CN107075536B - 生产3-羟基-3-甲基丁酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明描述了一种将3‑甲基巴豆酰基‑CoA转化为3‑羟基‑3‑甲基丁酸的方法，该方法包括以下步骤：(a)将3‑甲基巴豆酰基‑CoA酶促转化为3‑羟基‑3‑甲基丁酰基‑CoA；和(b)进一步将由此产生的3‑羟基‑3‑甲基丁酰基‑CoA酶促转化为3‑羟基‑3‑甲基丁酸；其中，根据步骤(b)的3‑羟基‑3‑甲基丁酰基‑CoA到3‑羟基‑3‑甲基丁酸的酶促转化，通过首先将3‑羟基‑3‑甲基丁酰基‑CoA转化为3‑羟基‑3‑甲基丁酰基‑磷酸、然后将由此生产的3‑羟基‑3‑甲基丁酰基磷酸转化为3‑羟基‑3‑甲基丁酸来实现。

Description

生产3-羟基-3-甲基丁酸的方法

技术领域

本发明涉及生产3-羟基-3-甲基丁酸的方法。

在一个方面，本发明涉及一种生产3-羟基-3-甲基丁酸的方法，该方法包括将3-甲基巴豆酰基-CoA酶促转化为3-甲基巴豆酸的步骤和将由此产生的3-甲基巴豆酸进一步酶促转化为3-羟基-3-甲基丁酸的步骤。可以通过直接转化来实现3-甲基巴豆酰基-CoA转化为3-甲基巴豆酸，其优选利用属于硫酯水解酶家族(也称为硫酯酶；EC 3.1.2))或者CoA-转移酶家族(EC 2.8.3)的酶。或者，可以通过以下转化实现3-甲基巴豆酰基-CoA转化为3-甲基巴豆酸，该转化首先包括将3-甲基巴豆酰基-CoA转化为3-甲基巴豆酰基-磷酸，随后将3-甲基巴豆酰基-磷酸转化为3-甲基巴豆酸。3-甲基巴豆酸向3-羟基-3-甲基丁酸的转化优选使用属于水裂合酶(EC 4.2.1)家族的酶，特别是乌头酸水合酶(EC 4.2.1.3)家族或马来酸水合酶(EC 4.2.1.31)家族或2-甲基柠檬酸脱水酶(EC 4.2.1.79)家族的酶。

本发明还涉及一种从3-甲基巴豆酰基-CoA生产3-羟基-3-甲基丁酸的方法，该方法包括以下步骤：

(a)将3-甲基巴豆酰基-CoA酶促转化为3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA；和

(b)进一步将由此产生的3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA酶促转化为3-羟基-3-甲基丁酸，

其中通过首先将3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA转化为3-羟基-3-甲基丁酰基-磷酸，然后将由此产生的3-羟基-3-甲基丁酰基磷酸转化为3-羟基-3-甲基丁酸，实现根据步骤(b)的将3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA酶促转化为3-羟基-3-甲基丁酸。

背景技术

目前大量的化学化合物来自石化产品。烯烃(如乙烯、丙烯、不同的丁烯、或者例如戊烯)用于塑料工业中，例如用于生产聚丙烯或聚乙烯，以及用于化学工业和燃料的其它领域。

丁烯以四种形式存在，其中一种异丁烯(isobutene)(也称为异丁烯(isobutylene))进入甲基-叔-丁基-醚(MTBE)(用于汽车燃料的抗爆添加剂)的组成中。异丁烯也可用于生产异辛烯，该异辛烯又可以还原为异辛烷(2,2,4-三甲基戊烷)；异辛烷的极高辛烷值使其成为所谓的“汽油”发动机的最佳燃料。烯烃如异丁烯目前通过石油产品的催化裂化(或在己烯的情况下，通过费希尔-特罗普希法(Fischer-Tropsch)的衍生，自煤或气)生产。因此，生产成本与油价格紧密相关。此外，催化裂化有时与相当多的技术困难相关，这增加了工艺复杂性和生产成本。

在与地球化学循环相协调的可持续工业操作的背景下，需要通过生物途径生产烯烃如异丁烯。第一代生物燃料为乙醇的发酵生产，因为发酵和蒸馏方法已经存在于食品加工工业中。第二代生物燃料的生产处于探索阶段，特别包括长链醇(丁醇和戊醇)、萜烯、直链烷烃和脂肪酸的生产。两篇最近的综述提供了在这一领域研究的一般概述：Ladygina等人(Process Biochemistry 41(2006),1001)和Wackett(Current Opinions in ChemicalBiology 21(2008),187)。

已经描述了酵母小红酵母(Rhodotorula minuta)将异戊酸转化为异丁烯(Fujii等人(Appl.Environ.Microbiol.54(1988),583))，但是该反应的效率，小于每分钟1百万分之一，或约每天1000分之一，与允许工业应用差得很远。Fukuda等人(BBRC 201(1994),516)阐明了反应机制，其涉及细胞色素P450酶，所述酶通过还原氧代铁基团(oxoferryl group)Fe^V＝O使异戊酸脱羧基。通过该途径的异丁烯大规模生物合成似乎是非常不利的，因为它需要一个亮氨酸分子的合成和降解以形成一个异丁烯分子。此外，催化反应的酶使用血红素作为辅因子，其本身不适于在细菌中重组表达、不适于酶参数的改进。由于所有这些原因，这一途径看起来十分不可能作为工业开发的基础。其它微生物已被描述勉强能够从异戊酸天然产生异丁烯；获得的产量甚至低于用小红酵母获得的产量(Fukuda等人(Agric.Biol.Chem.48(1984),1679))。

Gogerty等人(Appl.Environm.Microbiol.76(2010),8004-8010)和van Leeuwen等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.93(2012),1377-1387)描述了通过酶促转化从乙酰乙酰基-CoA生产异丁烯，其中所提出的途径的最后一步是，利用甲羟戊酸二磷酸脱羧酶转化3-羟基-3-甲基丁酸(也称为3-羟基异戊酸(HIV))。用于从3-羟基-3-甲基丁酸生产异丁烯的该反应也描述于WO2010/001078中。在Gogerty等人(参见上文)和van Leeuwen等人(参见上文)中提出，经由3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA，通过转化3-甲基巴豆酰基-CoA来实现3-羟基-3-甲基丁酸的生产。为了进一步提高由可再生资源生产异丁烯的方法的效率和可变性，需要替代途径来提供3-羟基-3-甲基丁酸，其可用作酶促转化为异丁烯的底物。

发明概述

本发明通过提供如本文所公开的和如权利要求中所限定的方法，满足了这种需求。因此，一方面，本发明涉及将3-甲基巴豆酰基-CoA转化为3-羟基-3-甲基丁酸的方法，该方法包括以下步骤：

(a)将3-甲基巴豆酰基-CoA酶促转化为3-甲基巴豆酸；和

(b)将由此产生的3-甲基巴豆酸进一步酶促转化为3-羟基-3-甲基丁酸。

3-甲基巴豆酰基-CoA到3-羟基-3-甲基丁酸的这种转化提供了对现有技术途径的替代，现有技术中3-甲基巴豆酰基-CoA经由3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA转化为3-羟基-3-甲基丁酸。

根据本发明，3-甲基巴豆酰基-CoA到3-甲基巴豆酸的转化可以通过直接转化来实现，其优选使用属于硫酯水解酶家族(在下文中称为硫酯酶(EC3.1.2))或属于CoA-转移酶家族(EC 2.8.3)的酶。或者，3-甲基巴豆酰基-CoA到3-甲基巴豆酸的转化可以通过以下转化实现:首先包括3-甲基巴豆酰基-CoA到3-甲基巴豆酰基-磷酸的转化，随后是3-甲基巴豆酰基-磷酸到3-甲基巴豆酸的转化。

因此，在第一实施方案中，3-甲基巴豆酰基-CoA到3-甲基巴豆酸的转化可以通过直接转化来实现。根据本发明，根据上述方法的步骤(a)，3-甲基巴豆酰基-CoA到3-甲基巴豆酸的这种直接酶促转化可以例如通过使用

(i)硫酯酶(EC 3.1.2)；或

(ii)CoA-转移酶(EC 2.8.3)，

来实现。

硫酯酶(TE；也称为硫酯水解酶)是分类为EC 3.1.2的酶。目前，硫酯酶被分类为EC3.1.2.1至EC 3.1.2.27和EC 3.1.2.-(用于未分类的TE)。Cantu等人(Protein Science 19(2010),1281-1295)描述了，有23个硫酯酶家族，其在一级结构方面彼此无关。然而，推定相同家族的所有成员具有基本上相同的三级结构。硫酯酶水解羰基和硫原子之间的硫酯键。

通过硫酯酶催化的3-甲基巴豆酰基-CoA到3-甲基巴豆酸的转化示意性地显示在图1中。

在优选的实施方案中，在根据本发明的方法中用于将3-甲基巴豆酰基-CoA转化为3-甲基巴豆酸的硫酯酶选自：

-乙酰基-CoA水解酶(EC 3.1.2.1)；

-棕榈酰基-CoA水解酶(EC 3.1.2.2)；

-3-羟基异丁酰基-CoA水解酶(EC 3.1.2.4)；

-油酰基-[酰基-载体-蛋白]水解酶(EC 3.1.2.14)；

-ADP依赖性短链酰基-CoA水解酶(EC 3.1.2.18)；

-ADP依赖性中链酰基-CoA水解酶(EC 3.1.2.19)；和

-酰基-CoA水解酶(EC 3.1.2.20)。

因此，在一个优选的实施方案中，通过使用乙酰基-CoA水解酶(EC 3.1.2.1)实现3-甲基巴豆酰基-CoA到3-甲基巴豆酸的直接转化。乙酰基-CoA水解酶是催化以下反应的酶：

乙酰基-CoA+H₂O→乙酸+CoA

该酶存在于多种生物体中，包括真核和原核生物体，如植物、动物、真菌和细菌。所述酶已经描述于例如褐家鼠(Rattus norvegicus)(Uniprot登录号：Q99NB7)、小家鼠(Musmusculus)、野猪(Sus scrofa)、牛(Bos taurus)、原鸡(Gallus gallus)、阔鼻猴类(Platyrrhini)、绵羊(Ovis aries)、金色大鼠(Mesocricetus auratus)、猪蛔虫(Ascarissuum)、人(Homo sapiens,Uniprot登录号：Q8WYK0)、豌豆(Pisum sativum)、黄瓜(Cucumissativus)、黍属(Panicus sp.)、蓖麻(Ricinus communis)、马铃薯(Solanum tuberosum)、菠菜(Spinacia oleracea)、玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、布氏布氏锥虫(Trypanosoma brucei brucei)、克氏锥虫(Trypanosomacruzi)、Trypanosoma dionisii、Trypanosoma vespertilionis、Crithidia fasciculate、氨基戊酸梭菌(Clostridium aminovalericum)、发酵氨基酸球菌(Acidaminococcusfermaentans)、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)和巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)。

在另一个优选的实施方案中，3-甲基巴豆酰基-CoA到3-甲基巴豆酸的直接转化通过使用棕榈酰基-CoA水解酶(EC 3.1.2.2)实现。棕榈酰基-CoA水解酶是催化以下反应的酶：

棕榈酰基-CoA+H₂O→棕榈酸+CoA

该酶存在于多种生物体中，包括真核和原核生物体，如植物、动物、真菌和细菌。该酶例如已经描述在拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Uniprot登录号：Q8GYW7)、豌豆(Pisumsativum)、菠菜(Spinacia oleracea)、Bumilleriopsis filiformis、Eremosphaeraviridis、Mougeotia scalaris、纤细裸藻(Euglena gracilis)、Rhodotorula aurantiaca、酿酒酵母(Saccharaomyces cerevisiae)、褶皱假丝酵母(Candida rugosa)、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)、小家鼠(Mus musculus)(Uniprot登录号：P58137)、人(Homosapiens)、阔鼻猴类(Platyrrhini)、牛(Bos taurus)、家犬(Canis lupus familiaris)、野猪(Cus scrofa)、豚鼠(Cavia procellus)、鸽属(Columba sp.)、Cricetulus griseus、金色大鼠(Mesocricetus auratus)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、褐家鼠(Rattusnorvegicus)、穴兔(Oryctolagus cuniculus)、原鸡(Gallus gallus)、绿头鸭(Anasplatyrhynchos)、结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)、乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter colcaceticus)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)和大肠杆菌(E.coli)。

在另一个优选的实施方案中，3-甲基巴豆酰基-CoA到3-甲基巴豆酸的直接转化通过使用3-羟基异丁酰基-CoA水解酶(EC 3.1.2.4)实现。3-羟基异丁酰-CoA水解酶是催化以下反应的酶：

3-羟基异丁酰基-CoA+H₂O→3-羟基异丁酸+CoA

该酶存在于多种生物体中，包括真核和原核生物体，如植物、动物、真菌和细菌。该酶已经描述于例如拟南芥(Arabidopsis thaliana)、人、家犬(Canis lupus familiaris)、褐家鼠(Rattus norvegicus)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中。

在另一个优选的实施方案中，3-甲基巴豆酰基-CoA到3-甲基巴豆酸的直接转化通过使用油酰基-[酰基-载体-蛋白]水解酶(EC 3.1.2.14)实现。油酰基-[酰基-载体-蛋白]水解酶是催化以下反应的酶：

油酰基-[酰基-载体-蛋白]+H₂O→油酸+[酰基-载体-蛋白]

这种酶存在于多种植物和细菌中。该酶已经描述于例如拟南芥(Arabidopsisthaliana)、南欧蒜(Allium ampeloprasum)、南瓜(Curcurbita moschata)、美叶萼距花(Cuphea calophylla)、萼距花(Cuphea hookeriana)、披针叶萼距花(Cuphealanceolata)、Cuphea wrightii、加州月桂(Umbellularia californica)、芫荽(Coriandrum sativum)、菠菜(Spinacia oleracea)、油棕属(Elaeis sp.)、Elaeisguineensis、大豆(Glycine max)、鳄梨(Persea americana)、豌豆(Pisum sativum)、白芥(Sinapis alba)、美洲榆(Ulmus americana)、玉米(Zea mays)、芥菜(Brassica juncea)、欧洲油菜(Brassica napus)、芜菁油菜亚种(Brassica rapa subsp.campestris)、桐油树(Jatropha curcas)、蓖麻(Ricinus communis)、樟(Cinnamomum camphorum)、四叶澳洲坚果(Macadamia tetraphylla)、Magnifera indica、长叶紫荆木(Madhuca longifolia)、毛白杨(Populus tomentosa)、腊梅(Chimonanthus praecox)、陆地棉(Gossypiumhirsutum)、藏榄(Diploknema butyracea)、向日葵(Helianthus annuus)和酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)。

在另一个优选的实施方案中，3-甲基巴豆酰基-CoA到3-甲基巴豆酸的直接转化通过利用ADP依赖性短链酰基-CoA水解酶(EC 3.1.2.18)来实现。ADP依赖性短链酰基-CoA水解酶是催化以下反应的酶：

酰基-CoA+H₂O→羧酸+CoA

这种酶存在于多种动物中，并且已经描述在例如小家鼠、褐家鼠和金色大鼠中。

在又一个优选的实施方案中，3-甲基巴豆酰基-CoA到3-甲基巴豆酸的直接转化通过使用ADP依赖性中链酰基-CoA水解酶(EC 3.1.2.19)来实现。ADP依赖性中链酰基-CoA水解酶是催化以下反应的酶：

酰基-CoA+H₂O→羧酸+CoA

这种酶存在于多种动物中，并且已经描述于例如褐家鼠和金色大鼠中。

在另一个优选的实施方案中，3-甲基巴豆酰基-CoA到3-甲基巴豆酸的直接转化通过使用酰基-CoA水解酶(EC 3.1.2.20)来实现。酰基-CoA水解酶是催化以下反应的酶：

酰基-CoA+H₂O→羧酸+CoA

该酶存在于多种生物体中，包括真核和原核生物体，如植物、动物、真菌和细菌。该酶例如已描述于拟南芥(Arabidopsis thaliana)、Rhodotorula aurantiaca、Bumilleriopsis filiformis,Eremosphaera viridis、纤细裸藻(Euglena gracilis)、小家鼠、褐家鼠、人、野猪、牛、家犬(Cais lupus familiaris)、豚鼠(Cavia porcellus)、Cricetus griseus、黑腹果蝇、绿头鸭、原鸡、秀丽隐杆线虫、酿酒酵母、皱褶假丝酵母、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、链霉菌属(Streptomyces sp.)、天蓝色链霉菌、粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)、铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsismediterranei)、醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)、幽门螺杆菌、类球红细菌和草分枝杆菌。在一个优选的实施方案中，酰基-CoA水解酶是来自大肠杆菌、来自恶臭假单胞菌或来自流感嗜血杆菌的酶，更优选为来自大肠杆菌的YciA酶、或来自流感嗜血杆菌的其密切相关的同源物HI0827(Zhuang等人，Biochemistry 47(2008),2789-2796)。在另一个优选的实施方案中，乙酰基-CoA水解酶是来自人的酶(Cao等人，Biochemistry 48(2009),1293-1304)。来自大肠杆菌、流感嗜血杆菌和人的酶已被报道能够接受β-甲基巴豆酰基-CoA(3-甲基巴豆酰-CoA的同义词)作为底物。

特别优选的是来自大肠杆菌的酰基-CoA硫酯水解酶(Uniprot P0A8Z0；SEQ IDNO:19)，来自大肠杆菌的酰基-CoA硫酯酶2(Uniprot P0AGG2；SEQ ID NO:20)和来自恶臭假单胞菌的酰基-CoA硫酯酶II(Uniprot Q88DR1；SEQ ID NO：21)。

在一个特别优选的实施方案中，本发明方法中使用的酰基-CoA水解酶具有SEQ IDNO：19至21中任一个所示的氨基酸序列、或显示与SEQ ID NO：19至21中的任一个至少x％同源的氨基酸序列，并且具有酰基-CoA水解酶的活性，其中x为30至100之间的整数，优选35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中这种酶能够催化3-甲基巴豆酰基-CoA转化为3-甲基巴豆酸。

优选地，通过将相应的序列与任何一个上述SEQ ID NO的氨基酸序列进行比较来确定同一性程度。当被比较的序列不具有相同的长度时，同一性程度优选地指，较短序列中与较长序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，或较长序列中与较短序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。可以根据本领域熟知的方法、优选使用合适的计算机算法，如CLUSTAL，测定序列同一性的程度。

当使用Clustal分析方法测定特定序列是否例如与参考序列80％相同时，可以使用默认设置，或者设置优选如下：矩阵：blosum 30；开放空位罚分：10.0；延伸空位罚分：0.05；延缓差异序列比对(Delay divergent)：40；空位间隔距离：8，用于氨基酸序列的比较。对于核苷酸序列比较，延伸空位罚分优选设定为5.0。

优选地，在序列的完整长度上计算同一性程度。

如上所述，3-甲基巴豆酰基-CoA到3-甲基巴豆酸的直接转化也可以通过使用分类为CoA-转移酶(EC 2.8.3)的酶来实现。通过CoA-转移酶催化的3-甲基巴豆酰基-CoA到3-甲基巴豆酸的转化示意性地显示在图2中。

CoA-转移酶存在于来自所有血统系的生物体中。大多数CoA-转移酶属于两个熟知的酶家族(以下称为家族I和II)，并且存在已在细菌的厌氧代谢途径中鉴定的第三家族。描述不同家族的综述可以在Heider(FEBS Letters 509(2001),345-349)中找到。

家族I含有例如以下CoA-转移酶：

对于3-含氧酸：分类在EC 2.8.3.5或EC 2.8.3.6中的酶；

对于短链脂肪酸：分类在EC 2.8.3.8或EC 2.8.3.9中的酶；

对于戊烯二酸：分类在EC 2.8.3.12中的酶；

对于琥珀酸：琥珀酰基-CoA：乙酸CoA-转移酶，即分类在EC 2.8.3.18中的酶(也参见Mullins等人,Biochemistry 51(2012),8422-34；Mullins et al.,J.Bacteriol.190(2006),4933-4940)。

家族I的大多数酶天然使用琥珀酰基-CoA或乙酰基-CoA作为CoA供体。这些酶在不同聚集态中含有两个不相似亚基。已经鉴定了两个保守的氨基酸序列基序：

Prosites条目PS01273(http://prosite.expasy.org/cgi-bin/prosite/prosite-search-ac？PDOC00980)

COA_TRANSF_1，PS01273；辅酶A转移酶标签1(PATTERN)

共有模式：

[DN]-[GN]-x(2)-[LIVMFA](3)-G-G-F-x(3)-G-x-P

和

Prosites条目PS01273(http://prosite.expasy.org/cgi-bin/prosite/prosite-search-ac？PDOC00980)

COA_TRANSF_2，PS01274；辅酶A转移酶标签2(PATTERN)

共有模式：

[LF]-[HQ]-S-E-N-G-[LIVF](2)-[GA]

E(谷氨酸)是活性位点残基。

在一个特别优选的实施方案中，用于将3-甲基巴豆酰基-CoA转化为3-甲基巴豆酸的酶是戊烯二酸-CoA-转移酶(EC 2.8.3.12)。优选的戊烯二酸-CoA-转移酶是来自黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)的戊烯二酸-CoA-转移酶亚基A或B(分别为Uniprot Q1D4I4和Q1D4I3)。在一个特别优选的实施方案中，在本发明的方法中使用的戊烯二酸-CoA-转移酶具有如SEQ ID NO：17或18所示的氨基酸序列、或显示与SEQ ID NO：17或18至少x％同源的氨基酸序列，并且具有戊烯二酸-CoA-转移酶的活性，其中x为30至100之间的整数，优选35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中这种酶能够催化3-甲基巴豆酰基-CoA转化为3-甲基巴豆酸。关于同一性程度的确定，这同样适用于上文已经给出的描述。

CoA-转移酶家族II由柠檬酸裂合酶(EC 2.8.3.10)和柠苹酸裂合酶(EC2.8.3.11)的同二聚α亚基组成。这些酶催化含有共价结合的CoA-衍生物的酰基载体蛋白(ACP)的转移。已经表明，这些酶在体外也接受游离的CoA-硫酯，如在柠檬酸裂合酶的情况下乙酰基-CoA、丙酰基-CoA、丁酰基-CoA(Dimroth等,Eur.J.Biochem.80(1977),479-488)和，在柠苹酸裂合酶情况下乙酰基-CoA和琥珀酰基-CoA(Dimroth等人,Eur.J.Biochem.80(1977),469-477)。

根据Heider(同上引文)，CoA-转移酶的家族III由甲酰基-CoA:草酸CoA-转移酶、琥珀酰基-CoA:(R)-苄基琥珀酸CoA-转移酶，(E)-肉桂酰基-CoA:(R)-苯基乳酸CoA-转移酶和丁酰甜菜碱酰-CoA:(R)-肉毒碱CoA-转移酶组成。家族III的另一个成员是琥珀酰基-CoA:L-苹果酸CoA-转移酶，其在橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)的自养(autrophic)CO₂固定中的功能是用琥珀酰基-CoA作为CoA供体、将L-苹果酸活化为其CoA硫酯(Friedman S.等人J.Bacteriol.188(2006),2646-2655)。该家族的CoA-转移酶的氨基酸序列与家族I和II的CoA-转移酶仅显示低程度的序列同一性。这些CoA-转移酶存在于原核生物和真核生物中。

在优选的实施方案中，在根据本发明的方法中使用的CoA-转移酶是属于如上文所述的家族I或II的CoA-转移酶。

优选地，在根据本发明的方法中使用的将3-甲基巴豆酰基-CoA直接转化为3-甲基巴豆酸的CoA-转移酶选自：

-乙酸CoA-转移酶(EC 2.8.3.8)；和

-丁酸-乙酰乙酸CoA-转移酶(EC 2.8.3.9)。

因此，在一个优选的实施方案中，通过使用乙酸CoA-转移酶(EC 2.8.3.8)实现3-甲基巴豆酰基-CoA到3-甲基巴豆酸的直接转化。乙酸CoA-转移酶是催化以下反应的酶：

这种酶存在于多种细菌中，并且已经描述在例如粪厌氧棒状菌(Anaerostipescaccae)、霍氏真杆菌(Eubacterium hallii)、普氏栖粪杆菌(Faecalibacteriumprausnitzii)、人罗斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)、肠道罗斯拜瑞氏菌(Roseburiaintestinalis)、粪球菌属(Coprococcus sp)和大肠杆菌。

在另一个优选的实施方案中，通过使用丁酸-乙酰乙酸CoA-转移酶(EC 2.8.3.9)实现3-甲基巴豆酰基-CoA到3-甲基巴豆酸的直接转化。丁酸-乙酰乙酸CoA-转移酶是催化以下反应的酶：

该酶存在于多种生物体中，包括真核和原核生物体，如动物和细菌。该酶已经描述于例如牛、梭菌属(Clostridium)和大肠杆菌中。

如上所述，3-甲基巴豆酰基-CoA到3-甲基巴豆酸的转化也可以通过以下转化来实现，该转化首先包括3-甲基巴豆酰基-CoA到3-甲基巴豆酰基-磷酸的转化，然后是3-甲基巴豆酰基-磷酸到3-甲基巴豆酸的转化。相应的反应示意性地显示在图11中。该转化具有产生一分子ATP的优点。

3-甲基巴豆酰基-CoA到3-甲基巴豆酰基-磷酸的转化可以例如通过使用磷酸丁酰基转移酶(EC 2.3.1.19)或磷酸乙酰基转移酶(EC 2.3.1.8)实现。

磷酸丁酰基转移酶(EC 2.3.1.19)天然催化以下反应

Wiesenborn等人(Appl.Environ.Microbiol.55(1989),317-322)和Ward等人(J.Bacteriol.181(1999),5433-5442)已经描述了，除丁酰基辅酶A(丁酰基-CoA)以外，磷酸丁酰基转移酶(EC 2.3.1.19)还可以利用一些底物，特别是乙酰基-CoA、丙酰基-CoA、异丁酰基-CoA、戊酰基-CoA和异戊酰基-CoA。

该酶已被描述为存在于许多生物体中，特别是在细菌和原生动物中。在一个实施方案中，该酶来自原生动物Dasytricha ruminantium。在一个优选的实施方案中，磷酸丁酰基转移酶是来自细菌的磷酸丁酰基转移酶，优选来自芽孢杆菌属(Bacillus)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、肠球菌属(Enterococcus)或梭菌属(Clostridium)的细菌，更优选来自肠球菌属或梭菌属，甚至更优选来自巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、枯草芽孢杆菌、溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)、科氏梭菌(Clostridium kluyveri)、糖丁醇梭菌(Clostridiumsaccharoacetobutylicum)、生孢梭菌(Clostridium sprorogenes)或粪肠球菌(Enterococcus faecalis)。最优选地，酶来自枯草芽孢杆菌(菌株168)(Uniprot登录号P54530)、丙酮丁醇梭菌(Uniprot登录号F0K6W0)或来自粪肠球菌MTUP9(Uniprot登录号K4YRE8或Uniprot登录号A0A038BNC2)。可获得的Uniprot登录号K4YRE8和Uniprot登录号A0A038BNC2下的粪肠球菌磷酸丁酰基转移酶的序列，具有99.3％的序列同源性。可获得的Uniprot登录号A0A038BNC2下的粪肠球菌磷酸丁酰基转移酶的序列，是更优选的。

如上所述，在一个优选的实施方案中，酶是来自枯草芽孢杆菌(菌株168)(Uniprot登录号P54530)的磷酸丁酰基转移酶(EC 2.3.1.19)。在一个特别优选的实施方案中，本发明方法中使用的磷酸丁酰基转移酶(EC 2.3.1.19)具有如SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列、或显示与SEQ ID NO：28至少x％同源的氨基酸序列，并且具有磷酸丁酰基转移酶的活性，其中x为30至100之间的整数，优选为35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中所述酶能够将3-甲基巴豆酰基-CoA转化为3-甲基巴豆酰基-磷酸，如上所述。

在另一个优选的实施方案中，如上所述，酶是来自粪肠球菌MTUP9的磷酸丁酰基转移酶(EC 2.3.1.19)(Uniprot登录号K4YRE8或Uniprot登录号A0A038BNC2)。在一个特别优选的实施方案中，本发明方法中使用的磷酸丁酰基转移酶(EC 2.3.1.19)具有如SEQ IDNO：29所示的氨基酸序列、或显示与SEQ ID NO：29至少x％同源的氨基酸序列，并且具有磷酸丁酰基转移酶的活性，其中x为30至100之间的整数，优选为35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中所述酶能够将3-甲基巴豆酰基-CoA转化为3-甲基巴豆酰基-磷酸，如上所述。

关于同一性程度的测定，同样适用于上文已经给出的描述。

磷酸乙酰基转移酶(EC 2.3.1.8)天然催化以下反应

Veit等人(J.Biotechnol.140(2009),75-83)描述了磷酸乙酰基转移酶也可以使用丁酰基-CoA或丙酰基-CoA作为底物。

InterPro数据库中该酶家族的登录号为IPR012147和IPR002505，“http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/IPR002505”

(http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/IPR012147

http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/IPR002505)

也参见http://pfam.sanger.ac.uk/family/PF01515

该酶已经在多种生物体中描述，特别是细菌和真菌。因此，在一个优选的实施方案中，该酶是来自细菌的酶，所述细菌优选埃希氏菌属(Escherichia)、Chlorogonium、梭菌属(Clostridium)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、棒杆菌属(Corynebacterium)、鲁杰氏菌属(Ruegeria)、沙门氏菌属(Salmonella)、固氮菌属(Azotobacter)、慢生根瘤菌属(Bradorhizobium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、穆尔氏菌属(Moorella)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、链球菌属(Streptococcus)、热袍菌属(Thermotoga)或芽孢杆菌属，更优选大肠杆菌、Chlorogonium elongatum、科氏梭菌(Clostridium kluyveri)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、尿酸梭菌(Clostridium acidurici)、小韦荣氏球菌(Veillonella parvula)、嗜热甲烷八叠球菌(Methanosarcina thermophila)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、帕氏鲁杰菌(Ruegeria pomeroyi)、肠沙门氏菌(Salmonella enterica)、棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)、大豆慢生根瘤菌、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、旧金山乳杆菌(Lactobacillus sanfranciscensis)、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)、海热袍菌(Thermotoga maritima)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。在另一个优选的实施方案中，酶是来自真菌的酶，优选来自酵母属，更优选来自酿酒酵母。

3-甲基巴豆酰基-磷酸到3-甲基巴豆酸的转化例如可以通过使用分类为EC 2.7.2的酶，即磷酸转移酶来实现。这种酶使用羧基作为受体。在优选的实施方案中，3-甲基巴豆酰基-磷酸到3-甲基巴豆酸的转化通过使用丁酸激酶(EC 2.7.2.7)、支链脂肪酸激酶(EC2.7.2.14)、丙酸激酶(EC 2.7.2.15)或乙酸激酶(EC 2.7.2.1)实现。

丁酸激酶(EC 2.7.2.7)天然催化以下反应

例如，Hartmanis(J.Biol.Chem.262(1987),617-621)已经描述，除丁酸以外，丁酸激酶还可以使用许多底物，例如，戊酸、异丁酸、异戊酸和乙烯乙酸。该酶已经描述在多种生物体中，特别是细菌中。在一个优选的实施方案中，该酶来自细菌，优选来自梭菌属、丁酸弧菌属、热袍菌属、肠球菌属、乳杆菌属或地芽孢杆菌属(Geobacillus)的细菌。优选梭菌属、乳杆菌属或地芽孢杆菌属。更优选地，所述酶来自丙酮丁醇梭菌、解蛋白梭菌(Clostridiumproteoclasticum)、酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)、丁酸梭菌、巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum)、假破伤风梭菌(Clostridium tetanomorphum)、溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio firbrosolvens)、洪氏丁酸弧菌(Butyrivibrio hungatei)、海热袍菌(Thermotoga maritime)、耐久肠球菌(Enterococcus durans)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)(Uniprot登录号K0N529)或地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)(Uniprot登录号L8A0E1)。优选丙酮丁醇梭菌、干酪乳杆菌W56或地芽孢杆菌GHH01。对于丙酮丁醇梭菌，已经描述了两种丁酸激酶：丁酸激酶1(Uniprot登录号：Q45829)和丁酸激酶II(Uniprot登录号：Q97II19)。

如上所述，在一个优选的实施方案中，酶是来自干酪乳杆菌W56的丁酸激酶(EC2.7.2.7)(Uniprot登录号K0N529)。在一个特别优选的实施方案中，本发明方法中使用的丁酸激酶(EC 2.7.2.7)具有SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列、或显示与SEQ ID NO：30至少x％同源的氨基酸序列，并且具有丁酸激酶的活性，其中x为30至100之间的整数，优选为35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中该酶能够将3-甲基巴豆酰基-磷酸转化为3-甲基巴豆酸，如上所述。

在另一个优选的实施方案中，酶是来自地芽孢杆菌GHH01的丁酸激酶(EC2.7.2.7)(Uniprot登录号L8A0E1)。在一个特别优选的实施方案中，本发明方法中使用的丁酸激酶(EC 2.7.2.7)具有如SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列、或显示与SEQ ID NO：31至少x％同源的氨基酸序列，并且具有丁酸激酶的活性，其中x为30至100之间的整数，优选为35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中该酶能够将3-甲基巴豆酰基-磷酸转化为3-甲基巴豆酸，如上所述。

支链脂肪酸激酶(EC 2.7.2.14)天然催化以下反应

该酶已被描述存在于许多细菌中。因此，在一个优选实施方案中，酶是来自细菌的酶，优选来自螺旋体属(Spirochaeta)或热袍菌属(Thermotoga)，更优选来自海热袍菌。

丙酸激酶(EC 2.7.2.15)天然催化以下反应

该酶已被描述存在于许多细菌中，特别是肠杆菌科(Enterobacteriacea)中。因此，在一个优选的实施方案中，酶是来自细菌的酶，优选来自沙门氏菌属或埃希氏菌属，更优选来自肠沙门氏菌或大肠杆菌。

乙酸激酶(EC 2.7.2.1)天然催化以下反应

已经描述了该酶存在于许多生物体中，特别是细菌和真核生物中。在一个优选的实施方案中，酶是来自细菌的酶，优选来自甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、隐球菌属(Cryptococcus)、产乙醇菌属(Ethanoligenens)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、玫瑰变色菌属、链球菌属(Streptococcus)、沙门氏菌属(Salmonella)、无胆甾原体属(Acholeplasma)、不动杆菌属(Acinetobacter)、Ajellomyces、芽孢杆菌属(Bacillus)、疏螺旋体属(Borrelia)、毛壳属(Chaetomium)、梭菌属(Clostridium)、Coccidioides、Coprinopsis，隐球菌属(Cryptococcus)、贪铜菌属(Cupriavidus)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、肠球菌属(Enterococcus)、埃希氏菌属(Escherichia)、产乙醇菌属(Ethanoligenes)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、螺杆菌属(Helicobacter)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、李斯特氏菌属(Listeria)、中间原体属(Mesoplasma)、穆尔氏菌属(Moorella)、支原体(Mycoplasma)、大洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、红假单胞菌属(Rhodospeudomonas)、玫瑰变色菌属(Roseovarius)、沙门氏菌属(Salmonella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、热袍菌属(Thermotoga)或韦荣氏球菌属(Veillonella)的细菌，更优选来自嗜热甲烷八叠球菌(Methanosarcina thermophila)、新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)、哈尔滨产乙酸菌(Ethanoligenens harbinense)、产丙酸丙酸杆菌(Propionibacterium acidipropionici)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、内脏链球菌(Streptococcus enterica)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、莱氏无胆甾原体(Acholeplasma laidlawii)、醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)、Ajellomyces capsulatus、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、布氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)、球毛壳(Chaetomium globosum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、热解纤维梭菌(Clostridium thermocellum)、Coccidioides immitis、Coprinopsis cinerea、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、杀虫贪铜菌(Cupriavidus necator)、普通脱硫弧菌(Desulfovibrio vulgaris)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、哈尔滨产乙醇菌(Ethanoligenes harbinense)、嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、旧金山乳杆菌(Lactobacillussanfranciscensis)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、单核增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)、花中间原体(Mesoplasma florum)、噬乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcina acetivorans)、马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、伊平屋桥大洋芽孢杆菌(Oceanobacillus iheyensis)、费氏丙酸杆菌(Propionibacteriumfreudenreichii)、产丙酸丙酸杆菌(Propionibacterium acidipropionici)、沼泽红假单胞菌(Rhodospeudomonas palustris)、肠沙门氏菌(Salmonella enteric)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、海热袍菌(Thermotoga maritime)、或小韦荣氏球菌(Veillonella parvula)。

在另一个优选的实施方案中，酶是来自真菌的酶，优选来自曲霉属(Aspergillus)、赤霉菌属(Gibberella)、肉座菌属(Hypocrea)、稻瘟病菌属(Magnaporthe)、暗球腔菌属(Phaeosphaeria)、原毛平革菌属(Phanerochaete)、疫霉属(Phytophthora)、核盘菌属(Sclerotinia)、Uncinocarpus、黑粉菌属(Ustilago)或脉孢菌属(Neurospora)的真菌，更优选来自以下物种的真菌：烟曲霉(Aspergillus fumigates)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)、红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)、水稻稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、颖枯暗球腔菌(Phaeosphaeria nodorum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、橡树疫霉(Phytophthora ramorum)、大豆疫霉(Phytophthora sojae)、核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)、Uncinocarpus reesii、玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)或粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)。

在另一个优选的实施方案中，酶是来自植物或藻类的酶，优选来自衣藻属(Chlamydomonas)，甚至更优选来自物种莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)。

在另一个实施方案中，酶来自内阿米巴属(Entamoeba)的生物体，更优选来自物种溶组织内阿米巴菌(Entamoeba histolytica)。

已经显示，上述适于将3-甲基巴豆酰基-磷酸转化为3-甲基巴豆酸的酶家族是进化相关的，并且含有共有序列标签(signature)。这些标签在Prosite数据库中引用和描述：

http://prosite.expasy.org/cgi-bin/prosite/nicedoc.pl？PS01075

Gao等人(FEMS Microbiol.Lett.213(2002),59-65)已经描述了遗传修饰的大肠杆菌细胞，尤其是已经被分别编码磷酸丁酰基转移酶(EC 2.3.1.19)和丁酸激酶(EC2.7.2.7)的丙酮丁醇梭菌的ptb基因和buk基因转化的大肠杆菌细胞。这些大肠杆菌细胞已经显示能够产生D-(-)-3-羟基丁酸(3HB)。

在上述方法的步骤(a)中获得的3-甲基巴豆酸被进一步酶促转化为3-羟基-3-甲基丁酸。这种转化可以例如通过使用属于水裂合酶(EC 4.2.1)家族的酶实现，特别是使用乌头酸水合酶(EC 4.2.1.3)或马来酸水合酶(EC 4.2.1.31)或2-甲基柠檬酸脱水酶(EC4.2.1.79)实现。反应示意性地显示在图3中。

因此，在一个优选的实施方案中，根据本发明，通过使用乌头酸水合酶(EC4.2.1.3)，将3-甲基巴豆酸进一步酶促转化为3-羟基-3-甲基丁酸。乌头酸水合酶是催化以下反应的酶：

该酶存在于多种生物体中，包括真核和原核生物体，如植物、动物、真菌和细菌。该酶例如已经描述于克莱门柚(Citrus clementina)、柠檬(Citrus limon)、玉蜀黍(Zeamays)、欧亚槭(Acer pseudoplatanus)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、大豆(Glycinemax)、本氏烟草(Nicotiana benthamiana)、大黄属物种(Rheum sp.)、白芥(Sinapisalba)、马铃薯(Solanum tuberosum)、玉米、人(Homo sapiens)、牛(Bos taurus)、野猪(Susscrofa)、家犬(Canis lupus familaris)、穴兔(Oryctolagus cuniculus)、褐家鼠(Rattusnorvegicus)、小家鼠(Mus musculus)、Crassostrea virginica、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)、恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、解脂复膜孢酵母(Saccharomycopsis lipolytica)、黑曲霉(Aspergillus niger)、血红栓菌(Trametes saguinea)、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、大肠杆菌、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、谷氨酸棒杆菌,枯草芽孢杆菌、Advenella kashmirensis、棕色固氮菌、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、结核分支杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、铜绿假单胞菌、肠沙门氏菌、金色素链霉菌(Streptomyces aureus)、绿产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)、嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobusacidocaldarius)、硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)和野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)。

在另一个优选的实施方案中，根据本发明，通过使用马来酸水合酶(EC 4.2.1.31)进一步将3-甲基巴豆酸酶促转化为3-羟基-3-甲基丁酸。马来酸水合酶是催化以下反应的酶：

该酶存在于多种生物体中，包括真核和原核生物体，如动物、真菌和细菌。该酶已经例如描述于穴兔、假丝酵母属物种(Candida sp.)、Exophialia属物种、汉逊氏酵母属物种(Hansenula sp.)、原毛平革菌属物种(Phanerochaete sp.)、毕赤酵母属物种(Pichiasp.)、侧耳属物种(Pleurotus sp.)、红酵母属物种(Rhodotorula sp.)、酿酒酵母属物种(Saccharomyces sp.)、裂殖酵母属物种(Schizosaccharomyces sp.)、掷孢酵母属物种(Sporobolomyces sp.)、丝孢酵母属物种(Trichosporon sp)、Yarrowia属物种、不动杆菌属物种、游动放线菌属物种(Actinoplanes sp.)、曲霉菌属物种、短杆菌属物种(Brevibacterium sp.)、棒杆菌属物种、克雷伯氏菌属物种(Klebsiella sp.)、微球菌属物种(Micrococcus sp.)、分枝杆菌属物种(Mycobacterium sp.)、诺卡氏菌属物种(Nocardiasp.)、青霉菌属物种(Penicillium sp.)、变形杆菌属物种(Proteus sp.)、假单胞菌属物种(Pseudomonas sp.)、产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)、链霉菌属物种、节杆菌属物种(Arthrobacter sp.)和黄色杆菌属物种(Xanthobacter sp.)。

在另一个优选的实施方案中，根据本发明，通过使用2-甲基柠檬酸脱水酶(EC4.2.1.79)将3-甲基巴豆酸进一步酶促转化为3-羟基-3-甲基丁酸。2-甲基柠檬酸脱水酶是催化以下反应的酶：

这种酶存在于多种细菌中，并且已经描述于例如肠沙门氏菌、谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌、耻垢分枝杆菌、结核分枝杆菌、奥奈达湖希瓦氏菌(Shewanella oneidensis)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、假单胞菌属(Pseudomonas sp)、产碱假单胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)(van der Werf et al.,Appl.Environ.Microbiol.59(1993),2823-2829)、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)和解脂耶氏酵母。

根据本发明的方法生产的3-羟基-3-甲基丁酸可以例如进一步转化为异丁烯。这种转化可以例如通过使用脱羧酶、特别是甲羟戊酸二磷酸(MDP)脱羧酶来实现。该转化已经在现有技术中描述，例如在WO 2010/001078、WO2012/052427和Gogerty等人(Appl.Environm.Microbiol.76(2010),8004-8010)中描述。因此，本发明还涉及生产异丁烯的方法，该方法包括将3-甲基巴豆酰基-CoA转化为3-羟基-3-甲基丁酸，该方法包括以下步骤：

(a)将3-甲基巴豆酰基-CoA酶促转化为3-甲基巴豆酸；和

(b)将由此产生的3-甲基巴豆酸进一步酶促转化为3-羟基-3-甲基丁酸；

并且其还包括步骤:通过脱羧反应，优选通过由MDP脱羧酶催化的脱羧反应,将由此产生的3-羟基-3-甲基丁酸转化为异丁烯。

根据本发明的方法转化为3-甲基巴豆酸的3-甲基巴豆酰基-CoA本身可以通过酶反应提供，例如，通过脱羧将3-甲基戊烯二酰基-CoA转化为3-甲基巴豆酰基-CoA。该反应示意性地显示在图4中。其可以由不同的酶催化。在一个优选的实施方案中，3-甲基戊烯二酰基-CoA通过脱羧转化为3-甲基巴豆酰基-CoA，可以通过甲基巴豆酰基-CoA羧化酶(EC6.4.1.4)催化。甲基巴豆酰CoA羧化酶已经描述为催化以下反应：

即，羧化，但它们可以用于催化脱羧反应。甲基巴豆酰基-CoA羧化酶存在于多种生物体中，包括真核和原核生物体，如植物、动物、真菌和细菌。该酶例如已经描述于：胡萝卜(Daucus carota)、大豆、大麦(Hordeum vulgare)、豌豆(Pisum sativum)、番茄(Solanumlycopersicum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、玉米(Zea mays)、拟南芥属物种(Arabidopsis sp.)、兵豆(Lens culinaris)、人、牛、褐家鼠、小家鼠、真鲷(Pagrusmajor)、构巢裸胞壳(Emericella nidulans)、铜绿假单胞菌、香茅醇假单胞菌(Pseudomonas citronellolis)、发酵氨基酸球菌(Acidaminococcus fermentans)、大肠杆菌、分枝杆菌属(Mycobacterium sp)和无色小杆菌属物种(Achromobacter sp.)。

在另一个优选的实施方案中，3-甲基戊烯二酰基-CoA通过脱羧到3-甲基巴豆酰基-CoA的转化，由香叶酰基-CoA羧化酶(EC 6.4.1.5)催化。香叶酰基-CoA羧化酶天然催化以下反应：

该酶发生在真核生物和原核生物中，例如植物和细菌。该酶例如描述在胡萝卜、大豆、玉米、假单胞菌属、铜绿假单胞菌、香茅醇假单胞菌和门多萨假单胞菌(Pseudomonasmendocina)中。

在另一个优选的实施方案中，3-甲基戊烯二酰基-CoA通过脱羧到3-甲基巴豆酰基-CoA的转化，通过3-甲基戊烯二酰基-CoA脱羧酶催化，例如由liuB基因编码的黄色粘球菌的3-甲基戊烯二酰基-CoA脱羧酶。该基因编码具有两个亚基AibA和AibB的酶(Li等人，Angew.Chem.Int.Ed.52(2013),1304-1308)。

因此，本发明还涉及一种从3-甲基戊烯二酰基-CoA生产3-羟基-3-甲基丁酸的方法，其中3-甲基戊烯二酰基-CoA首先通过脱羧反应转化为3-甲基巴豆酰基-CoA，然后进一步被酶促转化为3-羟基-3-甲基丁酸，如上文所述。

转化为3-甲基巴豆酰基-CoA的3-甲基戊烯二酰基-CoA本身可以通过天然发生的酶反应提供，其涉及3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA到3-甲基戊烯二酰基-CoA的转化，其可以例如由分类为3-甲基戊烯二酰基-辅酶A水合酶(EC 4.2.1.18)的酶催化。该反应示意性地显示在图5中。3-甲基戊烯二酰基-辅酶A水合酶是催化以下反应的酶：

该酶存在于多种生物体中，包括真核和原核生物体，例如植物、动物和细菌。该酶已经被描述于例如，黄长春花(Catharantus roseus)、人、牛、绵羊、不动杆菌属物种、粘球菌属物种(Myxococcus sp)和恶臭假单胞菌。在一个优选的实施方案中，3-甲基戊烯二酰基辅酶A水合酶是来自粘球菌属物种的酶，甚至更优选是具有如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列、或显示出至少x％同源于SEQ ID NO：10的氨基酸序列的酶，并且具有3-甲基戊烯二酰基辅酶A水合酶的活性，其中x为30至100之间的整数，优选35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中这种酶能够将3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA转化为3-甲基戊烯二酰基-CoA，如上所述。关于同一性程度的确定，同样适用于上文已有的阐述。

3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA到3-甲基戊烯二酰基-CoA的转化也可以通过使用3-羟基-3-甲基戊二酰基辅酶A脱水酶活性来实现，该酶已经例如在黄色粘球菌中鉴定，其由liuC基因编码(Li等人，Angew.Chem.Int.Ed.52(2013),1304-1308)。

因此，本发明还涉及一种从3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA生产3-羟基-3-甲基丁酸的方法，其中3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA首先被转化为3-甲基戊烯二酰基-CoA，然后通过脱羧反应被转化为3-甲基巴豆酰基-CoA，然后进一步酶促转化为3-羟基-3-甲基丁酸，如上所述。

转化为3-甲基戊烯二酰基-CoA的3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA本身可以通过酶促方式提供，例如，通过乙酰基-CoA和乙酰乙酰基-CoA的缩合，该反应由酶3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA合酶(也称为HMG-CoA合酶)天然催化。HMG-CoA合酶分类在EC 2.3.3.10(以前，HMG-CoA合酶被分类为EC 4.1.3.5，但已转移至EC 2.3.3.10)。术语“HMG-CoA合酶”是指，能够催化反应——乙酰基-CoA与乙酰乙酰基-CoA缩合以形成3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA(HMG-CoA)——的任何酶(参见图6)。HMG-CoA合酶是甲羟戊酸途径的一部分。已经鉴定了合成异戊烯基焦磷酸(IPP)的两种途径，即甲羟戊酸途径和甘油醛3-磷酸-丙酮酸途径。HMG-CoA合酶催化乙酰基-CoA与乙酰乙酰基-CoA的生物Claisen缩合，其是酰基缩合酶超家族的成员，该家族包括β-酮硫解酶(ketothiolases)、脂肪酸合酶(β-酮脂酰载体蛋白合酶)和聚酮化合物合酶(polyketide synthases)。

已经描述了各种生物体的HMG-CoA合酶。还可以从许多来源获得编码HMG-CoA合酶的氨基酸和核酸序列。通常，序列仅共有低程度的总体序列同一性。例如，来自葡萄球菌属或链球菌属的酶与人和禽类的HMG-CoA合酶只显示约20％的同一性。在一些来源中，报道了细菌HMG-CoA合酶及其动物对应物仅显示约10％的总体序列同一性(Sutherlin等人，Bacteriol.184(2002),4065-4070)。然而，涉及乙酰化和缩合反应的氨基酸残基在细菌和真核HMG-CoA合酶中是保守的(Campobasso等人，.Biol.Chem.279(2004),44883-44888)。已经测定了三种HMG-CoA合酶的三维结构，并且对于酶促反应至关重要的氨基酸基本上被充分表征(Campobasso等人,同上引文；Chun等人,J.Biol.Chem.275(2000),17946-17953；Nagegowda等人,Biochem.J.383(2004),517-527；Hegardt,Biochem.J.338(1999),569-582)。在真核生物中，存在两种形式的HMG-CoA合酶，即，胞质和线粒体形式。胞质形式在胆固醇和其它类异戊二烯的产生中起关键作用，线粒体形式参与酮体的产生。

原则上，任何HMG-CoA合酶可以在本发明的上下文中使用，特别是来自原核或真核生物体的。

原核HMG-CoA合酶描述于例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(Campobasso等人，loc.cit；Uniprot登录号Q9FD87)、表皮葡萄球菌(Staphylococusepidermidis)(Uniprot登录号Q9FD76)、溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)(Uniprot登录号Q9FD82)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)(Sutherlin等人,loc.cit.；Unirprot登录号Q9FD7)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)(Uniprot登录号Q9FD66)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)(Uniprot登录号Q9FD56)、酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)(Uniprot登录号Q9FD61)和热自养甲烷杆菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum)(登录号AE000857)、布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)(NCBI登录号BB0683)。其它HMG-CoA合酶例如描述于WO 2011/032934中。优选的HMG-CoA合酶是来自粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的酶(Uniprot P54874)。在特别优选的实施方案中，本发明方法中使用的HMG-CoA合酶具有SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列、或显示与SEQ ID NO：16至少x％同源的氨基酸序列，并具有HMG-CoA合酶的活性，其中x为30至100之间的整数，优选为35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中这种酶能够催化乙酰基-CoA和乙酰乙酰基-CoA缩合成3-羟基-3-甲基戊二酰CoA。关于同一性程度的确定，同样适用于上文已有的阐述。

因此，本发明还涉及一种从乙酰基-CoA和乙酰乙酰基-CoA生产3-羟基-3-甲基丁酸的方法，其中首先将乙酰基-CoA和乙酰乙酰基-CoA缩合以形成3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA，然后将3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA转化为3-甲基戊烯二酰基-CoA，然后通过脱羧反应转化为3-甲基巴豆酰基-CoA，然后进一步酶促转化为3-羟基-3-甲基丁酸，如上所述。

用于生产3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA的乙酰乙酰基-CoA本身可以通过酶反应提供。例如，乙酰乙酰基-CoA可以由乙酰基-CoA产生，例如，如WO 2013/057194中所述。因此，根据本发明，乙酰基-CoA可以例如通过以下反应转化为乙酰乙酰基-CoA：

该反应由称为乙酰基-CoA C-乙酰基转移酶的酶催化，其被归类为EC 2.3.1.9。属于该类并且催化上述两分子乙酰基-CoA转化为乙酰乙酰基-CoA和CoA的酶存在于所有界的生物体中，即植物、动物、真菌、细菌等，并且已广泛描述于文献中。已经针对多种生物体(仅举几个例子，例如人、拟南芥、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、丙酮丁醇梭菌和假丝酵母)测定了这些酶的核苷酸和/或氨基酸序列。原则上，任何乙酰基-CoA C-乙酰基转移酶(EC2.3.1.9)可以用于本发明的上下文中。在一个优选的实施方案中，酶是来自丙酮丁醇梭菌的乙酰基-CoA乙酰基转移酶(Uniprot P45359)。在一个特别优选的实施方案中，本发明方法中使用的乙酰基-CoA乙酰基转移酶具有如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列、或显示与SEQ ID NO：15至少x％同源的氨基酸序列，并具有乙酰基-CoA乙酰基转移酶的活性，其中x为30至100之间的整数，优选为35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中该酶能够将乙酰基-CoA转化为乙酰乙酰基-CoA，如上文所述。

关于同一性程度的确定，同样适用于上文已有的阐述。

或者，提供乙酰乙酰基-CoA也可以通过根据以下反应将乙酰基-CoA和丙二酰基-CoA酶促转化为乙酰乙酰基-CoA来实现。

乙酰基-CoA+丙二酰基CoA→乙酰乙酰基-CoA+CoA+CO₂

该反应由称为乙酰乙酰基-CoA合酶(EC 2.3.1.194)的酶催化。在土壤分离的革兰氏阳性链霉菌株CL190中、在用于生成萜类化合物的甲羟戊酸途径的基因簇中鉴定了编码该酶的基因(Okamura等人，PNAS USA 107(2010),11265-11270,2010)。此外，最近在大肠杆菌中开发了使用该酶生成乙酰乙酰基-CoA的生物合成途径(Matsumoto K等人，Biosci.Biotechnol.Biochem,75(2011),364-366)。

因此，在一个优选的实施方案中，乙酰基-CoA到所述乙酰乙酰基-CoA的酶促转化由单一酶反应组成，其中乙酰基-CoA直接转化为乙酰乙酰基-CoA。优选地，通过使用乙酰基-CoA乙酰基转移酶(EC 2.3.1.9)来实现乙酰基-CoA到乙酰乙酰基-CoA的酶促转化，如上所述。

或者，乙酰乙酰基-CoA也可以通过酶促转化提供，其包括两个步骤，即，

(i)乙酰基-CoA到丙二酰基-CoA的酶促转化；和

(ii)丙二酰基-CoA和乙酰基-CoA到乙酰乙酰基-CoA的酶促转化。

优选地，通过使用乙酰基-CoA羧化酶(EC 6.4.1.2)实现乙酰基-CoA到丙二酰基-CoA的酶促转化。该酶催化以下反应：

乙酰基-CoA+ATP+CO₂→丙二酰基-CoA+ADP

优选地，通过使用乙酰乙酰基-CoA合酶(EC 2.3.1.194)实现丙二酰基-CoA和乙酰基-CoA到乙酰乙酰基-CoA的酶促转化。原则上，在根据本发明的方法中可以应用任何乙酰基-CoA乙酰基转移酶(EC 2.3.1.9)、乙酰基-CoA羧化酶(EC 6.4.1.2)和/或乙酰乙酰基-CoA合酶(EC 2.3.1.194)。

图7示意性地显示了从乙酰基-CoA生产乙酰乙酰基-CoA的可能方式。

因此，本发明还涉及一种由乙酰基-CoA产生3-羟基-3-甲基丁酸的方法，其中如上所述由乙酰基-CoA产生乙酰乙酰基-CoA，由此产生的乙酰乙酰基-CoA然后与乙酰基-CoA缩合以形成3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA，其中3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA然后转化为3-甲基戊烯二酰基-CoA，然后通过脱羧反应转化为3-甲基巴豆酰基-CoA，然后如上文所述进一步酶促转化为3-羟基-3-甲基丁酸。

如上所述，根据上述任何方法生产的3-羟基-3-甲基丁酸可以进一步转化为异丁烯，如上所述。因此，本发明还涉及一种用于生产异丁烯的方法，该方法包括上述任何方法的步骤，并且还包括将所产生的3-羟基-3-甲基丁酸转化为异丁烯的步骤。

在另一方面，本发明还涉及将3-甲基巴豆酰基-CoA转化为3-羟基-3-甲基丁酸的方法，该方法包括以下步骤：

(a)将3-甲基巴豆酰基-CoA酶促转化为3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA；和

(b)将由此产生的3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA进一步酶促转化为3-羟基-3-甲基丁酸。

根据本发明，3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA到3-羟基-3-甲基丁酸的转化可以通过直接转化来实现。在另一个实施方案中，3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA到3-羟基-3-甲基丁酸的转化可以通过以下转化来实现，该转化首先包括3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA到3-羟基-3-甲基丁酰基磷酸的转化，和随后的3-羟基-3-甲基丁酰基磷酸到3-羟基-3-甲基丁酸的转化。

根据本发明，根据上述方法的步骤(a)，3-甲基巴豆酰基-CoA到3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA的酶促转化可以例如通过使用以下来实现

(i)3-羟基丙酰基-CoA脱水酶(EC 4.2.1.116)；

(ii)3-羟基丁酰基-CoA脱水酶(EC 4.2.1.55)；

(iii)烯酰基-CoA水合酶(EC 4.2.1.17)；

(iv)3-羟基辛酰基-[酰基-载体-蛋白]脱水酶(EC 4.2.1.59)；

(v)巴豆酰基-[酰基-载体-蛋白]水合酶(EC 4.2.1.58)；

(vi)3-羟基癸酰基-[酰基-载体-蛋白]脱水酶(EC 4.2.1.60)；

(vii)3-羟基棕榈酰基-[酰基-载体-蛋白]脱水酶(EC 4.2.1.61)；

(viii)长链烯酰基-CoA水合酶(EC 4.2.1.74)；

(ix)3-甲基戊烯二酰基-CoA水合酶(EC 4.2.1.18)。

3-甲基巴豆酰基-CoA到3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA的转化示意性地显示在图8中。

项(i)至(ix)中提及的酶的特征在于它们使用具有以下最小结构基序的天然底物：

其中

R¹是氢原子或烷基或CH₂COO^-，

R²是氢原子或甲基；和

R³是辅酶A或酰基-载体蛋白。

因此，上述酶可以分成如下两组：

I.上式中的R₃是酰基-载体蛋白

该组包括EC 4.2.1.58、EC 4.2.1.59、EC 4.2.1.60和EC 4.2.1.61。该组的酶具有催化以下类型的反应的共同点：

该组的酶具有共同的结构基序，其在InterPro中称为InterPro IPR013114(http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/IPR013114)。在Pfam数据库中这些酶的登录号是PF 07977(http://pfam.sanger.ac.uk/family/PF07977)。

II.上式中的R₃是辅酶A

该组包括EC 4.2.1.116、EC 4.2.1.55、EC 4.2.1.17、EC 4.2.1.74和EC4.2.1.18。

该组酶具有共同的结构基序，其在InterPRO数据库中称为InterPro IPR001753(http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/IPR001753)和IPR0018376(http：//www.ebi。ac.uk/interpro/entry/IPR018376)。在Pfam数据库中这些酶的登录号是PF00378(http://pfam.sanger.ac.uk/family/PF00378)。

在根据本发明方法的一个实施方案中，3-甲基巴豆酰基-CoA到3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA的转化通过使用3-羟基丙酰基-CoA脱水酶(EC 4.2.1.116)实现。3-羟基丙酰基-CoA脱水酶(EC 4.2.1.116)催化以下反应：

该酶已知来自各种细菌和古细菌。因此，在本发明的一个优选实施方案中，使用细菌3-羟基丙酰基-CoA脱水酶(EC 4.2.1.116)，优选来自选自以下属的细菌或古细菌的3-羟基丙酰基-CoA脱水酶：生金球菌属(Metallosphaera)、硫化叶菌属(Sulfolobus)和短芽孢杆菌属(Brevibacillus)，最优选选自铜生金球菌(Metallosphaera cuprina)、勤奋生金球菌(Metallosphaera sedula)、东京理工学院硫化叶菌(Sulfolobus tokodaii)和侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)的物种。这样的细菌3-羟基丙酰基-CoA脱水酶的实例是来自铜生金球菌(Uniprot F4FZ85；SEQ ID NO：1)、勤奋生金球菌(Uniprot A4YI89，Teufel等人，J.Bacteriol.191(2009)，4572-4581；SEQ ID NO：3)、东京理工学院硫化叶菌(Uniprot F9VNG3；SEQ ID NO：2)和侧孢短芽孢杆菌(Uniprot F7TTZ1；SEQ ID NO：6)。这些酶的氨基酸和核苷酸序列是可获得的。

在优选的实施方案中，本发明方法中使用的3-羟基丙酰基-CoA脱水酶具有SEQ IDNO：1至3或6中任一个所示的氨基酸序列，或显示至少x％同源于SEQ ID NO：1至3或6中的任一个的氨基酸序列，并且具有3-羟基丙酰基-CoA脱水酶的活性，其中x为30至100之间的整数，优选35、40、45、50、55、60、65、70、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中所述酶能够将3-甲基巴豆酰基-CoA转化为3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA，如上所述。

关于同一性程度的确定，同样适用于上文已有的阐述。

在根据本发明方法的另一个实施方案中，3-甲基巴豆酰基-CoA到3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA的转化通过使用3-羟基丁酰基-CoA脱水酶(EC 4.2.1.55)实现。3-羟基丁酰基-CoA脱水酶(EC 4.2.1.55)催化以下反应：

该反应对应于Michael消除(Michael elimination)。3-羟基丁酰基-CoA脱水酶属于裂合酶家族，特别是断裂碳-氧键的水裂合酶。该酶类的系统名称是(3R)-3-羟基丁酰基-CoA水裂合酶(巴豆酰基-CoA-形成)。常用的其它名称包括D-3-羟基丁酰基辅酶A脱水酶、D-3-羟基丁酰基-CoA脱水酶、烯酰基辅酶A水合酶和(3R)-3-羟基丁酰基-CoA水裂合酶。该酶参与丁酸代谢。属于该类并催化上述3-羟基丁酰基辅酶A转化为巴豆酰基辅酶A的酶，已被描述为存在于，例如，褐家鼠(Rattus norvegicus)、深红红螺菌(Rhodospirillumrubrum)、黄色粘球菌、微红黄色粘球菌(Myxococcus fulvus)、叶柄粘球菌(Myxococcusstipitatus)、类珊瑚珊瑚球菌(Corallococcus coralloides)、橙色标桩菌(Stigmatellaauranticaca)、嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)和好客酸双面菌(Acidianus hospitalis)中。已经确定了这些酶的核苷酸和/或氨基酸序列。原则上，可以在本发明的上下文中使用能够催化3-甲基巴豆酰基-CoA转化为3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA的任何3-羟基丁酰基-CoA脱水酶(EC 4.2.1.55)。在本发明的一个优选实施方案中，使用来自古细菌的3-羟基丁酰基-CoA脱水酶，优选来自选自硫化叶菌属和酸双面菌属(Acidianus)的古细菌的3-羟基丁酰基-CoA脱水酶，最优选来自选自嗜酸热硫化叶菌和好客酸双面菌(Acidianus hospitalis)的物种。这样的细菌3-羟基丁酰基-CoA脱水酶的实例是来自嗜酸热硫化叶菌(Uniprot Q4J8D5；SEQ ID NO：4)和来自好客酸双面菌(Acidianushospitalis)(Uniprot F4B9R3；SEQ ID NO：5)的酶。在另一个优选的实施方案中，使用来自粘球菌属(Myxococcus)、珊瑚球菌属(Corallococcus)或标桩菌属(Stigmatella)的细菌的3-羟基丁酰基-CoA脱水酶，优选来自物种黄色粘球菌、微红黄色粘球菌,叶柄粘球菌、类珊瑚珊瑚球菌或橙色标桩菌(Stigmatella aurantiaca)的3-羟基丁酰基-CoA脱水酶。这种细菌3-羟基丁酰基-CoA脱水酶的例子是来自黄色粘球菌(Uniprot Q1D5Y4；SEQ ID NO:7)、微红黄色粘球菌(Uniprot F8CDH2；SEQ ID NO:11)、叶柄粘球菌(Uniprot L7U993；SEQ IDNO:12)、类珊瑚珊瑚球菌(Uniprot H8N0F4；SEQ ID NO:13)或橙色标桩菌(UniprotQ08YS1；SEQ ID NO:14)的酶。

在一个优选的实施方案中，本发明方法中使用的3-羟基丁酰基-CoA脱水酶具有SEQ ID NO：4、5、7或11至14中任一个所示的氨基酸序列，或显示与SEQ ID NO：4、5、7或11至14中任一个至少x％同源的氨基酸序列，并且具有3-羟基丁酰基-CoA脱水酶的活性，其中x为30至100之间的整数，优选35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中该酶能够将3-甲基巴豆酰基-CoA转化为3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA，如上所述。

关于同一性程度的确定，同样适用于上文的阐述。

在根据本发明方法的另一个实施方案中，3-甲基巴豆酰基-CoA到3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA的转化通过使用烯酰基-CoA水合酶(EC 4.2.1.17)实现。烯酰基-CoA水合酶(EC4.2.1.17)催化以下反应：

烯酰基-CoA水合酶是通常使酰基-CoA上第二和第三碳原子之间双键发生水合的酶。然而，其也可以用于在相反方向上催化该反应。这种酶，也称为巴豆酸酶，天然地参与代谢脂肪酸以产生乙酰基-CoA和能量。属于这类的酶已经被描述存在于，例如，褐家鼠(Rattus norvegicus)、人、小家鼠(Mus musculus)、野猪(Sus scrofa)、牛(Bos taurus)、大肠杆菌、丙酮丁醇梭菌和氨基丁酸梭菌(Clostridium aminobutyricum)。已经确定了这种酶的核苷酸和/或氨基酸序列，例如，对于褐家鼠、人和枯草芽孢杆菌和炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)。原则上，可以催化3-甲基巴豆酰基-CoA转化为3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA的任何烯酰基-CoA水合酶(EC 4.2.1.17)可以用于本发明的上下文中。在优选的实施方案中，烯酰基-CoA水合酶是Galactomyces reessii的烯酰基-CoA水合酶(Dhar等人，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.28(2002),81-87)、枯草芽孢杆菌的烯酰基-CoA水合酶(Uniprot G4PBC3；SEQ ID NO：8)或炭疽芽孢杆菌的烯酰基-CoA水合酶(Uniprot Q81YG6；SEQ ID NO：9)。

在一个优选的实施方案中，本发明方法中使用的烯酰基-CoA水合酶具有SEQ IDNO：8或9中任一个所示的氨基酸序列，或显示与SEQ ID NO：8或9任何一个至少x％同源的氨基酸序列，并且具有烯酰基-CoA水合酶的活性，其中x为30至100之间的整数，优选优选35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中这种酶能够将3-甲基巴豆酰基-CoA转化为3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA，如上所述。

关于同一性程度的确定，同样适用于上文的阐述。

在根据本发明方法的另一个实施方案中，3-甲基巴豆酰基-CoA到3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA的转化通过使用3-羟基辛酰基-[酰基-载体-蛋白]脱水酶(EC 4.2.1.59)实现。3-羟基辛酰基-[酰基-载体-蛋白]脱水酶(EC 4.2.1.59)催化以下反应：

这种酶属于裂合酶家族，具体地断裂碳-氧键的水裂合酶。该酶的系统名称是(3R)-3-羟基辛酰基-[酰基-载体-蛋白]水裂合酶(辛-2-烯酰基-[酰基-载体蛋白]-形成)。常用的其它名称包括D-3-羟基辛酰基-[酰基载体蛋白]脱水酶、D-3-羟基辛酰基-酰基载体蛋白脱水酶、β-羟基辛酰基-酰基载体蛋白脱水酶、β-羟基辛酰基硫酯脱水酶、β-羟基辛酰基-ACP脱水酶、和(3R)-3-羟基辛酰基-[酰基-载体-蛋白]水裂合酶。已经描述了3-羟基辛酰基-[酰基-载体-蛋白]脱水酶存在于例如大肠杆菌中(Mizugaki等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.33(1968),520-527)。原则上，可以在本发明的上下文中使用能够催化3-甲基巴豆酰基-CoA转化为3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA的任何3-羟基辛酰基-[酰基-载体-蛋白]脱水酶。在优选的实施方案中，来自大肠杆菌的酶用于根据本发明的方法中。

在根据本发明方法的另一个实施方案中，3-甲基巴豆酰基-CoA到3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA的转化通过使用巴豆酰基-[酰基-载体-蛋白]水合酶(EC 4.2.1.58)实现。巴豆酰基-[酰基-载体-蛋白]水合酶(EC 4.2.1.58)催化以下反应：

这种酶属于裂合酶家族，具体地断裂碳-氧键的水裂合酶。

常用的其它名称包括(3R)-3-羟基丁酰基-[酰基-载体-蛋白]水裂合酶、β-羟基丁酰基酰基载体蛋白脱水酶、β-羟基丁酰基酰基载体蛋白(ACP)脱水酶、β-羟基丁酰基酰基载体蛋白脱水酶、烯酰基酰基载体蛋白水合酶、巴豆酰基酰基载体蛋白水合酶、3-羟基丁酰基酰基载体蛋白脱水酶、β-羟基丁酰基酰基载体和蛋白脱水酶。该酶参与脂肪酸生物合成。已经描述了巴豆酰基-[酰基-载体-蛋白]水合酶存在于例如大肠杆菌和拟南芥(Arabidopsisthaliana)中。原则上，可以催化3-甲基巴豆酰基-CoA转化为3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA的任何巴豆酰基-[酰基-载体-蛋白]水合酶可用于本发明的上下文中。在优选的实施方案中，来自大肠杆菌的酶用于根据本发明的方法中。

在根据本发明方法的另一个实施方案中，3-甲基巴豆酰基-CoA到3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA的转化通过使用3-羟基癸酰基-[酰基-载体-蛋白]脱水酶(EC4.2.1.60)实现。3-羟基癸酰基-[酰基-载体-蛋白]脱水酶(EC 4.2.1.60)催化以下反应：

已经描述了该酶存在于例如铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、恶性疟原虫、幽门螺杆菌、产氨棒杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、大肠杆菌、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)和肠沙门氏菌中。原则上，可以在本发明的上下文中使用能够催化3-甲基巴豆酰基-CoA转化为3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA的任何3-羟基癸酰基-[酰基-载体-蛋白]脱水酶。在优选的实施方案中，来自大肠杆菌的酶用于根据本发明的方法中。

在根据本发明方法的另一个实施方案中，3-甲基巴豆酰基-CoA到3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA的转化通过使用3-羟基棕榈酰基-[酰基-载体-蛋白]脱水酶(EC 4.2.1.61)实现。3-羟基棕榈酰基-[酰基-载体-蛋白]脱水酶(EC 4.2.1.61)催化以下反应：

这种酶属于裂合酶家族，具体地断裂碳-氧键的水裂合酶。常用的其它名称包括D-3-羟基棕榈酰基-[酰基-载体-蛋白]脱水酶、β-羟基棕榈酰基-酰基载体蛋白脱水酶、β-羟基棕榈酰基硫酯脱水酶、β-羟基棕榈酰基-ACP脱水酶和(3R)-3-羟基棕榈酰基-[酰基-载体-蛋白]水裂合酶。已经描述了3-羟基棕榈酰基-[酰基-载体-蛋白]脱水酶存在于例如白色念珠菌、解脂耶氏酵母、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母(S.pombe)、炭色旋孢腔菌(Cochliobolus carbonum)、小家鼠、褐家鼠、牛、原鸡和人。原则上，可以在本发明的上下文中使用能够催化3-甲基巴豆酰基-CoA转化为3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA的任何3-羟基棕榈酰基-[酰基-载体-蛋白]脱水酶。

在根据本发明方法的另一个实施方案中，3-甲基巴豆酰基-CoA到3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA的转化通过使用长链烯酰基-CoA水合酶(EC 4.2.1.74)实现。长链烯酰基-CoA水合酶(EC 4.2.1.74)催化以下反应：

这种酶属于裂合酶家族，具体地断裂碳-氧键的水裂合酶。该酶类的系统名称是长链-(3S)-3-羟基酰基-CoA水裂合酶。该酶也称为长链烯酰基辅酶A水合酶，并且其参与线粒体中的脂肪酸延长和脂肪酸代谢。这种酶存在于许多生物体中，例如，在褐家鼠(Wu等人,Org.Lett.10(2008),2235-2238)、野猪和豚鼠(Fong and Schulz,J.Biol.Chem.252(1977),542-547；Schulz,Biol.Chem.249(1974),2704-2709)中，并且原则上可以催化3-甲基巴豆酰基-CoA转化为3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA的任何长链烯酰基-CoA水合酶可用于本发明的方法中。

在根据本发明方法的另一个实施方案中，3-甲基巴豆酰基-CoA到3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA的转化通过使用3-甲基戊烯二酰基-CoA水合酶(EC 4.2.1.18)实现。3-甲基戊烯二酰基-CoA水合酶(EC 4.2.1.18)催化以下反应：

这种酶存在于许多生物体中，特别是在细菌、植物和动物中。该酶已有描述，例如对于恶臭假单胞菌、不动杆菌属物种(SwissProt登录号Q3HW12)、黄长春花(Catharantusroseus)、人(SwissProt登录号Q13825)、牛和绵羊，并且原则上可以催化3-甲基巴豆酰基-CoA转化为3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA的任何3-甲基戊烯二酰基-CoA水合酶可用于本发明的方法中。

在一个优选的实施方案中，用于将3-甲基巴豆酰基-CoA转化为3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA的酶是由黄色粘球菌的liuC基因编码的蛋白质(Li等人，Angew.Chem.Int.Ed.52(2013),1304-1308)。

如上所述，可以将所产生的3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA进一步酶促转化为3-羟基-3-甲基丁酸(步骤(b))。这种转化可以通过直接转化、或者可选地通过经由3-羟基-3-甲基丁酰基磷酸的两步反应来实现。

在第一实施方案中，3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA直接转化为3-羟基-3-甲基丁酸。

所产生的3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA到3-羟基-3-甲基丁酸的酶促转化可以例如通过使用以下实现

(i)硫酯酶(EC 3.1.2)；或

(ii)CoA-转移酶(EC 2.8.3)。

通过硫酯酶催化的3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA到3-羟基-3-甲基丁酸的转化，示意性地显示在图9中。由CoA-转移酶催化的3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA到3-羟基-3-甲基丁酸的转化，示意性地显示在图10中。

硫酯酶和CoA-转移酶已经在上面详细描述，这里也适用。

关于在所述的3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA向3-羟基-3-甲基丁酸转化的上下文中使用的CoA-转移酶，在此额外地，在优选的实施方案中，使用属于如上所述的家族I或II的CoA-转移酶，特别是酶复合物的α亚基。在更优选的实施方案中，CoA-转移酶是柠檬酸裂合酶(EC 2.8.3.10)柠苹酸CoA-转移酶(EC 2.8.3.11)或琥珀酰基-CoA:乙酸CoA-转移酶(EC2.8.3.18；也参见Mullins等人,Biochemistry 51(2012),8422-34；Mullins等人,J.Bacteriol.190(2006),4933–4940)的α亚基。

柠苹酸CoA-转移酶(EC 2.8.3.11)是催化以下反应的酶：

该酶已被描述存在于例如木糖氧化无色小杆菌(Achromobacter xylosoxidans)和假破伤风梭菌(Clostridium tetanomorphum)中。特别地，来自假破伤风梭菌(Clostridium tetanomorhum)的酶复合物柠苹酸裂合酶的α亚基被证明催化从柠苹酰基-CoA和乙酸形成乙酰基-CoA和柠苹酸(Dimroth等人，Eur.J.Biochem.80(1977),479-477)。

琥珀酰基-CoA:乙酸CoA-转移酶是催化以下反应的酶：

该酶已被描述存在于例如醋化醋杆菌(Acetobacter aceti)、胎儿三毛滴虫(Tritrichomonas foetus)、阴道三毛滴虫(Trichomonas vaginalis)和布氏锥虫(Trypanosoma brucei)。

在第二实施方案中，首先将3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA转化为3-羟基-3-甲基丁酰基磷酸，然后将其进一步转化为3-羟基-3-甲基丁酸。反应可概括如下：

(i)3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA+H₃PO₄→3-羟基-3-甲基丁酰基磷酸+CoA

(ii)3-羟基-3-甲基丁酰基磷酸+ADP→3-羟基-3-甲基丁酸+ATP

因此，本发明还提供了将3-甲基巴豆酰基-CoA转化为3-羟基-3-甲基丁酸的方法，该方法包括以下步骤：

(a)将3-甲基巴豆酰基-CoA酶促转化为3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA；和

(b)将由此产生的3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA进一步酶促转化为3-羟基-3-甲基丁酰基磷酸；和

(c)将由此产生的羟基-3-甲基丁酰基磷酸进一步酶促转化为3-羟基-3-甲基丁酸。

3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA到3-羟基-3-甲基丁酰基磷酸的转化可以例如通过使用磷酸丁酰基转移酶(EC 2.3.1.19)或磷酸乙酰基转移酶(EC 2.3.1.8)实现。

磷酸丁酰基转移酶(EC 2.3.1.19)天然催化以下反应

Wiesenborn等人(Appl.Environ.Microbiol.55(1989),317-322)和Ward等人(J.Bacteriol.181(1999),5433-5442)已经描述了，除丁酰基-辅酶A(丁酰基-CoA)以外，磷酸丁酰基转移酶(EC 2.3.1.19)还可以利用许多底物，特别是乙酰基-CoA、丙酰基-CoA、异丁酰基-CoA、戊酰基-CoA和异戊酰基-CoA。

该酶已被描述存在于许多生物体中，特别是在细菌和原生动物中。在一个实施方案中，该酶来自原生动物Dasytricha ruminantium。在优选的实施方案中，磷酸丁酰基转移酶是来自细菌的磷酸丁酰基转移酶，优选来自芽孢杆菌属、丁酸弧菌属、肠球菌属或梭菌属的细菌，更优选来自肠球菌属或梭菌属的细菌，甚至更优选来自巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、溶纤维丁酸弧菌、丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌、科氏梭菌、糖丁醇梭菌、生孢梭菌或粪肠球菌。最优选地，酶来自枯草芽孢杆菌(菌株168)(Uniprot登录号P54530)、丙酮丁醇梭菌(Uniprot登录号F0K6W0)或来自粪肠球菌MTUP9(Uniprot登录号K4YRE8或Uniprot登录号A0A038BNC2)。可获得的Uniprot登录号K4YRE8和Uniprot登录号A0A038BNC2下的来自粪肠球菌的磷酸丁酰基转移酶的序列具有99.3％的序列同源性。可获得的Uniprot登录号A0A038BNC2下的来自粪肠球菌的磷酸丁酰基转移酶的序列是更优选的。

如上所述，在一个优选的实施方案中，酶是来自枯草芽孢杆菌(菌株168)的磷酸丁酰基转移酶(EC 2.3.1.19)(Uniprot登录号P54530)。在一个特别优选的实施方案中，本发明方法中使用的磷酸丁酰基转移酶(EC 2.3.1.19)具有如SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列、或显示与SEQ ID NO：28至少x％同源的氨基酸序列，并且具有磷酸丁酰基转移酶的活性，其中x为30至100之间的整数，优选为35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中这种酶能够将3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA转化为3-羟基-3-甲基丁酰基磷酸，如上所述。

在另一个优选的实施方案中，如上所述，酶是来自粪肠球菌MTUP9的磷酸丁酰基转移酶(EC 2.3.1.19)(Uniprot登录号K4YRE8或Uniprot登录号A0A038BNC2)。在一个特别优选的实施方案中，本发明方法中使用的磷酸丁酰基转移酶(EC 2.3.1.19)具有如SEQ IDNO：29所示的氨基酸序列，或显示与SEQ ID NO：29至少x％同源的氨基酸序列，并且具有磷酸丁酰基转移酶的活性，其中x为30至100之间的整数，优选为35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中这种酶能够将3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA转化为3-羟基-3-甲基丁酰基磷酸，如上所述。

关于同一性程度的确定，同样适用于上文的阐述。

磷酸乙酰基转移酶(EC 2.3.1.8)天然催化以下反应

Veit等人已经描述了(J.Biotechnol.140(2009),75-83)磷酸乙酰基转移酶也可以用丁酰基-CoA或丙酰基-CoA作底物。

InterPro数据库中该酶家族的登录号为IPR012147和IPR002505

(http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/IPR012147

http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/IPR002505)

也参见http://pfam.sanger.ac.uk/family/PF01515

该酶已经描述于多种生物体中，特别是细菌和真菌。因此，在一个优选的实施方案中，酶是来自细菌的酶，优选埃希氏菌属(Escherichia)、Chlorogonium、梭菌属(Clostridium)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、棒杆菌属(Corynebacterium)、鲁杰氏菌属(Ruegeria)、沙门氏菌属(Salmonella)、固氮菌属(Azotobacter)、慢生根瘤菌属(Bradorhizobium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、穆尔氏菌属(Moorella)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、链球菌属(Streptococcus)、热袍菌属(Thermotoga)或芽孢杆菌属，更优选大肠杆菌、Chlorogonium elongatum、科氏梭菌(Clostridium kluyveri)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、尿酸梭菌(Clostridium acidurici)、小韦荣氏球菌(Veillonella parvula)、嗜热甲烷八叠球菌(Methanosarcina thermophila)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、帕氏鲁杰菌(Ruegeria pomeroyi)、肠沙门氏菌(Salmonella enterica)、棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)、大豆慢生根瘤菌、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、旧金山乳杆菌(Lactobacillus sanfranciscensis)、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)、海热袍菌(Thermotoga maritima)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。在另一个优选的实施方案中，酶是来自真菌的酶，优选来自酵母属，更优选来自酿酒酵母。

3-羟基-3-甲基丁基酰磷酸到3-羟基-3-甲基丁酸的转化可以例如通过使用丁酸激酶(EC 2.7.2.7)、支链脂肪酸激酶(例如，EC 2.7.2.14)、丙酸激酶(EC 2.7.2.15)或乙酸激酶(EC 2.7.2.1)实现。

丁酸激酶(EC 2.7.2.7)天然催化以下反应

例如，Hartmanis(J.Biol.Chem.262(1987),617-621)已经描述了，除了丁酸以外，丁酸激酶还可以使用许多底物，例如，戊酸、异丁酸、异戊酸和乙烯乙酸。该酶已经描述于多种生物体，特别是细菌中。在一个优选的实施方案中，酶来自细菌，优选来自梭菌属、丁酸弧菌属、热袍菌属、肠球菌属、乳杆菌属或地芽孢杆菌属的细菌。优选梭菌属、乳杆菌属或地芽孢杆菌属的细菌。更优选地，所述酶来自丙酮丁醇梭菌、解蛋白梭菌(Clostridiumproteoclasticum)、酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)、丁酸梭菌、巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum)、假破伤风梭菌(Clostridium tetanomorphum)、溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio firbrosolvens)、洪氏丁酸弧菌(Butyrivibrio hungatei)、海热袍菌(Thermotoga maritime)、耐久肠球菌(Enterococcus durans)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)(Uniprot登录号K0N529)或地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)(Uniprot登录号L8A0E1)。优选丙酮丁醇梭菌、干酪乳杆菌W56或地芽孢杆菌GHH01。对于丙酮丁醇梭菌，已经描述了两种丁酸激酶：丁酸激酶1(Uniprot登录号：Q45829)和丁酸激酶II(Uniprot登录号：Q97II19)

如上所述，在一个优选的实施方案中，酶是来自干酪乳杆菌W56的丁酸激酶(EC2.7.2.7)(Uniprot登录号K0N529)。在一个特别优选的实施方案中，本发明方法中使用的丁酸激酶(EC 2.7.2.7)具有SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列或显示与SEQ ID NO：30至少x％同源的氨基酸序列，并且具有丁酸激酶的活性，其中x为30至100之间的整数，优选为35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中这种酶能够将3-羟基-3-甲基丁酰基磷酸转化为3-羟基-3-甲基丁酸，如上所述。

在另一个优选的实施方案中，酶是来自地芽孢杆菌GHH01的丁酸激酶(EC2.7.2.7)(Uniprot登录号L8A0E1)。在一个特别优选的实施方案中，本发明方法中使用的丁酸激酶(EC 2.7.2.7)具有如SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列或显示与SEQ ID NO：31至少x％同源的氨基酸序列，并且具有丁酸激酶的活性，其中x为30至100之间的整数，优选为35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中这种酶能够将3-羟基-3-甲基丁酰基磷酸转化为3-羟基-3-甲基丁酸，如上所述。

支链脂肪酸激酶(EC 2.7.2.14)天然催化以下反应

该酶已被描述存在于许多细菌中。因此，在一个优选的实施方案中，该酶是来自细菌的酶，优选来自螺旋体属或热袍菌属，更优选海热袍菌的酶。

丙酸激酶(EC 2.7.2.15)天然催化以下反应

该酶已被描述存在于许多细菌中，特别是肠杆菌科(Enterobacteriacea)中。因此，在一个优选的实施方案中，酶是来自细菌的酶，优选来自沙门氏菌属或埃希氏菌属，更优选来自肠沙门氏菌或大肠杆菌。

乙酸激酶(EC 2.7.2.1)天然催化以下反应

已经描述了该酶存在于许多生物体中，特别是细菌和真核生物中。在一个优选的实施方案中，酶是来自细菌的酶，优选来自甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、隐球菌属(Cryptococcus)、产乙醇菌属(Ethanoligenens)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、玫瑰变色菌属(Roseovarius)、链球菌属(Streptococcus)、沙门氏菌属(Salmonella)、无胆甾原体属(Acholeplasma)、不动杆菌属(Acinetobacter)、Ajellomyces、芽孢杆菌属(Bacillus)、疏螺旋体属(Borrelia)、毛壳属(Chaetomium)、梭菌属(Clostridium)、Coccidioides、Coprinopsis，隐球菌属(Cryptococcus)、贪铜菌属(Cupriavidus)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、肠球菌属(Enterococcus)、埃希氏菌属(Escherichia)、产乙醇菌属(Ethanoligenes)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、螺杆菌属(Helicobacter)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、李斯特氏菌属(Listeria)、中间原体属(Mesoplasma)、穆尔氏菌属(Moorella)、支原体(Mycoplasma)、大洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、红假单胞菌属(Rhodospeudomonas)、玫瑰变色菌属(Roseovarius)、沙门氏菌属(Salmonella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、热袍菌属(Thermotoga)或韦荣氏球菌属(Veillonella)的细菌，更优选来自嗜热甲烷八叠球菌(Methanosarcina thermophila)、新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)、哈尔滨产乙酸菌(Ethanoligenens harbinense)、产丙酸丙酸杆菌(Propionibacterium acidipropionici)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、内脏链球菌(Streptococcus enterica)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、莱氏无胆甾原体(Acholeplasma laidlawii)、醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)、Ajellomyces capsulatus、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、布氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)、球毛壳(Chaetomium globosum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、热解纤维梭菌(Clostridium thermocellum)、Coccidioides immitis、Coprinopsis cinerea、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、杀虫贪铜菌(Cupriavidus necator)、普通脱硫弧菌(Desulfovibrio vulgaris)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、哈尔滨产乙醇菌(Ethanoligenes harbinense)、嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、旧金山乳杆菌(Lactobacillussanfranciscensis)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、单核增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)、花中间原体(Mesoplasma florum)、噬乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcina acetivorans)、马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、伊平屋桥大洋芽孢杆菌(Oceanobacillus iheyensis)、费氏丙酸杆菌(Propionibacteriumfreudenreichii)、产丙酸丙酸杆菌(Propionibacterium acidipropionici)、沼泽红假单胞菌(Rhodospeudomonas palustris)、肠沙门氏菌(Salmonella enteric)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、海热袍菌(Thermotoga maritime)、或小韦荣氏球菌(Veillonella parvu^la)。

在另一个优选的实施方案中，酶是来自真菌的酶，优选来自曲霉属(Aspergillus)、赤霉菌属(Gibberella)、肉座菌属(Hypocrea)、稻瘟病菌属(Magnaporthe)、暗球腔菌属(Phaeosphaeria)、原毛平革菌属(Phanerochaete)、疫霉属(Phytophthora)、核盘菌属(Sclerotinia)、Uncinocarpus、黑粉菌属(Ustilago)或脉孢菌属(Neurospora)的真菌，更优选来自以下物种的真菌：烟曲霉(Aspergillus fumigates)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)、红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)、水稻稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、颖枯暗球腔菌(Phaeosphaeria nodorum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、橡树疫霉(Phytophthora ramorum)、大豆疫霉(Phytophthora sojae)、核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)、Uncinocarpus reesii、玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)或粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)。

在另一个优选的实施方案中，酶是来自植物或藻类的酶，优选来自衣藻属(Chlamydomonas)，甚至更优选来自物种莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)。

在另一个实施方案中，酶来自内阿米巴属(Entamoeba)的生物体，更优选来自物种溶组织内阿米巴菌(Entamoeba histolytica)。

已经显示，上述适于将3-羟基-3-甲基丁酰磷酸转化为3-羟基-3-甲基丁酸的酶家族是进化相关的，并且含有共有序列标签(signature)。这些标签在Prosite数据库中引用和描述：

http://prosite.expasy.org/cgi-bin/prosite/nicedoc.pl？PS01075

Gao等人(FEMS Microbiol.Lett.213(2002),59-65)已经描述了遗传修饰的大肠杆菌细胞，尤其是已经被分别编码磷酸丁酰基转移酶(EC 2.3.1.19)和丁酸激酶(EC2.7.2.7)的丙酮丁醇梭菌的ptb基因和buk基因转化的大肠杆菌细胞。这些大肠杆菌细胞已经显示能够产生D-(-)-3-羟基丁酸(3HB)。

用于经由3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA转化为3-羟基-3-甲基丁酸的3-甲基巴豆酰基-CoA本身可以通过本文上述的方法提供。因此，本发明还涉及生产3-羟基-3-甲基丁酸的方法，该方法包括以下步骤：将3-甲基巴豆酰基-CoA经由3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA转化为3-羟基-3-甲基丁酸，和进一步包括用于提供3-甲基巴豆酰基-CoA的任何上述进一步的酶促步骤。所产生的3-羟基-3-甲基丁酸可以如上所述进一步转化为异丁烯。因此，本发明还涉及一种生产异丁烯的方法，其包括上述用于生产3-羟基-3-甲基丁酸的方法，和进一步地还包括将由此产生的3-羟基-3-甲基丁酸酶促转化为异丁烯的步骤，如上所述。

根据本发明的方法可以在体外或体内进行。体外反应理解为其中不使用细胞的反应，即无细胞反应。因此，体外优选是指在无细胞系统中。在一个实施方案中，术语“体外”是指在分离的酶(或任选包含可能需要的辅因子的酶系统)的存在下。在一个实施方案中，在该方法中使用的酶以纯化形式使用。

为了在体外实施该方法，在允许酶有活性并发生酶促转化的条件(缓冲液、温度、共底物、辅因子等)下，孵育用于反应的底物和酶。使反应进行足以产生相应产物的时间。相应产物的产量可以通过本领域已知的方法测量，如可与质谱检测连接的气相色谱。

酶可以是允许酶反应发生的任何合适的形式。它们可以被纯化或部分纯化，或者以粗细胞提取物或部分纯化的提取物的形式。也可以将酶固定在合适的载体上。

在另一个实施方案中，根据本发明的方法在生物(优选微生物)存在下在培养中进行，所述生物产生上述用于如上所述的本发明转化方法的酶。使用微生物实施本发明方法的方法被称为“体内”方法。可以使用天然产生上述用于根据本发明方法的转化的酶的微生物、或者使用已经被遗传修饰从而表达(包括过表达)一种或多种这样的酶的微生物。因此，微生物可以是表达上述用于根据本发明方法的转化的酶的工程化微生物，即所述微生物在其基因组中具有编码这种酶的核苷酸序列，并且已被修饰以过表达这些酶。表达可以组成型或以诱导或调节的方式发生。

在另一个实施方案中，微生物可以是已经通过引入一种或多种核酸分子进行遗传修饰的微生物，所述核酸分子含有编码上述用于根据本发明方法的转化的一种或多种酶的核苷酸序列。核酸分子可以稳定地整合到微生物的基因组中，或者可以以染色体外的方式存在，例如，在质粒上。

这种经遗传修饰的微生物可以是例如这样的微生物，所述微生物并不天然表达上述用于根据本发明方法的转化的酶，但其已经被遗传修饰以表达这样的酶；或者所述微生物是天然表达这样的酶的微生物并且其已经被遗传修饰，例如，用编码相应酶的核酸(例如载体)转化，和/或在编码酶的内源核苷酸序列前插入启动子，以增加所述微生物中相应的活性。

然而，本发明优选排除在自然界中发现的、以在自然界中的水平表达上述酶的、天然存在的微生物。相反，本发明的微生物和本发明方法中使用的微生物优选是非天然存在的微生物，无论其是已被遗传修饰以表达(包括过表达)通常不存在于其基因组中的本发明外源性酶，或是已经工程化以过表达外源酶。

因此，与本发明相关使用的酶和(微)生物优选是非天然存在的酶或(微生物)，即它们是与天然存在的酶或微生物显著不同的酶或(微)生物体，其在自然界中不存在。关于酶，它们优选是天然存在的酶的变体，其由此不是天然存在的。这样的变体包括例如突变体，特别是通过分子生物学方法制备的突变体，其显示出改进的性质，如更高的酶活性、更高的底物特异性、更高的温度耐性等。关于(微)生物，它们优选是如上所述的遗传修饰的生物，其由于遗传修饰而与天然存在的生物不同。遗传修饰的生物是非天然存在的生物体，即其不能在自然界中被找到，并且由于引入外源核酸分子而与天然存在的生物体实质上不同。

通过过表达上文所述的外源或内源酶，酶的浓度实质性地高于自然界中发现的浓度，这然后可以意想不到地促进使用非天然的相应酶的本发明反应。优选地，过表达酶的浓度为总宿主细胞蛋白的至少5％、10％、20％、30％或40％。

“非天然”底物理解为在自然界中不被相应的酶作用的分子，即使它可能实际上与内源性酶一起共存在于微生物中。该“非天然”底物在自然界中不被微生物转化，因为其它底物是优选的(例如“天然底物”)。因此，本发明考虑在非天然存在的环境中使用非天然底物与上述酶。

因此，在本发明的上下文中，微生物也可以是天然不具有相应酶活性但经遗传修饰而包含允许表达相应酶的核苷酸序列的微生物。类似地，微生物也可以是天然具有相应酶活性但被遗传修饰以增强该活性的微生物，例如通过引入编码相应酶的外源核苷酸序列，或通过引入启动子用于编码酶的内源基因以增加内源性生产至过表达(非天然)水平。

如果使用天然表达相应酶的微生物，可以修饰这样的微生物，使得相应活性在微生物中过表达。这可以例如通过在相应基因的启动子区域中进行突变或引入高表达启动子从而产生确保基因更高表达的启动子来实现。或者，还可以使基因突变以便产生显示更高活性的酶。

通过使用表达上述酶的微生物用于根据本发明方法的转化，可以在培养基中直接进行根据本发明的方法，而不需要分离或纯化酶。

在一个实施方案中，在本发明方法中使用的生物是已经被遗传修饰而含有外源核酸分子的微生物，其中所述外源核酸分子编码至少一种用于本发明方法的转化的上述酶。在本文中，术语“外来”或“外源”意指核酸分子不天然存在于所述微生物中。这意味着，它不存在于微生物的相同结构中或相同位置上。在一个优选的实施方案中，外源核酸分子是包含启动子和编码相应酶的编码序列的重组分子，其中驱动编码序列表达的启动子相对于编码序列是异源的。在本文中“异源”是指启动子不是天然驱动所述编码序列表达的启动子，而是天然驱动不同编码序列表达的启动子，即其来源于另一个基因，或是合成启动子或嵌合启动子。优选地，启动子是与微生物异源的启动子，即天然不存在于相应微生物中的启动子。甚至更优选地，启动子是诱导型启动子。用于在不同类型的生物体中，特别是在微生物中驱动表达的启动子是本领域技术人员公知的。

在另一个实施方案中，核酸分子对微生物是外源的，因为编码的酶对于微生物不是内源的，即当微生物没有被遗传修饰时其天然不表达该酶。换句话说，编码的酶相对于微生物是异源的。外源核酸分子可以以染色体外形式(例如，作为质粒)存在于微生物中，或稳定整合在染色体中。优选稳定的整合。因此，遗传修饰可以是，例如，将编码所述酶的相应基因整合到染色体中，或从在酶编码序列上游含有启动子的质粒表达该酶，启动子和编码序列优选源自不同生物体，或是本领域技术人员已知的任何其它方法。

在本发明的上下文中，术语“微生物”是指细菌、以及真菌，如酵母，以及藻类和古细菌。在一个优选的实施方案中，微生物是细菌。原则上可以使用任何细菌。在根据本发明的方法中使用的优选细菌是芽孢杆菌属、梭菌属、棒杆菌属、假单胞菌属、发酵单胞菌属(Zymomonas)或埃希氏菌属的细菌。在特别优选的实施方案中，细菌属于埃希氏菌属，甚至更优选属于大肠杆菌。在另一个优选的实施方案中，细菌属于恶臭假单胞菌种或运动发酵单胞菌种(Zymomonas mobilis)或属于谷氨酸棒杆菌种或枯草芽孢杆菌种。

还可以使用嗜极端细菌如嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)，或来自梭菌(Clostridiae)的厌氧细菌。

在另一个优选的实施方案中，微生物是真菌，更优选酵母属、裂殖酵母属、曲霉属、木霉属、克鲁维酵母属或毕赤酵母属的真菌，甚至更优选酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、黑曲霉、里氏木霉(Trichoderma reesei)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、圆毕赤酵母(Pichia torula)或产朊毕赤酵母(Pichia utilis)的菌种。

在另一个实施方案中，根据本发明的方法利用表达至少一种用于如上本发明转化的酶的光合微生物。优选地，微生物是光合细菌或微藻。在另一个实施方案中，微生物是藻类，更优选属于硅藻类(diatomeae)的藻。

还可以想到在根据本发明的方法中使用微生物的组合，其中不同的微生物表达如上所述的不同的酶。下面还将进一步详细描述表达感兴趣的酶的微生物的遗传修饰。

在另一个实施方案中，本发明的方法包括步骤：提供生物，优选提供(细胞)培养物形式(优选，液体细胞培养物形式)的、带有相应酶活性(一种或多种)的微生物；随后在允许相应酶表达的合适条件下在发酵罐(通常也称为生物反应器)中培养生物(优选微生物)；并且还包括步骤：实施如上文所述的本发明方法的酶促转化。合适的发酵罐或生物反应器装置和发酵条件是本领域技术人员已知的。生物反应器或发酵罐是指本领域已知的支持生物活性环境的任何生产的或工程化的装置或系统。因此，生物反应器或发酵罐可以是容器，在其中进行化学/生物化学如本发明方法，其中所述化学/生物化学涉及生物体，优选微生物和/或生物化学活性物质，即源自这些生物的上述酶或包含上述酶的生物。在生物反应器或发酵罐中，该过程可以是需氧的或厌氧的。这些生物反应器通常是圆柱形的，并且尺寸可以从升到立方米，并且通常由不锈钢制成。在这方面，不受理论的束缚，发酵罐或生物反应器可以以适于在例如分批培养、补料分批培养、灌注培养或恒化培养中培养生物体(优选微生物)的方式设计，所有这些都是本领域公知的。

培养基可以是适于培养相应生物体或微生物的任何培养基。

根据本发明的方法中使用的酶可以是天然存在的酶或源自天然存在的酶的酶，例如，通过引入突变或其它改变，例如改变或改善酶活性、稳定性等。

用于修饰和/或改善蛋白质的期望酶活性的方法是本领域技术人员公知的，包括例如随机诱变或定点诱变，随后选择具有所需性质的酶或称为“定向进化”的方法。

例如，对于原核细胞中的遗传修饰，可以将编码相应酶的核酸分子引入质粒，其允许通过DNA序列的重组进行诱变或序列修饰。标准方法(参见Sambrook and Russell(2001),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,CSH Press,Cold Spring Harbor,NY,USA)允许进行碱基交换或添加天然或合成序列。可以通过使用与片段互补的适体(adapters)和接头来连接DNA片段。此外，可以使用提供合适的限制性位点或去除多余DNA或限制性位点的工程化手段。在那些可能进行插入、缺失或取代的情况中，可以使用体外诱变、“引物修复”，限制或连接。通常，进行序列分析、限制性分析和其它生物化学和分子生物学方法作为分析方法。然后可以使用如上所述的测定法，特别是针对增加的酶活性，测试所得酶变体的期望活性，例如酶活性。

如上所述，在本发明的方法中使用或包含在本发明的组合物中的微生物可以是通过引入编码相应酶的核酸分子而被遗传修饰的微生物。因此，在优选的实施方案中，微生物是重组微生物，其已经被遗传修饰以具有增加的至少一种上述用于根据本发明方法的转化的酶的活性。这可以例如通过用编码相应酶的核酸转化微生物实现。下面将进一步详细描述微生物的遗传修饰。优选地，引入微生物中的核酸分子是相对于微生物是异源的核酸分子，即它不天然存在于所述微生物中。

在本发明的上下文中，“增加的活性”是指，在经遗传修饰的微生物中酶的表达和/或活性，比相应的未修饰的微生物中的，高至少10％、优选至少20％、更优选至少30％或50％、甚至更优选至少70％或80％、特别优选至少90％或100％。在甚至更优选的实施方案中，表达和/或活性的增加可以为至少150％、至少200％或至少500％。在特别优选的实施方案中，与相应的未修饰的微生物相比，表达高至少10倍、更优选至少100倍、甚至更优选至少1000倍。

术语“增加的”表达/活性还涵盖其中相应的未修饰的微生物不表达相应的酶从而在未修饰的微生物中相应的表达/活性为零的情况。优选地，过表达的酶的浓度为总宿主细胞蛋白的至少5％、10％、20％、30％或40％。

用于测量细胞中给定蛋白质的表达水平的方法是本领域技术人员公知的。在一个实施方案中，表达水平的测量通过测量相应蛋白质的量来进行。相应的方法是本领域技术人员熟知的，包括Western Blot，ELISA等。在另一个实施方案中，通过测量相应RNA的量，进行表达水平的测量。相应的方法是本领域技术人员公知的，包括例如Northern Blot。

在本发明的上下文中，术语“重组”是指，与野生型或非修饰的微生物相比，微生物被遗传修饰以包含编码如上定义的酶的核酸分子。编码如上定义的酶的核酸分子可以单独使用或作为载体的一部分使用。

核酸分子还可以包含与包含在该核酸分子中的多核苷酸可操作地连接的表达控制序列。如本说明书通篇使用的术语“可操作地连接”或“可操作地连接”是指，一个或多个表达控制序列与待表达的多核苷酸中的编码区之间的连接，使得在与表达控制序列相容的条件下可以实现表达。

表达包括异源DNA序列的转录，优选转录成可翻译的mRNA。确保在真菌以及细菌中表达的调节元件是本领域技术人员熟知的。它们包括启动子、增强子、终止信号、靶向信号等。下面结合有关载体的解释，进一步给出实例。

用于与核酸分子有关的启动子就其来源和/或就待表达的基因而言可以是同源或异源的。合适的启动子是例如引起组成型表达的启动子。然而，也可以使用仅在由外部影响决定的时间点上活化的启动子。人工和/或化学诱导型启动子可用于本文。

载体可以进一步包含与载体中所含的所述多核苷酸可操作地连接的表达控制序列。这些表达控制序列可以适合于确保可翻译的RNA在细菌或真菌中的转录和合成。

此外，可以通过分子生物学中常用的方法(参见例如Sambrook和Russell(2001)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，CSH Press，Cold Spring Harbor，NY，USA)，将不同的突变插入到多核苷酸中，导致可能具有修饰的生物学性质的多肽的合成。可以想到，在如下位置处引入点突变，在该位置处氨基酸序列的修饰将例如影响多肽的生物活性或多肽的调节。

此外，可以制备具有修饰的底物或产物特异性的突变体。优选地，这种突变体显示出增加的活性。或者，可以制备其催化活性被完全破坏而不丧失底物结合活性的突变体。

此外，可以将突变引入编码如上所定义的酶的多核苷酸中，以允许减少或增加所述多核苷酸编码的酶的基因表达速率和/或活性。

为了遗传修饰细菌或真菌，可以将编码如上定义的酶或这些分子的部分的多核苷酸引入允许通过DNA序列重组进行诱变或序列修饰的质粒中。标准方法(参见Sambrook和Russell(2001)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，CSH Press，Cold SpringHarbor，NY，USA)允许进行碱基交换或添加天然或合成序列。DNA片段可以通过对片段应用适体和接头而彼此连接。此外，可以使用工程化手段来提供合适的限制性位点或去除多余的DNA或限制性位点。在那些可能进行插入、缺失或取代的情况中，可以使用体外诱变、“引物修复”、限制或连接。通常，进行序列分析、限制性分析和其它生物化学和分子生物学方法作为分析方法。

因此，根据本发明，可以通过遗传修饰真菌或细菌，包括将上述多核苷酸、核酸分子或载体引入真菌或细菌中，来生产重组微生物，。

表达编码相应酶的多核苷酸，从而导致产生具有上述任何活性的多肽。不同表达系统的综述参见例如Methods in Enzymology 153(1987)，385-516，Bitter等人(Methodsin Enzymology 153(1987)，516-544)和Sawers等人(Applied Microbiology andBiotechnology 46(1996)，1-9)，Billman-Jacobe(Current Opinion in Biotechnology 7(1996)，500-4)，Hockney(Trends in Biotechnology 12(1994)，456-463)，Griffiths等人(Methods in Molecular Biology 75(1997)，427-440)。酵母表达系统的综述参见例如Hensing等人(Antonie van Leuwenhoek 67(1995)，261-279)，Bussineau等人(Developments in Biological Standardization 83(1994)，13-19)，Gellissen等人(Antonie van Leuwenhoek 62(1992)，79-93，Fleer(Current Opinion in Biotechnology3(1992)，486-496)，Vedvick(Current Opinion in Biotechnology 2(1991)，742-745)和Buckholz(Bio/Technology 9(1991)，1067-1072)。

表达载体已经在文献中广泛描述。通常，它们不仅包含选择标记基因和确保在所选宿主中复制的复制起点，而且包含细菌或病毒启动子，并且在大多数情况下包含用于转录的终止信号。在启动子和终止信号之间通常存在至少一个能够插入编码DNA序列的限制性位点或多接头。天然控制相应基因转录的DNA序列，如果它在所选宿主生物体中具有活性，则可用作启动子序列。然而，该序列也可以换成其它启动子序列。可以使用确保基因组成型表达的启动子和允许有意控制基因表达的诱导型启动子。具有这些性质的细菌和病毒启动子序列在文献中有详细描述。在文献中充分描述了在微生物(例如大肠杆菌、酿酒酵母)中用于表达的调节序列。允许下游序列的特别高表达的启动子是例如T7启动子(Studier等人，Methods in Enzymology 185(1990)，60-89)，lacUV5、trp、trp-lacUV5(DeBoer等人，in Rodriguez和Chamberlin(Eds)，Promoters，Structure and Function；Praeger，New York，(1982)，462-481；DeBoer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)，21-25)，lp1、rac(Boros等人，Gene 42(1986)，97-100)。诱导型启动子优选用于多肽的合成。这些启动子通常导致比组成型启动子更高的多肽产量。为了获得多肽的最佳量，通常使用两阶段方法。首先，将宿主细胞在最佳条件下培养至相对高的细胞密度。在第二步中，根据所用启动子的类型，诱导转录。在这方面，tac启动子是特别合适的，其可以被乳糖或IPTG(＝异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)诱导(deBoer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80(1983),21-25)。用于转录的终止信号也描述在文献中。

用如上所述的多核苷酸或载体转化宿主细胞可以通过标准方法进行，例如Sambrook and Russell(2001),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,CSH Press,Cold Spring Harbor,NY,USA；Methods in Yeast Genetics,A Laboratory CourseManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1990。宿主细胞培养在营养培养基中，所述培养基将满足所使用的特定宿主细胞的要求，特别是在pH值、温度、盐浓度、通气、抗生素、维生素、微量元素等方面。

本发明还涉及

-硫酯酶(EC 3.1.2)或表达硫酯酶(EC 3.1.2)的生物；或

-CoA-转移酶(EC 2.8.3)或表达CoA-转移酶(EC 2.8.3)的生物

用于将3-甲基巴豆酰基-CoA酶促转化为3-甲基巴豆酸的用途。

关于所述的硫酯酶和CoA-转移酶及微生物，适用上文就本发明方法所作出的描述。

本发明还涉及如下组合用于将3-甲基巴豆酰基-CoA转化为3-甲基巴豆酸的用途，所述组合包含：

-磷酸丁酰基转移酶(EC 2.3.1.19)和/或磷酸乙酰基转移酶(EC 2.3.1.8)；和

-磷酸转移酶(EC 2.7.2)，优选丁酸激酶(EC 2.7.2.7)、支链脂肪酸激酶(EC2.7.2.14)、丙酸激酶(EC 2.7.2.15)和/或乙酸激酶(EC 2.7.2.1)。

此外，本发明涉及如下组合用于将3-甲基巴豆酰基-CoA转化为3-羟基-3-甲基丁酸的用途，所述组合包含：

-硫酯酶(EC 3.1.2)和/或CoA-转移酶(EC 2.8.3)；和

-水裂合酶(EC 4.2.1)；

或包含

-磷酸丁酰基转移酶(EC 2.3.1.19)和/或磷酸乙酰基转移酶(EC 2.3.1.8)；和

-磷酸转移酶(EC 2.7.2)，优选丁酸激酶(EC 2.7.2.7)、支链脂肪酸激酶(EC2.7.2.14)、丙酸激酶(EC 2.7.2.15)和/或乙酸激酶(EC 2.7.2.1)；和

-水裂合酶(EC 4.2.1)。

关于所述的硫酯酶和CoA-转移酶以及水合酶/脱水酶和微生物，适用上文就本发明方法所作出的阐述。

本发明还涉及如下组合用于将3-甲基巴豆酰基-CoA转化为3-羟基-3-甲基丁酸的用途，所述组合包含：

-表达硫酯酶(EC 3.1.2)和/或CoA-转移酶(EC 2.8.3)的生物；和

-表达水裂合酶(EC 4.2.1)的生物，

或包含

-表达磷酸丁酰基转移酶(EC 2.3.1.19)和/或磷酸乙酰基转移酶(EC 2.3.1.8)；和

磷酸转移酶(EC 2.7.2)，优选丁酸激酶(EC 2.7.2.7)、支链脂肪酸激酶(EC2.7.2.14)、丙酸激酶(EC 2.7.2.15)和/或乙酸激酶(EC 2.7.2.1)的生物；和

-表达水裂合酶(EC 4.2.1)的生物。

此外，本发明涉及生物用于将3-甲基巴豆酰基-CoA转化为3-羟基-3-甲基丁酸的用途，所述生物表达：

-硫酯酶(EC 3.1.2)和/或CoA-转移酶(EC 2.8.3)；和

-水裂合酶(EC 4.2.1)，

或所述生物表达：

-磷酸丁酰基转移酶(EC 2.3.1.19)和/或磷酸乙酰基转移酶(EC 2.3.1.8)；和

-磷酸转移酶(EC 2.7.2)，优选丁酸激酶(EC 2.7.2.7)、支链脂肪酸激酶(EC2.7.2.14)、丙酸激酶(EC 2.7.2.15)和/或乙酸激酶(EC 2.7.2.1)；和

-水裂合酶(EC 4.2.1)。

关于上述实施方案，对于硫酯酶和CoA-转移酶以及水合酶/脱水酶和微生物，同样适用于上文就本发明方法所作出的描述。

本发明还涉及如下组合用于将3-甲基巴豆酰基-CoA酶促转化为3-羟基-3-甲基丁酸的用途，所述组合包含：

(a)选自以下的酶：

(i)3-羟基丙酰基-CoA脱水酶(EC 4.2.1.116)；

(ii)3-羟基丁酰基-CoA脱水酶(EC 4.2.1.55)；

(iii)烯酰基-CoA水合酶(EC 4.2.1.17)；

(iv)3-羟基辛酰基-[酰基-载体-蛋白]脱水酶(EC 4.2.1.59)；

(v)巴豆酰基-[酰基-载体-蛋白]水合酶(EC 4.2.1.58)；

(vi)3-羟基癸酰基-[酰基-载体-蛋白]脱水酶(EC 4.2.1.60)；

(vii)3-羟基棕榈酰基-[酰基-载体-蛋白]脱水酶(EC 4.2.1.61)；

(viii)长链烯酰基-CoA水合酶(EC 4.2.1.74)；和

(ix)3-甲基戊烯二酰基-CoA水合酶(EC 4.2.1.18)

和

(b)磷酸丁酰基转移酶(EC2.3.1.19)和/或磷酸乙酰基转移酶(EC2.3.1.8)；

和

(c)磷酸转移酶(EC 2.7.2)。

本发明还涉及如下组合用于将3-甲基巴豆酰基-CoA转化为3-羟基-3-甲基丁酸的用途，所述组合包含：

-表达如上文(a)中所定义的酶的生物；和

-表达如上文(b)中所定义的酶的生物；和

-表达如上文(c)中所定义的酶的生物。

此外，本发明涉及生物，所述生物表达：

-如上文(a)中所定义的酶；和

-如上文(b)中所定义的酶，和

-如上文(c)中所定义的酶；

以及所述生物用于将3-甲基巴豆酰基-CoA转化为3-羟基-3-甲基丁酸的用途。

关于上述实施方案，对于其中提及的酶和微生物，同样适用于上文就本发明方法所作出的描述。

此外，描述了一种用于生产3-羟基-3-甲基丁酸的方法，该方法包括步骤：将3-甲基巴豆酰基-CoA酶促转化为3-甲基巴豆酸；和将由此产生的3-甲基巴豆酸进一步酶促转化为3-羟基-3-甲基丁酸。3-甲基巴豆酰基-CoA到3-甲基巴豆酸的转化可以通过直接转化来实现，其优选利用属于硫酯水解酶家族(也称为硫酯酶(EC 3.1.2))的酶或属于CoA-转移酶家族(EC 2.8.3)的酶。或者，3-甲基巴豆酰基-CoA到3-甲基巴豆酸的转化可以通过以下转化实现，该转化首先包括3-甲基巴豆酰基-CoA到3-甲基巴豆酰基-磷酸的转化，和随后的3-甲基巴豆酰基-磷酸到3-甲基巴豆酸的转化。3-甲基巴豆酸到3-羟基-3-甲基丁酸的转化优选使用属于水裂合酶(EC 4.2.1)家族的酶，特别是使用乌头酸水合酶(EC 4.2.1.3)、或马来酸水合酶(EC 4.2.1.31)或2-甲基柠檬酸脱水酶(EC 4.2.1.79)。

因此，本发明特别涉及以下项：

1.一种将3-甲基巴豆酰基-CoA转化为3-羟基-3-甲基丁酸的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)将3-甲基巴豆酰基-CoA酶促转化为3-甲基巴豆酸；和

(b)将由此产生的3-甲基巴豆酸进一步酶促转化为3-羟基-3-甲基丁酸。

2.根据项1所述的方法，其中根据步骤(a)的3-甲基巴豆酰基-CoA到3-甲基巴豆酸的酶促转化通过使用

(i)硫酯水解酶(EC 3.1.2)；或

(ii)CoA-转移酶(EC 2.8.3)实现。

3.根据项2所述的方法，其中所述硫酯酶(EC 3.1.2)选自：

-乙酰基-CoA水解酶(EC 3.1.2.1)；

-棕榈酰基-CoA水解酶(EC 3.1.2.2)；

-3-羟基异丁酰基-CoA水解酶(EC 3.1.2.4)；

-油酰基-[酰基-载体-蛋白]水解酶(EC 3.1.2.14)；

-ADP-依赖性短链酰基-CoA水解酶(EC 3.1.2.18)；

-ADP-依赖性中链酰基-CoA水解酶(EC 3.1.2.19)；和

-酰基-CoA水解酶(EC 3.1.2.20)。

4.根据项2或3所述的方法，其中所述CoA-转移酶(EC 2.8.3)选自：

-乙酸CoA-转移酶(EC 2.8.3.8)；和

-丁酸-乙酰乙酸CoA-转移酶(EC 2.8.3.9)。

5.根据项1所述的方法，其中根据步骤(a)的3-甲基巴豆酰基-CoA到3-甲基巴豆酸的酶促转化，通过首先将3-甲基巴豆酰基-CoA转化为3-甲基巴豆酰基-磷酸，然后将由此产生的3-甲基巴豆酰基-磷酸转化为3-甲基巴豆酸来实现。

6.根据项5所述的方法，其中3-甲基巴豆酰基-CoA到3-甲基巴豆酰基-磷酸的转化通过利用磷酸丁酰基转移酶(EC 2.3.1.19)或磷酸乙酰基转移酶(EC 2.3.1.8)实现。

7.根据项5或6所述的方法，其中3-甲基巴豆酰基-磷酸到3-甲基巴豆酸的转化通过利用磷酸转移酶(EC 2.7.2)实现。

8.根据项7所述的方法，其中所述磷酸转移酶(EC 2.7.2)选自丁酸激酶(EC2.7.2.7)、支链脂肪酸激酶(EC 2.7.2.14)、丙酸激酶(EC 2.7.2.15)和乙酸激酶(EC2.7.2.1)。

9.根据项1至8中任一项所述的方法，其中根据步骤(b)的3-甲基巴豆酸到3-羟基-3-甲基丁酸的酶促转化通过使用水裂合酶(EC 4.2.1)实现。

10.根据项9所述的方法，其中所述水合酶/脱水酶(EC 4.2.1)选自：

-乌头酸水合酶(EC 4.2.1.3)；

-马来酸水合酶(EC 4.2.1.31)；和

-2-甲基柠檬酸脱水酶(EC 4.2.1.79)。

11.-硫酯水解酶(EC 3.1.2)或表达硫酯水解酶(EC 3.1.2)的生物；或

-CoA-转移酶(EC 2.8.3)或表达CoA-转移酶(EC 2.8.3)的生物

用于将3-甲基巴豆酰基-CoA酶促转化为3-甲基巴豆酸的用途；

或，包含

-磷酸丁酰基转移酶(EC 2.3.1.19)和/或磷酸乙酰基转移酶(EC 2.3.1.8)；和

-磷酸转移酶(EC 2.7.2)

的组合用于将3-甲基巴豆酰基-CoA酶促转化为3-甲基巴豆酸的用途。

12.如下组合用于将3-甲基巴豆酰基-CoA转化为3-羟基-3-甲基丁酸的用途，其中所述组合包含

-硫酯水解酶(EC 3.1.2)和/或CoA-转移酶(EC 2.8.3)；和

-水合酶/脱水酶(EC 4.2.1)；

或，包含

-磷酸丁酰基转移酶(EC 2.3.1.19)和/或磷酸乙酰基转移酶(EC 2.3.1.8)；和

-磷酸转移酶(EC 2.7.2)；和

-水裂合酶(EC 4.2.1)。

13.如下组合用于将3-甲基巴豆酰基-CoA转化为3-羟基-3-甲基丁酸的用途，所述组合包含

-表达硫酯水解酶(EC 3.1.2)和/或CoA-转移酶(EC 2.8.3)的生物；和

-表达水裂合酶(EC 4.2.1)的生物，

或包含

-表达磷酸丁酰基转移酶(EC 2.3.1.19)和/或磷酸乙酰基转移酶(EC 2.3.1.8)；和

磷酸转移酶(EC 2.7.2)的生物；

和

-表达水裂合酶(EC 4.2.1)的生物。

14.生物用于将3-甲基巴豆酰基-CoA转化为3-羟基-3-甲基丁酸的用途，所述生物表达

-硫酯水解酶(EC 3.1.2)和/或CoA-转移酶(EC 2.8.3)；和

-水裂合酶(EC 4.2.1)，

或所述生物表达

-磷酸丁酰基转移酶(EC 2.3.1.19)和/或磷酸乙酰基转移酶(EC 2.3.1.8)；和

-磷酸转移酶(EC 2.7.2)；和

-水裂合酶。

15.根据项11至14中任一项所述的用途，其中所述硫酯水解酶(EC 3.1.2)选自：

-乙酰基-CoA水解酶(EC 3.1.2.1)；

-棕榈酰基-CoA水解酶(EC 3.1.2.2)；

-3-羟基异丁酰基-CoA水解酶(EC 3.1.2.4)；

-油酰基-[酰基-载体-蛋白]水解酶(EC 3.1.2.14)；

-ADP-依赖性短链酰基-CoA水解酶(EC 3.1.2.18)；

-ADP-依赖性中链酰基-CoA水解酶(EC 3.1.2.19)；和

-酰基-CoA水解酶(EC 3.1.2.20)。

16.根据项11至15中任一项所述的用途，其中所述CoA-转移酶(EC 2.8.3)选自：

-乙酸CoA-转移酶(EC 2.8.3.8)；和

-丁酸-乙酰乙酸CoA-转移酶(EC 2.8.3.9)。

17.项11至16中任一项的用途，其中所述磷酸转移酶(EC 2.7.2)选自丁酸激酶(EC2.7.2.7)、支链脂肪酸激酶(EC 2.7.2.14)、丙酸激酶(EC 2.7.2.15)和乙酸激酶(EC2.7.2.1)。

附图简述

图1示意性示出了由硫酯酶催化的3-甲基巴豆酰基-CoA到3-甲基巴豆酸的转化反应。

图2示意性示出了由CoA-转移酶催化的3-甲基巴豆酰基-CoA到3-甲基巴豆酸的转化反应。

图3示意性示出了3-甲基巴豆酸到3-羟基-3-甲基丁酸的转化反应。

图4示出了3-甲基戊烯二酰基-CoA经由脱羧反应到3-甲基巴豆酰基-CoA的转化。

图5示出了3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA到3-甲基戊烯二酰基-CoA的转化。

图6示出了乙酰基-CoA和乙酰乙酰基-CoA缩合成3-羟基-3-甲基戊烯二酰基-CoA。

图7示出了从乙酰基-CoA生产乙酰乙酰基-CoA的可能途径。

图8示出了3-甲基巴豆酰基-CoA到3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA的转化。

图9示出了通过硫酯酶催化的3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA到3-羟基-3-甲基丁酸的转化。

图10示出了通过CoA-转移酶催化的3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA到3-羟基-3-甲基丁酸的转化。

图11示出了3-甲基巴豆酰基-CoA到3-甲基巴豆酰基-磷酸的转化，和随后的3-甲基巴豆酰基-磷酸到3-甲基巴豆酸的转化。

图12示出了几种研究的酶用于3-甲基巴豆酰基-CoA水合的活性，其中通过记录在263nm处3-甲基巴豆酰基-CoA的吸光度降低来监测所述活性(实施例2)。

图13示出了通过3-甲基巴豆酰基-CoA的水合而形成3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA酸(3-羟基异戊酰基-CoA)的时间过程，其中所述水合由来自勤奋生金球菌的3-羟基丙酰基-CoA脱水酶和来自炭疽芽孢杆菌的烯酰基-CoA水合酶催化(实施例3)。

图14示出了，如实施例4中描述的，用来自勤奋生金球菌的3-羟基丙酰基-CoA脱水酶酶促水合3-甲基巴豆酰基-CoA所获得的色谱图。该试验用4mM 3-甲基巴豆酰基-CoA进行并孵育16分钟。

图15示出了，在不同底物浓度下，作为时间的函数，3-羟基异戊酰基-CoA从3-甲基巴豆酰基-CoA的形成。该转化由来自勤奋生金球菌的3-羟基丙酰基-CoA脱水酶催化(实施例4)。

图16在A部分中示出了不同酶将3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA转化为3-甲基戊烯二酰基-CoA的百分比，其中所述酶在部分B中给出(实施例5)。

图17示出了，如实施例6中描述的，从乙酰基-CoA产生异丁烯的示例性生物化学途径的示意图。

图18示出了由来自枯草芽孢杆菌的磷酸丁酰基转移酶催化的、从3-羟基异戊酰基-CoA(3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA)和磷酸产生的3-羟基异戊酰基磷酸(3-羟基-3-甲基丁酰基磷酸)的质谱(实施例9)。

图19示出了，针对

a)实施例10中的酶学试验A；和

b)实施例10中的无酶试验H，

获得的典型HPLC-色谱图的叠加。

在HPLC-色谱图中，分析了3-羟基异戊酰基-CoA(3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA)和Co-SH。

在磷酸丁酰基转移酶与丁酸激酶组合的酶学试验中，观察到3-羟基异戊酰基-CoA(3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA)的消耗，同时产生CoA-SH。

图20示出了，针对

a)酶学试验(试验A，实施例10)

b)无酶试验(试验H，实施例10)，

获得的典型HPLC-色谱图的叠加。

在HPLC-色谱中，分析了3-羟基异戊酸、ADP和ATP。

在磷酸丁酰基转移酶与丁酸激酶组合的酶学试验中，观察到ADP消耗，同时产生ATP。

图21示出了在酶学试验中3-羟基异戊酸(3-羟基-3-甲基丁酸)和ATP的产生结果，其中来自枯草芽孢杆菌的磷酸丁酰基转移酶与不同的丁酸激酶组合。此外，示出了如实施例10中所示的不同对照试验的结果。

图22示出了在酶学试验中3-羟基异戊酸(3-羟基-3-甲基丁酸)和ATP的产生结果，其中来自粪肠球菌的磷酸丁酰基转移酶与不同的丁酸激酶组合。此外，示出了如实施例11中所示的不同对照试验的结果。

图23示出了使用来自恶臭假单胞菌的酰基-CoA硫酯酶II进行酶学试验所获得的典型HPLC-色谱图的实例。

图24a示出了，针对

a)酶学试验(试验A，实施例13)

b)无酶试验(试验H，实施例13)

获得的典型HPLC-色谱图(分析3-甲基巴豆酰基-CoA，3-甲基巴豆酸和CoA-SH)的叠加。

在磷酸丁酰基转移酶与丁酸激酶组合的酶学试验中，观察到3-甲基巴豆酰基-CoA的消耗，同时产生CoA-SH和3-甲基巴豆酸。

图24b示出了，针对

a)酶学试验(试验A，实施例13)

b)无酶试验(试验H，实施例13)，

获得的典型HPLC-色谱(分析ADP和ATP)的叠加。

在磷酸丁酰基转移酶与丁酸激酶组合的酶学试验中，观察到ADP的消耗，同时产生ATP。

图25示出了，在包含来自枯草芽孢杆菌的磷酸丁酰基转移酶和不同丁酸激酶的组合的酶学试验中，以及在不同的对照试验中，3-甲基巴豆酸和ATP的产生结果。

图26示出了，在包含来自粪肠球菌的磷酸丁酰基转移酶和不同丁酸激酶的组合的酶学试验中，以及在不同的对照试验中，3-甲基巴豆酸和ATP的产生结果。

在本说明书中，引用了许多文献，包括专利申请。这些文献的公开，虽然不被认为与本发明的可专利性相关，但通过引用以其整体并入本文。更具体地，所有参考文献通过引用并入，其程度如同每个单独文献被具体地和单独地指明通过引用并入。

现在将通过参考以下实施例来描述本发明，这些实施例仅仅是举例说明性的，而不应被解释为对本发明范围的限制。

实施例

实施例1：酶的克隆、表达和纯化

基因合成、克隆和重组蛋白的表达

从原核和真核生物的基因组推断的研究酶的序列，通过串联寡核苷酸而产生，以适合大肠杆菌的密码子使用(基因由

商业合成)。在甲硫氨酸起始密码子后插入6个组氨酸密码子以提供用于纯化的亲和标签。将如此合成的基因克隆到pET-25b(+)表达载体(由

构建的载体)中。

根据标准热休克步骤，用这些载体转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞(Novagen)。使用ZYM-5052自诱导培养基(Studier FW，Prot.Exp.Pur.41，(2005)，207-234)，在30℃下振荡(160rpm)培养转化的细胞6小时，并在28℃或18℃过夜继续蛋白表达(约16小时)。通过在4℃、10,000rpm离心20分钟收集细胞，并将沉淀储存在-80℃。

蛋白纯化和浓缩

将来自200ml培养细胞的沉淀在冰上解冻，并重悬于5ml含有500mM NaCl、10mMMgCl₂、10mM咪唑和1mM DTT的50mM HEPES缓冲液pH 7.0中。加入20微升的lysonase(Novagen)。将细胞在室温下孵育10分钟，然后放回冰上20分钟。通过超声处理2×30秒，完成细胞裂解。然后通过在4℃、4000rpm离心40分钟，澄清细菌提取物。将澄清的细菌裂解物加载到PROTINO-2000Ni-TED柱(Macherey-Nagel)上，该柱允许吸附6-His标记的蛋白质。洗涤柱子，用6ml含有300mM NaCl和250mM咪唑的50mM HEPES缓冲液pH7.0，洗脱目的酶。然后将洗脱液浓缩，在Amicon Ultra-4 10kDa过滤单元(Millipore)上脱盐，将酶重悬于含有100mM NaCl的50mM HEPES pH7.0中。由此纯化的蛋白质的纯度如通过SDS-PAGE分析评估的从70％至90％变化。通过在NanoDrop 1000分光光度计(Thermo Scientific)上直接UV280nm测量、或通过Bradford试验仪(BioRad)，测定蛋白质浓度。

实施例2：使用3-甲基巴豆酰基-CoA作为底物筛选一批水裂合酶用于生产3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA(3-羟基异戊酰基-CoA)

合成编码酰基-CoA脱水酶和烯酰基-CoA水合酶的基因，并根据实施例1中所述的步骤进一步产生相应的酶。在水中制备3-甲基巴豆酰基-CoA(Sigma-Aldrich)的储备溶液。

标准反应混合物含有：

50mM HEPES pH 7.0

0.25mM 3-甲基巴豆酰基-CoA

5mM MgCl₂

5mM NaCl

0.002mg/ml纯化的酶

在30℃下在96孔板中进行试验，总体积为0.12ml。

通过加入3-甲基巴豆酰基-CoA，开始每个反应。然后在SpectraMax Plus 384UV/Vis微板读数器(Molecular Devices)上，连续监测样品在263nm的3-甲基巴豆酰基-CoA吸光度的降低(Fukui T等人，J.Bacteriol.180(1998),667-673)。

几种酶显示了以3-甲基巴豆酰基-CoA作为底物的活性(图12)。对于没有酶的对照试验，没有观察到263nm处吸光度的改变。

实施例3：3-甲基巴豆酰基-CoA的酶促水合产物的基于HPLC的分析

酶学试验在0.2ml的总反应体积中进行。

标准反应混合物含有：

50mM HEPES pH 7.0

4mM 3-甲基巴豆酰基-CoA

20mM MgCl₂

20mM NaCl

0.02mg/ml来自勤奋生金球菌的纯化的3-羟基丙酰基-CoA脱水酶(Uniprot登录号：A4YI89)或来自炭疽芽孢杆菌的纯化的烯酰基-CoA水合酶(Uniprot登录号：Q81YG6)。

试验在30℃下振荡孵育0、5和30分钟。

在孵育期后，通过加入0.1ml乙腈来终止反应。使用基于HPLC的方法，定量3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA(3-羟基异戊酰基-CoA)的量。

将样品离心，通过0.22μm过滤器过滤，将澄清的上清液转移到干净的小瓶中用于进一步分析。

使用配备有柱加热模块和UV检测器(260nm)的1260Inifinity LC系统(Agilent)，进行HPLC分析。在Zorbax SB-Aq柱(250×4.6mm，5μm粒径，柱温30℃)上，以1.5ml/min的流动相流速，分离5μl样品。使用混合的A(含有8.4mM硫酸的H₂O)和B(乙腈)溶液以线性梯度(0％B在初始时间0分钟→70％B在8分钟)进行分离。

3-羟基异戊酰基-CoA由专门从事定制合成的公司(Syntheval，France)按要求从3-羟基异戊酸化学合成。

在这些条件下3-羟基异戊酰基-CoA和3-甲基巴豆酰基-CoA的保留时间分别为4.40和5.25分钟。

在酶学试验中观察到3-羟基异戊酰基-CoA的显著产生(图13)。在无酶对照试验中没有观察到3-羟基异戊酰基-CoA的产生。

因此，酰基-CoA脱水酶和烯酰基-CoA水合酶能够有效催化3-甲基巴豆酰基-CoA到3-羟基异戊酰基-CoA的水合。

实施例4：3-甲基巴豆酰基-CoA的水合反应的动力学研究

酶学试验在0.2ml的总反应体积中进行

标准反应混合物含有：

50mM HEPES pH 7.0

0-4mM 3-甲基巴豆酰基-CoA

20mM MgCl₂

20mM NaCl

0.01mg/ml来自勤奋生金球菌的3-羟基丙酰-CoA脱水酶。

将试验在30℃下振荡孵育0、2、4、8、16分钟，并通过加入100μl乙腈来终止反应。根据实施例3中描述的基于HPLC的方法，定量3-羟基异戊酰基-CoA的量。

图14示出了在孵育16分钟后，使用4mM底物浓度，在酶学试验中获得的典型色谱图的实例。

在图15中显示了，在不同底物浓度下，作为时间的函数，描绘的3-羟基异戊酰基-CoA的形成。发现来自勤奋生金球菌的3-羟基丙酰基-CoA脱水酶对于3-甲基巴豆酰基-CoA具有0.3mM的K_M和10s^-1的K_cat。

实施例5：酶催化的3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA脱水成3-甲基戊烯二酰基-CoA

合成编码酰基-CoA脱水酶和烯酰基-CoA水合酶的基因，并根据实施例1所述的方案进一步生产相应的酶。在水中制备3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA的储备溶液(Sigma-Aldrich)。酶学试验在0.2ml的总反应体积中进行。

标准反应混合物含有：

50mM HEPES pH 7.0

4mM 3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA

20mM MgCl₂

20mM NaCl

0.01mg/ml纯化的酶

在16分钟的孵育期后，通过加入0.1ml的乙腈来终止试验。

将样品离心，通过0.22μm过滤器过滤，将澄清的上清液转移到干净的小瓶中用于HPLC分析。根据实施例3中所述的方案，进行HPLC分析。在这些条件下3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA的保留时间为4.20分钟。

通过测量底物的消耗来跟踪反应进程。

几种酰基-CoA脱水酶和烯酰基-CoA水合酶显示能够催化3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA脱水成3-甲基戊烯二酰基-CoA(图16)。

实施例6：用于从乙酰基-CoA生产3-羟基异戊酸的微生物

该实施例显示，通过表达几种外源基因的重组大肠杆菌生产3-羟基异戊酸。

与大多数生物一样，大肠杆菌将葡萄糖转化为乙酰基-CoA。在该研究中，根据途径1(图17)，用于将乙酰基-CoA转化为3-羟基-3-甲基丁酸(又称，3-羟基异戊酸)的酶，总结在表1中。

表1

在大肠杆菌中表达3-羟基异戊酸生物合成途径

使用含有修饰的多克隆位点的修饰版本的pUC18(New England Biolabs)作为表达载体(pUC18MCS)(WO 2013/007786)。将终止子序列插入pUC18MCS中HindIII和NarI限制性位点之间，所得载体称为pGBE1992。

对相应的基因进行密码子优化以在大肠杆菌中表达，并通过

(LifeTechnologies)合成。

使用引物3211和3212，从pMK-RQ-thl_adc载体(由GeneArt提供的主质粒)，PCR扩增乙酰基-CoA乙酰基转移酶(CA_C2873)基因。在PCR产物的5'端引入PacI限制性位点。在PCR产物的3'端引入NotI限制性位点和ClaI限制性位点。将所得的1.6kbp PCR产物和pGBE1992用PacI和NotI限制性酶消化，然后连接在一起，得到pGBE2101质粒。通过测序验证重组pGBE2101质粒。

使用引物3327和3328，从pMK-T-ACoADH_MX载体(由GeneArt提供的主质粒)，PCR扩增3-羟基丁酰基-CoA脱水酶(MXAN_3757)基因。通过PCR插入EcoRI限制性位点在5'端和KpnI限制性位点在3'端。扩增的基因包含全长MXAN_3757编码序列，该编码序列在甲硫氨酸起始密码子后带有6个组氨酸密码子以提供用于纯化的亲和标签。将得到的0.8kbp PCR产物用限制性酶消化，并连接到事先用EcoRI和KpnI限制性内切酶消化的pGBE2101质粒中。所得质粒称为pGBE2326，并通过测序验证。

用限制性酶ClaI和NotI消化质粒pMK-RQ-AibA_AibB(GeneArt提供的主质粒)以产生1.6Kbp的产物。将含有MXAN_4264和MXAN_4265基因的1.6kbp限制性片段连接到切割的pGBE2326质粒中。通过测序验证所得的重组质粒pGBE2360。

使用引物3329和3330，从pET-25b(+)-A_129(由GeneArt提供的主质粒)，PCR扩增编码来自粟酒裂殖酵母的羟甲基戊二酰基-CoA合酶的Hcs1基因。由此通过PCR在5'端引入NotI限制性位点和在3'端引入HindIII限制性位点。扩增的基因包含全长Hcs1编码序列，该序列在甲硫氨酸起始密码子后带有6个组氨酸密码子以提供用于纯化的亲和标签。得到的1.4kbp PCR产物用NotI和HindIII限制性酶消化，并与消化的pGBE2360质粒连接。通过测序验证所得质粒pGBE2396。

表2

培养基和烧瓶发酵条件

菌株MG1655大肠杆菌制成电感受态。然后用表达载体pGBE2396转化MG1655电感受态细胞。还转化空质粒pUC18以产生在试验中用作阴性对照的菌株。

然后将转化的细胞涂布在提供有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上。将板在30℃过夜孵育。使用分离的菌落接种补充有氨苄青霉素的LB培养基，随后在30℃下过夜孵育。将1ml该过夜培养物用于接种300ml的ZYM-5052自诱导培养基(Studier FW，Prot.Exp.Pur.41，(2005)，207-234)。将该培养物在30℃和160rpm振荡下生长20小时。

取出对应于OD₆₀₀ 30的一定体积的培养物并离心。将沉淀重悬于30ml MS培养基(Richaud C,Mengin-Leucreulx D.,Pochet S.,Johnson EJ.,Cohen GN.and Marlière P,The Journal of Biological Chemistry,268,(1993),26827-26835)，该培养基含有葡萄糖(45g/L)和MgSO4(1mM)。

然后将培养物在160ml瓶中孵育，用螺旋盖密封，在30℃振荡3天。使用30％NH ₄OH将培养物的pH值调节至8.5，每天两次。

在孵育结束时，取出1ml培养基并在4℃、10,000rpm离心5分钟。将上清液通过0.22μm过滤器过滤并用等体积的H₂O稀释。然后分析3-羟基异戊酸的产生。

3-羟基异戊酸生产的分析

使用基于HPLC的方法，测量所产生的3-羟基异戊酸的量。使用配有柱加热模块和折射计的1260Inifinity LC系统Agilent，进行HPLC分析。使用如下串联连接的3个柱，分离10μl样品：

1.Hi-Plex保护柱(100×7.7mm，8μm粒径)(Agilent)

2.Hi-Plex柱(100×7.7mm，8μm粒径)(Agilent)

3.Zorbax SB-Aq柱(250×4.6mm，5μm粒径，柱温度65℃)(Agilent)。

流动相由硫酸水溶液(1mM)组成，流动相流速为1.5ml/min。使用商业3-羟基异戊酸(TCI)作为参考。在这些条件下3-羟基异戊酸的保留时间为7.7分钟。

在这些摇瓶实验中通过工程化大肠杆菌产生约2.2mM 3-羟基异戊酸，所述工程化大肠杆菌含有3-羟基异戊酸生物合成途径的基因。用含有空载体的对照菌株，没有观察到3-羟基异戊酸的产生。

生物反应器发酵条件

菌株大肠杆菌MG1655ΔagpΔaphA制成电感受态。然后用表达载体pGBE2396转化电感受态细胞。

然后将转化的细胞涂布在LB平板上，根据“培养基和烧瓶发酵条件”部分中所述的方案，制备预培养物。

在具有pH和温度控制的1L生物反应器(Multifors 2，Infors HT)中进行发酵。使用LB培养基中的预培养细胞，以0.5的初始光密度(OD₆₀₀)接种含有MgSO4(1mM)、酵母提取物(2g/L)和氨苄青霉素(100μg/ml)的900ml MS液体培养基。使用进料泵，将发酵运行中的葡萄糖浓度维持在0g/L和10g/L之间。温度和pH保持恒定(分别为30℃和6.5)。将溶解氧维持在20％(在空气中获得100％)。在发酵期间取等份试样的培养基，并在4℃、10000rpm离心5分钟。然后将上清液通过0.22μm过滤器过滤并用等体积的H₂O稀释。根据上述基于HPLC的方案，测量产生的3-羟基异戊酸的量。

发酵143小时后，3-羟基异戊酸浓度达到12mM。

实施例7：3-羟基异戊酰基-CoA到3-羟基异戊酸的酶催化水解

合成编码来自恶臭假单胞菌的酰基-CoA硫酯酶II的基因，并根据实施例1中所述的步骤进一步生产相应的酶。

载体pCAN含有编码来自大肠杆菌的酰基-CoA硫酯水解酶YciA和酰基CoA-硫酯酶2(TesB)的基因，该载体购自NAIST(Nara Institute of Science and Technology，Japan，ASKA collection)。提供的载体在甲硫氨酸起始密码子后含有6个组氨酸密码子。根据实施例1中所述的步骤进一步生产相应的酶。

酶学试验在0.2ml的总反应体积中进行

标准反应混合物含有：

50mM HEPES pH 7.0

10mM 3-羟基异戊酰基-CoA

20mM MgCl₂

20mM NaCl

1mg/ml纯化的硫酯酶

试验在30℃下振荡孵育30分钟，通过加入0.1ml乙腈终止反应。根据实施例3中描述的基于HPLC的方法，定量3-羟基异戊酰基-CoA的量。

在这些条件下，3-羟基异戊酰基-CoA保留时间为4.40分钟，辅酶A(CoA)保留时间为3.96分钟。观察到3-羟基异戊酰基-CoA峰显著降低，同时观察到增加的辅酶A峰。

另外，根据实施例6中所述的步骤，分析3-羟基异戊酸的生产。

所有研究的硫酯酶均催化了3-羟基异戊酰基-CoA的水解，形成3-羟基异戊酸(表3)。

在没有酶的对照试验中没有观察到3-羟基异戊酸信号。

表3

基因名称	生物	Uniprot登陆号	转化,％
				yciA	大肠杆菌	P0A8Z0	25
tesB	大肠杆菌	P0AGG2	52
				tesB	恶臭假单胞菌	Q88DR1	58

实施例8：重组的磷酸丁酰基转移酶和丁酸激酶的克隆和过表达

重组蛋白的基因合成、克隆和表达

来自枯草芽孢杆菌(菌株168)和粪肠球菌MTUP9的磷酸丁酰基转移酶基因的序列(分别为Uniprot登录号：P54530和A0A038BNC2)和来自干酪乳杆菌W56和地芽孢杆菌GHH01的丁酸激酶(分别为Uniprot登录号：K0N529和L8A0E1)，通过寡核苷酸连接而产生，以适合大肠杆菌的密码子使用(基因由

商业合成)。相应蛋白质的表达按照实施例1中所述的方法进行。

通过在4℃、10.000rpm离心20分钟收集细胞，并将沉淀储存在-80℃。

蛋白纯化和浓缩

将来自200ml培养细胞的沉淀在冰上解冻，并重悬于5ml含有100mM NaCl、10mMMgCl₂、10mM咪唑和1mM DTT的50mM磷酸钾缓冲液pH7.5中。加入20微升的lysonase(Novagen)。将细胞在室温下孵育10分钟，然后放回冰上20分钟。通过超声处理2×30秒,完成细胞裂解。然后通过在4℃、4000rpm离心40分钟，使细菌提取物澄清。将澄清的细菌裂解物加载到PROTINO-2000Ni-TED柱(Macherey-Nagel)上，该柱允许吸附6-His标签蛋白。洗涤柱，用6ml含有100mM NaCl和250mM咪唑的50mM磷酸钾缓冲液pH7.5洗脱目的酶。然后将洗脱液浓缩，在Amicon Ultra-4 10kDa过滤单元(Millipore)上脱盐，将酶重悬于含有100mMNaCl的50mM磷酸钾缓冲液pH7.5中。由此纯化的蛋白质的纯度如通过SDS-PAGE分析评估的，从70％至90％变化。在NanoDrop 1000分光光度计(Thermo Scientific)上通过直接UV280nm测量，或通过Bradford试验(BioRad)，测定了蛋白质浓度。

实施例9：由来自枯草芽孢杆菌的磷酸丁酰基转移酶催化从3-羟基异戊酰基-CoA和磷酸形成3-羟基异戊酰基磷酸

研究的酶促反应在以下条件下进行：

50mM Tris-HCl pH7.5

10mM MgCl₂

10mM NaCl

10mM 3-羟基异戊酰基-CoA(3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA)

将来自枯草芽孢杆菌的纯化的磷酸丁酰基转移酶重悬于5mM磷酸钾pH7.5中。

平行进行不含酶的对照试验。

通过向20μl反应混合物中加入20μl酶制剂，启动酶学试验。通过质谱(MS)分析3-羟基异戊酰基磷酸(3-羟基-3-甲基丁酰基磷酸)的形成。通过环注射将5μl的试验液注入质谱仪。

使用Dionex Ultimate色谱系统(Thermo Fisher Scientific)，以100μL/min的流速，进行流动注射分析，流动相由含10mM甲酸铵pH 9.45和乙腈75:25v/v的H₂O组成。用配备有电喷雾电离源(负离子化模式，分辨率为70000m/Δm，FWHM在m/z 200)的Q-exactive分光计(Thermo Fisher Scientific)进行检测。非共振诱导的解离实验——高能C阱裂解(HCD)——在10％的标化碰撞能量下获取。使用Xcalibur版本3.0(Thermo FisherScientific)的Qualbrowser模块，手动检查原始数据。

在酶学试验中观察到在m/z 197.0213处的新离子形成，对应于C₅H₁₀O₆P^-(图18)。

使用MS/MS分析进一步研究了该新形成的离子(m/z 197.0213)的结构解析和完全归属。在MS/MS实验下产生m/z值为96.968的片段离子，对应于H₂PO₄ ^-物质。因此，通过MS技术证明酶催化试验中3-羟基异戊酰基磷酸的产生。

实施例10：通过来自枯草芽孢杆菌的磷酸丁酰基转移酶和来自干酪乳杆菌或地芽孢杆菌的丁酸激酶的组合作用，催化3-羟基异戊酰基-CoA和ADP转化为3-羟基异戊酸和ATP。

酶学试验在0.2ml的总反应体积中进行。

标准反应混合物含有：

50mM磷酸钾缓冲液pH7.5

4mM 3-羟基异戊酰基-CoA

4mM ADP

10mM MgCl₂

10mM NaCl

0.2mg/ml来自枯草芽孢杆菌的纯化的磷酸丁酰基转移酶

0.2mg/ml来自干酪乳杆菌或地芽孢杆菌的纯化的丁酸激酶

平行进行一系列对照(试验C-H；表4)。

表4

然后将试验在30℃下振荡孵育20分钟。

在孵育期后，通过在90℃下加热反应介质4分钟来终止反应。将样品离心，通过0.22μm过滤器过滤，将澄清的上清液转移到干净的小瓶中用于进一步分析。通过使用基于HPLC的方法跟踪ADP和3-羟基异戊酰基-CoA的消耗以及ATP、3-羟基异戊酸和游离辅酶A(CoA-SH)的形成。

ADP、ATP和3-羟基异戊酸的基于HPLC分析

使用配备柱加热模块和RI检测器的1260Inifinity LC系统(Agilent)进行HPLC分析。在Polaris C18-A柱(150×4.6mm，5μm粒径，柱温30℃)上以1.5ml/min的流动相流速，分离2μl样品。使用8.4mM硫酸在H₂O/MeOH混合溶液(99/1)(V/V)中，进行分离。在这些条件下，ADP、ATP和3-羟基异戊酸的保留时间分别为2.09分钟、2.26分钟和5.01分钟。

3-羟基异戊酰基-CoA和游离辅酶A(CoA-SH)的基于HPLC的分析

使用配备有柱加热模块和UV检测器(260nm)的1260Inifinity LC系统(Agilent)，进行HPLC分析。在Zorbax SB-Aq柱(250×4.6mm，5μm粒径，柱温30℃)上，以1.5ml/min的流动相流速，分离1μl样品。使用混合的A(含有8.4mM硫酸的H₂O)和B(乙腈)溶液以线性梯度(0％B在初始时间0分钟→70％B在8分钟)进行分离。在这些条件下，3-羟基异戊酰基-CoA和游离辅酶A(CoA-SH)的保留时间分别为4.53和4.10分钟。

对于酶学试验A和无酶试验H获得的典型色谱图显示在图19和20中。

HPLC分析的结果总结于图21中。

所获得的数据表明，在分别由两种酶催化的两步反应(试验A和B)中，3-羟基异戊酰基-CoA被转化为3-羟基异戊酸，同时伴随从ADP产生ATP。因此，该转化通过形成中间体3-羟基异戊酰基磷酸、然后通过转移该中间体的磷酸基团到ADP上释放ATP，而发生。

当单独使用磷酸丁酰基转移酶时(试验E)，观察到3-羟基异戊酸的显著产生，没有同时产生ATP。该产生是由通过磷酸丁酰基转移酶作用产生的3-羟基异戊酰基磷酸的自发水解导致的。

在不含ADP的对照试验(试验C和D)中，以相同的方式观察到3-羟基异戊酸的产生。这种产生也是由通过磷酸丁酰基转移酶作用产生的3-羟基异戊酰基磷酸的水解导致的。

实施例11：由来自粪肠球菌的磷酸丁酰基转移酶和来自干酪乳杆菌或地芽孢杆菌的丁酸激酶的组合作用，催化3-羟基异戊酰基-CoA和ADP转化为3-羟基异戊酸和ATP。

酶学试验在0.2ml的总反应体积中进行。

标准反应混合物含有：

50mM磷酸钾缓冲液pH7.5

4mM 3-羟基异戊酰基-CoA

4mM ADP

10mM MgCl₂

10mM NaCl

0.2mg/ml来自粪肠球菌的纯化的磷酸丁酰基转移酶

0.2mg/ml来自干酪乳杆菌或地芽孢杆菌的纯化的丁酸激酶。

平行进行一系列对照(试验C-H表5)。

表5

然后将试验在30℃下振荡孵育20分钟

在孵育期后，通过在90℃下加热反应介质4分钟来终止反应。将样品离心，通过0.22μm过滤器过滤，将澄清的上清液转移到干净的小瓶中用于进一步分析。根据实施例10中描述的方法，通过HPLC分析来跟踪ADP和3-羟基异戊酰基-CoA的消耗以及ATP和3-羟基异戊酸和游离辅酶A(CoA-SH)的形成。

HPLC分析的结果总结于图22中。

所获得的数据表明，在分别由两种酶催化的两步反应(试验A和B)中，3-羟基异戊酰基-CoA被转化为3-羟基异戊酸，同时伴随从ADP产生ATP。因此，该转化通过形成中间体3-羟基异戊酰基磷酸，然后通过转移该中间体的磷酸基团到ADP上释放ATP，而发生。

当单独使用磷酸丁酰基转移酶时，观察到3-羟基异戊酸的显著产生，没有同时产生ATP(试验E)。这种产生是由通过磷酸丁酰基转移酶的作用产生的3-羟基异戊酰基磷酸的水解所导致的。

在不含ADP的对照试验(试验C和D)中，以相同的方式观察到3-羟基异戊酸的产生。这种产生也是由于通过磷酸丁酰基转移酶的作用产生的3-羟基异戊酰基磷酸的水解导致的。

实施例12：3-甲基巴豆酰基-CoA到3-甲基巴豆酸和游离辅酶A的酶催化水解

根据如实施例1中所述的步骤，合成编码来自恶臭假单胞菌的酰基-CoA硫酯酶II的基因。

含有编码来自大肠杆菌的酰基-CoA硫酯酶2(TesB)的基因的载体pCA24N，购自NAIST(Nara Institute of Science and Technology，Japan，ASKA collection)。提供的此载体在甲硫氨酸起始密码子后包含6个组氨酸的密码子。

根据实施例1中所述的步骤，产生相应的酶。

酶学试验在0.2ml的总反应体积中进行。

标准反应混合物含有：

50mM HEPES pH 7.0

10mM 3-甲基巴豆酰基-CoA(Sigma-Aldrich)

20mM MgCl₂

20mM NaCl

1mg/ml纯化的重组硫酯酶。

进行对照试验，其中不加入酶或不加入底物。

将试验在30℃下振荡孵育30分钟，通过加入0.1ml乙腈终止反应，然后通过基于HPLC的步骤，分析样品。

基于HPLC分析3-甲基巴豆酰基-CoA的消耗和3-甲基巴豆酸和游离辅酶A(CoA-SH)的形成

使用装备有柱加热模块和UV检测器(210nm)的1260Inifinity LC系统(Agilent)，进行HPLC分析。在Zorbax SB-Aq柱(250×4.6mm，5μm粒径，柱温30℃)上，以1.5ml/min的流动相流速，分离5μl样品。使用混合的A(含有8.4mM硫酸的H₂O)和B(乙腈)溶液以线性梯度(0％B在初始时间0分钟→70％B在8分钟)进行分离。使用商业的3-甲基巴豆酰基-CoA、3-甲基巴豆酸(Sigma-Aldrich)和CoA-SH(Sigma-Aldrich)作为参考。在这些条件下，游离的辅酶A(CoA-SH)、3-甲基巴豆酰基-CoA和3-甲基巴豆酸的保留时间分别为4.05、5.38和5.83分钟。

在对照试验中没有观察到3-甲基巴豆酸信号。

研究的两种硫酯酶均催化了3-甲基巴豆酰基-CoA的水解，形成3-甲基巴豆酸。用来自恶臭假单胞菌的酰基-CoA硫酯酶II获得的色谱图的实例显示在图23中。

在酶学试验中观察到的3-甲基巴豆酸的产生程度示于表6中。

表6

实施例13：由来自枯草芽孢杆菌的磷酸丁酰基转移酶和来自干酪乳杆菌或地芽孢杆菌的丁酸激酶的组合作用，催化3-甲基巴豆酰基-CoA和ADP转化为3-甲基巴豆酸和ATP

在下文所述的试验中，使用以下酶：

表7

基因名称	生物	Uniprot登陆号
			Ptb(yqiS)	枯草芽孢杆菌	P54530
Buk	干酪乳杆菌	K0N529
			BuK	地芽孢杆菌.	L8A0E1

酶学试验在0.2ml的总反应体积中进行。

标准反应混合物含有：

50mM磷酸钾缓冲液pH7.5

4mM 3-甲基巴豆酰基-CoA

4mM ADP

10mM MgCl₂

10mM NaCl

0.2mg/ml来自枯草芽孢杆菌的纯化的磷酸丁酰基转移酶

0.2mg/ml来自干酪乳杆菌或地芽孢杆菌的纯化的丁酸激酶。

平行进行一系列对照(试验C-H，如表8所示)。

表8

然后将试验在30℃下振荡孵育20分钟。

在孵育期后，通过在90℃下加热反应介质4分钟来终止反应。将样品离心，通过0.22μm过滤器过滤，将澄清的上清液转移到干净的小瓶中用于进一步分析。通过使用基于HPLC的方法，跟踪ADP和3-甲基巴豆酰基-CoA的消耗以及ATP、3-甲基巴豆酸和游离辅酶A(CoA-SH)的形成。

基于HPLC分析ADP和ATP

使用装备有柱加热模块和RI检测器的1260Inifinity LC系统(Agilent)进行HPLC分析。在Polaris C18-A柱(150×4.6mm，5μm粒径，柱温30℃)上以1.5ml/min的流动相流速，分离2μl样品。根据实施例10中所述的方法，通过HPLC分析来跟踪ADP的消耗和ATP的形成。

基于HPLC分析3-甲基巴豆酰基-CoA、3-甲基巴豆酸和游离辅酶A(CoA-SH)

使用装备有柱加热模块和UV检测器(260nm)的1260Inifinity LC系统(Agilent)进行HPLC分析。在Zorbax SB-Aq柱(250×4.6mm，5μm粒径，柱温度30℃)上以1.5ml/min的流动相流速，分离1μl样品。

根据实施例12中描述的步骤，跟踪3-甲基巴豆酰基-CoA的消耗和3-甲基巴豆酸和游离辅酶A(CoA-SH)的形成。在这些条件下，3-甲基巴豆酰基-CoA、3-甲基巴豆酸和游离辅酶A(CoA-SH)的保留时间分别为5.38分钟、5.73分钟和4.07分钟。

对于酶学试验A和无酶试验H获得的典型色谱图显示在图24a和24b中。

HPLC分析的结果总结在图25中。

所获得的数据表明，在分别由两种酶催化的两步反应中(试验A和B)，3-甲基巴豆酰基-CoA被转化为3-甲基巴豆酸，同时伴随从ADP产生ATP。因此，通过形成中间体3-甲基巴豆酰基磷酸，然后通过转移该中间体的磷酸基团到ADP上释放ATP，而发生该转化。

当单独使用磷酸丁酰基转移酶时，观察到3-甲基巴豆酸的显著产生，没有同时产生ATP(试验E)。这种产生是由于通过磷酸丁酰基转移酶的作用产生的3-甲基巴豆酰基磷酸的自发水解所导致的。

在不含ADP的对照试验(试验C和D)中，以相同的方式观察到3-甲基巴豆酸的产生。这种产生也是由于通过磷酸丁酰基转移酶的作用产生的3-甲基巴豆酰基磷酸的水解所导致的。

实施例14：由来自粪肠球菌的磷酸丁酰基转移酶和来自干酪乳杆菌或地芽孢杆菌的丁酸激酶的组合作用，催化3-甲基巴豆酰基-CoA和ADP转化为3-甲基巴豆酸和ATP。

在下文所述的试验中，使用以下酶：

表9

基因名称	生物	Uniprot登陆号
			Ptb	粪肠球菌	A0A038BNC2
Buk	干酪乳杆菌	K0N529
			BuK	地芽孢杆菌.	L8A0E1

酶学试验在0.2ml的总反应体积中进行。

标准反应混合物含有：

50mM磷酸钾缓冲液pH7.5

4mM 3-甲基巴豆酰基-CoA

4mM ADP

10mM MgCl₂

10mM NaCl

0.2mg/ml来自粪肠球菌的纯化的磷酸丁酰基转移酶

0.2mg/ml来自干酪乳杆菌或地芽孢杆菌的纯化的丁酸激酶。

平行进行一系列对照(试验C-H表10)。

表10

然后将试验在30℃下振荡孵育20分钟。

在孵育期后，通过在90℃下加热反应介质4分钟来终止反应。将样品离心，通过0.22μm过滤器过滤，将澄清的上清液转移到干净的小瓶中用于进一步分析。根据实施例10和实施例12中描述的方法，通过HPLC分析，跟踪ADP和3-甲基巴豆酰基-CoA的消耗以及ATP和3-甲基巴豆酸和游离辅酶A(CoA-SH)的形成。

HPLC分析的结果总结在图26中。

所获得的数据表明，在分别由两种酶催化的两步反应(试验A和B)中，3-甲基巴豆酰基-CoA被转化为3-甲基巴豆酸，同时伴随从ADP产生ATP。因此，通过形成中间体3-甲基巴豆酰基磷酸，然后通过转移该中间体的磷酸基团到ADP上释放ATP，而发生该转化。

当单独使用磷酸丁酰基转移酶时，观察到3-甲基巴豆酸的显著产生，没有同时产生ATP(试验E)。这种产生是由于通过磷酸丁酰基转移酶的作用产生的3-甲基巴豆酰基磷酸的水解所导致的。

在不含ADP的对照试验(试验C和D)中，以相似的方式观察到3-甲基巴豆酸的产生。这种产生也是由于通过磷酸丁酰基转移酶的作用产生的3-甲基巴豆酰基磷酸的水解所导致的。

实施例15：筛选用于从3-甲基巴豆酸产生3-羟基-3-甲基丁酸的水裂合酶

水裂合酶——被分类为属于2-甲基柠檬酸脱水酶(EC 4.2.1.79)家族的酶，已经被描述为能够将3-甲基巴豆酸转化为3-羟基-3-甲基丁酸。针对来自类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)的马来酸水合酶，这已被描述,其能够使用3-甲基巴豆酸作为底物(van der Werf等人，Appl.Environ.Microbiol.59(1993),2823-2829)。

显示具有将3-甲基巴豆酸酶促转化为3-羟基-3-甲基丁酸的相应反应性的其它水裂合酶，可以通过筛选已知水裂合酶的该反应性而鉴定，如下所述：

可以从通常可获得的来源，获得编码属于水裂合酶家族(分类为EC 4.2.1.-)的酶的相应基因，优选编码属于乌头酸水合酶(EC 4.2.1.3)、马来酸水合酶(EC 4.2.1.31)或2-甲基柠檬酸脱水酶(EC 4.2.1.79)家族的酶的相应基因。可以合成候选酶的相应基因，并且可以根据实施例1中所述的方法产生酶。

一旦根据上述描述产生和纯化酶，可以测试各水裂合酶将3-甲基巴豆酸酶促转化为3-羟基-3-甲基丁酸的反应性。

对于该水合酶试验，使用含有MgCl₂、NaCl和0-100mM的3-甲基巴豆酸的反应混合物。进行对照试验，其中不加入酶或不加入底物。通过基于HPLC的方案，监测每个样品中3-甲基巴豆酸的消耗和/或3-羟基-3-甲基丁酸的形成。

如果与对照试验相比，在上述试验中3-羟基-3-甲基丁酸的形成显示增加，则水裂合酶将被鉴定为能够将3-甲基巴豆酸酶促转化为3-羟基-3-甲基丁酸的合适酶。

Claims (6)

1.一种将3-甲基巴豆酰基-CoA转化为3-羟基-3-甲基丁酸的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)通过第一酶将3-甲基巴豆酰基-CoA酶促转化为3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA，其中所述第一酶为3-羟基丙酰基-CoA脱水酶(EC 4.2.1.116)或烯酰基-CoA水合酶(EC4.2.1.17)；

(b)通过第二酶进一步将由此产生的3-羟基-3-甲基丁酰基-CoA酶促转化为3-羟基-3-甲基丁酰基-磷酸，其中所述第二酶为磷酸丁酰基转移酶(EC 2.3.1.19)；和

(c)通过第三酶将产生的3-羟基-3-甲基丁酰基-磷酸进一步酶促转化为3-羟基-3-甲基丁酸，其中所述第三酶为丁酸激酶(EC 2.7.2.7)。

2.组合用于将3-甲基巴豆酰基-CoA酶促转化为3-羟基-3-甲基丁酸的用途，所述组合由如下组成：

(a)选自以下的酶：

(i)3-羟基丙酰基-CoA脱水酶(EC 4.2.1.116)；或

(ii)烯酰基-CoA水合酶(EC 4.2.1.17)；

和

(b)磷酸丁酰基转移酶(EC2.3.1.19)；

和

(c)丁酸激酶(EC 2.7.2.7)。

3.组合用于将3-甲基巴豆酰基-CoA转化为3-羟基-3-甲基丁酸的用途，所述组合由如下组成：

-表达权利要求2(a)中所定义的酶的生物；和

-表达权利要求2(b)所定义的酶的生物，和

-表达权利要求2(c)所定义的酶的生物。

4.一种用于将3-甲基巴豆酰基-CoA转化为3-羟基-3-甲基丁酸的工程化微生物，其表达

-权利要求2(a)所定义的酶；和

-权利要求2(b)所定义的酶，和

-权利要求2(c)所定义的酶。

5.根据权利要求4所述的微生物用于将3-甲基巴豆酰基-CoA转化为3-羟基-3-甲基丁酸的用途。

6.权利要求1的方法，特征在于回收所述3-羟基-3-甲基丁酸。

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