CN115427581A - 将甲醛掺入生物质中的方法 - Google Patents

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Abstract

描述了一种用于将甲醛掺入生物质中的方法，包括以下酶促催化的步骤(1)丙酮酸与甲醛缩合成4‑羟基‑2‑氧代丁酸(HOB)；(2)将由此产生的4‑羟基‑2‑氧代丁酸(HOB)胺化以产生高丝氨酸；(3)将由此产生的高丝氨酸转化为苏氨酸；(4)将由此产生的苏氨酸转化为甘氨酸和乙醛或乙酰‑CoA；(5)将由此产生的甘氨酸与甲醛缩合以产生丝氨酸；和(6)转化由此产生的丝氨酸以产生丙酮酸，其中所述丙酮酸然后可以用作步骤(1)中的底物。

Description

将甲醛掺入生物质中的方法
本发明涉及包括以下酶促催化步骤的方法或酶促途径：
(1)丙酮酸与甲醛缩合成4-羟基-2-氧代丁酸(HOB)；
(2)将由此产生的4-羟基-2-氧代丁酸(HOB)胺化以产生高丝氨酸；
(3)将由此产生的高丝氨酸转化为苏氨酸；
(4)将由此产生的苏氨酸转化为甘氨酸和乙醛或乙酰-CoA；
(5)将由此产生的甘氨酸与甲醛缩合以产生丝氨酸；和
(6)转化由此产生的丝氨酸以产生丙酮酸，其中所述丙酮酸然后可以用作步骤(1)中的底物。
这种方法/途径允许将甲醛有效地掺入碳化合物中，从而将甲醛转化为生物质。本发明还涉及表达用于催化相应酶促反应的酶的重组微生物。
微生物生产商业化学品受到原料可用性和成本的限制。糖和淀粉尽管是常用的，但不是理想的微生物原料，因为它们的生物技术利用与人类消费直接冲突，从而侵蚀食品安全(Walker，J.Appl.Phycol.21(2009)，509-517)。此外，农业种植的扩大以自然生境的萎缩为代价，从而威胁到生物多样性(Scholes等，在Intergovernmental Science-PolicyPlatform on Biodiversity and Ecosystem Services(波恩，德国；2018)中)。木质纤维素生物质的使用虽然避免了这些问题中的一些，但提出了其他挑战，包括异质性的组成、难以加工以及有害的废物(Sanderson，Nature 474(2011)，12-14)。一种碳化合物提供了有利的替代物，因为它们可以以高水平生产而不会使农业生产产生负担，并且它们代表均质的、易于处理的微生物原料(Takors等，Microb.Biotechnol.11(2018)，606-625；Yishai等，Curr.Opin.Chem.Biol.35(2016)，1-9；Schrader等，Trends Biotechnol.27(2009)，107-115)。甲醇是特别令人感兴趣的，因为它完全与水混溶，避免了限制气态单碳化合物(例如一氧化碳和甲烷)使用的传质屏障。甲醇可以低成本地从天然气生产(Zakaria和Kamarudin，Renew.Sust.Energ.Rev.65(2016)，250-261)，或者它可以由CO2和电化学衍生的氢可持续且有效地产生(Szima和Cormos，J.CO2 Util.24(2018)，555-563)。甲醇生物同化主要涉及其氧化成甲醛，然后通过专用循环将甲醛掺入生物质中。
对依靠甲醇天然生长的微生物(例如扭脱甲基杆菌(Methylobacteriumextorquens))的代谢工程化中已经有最近的进展(Schada von Borzyskowski等，ACSSynthetic Biology 4(2015)，430-443；Marx和Lidstrom，Microbiology 150(2004)，9-19)。此外，最近的许多努力已经试图工程化生物技术宿主，使其通过天然存在的甲醇同化途径之一依靠甲醇生长(Whitaker，Curr.Opin.Bioltechnol.33(2015)，165-175；Zhang等，RSC Advances 7，(2017)4083-4091)：核酮糖单磷酸(RuMP)循环(Chen等，Metab.Eng.49，(2018)257-266；Meyer等，Nature Communications 9，(2018)1508；He等，ACS SyntheticBiology 7，(2018)1601-1611)、二羟基丙酮(DHA)循环(Dai等，Bioresour.Technol.245(2017)，1407-1412)和丝氨酸循环(Yu和Liao，Nature Communications 9(2018)，3992)。然而，这些天然途径可能不代表最佳解决方案。可以设计和实施更好的途径，更有效地使用细胞资源和/或与宿主微生物在代谢上更相容。例如，最近的研究在大肠杆菌中设计并部分实施了修饰的丝氨酸循环，其中一些天然反应被其他天然反应替换，更好地拟合宿主的内源性代谢(Yu和Liao，Nature Communications 9(2018)，3992)。然而，丝氨酸循环及其修饰变体是ATP低效的，这导致低的生物质和产物产率(Claassens等，Nature Catalysis 2(2019)，437)。在其他研究中，证明了新的自然甲醛酶(formolase)反应，反应中两个或三个甲醛分子缩合以分别产生乙醇醛或DHA(Lu等，Nature Communications 10(2019)，1378；Wang等，Bioresour.Bioprocess.4(2017)，41)。然而，缩合速率和对甲醛的亲和力太低以致在生理上不相关。
因此，需要开发允许将甲醛(其可以由甲醇产生)有效同化和掺入生物质中的手段和方法，从而促进使用例如甲醇作为生物生产的原料。
本发明通过提供包括以下酶促催化步骤的方法或酶促途径满足了这个需求：
(1)丙酮酸与甲醛缩合成4-羟基-2-氧代丁酸(HOB)；
(2)将由此产生的4-羟基-2-氧代丁酸(HOB)胺化以产生高丝氨酸；
(3)将由此产生的高丝氨酸转化为苏氨酸；
(4)将由此产生的苏氨酸转化为甘氨酸和乙醛或乙酰-CoA；
(5)将由此产生的甘氨酸与甲醛缩合以产生丝氨酸；和
(6)转化由此产生的丝氨酸以产生丙酮酸，其中所述丙酮酸然后可以用作步骤(1)中的底物。
这种方法/途径允许将甲醛有效地掺入碳化合物中，从而将其转化为生物质。
上述酶促步骤的顺序代表循环(在下文中也称为“高丝氨酸循环”)，其非限制性实例显示在图1中。发明人努力提供更有效的从上述丝氨酸循环开始的甲醛同化方法，并提供了其改进的变体，其允许更有效地掺入甲醛。所提供的途径还具有以下优点：它可以容易地在经常用于生物技术生产方法的微生物(如大肠杆菌)中实施。
在高丝氨酸循环中，丙酮酸与甲醛缩合以产生非天然代谢物4-羟基-2-氧代丁酸(HOB)(Bouzon等，ACS Synthetic Biology 6(2017)，1520-1533)，其随后胺化成高丝氨酸。发现这些反应中的第一个(图1中的项(1))被大肠杆菌2-酮-3-脱氧-L-鼠李糖酸醛缩酶(RhmA)混杂催化(Hernandez等，ACS Catal.7(2017)，1707-1711)。后一反应-HOB胺化(图1中的目(2))由许多氨基转移酶(Hernandez等，ACS Catal.7(2017)，1707-1711；Walther等，Metab.Eng.45(2018)，237-245；Zhong等，ACS Synthetic Biology 8(2019)，587-595)以及氨基酸脱氢酶(如(工程化的)谷氨酸脱氢酶)(Chen等，Biotechnol.J.10(2015)，284-289)支持。虽然文献主要报道了反向反应，但它也可以用于HOB胺化的方向，因为它是可逆的。这个途径有效地用提供了产生C4中间体的替代方式的甲醛同化反应代替羧化反应(通过磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)。然后将高丝氨酸转化为苏氨酸，例如通过高丝氨酸激酶(ThrB，图1中的项(3))和苏氨酸合酶(ThrC，图1中的项(4))的作用。苏氨酸被切割以产生甘氨酸和乙醛。这可以例如通过利用苏氨酸醛缩酶(图1中的项(5)，例如通过图1中的项(6)的催化SAL反应的相同苏氨酸醛缩酶(LtaE))来实现，以再生甘氨酸并产生乙醛。所产生的乙醛可以例如进一步氧化为乙酰-CoA并同化至中心代谢。
在高丝氨酸循环中，由苏氨酸切割产生的甘氨酸直接与甲醛缩合以产生丝氨酸。此前发现这个反应(图1中的项(6))(本文也称为丝氨酸醛缩酶(SAL)反应)被苏氨酸醛缩酶(LtaE)混杂催化(体外)(Contestabile等，Eur.J.Biochem.268(2001)，6508-6525)。SAL反应绕过了已知的非常长的、多辅因子依赖性的和ATP低效的用于将甲醛同化成5,10-亚甲基-四氢叶酸(CH2-THF)的途径(Crowther等，J.Bacteriol.190(2008)，5057-5062)。如在先前提出的修饰的丝氨酸循环内那样(Yu和Liao，Nature Communications 9(2018)，3992；Bar-Even，Biochemistry 55(2016)，3851-3863)，丝氨酸随后通过丝氨酸脱氨酶被脱氨成丙酮酸(图1中的项目(7))，绕过更长的经由甘油酸的途径，其还涉及高毒性的中间体羟基丙酮酸(Kim和Copley，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 109(2012)，E2856-2864)。所得到的丙酮酸随后可以用于方法的步骤(1)中，从而闭环。
显示了这种新提出的合成途径在生物质产率、热力学有利性以及在宿主内源性代谢中的实施方面可以胜过丝氨酸循环及其已知变体。
发明人还可以证明该循环的体内活性，且特别是依赖于非天然反应的途径的那些反应的功能性。更确切地说，发明人通过实验证明了不同途径区段的体内活性，包括所有所需的活性，特别是混杂酶活性，其可以由宿主细胞本身提供，而不需要对其进行遗传修饰以表达这些酶活性。该循环可以有效地提供生物质生产所必需的组件。本申请中提供的数据证实所提出的途径将允许甲醇(经由甲醛)的有效同化，并且因此实施这种单碳原料高效转化成商业化学品。
根据本发明的方法与已知的丝氨酸循环的不同之处在于，例如，用甲醛同化替代了CO2固定。为此，它依赖于由醛缩酶(混杂地)催化的两个甲醛缩合反应。
如上所述，根据本发明的方法或途径允许掺入甲醛。术语“掺入甲醛”意指甲醛被同化成碳化合物，所述碳化合物是微生物中心代谢的一部分，并且因此可以转化成生物质和/或所需化合物。因此，该方法/途径可用于将甲醛同化成碳化合物并将其掺入生物质中。
方法的步骤1：丙酮酸与甲醛缩合以产生4-羟基-2-氧代丁酸(HOB)
在该方法/途径的第一步中，丙酮酸在酶促催化反应中与甲醛缩合，以产生4-羟基-2-氧代丁酸(HOB)。
在优选实施方案中，该缩合通过利用醛缩酶并且更优选地利用归类于EC4.1.2._中的醛缩酶来实现。
在本发明的方法/途径的上下文中可能特别有用的归类于EC 4.1.2._中的醛缩酶的实例是选自以下的醛缩酶：
(i)归类于EC 4.1.2.53中的醛缩酶(2-酮-3-脱氧-L-鼠李糖酸醛缩酶)；
(ii)归类于EC 4.1.2.51中的醛缩酶(2-脱氢-3-脱氧-D-葡萄糖酸醛缩酶)；
(iii)归类于EC 4.1.2.28中的醛缩酶(2-脱氢-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶)；
(iv)归类于EC 4.1.2.20中的醛缩酶(2-脱氢-3-脱氧葡糖二酸醛缩酶(2-dehydro-3-deoxyglucarate aldolase))。
在优选实施方案中，醛缩酶是属于HpcH醛缩酶家族的醛缩酶。分类为属于HpcH醛缩酶家族的醛缩酶的特征在于它们的结构域被称为“HpcH”(PF03328；http://pfam.xfam.org/family/PF03328)。此外，此类醛缩酶的特征优选在于使用涉及用于供体结合和烯醇化的二价金属阳离子的催化机制。此类醛缩酶的实例是分类为EC 4.1.2.53或分类为EC 4.1.2.20的醛缩酶。
在另一个实施方案中，醛缩酶是属于DHDPS醛缩酶家族的醛缩酶。分类为属于DHDPS醛缩酶家族的醛缩酶的特征在于它们的结构域被称为“DHDPS”(PF00701，http://pfam.xfam.org/familv/PF00701)。此外，此类醛缩酶的特征优选在于使用涉及催化性赖氨酸残基以与供体基材形成席夫碱的催化机制。此类醛缩酶的实例是分类为EC 4.1.2.51或分类为EC 4.1.2.28的醛缩酶。
丙酮酸与甲醛缩合成4-羟基-2-氧代丁酸(HOB)是未知的自然发生的反应。然而，文献中有报道(Hernandez等，ACS Catal.7(2017)，1707-1711)，来自大肠杆菌的醛缩酶，即RhmA/YfaU(EC 4.1.2.53)蛋白，可以混杂地催化这种转化。此外，本发明人可以表明，这种转化实际上可以由各种醛缩酶以混杂的方式催化，即这些酶可以使用丙酮酸和甲醛作为底物，尽管它们的天然底物不同于这些化合物。此外，如从所附实施例中显而易见的，本发明人还可以表明，相应的醛缩酶能够在体内催化相应的反应，并且达到导致丙酮酸和甲醛有效缩合成4-羟基-2-氧代丁酸(HOB)的程度。
归类于EC 4.1.2.53(2-酮-3-脱氧-L-鼠李糖酸醛缩酶)中的醛缩酶天然地催化反应
Figure BDA0003890907080000051
即2-脱氢-3-脱氧-L-鼠李糖酸至丙酮酸和(S)-乳醛的可逆的retro-aldo裂解(Rakus等，Biochemistry 47(2008)，9944-9954；Read等，Biochemistry 47(2008)，9955-9965)。
这种酶已经在几种生物体中被鉴定，例如在Azetobacter vinelandi、Scheffersomyces stipitis和多形许旺酵母(Schwanniomyces polymorphus)以及大肠杆菌中(UniProt登录号：P76469和D3QKU2)。原则上，任何2-酮-3-脱氧-L-鼠李糖酸醛缩酶(EC4.1.2.53)都可用于根据本发明的方法中，只要它可以催化丙酮酸与甲醛缩合成4-羟基-2-氧代丁酸(HOB)即可。在优选实施方案中，使用来自大肠杆菌的酶，特别是由大肠杆菌的rhmA基因或由大肠杆菌的yfaU基因编码的酶(Hernandez等，ACS Catal.7(2017)，1707-1711)。
在优选实施方案中，这种酶具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或显示与SEQID NO:1至少x％同源并具有2-酮-3-脱氧-L-鼠李糖酸醛缩酶(EC 4.1.2.53)活性的氨基酸序列，其中x为60至100之间的整数，优选65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中这种酶能够催化丙酮酸与甲醛缩合成4-羟基-2-氧代丁酸(HOB)。
优选地，通过将相应序列与SEQ ID NO:1的氨基酸序列进行比较来确定同一性程度。
关于如本申请中所述的序列同一性的确定，通常应当应用：比较的序列不具有相同的长度时，同一性程度是指较短序列中与较长序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，或者是指较长序列中与较短序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。优选地，是指较短序列中与较长序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。序列同一性程度可以通过优选使用本领域熟知的算法和软件(如具有EMBOSS NEEDLE软件的Needleman-Wunsch算法)进行成对比对来确定。
应用该方法来确定特定序列是否与参考序列例如至少60％相同时，可以使用EMBOSS NEEDLE软件的默认设置，其限定如下：
-矩阵：BLOSUM62
-空位开放：10
-空位延伸：0.5
-无末端空位罚分。
优选地，在比对序列的整个长度上计算同一性程度。
归类于EC 4.1.2.51(2-脱氢-3-脱氧-D-葡萄糖酸醛缩酶)中的醛缩酶天然地催化反应
Figure BDA0003890907080000061
即从丙酮酸和甘油醛形成2-酮-3-脱氧-葡糖酸(KDG)(Bhaskar等，Proteins 79(2011)，1132-1142)，
或反应(Liu等，Appl.Microbiol.Biotechnol 97(2013)，3409-3417)：
Figure BDA0003890907080000062
例如，已经在Picrophilus torridus和大肠杆菌中鉴定了这种酶。原则上，任何2-脱氢-3-脱氧-D-葡萄糖酸醛缩酶(EC 4.1.2.51)都可用于根据本发明的方法中，只要它可以催化丙酮酸与甲醛缩合成4-羟基-2-氧代丁酸(HOB)即可。在优选的实施方案中，使用来自大肠杆菌的酶，特别是由大肠杆菌的yagE基因(UniProt登录号P75682)编码的酶。
在优选的实施方案中，这种酶具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或显示与SEQ ID NO:2至少x％同源并具有2-脱氢-3-脱氧-D-葡萄糖酸醛缩酶(EC 4.1.2.51)活性的氨基酸序列，其中x是60至100之间的整数，优选65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中这种酶能够催化丙酮酸与甲醛缩合成4-羟基-2-氧代丁酸(HOB)。
优选地，通过将相应序列与SEQ ID NO:2的氨基酸序列进行比较来确定同一性程度。关于序列同一性程度的确定，同样适用如上文所述的。
归类于EC 4.1.2.28中的醛缩酶(2-脱氢-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶)天然催化反应(Liu等，Appl.Microbiol.Biotechnol 97(2013)，3409-3417)：
Figure BDA0003890907080000071
已经例如在假单胞菌属(Pseudomonas)(Dahms,A.S.；Biochem.Biophys.Res.Commun.60，1433-1439(1974))和大肠杆菌(Uniprot登录号：P39359)中鉴定了这种酶。原则上，任何2-脱氢-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶(EC 4.1.2.28)都可用于根据本发明的方法中，只要它可以催化丙酮酸与甲醛缩合成4-羟基-2-氧代丁酸(HOB)即可。在优选实施方案中，使用来自大肠杆菌的酶，特别是由大肠杆菌的yjhH基因编码的酶(Liu等，在上述引文中，UniProt登录号:P39359)。
在优选实施方案中，这种酶具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，或显示与SEQID NO:3至少x％同源并具有2-脱氢-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶(EC 4.1.2.28)活性的氨基酸序列，其中x是60至100之间的整数，优选65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中这种酶能够催化丙酮酸与甲醛缩合成4-羟基-2-氧代丁酸(HOB)。
优选地，通过将相应序列与SEQ ID NO:3的氨基酸序列进行比较来确定同一性程度。关于序列同一性程度的确定，同样适用如上文所述的。
归类于EC 4.1.2.20中的醛缩酶(2-脱氢-3-脱氧葡糖二酸醛缩酶)天然催化反应
Figure BDA0003890907080000081
如，例如，，描述于Hubbard等，Biochemistry 37(1998)，14369-14375中。
已经在几种生物体中鉴定出该酶，例如产气克雷伯氏菌(Klebsiellaaerogenes)、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、Picrophilus torridus和大肠杆菌(UniProt登录号：P23522)。原则上，任何2-脱氢-3-脱氧葡糖二酸醛缩酶(EC4.1.2.20)都可用于根据本发明的方法中，只要它可以催化丙酮酸与甲醛缩合成4-羟基-2-氧代丁酸(HBO)即可。在优选的实施方案中，使用来自大肠杆菌的酶，特别是由大肠杆菌的garL基因(UniProt登录号:P23522)编码的酶。
在优选的实施方案中，这种酶具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，或显示与SEQ ID NO:4至少x％同源并具有2-脱氢-3-脱氧葡糖二酸醛缩酶(EC 4.1.2.20)活性的氨基酸序列，其中x是60至100之间的整数，优选65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中这种酶能够催化丙酮酸与甲醛缩合成4-羟基-2-氧代丁酸(HOB)。
优选地，通过将相应序列与SEQ ID NO:4的氨基酸序列进行比较来确定同一性程度。关于序列同一性程度的确定，同样适用如上文所述的。
方法的步骤2：将4-羟基-2-氧代丁酸(HOB)转化为高丝氨酸
根据本发明的方法/途径，步骤(1)中产生的4-羟基-2-氧代丁酸(HOB)在步骤(2)中通过胺化反应进一步酶促转化为高丝氨酸。
已知在自然界中，三种不同的酶家族可以将氨基酸转化为相应的α-酮酸(或可逆反应)，即：(1)氨基酸转氨酶(氨基转移酶)、(2)氨基酸脱氢酶；和(3)氨基酸脱氨酶(氧化酶)。在本发明的方法中，原则上可以使用来自这些组的任一种酶来催化HOB转化为高丝氨酸。由于基本上所有生物体(包括所有微生物)表达上述三组的酶，因此在生物体中体内实施时，本发明的方法可以依赖于上述三组中任一种内源产生的酶活性来实现HOB转化为高丝氨酸。
胺化可以优选地通过氨基转移酶或通过氨基酸脱氢酶来实现。在优选实施方案中，通过利用归类于EC 2.6.1._中的氨基转移酶或通过归类于EC 1.4.1._中的氨基酸脱氢酶来实现胺化。特别地，在文献中已经报道了这种反应(在大多数报道中是反向的)通过许多氨基转移酶(参见，例如，Bouzon等，ACS Synth.Biol.6(2017)，1520-1533；Hernandez等，ACS Catal.7(2017)，1707-1711；Walther等，Metab.Eng.45(2018)，237-245；Zhong等，ACSSynthetic Biology8(2019)，587-595)以及氨基酸脱氢酶，如(工程化的)谷氨酸脱氢酶(Chen等，Biotechnol.J.10(2015)，284-289)来支持。
归类于EC 2.6.1._中的转氨酶用于进行HOB转化为高丝氨酸的用途已经在文献中由描述，例如Bouzon等(ACS Synth.Biol.6(2017)，1520-1533)。
在本发明的方法/途径的上下文中可能特别有用的归类于EC 2.6.1._中的氨基转移酶的实例是选自以下的氨基转移酶：
(i)归类于EC 2.6.1.2中的氨基转移酶(谷氨酸-丙酮酸氨基转移酶；也称为丙氨酸转氨酶)；
(ii)归类于EC 2.6.1.1中的氨基转移酶(天冬氨酸氨基转移酶；也称为天冬氨酸转氨酶)；
(iii)归类于EC 2.6.1.42中的氨基转移酶(支链氨基酸氨基转移酶)。
归类于EC 2.6.1.2中的氨基转移酶(谷氨酸-丙酮酸氨基转移酶；也称为丙氨酸转氨酶)天然催化反应：
Figure BDA0003890907080000091
这种酶存在于多种生物体中，包括真核和原核生物，如动物、植物、真菌和细菌。原则上，任何谷氨酸-丙酮酸氨基转移酶(EC 2.6.1.2)都可用于根据本发明的方法中，只要它可以将HOB转化为高丝氨酸。在优选实施方案中，使用来自大肠杆菌的酶，特别是由大肠杆菌的alaC和alaA基因编码的酶(UniProt登录号P77434和P0A959)。Bouzon等(ACSSynth.Biol.6(2017)，1520-1533)已经描述了谷氨酸-丙酮酸氨基转移酶(EC 2.6.1.2)用于将L-高丝氨酸和2-氧代戊二酸可逆转化为HOB和L-谷氨酸的用途。Bouzon等(ACSSynth.Biol.6(2017)，1520-1533)使用的来自大肠杆菌的酶显示在位置142和275处的取代，即A142P和Y275D取代，其显著提高酶对高丝氨酸的催化效率。因此，在优选实施方案中，使用谷氨酸-丙酮酸氨基转移酶(EC 2.6.1.2)，其在大肠杆菌AlaC蛋白序列的位置142和/或位置275或在与这些位置对应的位置处显示取代，甚至更优选在位置142(或相应位置)从A至P的取代和/或在位置275(或相应位置)从Y至D的取代。
归类于EC 2.6.1.1中的氨基转移酶(天冬氨酸氨基转移酶；也称为天冬氨酸转氨酶)天然催化反应：
Figure BDA0003890907080000101
这种酶存在于多种生物体中，包括真核和原核生物，如动物、植物、真菌和细菌。原则上，任何天冬氨酸转氨酶(EC 2.6.1.1)都可用于根据本发明的方法中，只要它可以将HOB转化为高丝氨酸即可。在优选实施方案中，使用来自大肠杆菌的酶，特别是由大肠杆菌的aspC基因(UniProt登录号P00509)编码的酶。对于该酶，已经报道其可以催化这个反应(Walther等，Metabolic Engin.45(2018)，237-245；Zhong等，ACS Synthetic Biology 8(2019)587-595)。
归类于EC 2.6.1.42(支链氨基酸氨基转移酶)的氨基转移酶天然催化反应：
Figure BDA0003890907080000102
Figure BDA0003890907080000103
这种酶存在于多种生物体中，包括真核和原核生物，如动物、植物、真菌和细菌。原则上，任何支链氨基酸氨基转移酶(EC 2.6.1.42)都可用于根据本发明的方法中，只要它可以将HOB转化为高丝氨酸。在优选实施方案中，使用来自大肠杆菌的酶，特别是由大肠杆菌的ilvE基因(UniProt登录号P0AB80)编码的酶。对于这种酶，已经报道其可以催化这个反应(Walther等，Metabolic Engin.45(2018)，237-245)。
归类于EC 1.4.1._的氨基酸脱氢酶用于进行将HOB转化为高丝氨酸的用途也已在文献中描述，例如Chen等(Biotechnol.J.10(2015)，284-289)。在本发明的方法/途径的上下文中可能特别有用的归类于EC 1.4.1._的氨基酸脱氢酶的实例是归类于EC 1.4.1.4的氨基酸脱氢酶(谷氨酸脱氢酶(NADP+))。
谷氨酸脱氢酶(NADP+)(EC 1.4.1.4)天然催化反应：
Figure BDA0003890907080000104
这种酶存在于多种生物体中，包括真核和原核生物，如动物、植物、真菌和细菌。原则上，任何谷氨酸脱氢酶(NADP+)(EC 1.4.1.4)都可用于根据本发明的方法中，只要它可以将HOB转化为高丝氨酸即可。在优选实施方案中，使用来自大肠杆菌的酶，特别是由大肠杆菌的gdhA基因(UniProt登录号P00370)编码的酶。
如Chen等(Biotechnol.J.10(2015)，284-289)所报道的，谷氨酸脱氢酶(NADP+)(EC 1.4.1.4)可以接受高丝氨酸作为底物，尽管活性低。然而，Chen等(在上述引文中)表明了可以提供这种酶的突变体，其显示出强烈增加的使用高丝氨酸作为底物的活性。因此，在优选实施方案中，采用谷氨酸脱氢酶(NADP+)(EC 1.4.1.4)的突变形式，其在使用高丝氨酸作为底物时显示增加的活性，特别是Chen等(Biotechnol.J.10(2015)，284-289)中公开的突变形式。
方法的步骤3：将高丝氨酸转化为苏氨酸
根据本发明方法的步骤(3)将步骤(2)中产生的高丝氨酸转化为苏氨酸可以通过本领域技术人员已知的方法来实现。在优选实施方案中，通过以下来进行步骤(2)中产生的高丝氨酸转化为苏氨酸：
(i)将由此产生的高丝氨酸磷酸化以产生o-磷酸高丝氨酸；和
(ii)将由此产生的o-磷酸高丝氨酸脱磷酸化以产生苏氨酸。
这些是天然的反应。步骤(i)的反应，即高丝氨酸磷酸化以产生o-磷酸高丝氨酸，由归类于EC 2.7.1.39的酶(高丝氨酸激酶)来催化。反应根据以下方案来进行：
Figure BDA0003890907080000111
这种酶存在于多种生物体中，包括真核和原核生物，如植物、真菌和细菌。原则上，任何高丝氨酸激酶(EC 2.7.1.39)都可用于根据本发明的方法中，只要它可以将高丝氨酸转化为o-磷酸高丝氨酸即可。在优选的实施方案中，使用来自大肠杆菌的酶，特别是由大肠杆菌的thrB基因(UniProt登录号P00547)编码的酶。
步骤(ii)的反应，即所产生的o-磷酸高丝氨酸的脱磷酸化以产生苏氨酸，由归类于EC EC 4.2.3.1中的酶(苏氨酸合酶)来催化。反应根据以下方案来进行：
Figure BDA0003890907080000112
这种酶存在于多种生物体中，包括真核和原核生物，如植物、真菌和细菌。原则上，任何苏氨酸合酶(EC 4.2.3.1)都可用于根据本发明的方法中，只要它可以将o-磷酸高丝氨酸转化为苏氨酸即可。在优选的实施方案中，使用来自大肠杆菌的酶，特别是由大肠杆菌的thrC基因(UniProt登录号P00934)编码的酶。
方法的步骤4：将苏氨酸转化为甘氨酸和乙醛
在本发明方法的步骤(4)中，将苏氨酸转化为甘氨酸。这种转化可以以不同的方式实现。
在一个实施方案中，将苏氨酸转化为甘氨酸和乙醛。这种转化可以例如通过使用苏氨酸醛缩酶来实现。苏氨酸醛缩酶是将苏氨酸(或别苏氨酸)转化为甘氨酸和乙醛的酶。合适的苏氨酸醛缩酶的实例是归类于EC 4.1.2.5或EC 4.1.2.48中的苏氨酸醛缩酶。
归类于EC 4.1.2.5中的苏氨酸醛缩酶已经在多种生物体中得到了鉴定，包括真核和原核生物，如植物、动物和细菌。原则上，归类于EC 4.1.2.5中的任何苏氨酸醛缩酶都可用于根据本发明的方法中，只要它可以将苏氨酸转化为甘氨酸和乙醛即可。
归类于EC 4.1.2.48中的苏氨酸醛缩酶(也称为低特异性L-苏氨酸醛缩酶)已经在多种生物体中得到了鉴定，包括真核和原核生物，如真菌和细菌。原则上，归类于EC4.1.2.48中的任何苏氨酸醛缩酶都可用于根据本发明的方法中，只要它可以将苏氨酸转化为甘氨酸和乙醛即可。在优选的实施方案中，使用来自大肠杆菌的酶，特别是由大肠杆菌的ltaE基因(UniProt登录号P75823)编码的酶。
在优选的实施方案中，这种酶具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，或显示与SEQ ID NO:3至少x％同源并具有低特异性L-苏氨酸醛缩酶(EC 4.1.2.48)活性的氨基酸序列，其中x是60至100之间的整数，优选65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中这种酶能够催化苏氨酸转化为甘氨酸和乙醛。
优选地，通过将相应序列与SEQ ID NO:5的氨基酸序列进行比较来确定同一性程度。关于序列同一性程度的确定，同样适用如上文所述的。
在可替代的实施方案中，苏氨酸可以在步骤(5)中转化为甘氨酸和乙酰-CoA。这种转化可以例如通过苏氨酸脱氢酶(EC 1.1.1.103)和2-氨基-3-酮丁酸CoA连接酶(EC2.3.1.29)的组合来实现。
苏氨酸脱氢酶(EC 1.1.1.103)天然地催化反应：
Figure BDA0003890907080000121
归类于EC 1.1.1.103中的苏氨酸脱氢酶已经在多种生物体中鉴定，包括真核和原核生物，如动物和细菌。原则上，归类于EC 1.1.1.103中的任何苏氨酸脱氢酶都可用于根据本发明的方法中，只要它可以将苏氨酸转化为2-氨基-3-氧代丁酸。在优选的实施方案中，使用来自大肠杆菌的酶，特别是由大肠杆菌的tdh基因(UniProt登录号P07913)编码的酶。
2-氨基-3-酮丁酸CoA连接酶(EC 2.3.1.29；也称为甘氨酸C-乙酰转移酶)天然地催化反应：
Figure BDA0003890907080000131
已经在多种生物体中鉴定了该酶，包括真核和原核生物，如动物和细菌。原则上，归类于EC 2.3.1.29的任何2-氨基-3-酮丁酸CoA连接酶都可用于根据本发明的方法中，只要它可以将2-氨基-3-氧代丁酸和CoA转化为甘氨酸和乙酰-CoA即可。在优选的实施方案中，使用来自大肠杆菌的酶，特别是由大肠杆菌的kbl基因(UniProt登录号P0AB77)编码的酶。
[步骤5]
根据本发明方法的步骤(5)，甘氨酸与甲醛缩合以产生丝氨酸。这种缩合反应可以例如通过利用苏氨酸醛缩酶来实现。关于苏氨酸醛缩酶的定义，如上文结合该方法的步骤(4)所述的相同内容也适用。因此，在优选的实施方案中，这个步骤中使用的苏氨酸醛缩酶是归类于EC 4.1.2.5或EC 4.1.2.48的苏氨酸醛缩酶。关于优选实施方案，如上文结合步骤(4)所述的相同内容也适用。
在特别优选的实施方案中，这个步骤中使用的苏氨酸醛缩酶是归类于EC4.1.2.48中的苏氨酸醛缩酶，甚至更优选来自大肠杆菌的由大肠杆菌的latE基因(UniProt登录号P75823)编码的苏氨酸醛缩酶。在Contestabile等(Eur.J.Biochem 268(2001)，6508-6525)中已经报道了苏氨酸醛缩酶确实可以催化甘氨酸与甲醛的这种缩合，从而产生丝氨酸。
[步骤6]
根据本发明方法的步骤(6)，步骤(5)中产生的丝氨酸随后被进一步转化以产生丙酮酸。用于实现这种转化的酶促反应和相应的酶是本领域技术人员已知的。在一个实施方案中，丝氨酸向丙酮酸的转化通过脱氨基反应来实现。催化这种反应的酶是本领域技术人员已知的，包括例如丝氨酸脱氨酶(EC 4.3.1.17；也称为L-丝氨酸氨裂解酶)和苏氨酸脱氨酶(EC 4.3.1.19；也称为苏氨酸氨裂解酶)。
将丝氨酸转化为丙酮酸的替代途径是通过氨基转移酶(2.6.1.X)或氨基酸脱氢酶(EC 1.4.1.X)从丝氨酸转化为羟基丙酮酸。然后通过羟基丙酮酸还原酶(1.1.1.29或1.1.1.81)将羟基丙酮酸转化为甘油酸，其随后通过甘油酸2-激酶(2.7.1.165)进一步转化为2-磷酸甘油酸。后一种酶可以用甘油酸3-激酶(EC 2.7.1.31)和磷酸甘油酸变位酶(EC5.4.2.1)的组合来代替。然后可以通过烯醇化酶(EC 4.2.1.11)将磷酸甘油酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸，其随后可以通过丙酮酸激酶(EC 2.7.1.40)转化为丙酮酸。
在根据本发明的方法的缩合步骤(1)和(5)中使用的甲醛可以通过本领域技术人员已知的手段和方法提供。在一个实施方案中，甲醛是外部提供的，即添加到反应混合物或培养基中，其中培养适于催化根据本发明的方法的反应的生物体。
在另一个实施方案中，甲醛本身通过酶促转化来提供。本领域技术人员知道可以从其通过酶促产生甲醛的各种底物。实例是例如甲醇、甲酸、甲烷、卤代甲烷和甲胺(或其衍生物)以及甲基化氨基酸(例如肌氨酸、甜菜碱和甘氨酸)。
在优选的实施方案中，通过将甲醇酶促转化为甲醛来提供甲醛，优选通过氧化反应。
在这种情况下可以使用的一种类型的酶是被分类为EC 1.1.1.244的甲醇脱氢酶(NAD+)。这种酶催化反应：
Figure BDA0003890907080000141
可以在根据本发明的方法中使用的这种甲醇脱氢酶的一个实例是由谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)的adhA基因编码的甲醇脱氢酶。对于这种酶，文献中已经显示它可以将甲醇转化为甲醛(He等，ACS Synthetic Biology 7(2018)，1601-1611)。可
用于从甲醇生产甲醛的另一种类型的酶是甲醇脱氢酶(细胞色素C，也称为“醌依赖性的”)，其分类为EC 1.1.2.7。
可用于从甲醇生产甲醛的另一种类型的酶是甲醇氧化酶，例如归类于EC1.1.3.13的甲醇氧化酶。
如上所述，在本发明方法的缩合步骤(1)和(5)中使用的甲醛也可以从甲烷通过酶促产生来提供。这可以例如通过将甲烷转化为甲醇来实现，然后可以如上所述转化为甲醛。甲烷向甲醇的转化可以例如通过利用甲烷单加氧酶(EC 1.14.14.3或1.14.13.25)来实现。
如上文进一步提及的，在本发明方法的缩合步骤(1)和(5)中使用的甲醛也可以从卤代甲烷通过酶促产生来提供。这可以例如通过将卤代甲烷(例如二氯甲烷)转化为甲醛来实现。这种转化可以例如通过利用脱卤素酶，优选脱卤素酶(归类于EC 4.5.1.3)来实现。
可以通过酶促产生甲醛的另一种底物是甲胺(或其衍生物)。甲胺(或其衍生物)可以例如通过氧化转化为甲醛。这可以通过例如使用甲胺脱氢酶(归类于EC 1.4.9.1中)或伯胺氧化酶(归类于EC 1.4.3.21中)来实现。
此外，还可以从甲酸开始通过酶促提供甲醛。例如，已经在Siegel等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 24(2015)，3704-3709)中描述了甲酸可以通过乙酰-CoA合酶(ACS)转化为甲酰-CoA，其随后可以通过利用乙醛脱氢酶(ACDH)进一步转化为甲醛。
根据本发明的方法可以在体外或体内进行。将理解体外反应为其中不使用细胞的反应，即无细胞反应。因此，体外优选表示在无细胞系统中。在一个实施方案中，术语“体外”意指在分离的酶(或任选地包含可能需要的辅因子的酶系统)的存在下。在一个实施方案中，该方法中使用的酶以纯化形式使用。
为了在体外进行该方法，将用于反应的底物和酶在允许酶具有活性并发生酶促转化的条件(缓冲液、温度、共底物、辅因子等)下温育。使反应进行足以产生相应产物的时间。相应产物的产生可以通过本领域已知的方法测量，如可能与质谱检测连接的气相色谱。
酶可以是允许酶促反应发生的任何合适的形式。它们可以是纯化的或部分纯化的，或者是粗细胞提取物或部分纯化的提取物的形式。也可以将酶固定在合适的载体上。
在另一个实施方案中，根据本发明的方法在生物体(优选微生物)的存在下在培养物中进行，所述生物体产生用于如本文以上所描述的根据本发明的方法的转化的如上文所描述的酶。
采用微生物进行根据本发明的方法的方法称为“体内”方法。可以使用天然产生上述酶的微生物用于根据本发明的方法的转化，或使用已经遗传修饰使得其表达(包括过表达)一种或多种这样的酶的微生物。
在一个实施方案中，本发明方法中使用的微生物是天然表达催化本发明方法的步骤(2)、(3)、(4)和(6)的酶的微生物，并且其中催化步骤(1)和(5)的酶被过表达。
因此，微生物可以是工程化的微生物，其表达至少一些上述用于根据本发明的方法的转化的酶，即，在其基因组中(或在质粒上)具有编码此类酶的核苷酸序列，并且其已经修饰以过表达。表达可以组成性地或以诱导或调控的方式发生。
在另一个实施方案中，微生物可以是已经通过引入一个或多个核酸分子进行遗传修饰的微生物，所述核酸分子含有编码上述用于根据本发明的方法的转化的一种或多种酶的核苷酸序列。核酸分子可以稳定地整合到微生物的基因组中，或者可以以染色体外方式存在，例如在质粒上。
这样的遗传修饰的微生物可以是例如不天然表达上述用于根据本发明的方法的转化的所有酶并且已经被遗传修饰以表达这样的酶的微生物，或者是天然表达这样的酶并且已经被遗传修饰以增加所述微生物中的相应活性的微生物，例如用编码相应酶的核酸(例如载体)转化，和/或在编码酶的内源性核苷酸序列前插入启动子或引入有效的核糖体结合位点。
然而，本发明优选排除在自然界中发现的天然存在的以它们在自然界中存在的水平表达如上所述的酶的微生物。相反，本发明的和在本发明的方法中使用的微生物优选是非天然存在的微生物，无论其是否已被遗传修饰以表达(包括过表达)通常不存在于其基因组中的至少一个外源性核酸分子。
在一个实施方案中，与本发明结合使用的(微)生物优选是非天然存在的(微)生物，即它们是与天然存在的或(微)生物显著不同的并且在自然界中不存在的(微)生物。
关于酶，它们可以是天然存在的酶，或者它们可以是天然存在的酶的变体，其本身不存在于自然界中。此类变体包括例如突变体，特别是通过分子生物学方法制备的突变体，其显示出改进的特性，如更高的酶活性、更高的底物特异性、更高的耐温性等。关于(微)生物，它们优选是如本文所述的遗传修饰的生物体，其由于遗传修饰而不同于天然存在的生物体。遗传修饰的生物体是非天然存在的生物体，即，其不能在自然界中发现，并且由于引入外源核酸分子而与天然存在的生物体显著不同。
通过过表达如上文所述的外源性或内源性酶，酶的浓度显著高于自然界中发现的浓度。这种过表达可导致相应基因修饰的微生物中代谢通量的方向进入某一方向。这种过表达还可以迫使本发明方法的反应(其使用相应酶的非天然底物)进入某一方向。优选地，术语“过表达”意指与相应的非遗传修饰的微生物相比，在表达所述酶的遗传修饰的微生物中，相应酶的活性高至少5％、10％、20％、30％或40％。
本发明方法的一些步骤(例如步骤(1)、(2)和(5))依赖于被理解为不由相应酶根据其“天然”反应催化的转化。这意味着已知酶天然催化不同的反应，特别是使用不同的底物。本发明利用以下事实：发现某些酶也能够使用“非天然”底物并催化相应的转化。酶使用“非天然”底物的能力也称为“混杂”活性。“非天然”底物应理解为在自然界中不受相应酶作用(或仅在较小程度上)的分子，即使它实际上可以与内源酶一起共存于微生物中。这种“非天然”底物在自然界中不被微生物转化(或仅在较小程度上)，因为其他底物是优选的(例如“天然底物”)。因此，本发明考虑将可接受非天然底物的酶用于某些步骤。
在本发明的上下文中，微生物也可能是天然不具有本发明方法所需的一种或多种酶活性但经遗传修饰以包含允许相应酶表达的核苷酸序列的微生物。类似地，微生物也可以是天然地具有相应的一种或多种酶活性但经遗传修饰以增强这样的一种或多种活性的微生物，例如通过引入编码相应酶的外源核苷酸序列或通过引入编码酶的内源基因的启动子以将内源性产生增加至过表达(非天然)水平。
如果使用天然表达相应酶的微生物，则可以修饰这样的微生物，使得相应的一种或多种活性在微生物中过表达。这可以例如通过在相应基因的启动子区域中实现突变或引入高表达启动子以产生确保基因更高表达的启动子来实现。或者，也可以如此突变基因以产生显示更高活性的酶。
通过使用表达上述用于本发明方法转化的酶的微生物，可以直接在培养基中进行本发明的方法，而不需要分离或纯化酶。
在一个实施方案中，根据本发明的方法中使用的生物体是已经遗传修饰以含有外源核酸分子的微生物，所述外源核酸分子编码至少一种上述用于根据本发明的方法的转化的酶。
在一个实施方案中，微生物已经遗传修饰以含有外源核酸分子，所述外源核酸分子编码可以催化根据本发明的方法的步骤(1)的转化的酶。
在一个实施方案中，微生物已经遗传修饰以含有编码可以催化根据本发明的方法的步骤(1)的转化的酶的外源核酸分子，并且已经遗传修饰以含有编码可以催化根据本发明的方法的步骤(5)的转化的酶的外源核酸分子。
在该上下文中，术语“外来的”或“外源的”意指核酸分子不天然存在于所述微生物中。这意味着它不存在于微生物中的相同结构或相同位置。在一个优选实施方案中，外源核酸分子是包含启动子和编码相应酶的编码序列的重组分子，其中驱动编码序列表达的启动子相对于编码序列是异源的。在此上下文中，“异源”意指启动子不是天然驱动所述编码序列表达的启动子，而是天然驱动不同编码序列表达的启动子，即其衍生自另一基因，或是合成启动子或嵌合启动子。优选地，启动子是微生物异源的启动子，即不是天然存在相应微生物中的启动子。甚至更优选地，启动子是诱导型启动子。用于在不同类型的生物体中，特别是在微生物中驱动表达的启动子是本领域技术人员熟知的。
在另一个实施方案中，核酸分子是微生物外源的，因为编码的酶对于微生物不是内源的，即不由未被遗传修饰时的微生物天然表达。换句话说，编码的酶相对于微生物是异源的。外源核酸分子可以以染色体外形式存在于微生物中，例如作为质粒，或稳定地整合在染色体中。稳定的整合是优选的。因此，遗传修饰可以包括例如将编码酶的相应基因整合到染色体中，或从在酶编码序列上游含有启动子的质粒表达酶，启动子和编码序列优选源自不同的生物体，或本领域技术人员已知的任何其他方法。
在本发明的上下文中，术语“微生物”是指细菌，以及真菌，如酵母，以及藻类和古细菌。在一个优选的实施方案中，微生物是细菌。原则上可以使用任何细菌。在根据本发明的方法中使用的优选细菌是芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、发酵单胞菌属(Zymomonas)或埃希氏菌属(Escherichia)的细菌。在特别优选的实施方案中，细菌属于埃希氏菌属，甚至更优选属于大肠杆菌(Escherichia coli)种。在另一个优选的实施方案中，细菌属于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)种或运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)种或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)种或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)种。
还可以使用极端嗜热细菌，如嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)，或来自梭菌科(Clostridiae)的厌氧细菌。
在另一个优选的实施方案中，微生物是真菌，更优选酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)或毕赤酵母属(Pichia)的真菌，且甚至更优选酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、黑曲霉(Aspergillus niger)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、圆毕赤酵母(Pichia torula)或产朊毕赤酵母(Pichia utilis)种的真菌。
在另一个实施方案中，根据本发明的方法利用表达至少一种用于上述根据本发明的转化的酶的光合微生物。优选地，微生物是光合细菌或微藻。在另一个实施方案中，微生物是藻类，更优选属于硅藻类的藻类。
在另一个实施方案中，根据本发明的方法利用能够代谢甲醇的微生物，例如嗜甲烷(methanothrophic)细菌、嗜甲基(methylotrophic)细菌、嗜甲烷酵母或嗜甲基酵母。
在另一个实施方案中，微生物是固C1微生物，优选重组固C1微生物。固C1微生物的性质没有特别限制，只要它是能够使用一氧化碳(CO)和包含CO的气态底物(如合成气)作为碳源和能源的微生物即可。合成气或合成气体是CO和CO2以及H2的混合物。相应的天然存在的(或遗传修饰的)能够利用CO并将其转化为乙酰-CoA的微生物是本领域已知的。这些生物体通常被称为产乙酸微生物(有时也称为一氧化碳营养型(carboxydotrophic)产乙酸微生物)。这些微生物使用Wood-Ljungdahl途径固定CO并将其转化为乙酰-CoA。此类微生物的实例属于梭菌科并且例如描述于WO 2009/094485；WO 2012/05905；WO 2013/180584；US2011/0236941；PNAS 107(29)：13087-13092(2010)；Current Opinion in Biotechnology23:36 4-381(2012)；Applied and Enviornmental Microbiology 77(15)：5467-5475。
在某些实施方案中，固C1微生物选自一氧化碳营养型产乙酸细菌。在优选的实施方案中，微生物选自自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、扬氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)、食一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)、德拉克梭菌(Clostridium drakei)、产粪梭菌(Clostridium scatologenes)、乙酸梭菌(Clostridium aceticum)、甲酸乙酸梭菌(Clostridium formicoaceticum)、巨大梭菌(Clostridium magnum)、甲基营养丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)、巴克氏碱杆菌(Alkalibaculum bacchii)、Blautia producta、Eubacterium limosum、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、热自养穆尔氏菌(Moorella thermautotrophica)、卵形鼠抱菌(Sporomusa ovata)、银醋鼠抱菌(Sporomusa silvacetica)、Sporomusasphaeroides、Oxobacter pfennigii和Thermoanaerobacter kiuvi。
在微生物中实施时，为了改善通过“高丝氨酸循环”的通量，将可能在相应微生物中内源性发生的某些酶活性进行失活可能是有利的。
因此，在一个实施方案中，其中实施本发明方法的微生物是内源性含有编码甲醛解毒系统的操纵子并且其中该操纵子缺失或失活的微生物。在优选的实施方案中，微生物属于大肠杆菌种，并且是其中甲醛解毒(frmRAB)操纵子(Chen等，Metabol.Engineering 49(2018)，257-266)缺失或失活的微生物。这个系统也称为谷胱甘肽依赖性甲醛氧化系统。这个操纵子的失活或缺失确保甲醛不被去除并且可用于细胞生长。特别地，这个操纵子的失活应避免甲醛氧化成甲酸，这可能导致细胞内甲醛库的耗尽。
在另一个实施方案中，其中实施本发明方法的微生物是内源性含有编码催化丙酮酸转化为天冬氨酸半醛的一种/多种酶活性的基因并且其中这个/这些基因缺失或失活的微生物。在优选的实施方案中，所述基因是编码天冬氨酸半醛脱氢酶(EC 1.2.1.11)的基因。在优选的实施方案中，微生物属于大肠杆菌种，并且是其中编码所述酶的asd基因缺失或失活的微生物。
在另一个实施方案中，其中实施本发明的方法的微生物是内源性含有编码3-羟基-磷酸甘油酸脱氢酶(EC 1.1.1.95)并且其中这个基因缺失或失活的微生物。在优选的实施方案中，微生物属于大肠杆菌种，并且是其中编码所述酶的serA基因缺失或失活的微生物。
在另一个实施方案中，其中实施本发明方法的微生物是内源性含有编码丝氨酸羟甲基转移酶(EC 2.1.2.1)的基因并且其中这个基因缺失或失活的微生物。在优选的实施方案中，微生物属于大肠杆菌种，并且是其中编码所述酶的glyA基因缺失或失活的微生物。
在另一个实施方案中，其中实施本发明方法的微生物是内源性含有编码甘氨酸切割系统(GCS)的操纵子并且其中这个操纵子缺失或失活的微生物。在优选的实施方案中，微生物属于大肠杆菌种，并且是其中甘氨酸切割系统(gcvTHP)操纵子缺失或失活的微生物。大肠杆菌中的GCS操纵子编码三种酶，即GcvT、GcvH和GcvP，并且可以使整个操纵子或三种基因中的一种或多种失活。
在另一个实施方案中，其中实施本发明方法的微生物是内源性含有编码双功能天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶(EC 1.1.1.3)的基因并且其中这个基因缺失或失活的微生物。在优选的实施方案中，微生物属于大肠杆菌种，并且是其中编码所述酶的thrA基因缺失或失活的微生物。
在另一个实施方案中，其中实施本发明方法的微生物是内源性含有编码L-苏氨酸3-脱氢酶脱氢酶(EC 1.1.1.103)的基因并且其中这个基因缺失或失活的微生物。在优选的实施方案中，微生物属于大肠杆菌种，并且是其中编码所述酶的tdh基因缺失或失活的微生物。
在另一个实施方案中，其中实施本发明方法的微生物是内源性含有编码2-氨基-3-酮丁酸CoA连接酶(EC 2.3.1.29)的基因并且其中这个基因缺失或失活的微生物。在优选的实施方案中，微生物属于大肠杆菌种，并且是其中编码所述酶的kbl基因缺失或失活的微生物。
在另一个实施方案中，其中实施本发明方法的微生物是内源性含有编码乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.28)的基因并且其中这个基因缺失或失活的微生物。在优选的实施方案中，微生物属于大肠杆菌种，并且是其中编码所述酶的ldhA基因缺失或失活的微生物。
在另一个实施方案中，微生物显示了如上所述的基因缺失的任何可能的组合。
还可以想到在根据本发明的方法中使用微生物的组合，其中不同的微生物表达如上所述的不同的酶。下面还将进一步详细描述微生物的基因修饰以表达目的酶。
在另一个实施方案中，本发明的方法包括以(细胞)培养物的形式，优选以液体细胞培养物的形式提供携带一种或多种相应酶活性的生物体，优选微生物的步骤，随后的步骤是在允许表达相应酶的合适条件下在发酵罐(通常也称为生物反应器)中培养生物体，优选微生物，并且还包括实现如上文所述的本发明方法的酶促转化的步骤。合适的发酵罐或生物反应器装置和发酵条件是本领域技术人员已知的。生物反应器或发酵罐是指本领域已知的支持生物活性环境的任何制造或工程化装置或系统。因此，生物反应器或发酵罐可以是其中进行如本发明方法的化学/生物化学的容器，其涉及生物体，优选微生物和/或生物化学活性物质，即衍生自此类生物体或携带上述酶的生物体的上述酶。在生物反应器或发酵罐中，这个过程可以是需氧的或厌氧的。这些生物反应器通常是圆柱形的，并且尺寸范围可以从升到立方米，并且通常由不锈钢制成。在这个方面中，不受理论束缚，发酵罐或生物反应器可以以适于在例如分批培养、补料分批培养、灌注培养或恒化培养中培养生物体(优选微生物)的方式设计，所有这些通常是本领域已知的。
培养基可以是适于培养相应生物体或微生物的任何培养基。
通过利用微生物进行时，根据本发明的方法可以例如被设计为连续发酵培养方法或分批培养或本领域技术人员已知的任何合适的培养方法。
在根据本发明的方法中使用的酶可以是天然存在的酶或衍生自天然存在的酶的酶，例如通过引入突变或其他改变，其例如改变或改善酶活性、稳定性等。
用于修饰和/或改善蛋白质的所需酶活性的方法是本领域技术人员熟知的，并且包括例如随机诱变或定点诱变以及随后选择具有所需性质的酶或所谓的“定向进化”方法。
例如，对于原核细胞中的遗传修饰，可以将编码相应酶的核酸分子引入质粒中，所述质粒允许通过DNA序列的重组进行诱变或序列修饰。标准方法(参见Sambrook和Russell(2001)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，CSH Press，Cold Spring Harbor，NY，USA)允许进行碱基交换或添加天然或合成序列。可以通过使用与片段互补的适体和接头来连接DNA片段。此外，可以使用提供合适的限制性位点或去除多余的DNA或限制性位点的工程化措施。在其中插入、缺失或取代是可能的那些情况下，可以使用体外诱变、“引物修复”、限制或连接。通常，进行序列分析、限制性分析和其他生物化学和分子生物学方法作为分析方法。然后用如上所述的测定法测试所得酶变体的所需活性，例如酶活性，特别是它们增加的酶活性。
如上所述，本发明方法中采用的微生物可以是已经通过引入编码相应酶的核酸分子进行遗传修饰的微生物。优选地，微生物是如下文所述的根据本发明的微生物。因此，在优选的实施方案中，微生物是重组微生物，其已被遗传修饰以具有增加的至少一种上述用于根据本发明的方法转化的酶的活性。这可以例如通过用编码相应酶的核酸转化微生物来实现。优选地，引入微生物中的核酸分子是相对于微生物异源的核酸分子，即它不天然存在于所述微生物中。
在本发明的上下文中，“增加的活性”优选意指经遗传修饰的微生物中酶的表达和/或活性比相应的未修饰微生物高至少10％，优选至少20％，更优选至少30％或50％，甚至更优选至少70％或80％，且特别优选至少90％或100％。在甚至更优选的实施方案中，表达和/或活性的增加可以是至少150％、至少200％或至少500％。在特别优选的实施方案中，表达比在相应的未修饰微生物中高至少10倍，更优选至少100倍，甚至更优选至少1000倍。
术语“增加的”表达/活性还涵盖其中相应的未修饰的微生物不表达相应的酶，使得未修饰的微生物中的相应表达/活性为零的情况。优选地，过表达的酶的浓度为总宿主细胞蛋白质的至少5％、10％、20％、30％或40％。
用于测量细胞中给定蛋白质的表达水平的方法是本领域技术人员熟知的。在一个实施方案中，通过测量相应蛋白质的量来测量表达水平。相应的方法是本领域技术人员熟知的，并且包括Western印迹、ELISA等。在另一个实施方案中，通过测量相应RNA的量来进行表达水平的测量。相应的方法是本领域技术人员熟知的，并且包括例如Northern印迹。
在本发明的上下文中，术语“重组”意指微生物经遗传修饰以与野生型或未修饰的微生物相比含有编码如上定义的酶的核酸分子。编码如上定义的酶的核酸分子可以单独使用或作为载体的一部分使用。
核酸分子可以进一步包含与核酸分子中包含的多核苷酸可操作地连接的表达控制序列。如在整个本说明书中使用的，术语“有效地(operatively)连接”或“可操作地(operably)连接”是指一个或多个表达控制序列与待表达的多核苷酸中的编码区之间的连接，其方式使得在与表达控制序列相容的条件下实现表达。
表达包括异源DNA序列的转录，优选转录成可翻译的mRNA。确保在真菌以及细菌中表达的调控元件是本领域技术人员熟知的。它们包括启动子、增强子、终止信号、靶向信号等。下面结合关于载体的解释进一步给出实例。
与核酸分子结合使用的启动子就其起源和/或就待表达的基因而言可以是同源的或异源的。合适的启动子是例如适于组成型表达的启动子。然而，也可以使用仅在由外部影响确定的时间点被激活的启动子。在这种情况下可以使用人工和/或化学诱导型启动子。
载体还可以包含与载体中包含的所述多核苷酸可操作地连接的表达控制序列。这些表达控制序列可适于确保可翻译RNA在细菌或真菌中的转录和合成。
此外，可以通过分子生物学中常用的方法将不同的突变插入多核苷酸中(参见例如Sambrook和Russell(2001)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，CSH Press，Cold Spring Harbor，NY，USA)，导致合成可能具有修饰的生物学性质的多肽。可以想到在氨基酸序列的修饰例如影响多肽的生物活性或调节的位置处引入点突变。
此外，可以制备具有修饰的底物或产物特异性的突变体。优选地，此类突变体显示增加的活性。或者，可以制备其催化活性被消除而不丧失底物结合活性的突变体。
此外，将突变引入编码如上定义的酶的多核苷酸中允许由所述多核苷酸编码的酶的基因表达速率和/或活性降低或增加。
为了遗传修饰细菌或真菌，可以将编码如上定义的酶的多核苷酸或这些分子的部分引入质粒中，所述质粒允许通过DNA序列的重组进行诱变或序列修饰。标准方法(参见Sambrook和Russell(2001)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，CSH Press，ColdSpring Harbor，NY，USA)允许进行碱基交换或添加天然或合成序列。DNA片段可以通过将适体和接头应用于片段而彼此连接。此外，可以使用提供合适的限制性位点或去除多余的DNA或限制性位点的工程化措施。在其中插入、缺失或取代是可能的那些情况下，可以使用体外诱变、“引物修复”、限制或连接。通常，进行序列分析、限制性分析和其他生物化学和分子生物学方法作为分析方法。
因此，根据本发明，可以通过遗传修饰真菌或细菌来产生重组微生物，包括将上述多核苷酸、核酸分子或载体引入真菌或细菌中。
表达编码相应酶的多核苷酸以导致产生具有上述任何活性的多肽。不同表达系统的综述例如包含在Methods in Enzymology 153(1987)，385-516、Bitter等(Methods inEnzymology 153(1987)，516-544)和Sawers等(Applied Microbiology andBiotechnology 46(1996)，1-9)、Billman-Jacobe(Current Opinion in Biotechnology 7(1996)，500-4)、Hockney(Trends in Biotechnology12(1994)，456-463)、Griffiths等(Methods in Molecular Biology 75(1997)，427-440)中。酵母表达系统的综述例如由Hensing等(Antonie van Leuwenhoek 67(1995)，261-279)、Bussineau等(Developmentsin Biological Standardization 83(1994)，13-19)、Gellissen等(Antonie vanLeuwenhoek 62(1992)，79-93，Fleer(Current Opinion in Biotechnology 3(1992)，486-496)，Vedvick(Current Opinion in Biotechnology 2(1991)，742-745)和Buckholz(Bio/Technology 9(1991)，1067-1072)给出。
表达载体已在文献中广泛描述。通常，它们不仅含有选择标记基因和确保在所选宿主中复制的复制起点，而且含有细菌或病毒启动子，并且在大多数情况下含有转录终止信号。在启动子和终止信号之间通常存在至少一个限制性位点或多接头，其能够插入编码DNA序列。天然控制相应基因转录的DNA序列可用作启动子序列，如果它在所选宿主生物体中有活性的话。然而，这个序列也可以交换为其他启动子序列。可以使用确保基因组成型表达的启动子和允许有意控制基因表达的诱导型启动子。具有这些特性的细菌和病毒启动子序列在文献中有详细描述。用于在微生物(例如大肠杆菌、酿酒酵母)中表达的调控序列在文献中充分描述。允许下游序列特别高表达的启动子是例如T7启动子(Studier等，Methodsin Enzymology 185(1990)，60-89)、lacUV5、trp、trp-lacUV5(DeBoer等，见Rodriguez和Chamberlin(编辑)，Promoters，Structure and Function；Praeger，New York，(1982)，462-481；DeBoer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)，21-25)、Ip1、rac(Boros等，Gene 42(1986)，97-100)。诱导型启动子优选用于多肽的合成。这些启动子通常导致比组成型启动子更高的多肽产量。为了获得最佳量的多肽，通常使用两阶段方法。首先，将宿主细胞在最佳条件下培养至相对高的细胞密度。在第二步中，根据所用启动子的类型诱导转录。在这点上，tac启动子是特别合适的，它可以被乳糖或IPTG(＝异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)诱导(deBoer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80(1983)，21-25)。用于转录的终止信号也描述于文献中。
用如上所述的多核苷酸或载体转化宿主细胞可以通过标准方法进行，例如Sambrook和Russell(2001)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，CSH Press，ColdSpring Harbor，NY，USA；Methods in Yeast Genetics，A Laboratory Course Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1990。宿主细胞在满足所用特定宿主细胞的要求的营养培养基中培养，特别是在pH值、温度、盐浓度、通气、抗生素、维生素、微量元素等方面。
本发明还涉及表达用于催化以下反应的酶的重组微生物：
(1)丙酮酸与甲醛通过归类于EC 4.1.2._的醛缩酶缩合成4-羟基-2-氧代丁酸(HOB)；
(2)通过归类于EC 2.6.1._的氨基转移酶或通过氨基酸脱氢酶(EC 1.4.1._)将由此产生的4-羟基-2-氧代丁酸(HOB)胺化以产生高丝氨酸；
(3)通过高丝氨酸激酶(EC 2.7.1.39)磷酸化由此产生的高丝氨酸以产生o-磷酸高丝氨酸；
(4)由此产生的o-磷酸高丝氨酸通过苏氨酸合酶(EC 4.2.3.1)脱磷酸化以产生苏氨酸；
(5)通过苏氨酸醛缩酶(选自EC 4.1.2.5、EC 4.1.2.6、EC 4.1.2.48和EC4.1.2.49)或通过苏氨酸脱氢酶(EC 1.1.1.103)和2-氨基-3-酮基丁酸CoA连接酶(EC2.3.1.29)的组合将由此产生的苏氨酸转化为甘氨酸；
(6)通过苏氨酸醛缩酶(选自EC 4.1.2.5、EC 4.1.2.6、EC 4.1.2.48和EC4.1.2.49)将由此产生的甘氨酸与甲醛缩合以产生丝氨酸；和
(7)通过丝氨酸脱氨酶(EC 4.3.1.17)或苏氨酸脱氨酶(EC 4.3.1.19)将由此产生的丝氨酸脱氨基以产生丙酮酸，其中所述丙酮酸随后可以用作步骤(1)中的底物，
其中所述微生物含有至少一个编码催化步骤(1)的醛缩酶的异源核酸分子并过表达催化步骤(6)即甘氨酸与甲醛缩合形成丝氨酸的酶。
在优选的实施方案中，微生物还过表达催化步骤(3)、步骤(4)或步骤(5)的酶中的至少一种。
关于上述(1)至(7)项中提及的酶及其优选实施方案，以及关于微生物的优选实施方案，适用如上文关于根据本发明的方法所述的相同内容。
本发明的微生物可以是对于上述(1)至(7)项中列出的所有酶活性是重组的微生物，其中术语“重组”意指用编码相应酶的异源核酸分子转化微生物。这些异源核酸分子可以整合到微生物的基因组中，或者可以作为染色体外元件存在。染色体位置是优选的。因此，在这种情况下，通过针对所有所需的酶活性引入编码它们的相应核酸分子，在相应的微生物中建立“高丝氨酸循环”。由核酸分子编码的酶可以是微生物中内源性地存在的但由于使用异源调控区(如异源启动子)和/或核糖体结合位点而过表达的酶。或者，酶可以是不天然存在于相应微生物中的酶。
然而，本申请中描述的“高丝氨酸循环”显示出以下优点：其部分依赖于在多种微生物中内源性表达的酶活性，且特别是其水平使得它们能够支持通过循环的代谢通量。因此，根据本发明的微生物还可以是其中内源性产生上述(1)至(7)项的一种或多种酶活性的微生物。然而，在这种情况下，项(1)的酶活性被重组引入到这种生物体中，并且如果它已经在这种微生物中内源性产生，则它被过表达。此外，优选在相应的微生物中过表达项(2)至(7)中列出的一种或多种内源性产生的酶活性。术语“过表达”意指与亲本菌株相比，特别是与内源性存在的基因的表达水平相比，微生物中相应酶的酶活性增加，优选增加至少5％、10％、20％、30％或至少40％。这种增加可能是由于相应基因表达的增加。这种表达的增加可以例如通过将相应基因的编码序列置于异源启动子，特别是确保基因更高表达的异源启动子的控制下来实现。或者，可以突变基因的内源性启动子以导致基因的更高表达。这种启动子置换或突变可以在位于微生物染色体上的内源基因中实现，或可以将具有更强启动子的相应修饰基因置于质粒上。可用于允许醛缩酶基因过表达的强启动子的实例是组成型强启动子pgi-20(Braatsch等，BioTechniques 45(2008)，335-337)。
此外，为了允许增加的表达，使用有效的核糖体结合位点也可能是有利的。在这方面，术语“异源的”还包括其中相应基因被修饰以包含与其天然核糖体结合位点不同的核糖体结合位点并且允许基因的表达(翻译)增加的情况。合适的结合位点的实例是核糖体结合位点“C”(AAGTTAAGAGGCAAGA)(Zelcbuch等，Nucleic Acids Res.41(2013)，e98)。
获得增加的酶活性的另一种可能性是突变酶的表达，与未突变的酶相比，所述突变酶对相应的反应显示出增加的活性。
术语“表达的增加”还涵盖由于蛋白质中导致更高活性的突变而增加酶活性的可能性。上文已经描述了通过突变提高酶活性的手段和方法。
在一个优选的实施方案中，微生物是内源性表达高丝氨酸激酶(EC 2.7.1.39)并且其中与亲本菌株相比高丝氨酸激酶(EC 2.7.1.39)过表达的微生物。
在另一个优选的实施方案中，微生物是内源性表达苏氨酸合酶(EC 4.2.3.1)并且其中与亲本菌株相比苏氨酸合酶(EC 4.2.3.1)过表达的微生物。
在进一步优选的实施方案中，微生物是内源性表达苏氨酸醛缩酶(选自EC4.1.2.5、EC 4.1.2.6、EC 4.1.2.48和EC 4.1.2.49)并且其中与亲本菌株相比苏氨酸醛缩酶(选自EC 4.1.2.5、EC 4.1.2.6、EC 4.1.2.48和EC 4.1.2.49)过表达的微生物。
在另一个优选的实施方案中，微生物是内源性表达苏氨酸脱氢酶(EC 1.1.1.103)和2-氨基-3-酮基丁酸CoA连接酶(EC 2.3.1.29)并且其中与亲本菌株相比苏氨酸脱氢酶(EC 1.1.1.103)和2-氨基-3-酮基丁酸CoA连接酶(EC 2.3.1.29)过表达的微生物。
在另一个优选的实施方案中，微生物是内源性表达归类于EC 2.6.1._的氨基转移酶或可以将4-羟基-2-氧代丁酸(HOB)转化为高丝氨酸的氨基酸脱氢酶(EC 1.4.1._)并且其中与亲本菌株相比归类于EC 2.6.1._的氨基转移酶或氨基酸脱氢酶(EC 1.4.1._)过表达的微生物。
在另一个优选的实施方案中，微生物是内源性表达丝氨酸脱氨酶(EC 4.3.1.17)或苏氨酸脱氨酶(EC 4.3.1.19)并且其中与亲本菌株相比丝氨酸脱氨酶(EC 4.3.1.17)或苏氨酸脱氨酶(EC 4.3.1.19)过表达的微生物。
在另一个实施方案中，微生物过表达上述用于催化步骤(2)至(7)的酶的任何可能的组合。在优选的实施方案中，微生物过表达催化步骤(3)和(4)的酶，或过表达催化步骤(3)和(5)的酶，或过表达催化步骤(3)和(5)的酶，或过表达催化步骤(3)、(4)和(5)的酶。
微生物可以是内源表达上述(1)至(7)项中所述的所有酶活性但对于至少项(1)中所述的酶活性(即归类于EC 4.1.2._的醛缩酶)是重组的微生物。在本文中，术语“重组”是指微生物含有编码相应醛缩酶的异源核酸分子。在本文中，醛缩酶本身可以是微生物内源的，但在这种情况下，术语“异源的”是指醛缩酶由编码区不在其天然环境中的核酸编码。优选地，编码区不位于其天然定位的基因组位置(即，其位于基因组中的不同位置或其位于染色体外元件(如质粒)上)和/或其与异源调控区(如启动子)连接。优选以这样的方式修饰编码醛缩酶的基因，使得其表达与相应的内源基因的表达相比增加，优选增加至少5％、10％、20％、30％或至少40％。这种表达的增加(在本文中也称为“过表达”)可以例如通过将醛缩酶的编码序列置于异源启动子，特别是确保基因更高表达的异源启动子的控制下来实现。或者，可以突变基因的内源性启动子以导致基因的更高表达。这种启动子置换或突变可以在位于微生物染色体上的内源基因中实现，或可以将具有更强启动子的相应修饰基因置于质粒上。可用于允许醛缩酶基因过表达的强启动子的实例是组成型强启动子pgi-20(Braatsch等，BioTechniques 45(2008)，335-337)。
此外，为了允许增加的表达，使用有效的核糖体结合位点也可能是有利的。在这方面，术语“异源的”还包括其中相应基因被修饰以包含与其天然核糖体结合位点不同的核糖体结合位点并且允许基因的表达(翻译)增加的情况。合适的结合位点的实例是核糖体结合位点“C”(AAGTTAAGAGGCAAGA)(Zelcbuch等，Nucleic Acids Res.41(2013)，e98)。
术语“表达的增加”还涵盖由于蛋白质中导致更高活性的突变而增加酶活性的可能性。上文已经描述了通过突变提高酶活性的手段和方法。
本发明的微生物可以是细菌、真菌，如酵母、藻类或古细菌。在一个优选的实施方案中，微生物是细菌。优选的细菌是芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、发酵单胞菌属(Zymomonas)或埃希氏菌属(Escherichia)的细菌。在特别优选的实施方案中，细菌属于埃希氏菌属，甚至更优选属于大肠杆菌(Escherichia coli)种。在另一个优选的实施方案中，细菌属于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)种或运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)种或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)种或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)种。
还可以使用极端嗜热细菌，如嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)，或来自梭菌科(Clostridiae)的厌氧细菌。
在另一个优选的实施方案中，微生物是真菌，更优选酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)或毕赤酵母属(Pichia)的真菌，且甚至更优选酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、黑曲霉(Aspergillus niger)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、圆毕赤酵母(Pichia torula)或产朊毕赤酵母(Pichia utilis)种的真菌。
在另一个实施方案中，微生物是光合微生物，优选光合细菌或微藻。在另一个实施方案中，微生物是藻类，更优选属于硅藻类的藻类。
在另一个实施方案中，微生物是能够代谢甲醇的微生物。在一个实施方案中，微生物天然能够代谢甲醇，并且例如是嗜甲烷细菌、嗜甲基细菌、嗜甲烷酵母或嗜甲基酵母。
在另一个实施方案中，微生物是固C1微生物，优选重组固C1微生物。固C1微生物的性质没有特别限制，只要它是能够使用一氧化碳(CO)和包含CO的气态底物(如合成气)作为碳源和能源的微生物即可。合成气或合成气体是CO和CO2以及H2的混合物。相应的天然存在的(或遗传修饰的)能够利用CO并将其转化为乙酰-CoA的微生物是本领域已知的。这些生物体通常被称为产乙酸微生物(有时也称为一氧化碳营养型产乙酸微生物)。这些微生物使用Wood-Ljungdahl途径固定CO并将其转化为乙酰-CoA。此类微生物的实例属于梭菌科并且例如描述于WO 2009/094485；WO 2012/05905；WO 2013/180584；US 2011/0236941；PNAS 107(29)：13087-13092(2010)；Current Opinion in Biotechnology 23:36 4-381(2012)；Applied and Enviornmental Microbiology 77(15)：5467-5475。
在某些实施方案中，固C1微生物选自一氧化碳营养型产乙酸细菌。在优选的实施方案中，微生物选自自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、扬氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)、食一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)、德拉克梭菌(Clostridium drakei)、产粪梭菌(Clostridium scatologenes)、乙酸梭菌(Clostridium aceticum)、甲酸乙酸梭菌(Clostridium formicoaceticum)、巨大梭菌(Clostridium magnum)、甲基营养丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)、巴克氏碱杆菌(Alkalibaculum bacchii)、Blautia producta、Eubacterium limosum、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、热自养穆尔氏菌(Moorella thermautotrophica)、卵形鼠抱菌(Sporomusa ovata)、银醋鼠抱菌(Sporomusa silvacetica)、Sporomusasphaeroides、Oxobacter pfennigii和Thermoanaerobacter kiuvi。
在一个实施方案中，微生物能够将甲醇转化为甲醛。在一个优选的实施方案中，微生物能够通过将甲醇酶促转化为甲醛(优选经由氧化反应)来提供甲醛。
在这种情况下可以使用的一种类型的酶是甲醇脱氢酶(NAD+)，其被分类为EC1.1.1.244。这种酶催化反应：
Figure BDA0003890907080000301
因此，微生物优选内源性地表达这种酶，或者因为已经遗传修饰以含有编码这种酶的核酸分子。这种甲醇脱氢酶的一个实例是由谷氨酸棒杆菌的adhA基因编码的甲醇脱氢酶。
可用于从甲醇生产甲醛的另一种类型的酶是甲醇脱氢酶(细胞色素c，也称为“醌依赖性”)，其分类为EC 1.1.2.7。因此，微生物优选内源表达这种酶，或者因为它已被遗传修饰以含有编码这种酶的核酸分子。
可用于从甲醇生产甲醛的另一种类型的酶是甲醇氧化酶，例如归类于EC1.1.3.13中的甲醇氧化酶。因此，微生物优选内源表达这种酶，或者因为它已被遗传修饰以含有编码这种酶的核酸分子。
在一个实施方案中，微生物能够将甲烷转化为甲醛。优选地，微生物能够将甲烷转化为甲醇并进一步将甲醇转化为甲醛。甲烷向甲醇的转化可以例如通过利用甲烷单加氧酶(EC 1.14.14.3或1.14.13.25)来实现。因此，微生物优选内源表达这样的酶，或者因为它已被遗传修饰以含有编码这样的酶的核酸分子。
在一个实施方案中，微生物能够将卤代甲烷转化为甲醛。优选地，微生物能够将卤代甲烷(例如二氯甲烷)转化为甲醛。这种转化可以例如通过利用脱卤素酶，优选归类于EC4.5.1.3的脱卤素酶来实现。因此，微生物优选内源表达这种酶，或者是因为它已经被遗传修饰以含有编码这种酶的核酸分子。
在一个实施方案中，微生物能够将甲胺(或其衍生物)转化为甲醛。优选地，微生物能够通过氧化将甲胺(或其衍生物)转化为甲醛。这可以通过例如使用甲胺脱氢酶(归类于EC 1.4.9.1)或伯胺氧化酶(归类于EC 1.4.3.21)来实现。因此，微生物优选内源表达这样的酶，或者因为它已被遗传修饰以含有编码这样的酶的核酸分子。
在一个实施方案中，微生物能够将甲酸转化为甲醛。例如，Siegel等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 24(2015)，3704-3709)已经描述了甲酸可以通过乙酰-CoA合酶(ACS)转化为甲酰-CoA，其随后可以通过利用乙醛脱氢酶(ACDH)进一步转化为甲醛。因此，微生物优选内源表达这种酶，或者因为它已被遗传修饰以含有编码这种酶的核酸分子。
在微生物中实施时，为了提高通过“高丝氨酸循环”的通量，灭活可能在相应微生物中内源性发生的某些酶活性可能是有利的。
因此，在一个实施方案中，微生物是内源性含有编码甲醛解毒系统的操纵子并且是其中该操纵子缺失或失活的微生物。在优选实施方案中，微生物属于大肠杆菌种，并且是其中甲醛解毒(frmRAB)操纵子(Chen等，Metabol.Engineering 49(2018)，257-266)缺失或失活的微生物。这个系统也称为谷胱甘肽依赖性甲醛氧化系统。该操纵子的灭活或缺失确保甲醛不被去除并且可用于细胞生长。特别地，该操纵子的失活应避免甲醛氧化成甲酸，这可能导致细胞内甲醛库的耗尽。
在另一个实施方案中，微生物是内源性含有编码催化丙酮酸转化为天冬氨酸半醛的一种或多种酶活性的基因的微生物，并且其中这个/这些基因缺失或失活。在优选实施方案中，所述基因是编码天冬氨酸半醛脱氢酶(EC 1.2.1.11)的基因。在优选的实施方案中，微生物属于大肠杆菌种，并且是其中编码所述酶的asd基因缺失或失活的微生物。
在另一个实施方案中，微生物是内源性含有编码3-磷酸甘油酸脱氢酶(EC1.1.1.95)的基因并且其中该基因缺失或失活的微生物。在优选实施方案中，微生物属于大肠杆菌种，并且是其中编码所述酶的serA基因缺失或失活的微生物。
在另一个实施方案中，微生物是内源性含有编码丝氨酸羟甲基转移酶(EC2.1.2.1)的基因并且其中该基因缺失或使其失活的微生物。在优选实施方案中，微生物属于大肠杆菌种，并且是其中编码所述酶的glyA基因缺失或失活的微生物。
在另一个实施方案中，微生物是内源性含有编码甘氨酸切割系统(GCS)的操纵子并且其中该操纵子缺失或失活的微生物。在优选实施方案中，微生物属于大肠杆菌种并且是其中甘氨酸切割系统(GcvTHP)操纵子缺失或失活的微生物。大肠杆菌中的GCS操纵子编码三种酶，即GcvT、GcvH和GcvP，并且可以使整个操纵子或三个基因中的一个或多个失活。
在另一个实施方案中，微生物是内源性含有编码双功能天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶(EC 1.1.1.3)的基因并且其中该基因缺失或失活的微生物。在优选实施方案中，微生物属于大肠杆菌种并且是其中编码所述酶的thrA基因缺失或失活的微生物。
在另一个实施方案中，微生物是内源性含有编码L-苏氨酸3-脱氢酶脱氢酶(EC1.1.1.103)的基因并且其中该基因缺失或失活的微生物。在优选实施方案中，微生物属于大肠杆菌种并且是其中编码所述酶的tdh基因缺失或失活的微生物。
在另一个实施方案中，微生物是内源性含有编码2-氨基-3-酮丁酸CoA连接酶(EC2.3.1.29)的基因并且其中该基因缺失或失活的微生物。在优选实施方案中，微生物属于大肠杆菌种，并且是其中编码所述酶的kbl基因缺失或失活的微生物。
在另一个实施方案中，该微生物是内源性含有编码乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.28)的基因并且其中该基因缺失或失活的微生物。在优选实施方案中，微生物属于大肠杆菌种，并且是其中编码所述酶的ldhA基因缺失或失活的微生物。
在另一个实施方案中，微生物显示如上所述的基因缺失/失活的任何可能的组合。
图1显示了根据本发明的用于掺入甲醛的方法中涉及的酶促步骤的代表性实例的示意图。
(1)丙酮酸与甲醛通过醛缩酶缩合成4-羟基-2-氧代丁酸(HOB)；(2)将由此产生的4-羟基-2-氧代丁酸(HOB)胺化以产生高丝氨酸；(3)将由此产生的高丝氨酸磷酸化以产生O-磷酸高丝氨酸；(4)将由此产生的O-磷酸高丝氨酸脱磷酸化以产生苏氨酸；(5)将由此产生的苏氨酸转化为甘氨酸和乙醛；(6)将由此产生的甘氨酸与甲醛缩合以产生丝氨酸；和(7)将由此产生的丝氨酸转化为丙酮酸。基于混杂酶活性的反应以颜色显示。
图2显示了通过LtaE催化的体内“丝氨酸醛缩酶”(SAL)活性：(a)LtaE催化甘氨酸和不同醛之间的醛醇缩合。苏氨酸醛缩酶(LTA)是其主要功能，而丝氨酸醛缩酶是混杂活性(Contestabile等，Eur.J.Biochem.268(2001)，6508-6525)。(b)、(c)用于SAL反应的体内活性的两种选择方案。碳源显示为紫色(葡萄糖未显示)，而甲醛部分显示为绿色。(b)其中丝氨酸的生物合成需要甲醇同化的ΔfrmRABΔserAΔglyA菌株。(c)其中丝氨酸和细胞C1部分的生物合成需要甲醇同化的ΔfrmRABΔserAΔgcvTHP菌株。(d)、(e)与不同浓度的甲醇的生长证实了SAL反应的活性。在所有情况下，向培养基中加入10mM葡萄糖和10mM甘氨酸。甲醇脱氢酶(mdh)和ItaE从质粒表达。每条生长曲线代表三次重复的平均值，其彼此相差小于5％。(f)、(g)在用13C-甲醇以及未标记的葡萄糖和甘氨酸给料时，组成蛋白的甘氨酸(GLY)、丝氨酸(SER)、苏氨酸(THR)、甲硫氨酸(MET)和组氨酸(HIS)的标记模式。
图3显示了Mn2+补充提高了LtaE依赖性生长。虽然Mn2+是LtaE的辅因子，但M9培养基仅含有0.08μM Mn2+。添加50μM MnCl2增加了LtaE依赖性菌株的生长速率和产率。误差条表示标准偏差，n＝3。
图4显示了LtaE可以同时作为苏氨酸醛缩酶和丝氨酸醛缩酶。(a)从苏氨酸和高丝氨酸生产丝氨酸和甘氨酸的选择方案。(b)在LtaE非依赖性苏氨酸切割系统(Δkbl-tdh)中缺失的两种选择菌株可以用甲醇作为丝氨酸前体生长。甘氨酸从外部提供(10mM，黑线)，或内部地从外部添加的苏氨酸(10mM，红线)或从内部苏氨酸库(绿线)产生。后一种生长证实了LtaE可以同时催化LTA和Sal反应。在所有情况下，加入10mM葡萄糖和500mM甲醇。每条生长曲线代表三次重复的平均，其彼此相差小于5％。(c)用不同碳标记的葡萄糖以及标记或未标记的甲醇给料时，组成蛋白的甘氨酸和丝氨酸的标记模式。这种标记证实了所有细胞丝氨酸都是由甘氨酸和甲醇产生的，即使当甘氨酸是内部地由苏氨酸生物合成和降解而产生时也是如此。
图5分别显示了将丙酮酸和甲醛缩合成HOB以及将HOB转化成高丝氨酸的酶的体内活性。(a)将丙酮酸和甲醛缩合成HOB以及将HOB转化成高丝氨酸的反应的体内活性的选择方案。碳源显示为紫色，而甲醛部分显示为绿色。(b)已知几种大肠杆菌酶催化以丙酮酸作为受体的醛缩酶反应，并且可能能够接受甲醛作为供体。这些酶的序列相似性由左边的示意性树表示。(c)四种测试的醛缩酶，一旦与甲醇脱氢酶一起过表达，支持选择菌株的生长。加入10mM的葡萄糖，500mM的甲醇，0.25mM的二氨基庚二酸(diaminopimelate)和1mM的异亮氨酸。每条生长曲线代表三次重复的平均，其彼此相差小于5％。(d)在用未标记的葡萄糖、二氨基庚二酸和异亮氨酸以及13C-甲醇给料时，组成蛋白的甲硫氨酸(MET)、苏氨酸(THR)、赖氨酸(LYS)和天冬氨酸(ASP)的标记模式。结果证实，所有细胞苏氨酸和甲硫氨酸均源自丙酮酸与甲醛缩合的酶活性和氨基酶反应。
图6显示了将丙酮酸和甲醛缩合成HOB的候选酶的多重序列比对。RhmA/YfaU(P76469；SEQ ID NO:1)、GarL(P23522；SEQ ID NO:4)、YagE(P75682；SEQ ID NO:2)、YjhH(P39359；SEQ ID NO:3)、Eda(P0A955；SEQ ID NO:45)、DgoA(Q6BF16；SEQ ID NO:46)和MhpE(P51020；SEQ ID NO:47)的蛋白质序列获自UniProt。通过MAFFT(Katoh和Standley，Mol.Biol.Evol.30(2013)，772-780)产生了序列比对。将ESPPript 3.0(Rober和Gouet，42(2014)，W320-W324)用于展示比对序列，并有GarL，1dxe的3D结构(Izard和Blackwell，EMBOJ.19(2000)，3849-3856)。上方指示了蛋白质α-螺旋和β-折叠，>70％的序列一致显示在cons.中。
图7显示了将丙酮酸和甲醛缩合成HOB的候选酶的基于蛋白质结构的比对。可用的蛋白质结构，GarL的1dxf(Izard和Blackwell，EMBO J.19(2000)，3849-3856)、RhmA的2vwt(Rea等，Biochemistry-US 47(2008)，9955-9965)、YagE的4ptn(Manicka等，Proteins 71(2008)，2102-2108)、DgoA的2v82(Walters等，Bioorganic&Medicinal Chemistry 16(2008)，710-720)和Eda的1eua(Allard等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98(2001)，3679-3684)从RCSB PDB获得。通过PyMOL内的TM-align(Zhang等，Nucleic Acids Res.33，2302-2309(2005)比对结构。比对的结果，RMSD和TM-score，显示在表中。使用PyMOL绘图。
图8显示了高丝氨酸循环的酶的基因组过表达的影响。通过在选择菌株ΔfrmRABΔasd内用合成启动子交换它们的天然启动子来过表达ThrB(HSK)、ThrC(TS)、AlaC*(AlaCA142P Y275D)或AspC。每个生长曲线表示三次重复的平均，其彼此相差小于5％。
在本说明书中，引用了包括专利申请在内的许多文献。这些文献的公开内容虽然不被认为与本发明的可专利性相关，但通过引用整体并入本文。更具体地，所有参考文献通过引用并入，其程度如同每篇单独的文献被具体和单独地指出通过引用并入。
现在将参考以下实施例描述本发明，这些实施例仅仅是说明性的，而不应被解释为限制本发明的范围。
实施例
为了证实高丝氨酸循环的体内可行性，构建了几种大肠杆菌基因缺失菌株，其生长与不同途径区段的活性偶联。使用这种方法，可以证明所有需要的混杂酶具有足够的活性以使营养缺陷型菌株能够生长。
方法
菌株和基因组操纵。本研究中使用的菌株列于表1中。
表1
大肠杆菌菌株的列表
Figure BDA0003890907080000351
Figure BDA0003890907080000361
1Jensen等(Sci.Rep.5(2015)，17874)
将大肠杆菌MG1655衍生的菌株SIJ488(Jensen等，Scientific Reports 5(2015)，17874)用作基因组修饰的亲本菌株。迭代轮次的λ-Red重组工程化(Jensen等，在上述引文中)或P1噬菌体转导(Thomason等，Curr.Protoc.Mol.Biol.第1章，第1单元17(2007))用于基因缺失。对于重组工程化，使用用于卡那霉素抗性(Km)的FRT-PGK-gb2-neo-FRT(Km)盒(Gene Bridges，德国)和作为氯霉素抗性盒(CAP)模板的pKD3质粒(GenBank:AY048742；Datsenko和Wanner，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(2000)，6640-6645)，经由PCR(如Baba等(Mol.Syst.Biol.2(2006)，2006-2008)中所述的引物50bp同源臂)产生可选择抗性盒。Wenk等(Methods Enzymol.608(2018)，329-367)详述了缺失、验证和抗生素盒去除的程序。
应用类似的策略来交换靶基因的基因组启动子。使用表2中列出的引物，在CAP盒的下游构建组成型强启动子pgi-20(Braatsch等，Biotechniques 45(2008)，335-337)和核糖体结合位点“C”(AAGTTAAGAGGCAAGA(SEQ ID NO:44)；Zelcbuch等，Nucleic AcidsRes.41(2013)，e98.)。
表2
本研究中使用的寡聚引物列表
Figure BDA0003890907080000362
Figure BDA0003890907080000371
首先通过重组工程方法将合成启动子引入SIJ488菌株；然后使用P1转导将合成启动子转移到选择菌株中。thrB(编码高丝氨酸激酶，HSK)和thrC(编码苏氨酸合酶，TS)与thrL和thrA在同一操纵子上。由于thrL编码调节肽并且thrA在asD选择菌株中是冗余的，因此在thrBC的启动子交换期间缺失thrLA。引入点突变A142P Y275D(Bouzon等，ACSSynthetic Biology 6(2017)，1520-1533)以及alaC的启动子交换(在这种情况下，重组工程化盒在CAP盒和合成启动子下游具有突变基因)。通过对启动子区域进行测序来确认启动子交换。
质粒构建。所有克隆程序均在大肠杆菌DH5α菌株中进行。用上表2中所示的引物从大肠杆菌MG1655基因组克隆大肠杆菌天然基因ltaE、rhmA、garL、yagE、yjhH、eda、dgoA和mhpE。
NAD依赖性甲醇脱氢酶(CgAdhA)取自密码子优化后的谷氨酸棒杆菌R(He等，ACSSynthetic Biology 7(2018)，1601-1611)。将基因插入核糖体结合位点“C”的pNivC载体下游(AAGTTAAGAGGCAAGA(SEQ ID NO:44)；Zelcbuch等，Nucleic Acids Res.41(2013)，e98.)。使用BioBrick酶：BcuI、SalI、NheI和XhoI将基因组装到一个操纵子中(FastDigest，Thermo Scientific；Zelcbuch等，Nucleic Acids Res.41(2013)，e98.)。然后使用EcoRI和PstI，将合成的操纵子插入过表达pZASS载体(Wenk等，Methods Enzymol.608(2018)，329-367)中在组成型强启动子pgi-20(Braatsch等，BioTechniques 45(2008)，335-337)下。最终质粒列于表3中。
表3
表S4的补充过表达质粒的列表
Figure BDA0003890907080000381
Figure BDA0003890907080000391
生长培养基。LB培养基(0.5％酵母提取物、1％胰蛋白胨、1％NaCl)用于菌株工程化和重组质粒克隆。抗生素以以下浓度使用：卡那霉素，50μg/ml；氨苄青霉素，100μg/ml；链霉素，100μg/ml；氯霉素，30μg/ml。在补充有微量元素(134μM EDTA，31μM FeCl3，6.2μMZnCl2、0.76μM CuCl2、0.42μm CoCl2、1.62μm H3BO3、0.081μM MnCl2)的M9最小培养基(47.8mM Na2HPO4、22nM KH2PO4、8.6mM NaCl、18.7mM NH4Cl，2mM MgSO4和100μM CaCl2)中进行生长实验。对于所有实验，添加50μM MnCl2，因为其改善LtaE的体内活性(图3)。根据菌株和具体实验添加碳源：10mM葡萄糖、10mM甘氨酸、10mM丝氨酸、10mM苏氨酸、2mM高丝氨酸和1mM异亮氨酸。在所有用于培养Δasd菌株的培养基中，补充0.25mM二氨基庚二酸(DAP)(Cardineau和Curtiss，J.Biol.Chem.262(1987)，3344-3353)。
生长实验。将菌株在具有适当碳源和链霉素的4mL M9培养基中预培养。收获预培养物并在M9培养基中洗涤三次，然后接种在具有合适碳源的M9培养基中，起始OD600为0.02。将150μL培养物加入96孔微量培养板(Nunclon Delta Surface，Thermo Scientific)的每个孔中。向每个孔中加入另外50μL矿物油(Sigma-Aldrich)以避免蒸发(同时使气体扩散)。将96孔微孔板在酶标仪(BioTek Epoch 2)中在37℃下孵育。振荡程序循环(由Gen5 v3控制)具有4个振荡阶段，每个振荡阶段持续60秒：线性振荡，然后轨道振荡，两者的振幅均为3mm，然后振幅均为2mm的线性振荡后接轨道振荡。在每三个振荡循环(～16.5min)后，监测并记录每个孔中的吸光度(OD600)。根据OD比色皿＝OD平板/0.23，将来自读板器的原始数据校准至标准比色皿测量的OD600。使用MATLAB(MathWorks)基于三个技术性三份重复计算生长参数-平均值用于生成生长曲线。在MATLAB中检查，在所有情况下，一式三份的测量之间的变异性小于5％。
稳定同位素标记。13C-甲醇、葡萄糖-1-13C、葡萄糖-2-13C、葡萄糖-3-13C购自Sigma-Aldrich。在指数后期收获细胞。收获OD600为1的1mL等体积培养物，并通过离心洗涤。将蛋白质生物质用6M HCl在95℃水解24h(You等人，Journal of Visualized Experiments 59(2012))。将样品在95℃的空气流下完全干燥。如先前所述(Giavalisco等，Plant J.68(2011)，364-376)用UPLC-ESI-MS分析水解的氨基酸。使用Waters Acquity UPLC系统(Waters)，使用HSS T3 C18反相柱(100mm×2.1mm，1.8μm，Waters)，进行层析。H2O中的0.1％甲酸(A)和乙腈中的0.1％甲酸(B)是流动相。流速为0.4mL/min且梯度为：0至1min-99％A；1至5min-线性梯度从99％A至82％；5至6min-线性梯度从82％A至1％A；6至8min-保持在1％A；8-8.5min-线性梯度至99％A；8.5-11min-重新平衡。使用Exactive质谱仪(ThermoScientific)以正离子模式获取质谱，扫描范围为50.0至300.0m/z。在LC梯度的前5分钟期间记录谱。使用Xcalibur(Thermo Scientific)进行数据分析。鉴定氨基酸基于保留时间和m/z，其通过在相同条件下分析氨基酸标准品(Sigma-Aldrich)来确定。
分子系统发育分析。用于催化HAL反应的醛缩酶的蛋白质序列获自Uniprot：RhmA/YfaU P76469、GarL P23522、YagE P75682和YjhH P39359、Eda P0A955、DgoA Q6BF16和MhpEP51020。MAFFT v7(Katoh和Standley，Mol.Biol.Evol.30(2013)，772-780)以默认参数用于多序列比对。使用最大似然法通过MEGA X(Kumar等，Mol.Biol.Evol.35(2018)，1547-1549)将比对的序列用于构建系统发育树。生成bootstrap consensus tree，引导重复的设置数为1000。
实施例1
新开发的“高丝氨酸循环”的概念
为了提供优于已知天然丝氨酸循环的代谢途径，设计了代谢途径，其在本文中也称为“高丝氨酸循环”。高丝氨酸循环的代表性实例显示在图1中。
在高丝氨酸循环中，甘氨酸直接与甲醛缩合生成丝氨酸。先前发现该反应(图1中的项(6))(本文中也称为丝氨酸醛缩酶(SAL)反应)通过苏氨酸醛缩酶(LtaE)混杂催化(体外)(Contestabile等，Eur.J.Biochem.268(2001)，6508-6525)。SAL反应绕过了用于甲醛同化成5,10-亚甲基-四氢叶酸(CH2-THF)的非常长的、多辅因子依赖性且ATP低效的途径(Crowther等，J.Bacteriol.190(2008)，5057-5062)。如在先前提出的修饰的丝氨酸循环内那样(Yu和Liao，Nature Communications 9(2018)，3992；Bar-Even，Biochemistry55(2016)，3851-3863)，丝氨酸随后通过丝氨酸脱氨酶被脱氨成丙酮酸(图1中的项目(7))，绕过更长的经由甘油酸的途径，其还涉及高毒性的中间体羟基丙酮酸(Kim和Copley，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 109(2012)，E2856-2864)。然后将丙酮酸与甲醛缩合以产生非天然代谢物4-羟基-2-氧代丁酸(HOB)(Bouzon等，ACS Synthetic Biology 6(2017)，1520-1533)，其随后胺化成高丝氨酸。发现这些反应中的第一个(图1中的项(1))被大肠杆菌2-酮-3-脱氧-L-鼠李糖酸醛缩酶(RhmA)混杂催化(Hernandez等，ACS Catal.7(2017)，1707-1711)。后一反应-HOB胺化(图1中的项(2))-由许多氨基转移酶(Hernandez等，ACS Catal.7(2017)，1707-1711；Walther等，Metab.Eng.45(2018)，237-245；Zhong等，ACS SyntheticBiology 8(2019)，587-595)以及氨基酸脱氢酶，如(工程化的)谷氨酸脱氢酶(Chen等，Biotechnol.J.10(2015)，284-289)所支持。该途径有效地用甲醛同化反应代替羧化反应(通过磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)，这提供了产生C4中间体的替代方式。然后将高丝氨酸转化为苏氨酸，例如通过高丝氨酸激酶(ThrB，图1中的项(3))和苏氨酸合酶(ThrC，图1中的项(4))的作用。最后，苏氨酸被切割以产生甘氨酸和乙醛。这可以例如通过利用苏氨酸醛缩酶(图1中的项(5)，例如通过催化SAL反应(图1中的项(6))以再生甘氨酸并产生乙醛的相同苏氨酸醛缩酶(LtaE)来实现。所产生的乙醛可以例如进一步氧化为乙酰CoA并同化至中心代谢。
催化甘氨酸和甲醛缩合成丝氨酸的酶的体内活性的证明
如上所述，新提出的“高丝氨酸循环”的几个反应对应于其催化酶的主要活性，因此，预期通常在体内由相应的酶催化，并且还预期这些反应不限制途径通量。然而，新设计的“高丝氨酸循环”的三个反应(即图1中的项(1)、(2)和(6))对应的混杂活性迄今为止仅在体外表征。因此，对于这些混杂活性中的每一种，测试了它们是否也可以支持体内相应的转化。为此目的，创建了专用的基因缺失菌株，其生长取决于这些反应的活性。
首先，测试LtaE在体内催化“SAL反应”(图1中的项(6)；图2a)的能力。为此目的，构建了甘氨酸和丝氨酸营养缺陷型的两个菌株。在两个株中，缺失了编码3-磷酸甘油酸脱氢酶(ΔserA)的基因。在一个菌株中，编码丝氨酸羟甲基转移酶的基因(ΔglyA)也被缺失，而在另一个菌株中，甘氨酸切割系统的基因(ΔgcvTHP)缺失。这些菌株的生长需要添加甘氨酸和丝氨酸，因为这些化合物的细胞互变被阻断(图2b和c)。
推测了如果SAL反应确实支持生理相关通量，则当甲醇脱氢酶(MDH)和LtaE过表达并且培养基中丝氨酸被甲醇替换时，两个菌株应该能够生长。在ΔserAΔglyA菌株中，SAL反应将负责丝氨酸的产生(图2b)，其占生物质中碳的～3％(Neidhardt等，见：Physiologyof the Bacterial Cell：A Molecular Approach 134-143(1990))。在ΔserAΔgcvTHP菌株中，SAL反应将负责产生丝氨酸和细胞C1部分两者(图2c)，一起占生物质中碳的～6％(Neidhardt等，在上述引文中)。为了避免甲醛氧化成甲酸(甲酸可能耗尽其胞内库并限制其同化)，还缺失了编码谷胱甘肽依赖性甲醛氧化系统的基因(ΔfrmRAB)(He等，ACSSynthetic Biology 7(2018)，1601-1611)。
在MDH和LtaE过表达后，观察到两个选择菌株的生长，其中葡萄糖作为主要碳源，甘氨酸和甲醇作为丝氨酸的前体(图2D、E)。这表明SAL反应可以以生理上显著的速率在体内操作。仅MDH或仅LtaE的表达不能维持生长，表明基因组ltaE的天然表达太低而不能支持SAL反应。观察到的生长速率和产率取决于甲醇的浓度，其中在低甲醇浓度下，ΔserAΔglyAΔfrmRAB菌株比ΔserAΔgcvTHPΔfrmRAB菌株支持更高的速率和产率。这对应于后一种菌株依赖于SAL反应以提供更高比例的细胞碳的预测。200-1000mM范围内的甲醇浓度似乎是最佳的，支持与阳性对照(其中将丝氨酸添加到培养基中)相似的生长速率。在所有实验中，加入50μM MnCl2，因为Mn2+是已知的LtaE辅因子(Fesko，Appl.Microbiol.Biotechnol.100(2016)，2579-2590)。在没有附加补充MnCl2的情况下，反应仍然发生，但观察到较低的生长速率和产率(参见图3)。
为了证实SAL反应的活性，进行13C标记实验。用13C-甲醇以及未标记的葡萄糖和甘氨酸培养两个菌株。在ΔserAΔglyAΔfrmRAB菌株中，发现丝氨酸如预期的那样被完全单一标记，而其他氨基酸未被标记(图2F)。由于苏氨酸和甲硫氨酸衍生自草酰乙酸，因此携带源自CO2的碳(即，回补反应)，它们缺乏标记表明甲醛氧化成CO2是可忽略的，如通过缺失frmRAB所预期的。在ΔserAΔgcvTHPΔfrmRAB菌株中，发现丝氨酸、甲硫氨酸和组氨酸被完全单一标记(图2g)。与苏氨酸不同，甲硫氨酸和组氨酸都具有衍生自携带C1单元的THF(在甲硫氨酸的情况下为甲基-THF，在组氨酸的情况下为甲酰基-THF)的碳(Yishai等，ACSSynthetic Biology 6(9)(2017)，1722-1731)。因此，这些氨基酸的标记表明所有细胞C1部分衍生自甲醇。总之，标记结果证实了SAL反应在两个菌株中提供了丝氨酸的唯一来源，并且在ΔserAΔgcvTHPΔfrmRAB菌株中提供了C1部分的唯一来源。
接下来，测试了是否可以从培养基中省略甘氨酸，使得其将通过LtaE依赖性苏氨酸切割内源性地产生(图4a)。为此目的，在两个选择菌株中，缺失编码苏氨酸脱氢酶和2-氨基-3-酮丁酸CoA连接酶(Δkbl-tdh)的基因，从而阻断苏氨酸降解的LtaE非依赖性途径(图4a)(Yishai等，ACS Synthetic Biology6(9)(2017)，1722-1731)。发现用苏氨酸替换甘氨酸不改变任一选择菌株的生长(图4b，注意生长仍然严格依赖于甲醇)。为了实现这种生长，过表达的LtaE催化两个后续反应，首先将苏氨酸切割成甘氨酸和乙醛，然后使甘氨酸与甲醛反应以产生丝氨酸。因此，LtaE可以被认为是甘氨酰转移酶-将甘氨酸部分从一种小的醛(乙醛)转移到另一种小的醛(甲醛)。
接下来，评估了是否也可以从培养基中省略苏氨酸并依赖于天然苏氨酸生物合成来提供该氨基酸作为甘氨酸和丝氨酸的前体(图4a)。实际上，尽管显示出降低的生长速率，但两个选择菌株都能够在仅具有葡萄糖(作为主要碳源)和甲醇而不添加甘氨酸或苏氨酸的情况下生长(图4b中的绿线)。这表明一半的高丝氨酸循环是有活性的：高丝氨酸(由天冬氨酸天然产生)通过高丝氨酸激酶(HSK)和苏氨酸合酶(TS)代谢为苏氨酸，然后LtaE将苏氨酸切割为甘氨酸(和乙醛)并将甘氨酸与甲醛缩合以产生丝氨酸(图4a)。
为了证实，也在不存在外部提供的甘氨酸或苏氨酸的情况下，所有细胞丝氨酸都由甘氨酸与甲醛缩合产生，进行了13C标记实验。在标记或未标记的甲醇以及在不同碳上标记的葡萄糖(葡萄糖-1-13C、葡萄糖-2-13C和葡萄糖-3-13C)的存在下培养菌株。虽然甘氨酸的标记模式根据标记的葡萄糖的碳而改变，但用13C-甲醇培养总是导致丝氨酸中的标记碳比甘氨酸中的标记碳多一个(图4c)。这毫不含糊地证实了当甘氨酸内部地从高丝氨酸代谢产生时，从甘氨酸以甲醇依赖性地产生丝氨酸。总之，所获得的结果证实了LtaE通过释放乙醛和同化甲醛在体内将苏氨酸转化为丝氨酸的能力。这些发现进一步证实了一半高丝氨酸循环的生理学上显著的活性，其中高丝氨酸代谢为甘氨酸和丝氨酸提供了这些氨基酸以及细胞C1部分的所有生物质需求，它们一起构成生物质中10％的碳(Neidhardt等，见：Physiology of the Bacterial Cell：A Molecular Approach 134-143(1990))。
催化甘氨酸和丙酮酸缩合形成HOB以及将HOB转化为高丝氨酸的酶的体内活性活 性的证明
在证明高丝氨酸向丝氨酸的甲醇依赖性转化后，目的是证明丙酮酸向高丝氨酸的甲醇依赖性转化。为了针对通过HOB产生和胺化将丙酮酸体内转化为高丝氨酸和苏氨酸的选择，构建了高丝氨酸营养缺陷型菌株：编码天冬氨酸-半醛脱氢酶的基因的缺失(ΔasD)导致仅在将高丝氨酸和二氨基庚二酸(DAP)添加到培养基中时才能够生长的菌株(Cardineau和Curtiss，J.Biol.Chem.262(1987)，3344-3353)。在该菌株中，高丝氨酸代谢为甲硫氨酸、苏氨酸和异亮氨酸，而DAP代谢为赖氨酸和肽聚糖。(注意到尽管形式上是可逆的，但高丝氨酸脱氢酶不能将高丝氨酸氧化为天冬氨酸-半醛(DAP的前体)，因此需要向培养基中加入后一种中间体)。
推测了在甲醇和甲醇脱氢酶存在下，催化通过丙酮酸与甲醛缩合形成HOB的酶和催化HOB转化为高丝氨酸的酶的组合活性应该使得ΔasdΔfrmRAB菌株能够在不向培养基中添加高丝氨酸的情况下生长(图5a)。到目前为止，仅RhmA在先前显示出催化丙酮酸与甲醛缩合以产生HOB(Hernandez等，ACS Catal.7(2017)，1707-1711)。为了找到可以催化这个反应的其他酶，测试了类似的醛缩酶的这种活性。因此，对已知催化以丙酮酸作为受体的醛缩酶反应(并且可能能够使用甲醛作为供体)的所有大肠杆菌酶(菌株MG1655，使用EcoCyc；Keseler等，Nucleic Acids Res.33(2005)，D334-337)进行了搜索。除了RhmA本身之外，还发现了六种候选醛缩酶：GarL、YagE、YjhH、Eda、DgoA和MhpE(图5b)。RhmA和GarL属于HpcH的结构家族，而mhpE属于DmpG家族。这两个家族都是II型丙酮酸醛缩酶，其使用二价金属阳离子进行供体结合和烯醇化(Fang等，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.58(2019)，11841-11845)。YagE和YjhH属于DHDPS的结构家族，而Eda和DgoA属于KDPG家族。这些家族是I型丙酮酸醛缩酶，使用赖氨酸残基以与供体底物形成席夫碱(Fang等，在上述引文中)。
发现了用甲醇替换高丝氨酸时，mdh与rhmA、garL、yagE或yjhH一起过表达使得ΔasdΔfrmRAB菌株能够生长(图5c)。这四种醛缩酶支持大致相同的生长速率。在没有甲醇的情况下，或甲醇脱氢酶或醛缩酶单独过表达时，没有观察到生长。RhmA、GarL、YagE和YjhH之间的相对序列相似性(图5b和图6)可以解释为什么这些酶而不是其它酶能够支持HAL反应。实际上，RhmA和GarL的结构几乎相同(图7)。
由于已知将HOB转化为高丝氨酸的反应由属于高表达蛋白质的天然天冬氨酸氨基转移酶(AspC)支持(Li等，Cell 157(2014)，624-635)，并且可能被其他高表达的混杂氨基转移酶进一步催化，因此假设不需要专门的酶过表达来实现这个关键反应，并且确实是这种情况。特别地，在没有专门过表达氨基转移酶的情况下生长是可能的。aspC或突变形式的丙氨酸氨基转移酶(alaC*，其蛋白质产物先前显示出催化其中从HOB形成高丝氨酸的反应；Bouzon等，ACS Synthetic Biology 6(2017)，1520-1533)的基因组过表达基本上不改变生长(图8)。类似地，thrBC的基因组过表达不一致地帮助生长(图8)。这表明从HOB到高丝氨酸的反应、高丝氨酸激酶(HSK)反应和苏氨酸合酶(TS)反应不限制从丙酮酸到苏氨酸的通量。
我们进行了13C标记实验以证实高丝氨酸及其下游产物苏氨酸和甲硫氨酸通过以下反应从丙酮酸和甲醇产生：其中HOB通过丙酮酸与甲醛的缩合形成，并随后HOB转化为高丝氨酸。在与未标记的葡萄糖和13C-甲醇一起培养时，发现苏氨酸和甲硫氨酸被全部标记一次，而赖氨酸和天冬氨酸(用作对照)是完全未标记的。这证实了高丝氨酸和苏氨酸完全衍生自丙酮酸和甲醇。
序列表
<110> 财富科学家股份有限公司
马克思—普朗克科学促进协会公司
<120> 将甲醛掺入生物质中的方法
<130> AC2528 PCT S3
<150> EP 20 15 7768.1
<151> 2020-02-17
<160> 47
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 267
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（E.coli）
<220>
<223> RhmA
<400> 1
Met Asn Ala Leu Leu Ser Asn Pro Phe Lys Glu Arg Leu Arg Lys Gly
1 5 10 15
Glu Val Gln Ile Gly Leu Trp Leu Ser Ser Thr Thr Ala Tyr Met Ala
20 25 30
Glu Ile Ala Ala Thr Ser Gly Tyr Asp Trp Leu Leu Ile Asp Gly Glu
35 40 45
His Ala Pro Asn Thr Ile Gln Asp Leu Tyr His Gln Leu Gln Ala Val
50 55 60
Ala Pro Tyr Ala Ser Gln Pro Val Ile Arg Pro Val Glu Gly Ser Lys
65 70 75 80
Pro Leu Ile Lys Gln Val Leu Asp Ile Gly Ala Gln Thr Leu Leu Ile
85 90 95
Pro Met Val Asp Thr Ala Glu Gln Ala Arg Gln Val Val Ser Ala Thr
100 105 110
Arg Tyr Pro Pro Tyr Gly Glu Arg Gly Val Gly Ala Ser Val Ala Arg
115 120 125
Ala Ala Arg Trp Gly Arg Ile Glu Asn Tyr Met Ala Gln Val Asn Asp
130 135 140
Ser Leu Cys Leu Leu Val Gln Val Glu Ser Lys Thr Ala Leu Asp Asn
145 150 155 160
Leu Asp Glu Ile Leu Asp Val Glu Gly Ile Asp Gly Val Phe Ile Gly
165 170 175
Pro Ala Asp Leu Ser Ala Ser Leu Gly Tyr Pro Asp Asn Ala Gly His
180 185 190
Pro Glu Val Gln Arg Ile Ile Glu Thr Ser Ile Arg Arg Ile Arg Ala
195 200 205
Ala Gly Lys Ala Ala Gly Phe Leu Ala Val Ala Pro Asp Met Ala Gln
210 215 220
Gln Cys Leu Ala Trp Gly Ala Asn Phe Val Ala Val Gly Val Asp Thr
225 230 235 240
Met Leu Tyr Ser Asp Ala Leu Asp Gln Arg Leu Ala Met Phe Lys Ser
245 250 255
Gly Lys Asn Gly Pro Arg Ile Lys Gly Ser Tyr
260 265
<210> 2
<211> 302
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（E.coli）
<220>
<223> YagE
<400> 2
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Ile Phe Thr Ala Asp Gly Gln Leu Asp Lys Pro Gly Thr Ala Ala Leu
20 25 30
Ile Asp Asp Leu Ile Lys Ala Gly Val Asp Gly Leu Phe Phe Leu Gly
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Ser Gly Gly Glu Phe Ser Gln Leu Gly Ala Glu Glu Arg Lys Ala Ile
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85 90 95
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<211> 301
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（E.coli）
<220>
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<213> 大肠杆菌（E.coli）
<220>
<223> GarL
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Lys Gln Val Gln Ile Gly Cys Trp Ser Ala Leu Ser Asn Pro Ile Ser
20 25 30
Thr Glu Val Leu Gly Leu Ala Gly Phe Asp Trp Leu Val Leu Asp Gly
35 40 45
Glu His Ala Pro Asn Asp Ile Ser Thr Phe Ile Pro Gln Leu Met Ala
50 55 60
Leu Lys Gly Ser Ala Ser Ala Pro Val Val Arg Val Pro Thr Asn Glu
65 70 75 80
Pro Val Ile Ile Lys Arg Leu Leu Asp Ile Gly Phe Tyr Asn Phe Leu
85 90 95
Ile Pro Phe Val Glu Thr Lys Glu Glu Ala Glu Leu Ala Val Ala Ser
100 105 110
Thr Arg Tyr Pro Pro Glu Gly Ile Arg Gly Val Ser Val Ser His Arg
115 120 125
Ala Asn Met Phe Gly Thr Val Ala Asp Tyr Phe Ala Gln Ser Asn Lys
130 135 140
Asn Ile Thr Ile Leu Val Gln Ile Glu Ser Gln Gln Gly Val Asp Asn
145 150 155 160
Val Asp Ala Ile Ala Ala Thr Glu Gly Val Asp Gly Ile Phe Val Gly
165 170 175
Pro Ser Asp Leu Ala Ala Ala Leu Gly His Leu Gly Asn Ala Ser His
180 185 190
Pro Asp Val Gln Lys Ala Ile Gln His Ile Phe Asn Arg Ala Ser Ala
195 200 205
His Gly Lys Pro Ser Gly Ile Leu Ala Pro Val Glu Ala Asp Ala Arg
210 215 220
Arg Tyr Leu Glu Trp Gly Ala Thr Phe Val Ala Val Gly Ser Asp Leu
225 230 235 240
Gly Val Phe Arg Ser Ala Thr Gln Lys Leu Ala Asp Thr Phe Lys Lys
245 250 255
<210> 5
<211> 333
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（E.coli）
<220>
<223> LtaE
<400> 5
Met Ile Asp Leu Arg Ser Asp Thr Val Thr Arg Pro Ser Arg Ala Met
1 5 10 15
Leu Glu Ala Met Met Ala Ala Pro Val Gly Asp Asp Val Tyr Gly Asp
20 25 30
Asp Pro Thr Val Asn Ala Leu Gln Asp Tyr Ala Ala Glu Leu Ser Gly
35 40 45
Lys Glu Ala Ala Ile Phe Leu Pro Thr Gly Thr Gln Ala Asn Leu Val
50 55 60
Ala Leu Leu Ser His Cys Glu Arg Gly Glu Glu Tyr Ile Val Gly Gln
65 70 75 80
Ala Ala His Asn Tyr Leu Phe Glu Ala Gly Gly Ala Ala Val Leu Gly
85 90 95
Ser Ile Gln Pro Gln Pro Ile Asp Ala Ala Ala Asp Gly Thr Leu Pro
100 105 110
Leu Asp Lys Val Ala Met Lys Ile Lys Pro Asp Asp Ile His Phe Ala
115 120 125
Arg Thr Lys Leu Leu Ser Leu Glu Asn Thr His Asn Gly Lys Val Leu
130 135 140
Pro Arg Glu Tyr Leu Lys Glu Ala Trp Glu Phe Thr Arg Glu Arg Asn
145 150 155 160
Leu Ala Leu His Val Asp Gly Ala Arg Ile Phe Asn Ala Val Val Ala
165 170 175
Tyr Gly Cys Glu Leu Lys Glu Ile Thr Gln Tyr Cys Asp Ser Phe Thr
180 185 190
Ile Cys Leu Ser Lys Gly Leu Gly Thr Pro Val Gly Ser Leu Leu Val
195 200 205
Gly Asn Arg Asp Tyr Ile Lys Arg Ala Ile Arg Trp Arg Lys Met Thr
210 215 220
Gly Gly Gly Met Arg Gln Ser Gly Ile Leu Ala Ala Ala Gly Ile Tyr
225 230 235 240
Ala Leu Lys Asn Asn Val Ala Arg Leu Gln Glu Asp His Asp Asn Ala
245 250 255
Ala Trp Met Ala Glu Gln Leu Arg Glu Ala Gly Ala Asp Val Met Arg
260 265 270
Gln Asp Thr Asn Met Leu Phe Val Arg Val Gly Glu Glu Asn Ala Ala
275 280 285
Ala Leu Gly Glu Tyr Met Lys Ala Arg Asn Val Leu Ile Asn Ala Ser
290 295 300
Pro Ile Val Arg Leu Val Thr His Leu Asp Val Ser Arg Glu Gln Leu
305 310 315 320
Ala Glu Val Ala Ala His Trp Arg Ala Phe Leu Ala Arg
325 330
<210> 6
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 RHMA_F
<400> 6
atgcatcatc accatcacca caacgcatta ttaagcaatc cc 42
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 RHMA_R
<400> 7
gcgctagctc aataactacc ttttatgc 28
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 YAGE_F
<400> 8
atgcatcatc accatcacca caccgcagtc cgcgttgttc 40
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 YAGE_R
<400> 9
gctagcatta gcaaagcttg agctgttg 28
<210> 10
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 YJHH_F
<400> 10
atgcatcatc accatcacca caaaaaaatt cagcggcatt attcc 45
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 YJHH_R
<400> 11
gctagcatta gactggtaaa atgccct 27
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 YJHH_C
<400> 12
taataaaggg gttgacgggc tg 22
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 YJHH_D
<400> 13
cagcccgtca acccctttat ta 22
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> YJHH_A
<400> 14
gtaaccattg ttgacgggcg ag 22
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 YJHH_B
<400> 15
ctcgcccgtc aacaatggtt ac 22
<210> 16
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 DGOA_F
<400> 16
atgcatcatc accatcacca cacagtggca aactaaactc c 41
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 DGOA_R
<400> 17
gctagcatca ttgcactgcc tctcg 25
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 DGOA_B
<400> 18
tcccgctgaa ctccccacaa tg 22
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 DGOA_C
<400> 19
cattgtgggg agttcagcgg ga 22
<210> 20
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 EDA_A
<400> 20
gaatgcatca tcaccatcac cacaaaaact ggaaaacaag tgcagaatca atcctgacca 60
c 61
<210> 21
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 EDA_B
<400> 21
gaacggaccc gcaatcgctt gcagggcttt cac 33
<210> 22
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 EDA_C
<400> 22
gtgaaagccc tgcaagcgat tgcgggtccg ttc 33
<210> 23
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 EDA_D
<400> 23
cgctagctct agattacagc ttagcgcctt ctacagcttc acg 43
<210> 24
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 MHPE_F
<400> 24
atgcatcatc accatcacca caaacggtaa aaaactttat atctcggacg 50
<210> 25
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 MHPE_R
<400> 25
gctagcatta tttgttgttg cgcagatc 28
<210> 26
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 LTAE_F
<400> 26
atgcatcatc accatcacca cattgattta cgcagtgata ccgttacccg acc 53
<210> 27
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 LTAE_B
<400> 27
gctgcgtagt cttgcagagc attaac 26
<210> 28
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 LTAE_C
<400> 28
gttaatgctc tgcaagacta cgcagc 26
<210> 29
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 LTAE_R
<400> 29
ctcttacgtg cccgatcaac gctagcttaa cgcgccagga atgcacgcca g 51
<210> 30
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 GARL_F
<400> 30
gttaagaggc aagaatgcat aataacgatg ttttcccgaa 40
<210> 31
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 GARL_R
<400> 31
ccgcgctagc tctagattat tttttaaagg tatcagccag t 41
<210> 32
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 ALAC_F
<400> 32
atgcatcatc accatcacca cgctgacact cgccctgaa 39
<210> 33
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 ALAC_C
<400> 33
gcgcggtgat tccaggggcg caggta 26
<210> 34
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 ALAC_B
<400> 34
tacctgcgcc cctggaatca ccgcgc 26
<210> 35
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 ALAC_E
<400> 35
gctatcacga tgacggcacc tttacg 26
<210> 36
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 ALAC_D
<400> 36
cgtaaaggtg ccgtcatcgt gatagc 26
<210> 37
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 ALAC_R
<400> 37
gctagcttat tccgcgtttt cgtgaa 26
<210> 38
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 PALAC_R
<400> 38
agtaaaccgt cggcacggaa catc 24
<210> 39
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 PALAC_F
<400> 39
ctctatgata ggtaacctga aggctgatga ccagcaggcc gtttttgagg aattaaccct 60
cactaaaggg cg 72
<210> 40
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 PTHRBC_R
<400> 40
aacccgacgc tcatattggc actggaagcc ggggcataaa ctttaaccat tcttgcctct 60
taactttaaa g 71
<210> 41
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 PTHRBC_F
<400> 41
caatgttgca ccgtttgctg catgatattg aaaaaaatat caccaaataa aattaaccct 60
cactaaaggg cg 72
<210> 42
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 PASPC_F
<400> 42
ggtcctgttt tttttatacc ttccagagca atctcacgtc ttgcaaaaac aattaaccct 60
cactaaaggg cg 72
<210> 43
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 PASPC_R
<400> 43
gccaggccca gaatcgggtc ggcaggagcg gcggtaatgt tctcaaacat tcttgcctct 60
taactttaaa g 71
<210> 44
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核糖体结合位点
<400> 44
aagttaagag gcaaga 16
<210> 45
<211> 213
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（E.coli）
<220>
<223> EDA
<400> 45
Met Lys Asn Trp Lys Thr Ser Ala Glu Ser Ile Leu Thr Thr Gly Pro
1 5 10 15
Val Val Pro Val Ile Val Val Lys Lys Leu Glu His Ala Val Pro Met
20 25 30
Ala Lys Ala Leu Val Ala Gly Gly Val Arg Val Leu Glu Val Thr Leu
35 40 45
Arg Thr Glu Cys Ala Val Asp Ala Ile Arg Ala Ile Ala Lys Glu Val
50 55 60
Pro Glu Ala Ile Val Gly Ala Gly Thr Val Leu Asn Pro Gln Gln Leu
65 70 75 80
Ala Glu Val Thr Glu Ala Gly Ala Gln Phe Ala Ile Ser Pro Gly Leu
85 90 95
Thr Glu Pro Leu Leu Lys Ala Ala Thr Glu Gly Thr Ile Pro Leu Ile
100 105 110
Pro Gly Ile Ser Thr Val Ser Glu Leu Met Leu Gly Met Asp Tyr Gly
115 120 125
Leu Lys Glu Phe Lys Phe Phe Pro Ala Glu Ala Asn Gly Gly Val Lys
130 135 140
Ala Leu Gln Ala Ile Ala Gly Pro Phe Ser Gln Val Arg Phe Cys Pro
145 150 155 160
Thr Gly Gly Ile Ser Pro Ala Asn Tyr Arg Asp Tyr Leu Ala Leu Lys
165 170 175
Ser Val Leu Cys Ile Gly Gly Ser Trp Leu Val Pro Ala Asp Ala Leu
180 185 190
Glu Ala Gly Asp Tyr Asp Arg Ile Thr Lys Leu Ala Arg Glu Ala Val
195 200 205
Glu Gly Ala Lys Leu
210
<210> 46
<211> 205
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（E.coli）
<220>
<223> dgoA
<400> 46
Met Gln Trp Gln Thr Lys Leu Pro Leu Ile Ala Ile Leu Arg Gly Ile
1 5 10 15
Thr Pro Asp Glu Ala Leu Ala His Val Gly Ala Val Ile Asp Ala Gly
20 25 30
Phe Asp Ala Val Glu Ile Pro Leu Asn Ser Pro Gln Trp Glu Gln Ser
35 40 45
Ile Pro Ala Ile Val Asp Ala Tyr Gly Asp Lys Ala Leu Ile Gly Ala
50 55 60
Gly Thr Val Leu Lys Pro Glu Gln Val Asp Ala Leu Ala Arg Met Gly
65 70 75 80
Cys Gln Leu Ile Val Thr Pro Asn Ile His Ser Glu Val Ile Arg Arg
85 90 95
Ala Val Gly Tyr Gly Met Thr Val Cys Pro Gly Cys Ala Thr Ala Thr
100 105 110
Glu Ala Phe Thr Ala Leu Glu Ala Gly Ala Gln Ala Leu Lys Ile Phe
115 120 125
Pro Ser Ser Ala Phe Gly Pro Gln Tyr Ile Lys Ala Leu Lys Ala Val
130 135 140
Leu Pro Ser Asp Ile Ala Val Phe Ala Val Gly Gly Val Thr Pro Glu
145 150 155 160
Asn Leu Ala Gln Trp Ile Asp Ala Gly Cys Ala Gly Ala Gly Leu Gly
165 170 175
Ser Asp Leu Tyr Arg Ala Gly Gln Ser Val Glu Arg Thr Ala Gln Gln
180 185 190
Ala Ala Ala Phe Val Lys Ala Tyr Arg Glu Ala Val Gln
195 200 205
<210> 47
<211> 337
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（E.coli）
<220>
<223> mhpE
<400> 47
Met Asn Gly Lys Lys Leu Tyr Ile Ser Asp Val Thr Leu Arg Asp Gly
1 5 10 15
Met His Ala Ile Arg His Gln Tyr Ser Leu Glu Asn Val Arg Gln Ile
20 25 30
Ala Lys Ala Leu Asp Asp Ala Arg Val Asp Ser Ile Glu Val Ala His
35 40 45
Gly Asp Gly Leu Gln Gly Ser Ser Phe Asn Tyr Gly Phe Gly Ala His
50 55 60
Ser Asp Leu Glu Trp Ile Glu Ala Ala Ala Asp Val Val Lys His Ala
65 70 75 80
Lys Ile Ala Thr Leu Leu Leu Pro Gly Ile Gly Thr Ile His Asp Leu
85 90 95
Lys Asn Ala Trp Gln Ala Gly Ala Arg Val Val Arg Val Ala Thr His
100 105 110
Cys Thr Glu Ala Asp Val Ser Ala Gln His Ile Gln Tyr Ala Arg Glu
115 120 125
Leu Gly Met Asp Thr Val Gly Phe Leu Met Met Ser His Met Thr Thr
130 135 140
Pro Glu Asn Leu Ala Lys Gln Ala Lys Leu Met Glu Gly Tyr Gly Ala
145 150 155 160
Thr Cys Ile Tyr Val Val Asp Ser Gly Gly Ala Met Asn Met Ser Asp
165 170 175
Ile Arg Asp Arg Phe Arg Ala Leu Lys Ala Glu Leu Lys Pro Glu Thr
180 185 190
Gln Thr Gly Met His Ala His His Asn Leu Ser Leu Gly Val Ala Asn
195 200 205
Ser Ile Ala Ala Val Glu Glu Gly Cys Asp Arg Ile Asp Ala Ser Leu
210 215 220
Ala Gly Met Gly Ala Gly Ala Gly Asn Ala Pro Leu Glu Val Phe Ile
225 230 235 240
Ala Ala Ala Asp Lys Leu Gly Trp Gln His Gly Thr Asp Leu Tyr Ala
245 250 255
Leu Met Asp Ala Ala Asp Asp Leu Val Arg Pro Leu Gln Asp Arg Pro
260 265 270
Val Arg Val Asp Arg Glu Thr Leu Ala Leu Gly Tyr Ala Gly Val Tyr
275 280 285
Ser Ser Phe Leu Arg His Cys Glu Thr Ala Ala Ala Arg Tyr Gly Leu
290 295 300
Ser Ala Val Asp Ile Leu Val Glu Leu Gly Lys Arg Arg Met Val Gly
305 310 315 320
Gly Gln Glu Asp Met Ile Val Asp Val Ala Leu Asp Leu Arg Asn Asn
325 330 335
Lys

Claims (14)

1.一种包括以下酶促催化步骤的方法
(1)丙酮酸与甲醛缩合成4-羟基-2-氧代丁酸(HOB)；
(2)将由此产生的4-羟基-2-氧代丁酸(HOB)胺化以产生高丝氨酸；
(3)将由此产生的高丝氨酸转化为苏氨酸；
(4)将由此产生的苏氨酸转化为甘氨酸和乙醛或乙酰-CoA；
(5)将由此产生的甘氨酸与甲醛缩合以产生丝氨酸；和
(6)转化由此产生的丝氨酸以产生丙酮酸，其中所述丙酮酸然后可以用作步骤(1)中的底物。
2.权利要求1的方法，其中步骤(3)中高丝氨酸向苏氨酸的转化通过以下进行：
(iii)将由此产生的高丝氨酸磷酸化以产生o-磷酸高丝氨酸；和
(iv)将由此产生的o-磷酸高丝氨酸脱磷酸化以产生苏氨酸。
3.权利要求1或2的方法，其中步骤(6)中丝氨酸向丙酮酸的转化通过脱氨基实现。
4.权利要求1至3任一项的方法，其中
(a)在步骤(1)中，使用归类于EC 4.1.2._的醛缩酶实现丙酮酸与甲醛缩合成4-羟基-2-氧代丁酸(HOB)；
(b)在步骤(2)中，通过使用归类于EC 2.6.1._的氨基转移酶或通过氨基酸脱氢酶(EC1.4.1._)实现由此产生的4-羟基-2-氧代丁酸(HOB)的胺化以产生高丝氨酸；
(c)在权利要求2的步骤(3)(i)中，通过使用高丝氨酸激酶(EC 2.7.1.39)实现由此产生的高丝氨酸的磷酸化以产生o-磷酸高丝氨酸；
(d)在权利要求2的步骤(3)(ii)中，通过使用苏氨酸合酶(EC 4.2.3.1)实现由此产生的o-磷酸高丝氨酸的脱磷酸化以产生苏氨酸；
(e)在步骤(4)中，通过使用苏氨酸醛缩酶(选自EC 4.1.2.5、EC 4.1.2.6、EC 4.1.2.48和EC 4.1.2.49)实现由此产生的苏氨酸向甘氨酸和乙醛的转化，和/或其中在步骤(5)中，通过苏氨酸脱氢酶(EC 1.1.1.103)和2-氨基-3-酮丁酸CoA连接酶(EC 2.3.1.29)的组合实现由此产生的苏氨酸向甘氨酸和乙酰-CoA的转化；
(f)在步骤(5)中，通过使用苏氨酸醛缩酶(选自EC 4.1.2.5、EC 4.1.2.6、EC 4.1.2.48和EC 4.1.2.49)实现由此产生的甘氨酸与甲醛缩合以产生丝氨酸；
(g)在步骤(6)中，通过使用丝氨酸脱氨酶(EC 4.3.1.17)或苏氨酸脱氨酶(EC4.3.1.19)实现由此产生的丝氨酸转化以产生丙酮酸；
或(a)至(g)的任何组合。
5.权利要求1至4任一项的方法，其中用于步骤(1)和/或(5)中的缩合的甲醛通过甲醇的氧化来提供。
6.权利要求1至5任一项的方法，其中步骤(1)和/或5)中的甲醛由以下提供：
(a)使用甲醇脱氢酶(EC 1.1.1.244)或甲醇脱氢酶(细胞色素c)(EC1.1.2.7)将甲醇酶促转化为甲醛；和/或
(b)使用醇氧化酶(EC 1.1.3.13)将甲醇酶促转化为甲醛。
7.一种重组微生物，其表达用于催化以下反应的酶：
(1)丙酮酸与甲醛通过归类于EC 4.1.2._的醛缩酶缩合成4-羟基-2-氧代丁酸(HOB)；
(2)通过归类于EC 2.6.1._的氨基转移酶或通过氨基酸脱氢酶(EC1.4.1._)将由此产生的4-羟基-2-氧代丁酸(HOB)胺化以产生高丝氨酸；
(3)通过高丝氨酸激酶(EC 2.7.1.39)磷酸化由此产生的高丝氨酸以产生o-磷酸高丝氨酸；
(4)由此产生的o-磷酸高丝氨酸通过苏氨酸合酶(EC 4.2.3.1)脱磷酸化以产生苏氨酸；
(5)通过苏氨酸醛缩酶(选自EC 4.1.2.5、EC 4.1.2.6、EC 4.1.2.48和EC4.1.2.49)或通过苏氨酸脱氢酶(EC 1.1.1.103)和2-氨基-3-酮基丁酸CoA连接酶(EC 2.3.1.29)的组合将由此产生的苏氨酸转化为甘氨酸；
(6)通过苏氨酸醛缩酶(选自EC 4.1.2.5、EC 4.1.2.6、EC 4.1.2.48和EC4.1.2.49)将由此产生的甘氨酸与甲醛缩合以产生丝氨酸；和
(7)通过丝氨酸脱氨酶(EC 4.3.1.17或苏氨酸脱氨酶(EC 4.3.1.19))将由此产生的丝氨酸脱氨基以产生丙酮酸，其中所述丙酮酸然后可以用作步骤(1)中的底物，
其中所述微生物含有至少一种编码催化步骤(1)的醛缩酶的异源核酸分子，和
过表达催化步骤(6)即甘氨酸与甲醛缩合形成丝氨酸的酶。
8.权利要求7的微生物，其还过表达催化步骤(3)、步骤(4)或步骤(5)的酶中的至少一种。
9.权利要求7或8的微生物，其能够将甲醇转化为甲醛。
10.权利要求9的微生物，其中所述微生物
(a)通过甲醇脱氢酶(EC 1.1.1.244)或甲醇脱氢酶(细胞色素c)(EC1.1.2.7)将甲醇酶促转化为甲醛；和/或
(b)通过醇氧化酶(EC 1.1.3.13)将甲醇酶促转化为甲醛。
11.7至10任一项的微生物，其中所述微生物缺乏将丙酮酸转化为天冬氨酸半醛的酶活性。
12.7至11任一项的微生物，其中所述微生物缺乏3-磷酸甘油酸脱氢酶(EC1.1.1.95)的酶活性。
13.7至12任一项的微生物，其中所述微生物缺乏丝氨酸羟甲基转移酶(EC2.1.2.1)的酶活性和/或甘氨酸切割系统(gcvTHP)。
14.权利要求7至13任一项的微生物，其是大肠杆菌。
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