CN116601301A - 用于从3-甲基巴豆酸产生异丁烯的改进装置和方法 - Google Patents
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Abstract
一种从碳源产生异丁烯的方法，其特征在于，所述方法包含：(a)在液体培养基中培养能够从碳源产生3‑甲基巴豆酸的微生物，从而产生3‑甲基巴豆酸，使其在液体培养基中积累；和(b)通过以下方式将步骤(a)中获得的液体培养基中含有的3‑甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯：(i)将表达与FMN异戊二烯基转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶的微生物与步骤(a)中获得的含有3‑甲基巴豆酸的液体培养基进行温育；和/或(ii)将与FMN异戊二烯基转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶与步骤(a)中获得的含有3‑甲基巴豆酸的液体培养基进行温育；从而产生所述异丁烯；和(c)回收所产生的异丁烯。
Description
本发明涉及一种从碳源产生异丁烯的方法，其特征在于，所述方法包含：(a)在液体培养基中培养能够从碳源产生3-甲基巴豆酸的微生物，从而产生所述3-甲基巴豆酸，使其在液体培养基中积累；和(b)通过以下方式将步骤(a)中获得的液体培养基中含有的所述3-甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯：(i)将表达与FMN异戊二烯基转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶的微生物与步骤(a)中获得的含有3-甲基巴豆酸的液体培养基进行温育；和/或(ii)将与FMN异戊二烯基转移酶(prenyl transferase)相关的FMN依赖性脱羧酶与步骤(a)中获得的含有3-甲基巴豆酸的液体培养基进行温育；从而产生异丁烯；和(c)回收所产生的异丁烯。
目前，大量化学化合物源自石化产品。烯烃(例如乙烯、丙烯、不同的丁烯或戊烯)用于塑料工业中，例如用于生产聚丙烯或聚乙烯，以及用于化学工业的其他领域和燃料领域。丁烯以四种形式存在，其中之一为异丁烯(也称为异丁基烯)，其进入甲基叔丁基醚(MTBE，用于汽车燃料的抗爆添加剂)的组合物中。异丁烯还可用于生产异辛烯，异辛烯又可被还原成异辛烷(2,2,4-三甲基戊烷)；异辛烷的极高辛烷值使其成为所谓的“汽油”发动机的最佳燃料。诸如异丁烯之类的烯烃目前通过石油产品的催化裂化(或在己烯的情况下，由煤或天然气的费-托(Fischer-Tropsch)工艺的衍生物)生产。因此，生产成本与油价密切相关。此外，催化裂化有时与相当大的技术困难有关，这增加了工艺复杂性及生产成本。
在与地球化学循环协调的可持续工业操作的背景下，需要通过生物途径生产烯烃，诸如异丁烯。第一代生物燃料包括乙醇的发酵生产，而发酵和蒸馏工艺已经存在于食品加工工业中。第二代生物燃料的生产处于探索阶段，特别包括长链醇(丁醇和戊醇)、萜烯、直链烷烃和脂肪酸的生产。最近的两篇综述提供了该领域研究的概述：Ladygina等(Process Biochemistry 41(2006),1001)和Wackett(Current Opinions in ChemicalBiology 21(2008),187)。
已经描述了酵母小红酵母(Rhodotorula minuta)将异戊酸酯转化成异丁烯(Fujii等人(Appl.Environ.Microbiol.54(1988),583))。
Gogerty等(Appl.Environm.Microbiol.76(2010),8004-8010)和van Leeuwen等(Appl.Microbiol.Biotechnol.93(2012),1377-1387)描述了通过酶促转化从乙酰乙酰辅酶A产生异丁烯，其中所提出的途径的最后一步是通过利用甲羟戊酸二磷酸脱羧酶转化3-羟基-3-甲基丁酸(也称为3-羟基异戊酸(HIV))。WO 2010/001078中也描述了这种由3-羟基-3-甲基丁酸产生异丁烯的反应，其概括地描述了通过生物过程产生烯烃的方法，特别是从3-羟基链烷酸酯类型的分子产生末端烯烃(特别是丙烯、乙烯、1-丁烯、异丁烯或异戊烯)的方法。
WO 2012/052427还描述了一种通过生物过程产生烯烃的方法，同时特别描述了从3-羟基链烷酸酯类型的分子产生烯烃(例如丙烯、乙烯、1-丁烯、异丁烯或异戊烯)的方法。在该内容中，从3-羟基-3-甲基丁酸产生异丁烯的反应也描述于WO 2012/052427中。
WO 2016/042012描述了用于制备所述3-羟基-3-甲基丁酸的方法。特别地，WO2016/042012描述了用于产生3-羟基-3-甲基丁酸的方法，其包含将3-甲基巴豆酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酸的步骤以及将由此产生的3-甲基巴豆酸进一步酶促转化成3-羟基-3-甲基丁酸的步骤。
在Gogerty等(在上述引文中)和van Leeuwen等(在上述引文中)中，提出经由3-羟基-3-甲基丁酰辅酶A转化3-甲基巴豆酰辅酶A来实现产生3-羟基-3-甲基丁酸。为了进一步提高从可再生资源产生异丁烯的方法的效率和可变性，已通过提供用于产生异丁烯的方法来研发用于提供异丁烯及其前体的替代途径，包含将3-甲基巴豆酸(也称为3-甲基-2-丁烯酸、3,3-二甲基丙烯酸或异戊烯酸)酶促转化成异丁烯。
特别地，在WO 2017/085167中，已经描述了用于产生异丁烯的方法，其包含将3-甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯，其中通过利用与FMN异戊二烯基转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶来实现将3-甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯，其中所述FMN异戊二烯基转移酶催化利用二甲基烯丙基磷酸酯(DMAP)将黄素辅因子(FMN或FAD)异戊二烯化成黄素衍生的辅因子，而这些酶已被人为地用于最终导致异丁烯产生的途径中。此外，在WO 2017/085167中，已经描述了方法，其中此类方法进一步包含(a)通过将3-甲基巴豆酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酸来提供3-甲基巴豆酸，或(b)通过将3-羟基异戊酸(HIV)酶促转化成3-甲基巴豆酸来提供3-甲基巴豆酸。
WO 2017/085167还描述了这种为从3-甲基巴豆酰辅酶A经由3-甲基巴豆酸或从3-羟基异戊酸(HIV)经由3-甲基巴豆酸产生异丁烯而开发的方法，其可以被嵌入到用于从乙酰辅酶A开始产生异丁烯的途径中，乙酰辅酶A是在多种生化反应中使用的代谢中的中心组分和重要关键分子。图1中示意性地示出了相应的反应。
在WO 2018/206262中，描述了当使用二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAPP)代替DMAP时，通过利用与FMN异戊二烯基转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶将3-甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯。
此外，WO 2018/206262描述了通过利用与FMN异戊二烯基转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶将3-甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯，其中所述FMN异戊二烯基转移酶利用二甲基烯丙基磷酸酯(DMAP)和/或二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAPP)催化黄素辅因子(FMN或FAD)异戊烯化成黄素衍生的辅因子，其是上述从乙酰辅酶A到异丁烯的总体代谢途径的关键步骤。已经发现，在该关键步骤中，二甲基烯丙基磷酸酯(DMAP)和/或二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAPP)的可用性以及黄素辅因子FMN的可用性是限制因素，而在WO 2018/206262中，描述了改进的方法，其通过增加二甲基烯丙基磷酸酯(DMAP)和/或二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAPP)的含量(pool)/量以确保异戊烯化黄素辅因子(FMN或FAD)的有效生物合成。
此外，WO 2020/188033基于通过在用于异丁烯产生的细胞中提供和维持高含量的乙酰辅酶A来增加异丁烯产率的概念，其中通过确保细胞对泛酸的摄取增加和/或泛酸向辅酶A的转化增加来保持高乙酰辅酶A含量。因此，WO 2020/188033尤其描述了一种能够将乙酰辅酶A酶促转化成异丁烯的重组生物体或微生物，(A)其中在所述生物体或微生物中：(i)将乙酰辅酶A酶促转化成乙酰乙酰辅酶A，(ii)将乙酰乙酰辅酶A酶促转化成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A，(iii)将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A酶促转化成3-甲基戊烯二酰辅酶A，(iv)将3-甲基戊烯二酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酰辅酶A，以及(v)其中所述3-甲基巴豆酰辅酶A通过以下方式转化成异丁烯：(a)将3-甲基巴豆酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酸，然后将3-甲基巴豆酸进一步酶促转化成所述异丁烯；或(b)将3-甲基巴豆酰辅酶A酶促转化成3-羟基-3-甲基丁酰辅酶A，然后将3-羟基-3-甲基丁酰辅酶A进一步酶促转化成3-羟基-3-甲基丁酸，然后将3-羟基-3-甲基丁酸进一步酶促转化成3-膦氧基-3-甲基丁酸，然后将3-膦氧基-3-甲基丁酸进一步酶促转化成所述异丁烯；(B)其中所述重组生物体或微生物与衍生它的生物体或微生物相比，具有增加含量(pool)的辅酶A，这是由于：(i)泛酸摄取增加；和/或(ii)泛酸向辅酶A的转化增加。
此外，WO 2014/086780描述了一种用于产生烃化合物(优选异丁烯)的发酵方法，其包含在液体发酵培养基中培养生物体，其中所述生物体通过酶途径产生期望的烃化合物，所述酶途径包含蒸发成气相的中间体，并且其中从气相中回收所述中间体并将其重新引入到液体发酵培养基中。
此外，WO 2014/086781描述了一种用于发酵产生烃(优选异丁烯)的方法，其中在发酵罐中的液体发酵培养基中培养产生烃的微生物，其中将包含氧气的入口气体(inletgas)进料到发酵罐中，并且在引入发酵罐之前，入口气体的总压力为约1.5巴至约15巴(约150kPa至约1500kPa)，其中在发酵废气中以气态获得烃，并且其中将发酵废气中的氧浓度控制为低于约10体积％。
尽管如此，如上所述，现有技术中已经描述了通过生物系统中以及在发酵过程/发酵罐中的酶促转化产生异丁烯的各种方法，从而允许使用可再生资源作为原料，但仍然需要改进这些方法，特别是关于此类(发酵)方法的效率、有效性和安全性，以便提高产率和/或安全性并使其更具有商业吸引力。
在第一方面，本发明通过提供一种用于从碳源产生异丁烯的方法来满足这种需求，其特征在于，该方法包含：
(a)在液体培养基中培养能够从碳源产生3-甲基巴豆酸的微生物，从而产生所述3-甲基巴豆酸，使其在液体培养基中积累；和
(b)通过以下方式将步骤(a)中获得的液体培养基中含有的所述3-甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯：
(i)将表达与FMN异戊二烯基转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶的微生物与步骤(a)中获得的含有3-甲基巴豆酸的所述液体培养基进行温育；和/或
(ii)将与FMN异戊二烯基转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶与步骤(a)中获得的含有3-甲基巴豆酸的所述液体培养基进行温育；
从而产生所述异丁烯；和
(c)回收所产生的异丁烯。
在第二方面，本发明提供了一种从碳源产生异丁烯的方法，其特征在于，该方法包含：
(a)在液体培养基中培养能够从碳源产生3-甲基巴豆酸的微生物，从而产生所述3-甲基巴豆酸，使其在液体培养基中积累；和
(b)优选在180℃至400℃的温度，将步骤(a)中获得的液体培养基中含有的所述3-甲基巴豆酸热化学(thermochemically)转化成异丁烯；以及
(c)回收所产生的异丁烯。
迄今为止所考虑的，用于从3-甲基巴豆酸(在本文中有时也称为prenate)产生异丁烯的发酵方法是基于使用能够产生异丁烯的微生物的常规发酵方法。在正常发酵条件下作为气态化合物产生的异丁烯作为培养物的废气的一部分回收，该废气是各种气体的混合物，该各种气体是在培养过程中用于培养物通风的入口气体的一部分或在培养过程中产生的。发现在此类条件下，培养的废气中异丁烯的百分比通常仅达到约3至7摩尔％的量。因此，为了将废气中的异丁烯纯化至所需的纯度，需要花费大量时间和努力。
本发明人令人惊讶地发现，如果将导致产生3-甲基巴豆酸的酶促反应与随后将3-甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯在以下意义上分开：首先确保3-甲基巴豆酸在发酵过程中从碳源产生并且在培养基中积累(并且不直接转化成异丁烯)，并且仅在3-甲基巴豆酸在培养基中积累之后，3-甲基巴豆酸才随后在单独的反应中转化成异丁烯，则包含将3-甲基巴豆酸转化成异丁烯的生物转化的发酵方法的废气中异丁烯的量/百分比可显著增加。将3-甲基巴豆酸转化成异丁烯的第二步可以在简化的条件下实现并且不需要维持发酵条件。在该第二步中，使允许3-甲基巴豆酸转化的酶与积累的3-甲基巴豆酸进行接触或引入产生此类酶的微生物的细胞就足够了。发现仅温育含有积累的3-甲基巴豆酸和酶/微生物的溶液导致3-甲基巴豆酸极有效地转化成异丁烯并且异丁烯在温育反应的废气中占极高百分比。
此外，可以表明，如果将3-甲基巴豆酸转化成异丁烯的温育步骤在完全没有气体供应的容器中或在具有非常低气体供应的容器中进行，则是有利的。
如以下实施例中所示，所要求保护的方法允许将3-甲基巴豆酸(prenate)有效转化成异丁烯并且因此导致异丁烯的有效产生。此外，实施例显示，当在用于将3-甲基巴豆酸转化成异丁烯的温育步骤期间保持低气体供应(即<0.1vvm)或不供应气体(0vvm)时，在废气中产生的异丁烯(IBN)浓度特别高。因此，更容易将异丁烯纯化至期望的纯度。
如实施例中所示，当在3-甲基巴豆酸转化成异丁烯的温育步骤期间使用低气体供应的条件时，以高浓度产生异丁烯和CO2(其在3-甲基巴豆酸酶促脱羧成异丁烯期间产生)，事实上，当在温育步骤期间保持极低的气体供应时，基本上仅产生CO2和异丁烯。
每当提及3-甲基巴豆酸时，均意指其去质子化的羧酸根离子形式(即COO-形式，即3-甲基巴豆酸盐(3-methylcrotonate))以及其质子化的酸性形式(即COOH形式，即甲基巴豆酸)。事实上，其形式取决于溶液的pH，因此，3-甲基巴豆酸的定义可互换地表示任一形式，即3-甲基巴豆酸盐以及3-甲基巴豆酸。
当以盐形式(即3-甲基巴豆酸盐)存在时，优选的阳离子是Na+、Ca2+、Mg2+、K+或NH4+。
根据本发明的方法在步骤(a)中包含在液体培养基中培养能够从碳源产生3-甲基巴豆酸的微生物，从而产生所述3-甲基巴豆酸，使得其在液体培养基中积累。
本文中使用的术语“培养”是指将细胞保持在液体培养基中，从而保持它们的活性并允许产生用于产生所需产物的所需酶。优选地，术语“培养”还包括在允许微生物细胞繁殖、增殖和细胞分裂的条件下培育微生物细胞，从而增加液体培养基中细胞的数目。因此，术语“培养”是指将微生物维持在允许细胞存活以及细胞所需的代谢过程发生的培养条件下，以便将碳源转化成3-甲基巴豆酸。此类条件通常包含在培养基中提供具有碳源的细胞，搅拌培养基，将培养基的温度保持在允许发生所需代谢转化(以及如果需要的话，微生物的生长)的值，并向培养的细胞提供允许细胞存活和代谢活性的空气或气体混合物。
因此，本文中使用的术语“培养”应理解为“发酵”，即优选通过酶的作用在有机底物中产生化学变化的代谢过程，因此，是指其中产物通过微生物的天然或遗传修饰的代谢从生长底物合成并通过代谢中间体实现的过程。因此，术语培养使得所培养细胞的代谢、它们的生长和它们的存活可能发生。此外，培养步骤为了实现这一点，需要存在碳源和能源(例如，以葡萄糖和氧的形式)。
通常，根据本发明的方法的培养步骤(a)可以根据使用本领域公知的装置(如发酵罐及其设备)和方法的经典发酵方法进行，其中培养基和培养条件适于步骤(a)中使用的特定微生物。
术语“能够从碳源产生3-甲基巴豆酸的微生物”是指当在合适的条件下培养时能够表达酶的微生物，该酶允许相应的碳源转化成3-甲基巴豆酸，并因此在培养期间从碳源产生3-甲基巴豆酸。
从碳源酶促产生3-甲基巴豆酸的方法是本领域已知的，并且已经描述了能够催化相应酶促转化的(重组)微生物。原则上，任何能够将碳源转化成3-甲基巴豆酸的微生物都可用于本发明方法的步骤(a)。
仅作为实例，但不限于此，以下进一步描述从碳源开始酶促转化成3-甲基巴豆酸的可能的单独步骤。此外，在优选的实施方案中，作为另外的实例，但不限于此，以下进一步描述了从碳源开始产生中心代谢物乙酰辅酶A并且进一步产生3-甲基巴豆酸的酶促转化的可能的单独步骤。
此外，在本发明的上下文中，术语“能够从碳源产生3-甲基巴豆酸的微生物”是指此类微生物在所应用的培养条件下，不将所产生的3-甲基巴豆酸进一步代谢或转化成其他化合物(特别是异丁烯)，或基本上不将所产生的3-甲基巴豆酸进一步代谢或转化成其他化合物，特别是异丁烯。该术语特别是指在培养步骤(a)期间微生物不将产生的3-甲基巴豆酸转化成异丁烯。这可能是由于在根据本发明的方法的步骤(a)中使用的微生物不包含编码可将3-甲基巴豆酸转化成异丁烯的酶的遗传信息，因此不能产生可催化该反应的酶。
可替代地，步骤(a)中使用的微生物也可以是包含编码酶的遗传信息的微生物，该酶能够将3-甲基巴豆酸转化成异丁烯，但在步骤(a)中使用的培养条件下不表达该酶。例如，可以将编码相应酶的基因置于启动子的控制下，该启动子的活性可以被调节并且在步骤(a)中使用的培养条件下是无活性的。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的方法的步骤(a)中使用的微生物是不包含编码能够将3-甲基巴豆酸转化成异丁烯的酶的基因的微生物。
然而，本发明方法的步骤(a)中也可以使用天然包含编码原则上可将3-甲基巴豆酸转化成异丁烯的酶的基因的微生物，该酶诸如是与FMN异戊二烯基转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶，但是其中该酶将3-甲基巴豆酸转化成异丁烯的活性低到在培养步骤(a)期间不发生任何实质性转化。
根据本发明的方法的步骤(a)的培养期间由微生物产生的3-甲基巴豆酸在培养基中积累。
因此，进行足够的时间的步骤(a)的培养以允许碳源转化成3-甲基巴豆酸并使其在培养基中积累。优选地，进行培养，直至培养基中提供的碳源被细胞代谢(即，从培养基中消耗)至至少20％、30％、40％、50％或60％，优选至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％或至少95％，特别优选至少99％。
“积累”是指在步骤(a)中由微生物产生的3-甲基巴豆酸主要在培养基中发生，并且其浓度在步骤(a)中的培养期间增加。优选地，进行培养，直至观察不到3-甲基巴豆酸的浓度进一步增加。
还优选进行步骤(a)的培养，直至在液体培养基中3-甲基巴豆酸的浓度达到至少5g/l，更优选至少10g/l，甚至更优选至少20g/l，甚至更优选至少40g/l。
一旦本发明方法的步骤(a)中实现了所需的3-甲基巴豆酸在培养基中的积累，就停止微生物的培养。停止培养是指停止发酵方法中使用的维持细菌生长的措施。
当碳源消耗低(优选低于0.03g碳源/g DCW(细胞干重)/小时)和/或3-甲基巴豆酸生产速率低(优选低于0.01g 3-甲基巴豆酸/g DCW/小时)时，优选停止培养。
可分别通过本领域已知的方法，例如通过HPLC，测量碳源消耗和3-甲基巴豆酸产生。
当不需要的副产物(例如，有机酸，诸如乙酸、乳酸；或醇，诸如乙醇)开始在培养基中积累时，也可优选停止培养。可以通过本领域已知的方法(例如，通过HPLC或GC分析)测量培养物中副产物的积累。
优选地，可以通过终止通气和/或终止碳源的提供来停止培养。
因此，在根据本发明的方法的培养步骤(a)结束时，获得包含积累的3-甲基巴豆酸以及用于产生它的微生物的液体培养基。该液体培养基随后用于根据本发明的方法的温育步骤(b)中。
根据本发明方法的步骤(b)，在步骤(a)中产生并且在液体培养基中含有的3-甲基巴豆酸随后被酶促转化成异丁烯。
该步骤的特征在于其不需要培养微生物，而是可以通过简单地将步骤(a)中产生的3-甲基巴豆酸与能够将3-甲基巴豆酸转化成异丁烯的酶(特别是与FMN异戊二烯基转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶)或与产生此类酶的微生物(的预生长培养物)进行温育来实现。在该步骤(b)中不进行培养是指例如通常不加入其他营养物。温育仅需要使底物(3-甲基巴豆酸)和酶(以分离的酶的形式或以已经预培养且合成了该酶的微生物的形式)接触并且在允许3-甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯的受控反应条件(例如，温度和pH值)下温育。
当步骤(a)的培养可以如上所述停止时，可以通过将含有3-甲基巴豆酸的液体培养基与表达与FMN异戊二烯基转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶的细胞或与FMN异戊二烯基转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶混合在一起来开始温育。
因此，在本发明方法的步骤(b)中使用的术语“温育”不一定要求微生物(如果在该步骤中使用的话)保持活力。术语“温育”也不一定包括步骤(b)中使用的微生物的进一步增殖/生长。就本发明而言，“温育”是指将表达所需酶的微生物和酶分别保持在活性状态，优选在最佳温度、湿度和允许3-甲基巴豆酸转化成异丁烯的其他条件下。因此，与步骤(a)的“培养”/“发酵”相反，根据本发明的“温育”本质上仅是指将3-甲基巴豆酸转化成异丁烯，而不一定需要微生物的增殖/生长和/或将3-甲基巴豆酸转化成异丁烯所需的相应酶的产生。因此，在本发明方法的步骤(b)的“温育”中，将3-甲基巴豆酸转化成异丁烯所需的微生物的增殖/生长和/或相应酶的产生(如果完全包含或需要)与3-甲基巴豆酸转化成异丁烯的实际转化率物理分离。相反，在上述“培养”中，从碳源到3-甲基巴豆酸的步骤如下面更详细描述的那样相连。
根据本发明的方法的温育步骤(b)在容器中进行，该容器包含溶液，该溶液含有步骤(a)中产生的3-甲基巴豆酸以及用于将3-甲基巴豆酸转化成异丁烯的酶或表达该酶的微生物。
该容器被设计为封闭系统，以便允许控制流出容器的气体的流量，并且任选地，还允许控制流入容器的气体的流量。
该容器还可以装备允许搅拌容器中所含溶液的装置或在温育步骤(b)期间控制温度的装置。
不受理论的约束，搅拌允许细胞/酶和含有3-甲基巴豆酸的溶液的混合，并因此允许细胞和/或酶和3-甲基巴豆酸在溶液中均匀分布。此外，搅拌可以促进气态组分(诸如异丁烯)从溶液离开进入气相。
有利地，在一个优选的实施方案中，容器包含pH调节系统和/或与酸储罐的连接，该酸储罐用于调整/调节容器中液体培养基的pH。例如，硫酸或磷酸可用于调整/调节pH。
在另一个优选的实施方案中，可以在温育步骤(b)期间用3-甲基巴豆酸(或其盐)的(浓缩)溶液，优选用已经根据本发明方法的步骤(a)产生的3-甲基巴豆酸进料到容器中。将3-甲基巴豆酸进料到溶液中的可能方式描述如下。通过在温育步骤(b)期间将3-甲基巴豆酸进料到容器中，例如可以将培养基中3-甲基巴豆酸的浓度维持在允许有效转化成异丁烯的所需水平。因此，在此类实施方案中，还设想(例如，恒定地或以预定的时间间隔)监测培养基中3-甲基巴豆酸的浓度，并通过向培养基中加入另外的3-甲基巴豆酸将浓度调节至所需浓度。
在本发明的一个实施方案中，温育步骤(b)在设计为封闭系统的容器中进行，该容器仅允许气体通过出口受控流出，但不允许气体流入。相应的容器示意性地示于图4的上部。因此，在此类实施方案中，没有来自外部的气体供应，并且该方法在没有气体供应的容器中进行。在这种情况下，温育步骤(b)过程中产生的(包括异丁烯的)气体作为废气通过允许气体流出的出口被捕获。因此，在此类封闭系统中，本发明的步骤(b)的温育过程中产生的气体可以从容器中回收，而不需要用入口气体重新补充相应体积的气体。换言之，当在培养过程中产生(包含异丁烯的)气体时，容器中的压力由于其产生而增加。为了保持恒定压力，可以通过出口从容器中回收气体。
因此，在此类情况下，容器是封闭系统(除了气体出口)，并且容器中的压力优选以不增加的方式进行控制(即，通过经由出口允许气体流出)。
在所附实施例中显示，在温育步骤(b)期间，根本没有任何气体供应的此类温育导致产生具有极高异丁烯含量的气体。
在另一个实施方案中，温育步骤(b)在设计为封闭系统但允许受控的气体流出和受控的气体流入的容器中进行。在此类实施方案中，可以以受控的方式向系统提供入口气体(inlet gas)，并且入口气体可用于迫使含有异丁烯的温育产生的气体离开系统。相应的容器示意性地示于图4的下部。
因此，存在入口，经由该入口，可以以受控的方式供应入口气体(例如氮气、空气等，如下面进一步更详细地概述的)。此外，存在允许气体流出的出口。
在此类情况下，优选将入口气体(气体供应)的流量保持在低速率。优选地，流量保持在小于0.1vvm(容器体积/分钟)的速率。
单位“vvm”(其表示“容器体积/每分钟”)是本领域技术人员已知的。单位“vvm”是在参考条件(101.325kPa，0℃)下每体积液体发酵培养基每分钟的入口气流的体积，并且可以容易地在容器中调节。相应的装置是本领域技术人员已知的。
在优选的实施方案中，气体供应在>0.0至0.1vvm、>0.0至0.09vvm、>0.0至0.08vvm、>0.0至0.07vvm、>0.0至0.06vvm、>0.0至0.05vvm、>0.0至0.04vvm、>0.0至0.03vvm、>0.0至0.02vvm或>0.0至0.01vvm的范围内。在更优选的实施方案中，气体供应在>0.0至0.05vvm的范围内。
在进一步优选的实施方案中，气体供应＜0.09vvm、＜0.08vvm、＜0.07vvm、＜0.06vvm、＜0.05vvm、＜0.04vvm、＜0.03vvm、＜0.02vvm、＜0.01vvm或＜0.005vvm。在一个更优选的实施方案中，气体供应<0.05vvm。
在一个特别优选的实施方案中，气体供应<0.1vvm。在另一个特别优选的实施方案中，气体供应<0.05vvm。在另一个特别优选的实施方案中，气体供应<0.02vvm。
气体可经由溶液的入口(例如，通过将气体吹过溶液)供应至容器。可替代地，也可以将气体供应至容器的气相。
优选地，用喷射器(例如，通过将气体“吹”过溶液)从容器底部向容器中的溶液提供入口气体。
在所附实施例中显示，在温育步骤(b)期间仅具有低气体供应的此类温育导致产生具有极高含量异丁烯的气体。特别地，实施例显示，当在没有或低气体供应的情况下进行温育步骤时，产生高浓度的CO2和异丁烯，并且实际上基本上仅产生CO2和异丁烯。因此，如下面进一步更详细解释的，来自容器的出口气体主要或甚至排他地(除了最终痕量的其他气体之外)由CO2和异丁烯组成，而基本上不存在氧气。
因此，本发明的方法的优点还在于，它可以消除或至少大大减少在异丁烯产生过程中产生的出口气体的燃烧风险。因此，如果没有气体供应，或者如果将气体供应控制在低水平，则出口气体中的氧气低于约10体积％，并因此低于燃烧所需的异丁烯的最小氧浓度(MOC)。因此，本发明的方法还允许提高异丁烯产生的安全性并促进回收的出口气体的后续加工。
入口气体优选为空气、惰性气体、几种气体的混合物或空气与惰性气体的混合物，其中所述惰性气体优选选自氮气、氦气、氩气、氖气、CO2和这些气体的混合物。
此外，如果在气体供应中使用氮气(或另一种惰性气体)，则它可以使系统惰性化(由此避免/降低燃烧和/或爆炸的风险)。
根据本发明的方法的温育步骤(b)在允许异丁烯处于气态并从溶液中蒸发出来的条件下进行。在图9中，示出了指示纯异丁烯的蒸气压与温度之间的相关性的曲线图。在曲线下方，异丁烯为气态，而在曲线上方，异丁烯为液态。
因此，在用于将3-甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯的温度(通常在30℃和40℃之间，通常在约37℃)和大气压下，产生的异丁烯以气态形式产生。本领域技术人员容易选择合适的条件(就调节容器中的温度和/或压力而言)以使产生的异丁烯处于其物质的气态。
然后根据本发明的方法的步骤(c)回收蒸发成气相的所产生的异丁烯。回收包括回收从溶液中蒸发并含有异丁烯的气体。随后可以根据本领域技术人员熟知的方法进一步纯化异丁烯。
如上所述，本发明方法的温育步骤(b)包括将含有3-甲基巴豆酸的液体培养基与能将3-甲基巴豆酸转化成异丁烯的酶或与表达此类酶的微生物一起培养。
在根据步骤(a)停止培养后，可以以不同的方式进行向步骤(b)的转变。例如，在步骤(a)结束时得到的培养基可以原样取出(含有积累的3-甲基巴豆酸以及用于其产生的微生物的细胞)，并且可以与温育步骤(b)中使用的酶和/或微生物组合。在这种情况下，不进行步骤(a)中使用的细胞与培养基的分离。通过简单地加入步骤(b)所需的酶和/或微生物，可以在与步骤(a)的培养相同的容器中进行温育步骤(b)。在一个优选的实施方案中，温育步骤(b)可以在与步骤(a)的培养相同的容器中进行，通过简单地加入步骤(b)所需的酶和/或微生物，并通过应用温育的最佳条件，即通过应用本领域已知的相应常规措施控制温度、pH、搅拌力和/或氧浓度进行步骤(b)的酶转化。
然而，优选将停止步骤(a)的培养后获得的培养基转移到不同的容器中。
在另一个实施方案中，本发明的方法包含在步骤(b)之前将停止步骤(a)的培养后获得的含有3-甲基巴豆酸的液体培养基与微生物分离的步骤。从液体培养基中分离微生物的方法是本领域技术人员已知的。例如，离心可用于从液体中分离微生物。一旦分离，含有所述3-甲基巴豆酸的液体培养基可以进行本发明方法的温育步骤(b)。
如上所述，在第二方面，本发明提供了一种从碳源产生异丁烯的方法，其特征在于，该方法包含：
(a)在液体培养基中培养能够从碳源产生3-甲基巴豆酸的微生物，从而产生所述3-甲基巴豆酸，使其在液体培养基中积累；和
(b)优选在180℃至400℃的温度，将步骤(a)中获得的液体培养基中含有的所述3-甲基巴豆酸热化学转化成异丁烯；和
(c)回收所产生的异丁烯。
在步骤(b)中，将步骤(a)中获得的液体培养基中含有的3-甲基巴豆酸热化学转化成异丁烯。优选地，所述热化学转化在180℃至400℃的温度进行。
可以根据本领域已知的程序将3-甲基巴豆酸有效地转化成异丁烯和二氧化碳。优选地，将3-甲基巴豆酸在180℃至400℃、优选230℃至350℃的温度加热。在另一个优选的实施方案中，热化学转化在沸腾反应器、搅拌釜反应器或管式反应器中进行。在另一个优选的实施方案中，热化学转化在0-30巴、优选10-30巴的压力下进行。
在一个优选的实施方案中，本发明的方法包含在本发明的方法的步骤(b)之前从液体培养基中分离或纯化本发明的方法的步骤(a)中产生的3-甲基巴豆酸的步骤。从液体培养基中分离(isolate)、纯化、提取或分离(separate)3-甲基巴豆酸的方法是本领域已知的。3-甲基巴豆酸可以例如被浓缩(例如，通过从液体培养基中除去水含量)或(部分)纯化，优选通过除去可能存在的潜在剩余的糖和其他化合物。除此之外或在替代方案中，可以通过应用本领域已知的方法将3-甲基巴豆酸富集和/或纯化至3-甲基巴豆酸的浓度为至少100g/l，更优选至少150g/l，甚至更优选至少200g/l并且甚至更优选至少250g/l。优选地，3-甲基巴豆酸以其钠盐或钾盐的形式回收。
在另一个优选的实施方案中，本发明的方法包含在本发明的方法的步骤(b)之前从液体培养基中纯化本发明的方法的步骤(a)中产生的3-甲基巴豆酸的步骤。
在一个相应的优选实施方案中，本发明方法的步骤(a)中产生的3-甲基巴豆酸可以在本发明方法的步骤(b)之前使用分批或连续液液萃取从液体培养基中纯化/分离。
3-甲基巴豆酸的液液萃取可以如下进行：
根据本发明，细菌和所有其他固体优选通过标准液固分离从发酵液(即，从液体培养基)中除去。标准液固分离可优选为离心或过滤。随后，可以酸化分离的发酵液，即分离的液体培养基。优选地，酸化处于低于4.2、优选低于4.0的pH下，并且更优选地通过添加任何无机酸。由此酸化的发酵液(即根据本发明的液体培养基)可以与有机溶剂混合，该有机溶剂优选醇(更优选2-辛醇或2-乙基己醇)、重有机酸(更优选庚酸)、酮(更优选甲基异丁基酮或甲基乙基酮)、重烷烃(更优选含有8、9、10、11、12、13、14、15或16个碳或其混合物)。这种混合可以在一系列搅拌釜反应器中或在本领域已知的任何技术的连续液液萃取塔中进行(例如，通过伴随搅拌或不搅拌)。可以回收有机相并送去蒸馏。可以在馏出物中回收溶剂并且可以在残余物中回收3-甲基巴豆酸。可替代地，还可以将3-甲基巴豆酸进一步蒸馏以在馏出物中回收。
在另一个优选的实施方案中，上述3-甲基巴豆酸的液液萃取也可以直接从在本发明的步骤(a)的培养中获得的液体培养基中进行，该液体培养基含有所述3-甲基巴豆酸并且仍然是在步骤(a)中培养的微生物。
这可以优选在培养容器或发酵罐中进行。
在一个优选的实施方案中，可以在培养或发酵开始时或在培养或发酵期间将溶剂、优选重烷烃(含有8、9、10、11、12、13、14、15或16个碳或其混合物)送至培养或发酵罐。所得混合物可以从培养或发酵罐中连续抽出。可优选将pH酸化降低至小于4.2以增强3-甲基巴豆酸向溶剂的迁移。两种相可被送至倾析器(decanter)。分离的有机相被送去蒸馏，而仍含有微生物的水相(aqueous phase)可被送回到培养或发酵罐。
在另一个优选的实施方案中，上述纯化/提取也可以在培养或发酵罐外部进行。在此类实施方案中，培养或发酵以标准方式进行，并且肉汤(即，根据本发明的步骤(a)的液体培养基)可以从培养或发酵罐中连续抽出。该流(即，根据本发明的步骤(a)的液体培养基，其从培养或发酵罐中连续抽出)优选用本领域已知的任何无机酸酸化，优选pH低于4.2。可替代地，也可以不进行酸化。该流(即，根据本发明的步骤(a)的液体培养基，其从培养或发酵罐中连续抽出)可以在一系列搅拌罐中或在如上所述的液液萃取塔中与溶剂(优选相同的重烷烃)混合。回收有机相并送至蒸馏以一方面回收3-甲基巴豆酸，另一方面回收溶剂。
优选地，在上述液液萃取中，使用生物来源的溶剂，更优选异十二烷或2-辛醇。
在本发明的方法中，在温育步骤(b)(i)中，其中将表达与FMN异戊二烯基转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶的微生物与在本发明的步骤(a)中获得的含有3-甲基巴豆酸的液体培养基一起培养，所述微生物可以作为液体培养基中的悬浮培养物(就自由漂浮而言)存在。可替代地，可以对微生物进行固定化。可以在合适的载体、表面和/或载体材料上进行固定化。合适的载体、表面和/或载体材料以及固定方法是本领域技术人员已知的。Martins等综述了相应的支持材料以及固定方法(African Journal of Biotechnology 12(28):441-4418(2013))。
在本发明的方法中，在温育步骤(b)(ii)中，其中将与FMN异戊二烯基转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶与步骤(a)中获得的含有3-甲基巴豆酸的所述液体培养基进行温育，所述酶可以存在于液体培养基中的溶液中(就自由漂浮而言)。可替代地，所述酶可以被固定化。可以在合适的载体、表面和/或载体材料上进行固定化。合适的载体、表面和/或支持材料以及酶的固定化方法是本领域技术人员已知的(参见例如Mohamad等，Biotechnology&Biotechnological Equipment 29(2),2015,205-220)。
温育步骤(b)在允许溶液中含有的3-甲基巴豆酸转化成异丁烯的条件下进行。这些条件取决于用于转化的生物体或酶的类型，并且可由本领域技术人员通过常规措施进行调整。
温育进行持续足以允许异丁烯产生的时间。可以在温育过程中监测溶液中3-甲基巴豆酸的浓度。优选地，进行温育直至至少90％、更优选至少95％、甚至更优选至少98％的3-甲基巴豆酸转化成异丁烯。
温育停止后，可将溶液与细胞/酶分离并重新引入该方法的步骤(a)。优选地，溶液在被重新引入到方法的步骤(a)之前被灭菌。步骤(b)中使用的细胞或酶可以再循环并在另一轮步骤(b)中使用。
在一个优选的实施方案中，在利用能够从碳源产生3-甲基巴豆酸的微生物的本发明的培养步骤(a)中，使用能够在其酶促转化成3-甲基巴豆酸之前将所述碳源代谢成乙酰辅酶A的微生物。在下文中更详细地描述能够将碳源代谢成乙酰辅酶A的相应酶促转化和微生物，优选重组微生物及其进一步酶促转化成3-甲基巴豆酸。
然而，本发明的方法不限于使用能够在所述碳源酶促转化成3-甲基巴豆酸之前将其代谢成乙酰辅酶A的相应微生物。如下面进一步更详细解释的，存在能够从碳源产生3-甲基巴豆酸的(重组)微生物，其中这些微生物中的代谢不需要形成作为中间体的乙酰辅酶A。
在本发明的使用能够从碳源产生3-甲基巴豆酸的微生物的培养步骤(a)中，还可以使用C1固定微生物或微生物的组合，优选C1固定微生物。
C1固定微生物是本领域已知的，并且例如描述于WO 2020/188033中，其内容通过引用并入本文。
在一个优选的实施方案中，微生物(优选如上定义的C1固定微生物)是能够消耗多于一种糖的微生物。优选地，所述多于一种糖包含葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、甘油、淀粉、乙醇、乳酸、乙酸和/或甘露糖。在更优选的实施方案中，微生物(优选C1固定微生物)是能够消耗两种或更多种选自葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、甘油、淀粉、乙醇、乳酸、乙酸和甘露糖的糖的微生物。能够消耗葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、甘油、淀粉、乙醇、乳酸、乙酸和/或甘露糖的生物体和/或微生物天然存在并且是本领域已知的。
在一个优选的实施方案中，微生物，优选C1固定微生物是能够消耗CO和/或合成气的生物体。在另一个优选的实施方案中，微生物(优选C1固定微生物)是能够消耗CO和/或CO2以及H2的混合物的生物体。
在另一个实施方案中，所述微生物经遗传修饰以能够消耗葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、甘油、淀粉、乙醇、乳酸、乙酸、甘露糖和/或CO(或合成气(syngas))，和/或经遗传修饰以提高微生物消耗葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、甘油、淀粉、乙醇、乳酸、乙酸、甘露糖和/或CO(或合成气)的能力。相应的遗传修饰是本领域已知的。
在另一个优选的实施方案中，微生物(优选C1固定微生物)是能够通过磷酸转移酶转运系统(PTS)消耗糖的微生物。
在一个优选的实施方案中，微生物(优选C1固定微生物)是能够通过非磷酸转移酶转运系统(非PTS)消耗糖的生物体。
在一个优选的实施方案中，在利用能够从碳源产生3-甲基巴豆酸的微生物的本发明的培养步骤(a)中，所述碳源选自葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、甘油、淀粉、乙醇、乳酸、乙酸及其混合物。
在一个优选的实施方案中，在本发明的培养步骤(a)中，所使用的微生物是重组微生物。相应的重组微生物在下文中更详细地描述。
在一个优选的实施方案中，在本发明的培养步骤(a)中，所使用的微生物是这样的微生物(优选重组微生物)：当根据步骤(a)培养所述(重组)微生物时，与FMN异戊二烯基转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶的表达和/或活性降低/减弱，或者不表达与FMN异戊二烯基转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶。
如上所述，在一个优选的实施方案中，本发明的方法包含在步骤(b)之前将步骤(a)的含有所述3-甲基巴豆酸的液体培养基与微生物分离的步骤。由此分离的微生物不必丢弃。事实上，在一个优选的实施方案中，从液体培养基中分离的所述微生物可以再循环并重新引入到本发明方法的步骤(a)中。图3中示意性地示出了相应的再循环。
在另一个优选的实施方案中，在本发明方法的转化步骤(b)(i)之前，在合适的条件下在合适的液体培养基中预培养步骤(b)(i)中使用的微生物。不受理论的约束，相应的预培养步骤具有微生物增殖和富集至一定程度的效果，这增加了微生物的数量和/或密度(以及相应地，用于所需酶转化的所需酶的数量和/或密度)。合适的液体培养基和合适的条件是本领域技术人员已知的，并且在下文中更详细地描述。
优选将步骤(b)(i)中使用的微生物加入到含有3-甲基巴豆酸的溶液中，以获得以细胞干重/升表示至少1g/l、甚至更优选至少5g/l、最优选至少10g/l的细胞密度。如上所述，温育步骤(b)(i)优选在不支持细胞进一步增殖的条件下进行。优选地，所述温育步骤(b)(i)在不支持细胞进一步增殖的条件下进行，使得细胞密度在温育期间基本上保持恒定或仅显示微小增加(优选不超过20％，甚至更优选不超过10％)。在另一个优选的实施方案中，所述温育步骤(b)(i)在不支持细胞进一步增殖的条件下进行，使得细胞密度在温育期间基本上保持恒定或仅显示轻微降低(优选不超过20％，甚至更优选不超过10％)。细胞密度的降低可以例如在裂解(部分)细胞时发生，在温育期间通过例如在调节液体培养基pH时添加(酸性)溶液来增加液体培养基的体积。
也可以例如通过添加3-甲基巴豆酸至容器中，在如上文和下文所述的温育步骤(b)期间将3-甲基巴豆酸进料至容器时发生细胞密度降低，由此在溶液中稀释生物质/细胞。
如上所述，本发明的方法包含一个步骤，其中在温育步骤(b)中，将表达与FMN异戊二烯基转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶的微生物与在本发明方法的步骤(a)中获得的含有3-甲基巴豆酸的所述液体培养基一起培养。可替代地，本发明的方法包含一个步骤，其中在温育步骤(b)中，将与FMN异戊二烯基转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶与本发明方法的步骤(a)中获得的含有3-甲基巴豆酸的所述液体培养基一起培养。在一个优选的实施方案中，在两种情况下，在完成本发明方法的所述步骤(b)之后，所述液体培养基可以被回收、任选地灭菌并且可以被重新引入到本发明方法的步骤(a)中。图3中示意性地示出了相应的再循环。
在前述的另一个优选实施方案中，将存在于所述回收的液体培养基中的微生物(即，表达与FMN异戊二烯基转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶的微生物)从所述液体培养基中除去，并重新引入到本发明方法的生物转化步骤(b)(i)中。图3中示意性地示出了相应的再循环。
在另一个优选的实施方案中，随后纯化和/或富集回收的异丁烯。
就本发明而言，纯化或部分纯化优选意指(部分或完全)除去可能存在的潜在剩余的其他化合物(除异丁烯以外的组分)。
根据本发明的富集意指气相或液相中异丁烯浓度的增加。
用于纯化和/或富集异丁烯的方法是本领域已知的。可以使用本领域已知的技术，例如物理吸附、反应性吸附、吸附、冷凝、低温技术和/或基于膜的分离，从本发明方法的温育步骤(b)的废气中回收或分离异丁烯。
在一个优选的实施方案中，在本发明方法的步骤(a)和/或步骤(b)中使用的微生物(优选重组微生物)是细菌、酵母、真菌或藻类。在一个特别优选的实施方案中，所述微生物是细菌，例如大肠杆菌。在下文中更详细地描述相应的合适的微生物，优选重组微生物。
根据步骤(a)从碳源酶促产生3-甲基巴豆酸
如上所述，用于从碳源酶促产生3-甲基巴豆酸的方法是本领域已知的，并且已经描述了能够催化相应酶促转化的(重组)生物体和微生物；参见例如WO 2017/085167、WO2018/206262和WO 2020/188033，其内容通过引用并入本文。
仅作为实例，但不限于此，描述了从产生中心代谢物乙酰辅酶A的碳源开始的酶促转化及其进一步转化成3-甲基巴豆酸的可能的单独步骤。
乙酰辅酶A(乙酰辅酶A)是存在于所有生物体中的中心代谢物并且参与蛋白质、碳水化合物和脂质代谢中的多种生化反应。在例如通过糖酵解分解碳源以及通过β-氧化分解脂肪酸而将辅酶A乙酰化为乙酰辅酶A时，产生乙酰辅酶A。
因此，由于从脂肪酸(特别是从碳源)产生的乙酰辅酶A是存在于所有生物体中的中心代谢物，所以本文不描述其产生。
在下文中，不限于此，总结了将乙酰辅酶A酶促转化成3-甲基巴豆酸的可能的单独步骤以及能够例如从乙酰辅酶A产生3-甲基巴豆酸的微生物。在例如WO 2017/085167、WO2018/206262和WO 2020/188033中描述了相应的酶转化和微生物，其内容通过引用并入本文。
已经描述了通过不同的可能途径产生3-甲基巴豆酸的方法(参见图1以及图2的概述)。特别地，在WO 2010/001078、WO 2012/052427、WO 2017/085167、WO 2018/206262和WO2020/188033(通过引用并入本文)中描述了利用这些途径和酶转化的方法以及重组生物体和微生物。
然而，在本发明方法的步骤(a)中，不仅可以使用这些反应，而且原则上可以使用现有技术文献WO 2017/085167、WO 2018/206262、WO 2010/001078、WO 2012/052427和WO2016/042012中描述的用于将乙酰辅酶A转化成3-甲基巴豆酸的任何其他途径。
此外，在本发明方法的步骤(a)中，所述3-甲基巴豆酸也可以作为硫酯，即作为3-甲基巴豆酰辅酶A从碳源或氮源经由丙酮酸和亮氨酸产生。Li等(Angew.Chem.Int.Ed.(2013)52:1304)中描述了相应的生物合成途径以及能够产生3-甲基巴豆酰辅酶A的微生物；具体参见图1。
然后，所产生的3-甲基巴豆酸的硫酯(即3-甲基巴豆酰辅酶A)可以通过现有技术中所述的酶转化进一步转化成3-甲基巴豆酸。
这些文献的公开内容，特别是关于用于其中所述途径的单独转化的酶的优选实施方案的公开内容，其通过引用整体并入本文。因此，在优选的实施方案中，优选使用选自这些现有技术文献中描述的与相应的酶转化有关的优选实施方案的酶。因此，这同样适用于本发明方法的步骤(a)的酶转化，分别如WO 2017/085167、WO 2018/206262、WO 2010/001078、WO 2012/052427、WO 2016/042012和Li等(Angew.Chem.Int.Ed.(2013)52:1304)所述。
在一个优选的实施方案中，在本发明方法的步骤(a)中，所述3-甲基巴豆酸通过以下途径产生：从乙酰辅酶A开始，其随后被酶促转化成乙酰乙酰辅酶A，乙酰乙酰辅酶A随后被酶促转化成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A随后被酶促转化成3-甲基戊烯二酰辅酶A，3-甲基戊烯二酰辅酶A随后被酶促转化成3-甲基巴豆酰辅酶A，3-甲基巴豆酰辅酶A随后被酶促转化成所述3-甲基巴豆酸(例如，参见图2的概述)。相应的方法、酶转化以及利用这些途径和酶转化的重组生物体和微生物已在上述现有技术文献中描述。这些文献的公开内容，特别是关于用于上述优选途径的酶的优选实施方案(即，从乙酰辅酶A经由乙酰乙酰辅酶A，然后经由3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A，然后经由3-甲基戊烯二酰辅酶A，然后经由3-甲基巴豆酰辅酶A，然后转化成所述3-甲基巴豆酸)，其通过引用整体并入本文。因此，在关于该可能的优选途径的优选实施方案中，优选使用选自这些现有技术文献中描述的与相应酶转化有关的优选实施方案的酶。因此，这同样适用于本发明方法的步骤(a)的酶转化，如上述现有技术文献中所述。
如上所述，在一个优选的实施方案中，在本发明的培养步骤(a)中，步骤(a)中使用的所述微生物是这样的微生物(优选重组微生物)：与FMN异戊二烯基转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶(优选能够将3-甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯的FMN依赖性脱羧酶)的活性降低/减弱。使用与FMN异戊二烯基转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶(优选能够将3-甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯的FMN依赖性脱羧酶)的活性降低/减弱的相应微生物是有益的，因为它避免了由此产生的3-甲基巴豆酸的代谢，并且因此允许3-甲基巴豆酸在所述液体培养基中积累。
因此，与FMN异戊二烯基转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶(优选能够将3-甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯的FMN依赖性脱羧酶)的活性降低/减弱的微生物是天然不表达与FMN异戊二烯基转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶的微生物或已经被修饰(特别是遗传修饰)的微生物，从而与相应的未修饰的微生物相比，相应的酶的活性被完全消除或活性被降低/减弱。
天然不表达与FMN异戊二烯基转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶(优选能够将3-甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯的FMN依赖性脱羧酶)的相应微生物是本领域已知的。
在一个优选的实施方案中，与非修饰的生物体或微生物相比，具有与FMN异戊二烯基转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶(优选能够将3-甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯的FMN依赖性脱羧酶)的活性降低/减弱的微生物优选是指这样的微生物，其中与非修饰的微生物相比，通过导致所述失活或降低的微生物的遗传修饰来实现相应的一种或多种酶活性的降低/减弱。
在一个优选的实施方案中，本发明的重组微生物是指这样的重组微生物，其中与未修饰的微生物相比，通过降低与FMN异戊二烯基转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶的活性，具有降低/减少的与FMN异戊二烯基转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶(优选能够将3-甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯的FMN依赖性脱羧酶)。优选地，通过微生物的遗传修饰来实现这种减少。这可以通过例如启动子和/或酶的随机诱变或定点诱变，随后选择具有所需性质的启动子和/或酶，或通过如上所述的互补核苷酸序列或RNAi效应来实现。
在本发明的上下文中，“降低的活性”是指与相应的未修饰的微生物相比，酶、特别是与FMN异戊二烯基转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶在遗传修饰的微生物中的活性低至少10％，优选至少20％，更优选至少30％或50％，甚至更优选至少70％或80％，特别优选至少90％或100％。用于测量与FMN异戊二烯基转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶的降低的酶活性的测定法是本领域已知的。
在另一个实施方案中，根据本发明的微生物是不具有与FMN异戊二烯基转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶(优选能够将3-甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯的FMN依赖性脱羧酶)活性的微生物。这优选意指此类微生物天然不具有与FMN异戊二烯基转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶的活性。这意指此类微生物在其基因组中天然不含有编码具有与FMN异戊二烯基转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶活性的酶的核苷酸序列。
在另一个优选的实施方案中，本发明的微生物是经遗传修饰的生物体，以避免乙酰辅酶A的泄漏，从而增加乙酰辅酶A的胞内浓度，其最终转化成3-甲基巴豆酸。导致细胞内乙酰辅酶A浓度增加的遗传修饰是本领域已知的。此类微生物可以优选地通过缺失或失活以下基因进行遗传修饰：
ΔackA(乙酸激酶)、Δldh(乳酸脱氢酶)、ΔadhE(乙醇脱氢酶)、ΔfrdB和/或ΔfrdC(延胡索酸还原酶和延胡索酸脱氢酶)。
在优选的实施方案中，使用其中增加乙酰辅酶A的产率、含量和/或通量的方法。现有技术，例如WO 2013/007786、WO 2020/021051和WO 2020/188033中描述了相应的方法以及具有增加的乙酰辅酶A含量的重组生物体和微生物，其内容通过引用并入本文。
在优选的实施方案中，通过利用具有磷酸转酮酶(PKT)活性的重组生物体或微生物来增加乙酰辅酶A的产率、含量和/或通量，如例如WO 2013/007786、WO 2020/021051和WO2020/188033中所述，其内容通过引用并入本文。
根据步骤(b)将3-甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯
如上所述，在本发明方法的温育步骤(b)(i)或(b)(ii)中，使用与FMN异戊二烯基转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶或表达此类酶的微生物，并将其与本发明步骤(a)中获得的含有3-甲基巴豆酸的液体培养基进行温育。
原则上，在根据本发明的方法的步骤(b)中可以使用与FMN异戊二烯基转移酶相关的任何FMN依赖性脱羧酶(或表达它的微生物)。在现有技术中，例如在WO 2017/085167、WO2018/206262和WO 2020/188033(通过引用并入本文)中已经描述了此类酶用于将3-甲基巴豆酸转化成异丁烯的用途。
在下文中，使用能够将3-甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯的与FMN异戊二烯基转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶，描述了将3-甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯。在本发明中，每当提及与FMN异戊二烯基转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶时，还可以更精确地提及“异戊二烯化的FMN依赖性脱羧酶”并且为了便于提及。
在图1的步骤I)中示意性地示出了3-甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯。可以通过使用与FMN异戊二烯基转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶进行脱羧来实现这种转化。“脱羧”通常是除去羧基并释放二氧化碳(CO2)的化学反应。
利用与FMN异戊二烯基转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶将3-甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯依赖于由两种酶催化的两个连续步骤的反应，即FMN依赖性脱羧酶(催化3-甲基巴豆酸实际脱羧成异丁烯)与提供修饰的黄素辅因子的相关FMN异戊二烯基转移酶。
黄素辅因子优选为FMN或FAD。FMN(黄素单核苷酸；核黄素(也称为核黄素-5′-磷酸酯)是由核黄素(维生素B2)通过核黄素激酶产生的生物分子，并且充当各种反应的辅基。FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸)是氧化还原辅因子，更具体地是辅基，参与代谢中的几项重要反应。
因此，在3-甲基巴豆酸转化成异丁烯的过程中，第一步中，黄素辅因子(FMN或FAD)被修饰为(修饰的)黄素衍生的辅因子。该修饰由所述FMN异戊二烯基转移酶催化。FMN异戊二烯基转移酶将黄素辅因子(FMN或FAD)的黄素环异戊二烯化成(修饰的)异戊二烯化的黄素辅因子。更具体地，FMN异戊二烯基转移酶利用二甲基烯丙基磷酸酯(DMAP)或二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAPP)催化黄素辅因子(FMN或FAD)异戊二烯化成黄素衍生的辅因子。
第二步中，3-甲基巴豆酸向异丁烯的实际转化由所述FMN依赖性脱羧酶经由基于1,3-偶极环加成的机制催化，其中所述FMN依赖性脱羧酶使用由相关FMN异戊二烯基转移酶提供的异戊二烯化的黄素辅因子(FMN或FAD)。
在一个优选的实施方案中，将黄素辅因子(FMN或FAD)修饰成(修饰的)黄素衍生的辅因子(利用二甲基烯丙基磷酸酯(DMAP)或二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAPP))的所述FMN异戊二烯基转移酶是苯基丙烯酸脱羧酶(PAD)型蛋白，或密切相关的原核酶UbiX，UbiX是参与原核生物中泛醌生物合成的酶。
在大肠杆菌中，蛋白质UbiX(也称为3-辛异戊二烯基-4-羟基苯甲酸脱羧酶)已显示参与泛醌生物合成的第三步。
在一个优选的实施方案中，将黄素辅因子(FMN或FAD)修饰为相应的(修饰的)黄素衍生的辅因子是由含有FMN的蛋白苯基丙烯酸脱羧酶(PAD)催化的。参与将黄素辅因子(FMN或FAD)修饰为相应的修饰的黄素衍生的辅因子的酶最初被注释为脱羧酶(EC 4.1.1.-)。一些苯基丙烯酸脱羧酶(PAD)现在被注释为黄素异戊二烯基转移酶，如EC 2.5.1.-。能够催化本文所述的黄素异戊二烯基转移酶的酶促反应的酶最近也被注释为如EC 2.5.1.129的黄素异戊二烯基转移酶。
在一个更优选的实施方案中，3-甲基巴豆酸转化成异丁烯利用苯基丙烯酸脱羧酶(PAD)型蛋白作为FMN异戊二烯基转移酶，其将黄素辅因子(FMN或FAD)修饰为相应的(修饰的)黄素衍生的辅因子，其中所述苯基丙烯酸脱羧酶(PAD)型蛋白来源于白色念珠菌(Candida albicans)(Uniprot登录号Q5A8L8)、黑曲霉(Aspergillus niger)(Uniprot登录号A3F715)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Uniprot登录号P33751)或格氏隐球菌(Cryptococcus gattii)(Uniprot登录号E6R9Z0)。
在另一个优选的实施方案中，将黄素辅因子(FMN或FAD)修饰为相应的(修饰的)黄素衍生的辅因子是由含FMN的蛋白3-辛异戊二烯基-4-羟基苯甲酸脱羧酶(也称为UbiX)(最初注释为EC 4.1.1.-)催化的。如上所述，参与将黄素辅因子(FMN或FAD)修饰为相应的修饰的黄素衍生的辅因子的酶最初被注释为脱羧酶。一些苯基丙烯酸脱羧酶(PAD)现在被注释为如EC 2.5.1.-的黄素异戊二烯基转移酶。
如上所述，能够催化本文所述的黄素异戊二烯基转移酶的酶促反应的酶最近也被注释为如EC 2.5.1.129的黄素异戊二烯基转移酶。
在一个更优选的实施方案中，3-甲基巴豆酸转化成异丁烯利用3-辛异戊二烯基-4-羟基苯甲酸脱羧酶(也称为UbiX)作为FMN异戊二烯基转移酶，其将黄素辅因子(FMN或FAD)修饰为相应的(修饰的)黄素衍生的辅因子，其中所述3-辛异戊二烯基-4-羟基苯甲酸脱羧酶(也称为UbiX)来源于大肠杆菌(Escherichia coli)(Uniprot登录号P0AG03)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(Uniprot登录号A0A086WXG4)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)(Uniprot登录号A0A072ZCW8)或肠杆菌属(Enterobacter sp.)DC4(Uniprot登录号W7P6B1)。
在另一个优选的实施方案中，将黄素辅因子(FMN或FAD)修饰为相应的(修饰的)黄素衍生的辅因子是由来源于大肠杆菌的Ubx样黄素异戊二烯基转移酶催化的，其分别由kpdB和ecdB编码(分别为Uniprot登录号A0A023LDW3和Uniprot登录号P69772)，以及由kpdB编码的来源于肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的Ubix样黄素异戊二烯基转移酶(Uniprot登录号Q462H4)。
在另一个优选的实施方案中，通过黄素异戊二烯基转移酶催化黄素辅因子(FMN或FAD)修饰为相应的(修饰的)黄素衍生的辅因子。
如上所述，实际的脱羧，即3-甲基巴豆酸转化成异丁烯是由FMN依赖性脱羧酶经由基于1,3-偶极环加成的机制催化的，其中所述FMN依赖性脱羧酶使用由任何上述相关的FMN异戊二烯基转移酶提供的异戊二烯化黄素辅因子(FMN或FAD)。
在一个优选的实施方案中，催化3-甲基巴豆酸脱羧为异丁烯的所述FMN依赖性脱羧酶由阿魏酸脱羧酶(FDC)催化。阿魏酸脱羧酶(FDC)属于酶类EC 4.1.1.-。
在一个甚至更优选的实施方案中，3-甲基巴豆酸转化成异丁烯利用阿魏酸脱羧酶(FDC)，该阿魏酸脱羧酶来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Uniprot登录号Q03034)、肠杆菌属(Enterobacter sp.)(Uniprot登录号V3P7U0)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)(Uniprot登录号Q45361)、黑曲霉(Aspergillus niger)(Uniprot登录号A2R0P7)或都柏林假丝酵母(Candida dubliniensis)(Uniprot登录号B9WJ66)。
在另一个更优选的实施方案中，3-甲基巴豆酸转化成异丁烯利用原儿茶酸脱羧酶(EC 4.1.1.63)。
在本发明的一个优选实施方案中，用于本发明方法的PCA脱羧酶是来源于肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)(Uniprot登录号B9AM6)、细鞘丝藻属(Uniprot登录号A0A0S3U6D8)或考拉杆菌属(Uniprot登录号R6IIV6)的PCA脱羧酶。
在另一个优选的实施方案中，催化3-甲基巴豆酸脱羧为异丁烯的所述FMN依赖性脱羧酶是与上述阿魏酸脱羧酶(FDC)密切相关的酶，即3-聚异戊二烯基-4-羟基苯甲酸脱羧酶(也称为UbiD)。3-聚异戊二烯基-4-羟基苯甲酸脱羧酶属于归类为EC 4.1.1.-的UbiD脱羧酶家族。
在一个更优选的实施方案中，3-甲基巴豆酸转化成异丁烯利用了3-聚异戊二烯基-4-羟基苯甲酸脱羧酶(UbiD)，其来源于黑绿肉座菌(Uniprot登录号G9NLP8)、Sphaerulina musiva(Uniprot登录号M3DF95)、洛克福特青霉菌(Uniprot登录号W6QKP7)、尖孢镰刀菌番茄专化型(Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici)(Uniprot登录号W9LTH3)、库德里阿兹威酵母(Uniprot登录号J8TRN5)、酿酒酵母、寄生曲霉、白色念珠菌、Grosmannia clavigera、大肠杆菌(Uniprot登录号P0AAB4)、巨大芽胞杆菌(Uniprot登录号D5DTL4)、甲烷嗜热杆菌CaT2变种(Uniprot登录号T2GKK5)、龟分枝杆菌1518(Uniprot登录号X8EX86)或阴沟肠杆菌(Uniprot登录号V3DX94)。
在另一个更优选的实施方案中，3-甲基巴豆酸转化成异丁烯利用了来源于链霉菌属的UbiD样脱羧酶(Uniprot登录号A0A0A8EV26)。
在一个优选的实施方案中，在本发明方法的温育步骤(b)(i)中，使用过表达与FMN异戊二烯基转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶的微生物，该微生物过表达此类(一种或多种)酶和/或表达此类(一种或多种)酶，该酶显示出改进的性质，例如更高的酶活性或更高的底物特异性。
在另一个优选的实施方案中，在本发明方法的温育步骤(b)(ii)中，使用与FMN异戊二烯基转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶，该FMN依赖性脱羧酶是用过表达此类(一种或多种)酶的微生物产生的，和/或使用显示出改进性质的(一种或多种)酶，例如更高的酶活性或更高的底物特异性。在现有技术中，例如在WO 2018/206262中已经描述了显示出此类改进性质的相应重组微生物和酶。
该文献的公开内容，特别是关于此类(一种或多种)酶和/或显示出改进性质(诸如更高的酶活性或更高的底物)的(一种或多种)酶的过表达，通过引用整体并入本文。
本发明还考虑了从3-甲基巴豆酸或从与3-甲基巴豆酸密切相关的化合物产生异丁烯的替代方式。
例如，在一个实施方案中，还可以想到省略根据本发明的上述方法的培养步骤(a)，并且在如上所述的温育步骤(b)中使用3-甲基巴豆酸(不管它是如何生产的)，其中控制气体供应以允许3-甲基巴豆酸有效转化成异丁烯。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及一种根据本发明的方法，其中省略培养步骤(a)，并将3-甲基巴豆酸(直接)进料到温育步骤(b)中所使用的容器中。因此，在一个实施方案中，本发明涉及由3-甲基巴豆酸产生异丁烯的方法，其特征在于该方法包含：
(a)将3-甲基巴豆酸进料到容器中的液体培养基中；和
(b)通过以下方式将所述液体培养基中含有的所述3-甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯：
(i)将表达与FMN异戊二烯基转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶的微生物与步骤(a)中获得的含有3-甲基巴豆酸的所述液体培养基进行温育；和/或
(ii)将与FMN异戊二烯基转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶与步骤(a)中获得的含有3-甲基巴豆酸的所述液体培养基进行温育；
由此产生所述异丁烯；和
(c)回收所产生的异丁烯，
其中步骤(b)的所述温育在以下中进行：
(a)无气体供应的所述容器；或
(b)使用入口气体以<0.1vvm(容器体积/分钟)供应气体的所述容器。
术语“将3-甲基巴豆酸进料到容器中的液体培养基中”是指将3-甲基巴豆酸提供到容器中的液体培养基中，其中应当进行温育步骤(b)。这可以通过首先提供液体培养基，其中温育应当在容器中进行，然后将3-甲基巴豆酸以所需浓度加入到所述培养基中，或者通过在容器中提供已经含有3-甲基巴豆酸的培养基来实现。用于实现3-甲基巴豆酸转化的微生物/酶可以在提供3-甲基巴豆酸之前、在提供3-甲基巴豆酸之后或同时加入。此外，在温育步骤(b)期间，可以将3-甲基巴豆酸进料到容器中的培养基中。这可以连续或分批进行。以这种方式，例如可以将培养基中3-甲基巴豆酸的浓度保持在允许有效转化成异丁烯的所需水平。因此，在此类实施方案中，还设想监测培养基中3-甲基巴豆酸的浓度(例如，恒定地或以预定的时间间隔)，并通过向培养基中加入另外的3-甲基巴豆酸将浓度调节至所需浓度。
关于温育步骤(b)的进一步优选的实施方案，与以上结合本发明的第一方面所述的相同。
在另一个替代方案中，本发明还涉及如上所述的方法，然而，其中在步骤(a)中不产生3-甲基巴豆酸，而是产生3-甲基巴豆酸的水合形式(即3-羟基-3-甲基丁酸(也称为3-羟基异戊酸，HIV))。
已经描述了通过不同的可能途径产生3-羟基-3-甲基丁酸的方法(参见图2的概述)。例如在WO 2012/052427、WO 2017/085167和WO 2016/042012中描述了利用这些途径和酶转化的方法以及重组生物体和微生物。
这些文献的公开内容，特别是关于其中描述的导致3-羟基-3-甲基丁酸的途径的单独转化的酶的优选实施方案，在此通过引用整体并入。因此，在优选的实施方案中，优选使用选自这些现有技术文献中描述的与各自酶转化有关的优选实施方案的酶。在此类替代方法中，一旦在步骤(a)中产生3-羟基-3-甲基丁酸，温育步骤(b)然后包含从由此产生的3-羟基-3-甲基丁酸产生3-甲基巴豆酸，优选通过热化学转化，通过将其脱水成3-甲基巴豆酸(参见图2用于说明)。在相同的步骤(b)中，由此产生的3-甲基巴豆酸然后如上所述转化成异丁烯。
在另一个优选的实施方案中，如以上对于将步骤(a)中获得的液体培养基中含有的3-甲基巴豆酸热化学转化成异丁烯所概述的，加以必要的修正，在以上替代方案中，其中用3-羟基-3-甲基丁酸代替3-甲基巴豆酸，将步骤(a)中获得的液体培养基中含有的所述3-羟基-3-甲基丁酸优选在180℃与400℃之间的温度热化学转化成异丁烯。
因此，在相应的步骤(b)中，包含在步骤(a)中获得的液体培养基中的3-羟基-3-甲基丁酸被热化学(thermochemically)转化成异丁烯。优选地，所述热化学转化在180℃至400℃的温度进行。
3-羟基-3-甲基丁酸可以根据本领域已知的程序有效地转化成异丁烯和二氧化碳。优选地，3-羟基-3-甲基丁酸在180℃至400℃、优选230℃至350℃的温度被加热。在另一个优选的实施方案中，热化学转化在沸腾反应器、搅拌釜反应器或管式反应器中进行。在另一个优选的实施方案中，热化学转化在0-30巴、优选10-30巴的压力下进行。
优选地，将3-羟基-3-甲基丁酸转化成气态形式的异丁烯、水和二氧化碳。
在另一个替代性实施方案中，本发明涉及如上所述的方法，然而，其中在步骤(a)中，不是产生3-甲基巴豆酸，而是产生3-羟基-3-甲基丁酸的磷酸化形式(即，3-膦氧基-3-甲基丁酸；也称为3-膦氧基异戊酸(PIV))。
已经描述了通过不同的可能途径制备3-膦氧基-3-甲基丁酸的方法(参见图2的概述)。利用这些途径和酶转化的方法以及重组生物体和微生物已描述于例如WO 2012/052427、WO 2017/085167和WO 2016/042012中。
这些文献的公开内容，特别是其中描述的导致3-膦氧基-3-甲基丁酸的途径的单独转化的酶的优选实施方案，在此通过引用整体并入。因此，在优选的实施方案中，优选使用选自这些现有技术文献中描述的与各自酶转化有关的优选实施方案的酶。
在此类替代方法中，一旦在步骤(a)中产生3-膦氧基-3-甲基丁酸，温育步骤(b)然后包含从由此产生的3-膦氧基-3-甲基丁酸产生3-羟基-3-甲基丁酸，优选通过3-膦氧基-3-甲基丁酸的去磷酸化(其中水解导致形成-OH键)(参见图2用于说明)，其中步骤(b)然后进一步包含从由此产生的3-羟基-3-甲基丁酸产生3-甲基巴豆酸，优选通过热化学转化，通过将其脱水成3-甲基巴豆酸。
在相同的步骤(b)中，由此产生的3-甲基巴豆酸然后如上所述转化成异丁烯。
可替代地，在此类替代方法中，一旦在步骤(a)中产生3-膦氧基-3-甲基丁酸，则温育步骤(b)包含从由此产生的3-膦氧基-3-甲基丁酸直接产生3-甲基巴豆酸，优选通过去磷酸化和伴随的双键形成。
在相同的步骤(b)中，由此产生的3-甲基巴豆酸然后如上所述转化成异丁烯。
在另一个替代性实施方案中，本发明涉及如上所述的方法，然而，其中在步骤(a)中，不是产生3-甲基巴豆酸，而是产生3-甲基巴豆酸的水合形式(即3-羟基-3-甲基丁酸(也称为3-羟基异戊酸，HIV))和3-羟基-3-甲基丁酸的磷酸化形式(即3-膦氧基-3-甲基丁酸；也称为3-膦氧基异戊酸(PIV))。
在此类替代方法中，一旦在步骤(a)中产生3-羟基-3-甲基丁酸，温育步骤(b)然后包含如上所述从由此产生的3-羟基-3-甲基丁酸产生3-甲基巴豆酸。在相同的步骤(b)中，然后将由此产生的3-甲基巴豆酸转化成异丁烯。
此外，在此类替代方法中，一旦在步骤(a)中产生3-膦氧基-3-甲基丁酸，则温育步骤(b)包含从由此产生的3-膦氧基-3-甲基丁酸产生3-羟基-3-甲基丁酸，并进一步如上所述产生3-甲基巴豆酸和/或如上所述从由此产生的3-膦氧基-3-甲基丁酸直接产生3-甲基巴豆酸。在相同的步骤(b)中，然后将由此产生的3-甲基巴豆酸转化成异丁烯。
如上所述，根据本发明的方法特别可用于体内大规模生产异丁烯，特别是用于商业生产。本发明描述了商业上且成本有效地生产迄今为止尚未获得的大量异丁烯的新装置和方法。然后可以将生产的大量异丁烯在商业环境中进一步转化，以生产大量例如掺入型(drop-in)汽油(例如异辛烷、ETBE、MTBE)、航空燃料(jet-fuel)、化妆品、化学品，诸如甲基丙烯酸、聚异丁烯或丁基橡胶。如本文所用，异丁烯在发酵容器中或体外的“大规模生产”、“商业生产”和“生物加工”以大于至少100升、优选大于至少400升的容量进行生产，或更优选1000升规模或更大规模生产，甚至更优选5000升规模或更大规模生产。如本文所用，“大量”特别排除微生物中固有产生的痕量。
图1：显示了从乙酰辅酶A经由3-甲基巴豆酸产生异丁烯的人工途径。此外，在步骤Xa、Xb、XI和XII中显示了在该途径中可能发生的代谢物的酶促再循环。
图2：显示了从乙酰辅酶A经由3-甲基巴豆酰辅酶A产生异丁烯的人工途径的主要途径以及从3-甲基巴豆酰辅酶A经由3-甲基巴豆酸到异丁烯的可能途径，而对于某些步骤，指出了相应的酶。
图3：显示了大规模工厂的流程图。IBN：异丁烯。
图4：分别示意性地显示了用于温育的容器“无气体供应”(上图)和“使用入口气体以<0.1vvm(容器体积/分钟)进行气体供应”(下图)。
图5：显示了关于N2、CO2和异丁烯(IBN)的废气随时间的组成。
图6：显示了异丁烯(IBN)和3-甲基巴豆酸消耗速率。
图7：显示了IBN总产量和3-甲基巴豆酸100％转化成异丁烯(IBN)。
图8：显示了分别在没有气体供应和气体供应为<0.1vvm(容器体积/分钟)的温育过程中，相对于气体供应为1vvm的温育过程，产生高浓度的IBN和CO2。
图9：显示了容器中异丁烯为气态时的温度与压力之间的相关性。在曲线上方，异丁烯为液态。在曲线下方，异丁烯为气态。
在本说明书中，引用了包括专利申请在内的许多文件。这些文件的公开内容虽然被认为与本发明的可专利性无关，但通过引用以其整体并入本文。更具体地，所有参考文献以相同的程度通过引用并入，如同每个单独的文件被具体地和单独地指出通过引用并入。
现在将参考以下实施例描述本发明，这些实施例仅仅是说明性的，不应解释为对本发明范围的限制。
实施例
实施例1：在15L反应器中通过两步法产生异丁烯
第一步：从乙酰辅酶A在体内产生3-甲基巴豆酸
本实施例显示通过表达外源基因的重组大肠杆菌菌株产生3-甲基巴豆酸，从而构成3-甲基巴豆酸途径。
与大多数微生物一样，大肠杆菌将葡萄糖转化成乙酰辅酶A。下文中概述了本研究中用于将乙酰辅酶A转化成3-甲基巴豆酸(图2)的酶。
在大肠杆菌中3-甲基巴豆酸生物合成途径的表达
对以下基因进行密码子优化以在大肠杆菌中表达并通过GeneArt(LifeTechnologies)合成：
-thl来自丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)(Uniprot登录号Q6LD78)
-ech(烯酰辅酶A水合酶)来自假单胞菌属(Pseudomonas sp.)(Unipro登录号K9NHK2)
-mvaS来自裂殖酵母菌属(Schizosaccharomyces pombe)(Uniprot登录号P54874)
-aibA和aibB编码来自汉斯粘球菌(Myxococcus hansupus)的戊二烯酸辅酶A转移酶的2个亚基(Uniprot登录号AKQ65711.1和AKQ65710.1)。
-menI来自大肠杆菌(Escherichia coli)(菌株K12)(Uniprot登录号P77781)
根据WO 2017/085167实施例12中描述的程序，含有pSC101复制起点的表达载体(参考：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC320470/)用于表达以下基因：mvaS、Ech、aibA、aibB、ydiI，除了整合FDC1基因。通过测序验证重组pGBE13786质粒。
通过将来自丙酮丁醇梭菌的thl基因整合到ssrS基因座中来修饰菌株MG1655。得到的菌株(GBI19077)是电感受态的，并用pGBE13786转化。
然后将转化的细胞(菌株SB1429)接种在LB平板上，并提供四环素。将平板于30℃温育过夜。分离的菌落用于制备如下所述的预培养物。
3-甲基巴豆酸的产生
向15L容器中装入6L培养基并于121℃灭菌20分钟，该培养基含有15g/L酵母提取物、50mM谷氨酸钠、4mM硫酸镁，5mM硫酸钠、10mM硫酸铵、25mM磷酸二氢钾和25mM磷酸氢二钠。冷却后，加入过滤灭菌的维生素，硫胺素的终浓度为0.6mM，泛酸钙的终浓度为5mM。还加入终浓度如下的过滤灭菌的痕量金属：10μM氯化铁III、4μM氯化钙、2μM氯化锰、2μM硫酸锌、0.4μM氯化铜和0.4μM钼酸钠。然后以1g/L的终浓度加入过滤灭菌的葡萄糖。
除了分批培养基之外，制备两种分批补料溶液。第一种是过滤灭菌的300g/L酵母提取物溶液。第二种是700g/L葡萄糖溶液，其还含有5g/L七水合硫酸镁、10mM谷氨酸钠和终浓度为50μM氯化铁III、20μM氯化钙、10μM氯化锰、10μM硫酸锌、2μM氯化铜和2μM钼酸钠的痕量金属。
用先前于30℃在含有50mM谷氨酸钠和四环素的LB培养基中生长的菌株(SB1429)的500mL预培养物接种培养基。温度保持于32℃持续30小时，然后升高至34℃。通气设置为0.77vvm，调节搅拌以使溶解氧保持在5％的饱和度。
培养6小时后，在18小时内连续加入400mL酵母提取物溶液。平行地，在培养开始后8小时开始葡萄糖分批补料培养，并将特定补料速率保持在0.1g葡萄糖/g细胞干重/小时，持续22小时。
然后将特定进料速率首先增加至0.25g/g/h，随后调节以维持培养基中低水平的葡萄糖和乙酸盐。通过HPLC监测3-甲基巴豆酸的产生，当乙酸而非所期望的产物开始积累时停止发酵。
然后当停止发酵时产生大于20g/L的3-甲基巴豆酸。然后通过离心使培养基澄清并用于第二步以及实施例2。
第二步：由3-甲基巴豆酸产生异丁烯
pSC101衍生载体
(参考：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC320470/)用于表达来自链霉菌属(Streptomyces sp)sp 769(Uniprot登录号A0A0A8EV26)的异戊烯化FMN依赖性3-甲基巴豆酸脱羧酶(FDC)以及来自肺炎克雷伯氏菌的Ubx样黄素异戊二烯基转移酶(kpdB；Uniprot登录号Q462H4)。用构建的质粒转化大肠杆菌MG1655细胞，新获得的菌株SB1505的细胞在含有酵母提取物和矿物盐的丰富培养基上生长至约35g/L的细胞密度，其中葡萄糖作为碳源。通过离心收集细胞并以250g/L的浓度重悬于上清液中并在使用前于4℃保持长达3周。
用12L含有3-甲基巴豆酸盐的培养基填充15L反应器并以800RPM搅拌。将温度设定于37℃并用20％磷酸将pH调节至6.3。将容器用氮气通过喷雾器通气以冲洗来自反应器顶部空间的空气(约3L)并将压力调节在0.5巴。分析出口气体，当不再检测到氧气时，将供气氮气设定为0.017vvm。将1L菌株MB 106的浓缩细胞加入容器中以开始产生异丁烯。
此时，3-甲基巴豆酸的浓度为231mM。
废气随时间的组成如图5所示。
当在培养基中不再检测到3-甲基巴豆酸时，停止产生异丁烯。
实施例2：在1L反应器中从3-甲基巴豆酸产生异丁烯
在1L容器中在以下条件下进行温育步骤：
温育培养基由以下组成：
随时间监测出口气体(IBN、CO2)以及3-甲基巴豆酸消耗。
结果示于图6(显示异丁烯(IBN)和3-甲基巴豆酸消耗速率)、图7(显示IBN总产量和100％的3-甲基巴豆酸转化成异丁烯(IBN))和图8(显示分别在没有气体供应以及气体供应为<0.1vvm的温育过程中，相对于气体供应为1vvm的温育过程，产生高浓度的IBN和CO2)。
总结：
已经表明，当气体供应低(0.05vvm)或没有任何气体供应(0vvm)时：
·IBN浓度高(因此易于纯化)
·没有燃烧/爆炸风险。
实施例3：3-甲基巴豆酸纯化，方法1
根据实施例1中描述的条件运行15升发酵罐。通过离心除去生物质，得到10.8L上清液，含29g/L 3-甲基巴豆酸盐。然后通过加入270g 98％硫酸酸化所得上清液，直至在蒸发步骤之前将pH调节至pH 3.5。
使用旋转蒸发器R300(Buchi)在80℃的加热温度、10℃的冷却温度和150毫巴的压力下进行蒸发。在冷凝器上回收3-甲基巴豆酸的晶体。通过用水洗涤除去它们并使其与馏出物混合。进行蒸发，直至残余物变得粘稠。回收11.7kg馏出物，其含有24.5g/L 3-甲基巴豆酸。
然后，将600g的3M氢氧化钠加入到馏出物中，以便将pH调节在9.1的值。在80℃的加热温度、10℃的冷却温度和150毫巴的压力下进行蒸发，直至固体出现在残余物中。回收900g 35重量％的3-甲基巴豆酸钠。
加入488g 20％硫酸和11g 80％硫酸，产生3-甲基巴豆酸沉淀。将浆液在布氏漏斗(Buchner)上过滤，得到488g含57w％3-甲基巴豆酸的湿固体。
实施例4：3-甲基巴豆酸纯化，方法2
根据实施例1中描述的条件运行15升发酵罐。通过离心除去生物质，得到27.3g/L3-甲基巴豆酸盐的7.1L上清液。然后通过加入204g 3M氢氧化钠调节pH至pH 9.0，进行碱化。
使用旋转蒸发器R300(Buchi)在80℃的加热温度、10℃的冷却温度和150毫巴的压力下进行蒸发。进行蒸发，直至残余物中出现固体。回收1.4kg馏出物，其含有117g/L 3-甲基巴豆酸。
将馏出物冷却至10℃并在布氏漏斗上过滤。
然后，向残余物中加入165g 98％硫酸，以将pH调节至3.78。在80℃的加热温度、10℃的冷却温度、150毫巴的压力下进行蒸发，直至固体出现在残余物中。回收900g 35重量％的3-甲基巴豆酸钠，得到146g湿固体，含52重量％3-甲基巴豆酸。
实施例5：3-甲基巴豆酸纯化，方法3
在200mL带夹套的玻璃搅拌池中，引入40mL澄清肉汤(根据实施例1获得)，其含有21g/L的3-甲基巴豆酸盐。然后通过加入98％硫酸将发酵液酸化至pH＝2。然后以1/1体积％/体积％的比例向细胞中加入40mL溶剂。在该实验中测试以下溶剂：
○2-辛醇(CAS号：123-96-6)
○异十二烷(IDD、CAS号：31807-55-3)
○庚酸(CAS号：111-14-8)
○4-甲基-2-戊酮(CAS号：108-10-1)
将细胞温度设定为20℃并将混合物剧烈搅拌2小时。然后停止搅拌，同时在16小时内形成两个液相。最后，分别回收各相并称重。
然后每个相分析如下：
○水相分析如下：
·LC-RID：3-甲基巴豆酸的定量
·在200℃下的干物质
○有机相分析如下：
·Karl Fisher：水定量
·在200℃下的干物质
测量的分配系数(K)示于下表中：
这表明所测试的四种溶剂可以有效地用于从发酵液中液液萃取3-甲基巴豆酸。
以2.5w％3-甲基巴豆酸、1.1w％乙酸从1kg澄清发酵液中提取3-甲基巴豆酸。加入1kg 2-辛醇并搅拌16小时。倾析后，有机相的质量为1.03kg。组成为97.1w％2-辛醇、2.3w％异戊烯酸、0.5w％乙酸、0.02w％水。将该混合物在21个理论塔板的间歇塔中、在100毫巴的压力和2的回流比下蒸馏。第一馏分含有2-辛醇、乙酸和水：它们的组成随时间变化，直到在蒸馏塔的顶部仅回收2-辛醇。当蒸馏塔中部的温度升高时(也表明蒸发了异戊烯酸)，回流比提高到5。回收含有35％2-辛醇和65％异戊烯酸的中间馏分。下一馏分由4.9g 99.9％的异戊烯酸组成。
实施例6：3-甲基巴豆酸热转化成异丁烯
将如上述实施例3至5中获得的3-甲基巴豆酸熔融至70℃的温度并送至搅拌釜反应器(管式反应器)。反应器在最低220℃的温度和10-30巴的压力下操作。3-甲基巴豆酸转化成气态形式的异丁烯和二氧化碳。
实施例7：3-甲基巴豆酸热转化成异丁烯
3-甲基巴豆酸于100℃熔融并连续泵送。将其预热至85℃并以22g/h的流速送入反应器。反应器是含有2mm玻璃珠的管状反应器(280mL-1英寸直径)。反应器压力为15巴且温度为290℃。在反应器之后，加入两个液体捕集器(依次由水和乙醇和水组成)，使得气体必须通过液体。运行115分钟后，分析样品。测量异丁烯与CO2的比率为65(GC上的面积比)，显示3-甲基巴豆酸对比异丁烯的产率为95％。通过GC-MS分析捕集器中收集的液体，仅显示痕量杂质。一些3-甲基巴豆酸保留在反应器中，解释为转化成异丁烯的转化率小于100％。
实施例8：3-甲基巴豆酸热转化成异丁烯
3-甲基巴豆酸在100℃下熔融并连续泵送。将其预热至85℃并以22g/h的流速送入反应器。反应器是含有2mm玻璃珠的管状反应器(280mL-1英寸直径)。反应器压力为25巴且温度为290℃。在反应器之后，加入两个液体捕集器(依次由水和乙醇和水组成)，使得气体必须通过液体。运行70分钟后，分析样品。测量3-甲基巴豆酸对比异丁烯的产率为101％。通过GC-MS分析捕集器中收集的液体，仅显示痕量杂质。在反应器中回收一些3-甲基巴豆酸。
实施例9：从乙酰辅酶A产生3-羟基-3-甲基丁酸
本实施例显示通过表达外源基因的重组大肠杆菌菌株产生3-羟基-3-甲基丁酸，从而构成3-羟基-3-甲基丁酸途径。
与大多数微生物一样，大肠杆菌将葡萄糖转化成乙酰辅酶A。下文中概述了本研究中用于将乙酰辅酶A转化成3-羟基-3-甲基丁酸(图2)的酶。
9.1 3-羟基-3-甲基丁酸生物合成途径在大肠杆菌中的表达
对以下基因进行密码子优化以在大肠杆菌中表达并通过GeneArt(LifeTechnologies)合成：
-thl来自丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)(Uniprot登录号P45359)
-mvaS来自粪肠球菌(Enterococcus faecalis)(Uniprot登录号P54874)
-aibA和aibB编码来自汉斯粘球菌(Myxococcus hansupus)的戊二烯酸辅酶A转移酶的2个亚基(Uniprot登录号A0A0H4WQB1和A0A0H4WWJ4)。
-tesB来自大肠杆菌(Escherichia coli)(菌株K12)(Uniprot登录号P0AGG2)
-liuC来自黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)(Uniprot登录号Q1D5Y4)
根据WO2017/085167实施例12中描述的程序，含有pSC101复制起点的表达载体(参考：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC320470/)用于表达以下基因：mvaS、Ech、aibA、aibB、menI、liuC，除了一方面整合FDC1基因，另一方面用liuC基因取代ech基因。通过测序验证重组pGB5550质粒(SEQ ID NO：1)。
通过将来自丙酮丁醇梭菌的thl基因整合到ssrS基因座中来修饰菌株MG1655。
进行ackA、pta和poxB基因的缺失，以减少乙酰辅酶A转化成乙酸酯。基因ldhA也缺失，以减少乳酸产生。得到的菌株(GBI19706)是电感受态的，并用质粒pGB 5550转化。
然后将转化的细胞、菌株SB1655接种在LB平板上，并提供大观霉素。将平板于30℃温育过夜。分离的菌落用于制备如下所述的预培养物。
9.2以分批补料方式产生3-羟基-3-甲基丁酸
向1L容器中装入0.5L培养基并于121℃灭菌20分钟，该培养基含有5g/L酵母提取物、10g/L胰蛋白胨、50mM谷氨酸钠、4mM硫酸镁、5mM硫酸钠、10mM硫酸铵、25mM磷酸二氢钾和25mM磷酸氢二钠。冷却后，加入过滤灭菌的维生素，硫胺素的终浓度为0.6mM，泛酸钙的终浓度为5mM，培养基中还加入50mg/L过滤灭菌的大观霉素。还以10μM氯化铁III、4μM氯化钙、2μM氯化锰、2μM硫酸锌、0.4μM氯化铜和0.4μM钼酸钠的终浓度加入过滤灭菌的痕量金属。然后以1g/L的终浓度加入过滤灭菌的葡萄糖。
除了分批培养基之外，制备两种分批补料溶液。第一种是过滤灭菌的250g/L酵母提取物溶液。第二种是600g/L葡萄糖溶液，其还含有5g/L七水合硫酸镁、20g/L谷氨酸钠和终浓度为50μM氯化铁III、20μM氯化钙、10μM氯化锰、10μM硫酸锌、2μM氯化铜和2μM钼酸钠的痕量金属。
用先前于30℃含有50mM谷氨酸钠和50mg/L大观霉素的LB培养基中生长的菌株SB1653的500mL预培养物接种培养基。将温度于32℃保持30小时，然后升高至34℃。通气设置为2vvm，并调节搅拌以将溶解氧保持在5％的饱和度。将pH调节至6.5。
培养8h、12h和16h后，每次加入10mL酵母提取物溶液。平行地，在培养开始后8小时，开始葡萄糖分批补料培养，并将比补料速率保持在0.08g葡萄糖/g细胞干重/小时持续22小时。
然后增加进料速率以输送4g/l/h葡萄糖，随后调节以维持培养基中低水平的葡萄糖和乙酸盐。通过HPLC监测3-羟基-3-甲基丁酸的产生，当乙酸开始积累而非期望产物时停止发酵。
然后当停止发酵时产生大于80g/L的3-羟基-3-甲基丁酸。
9.3以半连续方式产生3-羟基-3-甲基丁酸
向1L容器中填充0.5L培养基，该培养基含有15g/L酵母提取物、13.4g/l谷氨酸钠、2.2g/l硫酸镁、0.85g/l磷酸二氢钾和1.1g/l磷酸氢二钠，并于121℃灭菌20分钟。冷却后，加入过滤灭菌的维生素，硫胺素的终浓度为0.6mM，泛酸钙的终浓度为5mM，培养基中还加入50mg/L过滤灭菌的大观霉素。还以10μM氯化铁III、4μM氯化钙、2μM氯化锰、2μM硫酸锌和0.4μM氯化铜的终浓度加入过滤灭菌的痕量金属。然后以5g/L的终浓度加入过滤灭菌的葡萄糖。
除了分批培养基之外，制备两种分批补料溶液。第一种是过滤灭菌的600g/L葡萄糖溶液。第二种是含有0.85g/l磷酸二氢钾、1.1g/l磷酸氢二钠、2g/L七水硫酸镁、50μM氯化铁III、20μM氯化钙、10μM氯化锰、10μM硫酸锌和2μM氯化铜的盐水溶液。将1L容器连接至vivaflow 200PES(200cm2，0.2μ)模块(Sartorius)，以便在将培养物体积维持在约0.5升的同时使细胞再循环，并且以便获得含有3-羟基-3-甲基丁酸的渗透物。
用先前于30℃含有50mM谷氨酸钠和大观霉素的LB培养基中生长的500mL菌株(SB1654)的预培养物接种培养基。温度保持在32℃。通气设置为0.5vvm，并调节搅拌以将溶解氧保持在5％的饱和度。使用30％氨溶液和5M磷酸将pH调节至7.5。
培养7.5小时后，加入5g/l葡萄糖。然后，培养9小时后，用3g/l/h葡萄糖补料7小时。培养16小时后，补料0.3g葡萄糖/g细胞干重/小时。
通过HPLC监测3-羟基-3-甲基丁酸的产生，当发酵停止时产生超过12L的3-羟基-3-甲基丁酸溶液。
实施例10：通过浓缩纯化3-羟基-3-甲基丁酸(HMB)
离心如实施例9.2中所述获得的并含有48g 3-羟基-3-甲基丁酸(HMB)的590ml肉汤。回收上清液并用浓硫酸调节至pH 3.3。然后使用Buchi 300蒸发器在50℃和20毫巴压力下将酸化的发酵液浓缩至90ml。将浓缩物离心以除去固体，并以类似的方式将上清液再次蒸发至35ml的体积。将该新浓缩物也离心，最后回收26ml含有18g HMB(684g/L)的均质上清液。
实施例11：通过液体萃取纯化3-羟基-3-甲基丁酸(HMB)
使用Buchi 300蒸发器，在80℃和180毫巴压力下，将如实施例9.3中所述获得并含有177g 3-羟基-3-甲基丁酸(HMB)和约153g乙酸的pH7.6的11.9L渗透物浓缩至1.7L。用浓硫酸使浓缩物达到pH 3.84，然后首先用1.3L、再用1.1L MIBK(甲基异丁基酮)萃取两次。将两个MIBK层合并，并使用Buchi 300蒸发器在85℃和在首先150毫巴压力并在操作结束时降至10毫巴下进行蒸发。回收125ml液相(132g)，其含有93gHMB和10g乙酸。
序列表
<110> 环球生物能源公司（GLOBAL BIOENERGIES）
<120> 用于从3-甲基巴豆酸产生异丁烯的改进装置和方法
<130> AD3993 PCT S3
<150> EP 20 215 872.1
<151> 2020-12-21
<160> 1
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 10770
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组pGB 5550质粒
<400> 1
ctcactactt tagtcagttc cgcagtatta caaaaggatg tcgcaaacgc tgtttgctcc 60
tctacaaaac agaccttaaa accctaaagg cttaagtagc accctcgcaa gctcgggcaa 120
atcgctgaat attccttttg tctccgacca tcaggcacct gagtcgctgt ctttttcgtg 180
acattcagtt cgctgcgctc acggctctgg cagtgaatgg gggtaaatgg cactacaggc 240
gccttttatg gattcatgca aggaaactac ccataataca agaaaagccc gtcacgcttc 300
tcagggcgtt ttatggcggg tctgctatgt ggtgctatct gactttttgc tgttcagcag 360
ttcctgccct ctgattttcc agtctgaccc tagtcaaggc cttaagtgag tcgtattacg 420
gactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc 480
gccttgcagc acatccccct ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc 540
gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg gcgaatggcg cctgatgcgg tattttctcc 600
ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgcc cggggaacta tagtttaaac ttttcaatga 660
attcatttaa gcggccgcat caattctaga atttaaatag tcaaaagcct ccgaccggag 720
gcttttgact gacctattga caattaaagg ctaaaatgct ataattccac taatagaaat 780
aattttgttt aactttaggt ctctatcgta agaaggagat atacatatga aagaagtggt 840
gattgccagc gcagttcgta ccgcaattgg tagctatggt aaaagcctga aagatgttcc 900
ggcagttgat ctgggtgcaa ccgcaattaa agaagcagtt aaaaaagccg gtattaaacc 960
ggaagatgtg aacgaagtta ttctgggtaa tgttctgcaa gcaggtctgg gtcagaatcc 1020
ggcacgtcag gcctcgttta aagcaggtct gccggttgaa attccggcaa tgaccattaa 1080
caaagtttgt ggtagcggtc tgcgtaccgt tagcctggca gcacagatta tcaaagccgg 1140
tgatgcagat gttattattg ccggtggtat ggaaaatatg agccgtgcac cgtatctggc 1200
aaataatgca cgttggggtt atcgtatggg taatgccaaa tttgtggatg agatgattac 1260
cgatggtctg tgggatgcct ttaatgatta tcacatgggt attaccgcag agaatattgc 1320
agaacgttgg aatattagcc gtgaagaaca ggatgaattt gcactggcaa gccagaaaaa 1380
agcagaagaa gcaattaaaa gcggtcagtt caaagatgaa attgtgccgg ttgttatcaa 1440
aggtcgtaaa ggtgaaaccg ttgttgatac cgatgaacat ccgcgttttg gtagcaccat 1500
tgaaggtctg gcaaaactga aaccggcatt caaaaaagat ggcaccgtta ccgcaggtaa 1560
tgcaagcggt ctgaatgatt gtgcagcagt tctggttatt atgagcgcag aaaaagcaaa 1620
agaactgggt gttaaaccgc tggcaaaaat tgtgagctat ggtagtgccg gtgttgatcc 1680
ggcaattatg ggttatggtc cgttttatgc aaccaaagca gcaattgaaa aagcaggttg 1740
gaccgttgat gaactggatc tgattgaaag caatgaagca tttgcagcac agagcctggc 1800
agttgcaaaa gacctgaaat tcgatatgaa taaagtgaat gtgaatggcg gtgcaattgc 1860
cctgggtcat ccgattggtg caagcggtgc acgtattctg gttaccctgg ttcatgcaat 1920
gcagaaacgt gatgcaaaaa aaggtctggc caccctgtgt attggtggtg gtcagggcac 1980
cgcaattctg ctggaaaaat gctaataagc ttgaaggaga tataatgacc attggtattg 2040
ataaaatcag ctttttcgtg cctccgtact atattgatat gaccgcactg gccgaagcac 2100
gtaatgttga tccgggtaaa tttcatattg gtattggtca ggatcagatg gccgttaatc 2160
cgattagcca ggatattgtt acctttgcag caaatgcagc agaagcaatt ctgaccaaag 2220
aagataaaga ggccattgat atggttattg ttggcaccga aagcagcatt gatgaaagca 2280
aagcagcagc agttgttctg catcgtctga tgggtattca gccgtttgca cgtagctttg 2340
aaattaaaga agcatgttac ggagcaaccg caggtctgca actggcaaaa aatcatgttg 2400
cactgcatcc ggataaaaaa gttctggttg ttgcagcaga tattgccaaa tatggtctga 2460
atagcggtgg tgaaccgacc cagggtgccg gtgcagttgc aatgctggtt gcaagcgaac 2520
cgcgtattct ggcactgaaa gaagataatg ttatgctgac ccaggatatt tatgattttt 2580
ggcgtccgac cggtcatccg tatccgatgg ttgatggtcc gctgagcaat gaaacctata 2640
ttcagagctt tgcacaggtg tgggatgaac ataaaaaacg taccggtctg gatttcgcag 2700
attatgatgc actggcattt catatcccgt ataccaaaat gggtaaaaaa gcactgctgg 2760
ccaaaattag cgatcagacc gaagccgaac aagaacgcat tctggcacgt tatgaagaaa 2820
gcattgttta tagccgtcgt gtgggtaatc tgtataccgg tagcctgtat ctgggtctga 2880
ttagcctgct ggaaaatgca accaccctga ccgcaggtaa tcagattggt ctgtttagct 2940
atggtagcgg tgccgttgca gaatttttca caggtgaact ggttgcaggt tatcagaatc 3000
atctgcaaaa agaaacccat ctggcactgc tggataatcg taccgaactg agcattgcag 3060
aatatgaagc aatgtttgca gaaaccctgg ataccgatat tgatcagacc ctggaagatg 3120
aactgaaata tagcattagc gccattaata acaccgtgcg tagctatcgt aactaataag 3180
gtagaaggag atataatgcc ggaatttaaa gttgatgcac gtggtccgat tgaaatctgg 3240
accattgatg gtgaaagccg tcgtaatgca attagccgtg caatgctgaa agaactgggt 3300
gaactggtta cccgtgttag cagcagccgt gatgttcgtg cagttgttat taccggtgcc 3360
ggtgataaag cattttgtgc cggtgccgat ctgaaagaac gtgcaacaat ggccgaagat 3420
gaagttcgtg catttctgga tggtctgcgt cgtacctttc gtgcaattga aaaaagcgat 3480
tgcgttttta ttgcagccat taatggtgcc gcactgggtg gtggcaccga actggcactg 3540
gcatgtgatc tgcgtgttgc agcaccggca gcagaactgg gtctgaccga agttaaactg 3600
ggcattattc cgggtggtgg tggtacacag cgtctggcac gtctggttgg tccgggtcgt 3660
gcaaaagacc tgattctgac cgcacgtcgt attaatgcag cagaagcatt tagcgttggt 3720
ctggcaaatc gtctggcacc ggaaggtcat ctgctggcag ttgcctatgg tctggcagaa 3780
agcgttgttg aaaatgcacc gattgcagtt gcaaccgcaa aacatgcaat tgatgaaggc 3840
accggtctgg aactggatga tgcactggca ctggaactgc gtaaatatga agaaattctg 3900
aaaaccgaag atcgcctgga aggtctgcgt gcatttgcag aaaaacgtgc accggtttat 3960
aaaggtcgct aataagaacg aaggagatat aatgaaaacc gcacgttggt gtagcctgga 4020
agaagcagtt gcaagcattc cggatggtgc aagcctggca accggtggtt ttatgctggg 4080
tcgtgcaccg atggcactgg ttatggaact gattgcacag ggtaaacgtg atctgggtct 4140
gattagcctg ccgaatccgc tgccagcaga atttctggtt gccggtggtt gtctggctcg 4200
tctggaaatt gcatttggtg cactgagtct gcaaggtcgt gttcgtccga tgccgtgtct 4260
gaaacgtgca atggaacagg gcaccctggc atggcgtgaa catgatggtt atcgtgttgt 4320
tcagcgtctg cgtgcagcaa gcatgggtct gccgtttatt ccggcaccgg atgcagatgt 4380
tagcggtctg gcacgtaccg aaccgcctcc gaccgttgaa gatccgttta ccggtctgcg 4440
tgttgcagtt gaaccggcat tttatccgga tgttgcactg ctgcacgcac gtgcagccga 4500
tgaacgtggt aatctgtata tggaagatcc gaccaccgat ctgctggttg cgggtgcagc 4560
aaaacgtgtt attgcaaccg ttgaagaacg tgttgcaaaa ctgcctcgtg caaccctgcc 4620
tggttttcag gttgatcgta ttgttctggc accgggtggt gcactgccga ccggttgtgc 4680
aggtctgtat ccgcatgatg atgaaatgct ggcacgttat ctgagcctgg cagaaaccgg 4740
tcgtgaagcc gaatttctgg aaaccctgct gacccgtcgt gcagcataat gaggatccga 4800
aggagatata catatgagcg caaccctgga tattacaccg gcagaaaccg ttgttagcct 4860
gctggcacgt cagattgatg atggtggtgt tgttgcaacc ggtgttgcaa gtccgctggc 4920
aattctggcc attgcagttg cacgtgccac ccatgcaccg gatctgacct atctggcatg 4980
tgttggtagc ctggacccgg aaattccgac cctgctgccg agcagcgaag acctgggtta 5040
tctggatggt cgtagcgcag aaattaccat tccggacctg tttgatcatg cacgtcgtgg 5100
tcgtgttgat accgtttttt ttggtgcagc cgaagttgat gccgaaggtc gtaccaatat 5160
gaccgcaagc ggtagtctgg ataaaccgcg taccaaattt ccgggtgttg ccggtgcagc 5220
caccctgcgt cagtgggttc gtcgtccggt tctgctggtt ccgcgtcaga gccgtcgtaa 5280
tctggttccg gaagttcagg ttgcaaccac ccgtgatccg cgtcgtccgg tgaccctgat 5340
tagcgatctg ggtgtttttg aactgggtgc aagcggtgca cgtctgctgg cacgccatcc 5400
gtgggcaagc gaagaacata ttgcagaacg taccggtttt gcatttcagg ttagcgaagc 5460
actgagcgtt accagcctgc cggatgcacg taccgttgca gcaattcgtg caattgatcc 5520
gcatggctat cgtgatgcac tggttggtgc ataataataa gagagaccag cctgatacag 5580
attaaatcag aacgcagaag cggtctgata aaacagaatt tgcctggcgg cagtagcgcg 5640
gtggtcccac ctgaccccat gccgaactca gaagtgaaac gccgtagcgc cgatggtagt 5700
gtggggtcac cccatgcgag agtagggaac tgccaggcat caaataaaac gaaaggctca 5760
gtcgaaagac tgggcctttc gttttatctg ttgtttgtcg gtgaactact agaatttaaa 5820
tagtcaaaag cctccgaccg gaggcttttg actgacactt tgacacaccc tttacccccc 5880
ttataattaa cgtaatagaa ataattttgt ttaactttag gtctctatcg accataatta 5940
attaacttta agaaggagat atacatatga gtcaggcgct aaaaaattta ctgacattgt 6000
taaatctgga aaaaattgag gaaggactct ttcgcggcca gagtgaagat ttaggtttac 6060
gccaggtgtt tggcggccag gtcgtgggtc aggccttgta tgctgcaaaa gagacggtcc 6120
ctgaagaacg gctggtacat tcgtttcaca gctactttct tcgccctggc gatagtaaga 6180
agccgattat ttatgatgtc gaaacgctgc gtgacggtaa cagcttcagc gcccgccggg 6240
ttgctgctat tcaaaacggc aaaccgattt tttatatgac tgcctctttc caggcaccag 6300
aagcgggttt cgaacatcaa aaaacaatgc cgtccgcgcc agcgcctgat ggcctccctt 6360
cggaaacgca aatcgcccaa tcgctggcgc acctgctgcc gccagtgctg aaagataaat 6420
tcatctgcga tcgtccgctg gaagtccgtc cggtggagtt tcataaccca ctgaaaggtc 6480
acgtcgcaga accacatcgt caggtgtgga ttcgcgcaaa tggtagcgtg ccggatgacc 6540
tgcgcgttca tcagtatctg ctcggttacg cttctgatct taacttcctg ccggtagctc 6600
tacagccgca cggcatcggt tttctcgaac cggggattca gattgccacc attgaccatt 6660
ccatgtggtt ccatcgcccg tttaatttga atgaatggct gctgtatagc gtggagagca 6720
cctcggcgtc cagcgcacgt ggctttgtgc gcggtgagtt ttatacccaa gacggcgtac 6780
tggttgcctc gaccgttcag gaaggggtga tgcgtaatca caattaataa ccatggttat 6840
aagagagacc agcctgatac agattaaatc agaacgcaga agcggtctga taaaacagaa 6900
tttgcctggc ggcagtagcg cggtggtccc acctgacccc atgccgaact cagaagtgaa 6960
acgccgtagc gccgatggta gtgtggggtc accccatgcg agagtaggga actgccaggc 7020
atcaaataaa acgaaaggct cagtcgaaag actgggcctt tcgttttatc tgttgtttgt 7080
cggtgaacta ctagttggcg ggcggccgct tagctctgca gatgagaaat tcttgaagac 7140
gaaagggcct cgtgatacgc ctatttttat aggttaatgt catgataata atggtttaag 7200
cttcttagaa tagctcttct atgaggtggc acttttcggg gaaagatatc cgcatatatg 7260
gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta agccagtata cactccgcta 7320
tcgctacgtg actgggtcat ggctgcgccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc 7380
tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc 7440
tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg cgaggcagct gcggtaaagc 7500
tcatcagcgt ggtcgtgaag cgattcacag atgtctgcct gttcatcggt acctttcatg 7560
atatatctcc caatttgtgt agggcttatt atgcacgctt aaaaataata aaagcagact 7620
tgacctgata gtttggctgt gagcaattat gtgcttagtg catctaacgc ttgagttaag 7680
ccgcgccgcg aagcggcgtc ggcttgaacg aattgttaga cattatttgc cgactacctt 7740
ggtgatctcg cctttcacgt agtggacaaa ttcttccaac tgatctgcgc gcgaggccaa 7800
gcgatcttct tcttgtccaa gataagcctg tctagcttca agtatgacgg gctgatactg 7860
ggccggcagg cgctccattg cccagtcggc agcgacatcc ttcggcgcga ttttgccggt 7920
tactgcgctg taccaaatgc gggacaacgt aagcactaca tttcgctcat cgccagccca 7980
gtcgggcggc gagttccata gcgttaaggt ttcatttagc gcctcaaata gatcctgttc 8040
aggaaccgga tcaaagagtt cctccgccgc tggacctacc aaggcaacgc tatgttctct 8100
tgcttttgtc agcaagatag ccagatcaat gtcgatcgtg gctggctcga agatacctgc 8160
aagaatgtca ttgcgctgcc attctccaaa ttgcagttcg cgcttagctg gataacgcca 8220
cggaatgatg tcgtcgtgca caacaatggt gacttctaca gcgcggagaa tctcgctctc 8280
tccaggggaa gccgaagttt ccaaaaggtc gttgatcaaa gctcgccgcg ttgtttcatc 8340
aagccttacg gtcaccgtaa ccagcaaatc aatatcactg tgtggcttca ggccgccatc 8400
cactgcggag ccgtacaaat gtacggccag caacgtcggt tcgagatggc gctcgatgac 8460
gccaactacc tctgatagtt gagtcgatac ttcggcgatc accgcttccc tcatgatgtt 8520
taactttgtt ttagggcgac tgccctgctg cgtaacatcg ttgctgctcc ataacatcaa 8580
acatcgaccc acggcgtaac gcgcttgctg cttggatgcc cgaggcatag actgtacccc 8640
aaaaaaacag tcataacaag ccatgaaaac cgccacgagc tcctgtcaga ccaagtttac 8700
gagctcgctt ggactcctgt tgatagatcc agtaatgacc tcagaactcc atctggattt 8760
gttcagaacg ctcggttgcc gccgggcgtt ttttattggt gagaatccaa gcactaggga 8820
cagtaagacg ggtaagcctg ttgatgatac cgctgcctta ctgggtgcat tagccagtct 8880
gaatgacctg tcacgggata atccgaagtg gtcagactgg aaaatcagag ggcaggaact 8940
gctgaacagc aaaaagtcag atagcaccac atagcagacc cgccataaaa cgccctgaga 9000
agcccgtgac gggcttttct tgtattatgg gtagtttcct tgcatgaatc cataaaaggc 9060
gcctgtagtg ccatttaccc ccattcactg ccagagccgt gagcgcagcg aactgaatgt 9120
cacgaaaaag acagcgactc aggtgcctga tggtcggaga caaaaggaat attcagcgat 9180
ttgcccgagc ttgcgagggt gctacttaag cctttagggt tttaaggtct gttttgtaga 9240
ggagcaaaca gcgtttgcga catccttttg taatactgcg gaactgacta aagtagtgag 9300
ttatacacag ggctgggatc tattcttttt atcttttttt attctttctt tattctataa 9360
attataacca cttgaatata aacaaaaaaa acacacaaag gtctagcgga atttacagag 9420
ggtctagcag aatttacaag ttttccagca aaggtctagc agaatttaca gatacccaca 9480
actcaaagga aaaggacatg taattatcat tgactagccc atctcaattg gtatagtgat 9540
taaaatcacc tagaccaatt gagatgtatg tctgaattag ttgttttcaa agcaaatgaa 9600
ctagcgatta gtcgctatga cttaacggag catgaaacca agctaatttt atgctgtgtg 9660
gcactactca accccacgat tgaaaaccct acaaggaaag aacggacggt atcgttcact 9720
tataaccaat acgctcagat gatgaacatc agtagggaaa atgcttatgg tgtattagct 9780
aaagcaacca gagagctgat gacgagaact gtggaaatca ggaatccttt ggttaaaggc 9840
tttgagattt tccagtggac aaactatgcc aagttctcaa gcgaaaaatt agaattagtt 9900
tttagtgaag agatattgcc ttatcttttc cagttaaaaa aattcataaa atataatctg 9960
gaacatgtta agtcttttga aaacaaatac tctatgagga tttatgagtg gttattaaaa 10020
gaactaacac aaaagaaaac tcacaaggca aatatagaga ttagccttga tgaatttaag 10080
ttcatgttaa tgcttgaaaa taactaccat gagtttaaaa ggcttaacca atgggttttg 10140
aaaccaataa gtaaagattt aaacacttac agcaatatga aattggtggt tgataagcga 10200
ggccgcccga ctgatacgtt gattttccaa gttgaactag atagacaaat ggatctcgta 10260
accgaacttg agaacaacca gataaaaatg aatggtgaca aaataccaac aaccattaca 10320
tcagattcct acctacgtaa cggactaaga aaaacactac acgatgcttt aactgcaaaa 10380
attcagctca ccagttttga ggcaaaattt ttgagtgaca tgcaaagtaa gcatgatctc 10440
aatggttcgt tctcatggct cacgcaaaaa caacgaacca cactagagaa catactggct 10500
aaatacggaa ggatctgagg ttcttatggc tcttgtatct atcagtgaag catcaagact 10560
aacaaacaaa agtagaacaa ctgttcaccg ttagatatca aagggaaaac tgtccataag 10620
cacagatgaa aacggtgtaa aaaagataga tacatcagag cttttacgag tttttggtgc 10680
atttaaagct gttcaccatg aacagatcga caatgtaacg catgcaccga gcgcagcgag 10740
tcagtgagcg aggaagcgga acagcgcctg 10770
Claims (10)
1.一种从碳源产生异丁烯的方法，其特征在于，所述方法包含：
(a)在液体培养基中培养能够从碳源产生3-甲基巴豆酸的微生物，从而
产生所述3-甲基巴豆酸，使其在液体培养基中积累；和
(b)通过以下方式将步骤(a)中获得的液体培养基中含有的所述3-甲基巴豆酸酶促转化成异丁烯：
(i)将表达与FMN异戊二烯基转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶的微生物与步骤(a)中获得的含有3-甲基巴豆酸的所述液体培养基进行温育；和/或
(ii)将与FMN异戊二烯基转移酶相关的FMN依赖性脱羧酶与步骤(a)中获得的含有3-甲基巴豆酸的所述液体培养基进行温育；
从而产生所述异丁烯；和
(c)回收所产生的异丁烯；或
其中从碳源产生异丁烯的方法的特征在于，所述方法包含：
(a)在液体培养基中培养能够从碳源产生3-甲基巴豆酸的微生物，从而
产生所述3-甲基巴豆酸，使其在液体培养基中积累；和
(b)优选在180℃至400℃的温度，将步骤(a)中获得的液体培养基中
含有的所述3-甲基巴豆酸热化学转化成异丁烯；和
(c)回收所产生的异丁烯。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)的所述温育在以下中进行：
(a)无气体供应的容器；或
(b)使用入口气体以<0.1vvm(容器体积/分钟)进行气体供应的容器。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤(b)之前，将步骤(a)的含有所述3-甲基巴豆酸的液体培养基与所述微生物分离。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在权利要求1的步骤(b)之前，从所述液体培养基中分离或纯化所述3-甲基巴豆酸。
5.根据权利要求1中4中任一项所述的方法，其中所述入口气体是空气、惰性气体或空气与惰性气体的混合物，其中所述惰性气体优选选自氮气、氦气、氩气、氖气、CO2和这些气体的混合物。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述碳源在其酶促转化成3-甲基巴豆酸之前被代谢成乙酰辅酶A。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述碳源选自葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、甘油、淀粉、乙醇、乳酸、乙酸及其混合物。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中在权利要求1的转化步骤(b)(i)之前，在合适的条件下在合适的液体培养基中预培养权利要求1(b)(i)中使用的所述微生物。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，还包含纯化/富集所回收的异丁烯。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述微生物是细菌、酵母、真菌或藻类。
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