato y ATP en 3-fosfonoxiisovalerato y ADP, con un Km de 10 mM o inferior, por ejemplo, con un Km de 5 mM o inferior, preferentemente de 1 mM o inferior e incluso más preferentemente de 0,1 mM o inferior. En una realización particularmente preferida dicha enzima puede catalizar la reacción de conversión del 3-hidroxialcanoato en el correspondiente 3-fosfonoxialcanoato, preferentemente la reacción de conversión de 3-hidroxiisovalerato y ATP en 3-fosfonoxiisovalerato y ADP, con un kcat de al menos 0,2 s-1, preferentemente con un kcat de al menos 0,5 s-1, particularmente preferido con un kcat de al menos 1,0 s-1, más preferido de al menos 2,0 s_1 e incluso más preferido con un kcat de al menos 5,0 -1. En una realización particularmente preferida la capacidad para convertir 3-hidroxiisovalerato y ATP en 3-fosfonoxiisovalerato y ADP se mide en un ensayo como se describe en el Ejemplo 5.

El término "una enzima que tiene una actividad de conversión de dicho 3-fosfonoxialcanoato en dicho alqueno" significa una enzima que puede catalizar una reacción mediante la cual hay una descarboxilación y desfosforilación del 3-fosfonoxialcanoato conduciendo de ese modo al correspondiente alqueno.

Esta actividad se puede medir, por ejemplo, como se describe en los Ejemplos adjuntos, en particular en el Ejemplo 8. Por lo tanto, una posibilidad es incubar la respectiva enzima con el correspondiente fosfonoxialcanoato bajo condiciones que en principio permiten la descarboxilación y la desfosforilación y detectar la producción del correspondiente alqueno, por ejemplo, mediante cromatografía de gases. En una realización preferida el término "una enzima que tiene una actividad de conversión de dicho 3-fosfonoxialcanoato en dicho alqueno" significa una enzima que puede convertir 3-fosfonoxiisovalerato en isobuteno, preferentemente bajo las condiciones descritas en el Ejemplo 8. Incluso más preferentemente tal enzima puede catalizar la reacción de conversión del 3-fosfonoxialcanoato en el correspondiente alqueno (por descarboxilación y desfosforilación) con un Km de 100 mM o inferior, por ejemplo, con un Km de 75 mM o inferior, o con un Km de 50 mM o inferior, preferentemente de 10 mM o inferior o 5 mM o inferior o 1 mM o inferior, e incluso más preferentemente de 0,1 mM o inferior. En una realización particularmente preferida tal enzima puede catalizar la reacción de conversión del 3-fosfonoxialcanoato en el correspondiente alqueno, preferentemente la reacción de conversión de 3-fosfonoxiisovalerato en isobuteno, con un kcat de al menos 10_6 s-1, preferentemente con un kcat de al menos 10'4 s-1, por ejemplo, con un kcat de al menos 10'3 s_1 o con un kcat de al menos 10'2 s-1, tal como con un kcat de al menos 10'1 s-1, por ejemplo, con un kcat de al menos 0,2 s-1, preferentemente con un kcat de al menos 0,5 s-1, particularmente preferido con un kcat de al menos 1,0 s-1, más preferido de al menos 2,0 s_1 e incluso más preferido con un kcat de al menos 5,0 -1. En una realización particularmente preferida la capacidad de convertir 3-fosfonoxiisovalerato en isobuteno se mide en un ensayo como se describe en el Ejemplo 8.

En una realización preferida una enzima mencionada en (i) y (ii), anterior, es una enzima que es considerada por NCBI o un motor equivalente por tener el dominio COG3407.

En una realización preferida del procedimiento según la invención la primera enzima (i) que tiene una actividad de conversión del 3-hidroxialcanoato en el correspondiente 3-fosfonoxialcanoato se selecciona del grupo que consiste en

La SEQ ID NO: 1 muestra la secuencia de aminoácidos de una enzima de Picrophilus torridus DSM 9790 (número de acceso GenBank AAT43941; número de acceso Swissprot/TrEMBL Q6KZB1).

La SEQ ID NO: 2 muestra la secuencia de aminoácidos de una enzima de Thermoplasma acidophilum (número de acceso GenBank CAC12426; número de acceso Swissprot/TrEMBL Q9HIN1).

La SEQ ID NO: 3 muestra la secuencia de aminoácidos de una enzima de Thermoplasma volcanium (número de acceso GenBank BAB59465; número de acceso Swissprot/TrEMBL Q97BY2).

La SEQ ID NO: 4 muestra la secuencia de aminoácidos de una enzima de Ferroplasma acidarmanus fer1 (número de acceso GenBank ZP_05571615).

En una realización preferida adicional del procedimiento según la invención la segunda enzima (ii) que tiene una actividad de conversión de dicho 3-fosfonoxialcanoato en dicho alqueno se selecciona del grupo que consiste en

La SEQ ID NO: 5 muestra la secuencia de aminoácidos de una enzima clonada a partir de Streptococcus gordonii. La SEQ ID NO: 6 muestra la secuencia de aminoácidos de una enzima de Streptococcus gordonii. str. Challis substr. CH1 (número de acceso GenBank AAT43941; número de acceso Swissprot/TrEMBL A8UU9). La SEQ ID NO: 7 muestra la secuencia de aminoácidos de una enzima de Streptococcus infantarius subsp infantarius ATCC BAA-102 (número de acceso GenBank EDT48420.1; número de acceso Swissprot/TrEMBL B1SCG0). La SEQ ID NO: 8 muestra la secuencia de aminoácidos de una enzima de Homo sapiens (número de acceso GenBank AAC50440.1; número de acceso Swissprot/TrEMBL P53602.1). La SEQ ID NO: 9 muestra la secuencia de aminoácidos de una enzima de Lactobacillus delbrueckii (número de acceso de GenBank CAl97800.1; número de acceso Swissprot/TrEMBL Q1GAB2). La SEQ ID NO: 10 muestra la secuencia de aminoácidos de una enzima de Streptococcus mitis (cepa B6) (número de acceso GenBank CBJ22986.1). La SEQ ID NO: 11 muestra la secuencia de aminoácidos de una enzima de Streptococcus gallolyticus UCN34 (número de acceso GenBank CBI13757.1). La SEQ ID NO: 12 muestra la secuencia de aminoácidos de una enzima de Streptococcus sanguinis SK36 (número de acceso GenBank ABN43791.1). La SEQ ID NO: 13 muestra la secuencia de aminoácidos de una enzima de Streptococcus sp. M143 (número de acceso GenBank EFA24040.1), La SEQ ID NO: 14 muestra la secuencia de aminoácidos de una enzima de Streptococcus suis 89/1591 (número de acceso GenBank EEF63672.1). La SEQ ID NO: 15 muestra la secuencia de aminoácidos de una enzima de Streptococcus salivarius SK126 (número de acceso GenBank EEK09252).

En una realización preferida del procedimiento según la invención la primera enzima (i) es como se ha definido en (A) anterior y la segunda enzima (ii) es como se ha definido en (a) o (b) anteriormente mencionados, incluso más preferentemente la segunda enzima es como se ha definido en (f), (g), (h), (i), (j) o (k) anteriormente mencionados. Como se ilustra en los ejemplos, la combinación de estas enzimas es particularmente eficaz en la producción de compuestos de alqueno según la presente invención.

En otra realización preferida del procedimiento según la invención la segunda enzima (ii) que tiene una actividad de conversión de dicho 3-fosfonoxialcanoato en dicho alqueno se selecciona de una cualquiera de las proteínas enumeradas en la siguiente Tabla o de una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 15 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de tal proteína y que muestra una actividad de conversión de dicho 3-fosfonoxialcanoato en dicho alqueno que es al menos tan alta como la correspondiente actividad de dicha proteína.

Tabla 1

continuación

Como se ha mencionado anteriormente, no solamente se pueden usar las proteínas que tienen las secuencias de aminoácidos específicamente mencionadas enumeradas en las respectivas SEQ ID NO o en la Tabla 1, sino también proteínas que son consideradas por NCBI o un motor equivalente por tener un dominio COG3407 y, más preferido, proteínas cuya secuencia de aminoácidos muestra una homología de al menos 15 % a la secuencia de aminoácidos específicamente mencionada y que tiene una actividad enzimática respectiva al menos tan alta como la actividad de una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos específicamente mencionada. Enzimas preferidas de manera ventajosa tienen al menos x % de homología, en las que x se selecciona del grupo que consiste en 20, 25, 20, 35, 40, 45, 50, 55 y 60. En una realización preferida adicional la enzima tiene al menos 65 % de homología de secuencia, preferentemente al menos 70 %, más preferentemente al menos un 75 %, incluso más preferentemente, al menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % de homología a una de las secuencias mostradas en las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 o a una de las secuencias mostradas en la Tabla 1. El porcentaje de homología de secuencia se puede determinar mediante diferentes procedimientos y por medio de programas informáticos conocidos por el experto en la técnica, tales como, por ejemplo, el método de CLUSTAL o BLAST y programa informático derivado, o usando un algoritmo de comparación de secuencia tal como el descrito por Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol., 1970, 48:443) o Smith and Waterman (J. Mol. Biol., 1981, 147:195).

Tales proteínas que muestran el grado indicado de homología pueden, por ejemplo, ser otras enzimas que se dan de manera natural o que se han preparado sintéticamente. Incluyen, en particular, enzimas que se pueden seleccionar por su capacidad de producir alquenos según la invención. Por lo tanto, un ensayo de selección que comprende poner en contacto la enzima purificada, o un microorganismo que produce la enzima, con el sustrato de la reacción y medir la producción del respectivo compuesto, es decir, el 3-fosfonoxialcanoato o el alqueno. Tales ensayos se describen en la sección experimental. Tales ensayos de selección también se pueden usar para detectar enzimas con una actividad enzimática optimizada para que el sustrato se convierta en el 3-fosfonoxialcanoato o el alqueno, es decir, que tiene una actividad optimizada con respecto a uno o más de 3-hidroxialcanoatos o 3-fosfonoxialcanoatos.

Tales procedimientos de selección generalmente son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, técnicas de ingeniería proteica tales como mutagénesis aleatoria, mutagénesis masiva, mutagénesis dirigida, redistribución de ADN, redistribución sintética, evolución in vivo, o síntesis completa de genes y selección posterior para la actividad enzimática deseada.

Por lo tanto, las enzimas usadas en la invención pueden ser naturales o sintéticas, y producidas por medios químicos, biológicos o genéticos. También se pueden modificar químicamente, por ejemplo, para mejorar su actividad, resistencia, especificidad, purificación, o para inmovilizarlas sobre un soporte.

Se ha encontrado que las enzimas que son capaces de catalizar las reacciones anteriormente descritas para convertir un 3-hidroxialcanoato en un alqueno por un 3-fosfono-hidroxialcanoato con frecuencia son enzimas que se pueden clasificar en la superfamilia filogenética de mevalonato difosfato (MDP) descarboxilasas (nomenclatura enzimática EC 4.1.1.33). MDP descarboxilasa es una enzima implicada en la biosíntesis del colesterol. Dicha enzima se ha aislado de una diversidad de organismos que incluyen animales, hongos, levaduras y algunas bacterias. También se puede expresar por algunas plantas (Lalitha y col., Phytochemistry 24 (11), (1985), 2.569-2.571). Se han clonado y secuenciado muchos genes que codifican esta enzima. Estas enzimas generalmente están compuestas de 300 a 400 aminoácidos y usan ATP como cosustrato, las cuales se convierten durante la reacción en ADP y fosfato inorgánico. El grupo fosfato se transfiere de la molécula de ATP al alcohol terciario de mevalonato difosfato, liberando ADP. El intermediario de reacción fosforilado sobre el grupo 3-hidroxilo, a continuación, se somete a eliminación del grupo fosfato, en el proceso fisiológico liberando isopentenil difosfato (Figura 2).

En consecuencia, en una realización preferida, la enzima definida en (i) o (ii) anterior, es una MDP descarboxilasa. En el contexto de la presente invención una MDP descarboxilasa se define como una enzima que puede al menos catalizar la conversión de 5-difosfo-3-fosfomevalonato en isopentenil-5-difosfato y CO²o que puede al menos catalizar la reacción de conversión de mevalonato difosfato y a Tp en 5-difosfo-3-fosfomevalonato y ADP. Preferentemente, tal enzima puede catalizar ambas reacciones.

En otra realización preferida la enzima definida en (i) anterior, es una enzima como se ha definido en (i) (B). La secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 2 representa una enzima identificada en Thermoplasma acidophilum. En GenBank esta enzima se clasifica como una mevalonato difosfato descarboxilasa. Sin embargo, se sabe a partir de Chen and Poulter (Biochemistry 49 (2010), 207-217) que en Th. acidophilum existe una ruta de mevalonato alternativa que implica la acción de una mevalonato-5-monofosfato descarboxilasa. Por lo tanto, es posible que la enzima representada por la SEQ ID NO: 2 realmente represente una mevalonato-5-monofosfato descarboxilasa. Lo mismo puede ser verdad para otras bacterias arqueas. Por lo tanto, en otra realización preferida la enzima definida en (i) o (ii) anterior, es una mevalonato-5-monofosfato descarboxilasa. Tal enzima es capaz de convertir mevalonato-5-monofosfato en isopentenilpirofosfato.

En realizaciones preferidas de la invención:

- 3-hidroxipropionato se convierte por 3-fosfonoxipropionato en etileno; o

- 3-hidroxibutirato se convierte por 3-fosfonoxibutirato en propileno; o

- 3-hidroxivalerato se convierte por 3-fosfonoxivalerato en 1 -butileno; o

- 3-hidroxi-3-mentilbutirato (o 3-hidroxiisovalerato) se convierte por 3-fosfonoxi-3-metilbutirato (3-fosfonoxiisovalerato) en isobutileno; o

- 3-hidroxi-3-metilvalerato se convierte por 3-fosfonoxi-3-metilvalerato en isoamileno.

El procedimiento según la invención se puede llevar a cabo in vitro, en presencia de enzimas aisladas (o sistemas enzimáticos que comprenden además uno o más cofactores). In vitro preferentemente significa en un sistema exento de célula.

En una realización, las enzimas empleadas en el procedimiento se usan en forma purificada para convertir 3-hidroxialcanoatos en alquenos. Sin embargo, tal procedimiento puede ser costoso, puesto que los costes de producción de enzima y sustrato y purificación son altos.

Por lo tanto, en otra realización preferida, las enzimas empleadas en el procedimiento están presentes en la reacción como un extracto no purificado, o si no en la forma de bacterias no sometidas a lisis, para economizar los costes de purificación de proteína. Sin embargo, los costes asociados con tal procedimiento aún pueden ser bastantes altos debido a los costes de producción y purificación de los sustratos.

En consecuencia, en una realización preferida, las enzimas, nativas o recombinantes, purificadas o no, se usan para convertir un 3-hidroxialcanoato en un alqueno. Para hacer esto, las enzimas se incuban en presencia del sustrato en condiciones fisicoquímicas que permiten que las enzimas estén activas, y se deja que la incubación proceda durante un periodo suficiente de tiempo. Al final de la incubación, se mide opcionalmente la presencia del alqueno usando cualquier sistema de detección conocido por el experto en la técnica tal como cromatografía de gases o ensayos colorimétricos para medir la formación del producto de alqueno, o del fosfato libre, o si no para medir la desaparición del sustrato 3-hidroxialcanoato o de ATP.

En una realización preferida, los cofactores se añaden para imitar mejor la reacción natural o para proporcionar complementación estérica o electrónica en la hendidura catalítica. Por ejemplo, si una de las enzimas usadas en el procedimiento según la invención es una enzima que usa de manera natural mevalonato difosfato (MDP) como sustrato, la estructura de los 3-hidroxialcanoatos deja un gran espacio en la hendidura catalítica vacía durante la unión de enzima-sustrato puesto que generalmente un 3-hidroxialcanoato corresponde a un fragmento de MDP. Rellenar este espacio con un cofactor para reemplazar la parte perdida del sustrato tiene el fin de imitar mucho más la molécula de MDP. Ya que el cofactor no se modifica durante la reacción, por tanto, se añadirá solamente en cantidades catalíticas. En el caso en el que el sustrato de la reacción sea 3-hidroxipropionato, el cofactor complementario será propil difosfato. En el caso en el que el sustrato sea 3-hidroxibutirato o 3-hidroxi-3-metilbutirato, el cofactor complementario será etil difosfato. En el caso en el que el sustrato sea 3-hidroxivalerato o 3-hidroxi-3-metilvalerato, el cofactor complementario será metil difosfato. Estas moléculas diferentes se muestran en la Figura 5. Por casualidad, puede ocurrir que el cofactor complementario de una reacción tenga un efecto positivo sobre la reacción de otro sustrato. Generalmente, el cofactor puede ser cualquier molécula que comprende un fosfoanhidruro, y por tanto que tiene la fórmula global general R-PO²H-O-PO³H², en la que R es en particular H, un grupo alquilo lineal, ramificado o cíclico, que tiene preferentemente de 1 a 10 o de 1 a 5 átomos de carbono, o cualquier otro grupo orgánico monovalente. Los motivos análogos que corresponden a metileno difosfonato monoesteres, que tienen la fórmula general R-O-PO²H-CH²-PO³H²en la que fosfianhidruro se reemplaza por un puente de metileno que tiene la ventaja de no ser hidrolizado, son también parte de la invención. De forma más general, los cofactores pueden ser monofosfato, o incluso exentos de fosfato, análogos de las moléculas previas, o si no cualquier otra molécula que puede mejorar el rendimiento de la reacción proporcionando complementación estérica o electrónica en el sitio catalítico enzimático. El cofactor se selecciona de manera ventajosa del grupo que consiste en ion de pirofosfato, metil difosfato, etil difosfato, o propil difosfato.

En una realización preferida, la conversión se da en presencia de un cosustrato, siendo dicho cosustrato preferentemente un compuesto que contiene un fosfoanhidruro, y siendo preferentemente ATP, un rNTP, un dNTP o una mezcla de varias de estas moléculas, un polifosfato, o pirofosfato. El cosustrato generalmente está presente en el hospedador. Sin embargo, en otra realización particular, se puede añadir un cosustrato a la reacción, seleccionado preferentemente del grupo que consiste en ATP, un rNTP, un dNTP, una mezcla de varios rNTP o dNTP, un polifosfato, y preferentemente pirofosfato, o un compuesto que contiene un fosfoanhidruro (representado por la fórmula general X-PO³H²de la Figura 2).

Aunque la etapa de descarboxilación, es decir, la reacción definida como (ii) anterior en el presente documento, no requiere consumo de ATP, se podría mostrar que la presencia de ATP en la reacción podría ser beneficiosa. Esto se ha demostrado en el Ejemplo 7, usando 3-fosfonoxiisovalerato como sustrato. Se asume que ATP podría tener un efecto sobre el plegamiento de la proteína mediante la unión de ATP al sitio de unión a ATP de la difosfomevalonato descarboxilasa. De hecho, esto se puede observar a ojo: la enzima purificada tiene una tendencia de precipitar, y la adición de ATP previene este efecto. Se considera que no solamente ATP sino también otros compuestos similares como dATP, a Dp , AMP u otros NTP o dNTP tienen este efecto. Por lo tanto, en una realización preferida, el procedimiento según la presente invención se lleva a cabo con ATP, dATP, ADP, AMP o un NTP; distinto de ATP o un dNTP como cosustrato.

En otra realización preferida el procedimiento según la invención se lleva a cabo en cultivo, en presencia de un organismo, preferentemente un microorganismo, que produce de manera recombinante las enzimas. Por lo tanto, en tal realización de la invención, se usa un organismo, preferentemente un microorganismo, que produce de manera recombinante las enzimas especificadas en (i) y (ii) anteriores. El (micro)organismo es recombinante en el sentido de que las enzimas especificadas en (i) y (ii) producidas por el hospedador son heterólogas en relación al hospedador de producción. Por lo tanto, el procedimiento se lleva a cabo directamente en el medio de cultivo, sin la necesidad de separar o purificar las enzimas. De una manera especialmente ventajosa, se usa un (micro)organismo que tiene la propiedad natural o artificial de producir endógenamente uno o más 3-hidroxialcanoatos, y también de expresar o sobreexpresar las enzimas especificadas en (i) y (ii) anteriores, naturales o modificados, para producir alquenos directamente a partir de una fuente de carbono presente en solución.

Por ejemplo, el procedimiento según la invención se puede llevar a cabo usando microorganismos que producen uno o más 3-hidroxialcanoatos [por ejemplo, Alcaligenes eutrophus o Bacillus megaterium,, o si no una cepa de E. coli genéticamente modificada para producir dicho(s) producto(s)] y que se han modificado por ingeniería genética de modo que sobreexpresan las enzimas como se han definido en (i) y (ii) anteriores, dichas enzimas que preferentemente se originan de un organismo diferente del microorganismo hospedador. La modificación genética puede consistir, por ejemplo, en integrar los correspondientes genes que codifican las enzimas en el cromosoma, expresando las enzimas a partir de un plásmido que contiene un promotor cadena arriba de la secuencia codificante de enzima, el promotor y la secuencia codificante que se originan preferentemente de diferentes organismos, o cualquier otro procedimiento conocido por el experto en la técnica. Como alternativa, otras bacterias o levaduras pueden tener ventajas específicas y pueden ser elegidas. Por ejemplo, se pueden usar una levadura tal como Saccharomyces cerevisiae, una bacteria extremófila tal como Thermus thermophilus o una bacteria anaerobia de la familia Clostridiae, microalgas, o bacterias fotosintéticas.

Los organismos usados en la invención pueden ser procariotas o eucariotas, preferentemente, son microorganismos tales como bacterias, levaduras, hongos o mohos, o células vegetales o células animales. En una realización particular, los microorganismos son bacterias, preferentemente del género Escherichia, Alcaligenes o Bacillus e incluso más preferentemente de las especies Escherichia coli, Alcaligenes eutrophus o Bacillus megaterium.

En otra realización preferida, los microorganismos son bacterias recombinantes del género Escherichia, preferentemente de la especie Escherichia coli, que se ha modificado para producir endógenamente uno o más 3-hidroxialcanoatos, y que los convierte en alquenos.

En una realización preferida adicional el microorganismo es un hongo, más preferentemente un hongo del género Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Aspergillus o Trichoderma e incluso más preferentemente de las especies Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Aspergillus niger o de la especie Trichoderma reesei. En una realización particularmente preferida el microorganismo es una levadura recombinante que produce 3-hidroxialcanoatos y que los convierte en alquenos debido a la expresión de las enzimas especificadas en (i) y (ii) anteriores.

En otra realización preferida, el procedimiento según la invención hace uso de un microorganismo fotosintético que expresa las enzimas como se han especificado en (i) y (ii) anteriores. Preferentemente, el microorganismo es una bacteria fotosintética, o un microalga. Incluso más preferentemente dicho microorganismo tiene la propiedad natural o artificial de producir endógenamente uno o más 3-hidroxialcanoatos. En este caso el microorganismo debería ser capaz de producir alquenos directamente del CO²presente en la solución.

También es concebible el uso en el procedimiento según la invención de un microorganismo que produce una enzima como se ha definido en (i) anterior y otro microorganismo que produce una enzima como se ha definido en (ii) anterior. Además, en una realización adicional al menos uno de los microorganismos es capaz de producir uno o más 3-hidroxialcanoatos o, en una realización alternativa, se usa un microorganismo adicional en el procedimiento que es capaz de producir uno o más 3-hidroxialcanoatos.

En otra realización preferida el procedimiento según la invención hace uso de un organismo multicelular que expresa las enzimas como se han definido en (i) y (ii) anteriores. Ejemplos de tales organismos son plantas o animales.

En una realización particular, el procedimiento implica cultivar microorganismos en condiciones de cultivo estándar (30-37 °C a 101325 Pa, en un fermentador permitiendo el crecimiento aeróbico de las bacterias) o condiciones no estándar (mayor temperatura para corresponder a las condiciones de cultivo de organismos termófilos, por ejemplo).

En una realización preferida adicional el procedimiento de la invención se lleva a cabo en condiciones microaerófilas. Esto significa que la cantidad de aire inyectado es limitante para minimizar las concentraciones de oxígeno residual en los efluentes gaseosos que contienen los hidrocarburos de alqueno.

En otra realización preferida el procedimiento según la invención comprende además la etapa de recolección de alquenos gaseosos que salen de la reacción por desgasificación, es decir, recuperación de los productos que se desgasifican, por ejemplo, del cultivo. Por lo tanto, en una realización preferida, el procedimiento se lleva a cabo en presencia de un sistema para recoger alqueno bajo forma gaseosa durante la reacción.

De hecho, alquenos cortos, y particularmente etileno, propileno e isómeros de buteno, adoptan el estado gaseoso a temperatura ambiente y presión atmosférica. Por tanto, el procedimiento según la invención no requiere de extracción del producto del medio de cultivo líquido, una etapa que siempre es muy costosa cuando se realiza a escala industrial. La evacuación y almacenamiento de los hidrocarburos gaseosos y su posible separación física posterior y conversión química se puede realizar según cualquier procedimiento conocido por un experto en la técnica.

También se desvela que el procedimiento también comprende detectar el alqueno (por ejemplo, propileno, etileno o isobutileno) que está presente en la fase gaseosa. La presencia del compuesto se puede producir en un ambiente de aire u otro gas, incluso en pequeñas cantidades, se puede detectar usando diversas técnicas y en particular usando sistemas de cromatografía de gases con detección de ionización de llama o infrarrojo, o acoplando con espectrometría de masa.

En una realización particular, se condensan los alquenos producidos mediante un procedimiento según la invención, a continuación, se reducen opcionalmente, usando técnicas conocidas por el experto en la técnica, para producir alquenos de cadena más larga, o alcanos de cadena más larga. Por ejemplo, el isobutileno se puede usar para sintetizar isooctano: los procedimientos catalíticos para llevar a cabo con éxito esta reacción ya se han descrito completamente.

En otra realización, el procedimiento según la invención se caracteriza porque la conversión de una fuente de carbono tal como glucosa, a 3-hidroxialcanoato, seguido de la conversión de dicho 3-hidroxialcanoato en el correspondiente alqueno. Las diferentes etapas de dicho procedimiento se perfilan en la Figura 6.

En una realización particular, el procedimiento se caracteriza por la conversión de polihidroxialcanoatos en 3-hidroxialcanoato usando una enzima o un procedimiento fisicoquímico adecuado, seguido de la conversión de dicho 3-hidroxialcanoato en dicho alqueno. Opcionalmente, el polihidroxialcanoato se ha producido por una microorganismo o una planta cuyas rutas metabólicas se han modificado para producir altos rendimientos de polihidroxialcanoato. En otra realización, el procedimiento según la invención comprende la producción de alquenos de CO²atmosférico o de CO²artificialmente añadido al medio de cultivo. En este caso el procedimiento se implementa en un organismo que es capaz de llevar a cabo fotosíntesis, tal como, por ejemplo, microalga.

La presente invención se refiere a un procedimiento para producir un alqueno que comprende la etapa de convertir enzimática un 3-fosfonoxialcanoato en el correspondiente alqueno mediante el uso de una enzima que puede catalizar la conversión por descarboxilación y desfosforilación, en el que dicho 3-fosfonoxialcanoato, en una primera etapa, se produce por una enzima diferente.

En relación a la enzima preferida a usar en tal procedimiento, se aplica lo mismo que se ha expuesto anteriormente en relación con (ii) del procedimiento según la invención como se ha descrito anteriormente en el presente documento.

Además, también con respecto a las otras realizaciones preferidas descritas anteriormente para el procedimiento según la invención, lo mismo se aplica al procedimiento para producir un alqueno de un 3-fosfonoxialcanoato.

Tal organismo es un organismo recombinante en el sentido de que está genéticamente modificado debido a la introducción de al menos una molécula de ácido nucleico que codifica al menos una de las enzimas anteriormente mencionadas. Preferentemente tal molécula de ácido nucleico es heteróloga con respecto al organismo lo que significa que no se da de manera natural en dicho organismo.

Por lo tanto, la presente invención también se refiere a organismo, preferentemente un microorganismo, que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima como se ha definido en (i) anterior y que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima como se ha definido en (ii) anterior. En una realización preferida al menos una de las moléculas de ácido nucleico es heteróloga al organismo lo que significa que no se da de manera natural en dicho organismo. El microorganismo es preferentemente una bacteria, una levadura o un hongo. En otra realización preferida el organismo es una planta o animal no humano. En relación a otras realizaciones preferidas, se aplica lo mismo que se ha expuesto anteriormente en relación con el procedimiento según la invención.

Además, la presente invención también se refiere a una composición que comprende un microorganismo según la presente invención, un medio de cultivo adecuado y un compuesto 3-hidroxialcanoato o una fuente de carbono que se puede convertir por el microorganismo a un compuesto 3-hidroxialcanoato.

La presente invención también se refiere al uso de una combinación de al menos dos enzimas, en el que una enzima se selecciona del siguiente (i) y la otra enzima se selecciona del siguiente (ii) o de un organismo, preferentemente un microorganismo, según la invención o de una composición según la invención, para producir compuestos alqueno a partir de 3-hidroxialcanoatos, en las que (i) y (ii) son como sigue:

En relación a las realizaciones preferidas de los diferentes componentes enumerados, se aplica lo mismo que se ha expuesto anteriormente en relación con el procedimiento según la invención.

Otros aspectos y ventajas de la invención se describirán en los siguientes ejemplos, los cuales se dan con fines de ilustración y no a modo de limitación.

Leyendas de las figuras

Figura 1: El motivo de 3-hidroxipropionato.

Figura 2: Reacción catalizada por mevalonato difosfato descarboxilasa.

Figura 3: Ejemplos de 3-hidroxialcanoatos.

Figura 4: Producción de alquenos a partir de 3-hidroxialcanoatos combinando dos etapas enzimáticas.

Figura 5: Cofactores que se pueden usar en la reacción con el fin de complementación estructural en el sitio catalítico de la mevalonato difosfato descarboxilasa.

Figura 6: Procedimiento integrado para producir un alqueno a partir de glucosa.

Figura 7: Selección de MDP descarboxilasas en un ensayo de complementación. La reacción catalizada por la enzima de P. torridus sola (0,1 mg) sin una segunda enzima, se toma como referencia.

Figura 8: Efecto combinado de las enzimas MDP descarboxilasa de P. torridus y S. gordonii para convertir 3-hidroxiisovalerato (HIV) en isobuteno (IBN). La producción de IBN se midió en función de la concentración de MDP descarboxilasa de S. gordonii añadida a una mezcla de reacción preincubada de HIV con 100 |jg de MDP descarboxilasa de P. torridus.

Figura 9: Selección de homólogos de enzima de MDP descarboxilasa de S. gordonii. El área del pico de isobuteno obtenido para la reacción con enzima de Th. acidophilum (0,1 mg) sola (no segunda enzima), se usó como referencia (relación=1).

Las MDP descarboxilasas del género Streptococcus son particularmente eficaces cuando se usan en combinación con una enzima del filo P. torridus.

Figura 10: Esquema del ensayo de cuantificación de ADP, seguimiento del consumo de NADH por la disminución de la absorbancia a 340 nm.

Figura 11: Gráfica de la velocidad en función de la concentración de sustrato para la reacción de fosfotransferasa catalizada por MDP descarboxilasa de P. torridus. Las tasas iniciales se calcularon a partir de las cinéticas durante los primeros 30 minutos de la reacción.

Figura 12: Producción de isobuteno a partir de 3-hidroxiisovalerato en los siguientes ensayos:

Sin enzima

En presencia de MDP descarboxilasa de S. mitis

En presencia de MDP descarboxilasa de Th. acidophilum

En presencia de enzimas de tanto Th. acidophilum como S. mitis.

Figura 13: Esquema para la síntesis química de 3-fosfonoxiisovalerato.

Figura 14: Análisis GC de los ensayos para la producción de isobuteno a partir de 3-fosfonoxiisovalerato en ausencia y presencia de ATP. Ensayos:

1. Sin enzima, ATP 0 mM

2. 2 mg/ml de enzima, ATP 0 mM

3. Sin enzima, ATP 10 mM

4. 2 mg/ml de enzima, ATP 10 mM

Los siguientes Ejemplos sirven para ilustrar la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1: Clonación, expresión y purificación de una genoteca de MDP descarboxilasa.

Una genoteca de 55 genes que codifican representativos de la familia de la difosfomevalonato descarboxilasa (MDP descarboxilasa) a través de organismos eucariotas, procariotas y arqueas se construyó y se ensayó para identificar los candidatos más activos para mejorar la producción de isobuteno (IBN).

Clonación, cultivos bacterianos y expresión de proteínas.

Los genes que codifican mevalonato difosfato (MDP) descarboxilasa EC 4.1.1.33 se clonaron en el vector pET 25b (Novagen) en el caso de genes eucariotas y en pET 22b (Novagen) en el caso de genes procariotas. Un tramo de codones de 6 histidina se insertaron después del codón de iniciación de metionina para proporcionar una etiqueta de afinidad para la purificación. Las células de E. coli BL21(DE3) competentes (Novagen) se transformaron con estos vectores según el procedimiento de choque térmico. Las células transformadas se cultivaron con agitación (160 rpm) sobre medio de autoinducción ZYM-5052 (Studier FW, Prot.Exp.Pur. 41, (2005), 207-234) durante 6 h a 37 °C y la expresión proteica se continuó a 28 °C durante la noche (aproximadamente 16 h). Las células se recogieron por centrifugación a 4 °C, 10.000 rpm durante 20 min y los sedimentos se congelaron a -80 °C.

Purificación y concentración de proteína.

Los sedimentos de 200 ml de las células de cultivo se descongelaron sobre hielo y se resuspendieron en 5 ml de Na²HPO⁴pH 8 que contenía NaCl 300 mM, MgCh 5 mM y DTT 1 mM. Se añadieron veinte microlitros de lisonasa (Novagen). Las células se incubaron 10 minutos a temperatura ambiente y, a continuación, se volvieron a hielo durante 20 minutos. La lisis celular se completó mediante sonicación durante 3 x 15 segundos. A continuación, los extractos bacterianos se clarificaron mediante centrifugación a 4 °C, 10.000 rpm durante 20 min. Los lisados bacterianos clarificados se cargaron en columna PROTINO-1000 Ni-TED (Macherey-Nagel) permitiendo la adsorción de proteínas 6-His etiquetadas. Las columnas se lavaron y las enzimas de interés se eluyeron con 4 ml de Na²HPO⁴50 mM pH 8 que contenía NaCl 300 mM, MgCh 5 mM, d Tt 1 mM, Imidazol 250 mM. A continuación, los eluidos se concentraron y se desalaron sobre la unidad de filtro de 10 kDa Amicon Ultra-4 (Millipore) y se resuspendieron en 0,25 ml de Tris-HCl 50 mM pH 7,4 que contenía DTT 0,5 mM y MgCh 5 mM. Las concentraciones de proteína se cuantificaron según el procedimiento Bradford. Por lo tanto, la pureza de las proteínas purificadas variaron de 40 % a 90 %.

Ejemplo 2: Selección de la genoteca de MDP descarboxilasa.

Las MDP descarboxilasas se evaluaron usando un ensayo de complementación. La MDP descarboxilasa de P. torridus se incubó junto con cada enzima ensayada de la genoteca.

El ensayo enzimático se llevó a cabo bajo las siguientes condiciones:

Tris HCl 50 mM pH 7,0

MgCl²10 mM

KCl 20 mM

ATP 40 mM

3-hidroxiisovalerato (HIV) 50 mM

El pH se ajustó a 7,0

100 |jg de la MDP descarboxilasa de P. torridus y 1 mg de la MDP descarboxilasa a ensayar se añadieron a 1 ml de la mezcla de reacción. Se usó una mezcla de reacción que contenía solamente 100 |jg de MDP descarboxilasa de P. torridus como referencia. A continuación, la mezcla se incubó sin agitación a 45 °C durante 90 h en un vial sellado (Interchim).

Un ml de la fase gaseosa se recogió y se inyectó en un cromatógrafo de gases HP5890 (HP) equipado con un detector FID y una columna CP SilicaPlot (Varian). Se usó isobuteno comercial como referencia.

Este procedimiento de selección condujo a la identificación de varias enzimas MDP descarboxilasa incrementando la tasa de producción de isobuteno. Como se muestra en la Figura 7, se observó una producción mayor de isobuteno para las siguientes MDP descarboxilasas.

Candidato 1:

Número de acceso GenBank: CAI97800

Número de acceso SwissProt/TrEMBL: Q1GAB2

Organismo: Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC 11842

Candidato 2:

Número de acceso GenBank: AAC50440.1

Número de acceso SwissProt/TrEMBL: P53602.1

Organismo: Homo sapiens

Candidato 3:

Número de acceso GenBank: ABV09606

Número de acceso SwissProt/TrEMBL: A8AUU9

Organismo: Streptococcus gordonii str. Challis substr. CH1

La mayor producción de isobuteno se observó con MDP descarboxilasa purificada de Streptococcus gordonii.

Esto indicó que las dos enzimas presentes en el ensayo (una de P. torridus y la otra de S. gordonii) estaban realizando complementariamente las dos etapas de reacción que producen IBN a partir de HIV: transferencia del grupo fosforilo terminal del ATP al oxigeno en C3 de 3-hidroxiisovalerato seguido de desfosforilación-descarboxilación combinada del 3-fosfonoxiisovalerato intermediario.

Ejemplo 3: Efecto de la concentración de enzima sobre el rendimiento de la producción de isobuteno.

El efecto de la concentración de la MDP descarboxilasa de Streptococcus gordonii se valoró bajo las siguientes condiciones:

Tris-HCl 50 mM pH 7,0

MgCl²10 mM

KCl 20 mM

ATP 40 mM

3-hidroxiisovalerato (HIV) 50 mM

El pH se ajustó a 7,0

100 jg de MDP descarboxilasa de P. torridus y una cantidad variante (de 0 a 1 mg) de la MDP descarboxilasa purificada de Streptococcus gordonii se añadieron a 1 ml de la mezcla de reacción. A continuación, la mezcla se incubó sin agitación a 45 °C durante 90 h en un vial sellado (Interchim).

Un ml de la fase espacio de cabeza se recogió y se inyectó en un cromatógrafo de gases HP5890 (HP) equipado con un detector FID y una columna CP SilicaPlot (Varian). Se usó isobuteno comercial como referencia.

Incrementar la concentración de la enzima de S. gordonii dio como resultado un incremento de la cantidad del isobuteno producido (Figura 8).

Ejemplo 4: Selección de una genoteca de homólogos de MDP descarboxilasa de Streptococcus gordonii.

Usando el programa en línea BLAST presentado por NCBI, las secuencias se investigaron frente a bases de datos de secuencia proteica no redundante para generar una lista de enzimas con alta similitud de secuencia (>40 % de identidad) a la enzima de Streptococcus gordonii. La lista resultante incluía 18 candidatos.

continuación

Las secuencias de las enzimas MDP descarboxilasa inferidas de los genomas de las anteriores especies así como del genoma de S. gordonii se generaron mediante concatenación de oligonucleótidos para fijar el uso de condón de E. coli. Un tramo de codones de 6 histidina se insertaron después del codón de iniciación de metionina para proporcionar una etiqueta de afinidad para la purificación. Por tanto, los genes sintetizados se clonaron en el vector de expresión pET25b (los vectores se construyeron por GENEART AG). Después de la transformación de la cepa de E. coli BL21(DE3), las proteínas se produjeron según el protocolo descrito en el Ejemplo 1. A continuación, las enzimas se ensayaron usando el procedimiento descrito en el Ejemplo 2, usando la m Dp descarboxilasa de Th. acidophilum en lugar de la enzima de P. torridus. Este procedimiento de selección condujo a la identificación de enzimas más eficaces para la producción de isobuteno que la enzima de S. gordonii (Figura 9), en particular MDP descarboxilasas de S. infantarius, S. gallolyticus, S. sp. M143, S. salivarius, S. suis, S. sanguinis y S. mitis.

Ejemplo 5: Caracterización de la actividad de fosfotransferasa.

La liberación de ADP que está asociada con la producción de IBN de HIV se cuantificó usando el ensayo acoplado de piruvato quinasa/lactato deshidrogenasa (Figura 10). Las MDP descarboxilasas de P. torridus, Th. acidophilum, S. infantarius, S. mitis se evaluaron para su capacidad para fosforilar HIV, liberando ADP.

La reacción enzimática estudiada se llevó a cabo bajo las siguientes condiciones a 40 °C:

Tris-HCl 50 mM pH 7,0

MgCl²10 mM

KCl 100 mM

ATP 5 mM

NADH 0,2 mM

Fosfoenolpiruvato 0,5 mM

3 U/ml de lactato deshidrogenasa

1,5 U/ml de piruvato quinasa

3-Hidroxiisovalerato (HIV) 0-50 mM

El pH se ajustó a 7,0

Cada ensayo se comenzó mediante la adición de la enzima particular (a una concentración de 0,05 a 1 mg/ml) y se hizo un seguimiento de la desaparición de NADH mediante el seguimiento de la absorbancia a 340 nm.

Los ensayos con MDP descarboxilasas del filo de P. torridus así como del género Streptococcus dio lugar a un incremento reproducible en la producción de ADP en presencia de HIV. La Figura 11 muestra un ejemplo de un gráfico Michaelis-Menten que corresponde a los datos recogidos para la enzima de P. torridus. Los parámetros cinéticos se muestran en la siguiente Tabla.

Las enzimas del filo de P. torridus mostraron mayores actividades de fosfotransferasa que las del género Streptococcus.

Ejemplo 6: Producción de isobuteno a partir de 3-hidroxiisovalerato combinando dos enzimas.

La reacción enzimática deseada se llevó a cabo bajo las siguientes condiciones:

Tris HCl 50 mM pH 7,5

MgCl²10 mM

KCl 20 mM

ATP 40 mM

HIV 50 mM

El pH se ajustó a 7,5

100 |jg de la MDP descarboxilasa de Th. acidophilum y 500 |jg de la MDP descarboxilasa de S. mitis se añadieron a 1 ml de la mezcla de reacción. Las reacciones control con solamente una de las dos enzimas se corrieron en paralelo. Los ensayos se incubaron sin agitación a 37 °C en un vial sellado (Interchim).

La producción de IBN se midió analizando alícuotas muestreadas durante un periodo de incubación de 142 horas. Un ml de la fase gaseosa se recogió y se inyectó en un cromatógrafo de gases HP5890 (HP) equipado con un detector FID y una columna CP SilicaPlot (Varian). Se usó isobuteno comercial como referencia.

Las cinéticas de producción de isobuteno se muestran en la Figura 12. La MDP descarboxilasa de Th. acidophilum catalizaron la producción de isobuteno de HIV. La adición de MDP descarboxilasa de S. mitis condujeron a un incremento 3 veces de la producción de isobuteno después de 142 h de incubación.

La MDP descarboxilasa de S. mitis sola produjo solamente pequeñas cantidades de isobuteno después de 6 días de incubación, indicando una baja actividad de fosfotransferasa.

Por lo tanto, la producción de isobuteno se puede incrementar combinando dos tipos de enzimas que realizan complementariamente las dos etapas de reacción.

Ejemplo 7: Efecto del ATP sobre la producción de isobuteno de 3-fosfonoxiisovalerato (PIV).

El compuesto 3-fosfonoxiisovalerato (PIV) se sintetizó químicamente a partir de 3-hidroxiisovalerato según el esquema representado en la Figura 13 por SYNTHEVAL (Francia).

Los ensayos de la producción de isobuteno se llevaron a cabo bajo las siguientes condiciones:

Tris-HCl 50 mM pH 7,5

MgCl²10 mM

KCl 20 mM

ATP 0 mM (ensayo N.°1 y N.°2)

ATP 10 mM (ensayo N.°3 y N.°4)

3-Fosfonoxiisovalerato 25 mM

El pH se ajustó a 7,5

La reacción se iniciación mediante la adición de 2 mg de MDP descarboxilasa purificada de S. mitis a 0,5 ml de la mezcla de reacción. Las reacciones control se corrieron en ausencia de enzima (ensayos N.°1 y N.°3).

La mezcla se incubó sin agitación a 37 °C durante 26 h en un vial sellado de 2 ml (Interchim).

Un ml de la fase gaseosa se recogió y se inyectó en un cromatógrafo de gases Varian 430-GC equipado con un detector FID y una columna CP SilicaPlot (Varian). Se usó isobuteno comercial como referencia.

La adición de ATP 10 mM a la mezcla de reacción incrementó 120 veces la producción de isobuteno a partir de 3-fosfonoxiisovalerato (PIV) (Figura 14).

Ejemplo 8: Parámetros cinéticos de la producción de isobuteno a partir de 3-fosfonoxiisovalerato (PIV). Los parámetros cinéticos de la producción de isobuteno se midieron bajo las siguientes condiciones:

Tris-HCl 50 mM pH 7,5

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento de produción de alqueno, caracterizado porque comprende la conversión de un 3-hidroxialcanoato en dicho alqueno por

2. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende la etapa de conversión de 3-hidroxiproprionato en etileno.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende la etapa de conversión de 3-hidroxibutirato en propileno.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende la etapa de conversión de 3-hidroxivalerato en 1 -butileno.

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende la etapa de conversión de 3-hidroxi-3-metilbutirato en isobutileno.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende la etapa de conversión de 3-hidroxi-3-metilvalerato en isoamileno.

9. El procedimiento de una cualquiera de las anteriores reivindicaciones, caracterizado porque la etapa de conversión se lleva a cabo in vitro, en un sistema exento de células.

10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 caracterizado porque el procedimiento se lleva a cabo en presencia de un microorganismo que produce de manera recombinante ambas de dichas enzimas como se han definido en (i) y (ii) de la reivindicación 1.

11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por el uso de una planta, célula animal, célula vegetal o microorganismo que produce de manera recombinante ambas de dichas enzimas como se han definido en (i) y (ii) de la reivindicación 1.

12. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende una etapa de recolección de alquenos gaseosos que salen de la reacción por desgasificación.

14. Una composición que comprende el microorganismo de la reivindicación 13, un medio de cultivo adecuado y un compuesto 3-hidroxialcanoato o una fuente de carbono que se puede convertir por el microorganismo a un compuesto 3-hidroxialcanoato.

15. Uso de una combinación de al menos dos enzimas, en las que una enzima se selecciona del siguiente (i) y la otra enzima se selecciona del siguiente (ii) o de un microorganismo de la reivindicación 13 o de una composición de la reivindicación 14, para producir compuestos alqueno a partir de 3-hidroxialcanoatos,

en el que (i) y (ii) son como sigue:

16. El uso de la reivindicación 14, en el que

17. El uso de la reivindicación 15 o 16, en el que

18. Un procedimiento de producción de un alqueno que comprende la etapa de convertir enzimáticamente un 3-fosfonoxialcanoato en el correspondiente alqueno mediante el uso de una enzima que puede catalizar la conversión por descarboxilación y desfosforilación, en el que dicho 3-fosfonoxialcanoato, en una primera etapa, se produce por una enzima diferente.

19. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o el procedimiento de la reivindicación 18, caracterizado porque el procedimiento se lleva a cabo con ATP, dATP, ADP, AMP, un NTP distinto a ATP, un dNTP o pirofosfato como cosustrato.