KR20140023250A - 3-히드록시알카노산의 조합된 효소적 전환에 의한 알켄의 제조 - Google Patents

3-히드록시알카노산의 조합된 효소적 전환에 의한 알켄의 제조 Download PDF

Info

Publication number
KR20140023250A
KR20140023250A KR1020137010140A KR20137010140A KR20140023250A KR 20140023250 A KR20140023250 A KR 20140023250A KR 1020137010140 A KR1020137010140 A KR 1020137010140A KR 20137010140 A KR20137010140 A KR 20137010140A KR 20140023250 A KR20140023250 A KR 20140023250A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
amino acid
acid sequence
protein
seq
sequence represented
Prior art date
Application number
KR1020137010140A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101883511B1 (ko
Inventor
필립 마를리에르
마르크 델쿠르
마리아 아니시모바
리처드 탈롱
Original Assignee
글로벌 바이오에너지스
사이언티스트 오브 포춘 에스.에이.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 글로벌 바이오에너지스, 사이언티스트 오브 포춘 에스.에이. filed Critical 글로벌 바이오에너지스
Publication of KR20140023250A publication Critical patent/KR20140023250A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101883511B1 publication Critical patent/KR101883511B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
    • C12P5/02—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons acyclic
    • C12P5/026—Unsaturated compounds, i.e. alkenes, alkynes or allenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
    • C12P5/02—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons acyclic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01033—Diphosphomevalonate decarboxylase (4.1.1.33), i.e. mevalonate-pyrophosphate decarboxylase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 생물학적 과정을 통해 알켄을 제조하는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 3-히드록시알카노에이트 타입의 분자로부터 알켄(예를 들어, 프로필렌, 에틸렌, 1-부틸렌, 이소부틸렌 또는 이소아밀렌)을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

3-히드록시알카노산의 조합된 효소적 전환에 의한 알켄의 제조{PRODUCTION OF ALKENES BY COMBINED ENZYMATIC CONVERSION OF 3-HYDROXYALKANOIC ACIDS}
본 발명은 생물학적 과정을 통해 알켄을 제조하는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 3-히드록시알카노에이트 타입의 분자로부터 알켄(예를 들어, 프로필렌, 에틸렌, 1-부틸렌, 이소부틸렌 또는 이소아밀렌)을 제조하는 방법에 관한 것이다.
수많은 화학 화합물이 현재 석유화학제품으로부터 유래되고 있다. 알켄(예컨대, 에틸렌, 프로필렌, 상이한 부텐, 또는 그 밖에 예를 들어 펜텐)은 플라스틱 산업, 예를 들어 폴리프로필렌 또는 폴리에틸렌의 제조, 및 화학 산업의 다른 분야 및 연료 분야에 사용된다.
가장 간단한 알켄인, 에틸렌은 산업적인 유기 화학의 핵심을 차지하며: 이는 세계적으로 가장 널리 제조되는 유기 화합물이다. 이는 특히 주요한 플라스틱인 폴리에틸렌을 제조하는데 사용된다. 에틸렌은 또한 반응(산화, 또는 할로겐화)에 의하여 다수의 산업적으로 유용한 생성물로 전환될 수 있다.
프로필렌은 유사한 중요한 역할을 하며: 이의 중합은 플라스틱 물질인 폴리프로필렌을 생성한다. 저항성, 밀도, 견고성, 성형성, 및 투명성 면에서 이러한 생성물의 기술적 특성은 필적할 만한 것이 없다. 폴리프로필렌의 전세계적인 생산은 1954년에 이의 발명 이래로 지속적으로 성장하여 왔다.
부틸렌은 4개의 형태로 존재하며, 이 중 하나인 이소부틸렌은 자동차 연료를 위한 녹킹-방지(anti-knock) 첨가제인 메틸-터트-부틸-에테르(MTBE)의 조성물에 들어간다. 이소부틸렌은 또한 이소옥텐을 제조하기 위하여 사용될 수 있으며, 이는 결국 이소옥탄(2,2,4-트리메틸펜탄)으로 환원될 수 있으며; 이소옥탄의 매우 높은 옥탄가는 소위 "가솔린" 엔진을 위한 최고의 연료를 만든다.
아밀렌, 헥센 및 헵텐은 이중 결합의 위치 및 배치에 따라 다수의 형태로 존재한다. 이들 생성물은 실질의 산업적인 적용을 가지나 에틸렌, 프로필렌 또는 부텐보다 덜 중요하다.
모든 이들 알켄은 현재 석유화학 제품의 촉매적 크래킹(또는 헥센의 경우에 석탄 또는 가스로부터의 피셔-트롭시 과정의 유도체)에 의해 제조된다. 따라서, 이들의 비용은 자연적으로 원유 가격에 의해 연동된다. 또한, 촉매적 크래킹은 종종 공정 복잡성 및 생산 비용이 증가하는 상당한 기술적 곤란성과 관련이 있다.
상기 고려 사항과 별개로, 플라스틱의 바이오생산(bioproduction)("바이오플라스틱")은 성장하고 있는 분야이다. 이러한 붐(boom)은 원유의 가격과 관련된 경제적 관심에 의한 것이며, 지구(탄소-중립 제품) 및 지역적인(폐기물 관리) 환경적 고려 모두에 의한 것이다.
바이오플라스틱의 주요 패밀리는 폴리히드록시알카노에이트(PHA)의 패밀리이다. 이들은 산기와 알코올기 모두를 포함하는 분자의 축합에 의해 얻어진 중합체이다. 축합은 뒤따르는 단량체의 알코올 상에서 산의 에스테르화를 통해 수행한다. 이러한 에스테르 결합은 통상의 플라스틱의 중합체 내에 존재하는 탄소-탄소 직접 결합만큼 안정하지 않으며, 이는 PHA가 수주 내지 수개월의 생분해도를 갖는 원인을 나타낸다.
PHA 패밀리는 특히 폴리-3-히드록시부티레이트(PHB), 3-히드록시부티레이트의 중합체, 및 폴리히드록시부티레이트-발레르에이트(PHBV), 3-히드록시부티레이트와 3-히드록시발레르에이트의 교대 중합체를 포함한다.
PHB는 알칼리게네스 유트로퍼스(Alcaligenes eutrophus) 및 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)과 같은 몇몇의 박테리아 균주에 의해 자연적으로 제조된다. 일반적으로 PHB 또는 PHA로 이어지는 통합된 합성 경로를 갖는, 이. 콜라이(E. coli)와 같은, 실험실 박테리아가 구축되어 왔다. 화합물 또는 이의 중합체는, 특정한 실험실 조건에서, 박테리아 질량의 최고 80%에 달할 수 있다(Wong MS et al., Biotech. Bioeng.99 (2008), 919-928). PHB의 산업적인-규모의 제조는 1980년대에 시도되었으나, 발효를 통해 화합물을 제조하는 비용이 그 당시에 너무 높은 것으로 여겨졌다. 유전자 변형된 식물(생산자 박테리아 내에 존재하는 PHB 합성 경로의 집적된 핵심 효소를 가짐) 내에서의 이들 화합물의 직접적인 제조를 수반하는 사업이 진행 중에 있으며 이는 더욱 낮은 운영 비용을 필요로 할 수 있다.
알칸, 또는 연료 또는 합성 수지의 전구체로서 사용될 수 있는 다른 탄화수소 분자의 생물학적 제조는 지구화학적 순환과 조화를 이루는 지속가능한 산업적인 운영의 맥락에서 요구된다. 발효 및 증류 과정이 이미 식품 가공 산업에 존재하였기 때문에, 바이오연료의 제1세대는 에탄올의 발효적인 제조에서 이루어졌다. 제2세대의 바이오연료의 제조는 예비적인 단계에 있으며, 이는 특히 장쇄의 알코올(부탄올 및 펜탄올), 테르펜, 선형 알칸 및 지방산의 제조를 포함한다. 2개의 최근의 리뷰는 이러한 분야의 조사의 일반적인 개관을 제공한다: Ladygina N et al., Process Biochemistry, 2006, 41:1001; 및 Wackett LP, Current Opinions in Chemical Biology, 2008, 21:187.
알켄의 화학적 패밀리 중에서, 이소프렌(2-메틸-1,3-부타디엔)은 테르펜 모티프이고, 이는 중합을 통해 고무가 된다. 다른 테르펜이 바이오연료와 같은 사용 가능한 제품으로서 또는 플라스틱을 제조하기 위하여 화학적, 생물학적 또는 혼합 경로에 의해 개발될 수 있다. 최근의 문헌은 메발로네이트 경로(다수의 생물(organism) 내에서의 스테로이드 생합성에 있어 핵심 중간체)가 산업적인 수율로 테르펜 패밀리 유래의 생성물을 효율적으로 제조하기 위하여 사용될 수 있다는 점을 보여준다(Withers ST et al., Appl. Environ. Microbiol., 2007, 73:6277).
알켄, 특히 말단 알켄, [2번 위치에 단일- 또는 이중-치환된 에틸렌: H2C=C(R1)(R2)]의 제조는 명백히 덜 광범위하게 조사되어 왔다. 효소 로도토룰라 미누타(Rhodotorula minuta)에 의한 이소발레르에이트의 이소부틸렌으로의 전환이 개시된 바 있으나(Fujii T. et al., Appl. Environ. Microbiol., 1988, 54:583), 전환수(turnover number)의 매우 낮은 값(k cat 은 1x10-5 sec -1임)을 특징으로 하는 이러한 반응의 효율이 산업적인 적용을 허용하기에 충분하지 않다. 상기 반응 메커니즘은 Fukuda H et al. (BBRC, 1994, 201(2):516)에 의해 밝혀졌으며 옥소페릴기 FeV=O의 환원에 의해 이소발레르에이트를 디카르복실화시키는 시토크롬 P450 효소를 수반한다. 상기 반응은 어디에서도 이소발레르에이트의 히드록실화를 수반하지 않는다. 또한 이소발레르에이트는 류신 이화 작용의 중간체이다. 하나의 분자의 이소부틸렌을 형성하기 위하여 하나의 분자의 류신의 합성 및 분해가 요구되기 때문에, 이러한 경로에 의한 이소부틸렌의 대규모의 생합성은 매우 불리할 것으로 생각된다. 또한, 상기 반응을 촉매하는 효소는, 그 자체로는 박테리아 내 재조합 발현 및 효소 파라미터의 향상을 돕기 어려운, 보조 인자로서의 헴(heme)을 사용한다. 모든 이들 이유로, 종래 기술의 이러한 경로가 산업적인 개척의 토대로서의 역할을 할 수 있는 것은 매우 불가능할 것으로 보인다. 이소발레르에이트로부터 이소부틸렌을 자연적으로 조금 제조할 수 있는 것으로서 다른 미생물이 개시된 바 있으며; 얻어진 수율은 로도토룰라 미누타를 사용하여 얻은 것보다 훨씬 더 낮다(Fukuda H. et al, Agric. Biol. Chem., 1984, 48:1679).
또한, 동일한 연구가 프로필렌의 자연적인 제조를 개시한 바 있으며: 많은 미생물들이, 다시 한 번 극히 낮은 수율로, 프로필렌을 제조할 수 있다. 식물에 의한 에틸렌의 제조는 오랫동안 알려져 왔다(Meigh et al, 1960, Nature, 186:902). 밝혀진 대사 경로에 따르면, 메티오닌은 에틸렌의 전구체이다(Adams and Yang, PNAS, 1979,　76:170). 2-옥소글루타레이트의 전환이 또한 개시된 바 있다(Ladygina N et al., Process Biochemistry 2006, 41:1001). 2개-탄소 분자의 에틸렌의 제조가 4개- 또는 5개-탄소 분자 전구체를 소비하기 때문에, 이들 경로는 이들의 산업적인 적용에 실질적으로 그리고 에너지적으로 불리한 것으로 보인다.
따라서, 에틸렌, 프로필렌, 1-부틸렌, 이소부틸렌, 1-아밀렌 또는 이소아밀렌과 같은 알켄을 제조하기 위한 효율적인 방법이 요구된다.
WO2010/001078은 디카르복실라제의 활성을 갖는 효소를 사용한 3-히드록시알카노산의 효소적 전환에 의한 알켄의 제조 방법을 개시한다. 이러한 방법은 석유화학 제품의 사용을 피하고, 플라스틱 및 연료의 제조 비용을 낮추는데 도움을 주며, 탄소가 고체 형태로 저장되도록 허용함으로써 상당한 지구의 환경적인 영향을 줄 수 있기 때문에 유리하다. 비록 상기 WO　2010/001078에 개시된 방법이 3-히드록시알카노에이트를 효소적으로 전환함으로써 알켄을 제조하는 것을 허용할지라도, 여전히 개선에 대한 요구, 특히 산업적인 목적에 적합하게 하기 위하여 과정의 효율에 관한 개선의 요구가 있다. 본 출원은 이러한 요구에 관한 것이다.
본 발명은 생물학적 과정, 특히 생산율(production rate)의 효율을 증가시키기 위하여 2 종류의 효소가 조합된, 효소적 과정을 통한 3-히드록시알카노에이트로부터 출발하는 알켄 화합물의 제조 방법을 개시한다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 하기 효소에 의한 3-히드록시알카노에이트의 알켄으로의 전환을 포함하는 것을 특징으로 하는 알켄의 제조 방법에 관한 것이다:
(i) 3-히드록시알카노에이트를 상응하는 3-포스포녹시알카노에이트로 전환하는 활성을 갖는 제1 효소; 및
(ii) 상기 제1 효소와 다르며, 상기 3-포스포녹시알카노에이트를 상기 알켄으로 전환하는 활성을 갖는 제2 효소.
또한, 본 발명은, 하나의 효소는 상기에 기술된 바와 같은 (i)로부터 선택되고 다른 효소는 상기에 기술된 바와 같은 (ii)로부터 선택되는 적어도 2종의 효소, 또는 상기 조합의 효소를 생산하는 미생물의 3-히드록시알카노에이트로부터 알켄 화합물을 제조하기 위한 사용에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, 하나의 효소는 상기에 기술된 바와 같은 (i)로부터 선택되고 다른 효소는 상기에 기술된 바와 같은 (ii)로부터 선택되는, 적어도 2종의 효소를 생산하는, 생물, 바람직하기로 미생물에 관한 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "3-히드록시알카노에이트"는 하기 화학식에 상응하는 분자를 나타내며:
Cn +1H2n +2O3
상기 식에서, 1<n<7이고, 일반적인 모티프로서 3-히드록시프로피오네이트(도 1)를 포함하며, 임의로 3번 탄소 상에 1개 또는 2개의 알킬 치환기를 포함한다. 상기 알킬 잔기 또는 기는 선형 또는 분지형일 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "알코일(alkoyl)" 및 "알킬"은 동일한 의미를 가지며 상호교환 가능하다. 마찬가지로, 용어 "잔기(residue)" 및 "기(group)"는 동일한 의미를 가지며 상호교환 가능하다. 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 이소부틸기는 상기 알킬기의 예이다. 3번 탄소는 2개의 알킬 치환기가 다른 경우에 키랄 중심이 된다. 본 정의는, 비록 2개의 형태 중 하나, 예를 들어 R 형태가 자연적으로 제조되는 주요 형태일지라도, 2개의 키랄 형태를 포함한다. 3-히드록시알카노에이트의 예는 도 3에 나타내었다. 임의로, 알킬 치환기가 2번 탄소 상에 추가될 수 있으며, 이때 이는 또한 키랄이 될 수 있다(2개의 치환기가 다른 경우). 동일하게, 본 발명의 3-히드록시알카노에이트 기질(substrate)의 배치는 모든 입체 이성질체를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 3-히드록시알카노에이트는, 3-히드록시프로피오네이트, 또는 3번 탄소 상에 지닌 2개, 또는 2개 중 1개의 수소 원자가 치환기의 탄소 원자 수가 1 내지 5개, 바람직하기로 1 내지 3개 범위인, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸 또는 이소부틸인, 단지 탄소 및 수소 원자로 구성된 모티프로 치환된, 3-히드록시프로피오네이트의 변형 또는 유도체 중 어느 하나에 상응한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은, 접미사 "오에이트(oate)"는 카르복실레이트 이온(COO-) 또는 카르복실산(COOH) 중 어느 하나로 상호 교환 가능하게 나타낼 수 있다. 이는 에스테르를 정의하기 위하여 사용되지 않는다. 특별한 구현예에서, 3-히드록시알카노에이트는 하기 화학식으로 나타낸다: HO-CO-CH2-C(R1)(R2)-OH 또는 O--CO-CH2-C(R1)(R2)-OH.
용어 "3-포스포녹시알카노에이트"는 하기 화학식에 상응하는 분자를 나타낸다:
Cn +1H 2n+3 O6P
상기 식에서, 1<n<7이며, 일반적인 모티프로서 3-포스포녹시프로피오네이트를 포함하고, 임의로 3번 탄소 상에 1개 또는 2개의 알킬 치환기를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, 용어 "알켄"은 1개의 탄소-탄소 이중 결합을 포함하고 단일 불포화된 탄화수소의 하기 화학식을 가지는 탄소 및 수소만으로 구성된 분자를 나타낸다: CnH2n, 상기 식에서, n은 적어도 2이다. 바람직하기로, n은 적어도 3, 4, 5 또는 6이다. 가장 바람직하기로 n은 최대 6이다. 따라서, 일반적으로, 용어 "알켄"은 하기 식에 상응하는 분자를 언급한다: CnH2n, 상기 식에서, 1<n<7이다.
바람직한 구현예에서, 알켄은 하기 화학식으로 나타낸다: H2C=C(R1)(R2), 상기 식에서, R1 및 R2는, 알켄 분자 내 탄소 원자의 전체 수가 최대 6이 되도록, 수소 원자 및 선형 또는 분지형 알킬 라디칼로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
본 발명에 따른 알켄 화합물의 바람직한 예는 특히 에틸렌, 프로필렌, 이소부틸렌, 및 이소아밀렌(도 4), 또는 그 밖에 1-부틸렌 및 1-아밀렌이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, "탄소원(carbon source)"은 본 발명에 따라 생물을 위한 기질로서 사용될 수 있는 임의의 탄소 화합물을 나타낸다. 상기 용어는 글루코스 또는 임의의 다른 헥소스, 자일로스 또는 임의의 다른 펜토스, 폴리올, 예컨대 글리세롤, 소르비톨 또는 만니톨, 또는 그 밖에 중합체, 예컨대 전분, 셀룰로스 또는 헤미셀룰로스, 또는 그 밖에 폴리-3-히드록시알카노에이트, 예컨대 폴리-3-히드록시부티레이트를 포함한다. 이는 예를 들어 포르메이트와 같은 미생물의 성장을 허용하는 임의의 기질일 수 있다. 또한, 이는 생물이 광합성을 수행할 수 있는 경우에 CO2일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, "재조합(recombinant)"은 염색체 또는 염색체-외의 유전자 또는 프로모터와 같은 조절 모티프의 첨가, 제거 또는 변형, 또는 생물의 융합, 또는 임의의 타입, 예를 들어 플라스미드 타입의 벡터의 첨가 중 어느 하나에 의한, 생물의 인공적인 유전자 변형을 나타낸다. 용어 "재조합 발현"은, 바람직하기로 숙주에 대한 외인성 또는 이종 기원의 단백질, 즉, 생산 숙주 내에서 자연적으로 발생하지 않는 단백질을 생산하거나, 변형된 또는 돌연변이된 내인성 단백질을 생산하기 위한, 유전자 변형을 수반하는 단백질의 제조를 나타낸다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, "과발현" 또는 "과발현하는"은, 적어도 10%, 바람직하기로 20%, 50%, 100%, 500%까지 증가하며, 아마도 숙주 생물 내에서 발생하는 단백질의 자연적인 발현 대비 그 이상으로 증가된, 바람직하기로 발현되는 것과 다른 생물로부터 기원하는, 숙주 생물 내에서의 단백질의 재조합 발현을 나타낸다. 이러한 정의는 또한 상기 단백질의 자연적인 발현이 없는 경우도 포함한다.
"보조-기질(co-substrate)"은 특정한 파라미터, 특히 활성을 향상시키기 위하여, 효소 반응에 첨가되는 화합물 또는 분자이며, 상기 제품 및 주기질(principal substrate)은 동일한 양으로 소비된다. 따라서, 보조-기질은 주기질의 농도와 상응하는 농도로 반응에 첨가되어야 한다. 효소에 따라, 보조-기질의 존재가 효소 반응을 위해 필요할 수 있다.
"보조인자(cofactor)"는 특정한 파라미터를 향상시키기 위하여, 특히 활성을 향상시키기 위하여, 효소 반응에 첨가되는 제품이며, 상기 제품은 반응 도중에 소비되지 않고, 따라서 효소의 양에 비례하여 단지 낮은 농도로 첨가되어야 하며, 이에 따라 상기 농도는 "촉매적"으로서 언급된다.
아미노산 서열의 "부분(part)"은 상기 서열의 적어도 10개, 바람직하기로 적어도 20, 30, 40 또는 50개의 연속되는 아미노산 잔기를 포함하는 단편(fragment)을 나타낸다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, "상동성(homology)"은 2개의 서열 간을 퍼센트 동일성으로 측정하였을 때 2개 서열 간에 유사점이 존재하는 것을 나타낸다. 바람직한 구현예에서, 용어 "상동성"은 서열 동일성을 의미한다.
화학적 화합물은 공식명 또는 일반명의 몇몇의 명칭으로 종종 알려져 있다. 본 명세서에서는, 분자의 일반명이 선호된다. 따라서:
- "에틸렌"은 에텐을 나타내기 위하여 사용되고,
- "프로필렌"은 프로펜을 나타내기 위하여 사용되며,
- "부틸렌"은 부텐을 나타내기 위하여 사용되고,
- "이소부틸렌"은 2-메틸프로펜 또는 이소부텐을 나타내기 위하여 사용되며,
- "아밀렌"은 펜텐을 나타내기 위하여 사용되고,
- "이소아밀렌"은 2-메틸-부트-1-엔 또는 이소펜텐을 나타내기 위하여 사용되며,
- "프로피오네이트"는 프로파노산 또는 프로파노에이트 이온을 나타내기 위하여 사용되고,
- "부티레이트"는 부타노산 또는 부타노에이트 이온을 나타내기 위하여 사용되며,
- "발레르에이트"는 펜타노산 또는 펜타노에이트 이온을 나타내기 위하여 사용된다.
본 발명은 생물학적 과정, 특히 생산율의 효율을 증가시키기 위하여 2 종류의 효소가 조합된, 효소적 과정을 통한 3-히드록시알카노에이트로부터 출발하는 알켄 화합물의 제조 방법을 개시한다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 하기 효소에 의한 3-히드록시알카노에이트의 알켄으로의 전환을 포함하는 것을 특징으로 하는 알켄의 제조 방법에 관한 것이다:
(i) 3-히드록시알카노에이트를 상응하는 3-포스포녹시알카노에이트로 전환하는 활성을 갖는 제1 효소; 및
(ii) 상기 제1 효소와 다르며, 상기 3-포스포녹시알카노에이트를 상기 알켄으로 전환하는 활성을 갖는 제2 효소.
상기에서 언급한 바와 같이, WO　2010/001078은 디카르복실라제의 활성을 갖는 효소를 사용한 3-히드록시알카노산의 효소적 전환에 의한 알켄의 제조 방법을 개시한다. WO　2010/001078에는 일반적으로 디카르복실라제 활성을 갖는 효소, 예를 들어 메발로네이트 디포스페이트(MDP) 디카르복실라제(E.C. 4.1.1.33)에 의한 3-히드록시알카노에이트의 알켄으로의 전환이, 이후에 상응하는 알켄에 이르도록 디카르복실화되는, 상응하는 3-포스포녹시알카노에이트로의 3-히드록시알카노에이트의 전환에 의해 일어난다는 점이 개시되어 있다. 다양한 3-히드록시알카노에이트를 사용한 MDP 디카르복실라제에 의해 수행되는 일반적인 반응이 도 2B에 도시되어 있다.
다른 디카르복실라제, 특히 메발로네이트 디포스페이트 디카르복실라제가 다른 효율로 2개의 상기 언급된 단계를 촉매한다는 점, 즉 몇몇의 디카르복실라제가 다른 디카르복실라제보다 더욱 높은 효율로 제1 단계를 촉매하고 몇몇의 디카르복실라제는 제2 단계, 즉 디카르복실화 단계에 대한 선호를 보이며, 이에 따라 WO　2010/001078에 개시된 바와 같은 3-히드록시알카노에이트의 알켄으로의 전환의 효율이 상응하는 효소를 조합함으로써 유의적으로 증가될 수 있다는 점이 이제 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 특히 3-히드록시알카노에이트로부터의 알켄의 효소적 제조에 있어 더욱 높은 효율을 달성하기 위한 방법, 즉 이러한 효소적 제조의 효율을 향상시키는 방법에 관한 것이다.
용어 "3-히드록시알카노에이트를 상응하는 3-포스포녹시알카노에이트로 전환하는 활성을 갖는 효소"는 3-히드록시알카노에이트를 상응하는 3-포스포녹시알카노에이트로 포스포릴화할 수 있는 효소를 의미한다. 포스페이트기는 바람직하기로 ATP 분자로부터 온다.
이러한 활성은, 예를 들어 첨부된 실시예, 특히 실시예 5에 기재된 바와 같이 측정될 수 있다. 따라서, 하나의 가능성은 각각의 효소를 3-히드록시알카노에이트 및 ATP와 함께 인큐베이션시킨 후 ADP의 생성(이는 상응하는 3-포스포녹시알카노에이트의 생성을 반영함)을 측정하는 것이다. ADP의 생성을 측정하기 위한 어세이(assay)는 당업자에게 공지되어 있다. 이들 방법 중 하나는 실시예 5에 기재된 피루베이트 키나제/락테이트 디하이드로게나제 어세이이다. 이러한 경우에, 상기 어세이는 ADP 양에 비례하는 340 nm에서의 NADH 흡광도 감소의 비율을 측정한다. 바람직한 구현예에서, 용어 "3-히드록시알카노에이트를 상응하는 3-포스포녹시알카노에이트로 전환하는 활성을 갖는 효소"는 3-히드록시이소발레르에이트 및 ATP를 3-포스포녹시이소발레르에이트 및 ADP로 전환할 수 있는 효소를 의미한다. 더욱 더 바람직하기로, 이러한 효소는, 10 mM 이하의 KM, 예를 들어, 5 mM 이하, 바람직하기로 1 mM 이하, 더욱 더 바람직하기로 0.1 mM 이하의 KM으로, 3-히드록시알카노에이트를 상응하는 3-포스포녹시알카노에이트로 전환하는 반응, 바람직하기로 3-히드록시이소발레르에이트 및 ATP를 3-포스포녹시이소발레르에이트 및 ADP로 전환하는 반응을 촉매할 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서, 이러한 효소는, 적어도 0.2 s-1의 kcat, 바람직하기로 적어도 0.5 s-1의 kcat, 특히 바람직하기로 적어도 1.0 s-1, 더욱 바람직하기로 적어도 2.0 s-1의 kcat, 더욱 더 바람직하기로 적어도 5.0 s-1의 kcat로, 3-히드록시알카노에이트를 상응하는 3-포스포녹시알카노에이트로 전환하는 반응, 바람직하기로 3-히드록시이소발레르에이트 및 ATP를 3-포스포녹시이소발레르에이트 및 ADP로 전환하는 반응을 촉매할 수 있다.
특히 바람직한 구현예에서, 3-히드록시이소발레르에이트 및 ATP를 3-포스포녹시이소발레르에이트 및 ADP로 전환하는 능력(capacity)은 실시예 5에 기재된 바와 같은 어세이에서 측정된다.
용어 "상기 3-포스포녹시알카노에이트를 알켄으로 전환하는 활성을 갖는 효소"는, 이에 의하여 상응하는 알켄을 초래하는, 3-포스포녹시알카노에이트의 디카르복실화 및 디포스포릴화가 있는 반응을 촉매할 수 있는 효소를 의미한다.
이러한 활성은, 예를 들어 첨부된 실시예, 특히 실시예 8에 기재된 바와 같이 측정될 수 있다. 따라서, 하나의 가능성은 각각의 효소를 원칙적으로 디카르복실화 및 디포스포릴화를 허용하는 조건 하에서 상응하는 포스포녹시알카노에이트와 함께 인큐베이션시킨 후 예를 들어 기체 크로마토그래피에 의해 상응하는 알켄의 생성을 검출하는 것이다. 바람직한 구현예에서, 용어 "상기 3-포스포녹시알카노에이트를 알켄으로 전환하는 활성을 갖는 효소"는, 바람직하기로 실시예 8에 기재된 조건 하에서, 3-포스포녹시이소발레르에이트를 이소부텐으로 전환할 수 있는 효소를 의미한다. 더욱 더 바람직하기로, 이러한 효소는, 100 mM 이하의 KM, 예를 들어, 75 mM 이하의 KM, 또는 50 mM 이하, 바람직하기로 10 mM 이하, 또는 5 mM 이하, 또는 1 mM 이하, 더욱 더 바람직하기로 0.1 mM 이하의 KM으로, 3-포스포녹시알카노에이트를 상응하는 알켄으로 전환하는 반응(디카르복실화 및 디포스포릴화에 의한)을 촉매할 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서, 이러한 효소는, 적어도 10-6 s-1의 kcat, 바람직하기로 적어도 10-4 s-1의 kcat, 예를 들어 적어도 10-3 s-1의 kcat 또는 적어도 10-2 s-1의 kcat, 예컨대 적어도 10-1 s-1의 kcat, 예를 들어 적어도 0.2 s-1의 kcat, 바람직하기로 적어도 0.5 s-1의 kcat, 특히 바람직하기로 적어도 1.0 s-1, 더욱 바람직하기로 적어도 2.0 s-1의 kcat, 더욱 더 바람직하기로 적어도 5.0 s-1의 kcat로, 3-포스포녹시알카노에이트를 상응하는 알켄으로 전환하는 반응, 바람직하기로 3-포스포녹시이소발레르에이트를 이소부텐으로 전환하는 반응을 촉매할 수 있다.
특히 바람직한 구현예에서, 3-포스포녹시이소발레르에이트를 이소부텐으로 전환하는 능력은 실시예 8에 기재된 바와 같은 어세이에서 측정된다.
하나의 바람직한 구현예에서, 상기에서, (i) 및 (ii)에 언급되는 효소는 COG3407 도메인을 갖는 것으로서 NCBI 또는 등가의 엔진(engine)에 의해 고려된 효소이다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 구현예에서, 3-히드록시알카노에이트를 상응하는 3-포스포녹시알카노에이트로 전환하는 활성을 갖는 제1 효소 (i)은 하기 (A) 내지 (D)로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(A) 서열번호 1로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 서열번호 1로 나타내어지는 아미노산 서열과 적어도 15% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 적어도 서열번호 1로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 상응하는 활성만큼 높은, 상기 3-히드록시알카노에이트를 상기 상응하는 3-포스포녹시알카노에이트로 전환하는 활성을 나타내는 단백질;
(B) 서열번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 서열번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열과 적어도 15% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 적어도 서열번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 상응하는 활성만큼 높은, 상기 3-히드록시알카노에이트를 상기 상응하는 3-포스포녹시알카노에이트로 전환하는 활성을 나타내는 단백질;
(C) 서열번호 3으로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 서열번호 3으로 나타내어지는 아미노산 서열과 적어도 15% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 적어도 서열번호 3으로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 상응하는 활성만큼 높은, 상기 3-히드록시알카노에이트를 상기 상응하는 3-포스포녹시알카노에이트로 전환하는 활성을 나타내는 단백질; 및
(D) 서열번호 4로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 서열번호 4로 나타내어지는 아미노산 서열과 적어도 15% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 적어도 서열번호 4로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 상응하는 활성만큼 높은, 상기 3-히드록시알카노에이트를 상기 상응하는 3-포스포녹시알카노에이트로 전환하는 활성을 나타내는 단백질.
서열번호 1은 피크로필러스 토리두스(Picrophilus torridus) DSM 9790 유래의 효소의 아미노산 서열(GenBank 수탁번호 AAT43941; Swissprot/TrEMBL 수탁번호 Q6KZB1)을 나타낸다.
서열번호 2는 써모플라즈마 아시도필리움(Thermoplasma acidophilum) 유래의 효소의 아미노산 서열(GenBank 수탁번호 CAC12426; Swissprot/TrEMBL 수탁번호 Q9HIN1)을 나타낸다.
서열번호 3은 써모플라즈마 볼카늄(Thermoplasma volcanium) 유래의 효소의 아미노산 서열(GenBank 수탁번호 BAB59465; Swissprot/TrEMBL 수탁번호 Q97BY2)을 나타낸다.
서열번호 4는 페로플라즈마 에시드아마누스(Ferroplasma acidarmanus) fer1 유래의 효소의 아미노산 서열(GenBank 수탁번호 ZP_05571615)을 나타낸다.
본 발명에 따른 방법의 더욱 바람직한 구현예에서, 상기 3-포스포녹시알카노에이트를 알켄으로 전환하는 활성을 갖는 제2 효소 (ii)는 하기 (a) 내지 (k)로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(a) 서열번호 5로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 서열번호 5로 나타내어지는 아미노산 서열과 적어도 15% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 적어도 서열번호 5로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 상응하는 활성만큼 높은, 상기 3-포스포녹시알카노에이트를 상기 알켄으로 전환하는 활성을 나타내는 단백질;
(b) 서열번호 6으로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 서열번호 6으로 나타내어지는 아미노산 서열과 적어도 15% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 적어도 서열번호 6으로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 상응하는 활성만큼 높은, 상기 3-포스포녹시알카노에이트를 상기 알켄으로 전환하는 활성을 나타내는 단백질;
(c) 서열번호 7로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 서열번호 7로 나타내어지는 아미노산 서열과 적어도 15% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 적어도 서열번호 7로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 상응하는 활성만큼 높은, 상기 3-포스포녹시알카노에이트를 상기 알켄으로 전환하는 활성을 나타내는 단백질;
(d) 서열번호 8로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 서열번호 8로 나타내어지는 아미노산 서열과 적어도 15% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 적어도 서열번호 8로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 상응하는 활성만큼 높은, 상기 3-포스포녹시알카노에이트를 상기 알켄으로 전환하는 활성을 나타내는 단백질;
(e) 서열번호 9로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 서열번호 9로 나타내어지는 아미노산 서열과 적어도 15% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 적어도 서열번호 9로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 상응하는 활성만큼 높은, 상기 3-포스포녹시알카노에이트를 상기 알켄으로 전환하는 활성을 나타내는 단백질;
(f) 서열번호 10으로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 서열번호 10으로 나타내어지는 아미노산 서열과 적어도 15% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 적어도 서열번호 10으로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 상응하는 활성만큼 높은, 상기 3-포스포녹시알카노에이트를 상기 알켄으로 전환하는 활성을 나타내는 단백질;
(g) 서열번호 11로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 서열번호 11로 나타내어지는 아미노산 서열과 적어도 15% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 적어도 서열번호 11로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 상응하는 활성만큼 높은, 상기 3-포스포녹시알카노에이트를 상기 알켄으로 전환하는 활성을 나타내는 단백질;
(h) 서열번호 12로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 서열번호 12로 나타내어지는 아미노산 서열과 적어도 15% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 적어도 서열번호 12로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 상응하는 활성만큼 높은, 상기 3-포스포녹시알카노에이트를 상기 알켄으로 전환하는 활성을 나타내는 단백질;
(i) 서열번호 13으로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 서열번호 13으로 나타내어지는 아미노산 서열과 적어도 15% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 적어도 서열번호 13으로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 상응하는 활성만큼 높은, 상기 3-포스포녹시알카노에이트를 상기 알켄으로 전환하는 활성을 나타내는 단백질;
(j) 서열번호 14로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 서열번호 14로 나타내어지는 아미노산 서열과 적어도 15% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 적어도 서열번호 14로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 상응하는 활성만큼 높은, 상기 3-포스포녹시알카노에이트를 상기 알켄으로 전환하는 활성을 나타내는 단백질; 및
(k) 서열번호 15로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 서열번호 15로 나타내어지는 아미노산 서열과 적어도 15% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 적어도 서열번호 15로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 상응하는 활성만큼 높은, 상기 3-포스포녹시알카노에이트를 상기 알켄으로 전환하는 활성을 나타내는 단백질.
서열번호 5는 스트렙토코커스 고도니(Streptococcus gordonii)로부터 클로닝된 효소의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호 6은 스트렙토코커스 고도니 균주 찰리스 아균주(Streptococcus gordonii str. Challis substr.) CH1 유래의 효소의 아미노산 서열(GenBank 수탁번호 AAT43941; Swissprot/TrEMBL 수탁번호 A8UU9)을 나타낸다. 서열번호 7은 스트렙토코커스 인판타리우스 아종 인판타리우스(Streptococcus infantarius subsp infantarius) ATCC BAA-102 유래의 효소의 아미노산 서열(GenBank 수탁번호 EDT48420.1; Swissprot/TrEMBL 수탁번호 B1SCG0)을 나타낸다. 서열번호 8은 호모 사피엔스(Homo sapiens) 유래의 효소의 아미노산 서열(GenBank 수탁번호 AAC50440.1; Swissprot/TrEMBL 수탁번호 P53602.1)을 나타낸다. 서열번호 9는 락토바실러스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii) 유래의 효소의 아미노산 서열(GenBank 수탁번호 CAI97800.1; Swissprot/TrEMBL 수탁번호r Q1GAB2)을 나타낸다. 서열번호 10은 스트렙토코커스 미티스(Streptococcus mitis)(균주 B6) 유래의 효소의 아미노산 서열(GenBank 수탁번호 CBJ22986.1)을 나타낸다. 서열번호 11은 스트렙토코커스 갈로라이티쿠스(Streptococcus gallolyticus) UCN34 유래의 효소의 아미노산 서열(GenBank 수탁번호 CBI13757.1)을 나타낸다. 서열번호 12는 스트렙토코커스 산구이니스(Streptococcus sanguinis) SK36 유래의 효소의 아미노산 서열(GenBank 수탁번호 ABN43791.1)을 나타낸다. 서열번호 13은 스트렙토코커스 종(Streptococcus sp.) M143 유래의 효소의 아미노산 서열(GenBank 수탁번호 EFA24040.1)을 나타낸다. 서열번호 14는 스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis) 89/1591 유래의 효소의 아미노산 서열(GenBank 수탁번호 EEF63672.1)을 나타낸다. 서열번호 15는 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) SK126 유래의 효소의 아미노산 서열(GenBank 수탁번호 EEK09252)을 나타낸다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 구현예에서, 제1 효소 (i)은 상기 (A)에 정의된 바와 같고 제2 효소 (ii)는 상기 언급된 (a) 또는 (b)에 정의된 바와 같으며, 더욱 더 바람직하기로 제2 효소는 상기 언급된 (f), (g), (h), (i), (j) 또는 (k)에 정의된 바와 같다. 실시예에서 설명되는 바와 같이, 이들 효소의 조합은 본 발명에 따른 알켄 화합물 제조시 특히 효과적이다.
본 발명에 따른 방법의 다른 바람직한 구현예에서, 상기 3-포스포녹시알카노에이트를 알켄으로 전환하는 활성을 갖는 제2 효소 (ii)는 하기 표 1에 기재된 단백질 중 어느 하나, 또는 이러한 단백질의 아미노산 서열과 적어도 15% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 적어도 상기 단백질의 상응하는 활성만큼 높은, 상기 3-포스포녹시알카노에이트를 알켄으로 전환하는 활성을 나타내는 단백질로부터 선택된다.
[표 1]
Figure pct00001
Figure pct00002

상기에서 언급한 바와 같이, 각각의 서열번호로 기재되거나 또는 표 1에 기재된 구체적으로 언급된 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라, COG3407 도메인을 갖는 것으로서 NCBI 또는 등가의 엔진에 의해 고려되는 단백질, 더욱 바람직하기로 상기 구체적으로 언급된 아미노산 서열과 적어도 15%의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하고 적어도 상기 구체적으로 언급된 아미노산 서열을 갖는 단백질의 활성만큼 높은 각각의 효소의 활성을 갖는 단백질이 사용될 수 있다. 바람직한 효소는 유리하게는 적어도 x% 상동성을 가지며, 여기에서 x는 20, 25, 20, 35, 40, 45, 50, 55 및 60으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더욱 바람직한 구현예에서, 효소는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15로 나타낸 서열 중 하나, 또는 표 1에 나타낸 서열 중 하나에 대해, 적어도 65% 서열 상동성, 바람직하기로 적어도 70%, 더욱 바람직하기로 적어도 75%, 더욱 더 바람직하기로 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 상동성을 갖는다. 서열 상동성의 퍼센트는 당업자에게 알려져 있는 다양한 방법 및 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 CLUSTAL 방법 또는 BLAST 및 파생된 소프트웨어에 의하여, 또는 Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol., 1970, 48:443) 또는 Smith and Waterman (J. Mol. Biol., 1981, 147:195)에 기재된 바와 같은 서열 비교 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.
지시된 정도의 상동성을 나타내는 이러한 단백질은 예를 들어 자연적으로 발생하거나 또는 합성적으로 제조되는 다른 효소일 수 있다. 이들은 특히 본 발명에 따라 알켄을 제조하는 능력을 위하여 선택될 수 있는 효소를 포함한다. 따라서, 선택 테스트는 정제된 효소, 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 반응의 기질과 접촉시키는 단계, 및 각각의 화합물, 즉 3-포스포녹시알카노에이트 또는 알켄의 생성을 측정하는 단계를 포함한다. 이러한 테스트는 실험 부분에 기재되어 있다. 또한, 이러한 선택 테스트는 3-포스포녹시알카노에이트 또는 알켄으로 전환시키기 위한 기질에 대한 최적의 효소의 활성을 갖는 효소, 즉 하나 이상의 3-히드록시알카노에이트 또는 3-포스포녹시알카노에이트에 대한 최적의 활성을 갖는 효소를 스크리닝하는데 사용될 수 있다.
이러한 스크리닝 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 랜덤 돌연변이 유발(random mutagenesis), 대규모 돌연변이 유발(massive mutagenesis), 위치-지정 돌연변이 유발(site-directed mutagenesis), DNA 서플링(shuffling), 합성적 서플링, 생체 내 진화(in vivo evolution), 또는 유전자의 완전한 합성 및 원하는 효소의 활성에 대한 이후의 스크리닝과 같은 단백질 공학 기술을 포함한다.
따라서 본 발명에서 사용되는 효소는 천연 또는 합성일 수 있으며, 화학적, 생물학적 또는 유전적인 수단에 의해 제조된다. 또한 이는 예를 들어 이의 활성, 내성, 특이성, 정제도를 향상시키기 위하여, 또는 지지체에 대해 이를 고정화하기 위하여 화학적으로 개질될 수 있다.
3-히드록시알카노에이트를 3-포스포-히드록시알카노에이트를 거쳐 알켄으로 전환하는 상기 기재된 반응을 촉매할 수 있는 효소는 종종 메발로네이트 디포스페이트 (MDP) 디카르복실라제의 계통 발생적 상위 패밀리(superfamily)(효소 명명법 EC 4.1.1.33)에 분류될 수 있는 효소인 것으로 확인되었다. MDP 디카르복실라제는 콜레스테롤 생합성에 수반되는 효소이다. 상기 효소는 동물, 진균, 효모 및 몇몇의 박테리아를 포함하는 다양한 생물로부터 분리되어 왔다. 또한, 이는 몇몇의 식물에 의해 발현될 수 있다(Lalitha et al., Phytochemistry 24 (11), (1985), 2569-2571). 이러한 효소를 인코딩하는 다수의 유전자가 클로닝되고 서열 분석되어 왔다. 이들 효소는 일반적으로 300 내지 400개의 아미노산으로 이루어지고 보조기질(co-substrate)로서, 반응 도중에 ADP 및 무기 인산염으로 전환되는, ATP를 사용한다. 포스페이트기가 ATP 분자로부터 메발로네이트 디포스페이트의 3차 알코올로 이동하여, ADP를 방출시킨다. 그 다음 3-히드록실기 상에서 포스포릴화된 상기 반응 중간체에서 포스페이트기의 제거가 일어나고, 생리학적인 경우에 이소펜테닐 디포스페이트를 방출시킨다(도 2).
따라서, 바람직한 구현예에서, 상기 (i) 또는 (ii)에 정의된 효소는 MDP 디카르복실라제이다. 본 발명의 맥락에서, MDP 디카르복실라제는 적어도 5-디포스포-3-포스포메발로네이트의 이소펜테닐-5-디포스페이트 및 CO2로의 전환을 촉매할 수 있거나, 또는 적어도 메발로네이트 디포스페이트 및 ATP를 5-디포스포-3-포스포메발로네이트 및 ADP로 전환하는 반응을 촉매할 수 있는 효소로서 정의된다. 바람직하기로, 이러한 효소는 둘 모두의 반응을 촉매할 수 있다.
다른 바람직한 구현예에서, 상기 (i)에 정의된 효소는 상기 (i) (B)에 정의된 바와 같은 효소이다. 서열번호 2에 나타낸 서열은 써모플라즈마 아시도필룸(Thermoplasma acidophilum)에서 확인된 효소를 나타낸다. Genbank에서, 이러한 효소는 메발로네이트 디포스페이트 디카르복실라제로서 분류된다. 그러나, 써모플라즈마 아시도필룸(Th. acidophilum)에 메발로네이트-5-모노포스페이트 디카르복실라제의 작용을 포함하는 대안적인 메발로네이트 경로가 존재한다는 점이 Chen and Poulter (Biochemistry 49 (2010), 207-217)에 알려져 있다. 따라서, 서열번호 2로 나타낸 효소가 실제로 메발로네이트-5-모노포스페이트 디카르복실라제를 나타낼 가능성이 있다.
마찬가지로 다른 원시 세균(archae bacteria)에도 해당될 수 있다. 그러므로, 다른 바람직한 구현예에서, 상기 (i) 또는 (ii)에 정의된 효소는 메발로네이트-5-모노포스페이트 디카르복실라제이다. 이러한 효소는 메발로네이트-5-모노포스페이트를 이소펜테닐피로포스페이트로 전환할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서:
- 3-히드록시프로피오네이트는 3-포스포녹시프로피오네이트를 거쳐 에틸렌으로 전환되거나; 또는
- 3-히드록시부티레이트는 3-포스포녹시부티레이트를 거쳐 프로필렌으로 전환되거나; 또는
- 3-히드록시발레르에이트는 3-포스포녹시발레르에이트를 거쳐 1-부틸렌으로 전환되거나; 또는
- 3-히드록시-3-메틸부티레이트(또는 3-히드록시이소발레르에이트)는 3-포스포녹시-3-메틸부티레이트(3-포스포녹시이소발레르에이트)를 거쳐 이소부틸렌으로 전환되거나; 또는
- 3-히드록시-3-메틸발레르에이트는 3-포스포녹시-3-메틸발레르에이트를 거쳐 이소아밀렌으로 전환된다.
본 발명에 따른 방법은 분리된 효소(또는 하나 이상의 보조인자를 추가적으로 포함하는 효소계(enzyme system))의 존재 하에, 시험관 내에서 수행될 수 있다. 시험관 내는 바람직하기로 세포가 없는(cell-free) 계를 의미한다.
일 구현예에서, 상기 방법에 사용되는 효소는 3-히드록시알카노에이트를 알켄으로 전환시키기 위하여 정제된 형태로 사용된다. 그러나, 이러한 방법은 효소 및 기질 제조 및 정제 비용이 높기 때문에 비쌀 수 있다.
따라서, 다른 바람직한 구현예에서, 상기 방법에 사용되는 효소는, 단백질 정제 비용을 절약하기 위하여, 비-정제된 추출물, 또는 그 밖에 비-용해된 박테리아의 형태로 반응 중에 존재한다. 그러나, 이러한 방법과 관련된 비용은 기질을 제조하고 정제하는 비용으로 인하여 여전히 상당히 높을 수 있다.
따라서, 하나의 바람직한 구현예에서, 천연 또는 재조합, 정제된 또는 비정제된 효소가 3-히드록시알카노에이트를 알켄으로 전환하기 위하여 사용된다. 이를 수행하기 위하여, 효소는 효소가 활성이도록 허용하는 물리화학적인 조건에서 기질의 존재 하에 인큐베이션되고, 상기 인큐베이션은 충분한 기간 동안 진행되도록 허용된다. 인큐베이션 마지막에, 알켄 생성물, 또는 유리 포스페이트의 형성을 측정하거나, 그 밖에 3-히드록시알카노에이트 기질 또는 ATP의 소멸을 측정하기 위한 기체 크로마토그래피 또는 비색계 테스트와 같은 당업자에게 알려져 있는 임의의 검출 시스템을 사용함으로써 알켄의 존재를 임의로 측정한다.
바람직한 구현예에서, 보조인자는 천연 반응(natural reaction)을 최대로 모방하거나, 또는 촉매 파편(cleft)에 입체적 또는 전자적 상보성을 제공하기 위하여 첨가된다. 예를 들어, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 효소 중 하나가 천연적으로 기질로서 메발로네이트 디포스페이트 (MDP)를 사용하는 효소인 경우, 일반적으로 3-히드록시알카노에이트가 MDP의 단편과 상응하기 때문에 3-히드록시알카노에이트의 구조는 효소-기질 바인딩 도중에 비어 있는 촉매 파편 내 거대한 공간을 남긴다. 기질의 결여된 부분을 대체하기 위하여 보조인자로 이러한 공간을 채우는 것은 MDP 분자를 가장 근접하게 모방하는 목적을 갖는다. 보조인자가 반응 도중에 변형되지 않기 때문에, 이에 따라 이는 단지 촉매량으로 첨가된다. 반응의 기질이 3-히드록시프로피오네이트인 경우에, 상보적 보조인자는 프로필 디포스페이트이다. 기질이 3-히드록시부티레이트 또는 3-히드록시-3-메틸부티레이트인 경우에, 상보적 보조인자는 에틸 디포스페이트이다. 기질이 3-히드록시발레르에이트 또는 3-히드록시-3-메틸발레르에이트인 경우에, 상보적 보조인자는 메틸 디포스페이트이다. 이들 다른 분자들은 도 5에 도시되어 있다. 혹, 반응의 상보적 보조인자가 또 다른 기질의 반응에 긍정적인 효과를 갖는 일이 발생할 수 있다. 일반적으로, 보조인자는 포스포안하이드라이드를 포함하는 임의의 분자일 수 있으며, 이에 따라 화학식 R-PO2H-O-PO3H2을 가지고, 상기 식에서, R은 특히 H, 바람직하기로 1 내지 10개 또는 1 내지 5개의 탄소 원자를 갖는, 선형, 분지형 또는 사이클릭 알킬기, 또는 임의의 다른 1가 유기기(organic group)이다. 또한, 포스피안하이드라이드(phosphyanhydride)가 가수분해되지 않는 장점을 갖는 메틸렌 다리 결합(bridge)으로 대체된, 화학식 R-O-PO2H-CH2-PO3H2를 갖는, 메틸렌 디포스페이트 모노에스테르에 상응하는 유사한 모티프가 본 발명의 일부가 된다. 더욱 일반적으로, 보조인자는 이전 분자들의 모노포스페이트, 또는 심지어 포스페이트가 결여된(phosphate-free) 유사체, 또는 그 밖에 효소 촉매 자리(site)에 입체적 또는 전자적 상보성을 제공함으로써 반응 수율을 향상시킬 수 있는 임의의 다른 분자일 수 있다. 보조인자는 유리하기로는 피로포스페이트 이온, 메틸 디포스페이트, 에틸 디포스페이트, 또는 프로필 디포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 구현예에서, 상기 전환은 보조-기질의 존재 하에 발생하고, 상기 보조-기질은 바람직하기로 포스포안하이드라이드를 함유하는 화합물, 바람직하기로 ATP, rNTP, dNTP 또는 이들 분자의 몇몇의 혼합물, 폴리포스페이트, 또는 피로포스페이트이다. 보조-기질은 일반적으로 숙주 내에 존재한다. 그러나, 다른 특별한 구현예에서, 보조-기질은 반응에 첨가될 수 있으며, 바람직하기로 ATP, rNTP, dNTP, 몇몇의 rNTP 또는 dNTP의 혼합물, 폴리포스페이트, 및 바람직하기로 피로포스페이트, 또는 포스포안하이드라이드를 함유하는 화합물(도 2의 화학식 X-PO3H2로 나타냄)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
비록 디카르복실화 단계, 즉 상기에서 (ii)로서 정의된 반응이 ATP 소비를 필요로 하지 않을지라도, 반응 중의 ATP의 존재가 이로울 수 있는 것으로 보여질 수 있었다. 이는 기질로서 3-포스포녹시이소발레르에이트를 사용하여, 실시예 7에서 입증되었다. ATP는 디포스포메발로네이트 디카르복실라제의 ATP-바인딩 자리에 대한 ATP의 바인딩에 의하여 단백질의 접힘(folding)에 영향을 줄 수 있는 것으로 추측된다. 사실상, 이는 눈으로 관찰될 수 있으며: 정제된 효소는 침전하는 경향을 가지고, ATP의 첨가는 이러한 효과를 방지한다. ATP뿐만 아니라 dATP, ADP, AMP와 같은 다른 유사한 화합물, 또는 다른 NTP 또는 dNTP도 이러한 효과를 갖는 것으로 여겨진다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 보조-기질로서 ATP, dATP, ADP, AMP, 또는 ATP 이외의 NTP 또는 dNTP를 사용하여 수행된다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 생물, 바람직하기로 상기 효소를 생산하는 미생물의 존재 하의 배양으로 수행된다. 따라서, 이러한 본 발명의 구현예에서, 상기 (i) 및 (ii)에 기술된 효소를 생산하는 생물, 바람직하기로 미생물이 사용된다. 바람직한 구현예에서, 상기 (미)생물은 숙주에 의해 생산되는 (i) 및 (ii)에 기술된 효소가 생산 숙주와 대비하여 이종 기원(heterologous)인 재조합형이다. 따라서, 상기 방법은 효소를 분리 또는 정제할 필요 없이 배양 배지 내에서 직접 수행될 수 있다. 특히 이로운 방식으로, 용액 중에 존재하는 탄소원으로부터 알켄을 직접 제조하기 위하여, 하나 이상의 3-히드록시알카노에이트를 내생적으로 생산하는 천연 또는 인공적인 특성을 가지며, 또한 천연 또는 변형된 상기 (i) 및 (ii)에 기술된 효소를 발현 또는 과발현시키는 (미)생물이 사용된다.
예를 들어, 본 발명에 따른 방법은, 하나 이상의 3-히드록시알카노에이트를 생산하고[예를 들어, 상기 생성물(들)을 생산하기 위하여 유전적으로 변형된, 알카리게네스 유트로퍼스(Alcaligenes eutrophus) 또는 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 또는 그 밖에 이. 콜라이(E. coli) 균주], 상기 (i) 및 (ii)에 정의된 바와 같은 효소를 과발현시키도록 유전적으로 조작되었으며, 이때 상기 효소는 바람직하기로 숙주 미생물과 다른 생물로부터 기원하는 미생물을 사용함으로써 수행될 수 있다. 유전자 변형은 예를 들어, 염색체 내로 상기 효소를 인코딩하는 상응하는 유전자를 통합시키는 것, 상기 효소-코딩(enzyme-coding) 서열의 상부 프로모터(promoter upstream)를 함유하는 플라스미드로부터 상기 효소를 발현시키는 것으로서, 이때 상기 프로모터 및 코딩 서열은 바람직하기로 다른 생물로부터 기원하는 것, 또는 당업자에게 알려져 있는 임의의 다른 방법에 달려 있을 수 있다. 택일적으로, 다른 박테리아 또는 효모가 특정한 장점을 가질 수 있고 선택될 수 있다. 예를 들어, 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모, 써머스 써모필러스(Thermus thermophilus)와 같은 극한환경 박테리아(extremophilic bacterium), 또는 클로스트리디아에 패밀리 유래의 혐기성 박테리아, 미세 조류(microalgae), 또는 광합성 박테리아가 사용될 수 있다.
본 발명에 사용되는 생물은 원핵 생물 또는 진핵 생물일 수 있으며, 바람직하기로 이들은 박테리아, 효모, 진균 또는 곰팡이와 같은 미생물, 또는 식물 세포 또는 동물 세포이다. 특별한 구현예에서, 상기 미생물은 박테리아, 바람직하기로 에스케리키아(Escherichia), 알칼리게네스 또는 바실러스 속의 박테리아, 더욱 바람직하기로 에스케리키아 콜리, 알칼리게네스 유트로퍼스 또는 바실러스 메가테리움 종의 박테리아이다.
다른 바람직한 구현예에서, 상기 미생물은 하나 이상의 3-히드록시알카노에이트를 내생적으로 생산하고 이를 알켄으로 전환하기 위하여 변형된, 에스케리키아 속의 재조합 박테리아, 바람직하기로 에스케리키아 콜리 종의 재조합 박테리아이다.
더욱 바람직한 구현예에서, 상기 미생물은 진균, 더욱 바람직하기로 사카로마이세스, 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 아스퍼질러스(Aspergillus) 또는 트리코데마(Trichoderma) 속의 진균, 더욱 더 바람직하기로 사카로마이세스 세레비지아에, 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) 종 또는 트리코데마 리세이(Trichoderma reesei) 종의 진균이다. 특히 바람직한 구현예에서, 상기 미생물은 상기 (i) 및 (ii)에 기술된 효소의 발현으로 인하여 3-히드록시알카노에이트를 생산하고 이를 알켄으로 전환하는 재조합 효모이다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 상기 (i) 및 (ii)에 기술된 바와 같은 효소를 발현시키는 광합성 미생물을 사용한다. 바람직하기로, 상기 미생물은 광합성 박테리아, 또는 미세 조류이다. 더욱 더 바람직하기로, 이러한 미생물은 하나 이상의 3-히드록시알카노에이트를 내생적으로 생산하는 천연 또는 인공적인 특성을 갖는다. 이러한 경우에, 상기 미생물은 용액 중에 존재하는 CO2로부터 직접 알켄을 생산할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 방법에서, 상기 (i)에 정의된 바와 같은 효소를 생산하는 하나의 미생물과, 상기 (ii)에 정의된 바와 같은 효소를 생산하는 또 다른 미생물을 사용하는 것을 고려할 수 있다. 더 나아가, 추가의 구현예에서, 적어도 하나의 미생물이 하나 이상의 3-히드록시알카노에이트를 생산할 수 있거나, 또는 대안적인 구현예에서, 추가의 미생물이 하나 이상의 3-히드록시알카노에이트를 생산할 수 있는 상기 방법에 사용된다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 상기 (i) 및 (ii)에 기술된 바와 같은 효소를 발현시키는 다세포 생물을 사용한다. 이러한 생물의 예는 식물 또는 동물이다.
특별한 구현예에서, 상기 방법은 표준 배양 조건(1 atm에서 30-37℃, 박테리아의 호기성 성장을 허용하는 발효기) 또는 비표준 조건(예를 들어, 고온성 생물의 배양 조건에 해당하는 더욱 높은 온도)에서 미생물을 배양시키는 단계를 수반한다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법은 미호기성 조건에서 수행된다. 이는 알켄 탄화수소를 함유하는 기체 폐기물 중 잔여 산소 농도를 최소화하기 위하여 주입되는 공기의 양을 제한하는 것을 의미한다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 반응으로부터 탈기되는 기체 알켄을 수집하는 단계, 즉 예를 들어 배양으로부터 탈기되는 생성물을 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 반응 중에 기체 형태 하에 알켄을 수집하기 위한 시스템의 존재 하에 수행된다.
실제로, 단쇄 알켄(short alkene), 특히 에틸렌, 프로필렌 및 부텐 이성질체는 상온 및 대기압 하에서 기체 상태를 취한다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 산업적인 규모로 수행되는 경우 항상 매우 비용이 많이 드는 단계인, 액체 배양 배지로부터의 생성물의 추출을 필요로 하지 않는다. 기체 탄화수소의 배출 및 저장, 및 이들의 가능한 이후 물리적 분리 및 화학적 전환은 당업자에게 알려져 있는 임의의 방법에 따라 수행될 수 있다.
특별한 구현예에서, 상기 방법은 또한 기체 상으로 존재하는 알켄(예를 들어, 프로필렌, 에틸렌 또는 이소부틸렌)을 검출하는 단계를 포함한다. 비록 소량일지라도, 대기 또는 또 다른 기체의 환경에서 제조되는 상기 화합물의 존재는 다양한 기술을 사용함으로써, 특히 적외선 또는 불꽃 이온화 검출과 함께, 또는 질량 분광계와 함께 결합시킴으로써 기체 크로마토그래피 시스템을 사용하여 검출될 수 있다.
특별한 구현예에서, 본 발명에 따른 방법으로 제조된 알켄은, 더욱 긴 사슬의 알켄, 또는 더욱 긴 사슬의 알칸을 제조하기 위하여, 당업자에게 알려진 기술을 사용함으로써, 응축된 다음, 임의로 환원된다. 예를 들어, 이소부틸렌은 이소옥탄을 합성하기 위하여 사용될 수 있다: 이러한 반응을 성공적으로 수행하기 위한 촉매적 방법은 이미 충분히 개시되어 왔다.
또 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 글루코즈와 같은 탄소원의 3-히드록시알카노에이트로의 전환, 및 이후의 상기 3-히드록시알카노에이트의 상응하는 알켄으로의 전환을 특징으로 한다. 상기 방법의 상이한 단계는 도 6에 개략적으로 나타내었다.
특별한 구현예에서, 상기 방법은 효소 또는 적합한 물리화학적인 방법을 사용한 폴리히드록시알카노에이트의 3-히드록시알카노에이트로의 전환, 및 이후의 상기 3-히드록시알카노에이트의 알켄으로의 전환을 특징으로 한다. 임의로, 상기 폴리히드록시알카노에이트는 높은 수율의 폴리히드록시알카노에이트를 제조하기 위하여 대사 경로가 변형된 미생물 또는 식물에 의해 제조되었다.
또 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 대기의 CO2 또는 배양 배지에 인공적으로 첨가된 CO2로부터의 알켄의 제조를 포함한다. 이러한 경우에, 상기 방법은 예를 들어 미세 조류와 같은, 광합성을 수행할 수 있는 생물 내에서 수행된다.
또한, 본 발명은 디카르복실화 및 디포스포릴화에 의한 상기 전환을 촉매할 수 있는 효소를 사용하여 3-포스포녹시알카노에이트를 상응하는 알켄으로 효소적으로 전환시키는 단계를 포함하는 알켄의 제조 방법에 관한 것이다.
이러한 방법에 사용되는 바람직한 효소에 관하여는, 상기 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 방법의 (ii)와 관련하여 상기에서 설명한 바와 동일하다.
또한, 본 발명에 따른 방법에 대한 상기 기재된 다른 바람직한 구현예에 관하여도, 상기 3-포스포녹시알카노에이트로부터 알켄을 제조하는 방법에 대해 동일하게 적용된다.
또한, 본 발명은 하나의 효소는 상기 기술된 바와 같은 (i)로부터 선택되고 다른 효소는 상기 기술된 바와 같은 (ii)로부터 선택되는, 적어도 2종의 효소를 생산하는 생물, 바람직하기로 미생물에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 이러한 생물은 적어도 하나의 상기 언급된 효소를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 분자의 도입으로 인하여 유전적으로 변형된다는 점에서 재조합 생물이다. 바람직하기로 이러한 핵산 분자는 상기 생물에 대해 이종 기원이고, 이는 상기 생물 내에서 천연적으로 발생하지 않는다는 것을 의미한다.
따라서, 본 발명은 또한 상기 (i)에 정의된 바와 같은 효소를 코딩하는 핵산 분자를 포함하고 상기 (ii)에 정의된 바와 같은 효소를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 생물, 바람직하기로 미생물에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 적어도 하나의 핵산 분자는 상기 생물에 대해 이종 기원이고, 이는 상기 생물 내에서 천연적으로 발생하지 않는다는 것을 의미한다. 상기 미생물은 바람직하기로 박테리아, 효모 또는 진균이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 생물은 식물 또는 인간이 아닌 동물이다. 다른 바람직한 구현예에 관하여, 본 발명에 따른 방법과 관련하여 상기에서 설명한 바와 동일하다.
더 나아가, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 미생물, 적합한 배양 배지, 및 3-히드록시알카노에이트 화합물 또는 상기 미생물에 의하여 3-히드록시알카노에이트 화합물로 전환될 수 있는 탄소원을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 3-히드록시알카노에이트로부터 알켄 화합물을 제조하기 위한, 하나의 효소는 하기 (i)로부터 선택되고 다른 효소는 하기 (ii)로부터 선택되는, 적어도 2개의 효소의 조합의 사용, 또는 본 발명에 따른 생물, 바람직하기로 미생물의 사용, 또는 본 발명에 따른 조성물의 사용에 관한 것이며, 여기에서 (i) 및 (ii)는 하기와 같다:
(i) 3-히드록시알카노에이트를 상응하는 3-포스포녹시알카노에이트로 전환하는 활성을 갖는 제1 효소; 및
(ii) 상기 제1 효소와 다르며, 상기 3-포스포녹시알카노에이트를 상기 알켄으로 전환하는 활성을 갖는 제2 효소.
언급된 다른 성분의 바람직한 구현예에 관하여는, 본 발명에 따른 방법과 관련하여 상기에서 설명한 바와 동일하다.
본 발명의 다른 양태 및 장점은 이하 실시예에서 설명되며, 이는 설명의 목적으로 제공되고 제한을 위한 것은 아니다.
도 1은 3-히드록시프로피오네이트 모티프를 나타낸다.
도 2는 메발로네이트 디포스페이트 디카르복실라제에 의해 촉매되는 반응을 나타낸다.
도 3은 3-히드록시알카노에이트의 예를 나타낸다.
도 4는 2개의 효소적 단계를 결합함으로써 3-히드록시알카노에이트로부터 알켄을 제조하는 것을 나타낸다.
도 5는 메발로네이트 디포스페이트 디카르복실라제의 촉매 자리에서 구조적 상보성의 목적으로 반응에 사용될 수 있는 보조인자를 나타낸다.
도 6은 글루코즈로부터 알켄을 제조하는 통합된 방법을 나타낸다.
도 7은 상보성 어세이에서의 MDP 디카르복실라제의 스크리닝을 나타낸다. 제2 효소 없이, 피. 토리두스(P. torridus) 효소 단독(0.1 mg)으로 촉매된 반응이 참조(reference)로서 사용된다.
도 8은 3-히드록시이소발레르에이트(HIV)를 이소부텐(IBN)으로 전환하기 위한 피. 토리두스 및 에스. 고도니 유래의 MDP 디카르복실라제 효소의 조합된 효과를 나타낸다. IBN 생성은 100 ㎍의 피. 토리두스 MDP 디카르복실라제로 미리 인큐베이션시킨 HIV의 반응 혼합물에 첨가된 에스. 고도니 MDP 디카르복실라제의 농도의 함수로서 측정되었다.
도 9는 에스. 고도니 MDP 디카르복실라제의 효소 상동체(homolog)의 스크리닝을 나타낸다. 써모플라즈마 아시도필룸(0.1 mg) 효소 단독(제2 효소 무처리)을 사용한 반응에 대해 얻은 이소부텐의 피크 영역을 참조(비율=1)로서 사용하였다.
스트렙토코커스 속 유래의 MDP 디카르복실라제가 피. 토리두스 필룸의 효소와 조합하여 사용되는 경우 특히 효과적이다.
도 10은 340 nm에서의 흡광도의 감소로 NADH 소비를 모니터링하는, ADP 정량 어세이의 개략도이다.
도 11은 피. 토리두스 MDP 디카르복실라제에 의해 촉매되는 포스포트랜스퍼라제 반응에 대한 기질 농도의 함수로서 속도의 플롯을 나타낸다. 초기 속도는 반응의 처음 30분에 걸쳐 동력학적으로 컴퓨터로 계산되었다.
도 12는 하기 어세이에서의 3-히드록시이소발레르에이트로부터의 이소부텐 생성을 나타낸다:
효소 무처리
에스. 미티스 MDP 디카르복실라제의 존재 하
써모플라즈마 아시도필룸 MDP 디카르복실라제의 존재 하
써모플라즈마 아시도필룸 효소 및 에스. 미티스 MDP 효소 모두의 존재 하
도 13은 3-포스포녹시이소발레르에이트의 화학적 합성을 위한 반응식을 나타낸다.
도 14는 ATP의 부재 및 존재 하에 3-포스포녹시이소발레르에이트로부터의 이소부텐 생성에 대한 어세이의 GC 분석을 나타낸다.
어세이:
1. 효소 무처리, 0 mM ATP
2. 2 mg/ml 효소, 0 mM ATP
3. 효소 무처리, 10 mM ATP
4. 2 mg/ml 효소, 10 mM ATP
이하 실시예가 본 발명을 설명하기 위하여 제공된다.
실시예
실시예 1: MDP 디카르복실라제 라이브러리의 클로닝 , 발현 및 정제
진핵 생물, 원핵 생물 및 원시(archaeal) 생물에 걸친 디포스포메발로네이트 디카르복실라제 (MDP 디카르복실라제) 패밀리의 대표적인 55개의 인코딩 유전자의 라이브러리를 구축하고 이소부텐(IBN) 생성을 향상시키기 위한 최고의 활성 후보를 확인하기 위하여 테스트하였다.
클로닝 , 박테리아 배양 및 단백질의 발현.
메발로네이트 디포스페이트(MDP) 디카르복실라제 EC 4.1.1.33을 인코딩하는 유전자를 진핵 생물의 유전자의 경우 pET 25b 벡터(Novagen)에 클로닝하고 원핵 생물의 유전자의 경우 pET 22b (Novagen)에 클로닝하였다. 정제를 위한 어피니티 태그(affinity tag)를 제공하기 위하여 메티오닌 개시 코돈 이후에 이어지는(stretch) 6개의 히스티딘 코돈을 삽입하였다. 형질전환성(competent) 이. 콜라이 BL21(DE3) 세포(Novagen)를 열 쇼크 과정에 따라 이들 벡터로 형질전환시켰다. 상기 형질전환된 세포를 37℃에서 6 시간 동안 ZYM-5052 자가-유도 배지(Studier FW, Prot . Exp . Pur. 41, (2005), 207-234) 상에서 쉐이킹(160 rpm) 하면서 성장시키고 단백질 발현을 하룻밤 동안(대략 16 시간) 28℃에서 지속하였다. 세포를 20분 동안 4℃, 10,000 rpm으로 원심분리하여 수집하고 펠렛을 -80℃로 동결시켰다.
단백질 정제 및 농축
200 ml의 배양 세포 유래의 펠렛을 얼음 상에서 녹이고, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2 및 1 mM DTT를 함유하는 pH 8의 5 ml Na2HPO4 중에 재현탁시켰다. 20 마이크로리터의 lysonase (Novagen)를 첨가하였다. 세포를 상온에서 10분 동안 인큐베이션시킨 다음 20분 동안 얼음에 다시 두었다. 세포 용해를 3 x 15 초 동안 초음파 처리하여 완료하였다. 그 다음 박테리아 추출물을 20분 동안 4℃, 10,000 rpm으로 원심분리하여 맑게 하였다. 상기 맑아진 박테리아 용해물을 6-His 태그화된 단백질의 흡착을 허용하는 PROTINO-1000 Ni-TED 컬럼 (Macherey-Nagel) 상에 로딩하였다. 컬럼을 세척하고 대상이 되는 효소를 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 250 mM 이미다졸을 함유하는 pH 8의 4 ml 50 mM Na2HPO4로 용출시켰다. 그 다음 용출액을 농축시키고 Amicon Ultra-4 10 kDa 필터 유닛(Millipore) 상에서 탈염시킨 후 0.5 mM DTT 및 5 mM MgCl2를 함유하는 pH 7.4의 0.25 ml 50 mM Tris-HCl 중에 재현탁시켰다. 단백질 농도를 브래드포드(Bradford) 법에 따라 정량화하였다. 이에 따라 정제된 단백질의 순도는 40%로부터 90%까지 다양하였다.
실시예 2: MDP 디카르복실라제 라이브러리의 스크리닝.
상보성 어세이를 사용하여 MDP 디카르복실라제를 평가하였다. 피. 토리두스 MDP 디카르복실라제를 라이브러리로부터의 각각의 테스트되는 효소와 함께 인큐베이션시켰다.
효소적 어세이를 하기 조건 하에서 수행하였다:
50 mM Tris HCl pH 7,0
10 mM MgCl2
20 mM KCl
40 mM ATP
50 mM 3-히드록시이소발레르에이트 (HIV)
pH는 7.0로 조정됨
100 ㎍의 피. 토리두스 유래의 MDP 디카르복실라제 및 1 mg의 테스트되는 MDP 디카르복실라제를 1 ml의 반응 혼합물에 첨가하였다. 단지 100 ㎍의 피. 토리두스 MDP 디카르복실라제만을 함유하는 반응 혼합물을 참조로서 사용하였다. 그 다음 상기 혼합물을 밀봉된 바이알(Interchim) 내에서 90 시간 동안 45℃에서 쉐이킹 하지 않으면서 인큐베이션시켰다.
1 ml의 기체 상을 수집하고, FID 검출기 및 CP SilicaPlot 컬럼 (Varian)이 장착된 HP5890 기체 크로마토그래프 (HP)에 주입하였다. 상업용 이소부텐을 참조로서 사용하였다.
이러한 스크리닝 과정을 통해 이소부텐 생성율을 증가시키는 몇몇의 MDP 디카르복실라제 효소를 확인하였다. 도 7에 도시된 바와 같이, 하기 MDP 디카르복실라제에 대하여 이소부텐의 더욱 높은 생성이 관찰되었다.
후보 1:
Genbank 수탁번호 : CAI97800
SwissProt/TrEMBL 수탁번호 : Q1GAB2
생물: 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 ATCC 11842
후보 2:
Genbank 수탁번호 : AAC50440.1
SwissProt/TrEMBL 수탁번호 : P53602.1
생물: 호모 사피엔스
후보 3:
Genbank 수탁번호 : ABV09606
SwissProt/TrEMBL 수탁번호 : A8AUU9
생물: 스트렙토코커스 고도니 균주 칼리스 아균주 CH1
이소부텐의 가장 높은 생성은 스트렙토코커스 고도니 유래의 정제된 MDP 디카르복실라제에서 관찰되었다.
이는 상기 어세이에 존재하는 2종의 효소(피. 토리두스 유래의 하나 및 에스. 고도니 유래의 다른 하나)가 HIV로부터 IBN을 제조하는 반응의 2 단계를 상보적으로 수행함을 나타낸다: ATP로부터 3-히드록시이소발레르에이트의 C3-산소로의 말단 포스포릴기의 이동, 및 이후 중간체 3-포스포녹시이소발레르에이트의 결합된 디포스포릴화-디카르복실화.
실시예 3: 이소부텐 생산 수율에 대한 효소 농도의 영향
스트렙토코커스 고도니 MDP 디카르복실라제 농도의 영향을 하기 조건 하에서 평가하였다:
50 mM Tris-HCl pH 7,0
10 mM MgCl2
20 mM KCl
40 mM ATP
50 mM 3-히드록시이소발레르에이트 (HIV)
pH는 7,0으로 조정됨.
100 ㎍의 피. 토리두스 유래의 MDP 디카르복실라제 및 다양한 양(0 내지 1 mg)의 스트렙토코커스 고도니 유래의 정제된 MDP 디카르복실라제를 1 ml의 반응 혼합물에 첨가하였다. 그 다음 상기 혼합물을 밀봉된 바이알(Interchim) 내에서 90 시간 동안 45℃에서 쉐이킹 하지 않으면서 인큐베이션시켰다.
1 ml의 기체 상을 수집하고, FID 검출기 및 CP SilicaPlot 컬럼 (Varian)이 장착된 HP5890 기체 크로마토그래프 (HP)에 주입하였다. 상업용 이소부텐을 참조로서 사용하였다.
에스. 고도니 효소 농도가 증가함에 따라 제조된 이소부텐의 양의 증가를 초래하였다(도 8).
실시예 4: 스트렙토코커스 고도니 MDP 디카르복실라제 상동체의 라이브러리의 스크리닝
NCBI에 의해 호스팅된(hosted) BLAST 온라인 프로그램을 사용하여, non redundant 단백질 서열 데이터베이스에 대하여 서열을 조사하여 스트렙토코커스 고도니 효소에 대하여 높은 서열 유사성(> 40% 동일성)을 갖는 효소의 리스트를 만들어 냈다. 그 결과의 리스트는 18개의 후보를 포함하였다.
Figure pct00003
이. 콜라이의 코돈 사용에 맞는 올리고뉴클레오티드 연결을 통해 상기 종의 게놈뿐만 아니라 에스. 고도니의 게놈으로부터 결론지어진 MDP 디카르복실라제 효소의 서열을 만들어 냈다. 정제를 위한 어피니티 태그를 제공하기 위하여 메티오닌 개시 코돈 이후에 이어지는(stretch) 6개의 히스티딘 코돈을 삽입하였다. 이에 따라 합성된 유전자를 pET25b 발현 벡터(벡터는 GENEART AG에 의해 구축됨)에 클로닝하였다. 이. 콜라이 균주 BL21(DE3)의 형질 전환 후, 단백질을 실시예 1에 기재된 프로토콜에 따라 생산하였다. 그 다음 효소를 피. 토리두스 효소 대신에 써모플라즈마 아시도필룸 MDP 디카르복실라제를 사용하여, 실시예 2에 기재된 방법을 사용하여 어세이하였다. 이러한 스크리닝 과정을 통해 에스. 고도니 효소보다 이소부텐 생성에 더욱 효과적인 효소(도 9), 특히 에스. 인판타리우스, 에스. 갈로일티쿠스, 스트렙토코커스 종 M143, 에스. 살리바리우스, 에스. 수이스, 에스. 산구이니스 및 에스. 미티스 유래의 MDP 디카르복실라제를 확인하였다.
실시예 5: 포스포트랜스퍼라제 활성의 특징 조사
HIV로부터의 IBN 생성과 관련이 있는 ADP의 방출을 피루베이트 키나제/락테이트 디하이드로게나제 결합(coupled) 어세이를 사용하여 정량화하였다(도 10). 피. 토리두스, 써모플라즈마 아시도필룸, 에스. 인판타리우스, 에스. 미티스 유래의 MDP 디카르복실라제를 HIV를 포스포릴화하고, ADP를 방출하는 이들의 능력에 대해 평가하였다.
조사된 효소적 반응은 40℃에서 하기 조건 하에 수행되었다:
50 mM Tris-HCl pH 7,0
10 mM MgCl2
100 mM KCl
5 mM ATP
0,2 mM NADH
0,5 mM 포스포에놀피루베이트
3 U/ml 락테이트 디하이드로게나제
1,5 U/ml 피루베이트 키나제
0-50 mM 3-히드록시이소발레르에이트 (HIV)
pH는 7,0으로 조정됨
각각의 어세이는 특정한 효소(0.05 내지 1 mg/ml의 농도)의 첨가로 시작하였으며 NADH의 소멸을 이후의 340 nM에서의 흡광도를 통해 모니터링하였다.
스트렙토코커스 속과 마찬가지로 피. 토리두스 필룸 유래의 MDP 디카르복실라제를 사용한 어세이도 HIV의 존재 하에 ADP 생성에 있어 재현 가능한 증가를 일으켰다. 도 11은 피. 토리두스 효소에 대하여 수집한 데이터에 상응하는 미카엘리스-멘텐 플롯의 예를 보여준다. 동력학적 파라미터는 하기 표에 나타내었다.
Figure pct00004

피. 토리두스 필룸 유래의 효소는 스트렙토코커스 속보다 더욱 높은 포스포트랜스퍼라제 활성을 나타내었다.
실시예 6: 2종의 효소의 결합에 의한 3- 히드록시이소발레르에이트로부터의 이소부텐 제조
원하는 효소 반응을 하기 조건 하에서 수행하였다:
50 mM Tris HCl pH 7,5
10 mM MgCl2
20 mM KCl
40 mM ATP
50 mM HIV
pH는 7,5로 조정됨
100 ㎍의 써모플라즈마 아시도필룸 유래의 MDP 디카르복실라제 및 500 ㎍의 에스. 미티스 유래의 MDP 디카르복실라제를 1 ml의 반응 혼합물에 첨가하였다. 2종의 효소 중 단지 1종만을 사용한 대조구 반응을 병행해서 수행하였다. 상기 어세이를 밀봉된 바이알 (Interchim) 내에서 37℃로 쉐이킹하지 않으면서 인큐베이션시켰다.
142 시간의 인큐베이션 기간에 걸쳐 샘플링된 앨리쿼트(aliquot)를 분석함으로써 IBN의 생성을 측정하였다.
1 ml의 기체 상을 수집하고, FID 검출기 및 CP SilicaPlot 컬럼 (Varian)이 장착된 HP5890 기체 크로마토그래프 (HP)에 주입하였다. 상업용 이소부텐을 참조로서 사용하였다.
이소부텐 생성의 동력학을 도 12에 나타내었다. 써모플라즈마 아시도필룸 유래의 MDP 디카르복실라제가 HIV로부터의 이소부텐의 생성을 촉매하였다. 에스. 미티스 유래의 MDP 디카르복실라제의 첨가는 142 시간의 인큐베이션 후에 이소부텐 생성에 있어 3-배의 증가로 이어졌다.
에스. 미티스 유래의 MDP 디카르복실라제 단독은 6일의 인큐베이션 후에 단지 소량의 이소부텐을 생산하였으며, 이는 낮은 포스포트랜스퍼라제 활성을 나타낸다.
따라서, 이소부텐 생성은 상기 2 반응 단계를 상보적으로 수행하는 2종의 효소를 조합함으로써 증가될 수 있다.
실시예 7: 3- 포스포녹시이소발레르에이트(PIV)로부터의 이소부텐 생성에 대한 ATP 의 영향.
화합물 3-포스포녹시이소발레르에이트(PIV)를 SYNTHEVAL (France)를 통해 도 13에 도시된 반응식에 따라 3-히드록시이소발레르에이트로부터 화학적으로 합성하였다.
이소부텐 생성의 어세이는 하기 조건 하에서 수행하였다:
50 mM Tris-HCl pH 7,5
10 mM MgCl2
20 mM KCl
0 mM ATP (어세이 №1 및 №2)
10 mM ATP (어세이 №3 및 №4)
25 mM 3-포스포녹시이소발레르에이트
pH는 7.5로 조정됨
0.5 ml의 반응 혼합물에 2 mg의 에스. 미티스 유래의 정제된 MDP 디카르복실라제를 첨가하여 반응을 개시하였다. 효소 부재 하에 대조구 반응을 수행하였다(어세이 №1 및 №3).
상기 혼합물을 2 ml의 밀봉된 바이알(Interchim) 내에서 26 시간 동안 37℃로 쉐이킹하지 않으면서 인큐베이션시켰다.
1 ml의 기체 상을 수집하고, FID 검출기 및 CP SilicaPlot 컬럼 (Varian)이 장착된 Varian 430-GC 가스 크로마토그래프에 주입하였다. 상업용 이소부텐을 참조로서 사용하였다.
반응 혼합물에 대한 10 mM ATP의 첨가는 3-포스포녹시이소발레르에이트(PIV)로부터의 이소부텐 생성을 120 배 증가시켰다(도 14).
실시예 8: 3- 포스포녹시이소발레르에이트(PIV)로부터의 이소부텐 생성의 동력학적 파라미터
이소부텐 생성의 동력학적 파라미터를 하기 조건 하에서 측정하였다:
50 mM Tris-HCl pH 7,5
10 mM MgCl2
50 mM KCl
40 mM ATP
0-100 mM 3-포스포녹시이소발레르에이트
pH는 7,5로 조정됨
0.5 ml의 반응 혼합물에 1 mg의 에스. 미티스 유래의 정제된 MDP 디카르복실라제를 첨가하여 반응을 개시하였다. 그 다음 상기 혼합물을 2 ml의 밀봉된 바이알(Interchim) 내에서 44 시간 동안 37℃로 쉐이킹하지 않으면서 인큐베이션시켰다.
1 ml의 기체 상을 수집하고, FID 검출기 및 CP SilicaPlot 컬럼 (Varian)이 장착된 Varian 430-GC 가스 크로마토그래프에 주입하였다. 상업용 이소부텐을 참조로서 사용하였다.
에스. 미티스 유래의 정제된 MDP 디카르복실라제를 사용한 어세이는 보조인자로서 ATP의 존재 하에 바탕 수준(background level)(3-포스포녹시이소발레르에이트의 자발적인 분해) 이상으로 IBN 생성에 있어 160-400 배 증가를 나타내었다(하기 표 참조).
Figure pct00005

에스. 미티스 유래의 MDP 디카르복실라제는 60 mM 이상의 K M 및 적어도 1.3 x 10-3 sec-1의 k cat를 갖는 것으로 확인되었다.
<110> Global Bioenergies Scientist of Fortune S.A. <120> PRODUCTION OF ALKENES BY COMBINED ENZYMATIC CONVERSION OF 3-HYDROXYALKANOIC ACIDS <130> IPA130296 <150> EP 10 18 8001.1 <151> 2010-10-19 <160> 15 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 324 <212> PRT <213> Picrophilus torridus <400> 1 Met Glu Asn Tyr Asn Val Lys Thr Arg Ala Phe Pro Thr Ile Gly Ile 1 5 10 15 Ile Leu Leu Gly Gly Ile Ser Asp Lys Lys Asn Arg Ile Pro Leu His 20 25 30 Thr Thr Ala Gly Ile Ala Tyr Thr Gly Ile Asn Asn Asp Val Tyr Thr 35 40 45 Glu Thr Lys Leu Tyr Val Ser Lys Asp Glu Lys Cys Tyr Ile Asp Gly 50 55 60 Lys Glu Ile Asp Leu Asn Ser Asp Arg Ser Pro Ser Lys Val Ile Asp 65 70 75 80 Lys Phe Lys His Glu Ile Leu Met Arg Val Asn Leu Asp Asp Glu Asn 85 90 95 Asn Leu Ser Ile Asp Ser Arg Asn Phe Asn Ile Leu Ser Gly Ser Ser 100 105 110 Asp Ser Gly Ala Ala Ala Leu Gly Glu Cys Ile Glu Ser Ile Phe Glu 115 120 125 Tyr Asn Ile Asn Ile Phe Thr Phe Glu Asn Asp Leu Gln Arg Ile Ser 130 135 140 Glu Ser Val Gly Arg Ser Leu Tyr Gly Gly Leu Thr Val Asn Tyr Ala 145 150 155 160 Asn Gly Arg Glu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Leu Glu Pro Glu Ala Phe 165 170 175 Asn Asn Phe Thr Ile Ile Gly Ala His Phe Asn Ile Asp Arg Lys Pro 180 185 190 Ser Asn Glu Ile His Glu Asn Ile Ile Lys His Glu Asn Tyr Arg Glu 195 200 205 Arg Ile Lys Ser Ala Glu Arg Lys Ala Lys Lys Leu Glu Glu Leu Ser 210 215 220 Arg Asn Ala Asn Ile Lys Gly Ile Phe Glu Leu Ala Glu Ser Asp Thr 225 230 235 240 Val Glu Tyr His Lys Met Leu His Asp Val Gly Val Asp Ile Ile Asn 245 250 255 Asp Arg Met Glu Asn Leu Ile Glu Arg Val Lys Glu Met Lys Asn Asn 260 265 270 Phe Trp Asn Ser Tyr Ile Val Thr Gly Gly Pro Asn Val Phe Val Ile 275 280 285 Thr Glu Lys Lys Asp Val Asp Lys Ala Met Glu Gly Leu Asn Asp Leu 290 295 300 Cys Asp Asp Ile Arg Leu Leu Lys Val Ala Gly Lys Pro Gln Val Ile 305 310 315 320 Ser Lys Asn Phe <210> 2 <211> 318 <212> PRT <213> Thermoplasma acidophilum <400> 2 Met Thr Tyr Arg Ser Ile Gly Ser Thr Ala Tyr Pro Thr Ile Gly Val 1 5 10 15 Val Leu Leu Gly Gly Ile Ala Asn Pro Val Thr Arg Thr Pro Leu His 20 25 30 Thr Ser Ala Gly Ile Ala Tyr Ser Asp Ser Cys Gly Ser Ile Arg Ser 35 40 45 Glu Thr Arg Ile Tyr Ala Asp Glu Ala Thr His Ile Tyr Phe Asn Gly 50 55 60 Thr Glu Ser Thr Asp Asp Asn Arg Ser Val Arg Arg Val Leu Asp Arg 65 70 75 80 Tyr Ser Ser Val Phe Glu Glu Ala Phe Gly Thr Lys Thr Val Ser Tyr 85 90 95 Ser Ser Gln Asn Phe Gly Ile Leu Ser Gly Ser Ser Asp Ala Gly Ala 100 105 110 Ala Ser Ile Gly Ala Ala Ile Leu Gly Leu Lys Pro Asp Leu Asp Pro 115 120 125 His Asp Val Glu Asn Asp Leu Arg Ala Val Ser Glu Ser Ala Gly Arg 130 135 140 Ser Leu Phe Gly Gly Leu Thr Ile Thr Trp Ser Asp Gly Phe His Ala 145 150 155 160 Tyr Thr Glu Lys Ile Leu Asp Pro Glu Ala Phe Ser Gly Tyr Ser Ile 165 170 175 Val Ala Phe Ala Phe Asp Tyr Gln Arg Asn Pro Ser Asp Val Ile His 180 185 190 Gln Asn Ile Val Arg Ser Asp Leu Tyr Pro Ala Arg Lys Lys His Ala 195 200 205 Asp Glu His Ala His Met Ile Lys Glu Tyr Ala Lys Thr Asn Asp Ile 210 215 220 Lys Gly Ile Phe Asp Leu Ala Gln Glu Asp Thr Glu Glu Tyr His Ser 225 230 235 240 Ile Leu Arg Gly Val Gly Val Asn Val Ile Arg Glu Asn Met Gln Lys 245 250 255 Leu Ile Ser Tyr Leu Lys Leu Ile Arg Lys Asp Tyr Trp Asn Ala Tyr 260 265 270 Ile Val Thr Gly Gly Ser Asn Val Tyr Val Ala Val Glu Ser Glu Asn 275 280 285 Ala Asp Arg Leu Phe Ser Ile Glu Asn Thr Phe Gly Ser Lys Lys Lys 290 295 300 Met Leu Arg Ile Val Gly Gly Ala Trp His Arg Arg Pro Glu 305 310 315 <210> 3 <211> 320 <212> PRT <213> Thermoplasma volcanium <400> 3 Met Ser Asn Ser Ser Ile Thr Ser Val Ala Tyr Pro Thr Ile Gly Val 1 5 10 15 Val Leu Leu Gly Gly Ile Ala Asn Glu Lys Thr Arg Thr Pro Leu His 20 25 30 Thr Ser Ala Gly Ile Ala Tyr Thr Asp Ser Cys Gly Ser Ile Arg Thr 35 40 45 Glu Ser Thr Ile Tyr Gly Asp Ser Glu Met His Ile Tyr Phe Asn Gly 50 55 60 Thr Glu Ser Lys Asp Glu Asn Arg Ser Val Lys Ser Val Leu Glu Arg 65 70 75 80 Tyr Arg Asn Glu Leu Gln Ser Phe Phe Gly Lys Lys Asp Val Ser Tyr 85 90 95 Ser Ser Leu Asn Tyr Gly Ile Leu Ser Gly Ser Ser Asp Ala Gly Ala 100 105 110 Ala Ser Ile Gly Ala Ile Leu Ser Phe Ile Asp Lys Lys Asn Asp Ile 115 120 125 His Asp Ile Glu Asn Asp Ile Arg Met Ile Ser Glu Ser Ala Gly Arg 130 135 140 Ser Leu His Gly Gly Leu Thr Ile Thr Trp Ser Asp Gly Tyr Ser Ala 145 150 155 160 Tyr Thr Glu Arg Val Leu Gly Pro Glu His Phe Asn Asn Tyr Ala Ile 165 170 175 Val Gly Phe Ser Phe Asp Tyr Pro Arg Asn Pro Ser Asp Thr Ile His 180 185 190 Gln Asn Ile Ile Lys Ser Lys Arg Tyr Lys Gln Arg Thr Ile Asp Ala 195 200 205 Asp Glu His Ala His Glu Ile Lys Glu Met Ala Arg Thr Asp Asp Ile 210 215 220 Glu Gly Ile Phe Glu Lys Ala Glu Glu Asp Thr Glu Glu Tyr His Ser 225 230 235 240 Ile Leu Arg Glu Val Gly Val Leu Val Ile Arg Glu Asn Met Gln Lys 245 250 255 Leu Ile Glu Phe Ile Lys Ile Leu Arg Lys Glu Phe Trp Asn Ser Tyr 260 265 270 Ile Val Thr Gly Gly Ser Asn Val Tyr Val Ile Val Arg Arg Asp Asp 275 280 285 Leu Glu Arg Leu Ile His Ile Lys Asn Thr Phe Gly Ser Lys Pro Lys 290 295 300 Ile Leu Asn Val Ala Gly Pro Ala Trp Ile Lys Lys Val Glu Ser Asp 305 310 315 320 <210> 4 <211> 322 <212> PRT <213> Ferroplasma acidarmanus fer1 <400> 4 Met Glu Lys Tyr Tyr Val Glu Val Lys Ala Tyr Pro Thr Ile Gly Ile 1 5 10 15 Leu Leu Leu Gly Gly Val Ser Asp Asn Lys Lys Arg Leu Pro Arg His 20 25 30 Thr Thr Ala Gly Ile Ala Tyr Thr Gly Leu Asp Asp Asp Ile Tyr Val 35 40 45 Lys Thr Asp Leu Tyr Leu Ser Asn Gln Lys Ser Gly Ile Ile Asn Gly 50 55 60 Lys Glu Val Ser Pro Asp Ser Pro Arg Ser Pro Phe Val Val Ile Asp 65 70 75 80 Lys Tyr Arg His Glu Ile Leu Met Arg His Pro Glu Tyr Ser Glu Val 85 90 95 Ser Phe Val Ser Glu Asn Lys Asn Val Ile Ser Gly Ser Ser Asp Ala 100 105 110 Gly Ala Ala Ala Ile Gly Glu Cys Ile Gln Ser Ile Phe Glu Tyr Asn 115 120 125 Ile Asn Ile Phe Asn Phe Glu Asn Asp Leu Gln Gln Ile Ser Glu Ser 130 135 140 Ala Gly Arg Ser Met Phe Gly Gly Phe Thr Ile Asn His Ala Asn Gly 145 150 155 160 Lys Glu Ser Leu Thr Asp Glu Ile Leu Gly Pro Glu Asp Phe Glu Asp 165 170 175 Phe Val Ile Val Ala Cys Lys Phe Ser Glu Asp Arg Lys Pro Ser Asp 180 185 190 Thr Ile His Ser Asn Ile Ile Asn His Glu Lys Tyr Ala Glu Arg Val 195 200 205 Lys Asn Ser Glu Leu Arg Ala Lys Glu Leu Glu Lys Met Ala Asp Ser 210 215 220 Gly Asp Ile Lys Gly Ile Phe Glu Ala Gly Glu Lys Asp Thr Gln Glu 225 230 235 240 Tyr His Ser Met Leu Arg Glu Val Gly Val Ser Ile Ile Thr Asp Glu 245 250 255 Met Gln Arg Leu Ile Glu Lys Val Glu Glu Leu Lys Ala Glu Phe Trp 260 265 270 Asn Ala Tyr Ile Val Thr Gly Gly Thr Asn Val Phe Val Ala Val Glu 275 280 285 Arg Lys Asn Met Glu Lys Met Lys Asn Ala Ala Met Glu Phe Lys Cys 290 295 300 Thr Pro Val Tyr Leu Lys Val Ala Gly Lys Pro Asp Val Ile Ser Lys 305 310 315 320 Asn Phe <210> 5 <211> 315 <212> PRT <213> Streptococcus gordonii <400> 5 Met Asp Arg Lys Pro Val Ser Val Lys Ser Tyr Ala Asn Ile Ala Ile 1 5 10 15 Val Lys Tyr Trp Gly Lys Lys Asp Ala Glu Lys Met Ile Pro Ser Thr 20 25 30 Ser Ser Ile Ser Leu Thr Leu Glu Asn Met Tyr Thr Glu Thr Gln Leu 35 40 45 Ser Pro Leu Pro Ala Thr Ala Thr Gly Asp Glu Phe Tyr Ile Asp Gly 50 55 60 Gln Leu Gln Ser Pro Ala Glu His Thr Lys Ile Ser Lys Ile Ile Asp 65 70 75 80 Arg Phe Arg Ser Pro Glu Asp Gly Phe Val Arg Val Asp Thr Ser Asn 85 90 95 Asn Met Pro Thr Ala Ala Gly Leu Ser Ser Ser Ser Ser Gly Leu Ser 100 105 110 Ala Leu Val Lys Ala Cys Asn Ala Tyr Phe Gln Thr Gly Tyr Gln Ala 115 120 125 Gln Glu Leu Ala Gln Leu Ala Lys Phe Ala Ser Gly Ser Ser Ala Arg 130 135 140 Ser Phe Phe Gly Pro Leu Ala Ala Trp Asp Lys Asp Ser Gly Ala Ile 145 150 155 160 Tyr Pro Val Lys Thr Asp Leu Lys Leu Ala Met Ile Met Leu Val Leu 165 170 175 His Asp Glu Lys Lys Pro Ile Ser Ser Arg Asp Gly Met Glu Leu Cys 180 185 190 Ala Lys Thr Ser Thr Ile Phe Pro Asp Trp Ile Ala Gln Ser Ala Leu 195 200 205 Asp Tyr Gln Ala Met Leu Ala Tyr Leu Arg Asp Asn Glu Phe Ala Lys 210 215 220 Val Gly Gln Leu Thr Glu Glu Asn Ala Leu Arg Met His Ala Thr Thr 225 230 235 240 Glu Lys Ala Tyr Pro Pro Phe Ser Tyr Leu Thr Glu Glu Ser Tyr Gln 245 250 255 Ala Met Asp Ala Val Arg Lys Leu Arg Glu Gln Gly Glu Arg Cys Tyr 260 265 270 Phe Thr Met Asp Ala Gly Pro Asn Val Lys Val Leu Cys Leu Glu Glu 275 280 285 Asp Leu Asp His Leu Ala Ala Ile Leu Glu Lys Asp Tyr Arg Leu Ile 290 295 300 Val Ser Lys Thr Lys Asp Leu Ser Asp Glu Ser 305 310 315 <210> 6 <211> 315 <212> PRT <213> Streptococcus gordonii str. Challis substr. CH1 <400> 6 Met Asp Arg Lys Pro Val Ser Val Lys Ser Tyr Ala Asn Ile Ala Ile 1 5 10 15 Val Lys Tyr Trp Gly Lys Lys Asp Ala Glu Lys Met Ile Pro Ser Thr 20 25 30 Ser Ser Ile Ser Leu Thr Leu Glu Asn Met Tyr Thr Glu Thr Gln Leu 35 40 45 Ser Pro Leu Pro Asp Thr Ala Thr Gly Asp Glu Phe Tyr Ile Asp Gly 50 55 60 Gln Leu Gln Ser Pro Ala Glu His Ala Lys Ile Ser Lys Ile Ile Asp 65 70 75 80 Arg Phe Arg Ser Pro Glu Asp Gly Phe Val Arg Val Asp Thr Ser Asn 85 90 95 Asn Met Pro Thr Ala Ala Gly Leu Ser Ser Ser Ser Ser Gly Leu Ser 100 105 110 Ala Leu Val Lys Ala Cys Asn Ala Tyr Phe Gln Thr Gly Tyr Gln Thr 115 120 125 Glu Glu Leu Ala Gln Leu Ala Lys Phe Ala Ser Gly Ser Ser Ala Arg 130 135 140 Ser Phe Phe Gly Pro Leu Ala Ala Trp Asp Lys Asp Ser Gly Ala Ile 145 150 155 160 Tyr Pro Val Lys Thr Asp Leu Lys Leu Ala Met Ile Met Leu Val Leu 165 170 175 His Asp Glu Lys Lys Pro Ile Ser Ser Arg Asp Gly Met Glu Leu Cys 180 185 190 Ala Lys Thr Ser Thr Ile Phe Pro Asp Trp Ile Ala Gln Ser Ala Leu 195 200 205 Asp Tyr Gln Ala Met Leu Gly Tyr Leu Gln Asp Asn Asp Phe Ala Lys 210 215 220 Val Gly Gln Leu Thr Glu Glu Asn Ala Leu Arg Met His Ala Thr Thr 225 230 235 240 Glu Lys Ala Tyr Pro Pro Phe Ser Tyr Leu Thr Glu Glu Ser Tyr Gln 245 250 255 Ala Met Asp Ala Val Arg Lys Leu Arg Glu Gln Gly Glu Arg Cys Tyr 260 265 270 Phe Thr Met Asp Ala Gly Pro Asn Val Lys Val Leu Cys Leu Glu Glu 275 280 285 Asp Leu Asp His Leu Ala Ala Ile Phe Glu Lys Asp Tyr Arg Leu Ile 290 295 300 Val Ser Lys Thr Lys Asp Leu Ser Asp Glu Ser 305 310 315 <210> 7 <211> 311 <212> PRT <213> Streptococcus infantarius subsp infantarius ATCC BAA-102 <400> 7 Met Asp Arg Lys Ile Val Thr Val Lys Ser Tyr Ala Asn Ile Ala Ile 1 5 10 15 Ile Lys Tyr Trp Gly Lys Ala Asp Ala Ala Lys Met Ile Pro Ala Thr 20 25 30 Ser Ser Ile Ser Leu Thr Leu Glu Asn Met Phe Thr Thr Thr Ser Val 35 40 45 Ser Phe Leu Pro Asp Ser Ala Ser His Asp Glu Phe Tyr Ile Asn Gly 50 55 60 Val Leu Gln Asp Asp Lys Glu His Ala Lys Ile Ser Ala Ile Ile Asp 65 70 75 80 Gln Tyr Arg Gly Gln Arg Ser Glu Tyr Val Lys Val Glu Thr Ser Asn 85 90 95 Asn Met Pro Thr Ala Ala Gly Leu Ser Ser Ser Ser Ser Gly Leu Ser 100 105 110 Ala Leu Val Lys Ala Cys Asn Glu Leu Phe Glu Thr Gly Leu Thr Arg 115 120 125 Ala Glu Leu Ala Gln Lys Ala Lys Phe Ala Ser Gly Ser Ser Ser Arg 130 135 140 Ser Phe Phe Gly Pro Leu Ala Ala Trp Asp Lys Asp Ser Gly Glu Val 145 150 155 160 Tyr Pro Val Gln Thr Asp Leu Lys Leu Ala Met Ile Met Leu Val Leu 165 170 175 Ser Asp Ser Lys Lys Ser Ile Ser Ser Arg Glu Gly Met Lys Arg Cys 180 185 190 Val Glu Thr Ser Thr Thr Phe Ala Asp Trp Val Lys Gln Ser Glu Gln 195 200 205 Asp Tyr Lys Asp Met Leu Gly Tyr Leu Lys Asn Asn Asp Phe Glu Arg 210 215 220 Val Gly Glu Leu Thr Glu Arg Asn Ala Leu Ala Met His Asp Thr Asn 225 230 235 240 Thr His Ala Asn Pro Pro Phe Asn Tyr Leu Thr Glu Glu Ser Tyr Lys 245 250 255 Ala Met Glu Phe Val Lys Gln Leu Arg Ser Glu Gly Glu Lys Cys Tyr 260 265 270 Phe Thr Met Asp Ala Gly Pro Asn Val Lys Val Leu Cys Leu Glu Glu 275 280 285 Asp Leu Glu Arg Leu Thr Lys Arg Phe Glu Glu Asn Tyr Arg Val Ile 290 295 300 Val Ser Arg Thr Lys Glu Leu 305 310 <210> 8 <211> 400 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Ala Ser Glu Lys Pro Leu Ala Ala Val Thr Cys Thr Ala Pro Val 1 5 10 15 Asn Ile Ala Val Ile Lys Tyr Trp Gly Lys Arg Asp Glu Glu Leu Val 20 25 30 Leu Pro Ile Asn Ser Ser Leu Ser Val Thr Leu His Gln Asp Gln Leu 35 40 45 Lys Thr Thr Thr Thr Ala Val Ile Ser Lys Asp Phe Thr Glu Asp Arg 50 55 60 Ile Trp Leu Asn Gly Arg Glu Glu Asp Val Gly Gln Pro Arg Leu Gln 65 70 75 80 Ala Cys Leu Arg Glu Ile Arg Cys Leu Ala Arg Lys Arg Arg Asn Ser 85 90 95 Arg Asp Gly Asp Pro Leu Pro Ser Ser Leu Ser Cys Lys Val His Val 100 105 110 Ala Ser Val Asn Asn Phe Pro Thr Ala Ala Gly Leu Ala Ser Ser Ala 115 120 125 Ala Gly Tyr Ala Cys Leu Ala Tyr Thr Leu Ala Arg Val Tyr Gly Val 130 135 140 Glu Ser Asp Leu Ser Glu Val Ala Arg Arg Gly Ser Gly Ser Ala Cys 145 150 155 160 Arg Ser Leu Tyr Gly Gly Phe Val Glu Trp Gln Met Gly Glu Gln Ala 165 170 175 Asp Gly Lys Asp Ser Ile Ala Arg Gln Val Ala Pro Glu Ser His Trp 180 185 190 Pro Glu Leu Arg Val Leu Ile Leu Val Val Ser Ala Glu Lys Lys Leu 195 200 205 Thr Gly Ser Thr Val Gly Met Arg Ala Ser Val Glu Thr Ser Pro Leu 210 215 220 Leu Arg Phe Arg Ala Glu Ser Val Val Pro Ala Arg Met Ala Glu Met 225 230 235 240 Ala Arg Cys Ile Arg Glu Arg Asp Phe Pro Ser Phe Ala Gln Leu Thr 245 250 255 Met Lys Asp Ser Asn Gln Phe His Ala Thr Cys Leu Asp Thr Phe Pro 260 265 270 Pro Ile Ser Tyr Leu Asn Ala Ile Ser Trp Arg Ile Ile His Leu Val 275 280 285 His Arg Phe Asn Ala His His Gly Asp Thr Lys Val Ala Tyr Thr Phe 290 295 300 Asp Ala Gly Pro Asn Ala Val Ile Phe Thr Leu Asp Asp Thr Val Ala 305 310 315 320 Glu Phe Val Ala Ala Val Trp His Gly Phe Pro Pro Gly Ser Asn Gly 325 330 335 Asp Thr Phe Leu Lys Gly Leu Gln Val Arg Pro Ala Pro Leu Ser Ala 340 345 350 Glu Leu Gln Ala Ala Leu Ala Met Glu Pro Thr Pro Gly Gly Val Lys 355 360 365 Tyr Ile Ile Val Thr Gln Val Gly Pro Gly Pro Gln Ile Leu Asp Asp 370 375 380 Pro Cys Ala His Leu Leu Gly Pro Asp Gly Leu Pro Lys Pro Ala Ala 385 390 395 400 <210> 9 <211> 319 <212> PRT <213> Lactobacillus delbrueckii <400> 9 Met Ser Lys Thr Ala Arg Ala His Thr Asn Ile Ala Leu Ile Lys Tyr 1 5 10 15 Trp Gly Lys Lys Asp Ala Lys Leu Arg Leu Pro Leu Met Ser Ser Leu 20 25 30 Ser Met Thr Leu Asp Ala Phe Tyr Ser Asp Thr Lys Ile Ser Asp Ser 35 40 45 Glu Gln Met Ser Phe Lys Leu Asn Gly Gln Ala Val Ser Gly Pro Ala 50 55 60 Ala Asp Arg Val Phe Ala Tyr Leu Arg Ala Met Gln Asp Arg Phe Gly 65 70 75 80 Val Lys Gly Asn Leu Ala Val Glu Ser Val Asn Gln Val Pro Thr Ala 85 90 95 Ala Gly Leu Ala Ser Ser Ser Ser Ala Phe Ala Ala Met Ala Ala Ala 100 105 110 Phe Ala Asp His Tyr Gln Leu Gly Val Asp Arg Gln Glu Leu Ser Arg 115 120 125 Met Ala Arg Met Gly Ser Gly Ser Ala Ser Arg Ser Val Phe Gly Gly 130 135 140 Phe Ser Val Trp Gln Lys Gly Asp Ser Asp Gln Thr Ser Tyr Ala Tyr 145 150 155 160 Pro Leu Asp Glu Glu Pro Asp Met Asp Leu Arg Leu Leu Ala Val Glu 165 170 175 Ile Asn Asp Gln Glu Lys Lys Ile Ser Ser Thr Lys Gly Met Glu Met 180 185 190 Ser Lys Ser Ser Pro Phe Tyr Gln Val Trp Leu Asp Arg Asn Asp Ser 195 200 205 Glu Ile Lys Glu Met Glu Glu Ala Ile Lys Gln Ala Asp Phe Ser Lys 210 215 220 Leu Gly Ser Leu Ala Glu Leu Asn Ala Ser Glu Met His Thr Leu Thr 225 230 235 240 Phe Thr Ala Val Pro Gly Phe Thr Tyr Phe Glu Pro Asn Thr Ile Lys 245 250 255 Ala Ile Lys Leu Val Gln Asp Leu Arg Gln Gln Gly Leu Glu Cys Tyr 260 265 270 Tyr Thr Ile Asp Ala Gly Pro Asn Val Lys Val Leu Cys Gln Gly Lys 275 280 285 Asn Ser Lys Asp Ile Ile Asn Cys Phe Glu Ser Ser Phe Asp Arg Val 290 295 300 Lys Ile Ile Glu Ala Gly Phe Gly Pro Gly Val Thr Leu Leu Asp 305 310 315 <210> 10 <211> 317 <212> PRT <213> Streptococcus mitis (strain B6) <400> 10 Met Asp Arg Glu Pro Val Thr Val Arg Ser Tyr Ala Asn Ile Ala Ile 1 5 10 15 Ile Lys Tyr Trp Gly Lys Lys Lys Glu Lys Glu Met Val Pro Ala Thr 20 25 30 Ser Ser Ile Ser Leu Thr Leu Glu Asn Met Tyr Thr Glu Thr Thr Leu 35 40 45 Ser Ser Leu Pro Thr Asp Ala Thr Ala Asp Ala Phe Tyr Ile Asn Gly 50 55 60 Gln Leu Gln Asn Glu Ala Glu His Val Lys Met Ser Lys Ile Ile Asp 65 70 75 80 Arg Tyr Arg Pro Asp Gly Asp Gly Phe Val Arg Ile Asp Thr Gln Asn 85 90 95 Ser Met Pro Thr Ala Ala Gly Leu Ser Ser Ser Ser Ser Gly Leu Ser 100 105 110 Ala Leu Val Lys Ala Cys Asn Ala Tyr Phe Lys Leu Gly Leu Asn Arg 115 120 125 Ser Gln Leu Ala Gln Glu Ala Lys Phe Ala Ser Gly Ser Ser Ser Arg 130 135 140 Ser Phe Tyr Gly Pro Leu Gly Ala Trp Asp Lys Asp Ser Gly Glu Ile 145 150 155 160 Tyr Pro Val Glu Thr Gly Leu Lys Leu Ala Met Ile Met Leu Val Leu 165 170 175 Glu Asp Lys Lys Lys Pro Ile Ser Ser Arg Asp Gly Met Lys Leu Cys 180 185 190 Val Glu Thr Ser Thr Thr Phe Asp Asp Trp Val Arg Gln Ser Glu Lys 195 200 205 Asp Tyr Gln Asp Met Leu Val Tyr Leu Lys Ala Asn Asp Phe Ala Lys 210 215 220 Val Gly Glu Leu Thr Glu Lys Asn Ala Leu Ala Met His Ala Thr Thr 225 230 235 240 Lys Thr Ala Ser Pro Ala Phe Ser Tyr Leu Thr Asp Ala Ser Tyr Glu 245 250 255 Ala Met Asp Phe Val Arg Gln Leu Arg Glu Gln Gly Glu Ala Cys Tyr 260 265 270 Phe Thr Met Asp Ala Gly Pro Asn Val Lys Val Leu Cys Gln Glu Lys 275 280 285 Asp Leu Glu His Leu Ser Glu Ile Phe Gly Gln Arg Tyr Arg Leu Ile 290 295 300 Val Ser Lys Thr Lys Asp Leu Ser Gln Asp Gly Cys Cys 305 310 315 <210> 11 <211> 316 <212> PRT <213> Streptococcus gallolyticus UCN34 <400> 11 Met Asp Arg Lys Ile Val Thr Val Lys Ser Tyr Ala Asn Ile Ala Ile 1 5 10 15 Ile Lys Tyr Trp Gly Lys Ala Asp Ala Val Lys Met Ile Pro Ala Thr 20 25 30 Ser Ser Ile Ser Leu Thr Leu Glu Asn Met Phe Thr Thr Thr Thr Val 35 40 45 Ser Phe Leu Pro Gln Ser Val Gly His Asp Glu Phe Tyr Ile Asn Gly 50 55 60 Val Leu Gln Asp Glu Lys Glu His Ala Lys Ile Ser Ala Ile Ile Asp 65 70 75 80 Gln Tyr Arg Gly Gly Arg Ser Glu Phe Val Lys Val Glu Thr Ser Asn 85 90 95 Asn Met Pro Thr Ala Ala Gly Leu Ser Ser Ser Ser Ser Gly Leu Ser 100 105 110 Ala Leu Val Lys Ala Cys Asn Glu Leu Phe Glu Thr Gly Leu Asn Gln 115 120 125 Ser Glu Leu Ala Gln Lys Ala Lys Phe Ala Ser Gly Ser Ser Ser Arg 130 135 140 Ser Phe Phe Gly Pro Ile Ala Ala Trp Asp Lys Asp Ser Gly Asp Ile 145 150 155 160 Tyr Pro Val Gln Thr Asp Leu Lys Leu Ala Met Ile Met Leu Val Leu 165 170 175 Ser Asp Ser Lys Lys Pro Ile Ser Ser Arg Glu Gly Met Lys Arg Cys 180 185 190 Ala Glu Thr Ser Thr Thr Phe Ala Asp Trp Val Lys Gln Ser Glu Gln 195 200 205 Asp Tyr Lys Asp Met Leu Ala Tyr Leu Lys Ala Asn Asp Phe Glu Lys 210 215 220 Val Gly Glu Leu Thr Glu Arg Asn Ala Leu Ala Met His Asp Thr Asn 225 230 235 240 Thr His Ala Asn Pro Pro Phe Asn Tyr Leu Thr Asp Glu Thr Tyr Ala 245 250 255 Ala Met Asp Phe Val Lys Ser Leu Arg Thr Gln Gly Glu Lys Cys Tyr 260 265 270 Phe Thr Met Asp Ala Gly Pro Asn Val Lys Val Leu Cys Leu Glu Glu 275 280 285 Asp Leu Glu Cys Leu Thr Lys Arg Phe Glu Glu Asn Tyr Arg Val Ile 290 295 300 Ala Ser Arg Thr Lys Val Leu Pro Asp Glu Asn Asp 305 310 315 <210> 12 <211> 315 <212> PRT <213> Streptococcus sanguinis SK36 <400> 12 Met Asp Arg Lys Pro Val Ser Val Lys Ser Tyr Ala Asn Ile Ala Ile 1 5 10 15 Val Lys Tyr Trp Gly Lys Lys Asp Ala Glu Lys Met Ile Pro Ser Thr 20 25 30 Ser Ser Ile Ser Leu Thr Leu Glu Asn Met Tyr Thr Glu Thr Gln Leu 35 40 45 Ser Pro Leu Pro Asp Thr Ala Thr Gly Asp Glu Phe Tyr Ile Asp Ser 50 55 60 Gln Leu Gln Ser Pro Ala Glu His Ala Lys Ile Ser Lys Ile Ile Asp 65 70 75 80 Arg Phe Arg Ser Pro Glu Asp Gly Phe Val Arg Val Asp Thr Ser Asn 85 90 95 Asn Met Pro Thr Ala Ala Gly Leu Ser Ser Ser Ser Ser Gly Leu Ser 100 105 110 Ala Leu Val Lys Ala Cys Asn Ala Tyr Phe Gln Thr Gly Tyr Gln Thr 115 120 125 Gln Glu Leu Ala Gln Leu Ala Lys Phe Ala Ser Gly Ser Ser Ala Arg 130 135 140 Ser Phe Phe Gly Pro Leu Ala Ala Trp Asp Lys Asp Ser Gly Ala Ile 145 150 155 160 Tyr Pro Val Lys Thr Asp Leu Lys Leu Ala Met Ile Met Leu Val Leu 165 170 175 His Asp Glu Lys Lys Pro Ile Ser Ser Arg Asp Gly Met Glu Leu Cys 180 185 190 Ala Lys Thr Ser Thr Ile Phe Pro Asp Trp Ile Ala Gln Ser Ala Leu 195 200 205 Asp Tyr Lys Ala Met Leu Ser Tyr Leu Gln Asp Asn Asp Phe Ala Lys 210 215 220 Val Gly Gln Leu Thr Glu Glu Asn Ala Leu Arg Met His Ala Thr Thr 225 230 235 240 Glu Lys Ala Tyr Pro Pro Phe Ser Tyr Leu Thr Glu Glu Ser Tyr Gln 245 250 255 Ala Met Asp Ala Val Arg Lys Leu Arg Glu Gln Gly Glu Arg Cys Tyr 260 265 270 Phe Thr Met Asp Ala Gly Pro Asn Val Lys Val Leu Cys Leu Glu Glu 275 280 285 Asp Leu Asp His Leu Val Ala Ile Phe Glu Lys Asp Tyr Arg Leu Ile 290 295 300 Val Ser Lys Thr Lys Asp Leu Ser Asp Glu Asp 305 310 315 <210> 13 <211> 317 <212> PRT <213> Streptococcus sp. M143 <400> 13 Met Asp Arg Lys Pro Val Thr Val Arg Ser Tyr Ala Asn Ile Ala Ile 1 5 10 15 Ile Lys Tyr Trp Gly Lys Lys Lys Glu Lys Glu Met Val Pro Ala Thr 20 25 30 Ser Ser Ile Ser Leu Thr Leu Glu Asn Met Tyr Thr Glu Thr Thr Leu 35 40 45 Ser Pro Leu Pro Thr Asp Ala Thr Ala Asp Ala Phe Tyr Ile Asn Gly 50 55 60 Gln Leu Gln Ser Glu Ala Glu His Ala Lys Met Ser Lys Ile Ile Asp 65 70 75 80 Arg Tyr Arg Pro Ala Gly Glu Gly Phe Val Arg Ile Asp Thr Gln Asn 85 90 95 Asn Met Pro Thr Ala Ala Gly Leu Ser Ser Ser Ser Ser Gly Leu Ser 100 105 110 Ala Leu Val Lys Ala Cys Asn Ala Tyr Phe Gln Leu Gly Leu Asn Arg 115 120 125 Ser Gln Leu Ala Gln Glu Ala Lys Phe Ala Ser Gly Ser Ser Ser Arg 130 135 140 Ser Phe Tyr Gly Pro Leu Gly Ala Trp Asp Lys Asp Ser Gly Glu Ile 145 150 155 160 Tyr Pro Val Glu Thr Asp Leu Lys Leu Ala Met Ile Met Leu Val Leu 165 170 175 Glu Asp Lys Lys Lys Pro Ile Ser Ser Arg Asp Gly Met Lys Leu Cys 180 185 190 Val Glu Thr Ser Thr Thr Phe Asp Asp Trp Val Arg Gln Ser Glu Lys 195 200 205 Asp Tyr Gln Asp Met Leu Leu Tyr Leu Lys Glu Asn Asp Phe Ala Lys 210 215 220 Val Gly Glu Leu Thr Glu Lys Asn Ala Leu Ala Met His Ala Thr Thr 225 230 235 240 Lys Thr Ala Ser Pro Ala Phe Ser Tyr Leu Thr Asp Ala Ser Tyr Glu 245 250 255 Ala Met Asp Phe Val Arg Gln Leu Arg Glu Gln Gly Glu Ser Cys Tyr 260 265 270 Phe Thr Met Asp Ala Gly Pro Asn Val Lys Val Leu Cys Gln Glu Glu 275 280 285 Asp Leu Glu His Leu Ser Glu Ile Phe Gly Gln Arg Tyr Arg Leu Ile 290 295 300 Val Ser Lys Thr Lys Asp Leu Ser Gln Asp Asp Cys Cys 305 310 315 <210> 14 <211> 341 <212> PRT <213> Streptococcus suis 89/1591 <400> 14 Met Thr Lys Gln Ile Gly Ile Ala Arg Ala His Thr Asn Ile Ala Leu 1 5 10 15 Ile Lys Tyr Trp Gly Lys Arg Asp Lys Glu Leu Phe Leu Pro Met Asn 20 25 30 Ser Ser Leu Ser Leu Thr Leu Asp Ala Phe Tyr Thr Asp Thr Lys Val 35 40 45 Val Phe Asp Pro Glu Leu Thr Ala Asp Glu Phe Tyr Leu Asn Gly Met 50 55 60 Leu Gln Lys Glu Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ser Arg Phe Leu Asp Leu 65 70 75 80 Phe Cys Glu Tyr Ile Gly Glu Arg Ala Phe Ala Arg Val Glu Ser Leu 85 90 95 Asn Phe Val Pro Thr Ala Ala Gly Leu Ala Ser Ser Ala Ser Ala Phe 100 105 110 Ala Ala Leu Ala Leu Ala Thr Ala Thr Ala Leu Asp Leu Asp Leu Ser 115 120 125 Pro Ala Thr Leu Ser Thr Leu Ala Arg Arg Gly Ser Gly Ser Ser Thr 130 135 140 Arg Ser Leu Phe Gly Gly Phe Val Glu Trp Asp Met Gly Thr Gly Ser 145 150 155 160 Glu Asp Ser Met Ala His Pro Ile Asp Asp Ala Asp Trp Asp Ile Gly 165 170 175 Met Val Val Leu Ala Val Asn Thr Gly Pro Lys Lys Ile Ala Ser Arg 180 185 190 Glu Gly Met Asp His Thr Val Ala Thr Ser Pro Phe Tyr Ser Ala Trp 195 200 205 Val Asp Thr Ala Lys Gln Asp Leu Ala Asp Ile Lys Ala Ala Ile Ala 210 215 220 Gly Arg Asp Phe Glu Lys Leu Gly Gln Ile Thr Glu His Asn Gly Met 225 230 235 240 Lys Met His Ala Thr Thr Leu Ser Ala Asn Pro Pro Phe Thr Tyr Trp 245 250 255 Ser Ala Asp Ser Leu Val Ala Gln Glu Ala Val Arg Gln Val Arg Glu 260 265 270 Ala Thr Gly Leu Ser Ala Tyr Met Thr Met Asp Ala Gly Pro Asn Val 275 280 285 Lys Val Leu Cys Arg Ala Ser Gln Met Asp Glu Leu Val Ala Glu Leu 290 295 300 Ala Lys Val Phe Pro Arg Glu Lys Ile Ile Thr Ser Lys Pro Gly Pro 305 310 315 320 Ala Ala Tyr Val Leu Ser Glu Asp Glu Trp Gln Thr Ser Gln Ala Ala 325 330 335 Phe Glu Lys Gly Leu 340 <210> 15 <211> 314 <212> PRT <213> Streptococcus salivarius SK126 <400> 15 Met Asp Arg Lys Pro Val Ser Val Lys Ser Tyr Ala Asn Ile Ala Ile 1 5 10 15 Val Lys Tyr Trp Gly Lys Ala Asp Ala Glu Arg Met Ile Pro Ser Thr 20 25 30 Ser Ser Ile Ser Leu Thr Leu Glu Asn Met Tyr Thr Glu Thr Lys Leu 35 40 45 Ser Phe Leu Pro Glu Asp Ala Thr Gly Asp Val Met Tyr Ile Asp Asp 50 55 60 Glu Leu Gln Gly Glu Lys Glu Thr Thr Lys Ala Ser Lys Val Leu Asp 65 70 75 80 Leu Phe Arg Asn Asn Ser Asn Gln His Val Lys Ile Glu Thr Trp Asn 85 90 95 Asn Met Pro Thr Ala Ala Gly Leu Ser Ser Ser Ser Ser Gly Leu Ser 100 105 110 Ala Leu Val Lys Ala Ala Asn Glu Leu Phe Gln Val Gly Lys Thr Gln 115 120 125 Ser Glu Leu Ala Gln Ile Ala Lys Phe Ala Ser Gly Ser Ser Ser Arg 130 135 140 Ser Phe Phe Gly Pro Leu Ala Ala Trp Asp Lys Asp Ser Gly Glu Val 145 150 155 160 Tyr Pro Val Glu Thr Asp Leu Lys Leu Ala Met Ile Met Leu Val Leu 165 170 175 Thr Asp Gln Lys Lys Pro Val Ser Ser Arg Asp Gly Met Lys Leu Cys 180 185 190 Thr Glu Thr Ser Thr Ser Phe Pro Glu Trp Ile Lys Gln Ser Glu Leu 195 200 205 Asp Tyr Lys Asp Met Leu Ala Tyr Leu Lys Ala Asn Asp Phe Gln Ala 210 215 220 Val Gly Glu Leu Thr Glu Ala Asn Ala Leu Arg Met His Gln Thr Thr 225 230 235 240 Ser Thr Ala Asn Pro Pro Phe Ser Tyr Leu Thr Glu Ala Ser Tyr Gln 245 250 255 Ala Met Asp Lys Val Lys Ala Leu Arg Ala Ser Gly Glu Gln Cys Tyr 260 265 270 Phe Thr Met Asp Ala Gly Pro Asn Val Lys Val Leu Cys Leu Glu Glu 275 280 285 Asp Leu Asp Arg Leu Ala Glu His Phe Arg Lys Asp Tyr Gln Val Ile 290 295 300 Val Ser Arg Thr Lys Glu Leu Pro Asp Ala 305 310

Claims (19)

  1. 하기 효소에 의한 3-히드록시알카노에이트의 알켄으로의 전환을 포함하는 것을 특징으로 하는 알켄의 제조 방법:
    (i) 3-히드록시알카노에이트를 상응하는 3-포스포녹시알카노에이트로 전환하는 활성을 갖는 제1 효소; 및
    (ii) 상기 제1 효소와 다르며, 상기 3-포스포녹시알카노에이트를 상기 알켄으로 전환하는 활성을 갖는 제2 효소.
  2. 제1항에 있어서, 상기 3-히드록시알카노에이트를 상기 상응하는 3-포스포녹시알카노에이트로 전환하는 활성을 갖는 제1 효소 (i)은 하기 (A) 내지 (D)로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법:
    (A) 서열번호 1로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 서열번호 1로 나타내어지는 아미노산 서열과 적어도 15% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 적어도 서열번호 1로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 상응하는 활성만큼 높은, 상기 3-히드록시알카노에이트를 상기 상응하는 3-포스포녹시알카노에이트로 전환하는 활성을 나타내는 단백질;
    (B) 서열번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 서열번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열과 적어도 15% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 적어도 서열번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 상응하는 활성만큼 높은, 상기 3-히드록시알카노에이트를 상기 상응하는 3-포스포녹시알카노에이트로 전환하는 활성을 나타내는 단백질;
    (C) 서열번호 3으로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 서열번호 3으로 나타내어지는 아미노산 서열과 적어도 15% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 적어도 서열번호 3으로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 상응하는 활성만큼 높은, 상기 3-히드록시알카노에이트를 상기 상응하는 3-포스포녹시알카노에이트로 전환하는 활성을 나타내는 단백질; 및
    (D) 서열번호 4로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 서열번호 4로 나타내어지는 아미노산 서열과 적어도 15% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 적어도 서열번호 4로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 상응하는 활성만큼 높은, 상기 3-히드록시알카노에이트를 상기 상응하는 3-포스포녹시알카노에이트로 전환하는 활성을 나타내는 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 3-포스포녹시알카노에이트를 알켄으로 전환하는 활성을 갖는 제2 효소 (ii)는 하기 (a) 내지 (k)로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법:
    (a) 서열번호 5로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 서열번호 5로 나타내어지는 아미노산 서열과 적어도 15% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 적어도 서열번호 5로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 상응하는 활성만큼 높은, 상기 3-포스포녹시알카노에이트를 상기 알켄으로 전환하는 활성을 나타내는 단백질;
    (b) 서열번호 6으로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 서열번호 6으로 나타내어지는 아미노산 서열과 적어도 15% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 적어도 서열번호 6으로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 상응하는 활성만큼 높은, 상기 3-포스포녹시알카노에이트를 상기 알켄으로 전환하는 활성을 나타내는 단백질;
    (c) 서열번호 7로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 서열번호 7로 나타내어지는 아미노산 서열과 적어도 15% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 적어도 서열번호 7로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 상응하는 활성만큼 높은, 상기 3-포스포녹시알카노에이트를 상기 알켄으로 전환하는 활성을 나타내는 단백질;
    (d) 서열번호 8로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 서열번호 8로 나타내어지는 아미노산 서열과 적어도 15% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 적어도 서열번호 8로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 상응하는 활성만큼 높은, 상기 3-포스포녹시알카노에이트를 상기 알켄으로 전환하는 활성을 나타내는 단백질;
    (e) 서열번호 9로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 서열번호 9로 나타내어지는 아미노산 서열과 적어도 15% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 적어도 서열번호 9로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 상응하는 활성만큼 높은, 상기 3-포스포녹시알카노에이트를 상기 알켄으로 전환하는 활성을 나타내는 단백질;
    (f) 서열번호 10으로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 서열번호 10으로 나타내어지는 아미노산 서열과 적어도 15% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 적어도 서열번호 10으로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 상응하는 활성만큼 높은, 상기 3-포스포녹시알카노에이트를 상기 알켄으로 전환하는 활성을 나타내는 단백질;
    (g) 서열번호 11로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 서열번호 11로 나타내어지는 아미노산 서열과 적어도 15% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 적어도 서열번호 11로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 상응하는 활성만큼 높은, 상기 3-포스포녹시알카노에이트를 상기 알켄으로 전환하는 활성을 나타내는 단백질;
    (h) 서열번호 12로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 서열번호 12로 나타내어지는 아미노산 서열과 적어도 15% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 적어도 서열번호 12로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 상응하는 활성만큼 높은, 상기 3-포스포녹시알카노에이트를 상기 알켄으로 전환하는 활성을 나타내는 단백질;
    (i) 서열번호 13으로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 서열번호 13으로 나타내어지는 아미노산 서열과 적어도 15% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 적어도 서열번호 13으로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 상응하는 활성만큼 높은, 상기 3-포스포녹시알카노에이트를 상기 알켄으로 전환하는 활성을 나타내는 단백질;
    (j) 서열번호 14로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 서열번호 14로 나타내어지는 아미노산 서열과 적어도 15% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 적어도 서열번호 14로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 상응하는 활성만큼 높은, 상기 3-포스포녹시알카노에이트를 상기 알켄으로 전환하는 활성을 나타내는 단백질; 및
    (k) 서열번호 15로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 서열번호 15로 나타내어지는 아미노산 서열과 적어도 15% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 적어도 서열번호 15로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 상응하는 활성만큼 높은, 상기 3-포스포녹시알카노에이트를 상기 알켄으로 전환하는 활성을 나타내는 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 3-히드록시프로피오네이트를 에틸렌으로 전환하는 단계를 포함하는, 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 3-히드록시부티레이트를 프로필렌으로 전환하는 단계를 포함하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 3-히드록시발레르에이트를 1-부틸렌으로 전환하는 단계를 포함하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 3-히드록시-3-메틸부티레이트를 이소부틸렌으로 전환하는 단계를 포함하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 3-히드록시-3-메틸발레르에이트를 이소아밀렌으로 전환하는 단계를 포함하는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전환 단계는 세포가 없는(cell-free) 계 내에서의, 시험관 내에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 제1항의 (i) 및 (ii)에 정의된 바와 같은 상기 효소를 생산하는 미생물의 존재 하에 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항의 (i) 및 (ii)에 정의된 바와 같은 상기 효소를 생산하는 다세포 생물의 사용을 특징으로 하는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 반응으로부터 탈기되는 기체 알켄을 수집하는 단계를 포함하는, 방법.
  13. 하나의 효소는 하기 (i)로부터 선택되고 다른 효소는 하기 (ii)로부터 선택되며, 여기에서 (i) 및 (ii)는 하기와 같은, 적어도 2종의 효소를 생산하는 다세포 생물 또는 미생물:
    (i) 상기 3-히드록시알카노에이트를 상기 상응하는 3-포스포녹시알카노에이트로 전환하는 활성을 갖는 제1 효소; 및
    (ii) 상기 제1 효소와 다르며, 상기 3-포스포녹시알카노에이트를 상기 알켄으로 전환하는 활성을 갖는 제2 효소.
  14. 제13항의 미생물, 적합한 배양 배지, 및 3-히드록시알카노에이트 화합물 또는 상기 미생물에 의하여 3-히드록시알카노에이트 화합물로 전환될 수 있는 탄소원을 포함하는 조성물.
  15. 하나의 효소는 하기 (i)로부터 선택되고 다른 효소는 하기 (ii)로부터 선택되며, 여기에서 (i) 및 (ii)는 하기와 같은, 적어도 2종의 효소의 조합, 또는 제13항의 미생물, 또는 제14항의 조성물의 3-히드록시알카노에이트로부터 알켄 화합물을 제조하기 위한 사용:
    (i) 상기 3-히드록시알카노에이트를 상기 상응하는 3-포스포녹시알카노에이트로 전환하는 활성을 갖는 제1 효소; 및
    (ii) 상기 제1 효소와 다르며, 상기 3-포스포녹시알카노에이트를 상기 알켄으로 전환하는 활성을 갖는 제2 효소.
  16. 제14항에 있어서, 3-히드록시알카노에이트를 상응하는 3-포스포녹시알카노에이트로 전환하는 활성을 갖는 제1 효소 (i)은 하기 (A) 내지 (D)로 이루어진 군으로부터 선택되는 사용:
    (A) 서열번호 1로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 서열번호 1로 나타내어지는 아미노산 서열과 적어도 15% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 적어도 서열번호 1로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 상응하는 활성만큼 높은, 상기 3-히드록시알카노에이트를 상기 상응하는 3-포스포녹시알카노에이트로 전환하는 활성을 나타내는 단백질;
    (B) 서열번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 서열번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열과 적어도 15% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 적어도 서열번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 상응하는 활성만큼 높은, 상기 3-히드록시알카노에이트를 상기 상응하는 3-포스포녹시알카노에이트로 전환하는 활성을 나타내는 단백질;
    (C) 서열번호 3으로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 서열번호 3으로 나타내어지는 아미노산 서열과 적어도 15% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 적어도 서열번호 3으로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 상응하는 활성만큼 높은, 상기 3-히드록시알카노에이트를 상기 상응하는 3-포스포녹시알카노에이트로 전환하는 활성을 나타내는 단백질; 및
    (D) 서열번호 4로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 서열번호 4로 나타내어지는 아미노산 서열과 적어도 15% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 적어도 서열번호 4로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 상응하는 활성만큼 높은, 상기 3-히드록시알카노에이트를 상기 상응하는 3-포스포녹시알카노에이트로 전환하는 활성을 나타내는 단백질.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 3-포스포녹시알카노에이트를 알켄으로 전환하는 활성을 갖는 제2 효소 (ii)는 하기 (a) 내지 (k)로 이루어진 군으로부터 선택되는 사용:
    (a) 서열번호 5로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 서열번호 5로 나타내어지는 아미노산 서열과 적어도 15% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 적어도 서열번호 5로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 상응하는 활성만큼 높은, 상기 3-포스포녹시알카노에이트를 상기 알켄으로 전환하는 활성을 나타내는 단백질;
    (b) 서열번호 6으로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 서열번호 6으로 나타내어지는 아미노산 서열과 적어도 15% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 적어도 서열번호 6으로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 상응하는 활성만큼 높은, 상기 3-포스포녹시알카노에이트를 상기 알켄으로 전환하는 활성을 나타내는 단백질;
    (c) 서열번호 7로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 서열번호 7로 나타내어지는 아미노산 서열과 적어도 15% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 적어도 서열번호 7로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 상응하는 활성만큼 높은, 상기 3-포스포녹시알카노에이트를 상기 알켄으로 전환하는 활성을 나타내는 단백질;
    (d) 서열번호 8로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 서열번호 8로 나타내어지는 아미노산 서열과 적어도 15% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 적어도 서열번호 8로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 상응하는 활성만큼 높은, 상기 3-포스포녹시알카노에이트를 상기 알켄으로 전환하는 활성을 나타내는 단백질;
    (e) 서열번호 9로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 서열번호 9로 나타내어지는 아미노산 서열과 적어도 15% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 적어도 서열번호 9로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 상응하는 활성만큼 높은, 상기 3-포스포녹시알카노에이트를 상기 알켄으로 전환하는 활성을 나타내는 단백질;
    (f) 서열번호 10으로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 서열번호 10으로 나타내어지는 아미노산 서열과 적어도 15% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 적어도 서열번호 10으로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 상응하는 활성만큼 높은, 상기 3-포스포녹시알카노에이트를 상기 알켄으로 전환하는 활성을 나타내는 단백질;
    (g) 서열번호 11로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 서열번호 11로 나타내어지는 아미노산 서열과 적어도 15% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 적어도 서열번호 11로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 상응하는 활성만큼 높은, 상기 3-포스포녹시알카노에이트를 상기 알켄으로 전환하는 활성을 나타내는 단백질;
    (h) 서열번호 12로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 서열번호 12로 나타내어지는 아미노산 서열과 적어도 15% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 적어도 서열번호 12로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 상응하는 활성만큼 높은, 상기 3-포스포녹시알카노에이트를 상기 알켄으로 전환하는 활성을 나타내는 단백질;
    (i) 서열번호 13으로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 서열번호 13으로 나타내어지는 아미노산 서열과 적어도 15% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 적어도 서열번호 13으로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 상응하는 활성만큼 높은, 상기 3-포스포녹시알카노에이트를 상기 알켄으로 전환하는 활성을 나타내는 단백질;
    (j) 서열번호 14로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 서열번호 14로 나타내어지는 아미노산 서열과 적어도 15% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 적어도 서열번호 14로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 상응하는 활성만큼 높은, 상기 3-포스포녹시알카노에이트를 상기 알켄으로 전환하는 활성을 나타내는 단백질; 및
    (k) 서열번호 15로 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 서열번호 15로 나타내어지는 아미노산 서열과 적어도 15% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 적어도 서열번호 15로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 상응하는 활성만큼 높은, 상기 3-포스포녹시알카노에이트를 상기 알켄으로 전환하는 활성을 나타내는 단백질.
  18. 디카르복실화 및 디포스포릴화에 의한 전환을 촉매할 수 있는 효소의 사용으로 상기 3-포스포녹시알카노에이트를 상기 상응하는 알켄으로 효소적으로 전환하는 단계를 포함하는 알켄의 제조 방법.
  19. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항, 또는 제18항에 있어서, 상기 방법은 보조-기질로서 ATP, dATP, ADP, AMP, 또는 ATP 이외의 NTP, dNTP 또는 피로포스페이트를 사용하여 수행되는, 방법.
KR1020137010140A 2010-10-19 2011-10-18 3-히드록시알카노산의 조합된 효소적 전환에 의한 알켄의 제조 KR101883511B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP10188001 2010-10-19
EP10188001.1 2010-10-19
PCT/EP2011/068174 WO2012052427A1 (en) 2010-10-19 2011-10-18 Production of alkenes by combined enzymatic conversion of 3-hydroxyalkanoic acids

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20140023250A true KR20140023250A (ko) 2014-02-26
KR101883511B1 KR101883511B1 (ko) 2018-07-30

Family

ID=43734239

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020137010140A KR101883511B1 (ko) 2010-10-19 2011-10-18 3-히드록시알카노산의 조합된 효소적 전환에 의한 알켄의 제조

Country Status (19)

Country Link
US (2) US9193978B2 (ko)
EP (1) EP2630236B1 (ko)
JP (1) JP6148619B2 (ko)
KR (1) KR101883511B1 (ko)
CN (1) CN103261410B (ko)
AU (1) AU2011317682B2 (ko)
BR (1) BR112013009078A2 (ko)
CA (1) CA2813868A1 (ko)
CO (1) CO6731070A2 (ko)
ES (1) ES2739248T3 (ko)
GT (1) GT201300099A (ko)
IL (1) IL225549A (ko)
MX (1) MX353884B (ko)
MY (1) MY156446A (ko)
PE (1) PE20140009A1 (ko)
PL (1) PL2630236T3 (ko)
RU (1) RU2609656C2 (ko)
SG (1) SG189185A1 (ko)
WO (1) WO2012052427A1 (ko)

Families Citing this family (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101883511B1 (ko) * 2010-10-19 2018-07-30 글로벌 바이오에너지스 3-히드록시알카노산의 조합된 효소적 전환에 의한 알켄의 제조
CN107254492A (zh) 2011-06-17 2017-10-17 英威达技术有限责任公司 产生1,3‑丁二烯的方法
US9422578B2 (en) 2011-06-17 2016-08-23 Invista North America S.A.R.L. Methods for biosynthesizing 1,3 butadiene
US9873895B2 (en) 2011-12-20 2018-01-23 Scientist Of Fortune S.A. Production of 1,3-dienes by enzymatic conversion of 3-hydroxyalk 4-enoates and/or 3-phosphonoxyalk-4-enoates
DE102012105876A1 (de) 2012-07-02 2014-01-02 Oxea Gmbh Verfahren zur Herstellung von Terephthalsäure und ihren Derivaten
DE102012105879A1 (de) 2012-07-02 2014-01-02 Oxea Gmbh Verfahren zur Herstellung von Isononylderivaten
DE102012105874A1 (de) 2012-07-02 2014-01-02 Oxea Gmbh Verfahren zur Herstellung von Isononansäurevinylestern
DE102012105878A1 (de) 2012-07-02 2014-01-02 Oxea Gmbh Verfahren zur Herstellung von Isopentanderivaten
DE102012105877A1 (de) 2012-07-02 2014-01-02 Oxea Gmbh Verfahren zur Herstellung von Diisobuten
EP2912184B1 (en) * 2012-10-25 2017-01-18 Scientist of Fortune S.A. Production of alkenes from 3-hydroxy-1-carboxylic acids via 3-sulfonyloxy-1-carboxylic acids
US9777295B2 (en) 2012-11-28 2017-10-03 Invista North America S.A.R.L. Methods for biosynthesis of isobutene
EP2929036A1 (en) 2012-12-07 2015-10-14 Global Bioenergies Fermentative production of a hydrocarbon
EP2929037B1 (en) 2012-12-07 2020-09-09 Global Bioenergies Improved fermentation method
WO2015004211A2 (en) * 2013-07-09 2015-01-15 Global Bioenergies Mevalonate diphosphate decarboxylase variants
US10294496B2 (en) 2013-07-19 2019-05-21 Invista North America S.A.R.L. Methods for biosynthesizing 1,3 butadiene
WO2015021059A1 (en) 2013-08-05 2015-02-12 INVISTA North America S.á r.l. Methods for biosynthesis of isobutene
WO2015021045A2 (en) 2013-08-05 2015-02-12 INVISTA North America S.á r.l. Methods for biosynthesis of isoprene
US9920339B2 (en) 2014-06-16 2018-03-20 Invista North America S.A.R.L. Methods, reagents and cells for biosynthesizing compounds
WO2017017124A1 (en) 2015-07-28 2017-02-02 Global Bioenergies Hiv kinase variants
US11162115B2 (en) 2017-06-30 2021-11-02 Inv Nylon Chemicals Americas, Llc Methods, synthetic hosts and reagents for the biosynthesis of hydrocarbons
US11634733B2 (en) 2017-06-30 2023-04-25 Inv Nylon Chemicals Americas, Llc Methods, materials, synthetic hosts and reagents for the biosynthesis of hydrocarbons and derivatives thereof
US11505809B2 (en) 2017-09-28 2022-11-22 Inv Nylon Chemicals Americas Llc Organisms and biosynthetic processes for hydrocarbon synthesis
EP3502216A1 (en) 2017-12-21 2019-06-26 Global Bioenergies Gasoline composition enabling reduced particulate emissions
PL3765536T3 (pl) 2018-03-16 2022-06-13 Fina Technology, Inc. Kompozycja polimerowa i zastosowanie do wytwarzania kleju oraz wyrób ją zawierający
US11834384B2 (en) 2018-03-16 2023-12-05 Total Marketing Services Preparation of olefin by alcohol dehydration, and uses thereof for making polymer, fuel or fuel additive
BR112021000598A2 (pt) 2018-07-27 2021-04-13 Global Bioenergies Método para produzir frutose-6-fosfato, micro-organismo recombinante, combinação de enzimas, composição e uso do micro-organismo
CN109251940B (zh) * 2018-10-30 2020-10-16 浙江华睿生物技术有限公司 一种产β-羟基-β-甲基丁酸工程菌的构建方法
CN113710798A (zh) 2019-02-20 2021-11-26 布拉斯科公司 戊糖和己糖的降解途径
CN113710807A (zh) 2019-02-20 2021-11-26 布拉斯科公司 用于由己糖生产含氧化合物的微生物和方法
BR112021018090A2 (pt) 2019-03-20 2021-11-23 Global Bioenergies Organismo ou micro-organismo recombinante, uso do organismo ou micro-organismo recombinante e método para a produção de isobuteno
FR3099929B1 (fr) 2019-08-16 2024-02-16 Global Bioenergies Composés estérifiés ou éthérifiés, leurs procédés de préparation et leurs utilisations
FR3108606A1 (fr) 2020-03-27 2021-10-01 Global Bioenergies Oléfines ramifiées et leur procédé de préparation
FR3099931B1 (fr) 2019-08-16 2021-11-12 Global Bioenergies Alcanes ramifiés et fonctionnalisés et leur procédé de préparation
EP4013736A1 (fr) 2019-08-16 2022-06-22 L'oreal Alcanes ramifiés et leur procédé de préparation
FR3099928B1 (fr) 2019-08-16 2021-07-30 Global Bioenergies Alcanes ramifiés et leur procédé de préparation
FR3099930A1 (fr) 2019-08-16 2021-02-19 Global Bioenergies Composes carbonyles, leurs procedes de preparation et leurs utilisations
EP3792234A1 (en) 2019-09-16 2021-03-17 Total Raffinage Chimie Method for the preparation of 2-methyl-but-2-ene
WO2021063958A1 (en) 2019-09-30 2021-04-08 Global Bioenergies Improved means and methods for increasing the yield of acetyl-coa from glucose
FR3108608A1 (fr) 2020-03-27 2021-10-01 Global Bioenergies Oléfines ramifiées fonctionnalisées et leur procédé de préparation
FR3110081B1 (fr) 2020-05-14 2022-09-09 Global Bioenergies Composition cosmétique à base d’isododécane biosourcé et son procédé de préparation
FR3112477B1 (fr) 2020-07-15 2022-08-26 Global Bioenergies Composition cosmétique à base d’isododécane présentant une teneur élévée en 2,2,4,6,6-pentaméthylheptane
FR3115988A1 (fr) 2020-11-06 2022-05-13 Global Bioenergies Composition de maquillage à base d’isododécane biosourcé et son procédé de préparation
CA3193412A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 Claude Bensoussan Improved means and methods for producing isobutene from 3-methylcrotonic acid
WO2022171871A1 (fr) 2021-02-15 2022-08-18 Global Bioenergies Alkylphénols, leurs procédés de préparation et leurs utilisations
WO2022171887A1 (fr) 2021-02-15 2022-08-18 Global Bioenergies Alkyl(thio)phénols substitués, leurs procédés de préparation et leurs utilisations
WO2023031482A1 (en) 2021-09-06 2023-03-09 Global Bioenergies Organisms producing less crotonic acid
EP4144838A1 (en) 2021-09-06 2023-03-08 Global Bioenergies Organisms producing less crotonic acid

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20000022126A (ko) * 1996-06-27 2000-04-25 윌리암 엘. 레스페스 안드로겐 수용체 변조제 화합물 및 방법
JP2007528371A (ja) * 2004-02-09 2007-10-11 ジョージ・イナナ 網膜疾患を検出し処置するための方法および組成物
WO2010001078A2 (fr) * 2008-07-04 2010-01-07 Philippe Marliere Production d'alcenes par decarboxylation enzymatique d'acides 3-hydroxy-alcanoïques
KR20110104952A (ko) * 2008-12-12 2011-09-23 셀렉시온, 엘엘씨 알파 케토산으로부터의 이관능성 알칸의 생물학적 합성법

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6192579A (ja) 1984-10-09 1986-05-10 Hideo Fukuda 炭化水素混合物の製造法
JPH067798B2 (ja) 1985-06-06 1994-02-02 秀雄 福田 微生物によるエチレンの製造法
KR100704072B1 (ko) 2001-06-06 2007-04-05 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. 개선된 이소프레노이드 제조 방법
JP5074185B2 (ja) 2004-08-19 2012-11-14 ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． イソプレノイドの生成
RU2281316C1 (ru) * 2005-05-05 2006-08-10 Вадим Алексеевич Меньщиков Способ получения этилена
KR101883511B1 (ko) * 2010-10-19 2018-07-30 글로벌 바이오에너지스 3-히드록시알카노산의 조합된 효소적 전환에 의한 알켄의 제조

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20000022126A (ko) * 1996-06-27 2000-04-25 윌리암 엘. 레스페스 안드로겐 수용체 변조제 화합물 및 방법
JP2007528371A (ja) * 2004-02-09 2007-10-11 ジョージ・イナナ 網膜疾患を検出し処置するための方法および組成物
WO2010001078A2 (fr) * 2008-07-04 2010-01-07 Philippe Marliere Production d'alcenes par decarboxylation enzymatique d'acides 3-hydroxy-alcanoïques
KR20110104952A (ko) * 2008-12-12 2011-09-23 셀렉시온, 엘엘씨 알파 케토산으로부터의 이관능성 알칸의 생물학적 합성법

Also Published As

Publication number Publication date
SG189185A1 (en) 2013-05-31
PL2630236T3 (pl) 2020-03-31
IL225549A0 (en) 2013-06-27
RU2013122680A (ru) 2014-11-27
IL225549A (en) 2017-02-28
JP6148619B2 (ja) 2017-06-14
CO6731070A2 (es) 2013-08-15
EP2630236A1 (en) 2013-08-28
CA2813868A1 (en) 2012-04-26
CN103261410A (zh) 2013-08-21
GT201300099A (es) 2014-11-24
BR112013009078A2 (pt) 2016-07-19
AU2011317682B2 (en) 2015-01-22
WO2012052427A1 (en) 2012-04-26
US20160032326A1 (en) 2016-02-04
EP2630236B1 (en) 2019-06-26
CN103261410B (zh) 2018-05-11
US9193978B2 (en) 2015-11-24
US20130316425A1 (en) 2013-11-28
MX2013004431A (es) 2014-04-14
MY156446A (en) 2016-02-26
PE20140009A1 (es) 2014-01-18
MX353884B (es) 2018-02-01
JP2014501495A (ja) 2014-01-23
RU2609656C2 (ru) 2017-02-02
KR101883511B1 (ko) 2018-07-30
ES2739248T3 (es) 2020-01-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101883511B1 (ko) 3-히드록시알카노산의 조합된 효소적 전환에 의한 알켄의 제조
US9909146B2 (en) Production of alkenes by enzymatic decarboxylation of 3-hydroxyalkanoic acids
AU2011317682A1 (en) Production of alkenes by combined enzymatic conversion of 3-hydroxyalkanoic acids
JP6513022B2 (ja) 軽質アルケノールの酵素的脱水による揮発性ジエンの製造
EP2336341A1 (en) Method for producing an alkene comprising the step of converting an alcohol by an enzymatic dehydration step
US20110045563A1 (en) Short chain volatile isoprene hydrocarbon production using the mevalonic acid pathway in genetically engineered yeast and fungi
US9873895B2 (en) Production of 1,3-dienes by enzymatic conversion of 3-hydroxyalk 4-enoates and/or 3-phosphonoxyalk-4-enoates
CN109477082A (zh) 3-甲基巴豆酸脱羧酶(mdc)变体
CN105940111B (zh) 从3-羟基羧酸经3-羟基羧基-核苷酸制备烯烃
BRPI0914215B1 (pt) Produção de alcenos por descarboxilação enzimática de ácidos 3-hidróxi-alcanoicos

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant