JP2015519065A - 組み換え代謝微生物およびその使用 - Google Patents

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Abstract

テルペン類は多種多様な産業に使用される有効な商業産物である。テルペン類は石油化学供給源から産生されてもよく、テレピンなどのテルペン供給原料から産生されてもよい。しかしながら、これらの産生方法は高価であり、持続可能ではなく、およびしばしば気候変動に起因する問題を含む環境問題を引き起こす。微生物発酵はテルペン類の産生の代替的な選択肢を提供する。１つ以上のテルペン類および／または前駆体を、ＣＯを含む基質の微生物発酵により産生できる。組み換え微生物をこのような方法に使用してもよい。酸化炭素栄養性酢酸産生組み換え微生物をこのような方法に使用できる。組み換え微生物は、たとえば、外来性のメバロン酸（ＭＶＡ）経路の酵素および／またはＤＸＳ経路の酵素を含んでもよい。【選択図】図１

Description

本発明は、ＣＯを含む基質の微生物発酵によるテルペンおよび／またはその前駆体の産生のための組み換え微生物および方法に関する。
テルペン類は、５つの炭素を有するイソプレン単位から構成される天然に存在する化学基質であり、様々な種類に分けられる。テルペン誘導体としては、炭素骨格の酸化もしくは再配置、または多数の官能基追加もしくは再配置により形成され得るテルペノイド類（イソプレノイド類としても知られている）が挙げられる。
テルペン類の例としては、イソプレン（Ｃ５ヘミテルペン）、ファルネセン（Ｃ１５セスキテルペン類）、アーテミシニン（Ｃ１５セスキテルペン類）、シトラール（Ｃ１０モノテルペン類）、カロテノイド類（Ｃ４０テトラテルペン類）、メントール（Ｃ１０モノテルペン類）、カンファー（Ｃ１０モノテルペン類）、およびカンナビノイド類が挙げられる。
テルペン類は、多種多様な産業に使用される貴重なな商業産物である。最も多いトン単位でテルペン類が使用されるのは樹脂、溶剤、香水、およびビタミン類としてである。たとえば、イソプレンはたとえばタイヤ産業用の合成ゴム（シス−１，４−ポリイソプレン）の生産に使用され；ファルネセンは輸送に使用されるエネルギー濃縮ドロップイン燃料（ｄｒｏｐ−ｉｎ ｆｕｅｌ）またはジェット燃料として使用され；アルテミシニンはマラリアの薬剤に使用され；かつシトラール、カロテノイド類、メントール、カンファー、およびカンナビノイド類は医薬品、ブタジエン、および芳香成分の製造に使用される。
テルペン類は石油化学供給源から産生されてもよく、テレピンなどのテルペン供給原料から産生されてもよい。たとえば、イソプレンはナフサまたはエチレン生産の石油分解の副生成物として石油化学的に産生される。多くのテルペン類はまた、天然の供給源から比較的少量抽出される。しかしながら、これらの産生方法は費用がかかり、持続可能ではなく、および多くの場合気候変動への寄与を含む環境問題を引き起こす。
イソプレンの非常に強い可燃性の性質のため、既知の産生方法は、燃焼および爆発の可能性を制限するために大規模なな安全対策を必要とする。
本発明の目的は、先行技術の欠点の１つ以上を克服することであり、または公衆にテルペン類および他の関連する産物を産生するための代替手段を少なくとも提供する。
微生物発酵はテルペン類の産生の代替的な選択肢を提供する。テルペン類は自然界に普遍的に存在しており、たとえば細菌の細胞壁の生合成に関与し、かつＵＶ光の暴露から葉を保護するためいくつかの木（たとえばポプラ）により産生される。しかしながら、全ての細菌が代謝産物としてテルペン類および／またはテルペン類前駆体を産生するために必要な細胞機構を含むわけではない。たとえば、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍまたはＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉなどの酸化炭素栄養性酢酸産生菌（ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｒｏｐｈｉｃ ａｃｅｔｏｇｅｎ）は、一酸化炭素を含む基質を発酵させてエタノールなどの産物を産生できるが、代謝産物としてテルペン類および／またはテルペン類の前駆体を全く産生かつ発することがないことが知られている。さらに、大部分の細菌は、商業的に有効なテルペン類を産生しないことが知られている。
本発明は、特に、ＣＯを含む基質の微生物発酵により１つ以上のテルペン類および／またはその前駆体を産生する方法、ならびにこのような方法に使用する組み換え微生物を提供する。
第１の態様では、本発明は、ＣＯを含む基質の発酵により１つ以上のテルペン類および／またはその前駆体ならびに任意に１つ以上の他の産物を産生できる酸化炭素栄養性酢酸産生組み換え微生物を提供する。
１つの特定の実施形態では、本微生物は、組み換え微生物をもたらす親微生物中には存在しないメバロン酸（ＭＶＡ）経路中の１つ以上の酵素（本明細書中で外来性酵素と呼ばれる）を発現するよう適合される。別の実施形態では、本微生物は、組み換え微生物をもたらす親微生物中に存在するメバロン酸（ＭＶＡ）経路中の１つ以上の酵素（本明細書中で内在性酵素）を過剰発現するよう適合される。
さらなる実施形態では、本微生物は、
（ａ）メバロン酸（ＭＶＡ）経路中の１つ以上の外来性酵素を発現しかつ／またはメバロン酸（ＭＶＡ）経路中の１つ以上の内在性酵素を過剰発現し；かつ
（ｂ）ＤＸＳ経路中の１つ以上の外来性酵素を発現しかつ／またはＤＸＳ経路中の１つ以上の内在性酵素を過剰発現するよう
適合される。
１つの実施形態では、メバロン酸（ＭＶＡ）経路由来の１つ以上の酵素は、
ａ）チオラーゼ（ＥＣ ２．３．１．９）
ｂ）ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ ２．３．３．１０）
ｃ）ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ １．１．１．８８）
ｄ）メバロン酸キナーゼ（ＥＣ ２．７．１．３６）
ｅ）ホスホメバロン酸キナーゼ（ＥＣ ２．７．４．２）
ｆ）メバロン酸ジホスホデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．３３）、および
ｇ）機能的に等価であるそれらのいずれかの変異体
からなる群から選択される。
さらなる実施形態では、ＤＸＳ経路由来の１つ以上の酵素は、
ａ）１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ ＤＸＳ（ＥＣ：２．２．１．７）、
ｂ）１−デオキシ−Ｄ−キシルロース ５−リン酸レダクトイソメラーゼ ＤＸＲ（ＥＣ：１．１．１．２６７）、
ｃ）２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール ４−リン酸シチジリルトランスフェラーゼ ＩｓｐＤ （ＥＣ：２．７．７．６０）、
ｄ）４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール キナーゼ ＩｓｐＥ（ＥＣ：２．７．１．１４８）、
ｅ）２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール ２，４−シクロ二リン酸シンターゼ ＩｓｐＦ（ＥＣ：４．６．１．１２）、
ｆ）４−ヒドロキシ−３−メチルブタ −２−エン−１−イル 二リン酸シンターゼ ＩｓｐＧ（ＥＣ：１．１７．７．１）、
ｇ）４−ヒドロキシ−３−メチルブタ −２−エニル 二リン酸レダクターゼ（ＥＣ：１．１７．１．２）、および
ｈ）機能的に等価であるそれらのいずれかの変異体
からなる群から選択される。
さらなる実施形態では、１つ以上のさらなる外来性酵素または内在性酵素が発現または過剰発現されてテルペン化合物またはその前駆体の産生をもたらし、この発現される外来性酵素または過剰発現する内在性酵素は、
ａ）ゲラニルトランストランスフェラーゼ（EC: 2.5.1.10）、
ｂ）ヘプタプレニル二リン酸シンターゼ（ＥＣ：２．５．１．１０）、
ｃ）オクタプレニル−二リン酸シンターゼ（ＥＣ：２．５．１．９０）、
ｄ）イソプレンシンターゼ（ＥＣ ４．２．３．２７）、
ｅ）イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ（ＥＣ ５．３．３．２）、
ｆ）ファルネセンシンターゼ（ＥＣ ４．２．３．４６／ＥＣ ４．２．３．４７）、および
ｇ）機能的に等価であるそれらのいずれかの変異体
からなる群から選択される。
１つの実施形態では、親微生物は、ＣＯを含む基質を発酵してアセチルＣｏＡを産生できるがアセチルＣｏＡをメバロン酸またはイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）に変換できず、かつ組み換え微生物はメバロン酸経路に関与する１つ以上の酵素を発現するよう適合される。
１つの実施形態では、１つ以上のテルペンおよび／またはその前駆体は、メバロン酸、ＩＰＰ、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）、イソプレン、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）およびファルネセンから選択される。
１つの実施形態では、微生物は１つ以上の内在性核酸の発現を増大するよう適合された１つ以上の外来性核酸を含み、かつ１つ以上の内在性核酸は本明細書で前述した酵素の内の１つ以上をコードする。
１つの実施形態では、発現を増大するよう適合された１つ以上の外来性核酸は調節要素である。１つの実施形態では、この調節要素はプロモーターである。１つの実施形態では、このプロモーターは、構成的プロモーターである。１つの実施形態では、このプロモーターは、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌの遺伝子クラスターまたはホスホトランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼオペロンプロモーターを含む群から選択される。
１つの実施形態では、微生物は、前述した酵素の内の１つ以上をコードしかつ発現するよう適合され１つ以上の外来性核酸を含む。１つの実施形態では、微生物は、酵素のうち少なくとも２つをコードしかつ発現するよう適合され１つ以上の外来性核酸を含む。他の実施形態では、微生物は、酵素のうち少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ以上をコードしかつ発現するよう適合され１つ以上の外来性核酸を含む。
１つの実施形態では、１つ以上の外来性核酸は核酸構築物またはベクターであり、１つの特定の実施形態では、上記酵素の１つ以上を任意の組み合わせでコードするプラスミドである。
１つの実施形態では、外来性核酸は発現プラスミドである。
１つの特定の実施形態では、親微生物は酸化炭素栄養性酢酸産生細菌の群から選択される。特定の実施形態では、微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍａｇｎｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ ｂａｃｃｈｉｉ、Ｂｌａｕｔｉａ ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｏｖａｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｉｕｖｉからなる群から選択される。
１つの実施形態では、親微生物はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉである。１つの特定の実施形態では、微生物はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＤＳＭ２３６９３である。別の特定の実施形態では、微生物はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ ＤＳＭ１３５２８（またはＡＴＣＣ５５３８３）である。
１つの実施形態では、親微生物はＤＸＳ経路および／またはメバロン酸（ＭＶＡ）経路中の１つ以上の遺伝子を欠いている。１つの実施形態では、親微生物は、
ａ）チオラーゼ（ＥＣ ２．３．１．９）、
ｂ）ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ ２．３．３．１０）、
ｃ）ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ １．１．１．８８）、
ｄ）メバロン酸キナーゼ（ＥＣ ２．７．１．３６）、
ｅ）ホスホメバロン酸キナーゼ（ＥＣ ２．７．４．２）、
ｆ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．３３）、
ｇ）１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ ＤＸＳ（ＥＣ：２．２．１．７）、
ｈ）１−デオキシ−Ｄ−キシルロース ５−リン酸レダクトイソメラーゼ ＤＸＲ（ＥＣ：１．１．１．２６７）、
ｉ）２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール ４−リン酸シチジリルトランスフェラーゼ ＩｓｐＤ（ＥＣ：２．７．７．６０）、
ｊ）４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール キナーゼ ＩｓｐＥ（ＥＣ：２．７．１．１４８）、
ｋ）２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール ２，４−シクロ二リン酸シンターゼ ＩｓｐＦ（ＥＣ：４．６．１．１２）、
ｌ）４−ヒドロキシ−３−メチルブタ −２−エン−１−イル 二リン酸シンターゼ ＩｓｐＧ（ＥＣ：１．１７．７．１）、
ｍ）４−ヒドロキシ−３−メチルブタ −２−エニル 二リン酸レダクターゼ（ＥＣ：１．１７．１．２）、および
ｎ）機能的に等価であるそれらのいずれかの変異体
からなる群から選択される酵素をコードする１つ以上の遺伝子を欠いている。
第２の態様では、本発明は、微生物中で発現する時微生物がＣＯを含む基質の発酵により１つ以上のテルペン類および／またはその前駆体を産生することを可能にする、１つ以上の酵素をコードする核酸を提供する。
１つの実施形態では、核酸は、微生物中で発現する時微生物がＣＯを含む基質の発酵により１つ以上のテルペン類および／またはその前駆体を産生することを可能にする、２つ以上の酵素をコードする。１つの実施形態では、本発明の核酸は、このような酵素の少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ以上をコードする。
１つの実施形態では、核酸はメバロン酸（ＭＶＡ）経路中の１つ以上の酵素をコードする。１つの実施形態では、１つ以上の酵素は、
ａ） チオラーゼ（ＥＣ ２．３．１．９）、
ｂ） ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ ２．３．３．１０）、
ｃ） ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ １．１．１．８８）、
ｄ） メバロン酸キナーゼ（ＥＣ ２．７．１．３６）、
ｅ） ホスホメバロン酸キナーゼ（ＥＣ ２．７．４．２）、
ｆ） ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．３３）、および
ｇ） 機能的に等価であるそれらのいずれかの変異体
からなる群から選択される。
特定の実施形態では、核酸はチオラーゼ（アセチルＣｏＡｃ−アセチルトランスフェラーゼであってもよい）、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼおよびＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼをコードする。
さらなる実施形態では、核酸はメバロン酸（ＭＶＡ）経路中の１つ以上の酵素およびＤＸＳ経路中の１つ以上のさらなる酵素をコードする。１つの実施形態では、ＤＸＳ経路由来の１つ以上の酵素は、
ａ） １−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ ＤＸＳ（ＥＣ：２．２．１．７）、
ｂ） １−デオキシ−Ｄ−キシルロース ５−リン酸レダクトイソメラーゼ ＤＸＲ（ＥＣ：１．１．１．２６７）、
ｃ） ２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール ４−リン酸シチジリルトランスフェラーゼ ＩｓｐＤ（ＥＣ：２．７．７．６０）、
ｄ） ４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール キナーゼ ＩｓｐＥ（ＥＣ：２．７．１．１４８）、
ｅ） ２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール ２，４−シクロ二リン酸シンターゼ ＩｓｐＦ（ＥＣ：４．６．１．１２）、
ｆ） ４−ヒドロキシ−３−メチルブタ −２−エン−１−イル 二リン酸シンターゼ ＩｓｐＧ（ＥＣ：１．１７．７．１）、
ｇ） ４−ヒドロキシ−３−メチルブタ −２−エニル 二リン酸レダクターゼ（ＥＣ：１．１７．１．２）、および
ｈ） 機能的に等価であるそれらのいずれかの変異体
からなる群から選択される。
さらなる実施形態では、核酸は、発現または過剰発現されてテルペン化合物またはその前駆体の産生をもたらす１つ以上のさらなる外来性または内在性酵素をコードし、発現する外来性核酸または過剰発現する内在性核酸は、
ａ） ゲラニルトランストランスフェラーゼ Ｆｐｓ（ＥＣ：２．５．１．１０）、
ｂ） ヘプタプレニル二リン酸シンターゼ（ＥＣ：２．５．１．１０）、
ｃ） オクタプレニル−二リン酸シンターゼ（ＥＣ：２．５．１．９０）、
ｄ） イソプレンシンターゼ（ＥＣ ４．２．３．２７）、
ｅ） イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ（ＥＣ ５．３．３．２）、
ｆ） ファルネセンシンターゼ（ＥＣ ４．２．３．４６ ／ ＥＣ ４．２．３．４７）、および
ｇ） 機能的に等価であるそれらのいずれかの変異体
からなる群から選択される酵素をコードする。
１つの実施形態では、チオラーゼ（ＥＣ ２．３．１．９）をコードする核酸は配列番号４０の配列を有するか機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、チオラーゼ（ＥＣ ２．３．１．９）をコードする核酸は、配列番号４１の配列を有するか機能的に等価なその変異体であるアセチルＣｏＡ ｃ−アセチルトランスフェラーゼである。
１つの実施形態では、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ ２．３．３．１０）をコードする核酸は配列番号４２の配列を有するか機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ １．１．１．８８）をコードする核酸は配列番号４３の配列を有するか機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、メバロン酸キナーゼ（ＥＣ ２．７．１．３６）をコードする核酸は配列番号５１の配列を有するか機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＥＣ ２．７．４．２）をコードする核酸は配列番号５２の配列を有するか機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．３３）をコードする核酸は配列番号５３の配列を有するか機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ ＤＸＳ（ＥＣ：２．２．１．７）をコードする核酸は配列番号１の配列を有するか機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース ５−リン酸レダクトイソメラーゼ ＤＸＲ（ＥＣ：１．１．１．２６７）をコードする核酸は配列番号３の配列を有するか機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール ４−リン酸シチジリルトランスフェラーゼ ＩｓｐＤ（ＥＣ：２．７．７．６０）をコードする核酸は配列番号５の配列を有するか機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール キナーゼ ＩｓｐＥ（ＥＣ：２．７．１．１４８）をコードする核酸は配列番号７の配列を有するか機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール ２，４−シクロ二リン酸シンターゼ ＩｓｐＦ（ＥＣ：４．６．１．１２）をコードする核酸は配列番号９の配列を有するか機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、４−ヒドロキシ−３−メチルブタ −２−エン−１−イル 二リン酸シンターゼ ＩｓｐＧ（ＥＣ：１．１７．７．１）をコードする核酸は配列番号１１の配列を有するか機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、４−ヒドロキシ−３−メチルブタ −２−エニル 二リン酸レダクターゼ（ＥＣ：１．１７．１．２）をコードする核酸は配列番号１３の配列を有するか機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、ゲラニルトランストランスフェラーゼ Ｆｐｓをコードする核酸は配列番号１５の配列を有するか、機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、ヘプタプレニル二リン酸シンターゼをコードする核酸は配列番号１７の配列を有するか、機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、オクタプレニル−二リン酸シンターゼがポリプレニルシンテターゼであるオクタプレニル−二リン酸シンターゼ（ＥＣ：２．５．１．９０）をコードする核酸は、配列番号１９の配列によりコードされるか、機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、イソプレンシンターゼ（ｉｓｐＳ）をコードする核酸は配列番号２１の配列を有するか、機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、イソペンテニル−二リン酸デルタ−イソメラーゼ（ｉｄｉ）をコードする核酸は配列番号５４の配列を有するか、機能的に等価な変異体である。
１つの実施形態では、ファルネセンシンターゼをコードする核酸は、配列番号５７の配列を有するか、機能的に等価な変異体である。
１つの実施形態では、核酸は、以下の酵素
ａ） イソプレンシンターゼ；
ｂ） イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ（ｉｄｉ）；
ｃ） １−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ ＤＸＳ；
または機能的に等価なそれらの変異体
をコードする。
１つの実施形態では、核酸は、以下の酵素
ａ） チオラーゼ；
ｂ） ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ；
ｃ） ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ；
ｄ） メバロン酸キナーゼ；
ｅ） ホスホメバロン酸キナーゼ；
ｆ） ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ；
ｇ） イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ（ｉｄｉ）；および
ｈ） イソプレンシンターゼ；
または機能的に等価なそれらの変異体
をコードする。
１つの実施形態では、核酸は、以下の酵素
ａ） ゲラニルトランストランスフェラーゼ Ｆｐｓ；および
ｂ） ファルネセンシンターゼ
または機能的に等価なそれらの変異体
をコードする。
１つの実施形態では、本発明の核酸はプロモーターをさらに含む。１つの実施形態では、プロモーターはその制御下で遺伝子の構成的発現を可能にする。特定の実施形態では、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ ｃｌｕｓｔｅｒプロモーターを使用する。別の特定の実施形態では、ホスホトランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼオペロンプロモーターを使用する。１つの特定の実施形態では、プロモーターはＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ由来である。
第３の態様では、本発明は、第２の態様の１つ以上の核酸を含む核酸構築物またはベクターを提供する。
１つの特定の実施形態では、核酸構築物またはベクターは発現構築物または発現ベクターである。１つの特定の実施形態では、発現構築物または発現ベクターはプラスミドである。
第４の態様では、本発明は、第２の態様の核酸または第３の態様のベクターもしくは構築物のうちのいずれか１つ以上を含む宿主生物を提供する。
第５の態様では、本発明は、本発明の第３の態様に記載の発現構築物またはベクター、およびメチル化構築物またはベクターを含む組成物を提供する。
好ましくは、組成物は本発明の第１の態様に係る組み換え微生物を産生できる。
１つの特定の実施形態では、発現構築物／ベクターおよび／またはメチル化構築物／ベクターはプラスミドである。
第６の態様では、本発明は、本発明の第１の態様の組み換え微生物を使用して、ＣＯを含む基質を発酵することを含む微生物発酵による、１つ以上のテルペン類および／またはその前駆体および任意に１つ以上の他の産生物の産生方法を提供する。
１つの実施形態では、本方法は、
（ａ）本発明の第１の態様の１つ以上の微生物の培養物を含む生物反応器にＣＯを含む基質を提供するステップ；および
（ｂ）生物反応器中の培養物を嫌気的に発酵して少なくとも１つのテルペンおよび／またはその前駆体を産生するステップ
を含む。
１つの実施形態では、本方法は、
（ａ）工業的工程の結果として生成したＣＯ含有気体を補足するステップ；
（ｂ）本発明の第１の態様の１つ以上の微生物を含む培養によりこのＣＯ含有気体を嫌気的に発酵して少なくとも１つのテルペンおよび／またはその前駆体を産生するステップ
を含む。
本方法の態様の特定の実施形態では、微生物は水性培養媒体中で維持される。
本方法の態様の特定の実施形態では、基質の発酵は生物反応器中で行われる。
１つの実施形態では、１つ以上のテルペンおよび／またはその前駆体は、メバロン酸、ＩＰＰ、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）、イソプレン、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）およびファルネセンから選択される。
好ましくは、Ｃｏを含む基質はＣＯを含む気体の基質である。１つの実施形態では、基質は工業廃ガスを含む。特定の実施形態では、気体は製鋼所の排ガスまたは合成ガスである。
１つの実施形態では、基質は、概して、少なくとも約２０容量％〜約１００容量％のＣＯ、約２０容量％〜約７０容量％のＣＯ、約３０容量％〜約６０容量％のＣＯ、および約４０〜５５容量％のＣＯなどの、ＣＯの主要比率を含む。特定の実施形態では、基質は約２５容量％、または約３０容量％、または約３５容量％、または約４０容量％、または約４５容量％、または約５０容量％、または約５５容量％、または約６０容量％のＣＯを含む。
ある実施形態では、本方法は、発酵ブロスからテルペンまたはその前駆体および任意に１つ以上の他の産物を回収するステップをさらに含む。
第７の態様では、本発明は、第６の態様の方法により産生される際の１つ以上のテルペンおよび／またはその前駆体を提供する。１つの実施形態では、１つ以上のテルペンおよび／またはその前駆体は、メバロン酸、ＩＰＰ、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）、イソプレン、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）およびファルネセンからなる群から選択される。
別の態様では、本発明は、本発明の第１の態様の微生物の産生方法であって、ＣＯを含む基質の発酵により微生物が１つ以上のテルペン類および／またはその前駆体ならびに任意に１つ以上の他の産物を産生できるまたはそれらの産生を増大できるよう、１つ以上の核酸を導入することにより、酸化炭素栄養性酢酸産生微生物を形質転換することを含み、親微生物はＣＯを含む発酵による１つ以上のテルペンおよび／または前駆体を産生できない、または低レベルで産生する、方法を提供する。
１つの特定の実施形態では、親微生物は、メバロン酸（ＭＶＡ）経路および任意でＤＸＳ経路中の１つ以上の酵素を発現するよう適合され１つ以上の外来性核酸を導入することにより形質転換される。別の実施形態では、親微生物は、親微生物中に天然に存在するメバロン酸（ＭＶＡ）経路および任意でＤＸＳ経路の１つ以上の酵素を過剰発現するよう適合され１つ以上の核酸を用いて形質転換される。
ある実施形態では、１つ以上の酵素は本明細書に前述した酵素である。
１つの実施形態では、単離され遺伝的に改変されている酸化炭素栄養性酢酸産生細菌が提供され、細菌はメバロン酸経路またはＤＸＳ経路またはテルペン生合成経路中の酵素をコードする外来性核酸を含み、それにより細菌は酵素を発現する。酵素は、
ａ） チオラーゼ（ＥＣ ２．３．１．９）；
ｂ） ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ ２．３．３．１０）；
ｃ） ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ １．１．１．８８）；
ｄ） メバロン酸キナーゼ（ＥＣ ２．７．１．３６）；
ｅ） ホスホメバロン酸キナーゼ（ＥＣ ２．７．４．２）；
ｆ） ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．３３）；１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ ＤＸＳ（ＥＣ：２．２．１．７）；
ｇ） １−デオキシ−Ｄ−キシルロース ５−リン酸レダクトイソメラーゼ ＤＸＲ（ＥＣ：１．１．１．２６７）；
ｈ） ２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール ４−リン酸シチジリルトランスフェラーゼ ＩｓｐＤ（ＥＣ：２．７．７．６０）；
ｉ） ４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール キナーゼ ＩｓｐＥ（ＥＣ：２．７．１．１４８）；
ｊ） ２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール ２；４−シクロ二リン酸シンターゼ ＩｓｐＦ（ＥＣ：４．６．１．１２）；
ｋ） ４−ヒドロキシ−３−メチルブタ −２−エン−１−イル 二リン酸シンターゼ ＩｓｐＧ（ＥＣ：１．１７．７．１）；
ｌ） ４−ヒドロキシ−３−メチルブタ −２−エニル 二リン酸レダクターゼ（ＥＣ：１．１７．１．２）；ゲラニルトランストランスフェラーゼ Ｆｐｓ（ＥＣ：２．５．１．１０）；
ｍ） ヘプタプレニル二リン酸シンターゼ（ＥＣ：２．５．１．１０）；
ｎ） オクタプレニル−二リン酸シンターゼ（ＥＣ：２．５．１．９０）；
ｏ） イソプレンシンターゼ（ＥＣ ４．２．３．２７）；
ｐ） イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ（ＥＣ ５．３．３．２）；および
ｑ） ファルネセンシンターゼ（ＥＣ ４．２．３．４６ ／ ＥＣ ４．２．３．
４７）
からなる群から選択される。
いくつかの態様では、細菌は前記核酸の不在下では酵素を発現しない。いくつかの態様では、細菌は嫌気条件下で酵素を発現する。
１つの実施形態は、酸化炭素栄養性酢酸産生細菌中で複製できるプラスミドを提供する。プラスミドは、メバロン酸経路またはＤＸＳ経路またはテルペン生合成経路中の酵素をコードする核酸を含み、それによりプラスミドが細菌中に存在する際、酵素が前記細菌により発現される、核酸。酵素は、
ａ） チオラーゼ（ＥＣ ２．３．１．９）；
ｂ） ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ ２．３．３．１０）；
ｃ） ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ １．１．１．８８）；
ｄ） メバロン酸キナーゼ（ＥＣ ２．７．１．３６）；
ｅ） ホスホメバロン酸キナーゼ（ＥＣ ２．７．４．２）；
ｆ） ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．３３）；１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ ＤＸＳ（ＥＣ：２．２．１．７）；
ｇ） １−デオキシ−Ｄ−キシルロース ５−リン酸レダクトイソメラーゼ ＤＸＲ（ＥＣ：１．１．１．２６７）；
ｈ） ２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール ４−リン酸シチジリルトランスフェラーゼ ＩｓｐＤ（ＥＣ：２．７．７．６０）；
ｉ） ４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール キナーゼ ＩｓｐＥ（ＥＣ：２．７．１．１４８）；
ｊ） ２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール ２；４−シクロ二リン酸シンターゼ ＩｓｐＦ（ＥＣ：４．６．１．１２）；
ｋ） ４−ヒドロキシ−３−メチルブタ −２−エン−１−イル 二リン酸シンターゼ ＩｓｐＧ（ＥＣ：１．１７．７．１）；
ｌ） ４−ヒドロキシ−３−メチルブタ −２−エニル 二リン酸レダクターゼ（ＥＣ：１．１７．１．２）；ゲラニルトランストランスフェラーゼ Ｆｐｓ（ＥＣ：２．５．１．１０）；
ｍ） ヘプタプレニル二リン酸シンターゼ（ＥＣ：２．５．１．１０）；
ｎ） オクタプレニル−二リン酸シンターゼ（ＥＣ：２．５．１．９０）；
ｏ） イソプレンシンターゼ（ＥＣ ４．２．３．２７）；
ｐ） イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ（ＥＣ ５．３．３．２）；および
ｑ） ファルネセンシンターゼ（ＥＣ ４．２．３．４６ ／ ＥＣ ４．２．３．４７）
からなる群から選択される。
別の実施形態では、ＣＯおよび／またはＣＯ２をイソプレンに変換する工程が提供される。工程は、細菌がＣＯおよび／またはＣＯ２をイソプレンに変換するように、
培養媒体中の酸化炭素栄養性の酢酸産生細菌の培養物を含む生物反応器に気体のＣＯ含有基質および／またはＣＯ２含有基質を通すことと、生物反応器からイソプレンを回収することとを含む。酸化炭素栄養性の酢酸産生細菌はイソプレンシンターゼを発現するよう遺伝的に改変される。
別の実施形態では、イソプレンシンターゼをコードする核酸を含む、単離され遺伝的に改変されている酸化炭素栄養性酢酸産生細菌を提供する。細菌はイソプレンシンターゼを発現し、かつ細菌はジメチルアリル二リン酸（ｉｍｅｔｈｙｌａｌｌｙｌｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）をイソプレンに変換できる。１つの態様では、イソプレンシンターゼはＰｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓの酵素である。別の態様では、核酸は最適化されたコドンである。さらに別の態様では、イソプレンシンターゼの発現はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ由来のピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼの遺伝子のプロモーターの転写制御下にある。
別の実施形態は、ＣＯおよび／またはＣＯ２をイソペンチル二リン酸（ＩＰＰ）に変換する工程を提供する。工程は、細菌がＣＯおよび／またはＣＯ２をイソペンチル二リン酸（ＩＰＰ）に変換するように、培養媒体中の酸化炭素栄養性の酢酸産生細菌の培養液を含む生物反応器に気体のＣＯ含有基質および／またはＣＯ２含有基質を通すことと、生物反応器からＩＰＰを回収することとを含む。酸化炭素栄養性の酢酸産生細菌はイソプレン二リン酸Δイソメラーゼを発現するよう遺伝的に改変されている。
さらなる別の実施形態は、イソペンチル二リン酸Δイソメラーゼをコードする核酸を含む、単離され遺伝的に改変されている酸化炭素栄養性酢酸産生細菌を提供する。細菌は、イソペンチル二リン酸Δイソメラーゼを発現し、かつ細菌はジメチルアリル二リン酸塩をイソペンチルジリン酸塩に変換できる。いくつかの態様では、核酸は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉのイソペンチル二リン酸Δ イソメラーゼをコードする。xxx missing linexx。他の態様では、核酸はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍおよびイソプレンシンターゼをコードする第２の核酸の下流由来のピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ遺伝子のプロモーターの転写制御下にある。
さらなる別の実施形態では、ＣＯおよびＣＯ２をイソペンチル二リン酸塩（ＩＰＰ）および／またはイソプレンに変換する工程を提供する。工程は、細菌がＣＯおよび／またはＣＯ２をイソペンチル二リン酸塩（ＩＰＰ）および／またはイソプレンに変換するように、培養媒体中の酸化炭素栄養性の酢酸産生細菌の培養物を含む生物反応器に気体のＣＯ含有基質および／またはＣＯ２含有基質を通すことと、ＩＰＰおよび／またはイソプレンを生物反応器から回収することとを含む。酸化炭素栄養性の酢酸産生細菌は、デオキシキシルロース ５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）の酵素をコードする核酸のコピー数が増加するよう遺伝的に改変されており、増加したコピー数はゲノム当たり１を超える。
さらなる別の実施形態は、デオキシキシルロース ５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）酵素をコードする核酸のゲノム当たり１超のコピー数を含む、単離され遺伝的に改変されている酸化炭素栄養性酢酸産生細菌を提供する。いくつかの態様では、単離され遺伝的に改変されている酸化炭素栄養性酢酸産生細菌は、イソプレンシンターゼをコードする核酸をさらに含んでもよい。他の態様では、単離され遺伝的に改変されている酸化炭素栄養性酢酸産生細菌は、イソペンチル二リン酸Δイソメラーゼをコードする核酸をさらに含んでもよい。さらなる他の態様では、単離され遺伝的に改変されている酸化炭素栄養性酢酸産生細菌は、イソペンチル二リン酸Δイソメラーゼをコードする核酸およびイソプレンシンターゼをコードする核酸をさらに含んでもよい。
他の実施形態は、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）をコードする核酸を含む単離され遺伝的に改変されている酸化炭素栄養性酢酸産生細菌が提供される。細菌はコード化された酵素を発現し、かつ酵素はこの細菌由来のものではない。いくつかの態様では、酵素はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの酵素である。いくつかの態様では、酵素は１つ以上のＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのプロモーターの制御下で発現される。いくつかの態様では、細菌は、チオラーゼ（ｔｈｌＡ／ｖｒａＢ）をコードする核酸、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧＳ）をコードする核酸、およびＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＲ）をコードする核酸をさらに含む。いくつかの態様では、チオラーゼはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍのチオラーゼである。いくつかの態様では、細菌はジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭＤ）をコードする核酸をさらに含む。
さらなる他の実施形態では、αフェネルセンシンターゼをコードする外来性核酸を含む、単離され遺伝的に改変されている酸化炭素栄養性酢酸産生細菌が提供される。いくつかの態様では、核酸は、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍでの発現に最適化されたコドンである。いくつかの態様では、αフェネルセンシンターゼはＭａｌｕｓ ｘ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ のα−ファルネセンシンターゼである。いくつかの態様では、細菌はゲラニルトランストランスフェラーゼをコードする核酸セグメントをさらに含む。いくつかの態様では、ゲラニルトランストランスフェラーゼ（ｇｅｒｎａｙｌｔｒａｎｓｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）はＥ．ｃｏｌｉのゲラニルトランストランスフェラーゼである。
本発明のいずれかの態様または実施形態に適切な、単離され遺伝的に改変されている酸化炭素栄養性酢酸産生細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍａｇｎｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ ｂａｃｃｈｉｉ、Ｂｌａｕｔｉａ ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｏｖａｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｉｕｖｉからなる群から選択されてもよい。
また、本発明は、本願の明細書中に記されるまたは示される要素および特徴を部分的に含むよう広くあってもよく、個別または集合的であってもよく、これらの一部、要素および特徴のうちの２つ以上の組み合わせであってもよい。特定の整数が本明細書中に記載されているが、特定の整数は本発明に関連する技術で知られている均等物を有すると本明細書に記載されており、このような均等物は、以下に個別に記載されていない限り、本明細書に組み込まれるものである。
本発明のこれらの態様および他の態様は、すべての新規態様について検討され、添付図面を参照して例示の目的でのみ与えられる以下の記載により明白になるであろう。
は、テルペンの産生の経路図であり、本願に記載される遺伝子標的は太字の矢印で示される は、プラスミドｐＭＴＬ ８５１４６−ｉｓｐＳの遺伝子マップである。 は、プラスミドｐＭＴＬ ８５２４６−ｉｓｐＳ−ｉｄｉの遺伝子マップである。 は、プラスミドｐＭＴＬ ８５２４６−ｉｓｐＳ−ｉｄｉ−ｄｘｓの遺伝子マップである。 は、プラスミドｐＭＴＬ ８５２４６−ｉｓｐＳ−ｉｄｉ−ｄｘｓのシークエンシング結果である。 は、ＤＸＳおよびメバロン酸経路を介してＣＯからテルペンを産生するエネルギー論の比較を示す。 は、メバロン酸経路を示す。 は、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ形質変換体におけるプラスミドｐＭＴＬ ８５２４６−ｉｓｐＳ−ｉｄｉのイソプレン発現の存在を確認するアガロースゲル電気泳動の画像である。レーン１および２０は１００ｂｐＰｌｕｓＤＮＡラダーを示す。レーン３〜６、９〜１２、１５〜１８は、４つの異なるクローン由来の単離プラスミドをテンプレートとして用いたＰＣＲを示し、各々は以下の順である：ｃｏｌＥ１、ｅｒｍＢ、およびｉｄｉ。レーン２、８、および１４は陰性対照としてテンプレートのないＰＣＲを示し、各々は以下の順である：ｃｏｌＥ１、ｅｒｍＢ、およびｉｄｉ。レーン７、１３、および１９は陽性対照としてＥ．ｃｏｌｉ由来のｐＭＴＬ ８５２４６を用いたＰＣＲを示し、各々は以下の順である：ｃｏｌＥ１、ｅｒｍＢ、およびｉｄ。 は、メバロン酸発現プラスミドＭＴＬ８２１５−Ｐｐｔａａｃｋ−ｔｈｌＡ−ＨＭＧＳ−Ｐａｔｐ−ＨＭＧＲを示す。 は、イソプレン発現プラスミドｐＭＴＬ ８３１４−Ｐｐｔａａｃｋ−ｔｈｌＡ−ＨＭＧＳ−Ｐａｔｐ−ＨＭＧＲ−Ｐｒｎｆ−ＭＫ−ＰＭＫ−ＰＭＤ−Ｐｆｏｒ−ｉｄｉ−ｉｓｐＳを示す。 は、ファルネセン発現プラスミドｐＭＴＬ８３１４−Ｐｐｔａａｃｋ−ｔｈｌＡ−ＨＭＧＳ−Ｐａｔｐ−ＨＭＧＲ−Ｐｒｎｆ−ＭＫ−ＰＭＫ−ＰＭＤ−Ｐｆｏｒ−ｉｄｉ−ｉｓｐＡ−ＦＳを示す。 は、プラスミドｐＭＴＬ ８５２４６−ｉｓｐＳ−ｉｄｉ−ｄｘｓの遺伝子マップを示す。 は、プラスミドｐＭＴＬ ８５１４６−ｉｓｐＳをもつＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍを用いた遺伝子発現の実験の増幅チャートを示す。 は、プラスミドｐＭＴＬ ８５２４６−ｉｓｐＳ−ｉｄｉをもつＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍを用いた遺伝子発現の増幅チャートを示す。 は、プラスミドｐＭＴＬ ８５２４６−ｉｓｐＳ−ｉｄｉ−ｄｘｓをもつＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍを用いた遺伝子発現を実験した増幅チャートを示す。 は、プラスミドｐＭＴＬ８３１４Ｐｒｎｆ−ＭＫ−ＰＭＫ−ＰＭＤ−Ｐｆｏｒ−ｉｄｉ−ｉｓｐＡ−ＦＳの存在確認するＰＣＲを示す。予測バンドのサイズは１５８４ｂｐである。ＤＮＡマーカーは、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓの１ｋｂＤＮＡラダーである。 は、プラスミドｐＭＴＬ８３１４Ｐｒｎｆ−ＭＫ−ＰＭＫ−ＰＭＤ−Ｐｆｏｒ−ｉｄｉ−ｉｓｐＡ−ＦＳをもつ形質転換したＣ． ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｍｕｎの増殖曲線である。 は、メバロン酸キナーゼ（ＭＫ 配列番号：５１）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ 配列番号：５２）、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭＤ 配列番号：５３）、イソペンチル−二リン酸Δ−イソメラーゼ（ｉｄｉ 配列番号：５４）、ゲラニルトランストランスフェラーゼ（ｉｓｐＡ 配列番号：５６）およびファルネセンシンターゼ（Ｆｓ 配列番号５７）の遺伝子発現を示すＲＴ−ＰＲＣデータである。 は、ｉｄｉ−ｉｓｐＡ−ＦＳのｐＭＴＬ８３１４Ｐｒｎｆ−ＭＫ−ＰＭＫ−ＰＭＤ−Ｐを含む１ｍＭのメバロン酸を添加した培養物中のファルネセンの存在を検出および確認するＧＣ−ＭＳである。質量９３のイオンを含むピークををスキャンしたＧＣ−ＭＳクロトマトグラム。クロマトグラム１および２は形質転換されたＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍであり、３はＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ試料と同時に流入されるβファルネセン標準基質である。４は、αファルネセン産生を示す、Ｍ９グルコースで増殖させたプラスミドｐＭＴＬ８３１４Ｐｒｎｆ−ＭＫ−ＰＭＫ−ＰＭＤ−Ｐｆｏｒ−ｉｄｉ−ｉｓｐＡ−ＦＳをもつＥ．ｃｏｌｉである。５は、Ｅ．ｃｏｌｉ試料と同時に流入されるβファルネセンの標準基質である。Ｅ．ｃｏｌｉおよびＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ試料間の保持時間の差異は、分析機器に対する小さな変化によるものである。しかしながらβファルネセン標準基質および産生したαファルネセンの間の保持時間の差異はいずれの場合も全く同じであり、このことは質量スペクトルでの一致と合わせてＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのαファルネセン産生を確認する。 は、図１９で１Ａおよび２Ａと標識したピークのＭＳスペクトルである。ＭＳスペクトルはＮＩＳＴデータベーススペクトル（図２１）と一致し、ピークがαファルネセンであると確認される。 は、ＮＩＳＴ質量スペクトルデータベースからのαファルネセンのＭＳスペクトルである。
以下は、一般的な文言を用いた、その好ましい実施形態を含む本発明の記載である。本発明は以下の本明細書の「実施例」の下の開示からさらにさらに明らかにされており、開示は本発明を支持する実験データ、本発明の多様な態様の特定の実施例、および本発明を実施する手段を提供する。
驚くべきことに、本発明者らは、酸化炭素栄養性の酢酸産生細菌を改変して、ＣＯを含む基質の発酵によりイソプレンおよびファルネセンを含むテルペンおよびその前駆体を産生することができた。このことは、それらの産生のための現在の方法に対して利点を有し得る、これらの産物の産生のための代替手段を提供する。さらに、本発明者らは、さもなければ大気に放出され、かつ環境を汚染するであろう工業的工程からの一酸化炭素を使用する手段を提供する。
本明細書では、「発酵ブロス」は、少なくとも栄養培地および細菌細胞を含む培養培地を指す。
本明細書では、「シャトル微生物」は、メチルトランスフェラーゼ酵素が発現される微生物であり、かつ目的微生物と異なる微生物を指す。
本明細書では、「目的微生物」は、発現構築物／ベクター上に含まれる遺伝子が発現される微生物であり、かつシャトル微生物と異なる微生物を指す。
「主な発酵産物」という用語は、最も高い濃度および／または収率で産生される１つの発酵産物を意味すると意図される。
用語「効率を増大する」、「増大された効率」などは、発酵工程に関連して使用される際、限定するものではないが、発酵を触媒する微生物の増殖速度、産生物濃度の上昇した増殖および／または産物産生速度、消費された基質の容量あたり産生される所望の産物の容量、所望産物の産生速度または産生レベル、および発酵の他の副産物と比較した所望の産物の相対比率のうちの少なくとも１つの増加を含む。
「一酸化炭素を含む基質」およびそれに類する文言は、たとえば、１つ以上の細菌株の増殖および／または発酵に一酸化炭素が利用可能である任意の基質を含むと理解されるべきである。
「一酸化炭素を含む気体基質」およびそれに類する文言および用語は、あるレベルの一酸化炭素を含む任意の気体を含む。ある実施形態では、基質は少なくとも２０容量％〜１００容量％のＣＯ、２０容量％〜７０容量％のＣＯ、３０容量％〜６０容量％のＣＯ、および４０容量％〜５５容量％のＣＯを含む。特定の実施形態では、基質は約２５容量％、または約３０容量％、または約３５容量％、または約４０容量％、または約４５容量％、または約５０容量％、または約５５容量％、または約６０容量％のＣＯを含む。
基質が水素を含む必要はないが、Ｈ２の存在は、本発明の方法にしたがった形成を産生するために有害であってはならない。特定の実施形態では、水素の存在は、アルコール産生の総合的な効率を改善する。Xxmissing linexxたとえば、特定の実施形態では、基質は約２：１、または１：１、または１：２の比率のＨ２：ＣＯを含んでもよい。１つの実施形態では、基質は約３０容量％以下のＨ２、約２０容量％以下のＨ２、約１５容量％以下のＨ２、または約１０容量％以下のＨ２を含む。他の実施形態では、基質の流れは、たとえば、５％未満、または４％未満、または３％未満、または％未満、または１％未満の低濃度のＨ２を含み、もしくは水素を実質的に含まない。基質はまた、たとえば、約１容量％〜８０容量％、または１容量％〜約３０容量％のＣＯ２など、いくらかのＣＯ２を含んでもよい。１つの実施形態では、基質は約２０容量％以下のＣＯ２を含む。特定の実施形態では、基質は約１５容量％以下のＣＯ２、約１０容量％以下のＣＯ２、約５容量％以下のＣＯ２を含み、または実質的にＣＯ２を含まない。
以下に記載されるように、本発明の実施形態は、「ＣＯを含む気体基質」を送達かつ発酵することに関して記載される。しかしながら、気体基質は代替的な形態にて提供されてもよいことが理解されるべきである。たとえば、ＣＯを含む気体基質は液体に溶解されて提供されてもよい。本質的に、液体は、一酸化炭素を含む気体で飽和され、その後その液体を生物反応器に添加する。このことは標準的な方法を使用して達成し得る。例として、微細気泡分散ジェネレータ（Ｈｅｎｓｉｒｉｓａｋ ｅｔ． ａｌ． Ｓｃａｌｅ−ｕｐ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ ｇｅｎｅｒａｔｏｒ ｆｏｒ ａｅｒｏｂｉｃ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ； Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ １０１， Ｎｕｍｂｅｒ ３ ／ Ｏｃｔｏｂｅｒ， ２００２）を使用できる。さらなる例として、ＣＯを含む気体基質が固体の支持体上に吸着されてもよい。このような代替方法は、用語「ＣＯを含む基質」およびそれに類する用語の使用に含まれる。
本発明の特定の実施形態では、ＣＯ含有気体基質は、工業排ガスまたは工業廃棄ガスである。「工業廃棄ガスまたは工業排ガス」は、工業行程により産生されるＣＯを含む任意の気体を含み、また鉄金属製品製造、非鉄製品製造、石油精製工程、石炭の気化、バイオマスの気化、電力生産、カーボンブラック生産、およびコークの製造の結果として産生される気体を含むと広く解釈されるべきである。さらなる例が本明細書の他で提供されてもよい。
特段の記載が必要とされない限り、本明細書に使用される「発酵」、「発酵工程」、または「発酵反応」、およびそれに類する文言は、工程の増殖段階および産物生合成段階を含むと意図される。さらに本明細書に記載されるように、いくつかの実施形態では、生物反応器は第１の増殖リアクターおよび第２の発酵リアクターを含んでもよい。このように、金属類または組成物を発酵反応に添加することは、これらのリアクターのいずれかまたは両方への添加を含むことが理解べきである。
用語「生物反応器」は、１つ以上の容器および／またはタワー、またはパイプ配置からなる発酵装置を含み、連続撹はん槽リアクター（ＣＳＴＲ）、固定化細胞リアクター（ＩＣＲ）、リクルベッド反応器（ＴＢＲ）、気ほう塔反応器、ガスリフト発酵槽、スタティックミキサー、または気体―液体接触に適した他の装置を含む。いくつかの実施形態では、生物反応器は第１の増殖リアクターおよび第２の発酵リアクターを含む。よって、基質を生物反応器または発酵反応に添加することを指す際には、適切な場合これらのリアクターのいずれかまたは両方を含むことが理解される。
「外来性核酸」は、導入される微生物外に起源を有する核酸である。外来性核酸は、限定するものではないが、導入される微生物（たとえば組み換え微生物の由来となる親微生物）、導入される生物とは異なる微生物株または種類、あるいは人工的にまたは組み換えにて作成した微生物株化または種類を含む任意の適切な供給源に由来してもよい。１つの実施形態では、外来性核酸は導入される微生物内に天然に存在する核酸配列を表し、かつそれらは導入されて特定の遺伝子の発現または過剰発現を増大する（たとえば、配列（たとえば遺伝子）のコピー数を増大すること、または発現を増大するために強力なまたは構成的なプロモーターを導入することにより）。別の実施形態では、外来性核酸は導入される微生物内には天然に存在しない核酸配列を表し、かつ微生物内に天然に存在しない産物を発現させまたは微生物にとって天然の遺伝子の発現を増大させる（たとえば、プロモーターなどの調節要素を導入する場合）。外来性核酸は、導入される微生物のゲノム中に統合するよう適合されてもよいし染色体外にある状態を保持するように適合されてもよい。
「外来性」はまた、タンパク質を指すのに使用してもよい。これは、組み換え微生物が由来する親微生物中には存在しないタンパク質を指す。
組み換え微生物および核酸またはタンパク質に関して本明細書で使用される用語「内在性」は、組み換え微生物が由来する親微生物に存在する任意の核酸またはタンパク質を指す。
本発明は、本明細書で特に例示される配列と異なる核酸が実質的に同一に機能するならば、それらの配列を使用して実施されてもよいことが理解されるべきである。タンパク質またはペプチドをコードする核酸配列について、これは、コードされたタンパク質またはペプチドが実質的に同一の機能を有することを意味する。プロモーター配列を表す核酸配列については、変異型配列は１つ以上の遺伝子発現を促進する性質を有する。このような核酸は、本明細書で「機能的に等価な変異体」と呼ばれてもよい。例として、核酸の機能的に等価な変異体は、対立変異体、遺伝子のフラグメント、変異（欠損、挿入、ヌクレオチド置換など）および／または遺伝子多型を含む遺伝子などが挙げられる。他の微生物由来のホモログ遺伝子もまた、本明細書に特に例示される配列の機能的に等価な変異体の例と考えられてもよい。これらは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｃ． ｓａｃｃｈａｒｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、およびＣ． ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍなどの種のホモログ遺伝子を含み、この詳細は、ＧｅｎｅＢａｎｋまたはＮＣＢＩなどのウェブサイトに公開されており、利用可能である。「機能的に等価な変異体」という文言はまた、特定の生物のコドン最適化の結果として配列が変化した核酸を含むと解釈されるべきである。本明細書に記載される核酸の「機能的に等価な変異体」は、同定された核酸配列と好ましくは少なくとも約７０％、好ましくは８０％、より好ましくは８５％、好ましくは約９０％、好ましくは約９５％以上の核酸配列同一性を有する。
本発明は、その配列が本明細書に特に例示されるアミノ酸配列とは異なるポリペプチドを使用して実施してもよいこともまた理解すべきである。これらの変異体は、本明細書では「機能的に等価の変異体」を呼ばれてもよい。タンパク質またはペプチドの機能的に等価な変異体は、同定されたタンパク質またはペプチドと少なくとも４０％、好ましくは５０％、好ましくは６０％、好ましくは７０％、好ましくは７５％、好ましくは８０％、好ましくは９０％、好ましくは８５％、好ましくは９０％、好ましくは９５％以上のアミノ酸同一性を共有し、かつ目的のタンパク質またはペプチドと実質的に同じ機能を有するタンパク質またはペプチドを含む。このような変異体は、タンパク質またはペプチドのフラグメントの範囲内にあるものを含み、フラグメントは切り詰められた形態のポリペプチドを含み、欠損は１〜５、〜１０、〜１５、〜２０、〜２５アミノ酸であってよく、およびポリペプチドのいずれかの末端の１〜２５の残基から拡大してもよく、および欠損は領域内の任意の長さであってもよく；または内部の位置にあってもよい。本明細書の特定のポリペプチドの機能的に等価な変異体はまた、たとえば前の段落に例示されるような、他の細菌種のホモログ遺伝子により発現されるポリペプチドを含むと解釈されるべきである。
本明細書で使用される「実質的に同一の機能」は、核酸またはポリペプチドの変異体が、もとの核酸またはポリペプチドの機能を実行できることを意味するよう意図される。たとえば、本発明の酵素の変異体は、その酵素と同一の反応を触媒できる。しかしながら、変異体がもとのポリペプチドまたは核酸と同一のレベルの活性を有することを意味するものではない。
機能的に等価な変異体がもとの核酸またはポリペプチドと実質的に同一の機能を有するかどうかを、任意の既知の方法を使用して評価できる。しかしながら、例として、イソプレン合成酵素に関するＳｉｌｖｅｒらにより記載される方法（１９９１， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ９７： １５８８−１５９１）またはＺｈａｏらにより記載される方法（２０１１， Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ９０：１９１５-１９２２）、ファルネセンシンターゼに関するＧｒｅｅｎらによる方法（２００７， Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ； ６８：１７６-１８８）、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース ５−リン酸シンターゼＤｘｓに関するＫｕｚｕｙａｍａによる方法（２０００， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８２， ８９１−８９７）、チオラーゼに関するＢｅｒｎｄｔ ａｎｄ Ｓｃｈｌｅｇｅｌによる方法（１９７５， Ａｒｃｈ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １０３， ２１−３０）またはＳｔｉｍ−Ｈｅｒｎｄｏｎらによる方法（１９９５， Ｇｅｎｅ １５４： ８１−８５）、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼに関するＣａｂａｎｏらによる方法（１９９７， Ｉｎｓｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．Ｍｅｔａｂ． ２７：４９９-５０５）、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼおよびにメバロン酸キナーゼ酵素に関するＭａらによる方法（２０１１， Ｍｅｔａｂ． Ｅｎｇｉｎ．， １３：５８８-５９７）、ホスホメバロン酸キナーゼに関するＨｅｒｄｅｎｄｏｒｆ ａｎｄ Ｍｉｚｉｏｒｋｏによる方法（２００７， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ４６： １１７８０−８）、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼに関するＫｒｅｐｋｉｙらによる方法（２００４， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． １３： １８７５−１８８１）が挙げられる。また、Ｔｒｕｔｋｏらにより記載される（２００５， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ７４： １５３−１５８）ようにホスミドマイシンまたはメビノリンのような阻害剤を使用して、ＤＸＳおよびメバロン酸経路の遺伝子を同定することが可能である。
本明細書で使用される際の「過剰に発現」、「過剰発現」などの用語および文言は、同一条件下の親微生物の蛋白質（核酸を含む）の発現レベルと比較して１つ以上の蛋白質の発現（同じ蛋白質をコードする１つ以上の核酸の発現を含む）のいずれかの増大を含むと広く解釈されるべきである。タンパク質（または核酸）が任意の特定なレベルに発現するという意味にとるべきではない。
「親微生物」は、本発明の組換え微生物を作成するために使用される微生物である。親微生物は、天然に存在するもの（すなわち野生型微生物）または前もって修飾されているが本発明の対象である１つ以上の酵素を発現または過剰に発現しないものである。したがって、本発明の組換え微生物は、親微生物中で発現または過剰に発現しなかった１つ以上の酵素を発現または過剰に発現するように修飾されてもよい。
核酸「構築物」または「ベクター」などの用語は、細胞内に遺伝子基質を移送するビヒクルとしての使用に適した任意の核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡを含む）を含むと広く解釈されるべきである。この用語は、プラスミド、ウイルス（バクテリオファージを含む）、コスミドおよび人工染色体を含むと解釈されるべきである。構築物またはベクターは、１つ以上の調節要素、複製起源、マルチクローニング部位および／または選択可能マーカーを含んでもよい。１つの実施形態では、構築物またはベクターは、構築物またはベクターによりコードされた１つ以上の遺伝子発現を可能にするよう適合されている。核酸構築物またはベクターは、裸核酸ならびに細胞への送達を促進する１つ以上の薬剤と製剤化した核酸（たとえば、リポソーム結合型核酸、核酸が含まれている生物）を含む。
本明細書で言及される「テルペン」は、単純なテルペン類および複雑なテルペン類ならびにアルコール、アルデヒドおよびケトンなどの酸素含有テルペン化合物を含む、結合されたＣ５イソプレン単位からできる任意の化合物を含むと広く解釈されるべきである。単純なテルペンは、針葉樹などの植物の精油および樹脂に見いだされる。より複雑なテルペンは、テルペノイドおよびビタミンＡ、カロテノイド色素（リコピンなど）、スクアレン、およびゴムを含む。モノテルペン類の例は、限定するものではないが、イソプレン、ピネン、ネロール、シトラール、カンファー、メントール、リモネンを含む。セスキテルペンの例としては、限定するものではないが、ネロリドール、ファルネソールが挙げられる。ジテルペンの例としては、限定するものではないが、フィトール、ビタミンＡ１が挙げられる。スクアレンはトリテルペンの一例であり、カロテン（プロビタミンＡ１）はテトラテルペンである。
「テルペン前駆体」は、アセチルＣｏＡおよび任意にピルビン酸から開始したテルペンを形成する反応の間に産生される化合物または中間体物質である。この用語は、メバロン酸（ＭＶＡ）経路および任意にＤＸＳ経路に見いだされる前駆体化合物または中間体基質ならびにＦＰＰおよびＧＰＰなどの、より長鎖のテルペンの下流の前駆体を指す。特定の実施形態では、メバロン酸、ＩＰＰ、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）、ゲラニルピロリン酸(ＧＰＰ)およびファルネシルピロリン酸(ＦＰＰ)を含むが、これらに限定されない。
「ＤＸＳ経路」は、ピルビン酸およびＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸からＤＭＡＰＰまたはＩＰＰへの酵素的経路である。それはまた、デオキシキシルロース ５−リン酸（ＤＸＰ／ＤＸＰＳ／ＤＯＸＰまたはＤＸＳ）／メチルエリスリトール リン酸（ＭＥＰ）経路としても知られている。
「メバロン酸（ＭＶＡ）経路」は、アセチルＣｏａからＩＰＰまでの酵素的経路である。
微生物
２つのテルペン産生経路、解糖系における２つの重要な中間体基質であるピルビン酸およびＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）から開始するデオキシキシルロース ５−リン酸（ＤＸＰ／ＤＸＰＳ／ＤＯＸＰまたはＤＸＳ）／メチルエリスリトール リン酸（ＭＥＰ）経路（Ｈｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． ｃｈｅｍ． ２８２： ２１５７３−７７）、ならびにアセチルＣｏＡから開始するメバロン酸（ＭＶＡ）経路（Ｍｉｚｉｏｒｋｏ， ２０１１， Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ， ５０５： １３１−１４３）が知られている。多くの異なる分類の微生物が、これら経路のいずれかの存在について研究されている（Ｌａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００， ＰＮＡＳ， ９７： １３１７２−７７； Ｔｒｕｔｋｏ ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ７４： １５３−１５８； Ｊｕｌｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ７５： １３７７−８４）が、酸化炭素栄養性酢酸産生では研究されていなかった。たとえばＤＸＳ経路は、Ｅ．ｃｏｌｉ、 Ｂａｃｉｌｌｕｓ、またはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中に存在すると見出されており、一方メバロン酸経路は、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ、またはＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ中に存在する。
酸化炭素栄養性酢酸産生性Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉのゲノムは、２つの経路のいずれかの存在について本発明者らにより分析された。ＤＸＳ経路のすべての遺伝子は、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍおよびＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉで同定され（表１）、一方メバロン酸経路は存在しなかった。さらに、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ またはＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉなどの酸化炭素栄養性酢酸産生は、代謝最終産物としていずれのテルペンを産生することも知られていない。
Figure 2015519065
イソプレン単位からの下流のテルペン類合成のための遺伝子もまた両生物で同定された（表２）。
Figure 2015519065
テルペン類はエネルギー濃縮化合物であり、それらの合成は細胞がＡＴＰなどのヌクレオシド三リン酸の形態でエネルギーを費やす必要がある。基質としての糖の使用は、ＡＴＰのいくつかの分子を得るために解糖から供給される十分なエネルギーを必要とする。基質として糖を使用するＤＸＳ経路を介したテルペン類および／またはその前駆体の産生は、ピルビン酸およびＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）の利用可能性により相対的に単純な方法で進行し、Ｇ３ＰはＣ５ペントースおよびＣ６ヘキソース糖由来である。これらのＣ５およびＣ６分子はしたがって、テルペン類が構成されるＣ５イソプレン単位へと比較的簡単に変換される。
ＣＯまたはＣＯ２のようなＣ１基質を使用する嫌気的酢酸産生では、Ｃ１単位からのヘミテルペノイドなどの長い分子を合成することはより難しい。これは特に、Ｃ１０モノテルペン類、Ｃ１５セスキテルペン類、またはＣ４０テトラテルペン類などのより長鎖のテルペン類に当てはまる。これまでに酢酸産生菌（天然および組み換え微生物の両方）で報告された最も多くの炭素原子をもつ産物は、Ｃ４化合物のブタノール（Ｋoｐｋｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１１， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２２： ３２０−３２５； Ｓｃｈｉｅｌ−Ｂｅｎｇｅｌｓｄｏｒｆ ａｎｄ Ｄuｒｒｅ， ２０１２， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ： １０．１０１６／ｊ．ｆｅｂｓｌｅｔ．２０１２．０４．０４３； Ｋoｐｋｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． １０７： １３０８７−９２；米国特許第２０１１／０２３６９４１号）および２，３−ブタンジオール（Ｋoｐｋｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１１， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ７７：５４６７−７５）である。本発明者らは、アセチルＣｏＡ中間体を介してＣ１供給原料ＣＯを使用してこれらのより長鎖のテルペンを嫌気的に産生することが驚くべきことに可能であることを示した。
嫌気的酢酸産生菌のＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路のエネルギー論はちょうど明らかになりつつあるが、嫌気的増殖条件下または糖発酵生物の解糖とは異なり、基質レベルのリン酸化によるＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路ではＡＴＰを得ることはなく、実際ＣＯ２のギ酸への活性化は実質的に１分子のＡＴＰを必要とし、かつ膜勾配を必要とする。本発明者らは、産物の形成のための経路がエネルギー効率に優れていることが重要であると指摘する。本発明者らは、酢酸産生菌では基質ＣＯまたはＣＯ２はアセチルＣｏＡに直接運ばれ、これは特に糖系システムと比較した場合、６つの反応のみが必要であり、テルペン類および／またはそれらの前駆体への最も直接的な経路を表す（図１）ことを指摘する。嫌気的酢酸産生菌では利用可能なＡＴＰはより少ないが、本発明者らは、このより直接的な経路はより高い代謝の流れを持続する(中間体反応のより高い化学的推進力のため)と考える。テルペン生合成経路におけるいくつかの中間体、例えば重要な中間体であるメバロン酸およびＦＰＰ、は効率良く代謝回転されないと多くの細菌にとって毒性であるため、より高い代謝の流れは重要である。
より高いＡＴＰが利用可能であるにも関わらず、この中間体の毒性の問題は、糖からのテルペン産生における障害となり得る。
メバロン酸経路を介するＣＯからテルペン前駆体ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰ産生のエネルギー論をＤＸＳ経路と比較すると、メバロン酸経路はＡＴＰとしてより少ないヌクレオシド三リン酸塩を必要とし、等価物の還元がより少なく、かつアセチルＣｏＡから６つの反応ステップのみが必要でＤＸＳ経路と比べてより直接的でもあることを、本発明者らは指摘する。これは、反応および代謝流量の速度に利点を提供し、かつ総合的なエネルギー効率を増大させる。さらに、必要な酵素数がより少ないことは、組み換え微生物を産生するために必要とされる組み換え方法を簡易化する。
メバロン酸経路をもつ酢酸産生菌は同定されていないが、本発明者らは、メバロン酸経路および任意にＤＸＳ経路をＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍまたはＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉなどの酸化炭素栄養性酢酸産生菌に導入してＣ１炭素基質であるＣＯからテルペン類および／またはその前駆体を効率的に産生することが可能であることを示した。これはすべての酸化炭素栄養性酢酸産生微生物に適用可能であることが期待される。
さらに、テルペン類および／またはその前駆体の産生は、嫌気的条件下で組み換え微生物を使用して可能であるとは全く示されていなかった。イソプレンの嫌気的産生はより安全な操作環境を提供する利点を有する。なぜなら、イソプレンは酸素の存在下で非常に可燃性であり、室温および大気圧下では、１．５〜２．０％の引火下限界（ＬＦＬ）、および２．０〜１２％の引火上限界（ＵＦＬ）を有するからである。燃焼は酸素なしに起こることはないため、本発明者らは、嫌気的燃焼工程は、すべての生成物濃度、気体組成物、温度および圧力範囲に渡りより安全であるため、望ましいと考える。
本明細書で前述したように、本発明は、１つ以上のテルペン類および／またはその前駆体、ならびに任意に１つ以上の他の産物を、ＣＯを含む基質の発酵によって産生できる組み換え微生物を提供する。
さらなる実施形態では、微生物は、
メバロン酸（ＭＶＡ）経路由来の１つ以上の外来性酵素を発現し、かつ／またはメバロン酸（ＭＶＡ）経路由来の１つ以上の内在性酵素を過剰発現し；かつ
ａ）ＤＸＳ経路由来の１つ以上の外来性酵素を発現し、かつ／またはＤＸＳ経路由来の１つ以上の内在性酵素を過剰発現するように
適合される。
１つの実施形態では、組み換え微生物が由来する親微生物はＣＯを含む基質を発酵してアセチルＣｏＡを産生できるが、アセチルＣｏＡをメバロン酸またはイソペンチルピロリン酸（ＩＰＰ）に変換できず、かつ組み換え微生物はメバロン酸経路に関与する１つ以上の酵素を発現するよう適合される。
本微生物は、たとえば、微生物内の天然の遺伝子の発現を増大すること（たとえば、遺伝子発現を駆動するためにより強力なまたは構成的なプロモーターを導入することにより）と、酵素をコードしかつ酵素を発現するよう適合され外来性核酸を導入することにより特定の酵素をコードする遺伝子のコピー数を増大することと、親微生物中には天然に存在しない酵素をコードしかつ発現するよう適合された外来性核酸を導入することとを含む、任意の数の組み換え方法により１つ以上の酵素を発現しまたは過剰に発現するよう適合されてもよい。
１つの実施形態では、１つ以上の酵素はメバロン酸（ＭＶＡ）経路由来であり、かつ
ａ） チオラーゼ（ＥＣ ２．３．１．９）、
ｂ） ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ ２．３．３．１０）、
ｃ） ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ １．１．１．８８）、
ｄ） メバロン酸キナーゼ（ＥＣ ２．７．１．３６）、
ｅ） ホスホメバロン酸キナーゼ（ＥＣ ２．７．４．２）、
ｆ） ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．３３）、および
ｇ） 機能的に等価であるそれらのいずれかの変異体
からなる群から選択される。
さらなる実施形態では、任意の１つ以上の酵素はＤＸＳ経路由来であり、かつ
ａ） １−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ ＤＸＳ（ＥＣ：２．２．１．７）、
ｂ） １−デオキシ−Ｄ−キシルロース ５−リン酸レダクトイソメラーゼ ＤＸＲ（ＥＣ：１．１．１．２６７）、
ｃ） ２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール ４−リン酸シチジリルトランスフェラーゼ ＩｓｐＤ（ＥＣ：２．７．７．６０）、
ｄ） ４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール キナーゼ ＩｓｐＥ（ＥＣ：２．７．１．１４８）、
ｅ） ２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール ２，４−シクロ二リン酸シンターゼ ＩｓｐＦ（ＥＣ：４．６．１．１２）、
ｆ） ４−ヒドロキシ−３−メチルブタ −２−エン−１−イル 二リン酸シンターゼ ＩｓｐＧ（ＥＣ：１．１７．７．１）、
ｇ） ４−ヒドロキシ−３−メチルブタ −２−エニル 二リン酸レダクターゼ（ＥＣ：１．１７．１．２）、および
ｈ） 機能的に等価であるそれらのいずれかの変異体
からなる群から選択される。
さらなる実施形態では、１つ以上の外来性または内在性のさらなる酵素は、発現または過剰に発現されてテルペン化合物および／またはその前駆体の産生をもたらし、発現される外来性酵素、または過剰発現される内在性酵素は、
ａ） ゲラニルトランストランスフェラーゼ Ｆｐｓ（ＥＣ：２．５．１．１０）、
ｂ） ヘプタプレニル二リン酸シンターゼ（ＥＣ：２．５．１．１０）、
ｃ） オクタプレニル−二リン酸シンターゼ（ＥＣ：２．５．１．９０）、
ｄ） イソプレンシンターゼ（ＥＣ ４．２．３．２７）、
ｅ） イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ（ＥＣ ＥＣ ５．３．３．２）、
ｆ） ファルネセン シンターゼ（ＥＣ ４．２．３．４６ ／ ＥＣ ４．２．３．４７）、および
ｇ） 機能的に等価であるそれらのいずれかの変異体．
からなる群から選択される。
例示のためのみに、各酵素の配列情報が本明細書の図面に列挙される。
本発明の微生物中で使用される酵素は、細菌の異なる属および種、または他の生物を含む、任意の適切な供給源由来であってもよい。しかしながら、１つの実施形態では、酵素はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来である。
１つの実施形態では、酵素イソプレンシンターゼ（ｉｓｐＳ）は、Ｐｏｐｌａｒ ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ由来である。さらなる実施形態では、それは、以下の配列番号２１に例示される核酸配列、または機能的に等価なその変異体を有する。
１つの実施形態では、酵素デオキシキシルロース ５−リン酸シンターゼはＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ由来であり、以下の配列番号１に例示される核酸配列によりコードされおよび／または配列番号２に例示されるアミノ酸配列を有し、または機能的に等価なそれらの変異体である。
１つの実施形態では、酵素１−デオキシ−Ｄ−キシルロース ５−リン酸レダクトイソメラーゼ ＤＸＲはＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ由来であり、および配列番号３に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、酵素２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール ４−リン酸シチジリルトランスフェラーゼ ＩｓｐＤはＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ由来であり、かつ配列番号５に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、酵素４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール キナーゼ ＩｓｐＥはＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ由来であり、かつ配列番号７に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、酵素２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール ２，４−シクロ二リン酸シンターゼ ＩｓｐＦはＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ由来であり、かつ配列番号９に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、酵素４−ヒドロキシ−３−メチルブタ −２−エン−１−イル 二リン酸シンターゼ ＩｓｐＧはＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ由来であり、かつ配列番号１１に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、酵素４−ヒドロキシ−３−メチルブタ −２−エニル 二リン酸レダクターゼはＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ由来であり、かつ配列番号１３に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、酵素メバロン酸キナーゼ（ＭＫ）はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ Ｍｕ５０由来であり、かつ配列番号５１に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、酵素ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ Ｍｕ５０由来であり、かつ以下の配列番号５２に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、酵素ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭＤ）はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ Ｍｕ５０由来であり、かつ配列番号５３に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、酵素イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ（ｉｄｉ）はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ由来であり、かつ以下の配列番号５４に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、酵素チオラーゼ（ｔｈＩＡ）はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ ＡＴＣＣ８２４由来であり、かつ以下の配列番号４０に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、酵素はチオラーゼ酵素であり、かつＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ Ｍｕ５０由来のアセチル-CoA ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ｖｒａＢ）であり、かつ以下の配列番号４１に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、酵素３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ シンターゼ（ＨＭＧＳ）はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ Ｍｕ５０由来であり、かつ以下の配列番号４２に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、酵素ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡ レダクターゼ（ＨＭＧＲ）はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ Ｍｕ５０由来であり、かつ以下の配列番号４３に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、酵素ゲラニルトランストランスフェラーゼ（ｉｓｐＡ）はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｒ． Ｋ−１２ ｓｕｂｓｔｒ． ＭＧ１６５５由来であり、以下の配列番号５６に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、酵素ヘプタプレニル二リン酸シンターゼはＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ由来であり、かつ以下の配列番号１７に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、酵素ポリプレニルシンテターゼはＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ由来であり、かつ配列番号１９に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、酵素αファルネセンシンターゼ（ＦＳ）はＭａｌｕｓ ｘ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ由来であり、かつ以下の配列番号５７に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
微生物において使用する酵素および機能的変異体は、当業者に知られているアッセイにより同定してもよい。特定の実施形態では、酵素イソプレンシンターゼは、Ｓｉｌｖｅｒら （１９９１、 Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ９７： １５８８−１５９１）またはＺｈａｏら（２０１１、 Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ９０：１９１５-１９２２）によりまとめられた方法により同定されてもよい。さらなる特定の実施形態では、ファルネセンシンターゼは、Ｇｒｅｅｎら （２００７、 Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ； ６８： １７６−１８８）によりまとめられた方法により同定されてもよい。さらなる特定の実施形態では、メバロン酸経路に由来する酵素は、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼに関するＣａｂａｎｏら（１９９７、 Ｉｎｓｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２７： ４９９−５０５）による方法、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼおよびメバロン酸キナーゼに関するＭａらによる方法（２０１１、 Ｍｅｔａｂ． Ｅｎｇｉｎ．， １３：５８８-５９７）、ホスホメバロン酸キナーゼによるＨｅｒｄｅｎｄｏｒｆおよびＭｉｚｉｏｒｋｏによる方法（２００７、 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ４６： １１７８０−８）、ならびにジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼに関するＫｒｅｐｋｉｙらによる方法（２００４、 Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． １３： １８７５−１８８１）、Ｍａ らによる２０１１、 Ｍｅｔａｂ． Ｅｎｇｉｎ．， １３：５８８-５９７の方法により同定されてもよい。ＤＸＳ経路の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース ５−リン酸シンターゼは、Ｋｕｚｕｙａｍａら（２０００、 Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８２， ８９１−８９７）によりまとめられた方法を使用してアッセイできる。また、Ｔｒｕｔｋｏら（２００５、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ７４： １５３−１５８）により記載されるようにホスミドマイシンまたはメビロリン（ｍｅｖｉｎｏｌｉｎｅ）のような阻害剤を使用して、ＤＸＳ経路およびメバロン酸経路の遺伝子を同定することも可能である。
１つの実施形態では、微生物は、１つ以上の内在性核酸の発現を増大するよう適合された１つ以上の外来性核酸を含み、かつ１つ以上の内在性核酸は本明細書に前述される酵素のうちの１つ以上をコードする。１つの実施形態では、発現を増大するよう適合され１つ以上の外来性核酸は、調節要素である。１つの実施形態では、調節要素はプロモーターである。１つの実施形態では、プロモーターは、好ましくは適切な発酵条件下で高活性である構成的プロモーターである。誘導可能なプロモーターを使用することもできる。好ましい実施形態では、プロモーターは、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ遺伝子クラスターまたはホスホトランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼオペロンプロモーターを含む群から選択される。発現、好ましくは適切な発酵条件下での高レベルの発現を指揮できる他のプロモーターが、例示的な実施形態に代わるものとして有効であることは、当業者には理解できるであろう。
１つの実施形態では、微生物は、本明細書に前述された１つ以上の酵素をコードしかつ発現するよう適合され１つ以上の外来性核酸を含む。１つの実施形態では、微生物は、少なくとも２つの酵素をコードしかつ発現するよう適合され１つ以上の外来性核酸を含む。他の実施形態では、微生物は、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ以上の酵素をコードしかつ発現するよう適合され１つ以上の外来性核酸を含む。
１つの特定の実施形態では、微生物は、本発明の酵素または機能的に等価なその変異体をコードする１つ以上の外来性核酸を含む。
微生物は１つ以上の外来性核酸を含んでもよい。親微生物を２つ以上の遺伝子成分（遺伝子または調節要素（たとえばプロモーター）など）で形質転換することが望ましい場合、それらは１つ以上の外来性核酸に含まれてもよい。
１つの実施形態では、１つ以上の外来性核酸は核酸構築物またはベクターであり、１つの特定の実施形態では、任意の組み合わせで本明細書に記載される酵素の１つ以上をコードするプラスミドである。
外来性核酸は、親微生物の形質転換の際、染色体の外に保持してもよく、または親微生物のゲノムに統合してもよい。したがって、外来性核酸は、統合を支援するよう適合されたさらなるヌクレオチド配列（たとえば、宿主ゲノムへのホモログ組み換えおよび標的化した統合を可能にする領域）または、染色体外の構築物の発現および複製を支援するよう適合されたさらなるヌクレオチド配列（たとえば、複製起源、プロモーターおよび他の調節要素または配列）を含んでもよい。
１つの実施形態では、本明細書に前述した１つ以上の酵素をコードする外来性核酸は、外来性核酸によりコードされる１つ以上の酵素の発現を促進するよう適合されプロモーターをさらに含む。１つの実施形態では、プロモーターは、好ましくは適切な発酵条件下で高活性である構成的プロモーターである。誘導可能なプロモーターも使用できる。好ましい実施形態では、プロモーターは、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ遺伝子クラスターおよびホスホトランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼプロモーターを含む群から選択される。発現、好ましくは適切な発酵条件下での高レベルの発現を指示できる他のプロモーターが、例示した実施形態の代替方法として有効であることは、当業者には理解できるであろう。
１つの実施形態では、外来性核酸は発現プラスミドである。
１つの特定の実施形態では、親微生物がは酸化炭素栄養性酢酸産生細菌の群から選択される。特定の実施形態では、微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍａｇｎｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ ｂａｃｃｈｉｉ、Ｂｌａｕｔｉａ ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｏｖａｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｉｕｖｉを含む群から選択される。
１つの特定の実施形態では、親微生物は、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉおよび関連する単離菌を含む、エタノール産生、酢酸産生クロストリジウムのクラスターから選択される。これらは、限定するものではないが、株化細胞Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＪＡＩ−１Ｔ ＤＳＭ１００６１）［Ａｂｒｉｎｉ Ｊ， Ｎａｖｅａｕ Ｈ， Ｎｙｎｓ Ｅ−Ｊ： Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ， ｓｐ． ｎｏｖ．， ａｎ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈａｔ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ｅｔｈａｎｏｌ ｆｒｏｍ ｃａｒｂｏｎ ｍｏｎｏｘｉｄｅ． Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １９９４， ４： ３４５−３５１］、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＬＢＳ１５６０（ＤＳＭ１９６３０）［Ｓｉｍｐｓｏｎ ＳＤ， Ｆｏｒｓｔｅｒ ＲＬ， Ｔｒａｎ ＰＴ， Ｒｏｗｅ ＭＪ， Ｗａｒｎｅｒ ＩＬ： Ｎｏｖｅｌ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｈｅｒｅｏｆ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｐａｔｅｎｔ ２００９， ＷＯ／２００９／０６４２００］、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＬＢＳ１５６１（ＤＳＭ２３６９３）、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ ＰＥＴＣＴ（ＤＳＭ１３５２８ ＝ ＡＴＣＣ ５５３８３）［Ｔａｎｎｅｒ ＲＳ， Ｍｉｌｌｅｒ ＬＭ， Ｙａｎｇ Ｄ： Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ ｓｐ． ｎｏｖ．， ａｎ Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｃ Ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ ｒＲＮＡ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ Ｉ． Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９９３， ４３： ２３２−２３６］、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ ＥＲＩ−２（ＡＴＣＣ ５５３８０）［Ｇａｄｄｙ ＪＬ： Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔａｉｎ ｗｈｉｃｈ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｆｒｏｍ ｗａｓｔｅ ｇａｓｅｓ． ＵＳ ｐａｔｅｎｔ １９９７， ５，５９３，８８６］、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ Ｃ−０１ （ＡＴＣＣ ５５９８８）［Ｇａｄｄｙ ＪＬ， Ｃｌａｕｓｅｎ ＥＣ， Ｋｏ Ｃ−Ｗ： Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｓｏｌｖｅｎｔ ｆｏｒ ｉｔｓ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈ． ＵＳ ｐａｔｅｎｔ， ２００２， ６，３６８，８１９］、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ Ｏ−５２ （ＡＴＣＣ ５５９８９）［Ｇａｄｄｙ ＪＬ， Ｃｌａｕｓｅｎ ＥＣ， Ｋｏ Ｃ−Ｗ： Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｓｏｌｖｅｎｔ ｆｏｒ ｉｔｓ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈ． ＵＳ ｐａｔｅｎｔ， ２００２， ６，３６８，８１９］、Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉ Ｐ１１Ｔ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−６２２）［Ｈｕｈｎｋｅ ＲＬ， Ｌｅｗｉｓ ＲＳ， Ｔａｎｎｅｒ ＲＳ： Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ Ｓｐｅｃｉｅｓ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｐａｔｅｎｔ ２００８， ＷＯ ２００８／０２８０５５］、「Ｃ．ｃｏｓｋａｔｉｉ」［Ｚａｈｎ ｅｔ ａｌ − Ｎｏｖｅｌ ｅｔｈａｎｏｌｏｇｅｎｉｃ ｓｐｅｃｉｅｓ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｓｋａｔｉｉ （ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＵＳ２０１１０２２９９４７）］および「Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．」（Ｔｙｕｒｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１２， Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｒｅｓ． ４： １−１２）などの関連した単離菌、またはＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ ＯＴＡ−１（Ｔｉｒａｄｏ−Ａｃｅｖｅｄｏ Ｏ． Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ ｆｒｏｍ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｇａｓ Ｕｓｉｎｇ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ． ＰｈＤ ｔｈｅｓｉｓ， Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， ２０１０）などの変異株が挙げられる。これらの株は、クロストリジウムｒＲＮＡクラスター１内のサブクラスターを形成し、それらの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、３０％前後の同様の低ＧＣ含量を有し９９％超同一である。しかしながら、ＤＮＡ−ＤＮＡ再会合およびＤＮＡフィンガープリンティング実験は、これらの株は別々の種に属することを示した［Ｈｕｈｎｋｅ ＲＬ， Ｌｅｗｉｓ ＲＳ， Ｔａｎｎｅｒ ＲＳ： Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ Ｓｐｅｃｉｅｓ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｐａｔｅｎｔ ２００８， ＷＯ ２００８／０２８０５５］。
このクラスターのすべての種は、同様の形態およびサイズを有し（対数増殖期細胞は、０．５〜０．７×３〜５μｍである）中温性（最適増殖温度 ３０〜３７℃）および厳密に嫌気性である［Ｔａｎｎｅｒ ＲＳ， Ｍｉｌｌｅｒ ＬＭ， Ｙａｎｇ Ｄ： Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ ｓｐ． ｎｏｖ．， ａｎ Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｃ Ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ ｒＲＮＡ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ Ｉ． Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９９３， ４３： ２３２−２３６； Ａｂｒｉｎｉ Ｊ， Ｎａｖｅａｕ Ｈ， Ｎｙｎｓ Ｅ−Ｊ： Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ， ｓｐ． ｎｏｖ．， ａｎ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈａｔ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ｅｔｈａｎｏｌ ｆｒｏｍ ｃａｒｂｏｎ ｍｏｎｏｘｉｄｅ． Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １９９４， ４： ３４５−３５１； Ｈｕｈｎｋｅ ＲＬ， Ｌｅｗｉｓ ＲＳ， Ｔａｎｎｅｒ ＲＳ： Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ Ｓｐｅｃｉｅｓ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｐａｔｅｎｔ ２００８， ＷＯ ２００８／０２８０５５］。さらに、これらは、同じｐＨ範囲（ｐＨ４〜７．５、最適初期ｐＨ：５．５〜６）、同様の増殖率かつ主な発酵最終産物としてエタノールおよび酢酸を有する同様の代謝プロファイル、ＣＯ含有気体での強力な独立栄養性増殖、ならびに特定の条件下で形成される少量の２，３−ブタンジオールおよび乳酸、などの同様の主要な系統的な性質を共有する［Ｔａｎｎｅｒ ＲＳ， Ｍｉｌｌｅｒ ＬＭ， Ｙａｎｇ Ｄ： Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ ｓｐ． ｎｏｖ．， ａｎ Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｃ Ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ ｒＲＮＡ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ Ｉ． Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９９３， ４３： ２３２−２３６； Ａｂｒｉｎｉ Ｊ， Ｎａｖｅａｕ Ｈ， Ｎｙｎｓ Ｅ−Ｊ： Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ， ｓｐ． ｎｏｖ．， ａｎ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈａｔ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ｅｔｈａｎｏｌ ｆｒｏｍ ｃａｒｂｏｎ ｍｏｎｏｘｉｄｅ． Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １９９４， ４： ３４５−３５１； Ｈｕｈｎｋｅ ＲＬ， Ｌｅｗｉｓ ＲＳ， Ｔａｎｎｅｒ ＲＳ： Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ Ｓｐｅｃｉｅｓ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｐａｔｅｎｔ ２００８， ＷＯ ２００８／０２８０５５］。インドール産生もまた、３つすべての種で観察された。しかしながら、この種は、多様な糖（たとえばラムノース、アラビノース）、酸（たとえばグルコン酸、クエン酸）、アミノ酸（たとえば、アルギニン、ヒスチジン）、または他の基質（たとえばベタイン、ブタノール）の基質の利用において差異がある。さらに、一部の種は、特定のビタミン類（たとえばチアミン、ビオチン）に対する独立栄養生物であることが見いだされたが、そうでない種もある。
１つの実施形態では、親酸化炭素栄養性酢酸産生微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ ｂａｃｃｈｉｉ、Ｂｌａｕｔｉａ ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ、および Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｉｕｖｉからなる群から選択される。
第１または第２の態様の１つの特定の実施形態では、親微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍａｇｎｕｍを含む酸化炭素栄養性クロストリジウムの群から選択される。
１つの実施形態では、微生物は、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、および「Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉ」ならびに関連する単離菌を含む酸化炭素栄養性クロストリジウムのクラスターから選択される。これらは、限定するものではないが、細菌株Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＪＡＩ−１Ｔ（ＤＳＭ１００６１） （Ａｂｒｉｎｉ， Ｎａｖｅａｕ， ＆ Ｎｙｎｓ， １９９４）、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＬＢＳ１５６０（ＤＳＭ１９６３０）（ＷＯ／２００９／０６４２００）、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＬＢＳ１５６１（ＤＳＭ２３６９３）、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ ＰＥＴＣＴ（ＤＳＭ１３５２８ ＝ ＡＴＣＣ ５５３８３）（Ｔａｎｎｅｒ， Ｍｉｌｌｅｒ， ＆ Ｙａｎｇ， １９９３）、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ ＥＲＩ−２（ＡＴＣＣ ５５３８０）（米国特許第５，５９３，８８６号）、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ Ｃ−０１（ＡＴＣＣ ５５９８８）（米国特許第６，３６８，８１９号）、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ Ｏ−５２（ＡＴＣＣ ５５９８９）（米国特許第６，３６８，８１９号）、または 「Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉ Ｐ１１Ｔ」（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−６２２）（ＷＯ ２００８／０２８０５５）、ならびに「Ｃ． ｃｏｓｋａｔｉｉ」 （米国特許第２０１１／０２２９９４７号）、「Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ． ＭＴ３５１」（Ｍｉｃｈａｅｌ Ｔｙｕｒｉｎ ＆ Ｋｉｒｉｕｋｈｉｎ， ２０１２）などの関連する単離菌およびＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ ＯＴＡ−１（Ｔｉｒａｄｏ−Ａｃｅｖｅｄｏ Ｏ． Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ ｆｒｏｍ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｇａｓ Ｕｓｉｎｇ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ． ＰｈＤ ｔｈｅｓｉｓ， Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， ２０１０）などのそれらの変異株を含む。
ＤＮＡ−ＤＮＡ再会合およびＤＮＡフィンガープリンティングの実験により判定されるように別々の種類であるにも関わらずこれらの株は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子レベルで少なくとも９９％の同一性を有し、クロストリジウムｒＲＮＡクラスターＩ内のサブクラスターを形成する。（Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．， １９９４）（ＷＯ ２００８／０２８０５５、米国特許第２０１１／０２２９９４７号）
このクラスターの株は、同様の遺伝子型および表現型の両方を有し、共通の特徴により定義され、かつエネルギー保存および発酵代謝の同じ様式を共有する。このクラスターの株はシトクロムを欠いており、かつＲｎｆ複合体を介してエネルギーを保存する。
このクラスターの株は４．２ＭＢｐ前後のゲノムサイズを有し（Ｋoｐｋｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１０）かつ３２モル％前後のＧＣ組成物を有し（Ａｂｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， １９９４； Ｋoｐｋｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１０； Ｔａｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９３） （ＷＯ ２００８／０２８０５５； ＵＳ ｐａｔｅｎｔ ２０１１／０２２９９４７）、かつＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の酵素をコードする必須の重要な遺伝子オペロンが保存されている（一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼ、メチレン−テトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ、ホルミル−テトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、メチレン−テトラヒドロ葉酸レダクターゼ、および一酸化炭素デヒドロゲナーゼ／アセチル−ＣｏＡシンターゼ）、ヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、Ｒｎｆ複合体（ｒｎｆＣＤＧＥＡＢ）、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、アルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（Ｋoｐｋｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１０， ２０１１）。Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路遺伝子の組織化および数は、気体の取り込みに関与し、核酸およびアミノ酸配列において差異があるにも関わらず、すべての種において同じであることが見いだされている（Ｋoｐｋｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１１）。
これらの株は、同様の形態およびサイズを有し（対数増殖期細胞は、０．５〜０．７×３〜５μｍである）、中温性であり（最適な増殖温度３０〜３７℃）、かつ厳密に嫌気性である（Ａｂｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， １９９４； Ｔａｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９３）（ＷＯ ２００８／０２８０５５）。さらに、それらはすべて、同じｐＨ範囲（ｐＨ４〜７．５ 最適初期ｐＨ５．５〜６）、同様の増殖比率でＣＯ含有気体での強力な独立栄養性増殖、ならびにある条件下で形成される少量の２，３−ブタンジオールおよび乳酸を有する、主要な発酵の最終産物としてエタノールおよび酢酸を有する代謝プロファイル、などの同じの主要な系統発生性質を共有する（Ａｂｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， １９９４； Ｋoｐｋｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１１； Ｔａｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９３）。しかしながら、これらの種は、様々な糖（たとえばラムノース、アラビノース）、酸（たとえばグルコン酸、クエン酸）、アミノ酸（たとえばアルギニン、ヒスチジン）、または他の基質（たとえばベタイン、ブタノール）の基質の利用において差異がある。一部の種はあるビタミン類（たとえばチアミン、ビオチン）に対して栄養要求性であることが見出されているが、他の種はそうではない。対応するアルコールへのカルボン酸の還元が、様々なこれらの生物で示されている（Ｐｅｒｅｚ， Ｒｉｃｈｔｅｒ， Ｌｏｆｔｕｓ， ＆ Ａｎｇｅｎｅｎｔ， ２０１２）。
記載される特徴は、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍまたはＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉのような１つの生物に特異的ではなく、むしろ酸化炭素栄養性エタノール―合成クロストリジウムの一般的な特徴である。したがって、本発明は、性能に差異があるかもしれないが、これらの株全体で機能することが予測され得る。
本発明の組み換え酸化炭素栄養性酢酸産生微生物は、親酸化炭素栄養性酢酸産生微生物および１つ以上の外来性核酸から、組み換え微生物を産生するための当業者に知られている任意の数の技術を使用して、調製されてもよい。例としてのみであるが、形質転換（形質導入またはトランスフェクションを含む）は、エレクトロポレーション、電気融合、超音波処理、ポリエチレングリコール媒介形質転換、接合、または化学的および天然のコンピテンスにより達成されてもよい。適切な形質転換技術は例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ， Ｆｒｉｔｓｃｈ ＥＦ， Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ： Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｒｏｔａｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ， １９８９に記載される。
エレクトロポレーションは、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ （Ｋoｐｋｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１０； Ｌｅａｎｇ， Ｕｅｋｉ， Ｎｅｖｉｎ， ＆ Ｌｏｖｌｅｙ， ２０１２） （ＰＣＴ／ＮＺ２０１１／０００２０３； ＷＯ２０１２／０５３９０５）、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ（ＰＣＴ／ＮＺ２０１１／０００２０３； ＷＯ２０１２／０５３９０５）、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉ （Ｓｔｒaｔｚ， Ｓａｕｅｒ， Ｋｕｈｎ， ＆ Ｄuｒｒｅ， １９９４）またはＭｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ（Ｋｉｔａ ｅｔ ａｌ．， ２０１２）などのいくつかの酸化炭素栄養性酢酸産生菌について記載されており、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ（Ｍｅｒｍｅｌｓｔｅｉｎ， Ｗｅｌｋｅｒ， Ｂｅｎｎｅｔｔ， ＆ Ｐａｐｏｕｔｓａｋｉｓ， １９９２）、Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ（Ｊｅｎｎｅｒｔ， Ｔａｒｄｉｆ， Ｙｏｕｎｇ， ＆ Ｙｏｕｎｇ， ２０００）またはＣ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ（ＭＶ Ｔｙｕｒｉｎ， Ｄｅｓａｉ， ＆ Ｌｙｎｄ， ２００４）などの多くのクロストリジウム菌で用いられる標準の方法である。
電気融合は、酢酸産生菌Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ． ＭＴ３５１ について記載されている（Ｔｙｕｒｉｎ ａｎｄ Ｋｉｒｉｕｋｈｉｎ， ２０１２）。
プロファージ導入は、Ｃ．ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ（Ｐｒａｓａｎｎａ Ｔａｍａｒａｐｕ Ｐａｒｔｈａｓａｒａｔｈｙ， ２０１０， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ ２５７７５ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｕｔａｎｔｓ， Ｍａｓｔｅｒｓ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｋｅｎｔｕｃｋｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）の場合に同様に酸化炭素栄養性酢酸産生菌について記載されている。
接合は、酢酸産生菌Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（Ｈｅｒｂｅｒｔ， Ｏ’Ｋｅｅｆｆｅ， Ｐｕｒｄｙ， Ｅｌｍｏｒｅ， ＆ Ｍｉｎｔｏｎ， ２００３）およびＣ．ａｃｅｔｏｂｕｙｌｉｃｕｍ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ， Ｙｏｕｎｇ， ＆ Ｙｏｕｎｇ， １９９０）を含む多くの他のクロストリジウムに対して選択される方法として記載されている。
１つの実施形態では、親株は唯一の炭素およびエネルギー供給源としてＣＯを使用する。
１つの実施形態では、親微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉである。１つの特定の実施形態では、微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＤＳＭ２３６９３である。別の特定の実施形態では、微生物はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ ＤＳＭ１３５２８（またはＡＴＣＣ５５３８３）である。
核酸
本発明はまた、本発明の組換え微生物を作成するのに使用される１つ以上の核酸または核酸構築物を提供する。
１つの実施形態では、核酸はメバロン酸（ＭＶＡ）経路および任意にＤＸＳ経路の１つ以上の酵素をコードする配列を含み、微生物中で発現された場合ＣＯを含む基質の発酵により微生物に１つ以上のテルペン類および／またはその前駆体を産生させる。１つの特定の実施形態では、本発明は、微生物中で発現された場合ＣＯを含む基質の発酵により微生物に１つ以上のテルペン類および／またはその前駆体を産生させる、２つ以上の酵素をコードする核酸を提供する。１つの実施形態では、本発明の核酸は３つ、４つ、または５つ以上のそのような酵素をコードする。
１つの実施形態では、核酸によりコードされる１つ以上の酵素はメバロン酸（ＭＶＡ）経路由来であり、
ａ） チオラーゼ（ＥＣ ２．３．１．９）、
ｂ） ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ ２．３．３．１０）、
ｃ） ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ １．１．１．８８）、
ｄ） メバロン酸キナーゼ（ＥＣ ２．７．１．３６）、
ｅ） ホスホメバロン酸キナーゼ（ＥＣ ２．７．４．２）、
ｆ） ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．３３）、および
ｇ） 機能的に等価であるそれらのいずれかの変異体
からなる群から選択される。
さらなる実施形態では、核酸によりコードされる１つ以上の酵素はＤＸＳ経路由来であり、
ａ） １−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ ＤＸＳ（ＥＣ：２．２．１．７）、
ｂ） １−デオキシ−Ｄ−キシルロース ５−リン酸レダクトイソメラーゼ ＤＸＲ （ＥＣ：１．１．１．２６７）、
ｃ） ２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール ４−リン酸シチジリルトランスフェラーゼ ＩｓｐＤ（ＥＣ：２．７．７．６０）、
ｄ） ４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール キナーゼ ＩｓｐＥ（ＥＣ：２．７．１．１４８）、
ｅ） ２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール ２，４−シクロ二リン酸シンターゼ ＩｓｐＦ（ＥＣ：４．６．１．１２）、
ｆ） ４−ヒドロキシ−３−メチルブタ −２−エン−１−イル 二リン酸シンターゼ ＩｓｐＧ（ＥＣ：１．１７．７．１）、
ｇ） ４−ヒドロキシ−３−メチルブタ −２−エニル 二リン酸レダクターゼ（ＥＣ：１．１７．１．２）、および
ｈ） 機能的に等価であるそれらのいずれかの変異体
からなる群から選択される。
さらなる実施形態では、核酸は、発現または過剰に発現されてテルペン類化合物および／またはその前駆体の産生をもたらす１つ以上のさらなる酵素をコードし、発現される外来性酵素、または過剰発現される内在性酵素は、
ａ） ゲラニルトランストランスフェラーゼ Ｆｐｓ（ＥＣ：２．５．１．１０）、
ｂ） ヘプタプレニル二リン酸シンターゼ（ＥＣ：２．５．１．１０）、
ｃ） オクタプレニル−二リン酸シンターゼ（ＥＣ：２．５．１．９０）、
ｄ） イソプレンシンターゼ（ＥＣ ４．２．３．２７）、
ｅ） イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ（ＥＣ ＥＣ ５．３．３．２）
ｆ）ファルネセンシンターゼシンターゼ（ＥＣ ４．２．３．４６／ＥＣ ４．２．３．４７）、および
ｇ）機能的に等価なそれらのいずれかの変異体
からなる群から選択される。
上記酵素の各々をコードする例示的なアミノ酸配列および核酸配列は本明細書に提供され、または本明細書に前述されたようにＧｅｎＢａｎｋから取得できる。しかしながら、、本明細書、ＧｅｎＢａｎｋおよび他のデータベース、ならびに遺伝子コードに含まれる情報を考慮して、これらの酵素または機能的に等価なその変異体をコードする代替的な核酸配列は当業者に明らかである。
さらなる実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ ＡＴＣＣ８２４由来のチオラーゼ（ｔｈＩＡ）をコードする核酸は以下の配列番号４０に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
さらなる実施形態では、チオラーゼがＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ Ｍｕ５０由来のアセチル−ＣｏＡ ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ｖｒａＢ）である、チオラーゼをコードする核酸は、は以下の配列番号４１に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
さらなる実施形態では、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ Ｍｕ５０由来の３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ シンターゼ（ＨＭＧＳ）をコードする核酸は以下の配列番号４２に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
さらなる実施形態では、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ Ｍｕ５０由来のヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡ レダクターゼ（ＨＭＧＲ）をコードする核酸は以下の配列番号４３に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
さらなる実施形態では、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ Ｍｕ５０由来のメバロン酸キナーゼ（ＭＫ）をコードする核酸は以下の配列番号５１に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
さらなる実施形態では、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ Ｍｕ５０由来のホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）をコードする核酸は以下の配列番号５２に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
さらなる実施形態では、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｕｓ Ｍｕ５０由来のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭＤ）をコードする核酸は以下の配列番号５３に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
さらなる実施形態では、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ由来のデオキシキシルロース ５−リン酸シンターゼをコードする核酸は配列番号１に例示される核酸配列によりコードされおよび／または以下の配列番号２に例示されるアミノ配列を有し、または機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース ５−リン酸レダクトイソメラーゼ ＤＸＲ（ＥＣ：１．１．１．２６７）をコードする核酸は配列番号３の配列を有し、または機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール ４−リン酸シチジリルトランスフェラーゼ ＩｓｐＤ（ＥＣ：２．７．７．６０）をコードする核酸は配列番号５の配列を有し、または機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール キナーゼ ＩｓｐＥ（ＥＣ：２．７．１．１４８）をコードする核酸は配列番号７の配列を有し、または機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール ２，４−シクロ二リン酸シンターゼ ＩｓｐＦ（ＥＣ：４．６．１．１２）をコードする核酸は配列番号９の配列を有し、または機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、４−ヒドロキシ−３−メチルブタ −２−エン−１−イル 二リン酸シンターゼ ＩｓｐＧ（ＥＣ：１．１７．７．１）をコードする核酸は配列番号１１の配列を有し、または機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、４−ヒドロキシ−３−メチルブタ −２−エニル 二リン酸レダクターゼ（ＥＣ：１．１７．１．２）をコードする核酸は配列番号１３の配列を有し、または機能的に等価なその変異体である。
さらなる実施形態では、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｒ． Ｋ−１２ ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５由来のゲラニルトランストランスフェラーゼ（ｉｓｐＡ）をコードする核酸は以下の配列番号５６に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、ヘプタプレニル二リン酸シンターゼをコードする核酸は配列番号１７の配列を有し、または機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、オクタプレニル−二リン酸シンターゼがポリプレニルシンテターゼであるオクタプレニル−二リン酸シンターゼ（ＥＣ：２．５．１．９０）をコードする核酸は配列番号１９によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、Ｐｏｐｌａｒ ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ由来のイソプレンシンターゼ（ｉｓｐＳ）をコードする核酸は以下の配列番号２１に例示され、または機能的に等価なその変異体である。
さらなる実施形態では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ由来のイソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ（ｉｄｉ）をコードする核酸は配列番号５４に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
さらなる実施形態では、Ｍａｌｕｓ ｘ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ由来のαファルネセンシンターゼ（ＦＳ）をコードする核酸は以下の配列番号５７に例示される核酸配列によりコードされ、または機能的に等価なその変異体である。
１つの実施形態では、本発明の核酸はプロモーターをさらに含む。１つの実施形態では、プロモーターはその制御下で遺伝子の構成的発現を可能にする。しかしながら、誘導可能なプロモーターを使用してもよい。当業者は、本発明に使用される適切なプロモーターを容易に理解するものである。好ましくは、プロモーターは、適切な発酵条件下で高レベルの発現を導くことができる。特定の実施形態では、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌクラスタープロモーターを使用する。別の実施形態では、ホスホトランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼプロモーターを使用する。別の実施形態では、ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼプロモーター、Ｒｎｆ複合オペロンプロモーターまたはＡＴＰシンターゼオペロンプロモーターを使用する。１つの特定の実施形態では、プロモーターはＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ由来である。
本発明の核酸は、親微生物の形質転換の際、染色体の外に保持してもよく、または微生物のゲノム中に統合するよう適合させてもよい。したがって、本発明の核酸は、統合を支援するよう適合された追加的なヌクレオチド配列（たとえば、相同組み換えおよび宿主ゲノムへの標的化統合を可能にする領域）、または染色体外構築物の安定な発現および複製を支援するように適合された追加的なヌクレオチド配列（たとえば、複製起源、プロモーター、および他の制御配列）を含んでもよい。
１つの実施形態では、核酸は、核酸構築物またはベクターである。１つの特定の実施形態では、核酸構築物またはベクターは発現構築物またはベクターであるが、クローニングに使用されるような他の構築物およびベクターも本発明に含まれる。１つの特定の実施形態では、発現構築物またはベクターはプラスミドである。
本発明の発現構築物／ベクターは、もし望ましい場合、さらなるタンパク質の発現に適した追加的な遺伝子ならびにプロモーターに加えて、任意の数の調節要素を含んでもよい。１つの実施形態では、発現構築物／ベクターは、１つのプロモーターを含む。別の実施形態では、発現構築物／ベクターは、２つ以上のプロモーターを含む。１つの特定の実施形態では、発現構築物／ベクターは、発現される各遺伝子に対する１つのプロモーターを含む。１つの実施形態では、発現構築物／ベクターは、１つ以上のリボソーム結合部位、好ましくは発現する各遺伝子に対するリボソーム結合部位を含む。
本明細書に記載される核酸配列および構築物／ベクター配列は、リボソーム結合部位および／または制限部位に必要であるもののような、標準的なリンカーヌクレオチドを含んでもよいことは当業者に明らかである。このようなリンカー配列は、必要であると解釈されるべきではなく、また定義した配列を限定するものではない。
本発明の発現構築物／ベクターを含む、核酸および核酸構築物は、標準的な先行技術のいずれかを使用して構築されてもよい。たとえば、化学的合成または組み換え技術を使用してもよい。このような技術は、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋらにより（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９）に記載されている。さらなる例示的な技術は、以下の本明細書の実施例部分に記載される。本質的に、個々の遺伝子および調節要素は、遺伝子が発現されて所望のタンパク質を形成するようお互いに操作可能に結合されている。本発明の使用に適切なベクターは、当業者に理解されている。しかしながら、例として、以下のベクターが適切であろう：ｐＭＴＬ８００００ベクター、ｐＩＭＰ１、ｐＪＩＲ７５０、および以下の本明細書の実施例に例示されるプラスミド。
本発明の核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはｃＤＮＡを含む任意の適切な形態であってもよいことは明らかである。
本発明はまた、本明細書に記載される核酸のいずれかの１つ以上を含む、ウイルス、細菌、および酵母を含む宿主生物、特に微生物を提供する。
生物産生方法
１つ以上の外来性核酸は、裸核酸として親微生物に送達されてもよく、または形質転換工程を促進するために１つ以上の薬剤と製剤化されてもよい（たとえば、リポソーム結合核酸、核酸が含まれる生物）。１つ以上の核酸は、適切なように、ＤＮＡ、ＲＮＡ，またはその組み合わせであってもよい。制限酵素を特定の実施形態で使用してもよい；たとえば、Ｍｕｒｒａｙ， Ｎ．Ｅ．らによる（２０００） Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ． Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． ６４， ４１２．参照。
本発明の微生物は、親微生物および１つ以上の外来性核酸から、組み換え微生物を産生するための任意の先行技術を使用して調製されてもよい。例として、形質転換（形質誘導またはトランスフェクション）は、エレクトロポレーション、超音波処理、ポリエチレングリコール媒介形質転換、または化学的もしくは天然のコンピテンス、または接合により達成されてもよい。適切な形質転換技術は、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ， Ｆｒｉｔｓｃｈ ＥＦ， Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ： Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｒｏｔａｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ， １９８９．に記載される。
特定の実施形態では、形質転換される微生物中で活性な制限系のため、微生物に導入される核酸をメチル化する必要がある。これは以下に記載される技術を含む様々な技術を使用して行うことができ、かつ以下の本明細書の実施例にさらに例示される。
例として、１つの実施形態では、本発明の組換え微生物は、以下のステップ：
ｂ）（ｉ）本明細書に記載される発現構築物／ベクターおよび（ｉｉ）メチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むメチル化構築物／ベクターのシャトル微生物への導入；
ｃ）メチルトランスフェラーゼの発現；
ｄ）シャトル微生物由来の１つ以上の構築物／ベクターの単離；
ｅ）１つ以上の構築物／ベクターの目的微生物への導入
を含む方法により産生される。
１つの実施形態では、ステップＢのメチルトランスフェラーゼ遺伝子は構成的に発現される。別の実施形態では、ステップＢのメチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現は誘導される。
シャトル微生物は、微生物、好ましくは、発現構築物／ベクターを構成する核酸配列のメチル化を促進する、制限陰性の微生物である。特定の実施形態では、シャトル微生物は、制限陰性のＥ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ、またはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓである。
メチル化構築物／ベクターは、メチルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を含む。
発現構築物／ベクターおよびメチル化構築物／ベクターがシャトル微生物に導入されると、メチル化構築物／ベクター上に存在するメチルトランスフェラーゼ遺伝子が誘導される。本発明の１つの特定の実施形態では、メチル化構築物／ベクターは、誘導可能なｌａｃプロモーターを含み、かつラクトースまたはその類似体、より好ましくはイソプロピル―β―Ｄ−チオ―ガラクトシド（ＩＰＴＧ）の添加により誘導されるが、誘導は任意の適切なプロモーター系によるものであってもよい。他の適切なプロモーターは、ａｒａ、ｔｅｔ、またはＴ７システムを含む。本発明のさらなる実施形態では、メチル化構築物／ベクタープロモーターは構成的プロモーターである。
特定の実施形態では、メチル化構築物／ベクター上に存在する任意の遺伝子がシャトル微生物で発現されるように、メチル化構築物／ベクターはシャトル微生物のアイデンティティーに特異的な複製起源を有する。好ましくは、発現構築物上に存在する任意の遺伝子が目的微生物で発現されるように、発現構築物／ベクターは、目的微生物のアイデンティティーに特異的な複製起源を有する。
メチルトランスフェラーゼ酵素の発現は、発現構築物／ベクター上に存在する遺伝子のメチル化をもたらす。発現構築物／ベクターはその後、任意の既知の方法にしたがいシャトル微生物から単離されてもよい。例として、本明細書の実施例に記載される方法を使用して発現構築物／ベクターを単離してもよい。
１つの特定の実施形態では、構築物／ベクターのいずれもが共に単離されてもよい。
発現構築物／ベクターは、任意の既知の方法を使用して目的微生物に導入されてもよい。しかしながら、例として、以下の実施例に記載される方法を使用してもよい。発現構築物／ベクターはメチル化されるため、発現構築物／ベクター上に存在する核酸配列は目的微生物に組み込まれることができ、かつうまく発現される。
メチルトランスフェラーゼ遺伝子がシャトル微生物に導入されかつ過剰に発現されることが予想される。したがって、１つの実施形態では、結果として得られるメチルトランスフェラーゼ酵素を知られている方法を使用して収集し、発現プラスミドをメチル化するために体外で使用してもよい。発現構築物／ベクターはそれから発現用の目的微生物に導入されてもよい。別の実施形態では、メチルトランスフェラーゼ遺伝子がシャトル微生物のゲノムに誘導された後、シャトル微生物への発現構築物／ベクターの導入、シャトル微生物からの１つ以上の構築物／ベクターの単離を行い、その後、目的微生物への発現構築物／ベクターの導入が行われる。
上に定義される発現構築物／ベクターおよびメチル化構築物／ベクターが組み合わされて当該の組成物を提供してもよいことが予想される。このような組成物は、制限障壁機構を回避して本発明の組換え微生物を産生するために特に有用である。
１つの特定の実施形態では、発現構築物／ベクターおよび／またはメチル化構築物／ベクターはプラスミドである。
本発明の微生物を産生するのに用いられる多くの適切なメチルトランスフェラーゼが当業者には明らかである。しかしながら、例として、枯草菌ファージ ΦＴ１ メチルトランスフェラーゼおよび以下の本明細書の実施例に記載されるメチルトランスフェラーゼが使用されてもよい。１つの実施形態では、メチルトランスフェラーゼは配列番号６０のアミノ酸配列を有し、または機能的に等価なその変異体である。所望のメチルトランスフェラーゼ配列および遺伝子コードを考慮して、適切なメチルトランスフェラーゼをコードする核酸は明らかである。１つの実施形態では、メチルトランスフェラーゼをコードする核酸は、以下の本明細書の実施例に記載されている通りである（たとえば、配列番号６３の核酸、または機能的に等価なその変異体である）。
メチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を可能にするよう適合され任意の数の構築物／ベクターを使用して、メチル化構築物／ベクターを生成してもよい。しかしながら、例として、以下の実施例に記載されるプラスミドを使用してもよい。
産生方法
本発明は、本発明の組換え微生物を使用してＣＯを含む基質を発酵することを含む微生物発酵により、１つ以上のテルペン類および／またはその前駆体、ならびに任意に１つ以上の他の産物を産生する方法を提供する。好ましくは、１つ以上のテルペンおよび／またはその前駆体は、主要な発酵産物である。本発明の方法は、工業工程由来の大気中炭素の排出の総量を低減するために使用してもよい。
好ましくは、発酵は、本発明の組換え微生物を使用して、生物反応器中で基質を嫌気的に発酵して少なくとも１つ以上のテルペン類および／またはその前駆体を産生するステップを含む。
１つの実施形態では、１つ以上のテルペン類および／またはその前駆体は、メバロン酸、ＩＰＰ、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）、イソプレン、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）、およびファルネセンから選択される。
テルペノイドの重要な中間体ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰから直接イソプレンを産生しその後これを用いてより長鎖のテルペン類を合成する代わりに、直接ゲラニルトランストランスフェラーゼを介して、Ｃ１０モノテルペノイド類またはＣ１５セスキテルペノイド類などのより長鎖のテルペン類を合成することも可能である（表６参照）。Ｃ１５セスキテルペノイド構築ブロックファルネシル―ＰＰからファルネセンを産生することが可能であり、これは、エタノールと同様に、輸送燃料として使用できる。
１つの実施形態では、本方法は、
（ａ）本発明の１つ以上の微生物の培養物を含む生物反応器にＣＯを含む基質を提供するステップ；および
（ｂ）生物反応器の培養物を嫌気的に発酵して少なくとも１つのテルペンおよび／またはその前駆体を産生するステップと
を含む。
１つの実施形態では、本方法は、
ａ）工業的工程の結果として産生されたＣＯ含有気体を補足することと、
ｂ）本発明の１つ以上の微生物を含む培養による、少なくとも１つ以上のテルペンおよび／またはその前駆体を産生するためのＣＯ含有気体の嫌気的発酵のステップ
を含む。
本発明の１つの実施形態では、微生物により発酵される気体状の基質は、ＣＯを含む気体の基質である。気体状の基質は工業工程の副産物として得られる廃ガスを含むＣＯであってもよく、または自動車の排気煙霧由来などのいくつかの他の供給源由来であってもよい。ある実施形態では、工業工程は、製鋼などの鉄金属製品製造、非鉄製品の製造、石油精製工程、石炭の気化、電力生成、カーボンブラック生成、アンモニア生成、メタノール産生および石炭製造からなる群から選択される。これらの実施形態では、ＣＯ含有気体は、任意の便利な方法を使用して、大気中に排出される前に工業工程から補足されてもよい。ＣＯは合成ガス（一酸化炭素および水素を含む気体）の成分であってもよい。工業工程から生成したＣＯは通常燃焼されてＣＯ２を産生する。したがって本発明は、ＣＯ２温室ガスの放出を低減しかつバイオ燃料として使用するテルペンを産生するのに特に有用である。気体状のＣＯ含有基質の組成に応じて、発酵にこの基質を導入する前に、ダスト粒子などの望ましくない不純物を除去するよう処置することもまた望ましい。たとえば、気体状の基質は、知られている方法を使用して濾過され、または洗浄されてもよい。
細菌の増殖および少なくとも１つ以上のテルペンおよび／またはその前駆体に応じたＣＯを発生するために、ＣＯ含有基質の気体に加え、適切な液体栄養培地が生物反応器に供給される必要があることが理解されるであろう。基質および培地は、連続形態、バッチ、またはバッチ供給形態で生物反応器に供給されてもよい。栄養培地は、使用される微生物の増殖を可能にするために十分なビタミン類および無機類を含む。ＣＯを使用するテルペンおよび／またはその前駆体を産生するための発酵に適した嫌気性培地は当業者に知られている。たとえば、適切な培地は、Ｂｉｅｂｅｌ（２００１）に記載される。本発明の１つの実施形態では、培地は、以下の本明細書の実施例に記載される通りである。
発酵は、少なくとも１つ以上のテルペンおよび／またはその前駆体の発酵に応じたＣＯを発生させるための適切な条件下で行われることが望ましい。考慮されるべき反応条件としては、圧力、温度、ガス流量、液体流量、培地のｐＨ、培地の酸化還元電位、撹拌速度（もし連続撹拌タンクリアクターが使用される場合）、接種レベル、液相中のＣＯが制限されないことを保証するための最大気体基質濃度、および産生物阻害を回避するための最大産生物濃度が挙げられる。
その上、多くの場合、基質の流れのＣＯ濃度（または気体状基質中のＣＯ分圧）を増大させ、それによりＣＯが基質である発酵反応の効率を増大させることが望ましい。増大した圧力で操作することにより、気相から液相へＣＯ移送の速度が著しく増大し、少なくとも１つ以上のテルペンおよび／またはその前駆体の産生のための炭素供給源としてＣＯが微生物に取り込まれ得る。このことはまた、生物反応器が大気圧よりも高い圧力で維持される場合、保持時間（入力した気体の流量で割った生物反応器の液体容量として定義される）が、低減できることを意味する。最適反応条件は、使用される本発明の特定の微生物に部分的に依存する。しかしながら、一般的に、大気圧よりも高い圧力で発酵を実施することが好ましい。また、ＣＯから１つ以上のテルペンおよび／またはその前駆体への与えられる変換比率は部分的に基質の保持時間の関数に依存し、また所望の保持時間を達成することが今度は必要とされる生物反応器の容量を決定づけるため、加圧したシステムの使用により必要とされる生物反応器の容量を大きく低減でき、その結果発酵器具の資本費用を大きく低減できる。米国特許第５，５９３，８８６号に開示される実施例にしたがって、生物反応器の容量はリアクターの作動圧力の増大に対して直線的比率で低減できうる。すなわち、１０大気圧で作動する生物反応器は、１大気圧で作動する生物反応器の１／１０の容量のみを必要とする。
例として、増加された圧力において気体からエタノールへの発酵を実施する利点が記載されている。たとえば、国際公開公報第０２／０８４３８号は、３０ｐｓｉｇおよび７５ｐｓｉｇの圧力下で気体からエタノールへの発酵を実施し、それぞれ１５０ｇ／日、３６９ｇ／日の生産性でエタノールを得る。しかしながら、同様の媒体および投入気体組成物を使用して大気圧で実施した発酵の例では、１日に１リットルあたり１０〜２０倍少ないエタノールが産生されることがわかった。
また、ＣＯ含有気体状基質の導入速度は、液相のＣＯ濃度が制限されないことを保証するようなものであることが望ましい。これは、ＣＯが限定される条件の結果、１つ以上の産生物が培養に消費され得ることによるものである。
発酵反応への供給に使用される気体流の組成は、反応の効率および／または費用に著しく影響する。たとえば、Ｏ２は、嫌気的発酵工程の効率を低減する。発酵の前後の発酵工程の段階における望ましくないまたは不必要な気体の処理は、このような段階の負担を増大させる可能性がある（たとえば、気体流が生物反応器に入る前に圧縮される場合、発酵には必要ではない気体を圧縮するために不必要なエネルギーが使用される）。したがって、基質の流れ、特に工業供給源由来の基質の流れを処置して望ましくない成分を除去し、かつ望ましい成分の濃度を増大させることが望ましい。
ある実施形態では、本発明の細菌の培養物は水性培養培地に維持される。好ましくは、水性培養培地は最小嫌気性細菌増殖培地である。適切な培地は当業者に知られており、例えば米国特許第５，１７３，４２９号、同第５，５９３，８８６号、および国際公開公報第０２／０８４３８号に記載され、および本明細書で以下の実施例に記載される通りである。
テルペン類および／もしくはその前駆体、または１つ以上のテルペン類、その前駆体、および／または１つ以上の他の産物を含む混合流は、分別蒸留または蒸発、浸透気化法、気体のストリッピングおよび液体―液体抽出などを含む抽出発酵などの、当業者に知られている方法により発酵ブロスから回収されてもよい。
本発明のある好ましい実施形態では、１つ以上のテルペンおよび／またはその前駆体ならびに１つ以上の産物は、生物反応器からブロスの一部を連続的に除去し、微生物細胞をブロスから（濾過により簡便に）分離し、およびブロスから１つ以上の産物を回収することにより、発酵ブロスから回収される。アルコールは、たとえば蒸留により簡便に回収される。アセトンは、たとえば蒸留により回収されてもよい。産生された任意の酸は、たとえば活性炭への吸着により回収されてもよい。分離された微生物細胞は、好ましくは発酵生物反応器に戻される。任意のアルコールおよび酸が除去された後に残存する細胞を含まない透過物もまた、好ましくは発酵生物反応器に戻される。生物反応器に戻す前に、栄養培地を補充するために追加的な栄養物（ビタミンＢなど）が細胞を含まない透過物に添加されてもよい。
また、ブロスのｐＨが活性炭への酢酸の吸収を高めるために上述のように調節された場合、ｐＨは、生物反応器に戻す前に、発酵生物反応器中のブロスのｐＨと同様のｐＨに再調節されるべきである。
実施例
本発明を以下の限定する意味を持たない実施例を参照してより詳細に記載する。
実施例１：ＣＯからのイソプレン産生のためのＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍでのイソプレンシンターゼの発現
本発明者らは、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍおよびＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉなどの酸化炭素栄養性酢酸産生菌におけるテルペン生合成遺伝子を同定した。組み換え微生物を、イソプレンを産生するように改変した。イソプレンは、ポプラなどのいくつかの植物から、ＵＶ放射から葉を保護するため天然に発せられる。ポプラのイソプレンシンターゼ（ＥＣ ４．２．３．２７）遺伝子を、コドンを最適化して、ＣＯからイソプレンを産生するように酸化炭素栄養性酢酸産生菌Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍに導入した。この酵素は、テルペノイド生合成の鍵となる中間体ＤＭＡＰＰ（ジメチルアリル二リン酸）を不可逆反応でイソプレンに変換する（図１）。
株および増殖条件：
すべてのサブクローニングステップを、以前に記載された標準的な株および増殖条件を使用してＥ．ｃｏｌｉで実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｒｏｔａｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ， １９８９； Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ， Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｌｔｄ．， Ｈｏｂｏｋｅｎ， １９８７）。
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＤＳＭ１００６１およびＤＳＭ２３６９３（ＤＳＭ１００６１誘導体）を、ＤＳＭＺ（Ｔｈｅ Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａsｅ ７ Ｂ， ３８１２４、ドイツブラウンシュヴァイク市）から取得した。増殖を、厳密な嫌気的条件および技術を使用して３７℃で実行した（Ｈｕｎｇａｔｅ， １９６９， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ． ３Ｂ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： １１７−１３２； Ｗｏｌｆｅ， １９７１， Ａｄｖ． Ｍｉｃｒｏｂ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ６： １０７−１４６）。酵母抽出物を含まない化学的に定義されたＰＥＴＣ培地（表１）ならびに唯一の炭素およびエネルギー供給源として、製鋼排ガスを含む３０ｐｓｉの一酸化炭素（ニュージーランドＧｌｅｎｂｒｏｏｋのＮｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｓｔｅｅｌで収集、組成：４４％ ＣＯ、３２％ Ｎ２、２２％ ＣＯ２、２％ Ｈ２）
を使用した。
Figure 2015519065
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発現プラスミドの構築：
本発明では、標準的な組み換えＤＮＡおよび分子クローニング技術を使用した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ， Ｆｒｉｔｓｃｈ ＥＦ， Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ： Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ， １９８９； Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ， Ｂｒｅｎｔ Ｒ， Ｋｉｎｇｓｔｏｎ ＲＥ， Ｍｏｏｒｅ ＤＤ， Ｓｅｉｄｍａｎ ＪＧ， Ｓｍｉｔｈ ＪＡ， Ｓｔｒｕｈｌ Ｋ： Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｌｔｄ．， Ｈｏｂｏｋｅｎ， １９８７）。Ｐｏｐｌａｒ ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓのイソプレンシンターゼ（ＡＡＱ１６５８８．１； ＧＩ：３３３５８２２９）を、コドンを最適化して（配列番号２１）合成した。Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼのプロモーター領域（配列番号２２）を使用してこの遺伝子を発現した。
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＤＳＭ２３６９３由来のゲノムＤＮＡを、ＢｅｒｔｒａｍとＤuｒｒｅ（１９８９）による方法の改変法を使用して単離した。１晩培養した１００ｍｌの培養物を回収し（６，０００×ｇ、１５分、４℃）、リン酸カリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．５）で洗浄して１．９ｍｌのＳＴＥ緩衝液（５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２００ｍＭ スクロース；ｐＨ８．０）に懸濁した。３００μｌのリゾチーム（〜１００，０００Ｕ）を添加して混合物を３７℃で３０分間インキュベートした後、２８０μｌの１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ溶液を添加し、さらに１０分間インキュベートした。２４０μｌのＥＤＴＡ溶液（０．５Ｍ、ｐＨ８）、２０μｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１Ｍ、ｐＨ７．５）、および１０μｌ ＲＮａｓｅ Ａ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加することによりＲＮＡを室温でs消化した。その後、１００μｌのプロテイナーゼＫ（０．５Ｕ）を添加し、タンパク質の分解を３７℃で１〜３時間行った。最終的に、６００μｌの過塩素酸ナトリウム（５Ｍ）を添加し、その後フェノール―クロロホルム抽出およびイソプロパノール沈殿を行った。ＤＮＡの定量および定性分析を分光測定で行った。ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ のプロモーター配列を、オリゴヌクレオチドＰｐｆｏｒ−ＮｏｔＩ−Ｆ（配列番号：２３：ＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＡＡＴＡＧＴＴＧＡＴＡＡＴＡＡＴＧＣ）およびＰｐｆｏｒ−ＮｄｅＩ−Ｒ（配列番号：２４：ＴＡＣＧＣＡＴＡＴＧＡＡＴＴＣＣＴＣＴＣＣＴＴＴＴＣＡＡＧＣ）を使用し、ｉＰｒｏｏｆ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびを以下のプログラムを使用するＰＣＲにより増幅した、そして最初の変性（９８℃、３０秒）、続いて３２周期の変性（９８℃、１０秒間）、アニーリング（５０〜６２℃、３０〜１２０秒）および伸長（７２℃、３０〜９０秒）、その後の最終伸長ステップ（７２℃、１０分間）。
イソプレンシンターゼ発現プラスミドの構築：
発現プラスミドの構築を、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５α−Ｔ１Ｒ（体外ｇｅｎ）およびＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’ Ｋａｎ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で実施した。第１のステップで、増幅したＰｐｆｏｒプロモーター領域をＮｏｔＩおよびＮｄｅＩ制限部位を使用してＥ．ｃｏｌｉ−ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍシャトルベクターｐＭＴＬ８５１４１ （ＦＪ７９７６５１．１； Ｎｉｇｅｌ Ｍｉｎｔｏｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ； Ｈｅａｐ ｅｔ ａｌ．， ２００９）にクローニングし、プラスミドｐＭＴＬ８５１４６を産生した。第２のステップとして、ｉｓｐＳを制限部位ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩを使用してｐＭＴＬ８５１４６にクローニングし、プラスミドｐＭＴＬ ８５１４６−ｉｓｐＳを得た（図２、配列番号２５）。
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍでの形質転換および発現
形質転換の前に、米国特許公開公報第２０１１／０２３６９４１号に記載されるように、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉおよびＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ由来のメチルトランスフェラーゼ遺伝子から設計したメチル化プラスミド（配列番号６４）上に共発現される、合成したハイブリッドタイプＩＩメチルトランスフェラーゼ（配列番６３）を使用して、ＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ中で生体内でメチル化した。
発現プラスミドおよびメチル化プラスミドの両方を、制限陰性のＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’ Ｋａｎ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の同じ細胞に形質転換したが、これは、それらのグラム−（−）複製起源の適合性（発現プラスミドにおける高コピーのColE1およびメチル化プラスミドにおける低コピーのｐ１５Ａ）により可能である。生体内メチル化を１ｍＭのＩＰＴＧの添加により誘導し、メチル化プラスミドをＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して単離した。この結果として得られる混合物を、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＤＳＭ２３６９３での形質転換の実験に使用したが、多量（高コピー）発現プラスミドのみがクロストリジウム中での複製を可能にするグラム−（＋）複製起源（ｒｅｐＬ）を有する。
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍへの形質転換：
すべての形質転換の実験の間、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＤＳＭ２３６９３は、１ｇ／Ｌの酵母抽出物および１０ｇ／ｌのフルクトースならびに炭素供給源として３０ｐｓｉの製鋼排ガス（ニュージーランドＧｌｅｎｂｒｏｏｋのＮｅｗ ＺＥａｌａｎｄ Ｓｔｅｅｌから収集、組成：４４％ ＣＯ、３２％ Ｎ２、２２％ ＣＯ２、２％ Ｈ２）で補足されたＰＥＴＣ培地（表１）中で増殖させた。
コンピテント細胞を作製するために、５０ｍｌのＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＤＳＭ２３６９３培養物を、新鮮な培地に継代し３日間連続で継代
培養した。これらの細胞を使用して、４０ｍＭのＤＬ−スレオニンを含む５０ｍｌのＰＥＴＣ培地に０．０５のＯＤ６００ｍで播種した。培養物のＯＤ６００ｍが０．４に達した際に、細胞を嫌気チャンバーに移し、４，７００×ｇおよび４℃で収集した。この培養物を、氷冷したエレクトロポレーションバッファー（２７０ｍＭ スクロース、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、７ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）で２回洗浄し、最終的に６００μｌの新鮮なエレクトロポレーションバッファー懸濁した。この混合物を、メチル化プラスミド混合物１μｇを含む０．４ｃｍの電極ギャップをもつあらかじめ氷冷したエレクトロポレーションキュベットに移し、すぐに以下の設定（２．５ｋＶ、６００Ω、および２５μＦ）でＧｅｎｅ ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌエレクトロポレーションシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して電気を通した。時間定数は３．７〜４．０ｍｓが達成されたった。この培養物を、５ｍｌの新鮮な培地に移した。細胞の再産生を、チューブホルダーを備えたＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｈｅｌｉｏｓ Ｅｐｓｉｌｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ （Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して６００ｎｍの波長でモニタリングした。最初にバイオマスが低下した後、細胞は再び増殖を開始した。この時点からバイオマスが二倍になった後、細胞を回収し、２００μｌの新鮮な培地に懸濁し、適切な抗生基質である４μｇ／ｍｌクラリスロマイシンまたは１５μｇ／ｍｌチアンフェニコールを含む選択的ＰＥＴＣプレート（１．２％ Ｂａｃｔｏ（商標）アガロース（ＢＤ）を含む）にプレーティングした。播種後３７℃の３０ｐｓｉの製鋼ガスで４〜５日で、コロニーが視認できた。
このコロニーを使用して、抗生基質を備えた２ｍｌのＰＥＴＣ培地に播種した。増殖が発生した後、培養を、唯一の炭素供給源として３０ｐｓｉの製鋼ガスとともに、５ｍｌの容量、次に５０ｍｌの容量にスケールアップした。
成功した形質転換の確認：
ＤＮＡの転移を検証するために、プラスミドミニプレップを、Ｚｙｐｐｙ ｐｌａｓｍｉｄ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ）を使用して１０ｍｌの培養容量から実施した。単離したプラスミドの質は、クロストリジウムのエキソヌクレアーゼ活性のため制限消化に十分ではなかったので［Ｂｕｒｃｈｈａｒｄｔ および Ｄuｒｒｅ， １９９０］、オリゴヌクレオチドの対ｃｏｌＥ１−Ｆ（配列番号：６５：ＣＧＴＣＡＧＡＣＣＣＣＧＴＡＧＡＡＡ）＋ｃｏｌＥ１−Ｒ（配列番号：６６：ＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＣＣＧＡＣＣＣＴ）を用いて単離プラスミドでＰＣＲを実施した。ＰＣＲはｉＮｔＲＯＮ Ｍａｘｉｍｉｓｅ Ｐｒｅｍｉｘ ＰＣＲ ｋｉｔ （Ｉｎｔｒｏｎ Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、以下の条件で行った：最初の変性（９４℃、２分間）、続いて３５周期の変性（９４℃、２０秒間）、アニーリング（５５℃、２０秒間）、および伸長（７２℃、６０秒間）、その後最終伸長ステップ（７２℃、５分間）。
クローンの同定を確認するために、ＤＮＡゲノムを、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＤＳＭ２３６９３の５０ｍｌの培養物から単離した（上記参照）。オリゴヌクレオチド（配列番号６７：ＣＣＧＡＡＴＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＣＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ）およびｒＰ２（配列番号：６８：ＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＧＧＣＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ）［Ｗｅｉｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， １９９１］およびｉＮｔＲＯＮ Ｍａｘｉｍｉｓｅ Ｐｒｅｍｉｘ ＰＣＲ ｋｉｔ（Ｉｎｔｒｏｎ Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、１６ｓ ｒＲＮＡに対するＰＣＲを、以下の条件で行った：最初の変性（９４℃、２分間）、続いて３５周期の変性（９４℃、２０秒）、アニーリング（５５℃、２０秒）、および伸長（７２℃、６０秒）、その後最終伸長ステップ（７２℃、５分間）。シークエンスの結果は、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（ｒｒｓＡ）（Ｙ１８１７８，ＧＩ：７２７１１０９）に対して少なくとも９９．９％同一であった。
イソプレンシンターゼ遺伝子の発現
ｑＲＴ−ＰＣＲ実験を、導入されたのイソプレンシンターゼの遺伝子がＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍでうまく発現したことを確認するために実行した。
イソプレンシンターゼプラスミドｐＭＴＬ ８５１４６−ｉｓｐＳを含む培養物およびプラスミドを含まない対照培養物を、５０ｍｌの血清用のビンおよび唯一のエネルギーおよび炭素の供給源として３０ｐｓｉ製鋼排ガス（ニュージーランドＧｌｅｎｂｒｏｏｋのＮｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｓｔｅｅｌで収集、組成：４４％ ＣＯ、３２％ Ｎ２、２２％ ＣＯ２、２％ Ｈ２）を用いてＰＥＴＣ培地（表１）中で増殖させた。０．８ｍｌの試料を０．５前後のＯＤ６００ｎｍの対数増殖期中に採取し、１．６ｍｌのＲＮＡ保護試薬（Ｑｉａｇｅｎ）と混合した。この混合物を遠心し（６，０００×ｇ、５分、４℃）、細胞沈殿物を、液体窒素ですばやく凍結し、ＲＮＡ抽出まで−８０℃で保存した。総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ）を使用してマニュアルのプロトコル５にしたがって単離した。細胞の破壊を、混合物をシリンジに１０回通過させることにより行い、５０μｌのＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅを含まない水で溶出した。ＤＮＡ−ｆｒｅｅ(登録商標) Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用したＤＮａｓｅ Ｉ処理の後、逆転写ステップを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｋｉｔ （体外ｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）を使用して実行した。ＲＮＡを、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ， ＣＡ， ＵＳＡ）、Ｑｕｂｉｔ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（体外ｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）を使用して、およびゲル電気泳動により検査した。非ＲＴ対照を、オリゴヌクレオチド対ごとに実施した。すべてのｑＲＴ−ＰＣＲ反応は、２５ｎｇのｃＤＮＡテンプレート、６７ｎＭの各オリゴヌクレオチド(表２)、および１ｘ ｉＱ（商標）ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）を含む総反応容量１５μｌ中で、ＭｙｉＱ（商標）Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｏｌｏｕｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）を使用して二連で実施した。反応条件は、９５℃を３分間、続いて４０周期の９５℃の１５秒間、５５℃を１５秒間および７２℃を３０秒間であった。オリゴヌクレオチドの二量体化または他の増幅副産物の検出のため、融解曲線分析を、ｑＰＣＲ（１℃／秒で５８℃から９５℃へ３８周期）の完了直後に実施した。２つのハウスキーピング遺伝子（グアニル酸キナーゼおよびギ酸テトラヒドロ葉酸リガーゼ）を標準化のために各ｃＤＮＡ試料に含めた。相対的な遺伝子発現の決定を、Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｔｏｏｌ （ＲＥＳＴ(c)） ２００８ Ｖ２．０．７（３８）を使用して行った。４ｌｏｇ単位に渡るｃＤＮＡの段階希釈を使用して標準曲線を作成し、結果として得られる増幅効率を用いてｍＲＮＡの濃度を計算した。
Figure 2015519065
オリゴヌクレオチド対ｉｓｐＳを使用した野生型株では増幅が観察されなかったが、プラスミドｐＭＴＬ ８５１４６−ｉｓｐＳをもつ株でｉｓｐＳオリゴヌクレオチド対を用いてシグナルが測定され、ｉｓｐＳ遺伝子がうまく発現していることを確認した。
実施例２−重要なテルペン前駆体ＤＭＡＰＰ（ジメチルアリル二リン酸）およびＩＰＰ（イソペンテニル二リン酸）間の変換のためのイソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼの発現
前駆体ＤＭＡＰＰ（ジメチルアリル二リン酸）およびＩＰＰ（イソペンテニル二リン酸）の利用可能性および均衡は、テルペン類の産生に重要である。ＤＸＳ経路はＩＰＰおよびＤＭＡＰＰを等しく合成するのに対し、メバロン酸経路ではＩＰＰのみが産生される。イソプレンの産生では、イソプレンシンターゼとともに存在する前駆体ＤＭＡＰＰのみを必要とし、一方より高度のテルペン類およびテルペノイド類の産生では、ゲラニルトランストランスフェラーゼによりゲラニル−ＰＰを産生するために利用可能な等量のＩＰＰおよびＤＭＡＰＰを有することが必要である。
イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ発現プラスミドの構築：
イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ（ＹＰ＿００１３１０１７４．１）をコードするＣ． ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ由来のイソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ遺伝子ｉｄｉ（Ｇｅｎｅ ＩＤ：５２９４２６４）を、ｉｓｐＳの下流にクローニングした。この遺伝子を、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍで上述した同一の方法を使用して取得したＣ． ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＮＣＩＭＢ８０５２のゲノムＤＮＡ由来のオリゴヌクレオチドＩｄｉ−Ｃｂｅｉ−ＳａｃＩ−Ｆ（配列番号：２６：ＧＴＧＡＧＣＴＣＧＡＡＡＧＧＧＧＡＡＡＴＴＡＡＡＴＧ）およびＩｄｉ−Ｃｂｅｉ−ＫｐｎＩ−Ｒ（配列番号：２７：ＡＴＧＧＴＡＣＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＴＡＴＴＴＡＧＡＣＧ）を使用して増幅した。このＰＣＲ産物を、ＳａｃＩおよびＫｐｎＩ制限部位を使用してベクターｐＭＴＬ ８５１４６−ｉｓｐＳにクローニングし、プラスミドｐＭＴＬ８５１４６−ｉｓｐＳ−ｉｄｉ（配列番号：２８）を得た。嫌気性抵抗マーカーを、制限酵素ＰｍｅＩおよびＦｓｅＩを使用してｃａｔＰからｅｒｍＢ（ベクターｐＭＴＬ８２２５４（ＦＪ７９７６４６．１； Ｎｉｇｅｌ Ｍｉｎｔｏｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ； Ｈｅａｐ ｅｔ ａｌ．， ２００９から入手）に交換し、プラスミドｐＭＴＬ８５２４６−ｉｓｐＳ−ｉｄｉを形成した（図３）。
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍでの形質転換および発現を、プラスミドｐＭＴＬ ８５１４６−ｉｓｐＳについて記載されるように実行した。形質転換の成功後に、増殖実験を、５０ｍｌの血清ビンおよび唯一のエネルギーおよび炭素供給源として製鋼排ガス（ニュージーランドＧｌｅｎｂｒｏｏｋのＮｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｓｔｅｅｌで収集、組成：４４％ ＣＯ、３２％ Ｎ２、２２％ ＣＯ２、２％ Ｈ２）を用いてＰＥＴＣ培地（表１）中で実行した。プラスミドがうまく導入されたことを確認するために、プラスミドミニプレップＤＮＡを、上述したように形質転換体から実行した。ｃｏｌＥ１（ｃｏｌＥ１−Ｆ：配列番号：６５：ＣＧＴＣＡＧＡＣＣＣＣＧＴＡＧＡＡＡおよびｃｏｌＥ１−Ｒ：配列番号：６６：ＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＣＣＧＡＣＣＣＴ）、ｅｒｍＢ（ｅｒｍＢ−Ｆ：配列番号：１０６：ＴＴＴＧＴＡＡＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧおよびｅｒｍＢ−Ｒ：配列番号：１０７：ＧＴＡＧＡＡＴＣＣＴＴＣＴＴＣＡＡＣ）およびｉｄｉ（Ｉｄｉ−Ｃｂｅｉ−ＳａｃＩ−Ｆ：配列番号：２６：ＧＴＧＡＧＣＴＣＧＡＡＡＧＧＧＧＡＡＡＴＴＡＡＡＴＧおよびＩｄｉ−Ｃｂｅｉ−ＫｐｎＩ−Ｒ：配列番号：２７：ＡＴＧＧＴＡＣＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＴＡＴＴＴＡＧＡＣＧ）を標的とするオリゴヌクレオチド対を使用する単離型プラスミドに対するＰＣＲで、形質転換の成功を確認した（図８）。同様に、これらの形質転換からゲノムＤＮＡを抽出し、オリゴヌクレオチドｆＤ１およびｒＰ２（上述参照）を使用して得られた１６ｓ ｒＲＮＡアンプリコンがＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの１６Ｓ ｒＲＮＡの遺伝子(Ｙ１８１７８，ＧＩ：７２７１１０９)に対して９９．９％同一であることを確認した。
イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼの遺伝子 ｉｄｉに対するオリゴヌクレオチド対（ｉｄｉ−Ｆ、配列番号：７１：ＡＴＡ ＣＧＴ ＧＣＴ ＧＴＡ ＧＴＣ ＡＴＣ ＣＡＡ ＧＡＴ Ａ および ｉｄｉＲ、配列番号：７２：ＴＣＴ ＴＣＡ ＡＧＴ ＴＣＡ ＣＡＴ ＧＴＡ ＡＡＡ ＣＣＣ Ａ）およびプラスミドｐＭＴＬ ８５１４６−ｉｓｐＳ−ｉｄｉをもつＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍを用いた血清ビンでの増殖実験由来の試料を使用して、上述のように、遺伝子発現が成功したことの確認を行った。イソプレンシンターゼ遺伝子ｉｓｐＳに対するシグナルもまた観察された（図１４）。
実施例３−ＤＸＳ経路の過剰発現
ＤＸＳ経路を介するフローを改善するために、経路の遺伝子を過剰発現させた。経路の最初のステップである、ピルビン酸およびＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）のデオキシキシルロース５−リン酸（ＤＸＰ／ＤＸＰＳ／ＤＯＸＰ）への変換は、デオキシキシルロース ５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）により触媒される。
ＤＸＳ過剰発現発現プラスミドの構築：
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのｄｘｓ遺伝子を、上述の他の遺伝子に記載されるように、オリゴヌクレオチドＤｘｓ−ＳａｌＩ−Ｆ（配列番号：２９：ＧＣＡＧＴＣＧＡＣＴＴＴＡＴＴＡＡＡＧＧＧＡＴＡＧＡＴＡＡ）およびＤｘｓ−ＸｈｏＩ−Ｒ（配列番号：３０：ＴＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＴＡＴＧＡＣＴＴＡＣＣＴＣＴＧ）を用いてゲノムＤＮＡから増幅させた。増幅された遺伝子を次にＳａｌＩおよびＸｈｏＩでプラスミドｐＭＴＬ８５２４６−ｉｓｐＳ−ｉｄｉ内にクローン化し、プラスミドｐＭＴＬ８５２４６−ｉｓｐＳ−ｉｄｉ−ｄｘｓ（配列番号：３１および図４）を産生した。表３に開示されるオリゴヌクレオチドを使用したＤＮＡの配列決定により、ｉｓｐＳ、ｉｄｉ、およびｄｘｓのクローニングが変異なく成功したことを確認した（図５）。ｉｓｐＳおよびｉｄｉ遺伝子を、それぞれ実施例１および実施例２に記載する。
Figure 2015519065
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍでの形質転換および発現
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍｎでの形質転換および発現を、プラスミドｐＭＴＬ ８５１４６−ｉｓｐＳに記載されるように実行した。形質転換の成功後に、増殖実験を、５０ｍｌの血清用のビンおよび単一のエネルギーおよび炭素の供給源として３０ｐｓｉ製鋼排ガス（ニュージーランドＧｌｅｎｂｒｏｏｋのＮｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｓｔｅｅｌで収集、組成：４４％ ＣＯ、３２％ Ｎ２、２２％ ＣＯ２、２％ Ｈ２）を用いＰＥＴＣ培地（表１）中で実行した。遺伝子発現の確認を、ＯＤ６００ｎｍ＝０．７５で収集した試料から上述したように実行した。オリゴヌクレオチド対 ｄｘｓ−Ｆ（配列番号：７３：ＡＣＡＡＡＧＴＡＴＣＴＡＡＧＡＣＡＧＧＡＧＧＴＣＡ）およびｄｘｓ−Ｒ（配列番号：７４：ＧＡＴＧＴＣＣＣＡＣＡＴＣＣＣＡＴＡＴＡＡＧＴＴＴ）を使用して、野生型株およびプラスミドｐＭＴＬ ８５１４６−ｉｓｐＳ−ｉｄｉ−ｄｘｓをもつ株における遺伝子ｄｘｓの発現を測定した。プラスミドをもつ株でのｍＲＮＡレベルが、野生型と比較して３倍超増加していることが見出された（図１５）。バイオマスはＲＮＡ抽出前に規準化した。
実施例４−メバロン酸経路の導入および発現
メバロン酸経路の第１のステップ（図７）は、２分子のアセチルＣｏＡをアセトアセチルＣｏＡ（およびＨＳ−ＣｏＡ）に変換するチオラーゼにより触媒される。この酵素は、同一の発明者らにより酸化炭素栄養性酢酸産生菌のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍおよびＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉでうまく発現されている（米国特許公開公報第２０１１／０２３６９４１号）。メバロン酸経路の残りの遺伝子の構築物が設計されている。
メバロン酸発現プラスミドの構築：
標準的な組み換えＤＮＡおよび分子クローニング技術を使用した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， および Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｄ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ， ＮＹ， ２００１）。メバロン酸経路の前半部によるメバロン酸の合成に必要とされる３つの遺伝子、すなわちチオラーゼ（ｔｈｌＡ／ｖｒａＢ）、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧＳ）およびＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＲ）は、オペロン（Ｐｐｔａａｃｋ−ｔｈｌＡ／ｖｒａＢ−ＨＭＧＳ−Ｐａｔｐ−ＨＭＧＲ）としてコドンを最適化された。
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのホスホトランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼオペロンプロモーター（Ｐｐｔａ−ａｃｋ）（配列番号：６１）を、チオラーゼおよびＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼの発現に使用し、一方Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのＡＴＰシンターゼのプロモーター領域（Ｐａｔｐ）をＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの発現に使用した。チオラーゼの２つの変異体、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来のｔｈｌＡおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕ由来のｖｒａＢを合成し、かつ、さらなるサブクローニングのためにＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を側面に位置した。ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧＳ）およびＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＲ）の両方をＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓから合成し、さらなるサブクローニングのためＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ および ＫｐｎＩ−ＸｂａＩ制限部位それぞれに側面に位置した。使用したすべての最適化ＤＮＡを表４に示す。
Figure 2015519065
ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡ レダクターゼ（ＨＭＧＲ）と共にＡＴＰシンターゼプロモーター（Ｐａｔｐ）を、オリゴヌクレオチドｐＵＣ５７−Ｆ（配列番号：４６：ＡＧＣＡＧＡＴＴＧＴＡＣＴＧＡＧＡＧＴＧＣ）およびｐＵＣ５７−Ｒ（配列番号：４７：ＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧ）を使用し、ならびにｐＵＣ５７−Ｐａｔｐ−ＨＭＧＲをテンプレートとして使用して増幅した。２０３３ｂｐの増幅したフラグメントを、ＳａｃＩおよびＸｂａＩで消化して、Ｅ．ｃｏｌｉ−ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍシャトルベクターｐＭＴＬ ８２１５１に連結し（ＦＪ７９７６； Ｎｉｇｅｌ Ｍｉｎｔｏｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ， ＵＫ； Ｈｅａｐ ｅｔ ａｌ．， ２００９， Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ７８： ７９−８５）、プラスミドｐＭＴＬ ８２１５１−Ｐａｔｐ−ＨＭＧＲ（配列番号：７６）を得た。
３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ シンターゼ（ＨＭＧＳ）を、オリゴヌクレオチドＥｃｏＲＩ−ＨＭＧＳ＿Ｆ（配列番号：７７：ＡＧＣＣＧＴＧＡＡＴＴＣＧＡＧＧＣＴＴＴＴＡＣＴＡＡＡＡＡＣＡ）およびＥｃｏＲＩ−ＨＭＧＳ＿Ｒ（配列番号：７８：ＡＧＧＣＧＴＣＴＡＧＡＴＧＴＴＣＧＴＣＴＣＴＡＣＡＡＡＴＡＡＴＴ）を使用して、コドンを合成したプラスミドｐＧＨ−ｓｅｑ３．２から増幅した。１３９１ｂｐの増幅したフラグメントを、ＳａｃＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、以前に作成したプラスミドｐＭＴＬ ８２１５１−Ｐａｔｐ−ＨＭＧＲに連結して、ｐＭＴＬ ８２１５１−ＨＭＧＳ−Ｐａｔｐ−ＨＭＧＲ（配列番号：７９）を得た。作成したプラスミドｐＭＴＬ ８２１５１−ＨＭＧＳ−Ｐａｔｐ−ＨＭＧＲ（配列番号：７９）および１７６８ ｂｐのコドンを最適化したオペロンＰｐｔａａｃｋ−ｔｈｌＡ／ｖｒａＢは、両方ともＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩで切断した。連結反応を実施し、その後Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’ Ｋａｎに形質転換して、プラスミドｐＭＴＬ８２１５−Ｐｐｔａａｃｋ−ｔｈｌＡ／ｖｒａＢ−ＨＭＧＳ−Ｐａｔｐ−ＨＭＧＲ（配列番号：５０）を得た。
メバロン酸経路の後半部を介したメバロン酸からのテルペノイドの重要な中間体の合成のために必要である５つの遺伝子、すなわち、メバロン酸キナーゼ（ＭＫ）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭＤ）、イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ（ｉｄｉ）およびイソプレンシンターゼ（ｉｓｐＳ）を、ＡＴＧ：Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｓ ＧｍｂＨ（Ｍｅｒｚｈａｕｓｅｎ、ドイツ）によりコドンを最適化した。メバロン酸キナーゼ（ＭＫ）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）およびジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭＤ）を、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓから取得した。
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのＲＮＦ複合体のプロモーター領域（Ｐｒｎｆ）（配列番号：６２）を、メバロン酸キナーゼ（ＭＫ）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）およびジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭＤ）の発現に使用し、一方Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼのプロモーター領域（Ｐｆｏｒ）（配列番号：２２）を、イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ（ｉｄｉ）およびイソプレンシンターゼ（ｉｓｐＳ）の発現に使用した。使用されたすべてのＤＮＡ配列を表５に示す。コドンが最適化されたＰｒｎｆ−ＭＫを、オリゴヌクレオチド ＮｏｔＩ−ＸｂａＩ−Ｐｒｎｆ−ＭＫ＿Ｆ（配列番号：８０：ＡＴＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＧＧＴＣＴＡＧＡＡＴＡＴＣＧＡＴＡＣＡＧＡＴＡＡＡＡＡＡＡＴＡＴＡＴＡＡＴＡＣＡＧ）およびＳａｌＩ−Ｐｒｎｆ−ＭＫ＿Ｒ（配列番号：８１：ＴＧＧＴＴＣＴＧＴＡＡＣＡＧＣＧＴＡＴＴＣＡＣＣＴＧＣ）で合成プラスミドｐＧＨ− Ｐｒｎｆ−ＭＫ−ＰＭＫ−ＰＭＤから増幅した。その後、増幅した遺伝子をＮｏｔＩおよびＳａｌＩでプラスミドｐＭＴＬ８３１４５（配列番号：４９）にクローニングして、プラスミドｐＭＴＬ８３１４−Ｐｒｎｆ−ＭＫ（配列番号：８２）を産生した。この結果として得られるプラスミドおよびコドンを最適化した２１６５ｂｐのフラグメントＰＭＫ−ＰＭＤを、ＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。連結反応を実施してプラスミドｐＭＴＬ ８３１４−Ｐｒｎｆ−ＭＫ−ＰＭＫ−ＰＭＤ（配列番号：８３）を得た。
メバロン酸経路をもたないイソプレン発現プラスミドを、制限部位AgelおよびＮｈｅｌの側面に位置するイソプレンシンターゼ（ｉｓｐＳ）を以前に作成したファルネセンプラスミドｐＭＴＬ ８３１４−Ｐｒｎｆ−ＭＫ−ＰＭＫ−ＰＭＤ−Ｐｆｏｒ−ｉｄｉ−ｉｓｐＡ−ＦＳ（配列番号：９１）に連結することにより作成し、プラスミドｐＭＴＬ８３１４−Ｐｒｎｆ−ＭＫ−ＰＭＫ−ＰＭＤ−Ｐｆｏｒ−ｉｄｉ−ｉｓｐＳ（配列番号：８４）を得た。最終的なイソプレン発現プラスミドｐＭＴＬ ８３１４−Ｐｐｔａａｃｋ−ｔｈｌＡ−ＨＭＧＳ−Ｐａｔｐ−ＨＭＧＲ−Ｐｒｎｆ−ＭＫ−ＰＭＫ−ＰＭＤ−Ｐｆｏｒ−ｉｄｉ−ｉｓｐＳ（配列番号：５８、図１０）を、ＮｏｔＩおよびＸｂａＩを使用してｐＭＴＬ８２１５−Ｐｐｔａａｃｋ−ｔｈｌＡ−ＨＭＧＳ−Ｐａｔｐ−ＨＭＧＲ（配列番号：５０）由来のＰｐｔａａｃｋ−ｔｈｌＡ−ＨＭＧＳ−Ｐａｔｐ−ＨＭＧＲの４３６０ｂｐのフラグメントとｐＭＴＬ ８３１４−Ｐｒｎｆ−ＭＫ−ＰＭＫ−ＰＭＤ−Ｐｆｏｒ−ｉｄｉ−ｉｓｐＳ（配列番号：８４）を連結することにより作成した。
Figure 2015519065
実施例５‐メバロン酸経路を介したＣＯからのファルネセンの産生のためのＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍへのファルネセンシンターゼの導入
テルペノイドの重要な中間体ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰから直接イソプレンを産生してより長鎖のテルペンを合成する代わりに、ゲラニルトランストランスフェラーゼを介して、直接Ｃ１０モノテルペノイド類またはＣ１５セスキテルペノイド類などの長鎖テルペン類を合成することも可能である（表６参照）。Ｃ１５セスキテルペノイド構築ブロックファルネシルＰＰから、ファルネセンを産生することが可能であり、これはエタノールと同じく、輸送燃料に使用できる。
ファルネセン発現プラスミドの構築
メバロン酸経路を介したＩＰＰおよびＤＭＡＰＰからのファルネセン合成に必要とされる２つの遺伝子、すなわち、ゲラニルトランストランスフェラーゼ（ｉｓｐＡ）およびαファルネセンシンターゼ（ＦＳ）を、コドンを最適化した。ゲラニルトランストランスフェラーゼ（ｉｓｐＡ）はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｒ． Ｋ−１２ ｓｕｂｓｔｒから取得しＭＧ１６５５アルファダルファルネセンシンターゼ（ＦＳ）はＭａｌｕｓ ｘ ｄｏｍｅｓｔｉｃａから取得した。使用されたすべてのＤＮＡ配列を表６に記載する。コドンを最適化したｉｄｉは、メバロン酸経路ｉｄｉ＿Ｆ（配列番号：８６：ＡＧＧＣＡＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＣＡＧＡＧＴＡＴＡＴＡＡＴＡＧＣＡＧＴＡＧ）およびｉｄｉ＿Ｒ２（配列番号：８７： ＡＧＧＣＧＣＡＡＧＣＴＴＧＧＣＧＣＡＣＣＧＧＴＴＴＡＴＴＴＡＡＡＴＡＴＣＴＴＡＴＴＴＴＣＡＧＣ）で合成プラスミドｐＭＴＬ８３２４５−Ｐｆｏｒ−ＦＳ−ｉｄｉ（配列番号：８５）から増幅した。その後、増幅した遺伝子を、ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでプラスミドｐＭＴＬ８３２４５−Ｐｆｏｒにクローン化し、プラスミドｐＭＴＬ８３２４５−Ｐｆｏｒ−ｉｄｉ（配列番号：８８）を産生した。この結果として得られたプラスミドおよびファルネセンシンターゼの１７５４ｂｐのコドン最適化フラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｈｅＩで消化した。連結反応を実施して、プラスミドｐＭＴＬ８３２４５−Ｐｆｏｒ−ｉｄｉ−ＦＳ（配列番号：８９）を得た。ｉｓｐＡの９４６ｂｐフラグメントおよびｐＭＴＬ８３２４５−Ｐｆｏｒ−ｉｄｉ−ＦＳを、ＡｇｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、結合させ、結果としてプラスミドｐＭＴＬ８３２４５−Ｐｆｏｒ−ｉｄｉ−ｉｓｐＡ−ＦＳ（配列番号：９０）を作成した。上流のメバロン酸経路をもたないファルネセン発現プラスミドは、ｐＭＴＬ８３２４５−Ｐｆｏｒ−ｉｄｉ−ｉｓｐＡ−ＦＳからのＰｆｏｒ−ｉｄｉ−ｉｓｐＡ−ＦＳの２５１６ｂｐのフラグメントをｐＭＴＬ ８３１４−Ｐｒｎｆ−ＭＫ−ＰＭＫ−ＰＭＤに連結することにより作成して、プラスミドｐＭＴＬ ８３１４−Ｐｒｎｆ−ＭＫ−ＰＭＫ−ＰＭＤ−Ｐｆｏｒ−ｉｄｉ−ｉｓｐＡ−ＦＳ（配列番号：９１）を得た。最終的なファルネセン発現プラスミドＭＴＬ８３１４５−ｔｈｌＡ−ＨＭＧＳ−Ｐａｔｐ−ＨＭＧＲ−Ｐｒｎｆ−ＭＫ−ＰＭＫ−ＰＭＤ−Ｐｆｏｒ−ｉｄｉ−ｉｓｐＡ−ＦＳ（配列番号：５９および図１８）は、制限部位ＮｏｔＩおよびＸｂａＩを使用してｐＭＴＬ８２１５−Ｐｐｔａａｃｋ−ｔｈｌＡ−ＨＭＧＳ−Ｐａｔｐ−ＨＭＧＲ （配列番号：５０）由来のＰｐｔａａｃｋ−ｔｈｌＡ−ＨＭＧＳ−Ｐａｔｐ−ＨＭＧＲの４６３０ｂｐフラグメントをｐＭＴＬ ８３１４−Ｐｒｎｆ−ＭＫ−ＰＭＫ−ＰＭＤ−Ｐｆｏｒ−ｉｄｉ−ｉｓｐＡ−ＦＳ（配列番号：９１）と連結することにより作成される。
Figure 2015519065
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍへの形質転換
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍでの形質転換および発現を、実施例１に記載するように実行した。
成功した形質転換の確認
ＭＴＬ８３１４−Ｐｒｎｆ−ＭＫ−ＰＭＫ−ＰＭＤ−Ｐｆｏｒ−ｉｄｉ−ｉｓｐＡ−ＦＳ（配列番号：５９）の存在を、ｇａｒｍ＋ve ｐｅｒｐｌｉｃｏｎの一部およびｐＭＴＬ８３１ｘｘｘの一連のプラスミド上のｃａｔ遺伝子の大部分を選択的に増幅するオリゴヌクレオチドｒｅｐＨＦ（配列番号：９２：ＡＡＧＡＡＧＧＧＣＧＴＡＴＡＴＧＡＡＡＡＣＴＴＧＴ）およびｃａｔＲ（配列番号：９３：ＴＴＣＧＴＴＴＡＣＡＡＡＡＣＧＧＣＡＡＡＴＧＴＧＡ）を使用して、コロニーＰＣＲにより確認した。１８５４ｂｐのバンドを得た（図１６）。
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍでの下流メバロン酸経路の発現
下流のメバロン酸経路遺伝子であるメバロン酸キナーゼ（ＭＫ 配列番号：５１）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ 配列番号：５２）、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭＤ 配列番号：５３）、イソペンチル−二リン酸Δ−イソメラーゼ（ｉｄｉ；配列番号：５４）、ゲラニルトランストランスフェラーゼ（ｉｓｐＡ；配列番号：５６）およびファルネセンシンターゼ（ＦＳ配列番号５７）の発現の確認を、実施例１に上述するように行った。使用したオリゴヌクレオチドを表７に列挙する。
Figure 2015519065
下流メバロン酸経路のすべての遺伝子の発現を確認するＲｔ−ＰＣＲデータを図１８に示し、このデータはまた表８にまとめた。
Figure 2015519065
メバロン酸からのαファルネセンの産生
プラスミドｐＭＴＬ８３１４−Ｐｒｎｆ−ＭＫ−ＰＭＫ−ＰＭＤ−Ｐｆｏｒ−ｉｄｉ−ｉｓｐＡ−ＦＳの形質転換の成功を確認した後に、唯一の炭素およびエネルギー供給源として３０ｐｓｉのＲｅａｌ Ｍｉｌｌ Ｇａｓ（ニュージーランドＧｌｅｎｂｒｏｏｋのＮｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｓｔｅｅｌで収集、組成：４４％ ＣＯ、３２％ Ｎ２、２２％ ＣＯ２、２％ Ｈ２）を用いて、２５０ｍｌの血清ビン中の５０ｍｌＰＥＴＣ培地（表１）で増殖実験を行った。すべての培養物を、血清ビンを保持するよう適合されオービタル振盪機上で、３７℃でインキュベートした。形質転換物を、１ｍＭのメバロン酸を追加した新鮮な培地に継代培養する前に、ＯＤ６００が、〜０．４となるまで増殖させた。メバロン酸のない対照を、同一の培養物から同一の時間に設定した。ＧＣ−ＭＳ（ガスクロマトグラフィー-質量分析）の試料を、各時点で採取した。図１７は、２つの対照培養物および１ｍＭのメバロン酸を供給した２つの培養物の代表的な増殖曲線を示す。ファルネセンが、実験の開始から６６時間後および９０時間後に採取した試料で検出された(図１９〜２１)。
ガスクロマトグラフィー-質量分析によるαファルネセンの検出
αファルネセンのＧＣ−ＭＳ検出のため、５ｍｌの培養物に対し、２ｍｌのヘキサンを添加し、激しく振って密封したガラスのバルク管（ｂａｌｃｈ ｔｕｂｅ）中で混合することによりヘキサン抽出を実施した。その後、この管を、５分間超音波処置ウォーターバスでインキュベートして相の分離を促進した。４００μｌのヘキサン抽出物をＧＣバイアル（ｖａｉｌ）に移しオートローダーに装填した。試料を、０．２５μｍのフィルム厚のＥＣ−１０００カラム（ Ｇｒａｃｅ Ｄａｖｉｄｓｏｎ， ＯＲ， ＵＳＡ）、ＶＡＲＩＡＮ ＭＳ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ （Ｖａｒｉａｎ Ｉｎｃ， ＣＡ， ＵＳＡ． Ｎｏｗ Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＮＩＳＴ ＭＳ Ｓｅａｒｃｈ ２．０ （Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）を備えたＶＡＲＩＡＮ ＧＣ３８００ ＭＳ４０００ ｉｏｎｔｒａｐ ＧＣ／ＭＳ （Ｖａｒｉａｎ Ｉｎｃ， ＣＡ， ＵＳＡ． Ｎｏｗ Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分析した。注入容量は１μｌであり、ヘリウムキャリアーガスの流量は１ｍｌ／分であった。
本発明は本明細書に記載されている通りであり、これは、過度の実験を行うことなく本明細書を読むことにより本発明の実施を可能とすることを目的とする。しかしながら、本発明の範囲を逸脱することなく、多くの成分およびパラメータを、特定の内容に変動または修正してもよく、知られている均等物に変えてもよいことは、当業者に明らかである。また、このような修正および均等物は、個々に設定されるように本明細書に組み込まれていることは明らかである。発明の名称、表題などは、本文書の読み手の理解を高めるために提供されるものであり、本発明の範囲を限定するように読み取られるものではない。
もし存在する場合には、上記かつ以下に引用されるすべての特許出願、特許、および公開公報のすべての開示は、本明細書に参照として援用される。しかしながら、いずれの特許出願、特許、および公開公報に対する参照は、有効な先行技術を構成するまたは世界のいずれかの国で共通な一般的知識の部分を形成すると認識されるものではなく、また示唆されるものではない。
特段の記載がない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの用語は、排他的な意味と反対の包括的な意味として理解され、すなわち「限定するものではないが、〜を含む」と理解される。

Claims (31)

  1. メバロン酸経路またはＤＸＳ経路またはテルペン生合成経路の酵素をコードする外来性核酸を含む、単離され、遺伝的に改変された、酸化炭素栄養性の、酢酸産生細菌であって、これにより細菌が酵素を発現し、前記酵素が、
    ａ） チオラーゼ（ＥＣ ２．３．１．９）；
    ｂ） ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ ２．３．３．１０）；
    ｃ） ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ １．１．１．８８）；
    ｄ） メバロン酸キナーゼ（ＥＣ ２．７．１．３６）；
    ｅ） ホスホメバロン酸キナーゼ（ＥＣ ２．７．４．２）；
    ｆ） ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．３３）；１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ ＤＸＳ（ＥＣ：２．２．１．７）；
    ｇ） １−デオキシ−Ｄ−キシルロース ５−リン酸レダクトイソメラーゼ ＤＸＲ（ＥＣ：１．１．１．２６７）；
    ｈ） ２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール ４−リン酸シチジリルトランスフェラーゼ ＩｓｐＤ（ＥＣ：２．７．７．６０）；
    ｉ） ４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール キナーゼ ＩｓｐＥ（ＥＣ：２．７．１．１４８）；
    ｊ） ２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール ２；４−シクロ二リン酸シンターゼＩｓｐＦ（ＥＣ：４．６．１．１２）；
    ｋ） ４−ヒドロキシ−３−メチルブタ −２−エン−１−イル 二リン酸シンターゼ ＩｓｐＧ（ＥＣ：１．１７．７．１）；
    ｌ） ４−ヒドロキシ−３−メチルブタ −２−エニル 二リン酸レダクターゼ（ＥＣ：１．１７．１．２）；ゲラニルトランストランスフェラーゼ Ｆｐｓ（ＥＣ：２．５．１．１０）；
    ｍ） ヘプタプレニル二リン酸シンターゼ（ＥＣ：２．５．１．１０）；
    ｎ） オクタプレニル−二リン酸シンターゼ（ＥＣ：２．５．１．９０）；
    ｏ） イソプレンシンターゼ（ＥＣ ４．２．３．２７）；
    ｐ） イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ（ＥＣ ５．３．３．２）；および
    ｑ） ファルネセンシンターゼ（ＥＣ ４．２．３．４６ ／ ＥＣ ４．２．３．４７）
    からなる群から選択される、
    細菌。
  2. 前記核酸の不在下で、細菌が酵素を発現しない、請求項１に記載の細菌。
  3. 嫌気的条件下で酵素を発現する、請求項１に記載の細菌。
  4. メバロン酸経路またはＤＸＳ経路またはテルペン生合成経路の酵素をコードする核酸を含む酸化炭素栄養性酢酸産生細菌中で複製できるプラスミドであって、それによりプラスミドが前記細菌にある際に酵素が前記細菌により発現され、前記酵素が、
    チオラーゼ（ＥＣ ２．３．１．９）；
    ａ） ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ ２．３．３．１０）；
    ｂ） ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ １．１．１．８８）；
    ｃ） メバロン酸キナーゼ（ＥＣ ２．７．１．３６）；
    ｄ） ホスホメバロン酸キナーゼ（ＥＣ ２．７．４．２）；
    ｅ） ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．３３）；１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ ＤＸＳ（ＥＣ：２．２．１．７）；
    ｆ） １−デオキシ−Ｄ−キシルロース ５−リン酸レダクトイソメラーゼ ＤＸＲ（ＥＣ：１．１．１．２６７）；
    ｇ） ２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール ４−リン酸シチジリルトランスフェラーゼ ＩｓｐＤ（ＥＣ：２．７．７．６０）；
    ｈ） ４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール キナーゼ ＩｓｐＥ（ＥＣ：２．７．１．１４８）；
    ｉ） ２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール ２；４−シクロ二リン酸シンターゼ ＩｓｐＦ（ＥＣ：４．６．１．１２）；
    ｊ） ４−ヒドロキシ−３−メチルブタ −２−エン−１−イル 二リン酸シンターゼ ＩｓｐＧ（ＥＣ：１．１７．７．１）；
    ｋ） ４−ヒドロキシ−３−メチルブタ −２−エニル 二リン酸レダクターゼ（ＥＣ：１．１７．１．２）；ゲラニルトランストランスフェラーゼ Ｆｐｓ（ＥＣ：２．５．１．１０）；
    ｌ） ヘプタプレニル二リン酸シンターゼ（ＥＣ：２．５．１．１０）；
    ｍ） オクタプレニル−二リン酸シンターゼ（ＥＣ：２．５．１．９０）；
    ｎ） イソプレンシンターゼ（ＥＣ ４．２．３．２７）；
    ｏ） イソペンテニル−二リン酸Δ−イソメラーゼ（ＥＣ ５．３．３．２）；および
    ｐ） ファルネセンシンターゼ（ＥＣ ４．２．３．４６ ／ ＥＣ ４．２．３．４７）
    からなる群から選択される、
    プラスミド。
  5. ＣＯおよび／またはＣＯ２をイソプレンに変換する工程であって、
    気体状のＣＯ含有基質および／またはＣＯ２含有基質を培地中の酸化炭素栄養性酢酸産生細菌の培養物を含む生物反応器に通すことにより、細菌がＣＯおよび／またはＣＯ２をイソプレンに変換すること、および
    前記生物反応器からイソプレンを回収すること
    を含み、
    酸化炭素栄養性酢酸産生細菌がイソプレンシンターゼを発現するよう遺伝的に改変されている、
    工程。
  6. イソプレンシンターゼをコードする核酸を含む、単離され、遺伝的に改変された、型酸化炭素栄養性の、酢酸産生細菌であって、
    それにより細菌がイソプレンシンターゼを発現し、かつ細菌がジメチルアリル二リン酸をイソプレンに変換できる、
    細菌。
  7. イソプレンシンターゼがＰｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓの酵素である、請求項６に記載の単離され、遺伝的に改変された、酸化炭素栄養性の、酢酸産生細菌。
  8. 核酸が最適化されたコドンである、請求項６に記載の単離され、遺伝的に改変さた、酸化炭素栄養性の、酢酸産生細菌。
  9. イソプレンシンターゼの発現がＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ由来のピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ遺伝子のプロモーターの転写制御下にある、請求項６に記載の単離され、遺伝的に改変された、酸化炭素栄養性の、酢酸産生細菌。
  10. ＣＯおよび／またはＣＯ２をイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）に変換する工程であって、
    気体状のＣＯ含有基質および／またはＣＯ２含有基質を培地中の酸化炭素栄養性酢酸産生細菌の培養物を含む生物反応器に通すことにより、細菌がＣＯおよび／またはＣＯ２をイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）に変換すること、および
    生物反応器からＩＰＰを回収すること
    を含み、
    酸化炭素栄養性酢酸産生細菌が、イソペンチル二リン酸デルタ イソメラーゼを発現するよう遺伝的に改変されている、
    工程。
  11. イソペンチル二リン酸デルタ イソメラーゼをコードする核酸を含む、単離され、遺伝的に改変された、酸化炭素栄養性の、酢酸産生細菌であって、
    それにより細菌がイソペンチル二リン酸デルタ イソメラーゼを発現し、かつ細菌がジメチルアリル二リン酸をイソペンチル二リン酸に変換できる、
    細菌。
  12. 核酸がＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ イソペンチル二リン酸デルタ イソメラーゼをコードする、請求項１１に記載の単離され、遺伝的に改変された、酸化炭素栄養性の、酢酸産生細菌。
  13. 核酸がＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ由来のピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ遺伝子のプロモーターの転写制御下にある、請求項１１に記載の単離され、遺伝的に改変された、酸化炭素栄養性の、酢酸産生細菌。
  14. 核酸がＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ由来のピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ遺伝子の転写制御下にありかつイソプレンシンターゼをコードする第２の核酸の下流にある、請求項１１に記載の単離され、遺伝的に改変された、酸化炭素栄養性の、酢酸産生細菌。
  15. ＣＯおよび／またはＣＯ２をイソペンチル二リン酸（ＩＰＰ）および／またはイソプレンに変換する工程であって、
    気体状のＣＯ含有基質および／またはＣＯ２含有基質を培地中の酸化炭素栄養性酢酸産生細菌の培養物を含む生物反応器に通すことにより、細菌がＣＯおよび／またはＣＯ２をイソペンチル二リン酸（ＩＰＰ）および／またはイソプレンに変換すること、および
    前記生物反応器からＩＰＰおよび／またはイソプレンを回収すること
    を含み、
    酸化炭素栄養性酢酸産生細菌がデオキシキシルロース ５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）酵素をコードする核酸の増加されたコピー数をもつよう遺伝的に改変され、増加されたコピー数がゲノム当たり１より大きい、
    工程。
  16. デオキシキシルロース ５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）の酵素をコードする核酸のゲノムあたり１より大きいコピー数を含む、単離され、遺伝的に改変された、酸化炭素栄養性の、酢酸産生細菌。
  17. イソプレンシンターゼをコードする核酸をさらに含む、請求項１６に記載の単離され、遺伝的に改変された、酸化炭素栄養性の、酢酸産生細菌。
  18. イソペンチル二リン酸デルタイソメラーゼをコードする核酸をさらに含む、請求項１６に記載の一般的に改変されている単離型酸化炭素栄養性酢酸産生細菌。
  19. イソペンチル二リン酸デルタイソメラーゼをコードする核酸およびイソプレンシンターゼをコードする核酸をさらに含む、請求項１６に記載の単離され、遺伝的に改変された、酸化炭素栄養性の、酢酸産生細菌。
  20. ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）をコードする核酸を含む、単離され、遺伝的に改変された、酸化炭素栄養性の、酢酸産生細菌であって、それにより細菌がコードされた酵素を発現し、酵素が細菌にとって天然ではない、細菌。
  21. 酵素が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの酵素である、請求項２０に記載の単離され、遺伝的に改変された、酸化炭素栄養性の、酢酸産生細菌。
  22. 酵素が１つ以上のＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのプロモーターの制御下で発現される、請求項２０に記載の単離され、遺伝的に改変された、酸化炭素栄養性の、酢酸産生細菌。
  23. チオラーゼ（ｔｈｌＡ／ｖｒａＢ）をコードする核酸、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧＳ）をコードする核酸、およびＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＲ）をコードする核酸をさらに含む、請求項２０に記載の遺伝的に改変された、酸化炭素栄養性の、酢酸産生細菌。
  24. チオラーゼがＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍのチオラーゼである、請求項２３に記載の単離され、遺伝的に改変された、酸化炭素栄養性の、酢酸産生細菌。
  25. ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭＤ）をコードする核酸をさらに含む、請求項２０に記載の単離され、遺伝的に改変された、酸化炭素栄養性の、酢酸産生細菌。
  26. αファルネセンシンターゼをコードする外来性核酸を含む、単離され、遺伝的に改変された、酸化炭素栄養性の、酢酸産生細菌。
  27. 核酸がＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍでの発現のためにコドンが最適化されている、請求項２６に記載の単離され、遺伝的に改変された、酸化炭素栄養性の、酢酸産生細菌。
  28. αファルネセンシンターゼがＭａｌｕｓ ｘ ｄｏｍｅｓｔｉｃａのαファルネセンシンターゼである、請求項２６に記載の細菌。
  29. ゲラニルトランストランスフェラーゼをコードする核酸セグメントをさらに含む、請求項２６に記載の単離され、遺伝的に改変された、酸化炭素栄養性の、酢酸産生細菌。
  30. ゲラニルトランスフェラーゼ（ｇｅｒｎａｙｌｔｒａｎｓｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）がＥ．ｃｏｌｉのゲラニルトランストランスフェラーゼである、請求項２９に記載の単離され、遺伝的に改変された、酸化炭素栄養性の、酢酸産生細菌。
  31. Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍａｇｎｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ ｂａｃｃｈｉｉ、Ｂｌａｕｔｉａ ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｏｖａｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｉｕｖｉからなる群から選択される、請求項１、６、１１、２０、または２６に記載の単離され、遺伝的に改変された、酸化炭素栄養性の、酢酸産生細菌。
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