ES2841725T3 - Microorganismos recombinantes y sus usos - Google Patents

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Wendy Chen
Fungmin Liew
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Abstract

Un método de producción de isopreno, que comprende: (I) obtener un sustrato gaseoso que comprende monóxido de carbono y/o dióxido de carbono de un procedimiento industrial seleccionado del grupo que consiste en fabricación de productos de metales ferrosos, fabricación de productos no ferrosos, refinación del petróleo, gasificación de carbón, producción de energía eléctrica, producción de negro de carbón, producción de amoníaco, producción de metanol y fabricación de coque; y (II) poner el sustrato gaseoso que comprende monóxido de carbono y/o dióxido de carbono en contacto con un microorganismo recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica isopreno sintasa, para permitir el microorganismo recombinante para producir isopreno del monóxido de carbono y/o dióxido de carbono; en donde el microorganismo recombinante se prepara introduciendo un ácido nucleico que codifica isopreno sintasa en un microorganismo parental Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium ragsdalei, Clostridium carboxidivorans, Clostridium drakei, Clostridium scatologenes, Clostridium aceticum, Clostridium formicoaceticum, Clostridium magnum, Butyribacterium methylotrophicum, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Blautia producta, Eubacterium limosum, Moore- lla thermoacetica, Moorella thermautotrophica, Sporomusa ovata, Sporomusa silvacetica, Sporomusa sphaeroides, Oxobacter pfennigii o Thermoanaerobacter kiuvi.

Description

DESCRIPCIÓN
Microorganismos recombinantes y sus usos
Campo de la invención
La presente invención se refiere a métodos para la producción de isopreno de los mismos por fermentación microbiana de un sustrato que comprende CO.
Antecedentes de la invención
Los terpenos son una clase diversa de compuestos químicos que se encuentran de forma natural compuestos de unidades de isopreno de cinco carbonos. Los derivados de terpeno incluyen terpenoides (también conocidos como isoprenoides) que se pueden formar por oxidación o reordenación de la cadena principal de carbonos o una serie de adiciones o transposiciones de grupos funcionales.
Los ejemplos de terpenos incluyen: isopreno (hemiterpeno C5), farneseno (sesquiterpenos C15 ), artemisinina (sesquiterpenos C15), citral (monoterpenos C10), carotenoides (tetraterpenos C40), mentol (monoterpenos C10 ), alcanfor (monoterpenos C10), y canabinoides.
Los terpenos son productos comerciales valiosos usados en una serie diversa de industrias. Los usos de mayor tonelaje de los terpenos son como resinas, disolventes, fragancias y vitaminas. Por ejemplo, el isopreno se usa en la producción de caucho sintético (cis-1,4-poliisopreno) por ejemplo en la industria de los neumáticos; el farneseno se usa como un combustible de baja densidad energética usado para el transporte o como combustible para aviones; la artemisinina se usa como un fármaco para la malaria; y el citral, carotenoides, mentol, alcanfor y canabinoides se usan en la fabricación de productos farmacéuticos, butadieno y como ingredientes aromáticos.
Los terpenos se pueden producir a partir de fuentes petroquímicas y de materias primas del terpeno, tales como la trementina. Por ejemplo, el isopreno se produce por vía petroquímica como un subproducto de la nafta o craqueo del petróleo en la producción de etileno. Muchos terpenos se extraen también en cantidades relativamente pequeñas de fuentes naturales. Sin embargo, estos métodos de producción son caros, no son sostenibles y a menudo causan problemas ambientales que incluyen la contribución al cambio climático.
Debido a la naturaleza extremadamente inflamable del isopreno, los métodos de producción conocidos requieren amplias protecciones para limitar el potencial de incendios y explosiones.
Un objeto de la invención es superar una o más de las desventajas de la técnica anterior, o al menos proporcionar al público un medio alternativo para producir isopreno y otros productos relacionados.
Resumen de la invención
La fermentación microbiana proporciona una opción alternativa para la producción de terpenos. Los terpenos son de naturaleza ubicua, por ejemplo, están implicados en la biosíntesis de la pared celular bacteriana, y son producidos por algunos árboles (por ejemplo, álamos) para proteger las hojas de la exposición a la luz UV. Sin embargo, no todas las bacterias comprenden la maquinaria celular necesaria para producir terpenos y/o sus precursores como productos metabólicos. Los acetógenos carboxidotróficos, tales como C. autoethanogenum o C. Ijungdahlii, que pueden fermentar sustratos que comprenden monóxido de carbono para producir productos tales como etanol, no se sabe que produzcan y emitan terpenos y/o sus precursores como productos metabólicos. Además, la mayoría de las bacterias no se sabe que produzcan ningún terpeno que tenga valor comercial.
La invención proporciona en general, entre otros, métodos para la producción de isopreno por fermentación microbiana de un sustrato que comprende CO, y microorganismos recombinantes para usar en dichos métodos. En un primer aspecto, la invención proporciona un método para producir isopreno que comprende:
(I) obtener un sustrato gaseoso que comprende monóxido de carbono y/o dióxido de carbono de un procedimiento industrial seleccionado del grupo que consiste en fabricación de productos de metales ferrosos, fabricación de productos de metales no ferrosos, refinación del petróleo, gasificación de carbón, producción de energía eléctrica, producción de negro de carbón, producción de amoníaco, producción de metanol y fabricación de coque; y
(II) poner el sustrato gaseoso que comprende monóxido de carbono y/o dióxido de carbono en contacto con un microorganismo recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica isopreno sintasa, para permitir el microorganismo recombinante para producir isopreno del monóxido de carbono y/o dióxido de carbono;
en donde el microorganismo recombinante se prepara introduciendo un ácido nucleico que codifica isopreno sintasa en un microorganismo parental Clostridium autoethanogenum, Clostridium Ijungdahlii, Clostridium ragsdalei, Clostridium carboxidivorans, Clostridium drakei, Clostridium scatologenes, Clostridium aceticum, Clostridium formicoaceticum, Clostridium magnum, Butyribac- terium methylotrophicum, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Blautia producta, Eubacterium limosum, Moore- lla thermoacetica, Moorella thermautotrophica, Sporomusa ovata, Sporomusa silvacetica, Sporomusa sphaeroides, Oxobacter pfennigii, o Thermoanaerobacter kiuvi.
En segundo aspecto, la invención proporciona un método de acuerdo con el primer aspecto, en donde el microorganismo recombinante se proporciona con un sustrato gaseoso que comprende monócido de carbono e hidrógeno, o dióxido de carbono e hidrógeno.
En un tercer aspecto, la invención proporciona un método según el segundo aspecto, en donde el sustrato gaseoso es un gas sintético.
En un cuarto aspecto, la invención proporciona un método según uno cualquiera de los aspectos previos, en donde el microorganismo recombinante comprende además un ácido nucleico que codifica una enzima exógena que actúa en una ruta de mevalonato, en donde el microorganismo recombinante es capaz de producir difosfato de isopentenilo a través de la ruta de mevalonato.
En un quinto aspecto, la invención proporciona un método según el cuarto aspecto, en donde el ácido nucleico que codifica la enzima exógena que actúa en la ruta de mevalonato se selecciona de mevalonato quinasa, mevalonato difosfato descarboxilasa, fosfomevalonato quinasa, tiolasa, 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A (HMG-CoA) reductasa y HMG-CoA sintasa.
En un sexto aspecto, la invención proporciona un método según el cuarto o quinto aspecto, en donde la ruta de mevalonato la de levadura.
En un séptimo aspecto, la invención proporciona un método según el sexto aspecto, en donde la levadura es Saccharomyces.
En un octavo aspecto, la invención proporciona un método según uno cualquiera de los aspectos previos, en donde el microorganismo recombinante comprende además un ácido nucleico que codifica al menos una enzima que actúa en una ruta de DXS, en donde la ruta de DXS:
(a) no está presente de forma natural en el microorganismo parental; o
(b) está presente de forma natural en el microorganismo parental.
En un noveno aspecto, la invención proporciona un método según el octavo aspecto, en donde el ácido nucleico que codifica al menos una enzima que actúa en la ruta de DXS se selecciona de 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato sintasa DXS, 1-desoxi-D-xilulosa 5-fosfato reductoisomerasa DXR, 2-C-metil-D-eritritol 4-fosfato citidiltransferasa IspD, 4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol quinasa IspE, 2-C-metil-D-eritritol 2,4-ciclodifosfato sintasa IspF, 4-hidroxi-3-metilbut-2-en-1-il difosfato sintasa IspG y 4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasa.
En un décimo aspecto, la invención proporciona un método según uno cualquiera de los aspectos previos, en donde la isopreno sintasa procede de una planta.
En un undécimo aspecto, la invención proporciona un método según uno cualquiera de los aspectos previos, en donde el ácido nucleico que codifica isopreno sintasa es:
(a) una secuencia representada por la SEQ ID NO: 21; o
(b) una secuencia que tiene una identidad de 90 % o más con la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 21.
En un duodécimo aspecto, la invención proporciona un método según uno cualquiera de los aspectos previos, en donde el ácido nucleico tiene codones optimizados.
En un decimotercer aspecto, la invención proporciona un método según uno cualquiera de los aspectos previos, en donde:
(a) el ácido nucleico se incorpora en el genoma del microorganismo recombinante; y/o
(b) el ácido nucleico se incorpora en un plásmido.
En un decimocuarto aspecto, la invención proporciona un método según uno cualquiera de los aspectos previos, en donde el microorganismo recombinante se selecciona de Clostridium autoethanogenum y Clostridium ljungdahlii. En un decimoquinto aspecto, la invención proporciona el uso del microorganismo recombinante según uno cualquiera de los aspectos previos en un método para producir isopreno, comprendiendo dicho método:
(I) obtener un sustrato gaseoso que comprende monóxido de carbono y/o dióxido de carbono de un proceso industrial seleccionado del grupo que consiste en fabricación de productos metálicos ferrosos, fabricación de productos no ferrosos, refinamiento de petróleo, gasificación de carbón, producción de energía eléctrica, producción de negro de carbón, producción de amoníaco, producción de metanol y fabricación de coque; y (II) poner el sustrato gaseoso que comprende monóxido de carbono y/o dióxido de carbono en contacto con dicho microorganismo recombinante para producir isopreno a partir del monóxido de carbono y/o dióxido de carbono.
Se proporciona un proceso en otra realización para convertir CO y/o CO2 en isopreno. El proceso comprende pasar un sustrato gaseoso que contiene CO y/o CO2 a un biorreactor que contiene un cultivo de bacterias acetógenas carboxidotróficas en un medio de cultivo de modo que las bacterias convierten el CO y/o CO2 a isopreno y recuperar el isopreno del biorreactor. Las bacterias acetógenas carboxidotróficas se modifican por ingeniería genética para expresar una isopreno sintasa.
Otra realización proporciona una bacteria aislada, modificada por ingeniería genética, carboxidotrófica, acetógena, que comprende un ácido nucleico que codifica una isopreno sintasa. Las bacterias expresan la isopreno sintasa y las bacterias son capaces de convertir metilalildifosfato en isopreno. En un aspecto, la isopreno sintasa es una enzima de Populus tremuloides. En otro aspecto, el ácido nucleico tiene codones optimizados. En una divulgación, la expresión de la isopreno sintasa está bajo el control transcripcional de un promotor para un gen de piruvato ferredoxina oxidorreductasa de Clostridium autoethanogenum.
Las bacterias acetógenas carboxidotróficas, genéticamente modificadas, aisladas adecuadas para cualquiera de los aspectos o realizaciones de la invención, se pueden seleccionar del grupo que consiste en Clostridium autoethanogenum, Clostridium jungdahlii, Clostridium ragsdalei, Clostridium carboxidivorans, Clostridium drakei, Clostridium scatologenes, Clostridium aceticum, Clostridium formicoaceticum, Clostridium magnum, Butyribacterium metilotrophicum, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Blautia producta, Eubacterium limosum, Moorella thermoacetica, Moorella thermautotrophica, Sporomusa ovata, Sporomusa silvacetica, Sporomusa sphaeroides, Oxobacter pfennigii y Thermoanaerobacter kiuvi.
La invención también puede decirse de forma amplia, que consiste en las partes, elementos y características a los que se hace referencia o indicados en la memoria descriptiva de la solicitud, individual o colectivamente, en cualquiera o todas las combinaciones de dos o más de dichas partes, elementos o características.
Breve descripción de las figuras
Estos y otros aspectos de la presente invención, que deberían considerarse en todos sus nuevos aspectos, serán evidentes a partir de la siguiente descripción, que se da solo a modo de ejemplo, con referencia a las figuras adjuntas.
Figura 1: Diagrama de ruta para la producción de terpenos, las dianas génicas descritas en esta solicitud se destacan con flechas en negrita.
Figura 2: Mapa genético del plásmido pMTL 85146-ispS
Figura 3: Mapa genético del plásmido pMTL 85246-ispS-idi
Figura 4: Mapa genético del plásmido pMTL 85246-ispS-idi-dxs
Figura 5: Resultados de la secuenciación para el plásmido pMTL 85246-ispS-idi-dxs
Figura 6: Comparación de energía para la producción de terpenos a partir de CO por la ruta de la DXS y el mevalonato.
Figura 7: Ruta del mevalonato
Figura 8: Imagen de electroforesis en gel de agarosa que confirma la presencia del plásmido de expresión de isopreno pMTL 85246-ispS-idi en transformantes C. autoethanogenum. Las bandas 1 y 20 muestran 100 pb Plus DNA Ladder. Las bandas 3-6, 9-12, 15-18 muestran la PCR con plásmidos aislados de 4 clones diferentes como molde, cada uno en el siguiente orden: colE1, ermB, e idi. Las bandas 2, 8, y 14 muestran la PCR sin moldes como control negativo, cada uno en el siguiente orden: colE1, ermB, e idi. Las bandas 7, 13, y 19 muestran la PCR con pMTL 85246-ispS-idi de E. coli como control positivo, cada uno en el siguiente orden: colE1, ermB, e idi.
Figura 9 - Plásmido de expresión del mevalonato pMTL8215-Pptaack-thlA-HMGS-Patp-HMGR
Figura 10 - Plásmido de expresión del isopreno pMTL 8314-Pptaack-thlA-HMGS-Patp-HMGR-Prnf-MK-PMK PMD-Pfor-idi-ispS
Figura 11 - Plásmido de expresión del farneseno pMTL8314-Pptaack-thlA-HMGS-Patp-HMGR-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS
Figura 12 - Mapa genético del plásmido pMTL 85246-ispS-idi-dxs
Figura 13 - Gráfica de amplificación para el experimento de expresión de genes con C. autoethanogenum que lleva el plásmido pMTL 85146-ispS
Figura 14 - Gráfica de amplificación para el experimento de expresión de genes con C. autoethanogenum que lleva el plásmido pMTL 85246-ispS-idi
Figura 15 - Gráfica de amplificación para el experimento de expresión de genes con C. autoethanogenum que lleva el plásmido pMTL 85246-ispS-idi-dxs
Figura 16 - Comprobación por PCR de la presencia del plásmido pMTL8314Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS. Tamaño de banda esperado 1584 pb. Marcador de ADN 1 kb DNA ladder de Fermentas.
Figura 17 - Curva de crecimiento para C. autoethanogemun transformado que lleva el plásmido pMTL8314Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS
Figura 18 - Datos de RT-PRC que muestran la expresión de los genes de la mevalonato quinasa (MK SEQ ID NO: 51), fosfomevalonato quinasa (PMK SEQ ID NO: 52), mevalonato difosfato descarboxilasa (PMD SEQ ID NO: 53), isopentil-difosfato delta-isomerasa (idi SEQ ID nO: 54), geraniltranstransferasa (ispA SeQ ID NO: 56) y farneseno sintasa (FS SEQ ID NO: 57).
Figura 19 - Detección por GC-MS y confirmación de la presencia de farneseno en cultivos enriquecidos en mevalonato 1 mM que llevan pMTL8314Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS. Cromatograma de GC-MS barrido para picos que contienen iones con una masa de 93. El cromatograma 1 y 2 son C. autoethanogenum transformado, 3 es referencia de beta-farneseno realizado al mismo tiempo que las muestras de C. autoethanogenum.4 es E. coli que lleva los plásmidos pMTL8314Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS cultivada en glucosa M9 que muestra la producción de alfa-farneseno y 5 es la referencia de beta-farneseno realizado al mismo tiempo que las muestras de E. coli. La diferencia en el tiempo de retención entre las muestras de E. coli y C. autoethanogenum se debe a cambios minoritarios del instrumento. Sin embargo, la diferencia en el tiempo de retención entre la referencia de beta-farneseno y el alfa-farneseno producido es exactamente la misma en ambos casos, lo cual junto con la correspondencia en los espectros de masas confirma la producción de alfa-farneseno en C. autoethanogenum.
Figura 20 - Espectros de MS para los picos marcados 1A y 2A en la figura 19. Los espectros de masas se corresponden con los espectros de la base de datos NIST (figura 21) que confirman que el pico es alfafarneseno.
Figura 21 - Espectro de MS del alfa-farneseno de la base de datos de espectros de masas de NIST.
Descripción detallada de la invención
A continuación se da una descripción de la presente invención, que incluye realizaciones preferidas de la misma, dadas en términos generales. La invención se elucida adicionalmente en la descripción dada bajo el encabezado "Ejemplos" más adelante en la presente memoria, que proporciona datos experimentales que respaldan la invención, ejemplos específicos de diferentes aspectos de la invención y medios ilustrativos de llevar a cabo la invención. Los autores de la invención sorprendentemente han podido modificar genéticamente un microorganismo acetógeno carboxidotrófic para producir terpeno y sus precursores que incluyen isopreno y farneseno por fermentación de un sustrato que comprende CO. Esto ofrece un medio de producción alternativo de estos productos que puede tener beneficios frente a los métodos actuales para su producción. Además, ofrece un medio de uso del monóxido de carbono de procedimientos industriales que de lo contrario se liberaría a la atmósfera y contaminaría el entorno. Como se menciona en la presente memoria, un "caldo de fermentación" es un medio de cultivo que comprende al menos un medio nutriente y células bacterianas.
Como se menciona en la presente memoria, un "microorganismo lanzadera" es un microorganismo en el que se expresa una enzima metiltransferasa y es distinta del microorganismo de destino.
Como se menciona en la presente memoria, un "microorganismo destino" es un microorganismo en el que son expresados los genes incluidos en una construcción/vector de expresión y es distinto del microorganismo lanzadera.
La expresión "producto de fermentación principal" se pretende que signifique el producto de fermentación que es producido en la mayor concentración y/o rendimiento.
Las expresiones "aumento de la eficacia", "mayor eficacia" y similares, cuando se usan en relación con un proceso de fermentación incluyen, pero no se limitan, a aumentar uno o más de la velocidad de crecimiento de los microorganismos que catalizan la fermentación, la velocidad de crecimiento y/o producción de producto en concentraciones de producto elevadas, el volumen de producto deseado producido por volumen de sustrato consumido, la velocidad de producción o nivel de producción del producto deseado, y la proporción relativa del producto deseado producido comparado con otros subproductos de la fermentación.
Debe entenderse que la frase "sustrato que comprende monóxido de carbono" y las expresiones similares incluyen cualquier sustrato en el que haya disponible monóxido de carbono para una o más cepas de bacterias para el crecimiento y/o la fermentación, por ejemplo.
La frase "sustrato gaseoso que comprende monóxido de carbono" y frases y términos similares, incluyen cualquier gas que contiene un nivel de monóxido de carbono. En algunas divulgaciones, el sustrato contiene al menos de aproximadamente 20% a aproximadamente 100% de CO en volumen, de 20% a 70% de CO en volumen, de 30% a 60% de CO en volumen y de 40% a 55% de CO en volumen. En divulgaciones particulares, el sustrato comprende aproximadamente 25%, o aproximadamente 30%, o aproximadamente 35%, o aproximadamente 40%, o aproximadamente 45%, o aproximadamente 50% CO, o aproximadamente 55% CO, o aproximadamente 60% CO en volumen.
Aunque no es necesario que el sustrato contenga hidrógeno, la presencia de H2 no debe ser perjudicial para la formación del producto de acuerdo con los métodos de la invención. En realizaciones particulares, la presencia de hidrógeno da como resultado una eficacia total mejorada de producción de alcohol. Por ejemplo, en divulgaciones particulares, el sustrato puede comprender una relación de aproximadamente 2:1, o 1:1, o 1:2 de H2:CO. En una divulgación, el sustrato comprende aproximadamente 30% o menos H2 en volumen, 20% o menos H2 en volumen, aproximadamente 15% o menos H2 en volumen o aproximadamente 10% o menos H2 en volumen. En otras descripciones, la corriente de sustrato comprende concentraciones bajas de H2, por ejemplo menos de 5%, o menos de 4%, o menos de 3%, o menos de 2%, o menos de 1%, o está sustancialmente exenta de hidrógeno. El sustrato también puede contener algo de CO2 por ejemplo, tal como de aproximadamente 1% a aproximadamente 80% de CO2 en volumen, o de 1% a aproximadamente 30% de CO2 en volumen. En una descripción el sustrato comprende menos o igual a aproximadamente 20% de CO2 en volumen. En descripciones particulares, el sustrato comprende menos de o igual a aproximadamente 15% de CO2 en volumen, menos de o igual a aproximadamente 10% de CO2 en volumen, menos de o igual a aproximadamente 5% de CO2 en volumen o sustancialmente no comprende CO2. En la siguiente descripción, las realizaciones de la invención se describen en términos de suministro y fermentación de un "sustrato gaseoso que contiene CO". Sin embargo, debe apreciarse que el sustrato gaseoso se puede proporcionar en formas alternativas. Por ejemplo, el sustrato gaseoso que contiene CO se puede proporcionar disuelto en un líquido. Esencialmente, se satura un líquido con un gas que contiene monóxido de carbono y después se añade el líquido al biorreactor. Esto se puede lograr usando metodología convencional. A modo de ejemplo, se podría usar un generador de dispersión de microburbujas (Hensirisak et. al. "Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation"; Applied Biochemistry and Biotechnology, Volumen 101, Número 3 / Octubre, 2002). A modo de ejemplo adicional, el sustrato gaseoso que contiene CO se puede adsorber en un soporte sólido. Dichos métodos alternativos están englobados por el uso de la expresión "sustrato que contiene CO" y similares. En realizaciones particulares de la invención, el sustrato gaseoso que contiene CO es un gas residual o de descarga industrial. Los "gases residuales o de descarga industrial" deben considerarse de forma amplia que incluyen cualesquiera gases que comprenden CO producido por un procedimiento industrial, e incluyen gases producidos como resultados de la fabricación de productos metálicos ferrosos, fabricación de productos no ferrosos, procedimientos de refinado del petróleo, gasificación de carbón, gasificación de biomasa, producción de energía eléctrica, producción de negro de carbón y fabricación de coque. Se pueden proporcionar ejemplos adicionales en otra parte en la presente memoria.
Salvo que el contexto requiera otra cosa, las frases "fermentación", "procedimiento de fermentación" o "reacción de fermentación" y similares, como se usan en la presente memoria, se pretende que abarquen tanto la fase de crecimiento como la fase de biosíntesis de producto del procedimiento. Como se describirá además en la presente memoria, en algunas realizaciones el biorreactor puede comprender un primer reactor de crecimiento y un segundo reactor de fermentación. Como tal, la adición de metales o composiciones a la reacción de fermentación debe entenderse que incluye la adición a uno o ambos de estos reactores.
El término "biorreactor" incluye un dispositivo de fermentación que consiste en uno o más recipientes y/o torres o disposición de tuberías, que incluye el reactor de tanque agitado continuo (CSTR), el reactor celular inmovilizado (ICR), reactor de rejilla (TBR), columna de burbujas, fermentador de gas, mezclador estático u otro recipiente u otro dispositivo adecuado para el contacto gas-líquido. En algunas realizaciones, el biorreactor puede comprender un primer reactor de crecimiento y un segundo reactor de fermentación. Como tal, cuando se menciona la adición de sustrato al biorreactor o reacción de fermentación debe entenderse que incluye adición a cualquiera o ambos de estos reactores donde sea apropiado.
Los "ácidos nucleicos exógenos" son ácidos nucleicos que se originan fuera del microorganismo en el que se introducen. Los ácidos nucleicos exógenos se pueden obtener de cualquier fuente adecuada, que incluye, pero no se limita al microorganismo en el que se van a introducir (por ejemplo, en un microorganismo parental del que deriva el microorganismo recombinante), cepas o especies de microorganismos que difieren del organismo en el que se van a introducir, o se pueden crear de forma artificial o recombinante. En una realización, los ácidos nucleicos exógenos representan secuencias de ácido nucleico presentes de forma natural dentro del microorganismo en el que se van a introducir, y se introducen para aumentar la expresión o sobreexpresar un gen particular (por ejemplo, aumentando el número de copias de la secuencia (por ejemplo un gen) o introduciendo un promotor fuerte o constitutivo para aumentar la expresión. En otra realización, los ácidos nucleicos exógenos representan secuencias de ácido nucleico que no se encuentran naturalmente dentro del microorganismo al que han de ser introducidas y permiten la expresión de un producto que no se encuentra naturalmente dentro del microorganismo o la mayor expresión de un gen natural del microorganismo (por ejemplo, en el caso de la introducción de un elemento regulador tal como un promotor). El ácido nucleico exógeno se puede adaptar para integrarlo en el genoma del microorganismo al que se va a introducir o para permanecer en un estado extracromosómico.
"Exógeno" también se puede usar para referirse a proteínas. Esto se refiere a una proteína que no está presente en el microorganismo parental del cual deriva el microorganismo recombinante.
El término "endógeno" como se usa en la presente memoria en relación con un microorganismo recombinante y un ácido nucleico o proteína, se refiere a cualquier ácido nucleico o proteína que está presente en un microorganismo parental del que deriva el microorganismo recombinante.
Debe apreciarse que la invención se puede poner en práctica usando ácidos nucleicos cuya secuencia varía de las secuencias específicamente ejemplificadas en la presente memoria siempre que realicen sustancialmente la misma función. Para secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína o péptido esto significa que la proteína codificada, o el péptido, tiene sustancialmente la misma función. Para secuencias de ácido nucleico que representan secuencias promotoras, la secuencia variante tendrá la capacidad de promover la expresión de uno o más genes. Tales ácidos nucleicos se pueden denominar en la presente memoria "variantes funcionalmente equivalentes". A modo de ejemplo, las variantes funcionalmente equivalentes de un ácido nucleico incluyen variantes alélicas, fragmentos de un gen, genes que incluyen mutaciones (eliminación, inserción, sustituciones de nucleótidos y similares) y/o polimorfismos y similares. Los genes homólogos de otros microorganismos también se pueden considerar como ejemplos de variantes funcionalmente equivalentes de las secuencias ilustradas específicamente en la presente memoria. Estos incluyen genes homólogos en especies tales como Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, C. saccharobutylicum y C. saccharoperbutylacetonicum, de los cuales se encuentran detalles disponibles al público en sitios de internet tales como Genbank o NCBI. La frase "variantes funcionalmente equivalentes" también debe considerarse que incluye ácidos nucleicos cuya secuencia varía como resultado de la optimización de codones para un organismo particular. Las "variantes funcionalmente equivalentes" de un ácido nucleico de la presente invención tendrán preferiblemente una identidad de secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente 70%, preferiblemente aproximadamente 80%, más preferiblemente aproximadamente 85%, preferiblemente aproximadamente 90%, preferiblemente aproximadamente 95% o más con el ácido nucleico identificado.
También debe apreciarse que la invención se puede poner en práctica usando polipéptidos cuya secuencia varía de las secuencias de aminoácidos específicamente ejemplificadas en la presente memoria. Estas variantes se pueden denominar en la presente memoria "variantes funcionalmente equivalentes". Una variante funcionalmente equivalente de una proteína o un péptido incluye aquellas proteínas o péptidos que comparten al menos el 40%, preferiblemente el 50%, preferiblemente el 60%, preferiblemente el 70%, preferiblemente el 75%, preferiblemente el 80%, preferiblemente el 85%, preferiblemente el 90%, preferiblemente el 95% o mayor de identidad de aminoácidos con la proteína o el péptido identificado y tiene sustancialmente la misma función que el péptido o la proteína de interés. Dichas variantes incluyen dentro de su alcance fragmentos de una proteína o un péptido en donde el fragmento comprende una forma truncada del polipéptido en el que las eliminaciones pueden ser de 1 a 5, a 10, a 15, a 20, a 25 aminoácidos, y pueden extenderse desde el resto 1 al 25 en cualquiera de los extremos del polipéptido, y en donde las eliminaciones pueden ser de cualquier longitud dentro de la región; o puede estar en un lugar interno. También se deben tomar variantes funcionalmente equivalentes de los polipéptidos específicos de la presente invención para incluir polipéptidos expresados por genes homólogos en otras especies de bacterias, por ejemplo como se ejemplifica en el párrafo anterior.
"Sustancialmente la misma función" como se usa en la presente memoria, pretende significar que el ácido nucleico o polipéptido es capaz de realizar la función del ácido nucleico o polipéptido del que es una variante. Por ejemplo, una variante de una enzima de la invención será capaz de catalizar la misma reacción que esa enzima. Sin embargo, no debe entenderse que la variante tiene el mismo nivel de actividad que el polipéptido o ácido nucleico del que es una variante.
Se puede evaluar si una variante funcionalmente equivalente tiene sustancialmente la misma función que el ácido nucleico o polipéptido del que es una variante usando cualquier número de métodos conocidos. Sin embargo, a modo de ejemplo, los métodos descritos por Silver et al. (1991, Plant Physiol. 97: 1588-1591) o Zhao et al. (2011, Appl Microbiol Biotechnol, 90:1915-1922) para la enzima isopreno sintasa, por Green et al. (2007, Phytochemistry, 68:176-188) para la enzima farneseno sintasa, por Kuzuyama et al. (2000, J. Bacteriol. 182, 891-897) para la 1-desoxi-D-xilulosa 5-fosfato sintasa Dxs, por Berndt y Schlegel (1975, Arch. Microbiol. 103, 21-30) o por Stim-Herndon et al. (1995, Gene 154: 81-85) para la tiolasa, por Cabano et al. (1997, Insect Biochem. Mol. Biol. 27: 499­ 505) para la HMG-CoA sintasa, por Ma et al. (2011, Metab. Engin., 13:588-597) para la enzima HMG-CoA reductasa y mevalonato quinasa, por Herdendorf y Miziorko (2007, Biochemistry, 46: 11780-8) para la fosfomevalonato quinasa, y por Krepkiy et al. (2004, Protein Sci. 13: 1875-1881) para la mevalonato difosfato descarboxilasa. También se pueden identificar genes para la ruta de la DXS y el mevalonato usando inhibidores tales como fosmidomicina o mevinolina, como describen Trutko et al. (2005, Microbiology 74: 153-158).
"Sobreexpresar" o "exceso de expresión" y términos y frases similares, cuando se usan en relación con la invención deben considerarse de forma amplia para incluir cualquier aumento de expresión de una o más proteínas (incluyendo la expresión de uno o más ácidos nucleicos que las codifican) comparado con el nivel de expresión de la proteína (incluyendo los ácidos nucleicos) de un microorganismo parental en las mismas condiciones. No debe considerarse que significa que la proteína (o ácido nucleico) se expresa en cualquier nivel particular.
Un "microorganismo parental" es un microorganismo usado para generar un microorganismo recombinante de la invención. El microorganismo parental puede ser uno que se encuentre en la naturaleza (es decir, un microorganismo de tipo natural) o uno que se ha modificado previamente pero que no expresa o sobreexpresa una o más de las enzimas que son el objeto de la presente invención. Por consiguiente, los microorganismos recombinantes de la invención se pueden haber modificado para expresar o sobreexpresar una o más enzimas que no se expresaban o sobreexpresaban en el microorganismo parental.
Los términos "construcciones" o "vectores" de ácido nucleico y términos similares, debe considerarse de forma amplia que incluyen cualquier ácido nucleico (incluyendo ADN o ARN) adecuado para usar como un vehículo para transferir material genético a una célula. Se debe considerar que los términos incluyen plásmidos, virus (incluyendo bacteriófagos), cósmidos y cromosomas artificiales. Las construcciones o vectores pueden incluir uno o más elementos reguladores, un origen de replicación, un sitio de multiclonación y/o un marcador seleccionable. En una descripción, las construcciones o vectores están adaptados para permitir la expresión de uno o más genes codificados por la construcción o el vector. Las construcciones o vectores de ácido nucleico incluyen ácidos nucleicos desnudos así como ácidos nucleicos formulados con uno o más agentes para facilitar el suministro a una célula (por ejemplo, ácido nucleico conjugado con liposoma, un organismo en el que está contenido el ácido nucleico).
Un "terpeno" como se menciona en la presente memoria, debe considerarse de forma amplia para incluir cualquier compuesto formado por unidades de isopreno Cs unidas entre sí, que incluyen terpenos simples y complejos y compuestos terpénicos que contienen oxígeno, tales como alcoholes, aldehídos y cetonas. Los terpenos simples se encuentran en los aceites esenciales y resinas de plantas tales como coníferas. Los terpenos más complejos incluyen los terpenoides y vitamina A, pigmentos carotenoides (tales como licopeno), escualeno y caucho. Los ejemplos de monoterpenos incluyen, pero no se limitan a isopreno, pineno, nerol, citral, alcanfor, mentol, limoneno. Los ejemplos de sesquiterpenos incluyen, pero no se limitan a nerolidol, farnesol. Los ejemplos de diterpenos incluyen pero no se limitan a fitol, vitamina A1. El escualeno es un ejemplo de un triterpeno, y el caroteno (provitamina A1) es un tetraterpeno.
Un "precursor de terpeno" es un compuesto o compuesto intermedio producido durante la reacción para formar un terpeno partiendo de acetil-CoA y opcionalmente piruvato. El término se refiere a un compuesto precursor o compuesto intermedio encontrado en la ruta del mevalonato (MVA) y opcionalmente en la ruta de la DXS, así como precursores más abajo de terpenos de cadena más larga, tales como FPP y GPP. En divulgaciones particulares, incluye, pero no se limita al ácido mevalónico, IPP, pirofosfato de dimetilalilo (DMAPP), pirofosfato de geranilo (GPP) y pirofosfato de farnesilo (FPP).
La ruta de la "DXS" es una ruta enzimática del piruvato y D-gliceraldehído-3-fosfato a DMAPP o IPP. Se conoce también como la ruta de la desoxixilulosa-5-fosfato (DXP/DXPS/DOXP o DXS)/metileritritol-fosfato (MEP).
La "ruta del mevalonato (MVA)" es la ruta enzimática desde el acetil-CoA a IPP.
Microorganismos
Se conocen dos rutas de producción de terpenos, la ruta de la desoxixilulosa-5-fosfato (DXP/DXPS/DOXP o DXS)/metileritritol-fosfato (MEP) (Hunter et al., 2007, J. Biol. Chem. 282: 21573-77) que parte del piruvato y D-gliceraldehído-3-fosfato (G3P), los dos compuestos intermedios clave en la glucolisis, y la ruta del mevalonato (MVA) (Miziorko, 2011, Arch Biochem Biophys, 505: 131-143) que parte de la acetil--CoA. Se ha investigado en muchas clases diferentes de microorganismos la presencia de cualquiera de estas rutas (Lange et al., 2000, PNAS, 97: 13172-77; Trutko et al., 2005, Microbiology, 74: 153-158; Julsing et al., 2007, Appl Microbio! Biotechnol, 75: 1377­ 84), pero no en acetógenos carboxidotróficos. Se encontró por ejemplo, que la ruta de la DXS estaba presente en E. coli, Bacillus, o Mycobacterium, mientras que la ruta del mevalonato está presente en levaduras Saccharomyces, Cloroflexus, o Myxococcus.
Los autores de la invención analizaron en los genomas de los acetógenos carboxidotróficos C. autoethanogenum, C. ljungdahlii la presencia de cualquiera de las dos rutas. Se identificaron todos los genes de la ruta de la DXS en C. autoethanogenum y C. ljungdahlii (tabla 1), mientras que la ruta del mevalonato está ausente. Además, no se sabe que los acetógenos carboxidotróficos tales como C. autoethanogenum o C. ljungdahlii produzcan ningún terpeno como productos finales metabólicos.
Ta l 1: n l i ín i r n l r DX i nifi n . h n n m . l n hlii:
Figure imgf000009_0001
También se identificaron genes para la síntesis corriente abajo a partir de unidades de isopreno, en ambos organismos tabla 2.
Figure imgf000009_0002
continuación
Figure imgf000010_0001
Los terpenos son compuestos con alta densidad energética, y su síntesis requiere que la célula invierta energía en forma de trifosfatos de nucleósidos tales como ATP. El uso de azúcar como un sustrato requiere que la glucolisis suministre suficiente energía para dar varias moléculas de ATP. La producción de terpenos y/o sus precursores por la ruta de la DXS usando azúcar como un sustrato procede de una forma relativamente directa debido a la disponibilidad del piruvato y el D-gliceraldehído-3-fosfato (G3P), procediendo el G3P de azúcares pentosas C5 y hexosas C6. Estas moléculas C5 y C6 se convierten, por lo tanto, de forma relativamente fácil en unidades de isopreno C5 de las cuales están compuestas los terpenos.
Para los acetógenos anaerobios que usan un sustrato C1 como CO o CO2, es más difícil sintetizar moléculas largas tales como hemiterpenoides a partir de unidades C1. Esto es especialmente cierto para terpenos de cadenas más largas como los monoterpenos C10, sesquiterpenos C15 o tetraterpenos C40. Hasta la fecha el producto con más átomos de carbono descrito en acetógenos (tanto organismos naturales como recombinantes) son los compuestos C4 butanol (Kopke et al., 2011, Curr. Opin. Biotechnol. 22: 320-325; Schiel-Bengelsdorf y Dürre, 2012, FEBS Letters: 10.1016/j.febslet.2012.04.043; Kopke et al., 2011, Proc. Nat. Sci. U.S.A. 107: 13087-92; patente de EE.UU.
2011/0236941) y 2,3-butanodiol (Kopke et al., 2011, Appl. Environ. Microbiol. 77:5467-75). Los autores de la invención han mostrado que sorprendentemente se pueden producir de forma anaerobia estas moléculas de terpeno de cadena más larga usando de materia prima C1 el CO a través del intermedio acetil-CoA.
La energía de la ruta de Wood-Ljungdahl de los acetógenos anaerobios, está emergiendo ahora, pero a diferencia de las condiciones de crecimiento aerobias o glucolisis de organismos fermentadores de azúcar, no se gana ATP en la ruta Wood-Ljungdahl por la fosforilación a nivel del sustrato, de hecho, la activación del CO2 a formiato requiere realmente una molécula de ATP y se requiere un gradiente de membrana. Los autores de la invención indican que es importante que una ruta para la formación de producto sea energéticamente eficiente. Los autores de la invención indican que en acetógenos el sustrato CO o CO2 es canalizado directamente en acetil-CoA, lo que representa la ruta más directa a terpenos y/o sus precursores, en especial cuando se compara con los sistemas basados en azúcar, requiriéndose solo seis reacciones (Fig. 1). Aunque hay menos ATP disponible en los acetógenos carboxidotróficos, los autores de la invención creen que esta ruta más directa puede mantener un flujo metabólico mayor (debido a la mayor fuerza motriz química de las reacciones intermedias). Un flujo metabólico altamente eficaz es importante ya que varios productos intermedios en la ruta de biosíntesis de terpenos, tales como los compuestos intermedios clave mevalonato y FPP, son tóxicos para la mayor parte de las bacterias cuando no se renuevan eficazmente. A pesar de tener una mayor disponibilidad de ATP, este problema de la toxicidad de los compuestos intermedios, puede ser un cuello de botella en la producción de terpenos a partir de azúcares.
Cuando se compara la energía de la producción de los precursores de terpenos IPP y DMAPP a partir de CO (Fig. 6) por la ruta del mevalonato frente a la ruta de la DXS, los autores de la invención observaron que la ruta del mevalonato requiere menos trifosfatos de nucleósidos como ATP, menos equivalentes de reducción, y también es más directa cuando se compara con la ruta de la DXS, siendo necesarias solo seis etapas de reacción a partir de la acetil-CoA. Esto proporciona ventajas en la velocidad de las reacciones y flujos metabólicos y aumenta la eficiencia energética global. Además, el menor número de enzimas requeridas simplifica el método de recombinación requerido para producir un microorganismo recombinante.
No se han identificado acetógenos con una ruta del mevalonato, pero los autores de la invención han mostrado que se puede introducir la ruta del mevalonato y opcionalmente la ruta de la DXS en un acetógeno carboxidotrófico tal como Clostridium autoethanogenum o C. jungdahlii para producir eficazmente terpenos y/o sus precursores a partir del sustrato de C1 carbono CO. Contemplan que esto se puede aplicar a todos los microorganismos acetógenos carboxidotróficos.
Además, no se ha mostrado nunca que la producción de terpenos y/o sus precursores fuera posible usando microorganismos recombinantes en condiciones anaerobias. La producción anaerobia de isopreno tiene la ventaja de proporcionar un entorno de trabajo más seguro porque el isopreno es extremadamente inflamable en presencia de oxígeno y tiene un límite de inflamabilidad inferior (lFl ) de 1,5-2,0 % y un límite de inflamabilidad superior (UFL) de 2,0-12 % a temperatura ambiente y presión atmosférica. Puesto que no se pueden producir llamas en ausencia de oxígeno, los autores de la invención creen que un procedimiento de fermentación anaerobia es conveniente, ya que sería más seguro a lo largo de todos los intervalos de concentraciones de producto, composiciones de gases, temperaturas y presiones.
Como se ha descrito en lo que antecede, la divulgación proporciona un microorganismo recombinante capaz de producir uno o más terpenos y/o sus precursores, y opcionalmente uno o más de otros productos, por fermentación de un sustrato que comprende CO.
En una divulgación adicional, el microorganismo está adaptado para:
expresar una o más enzimas exógenas de la ruta del mevalonato (MVA) y/o sobreexpresar una o más enzimas endógenas de la ruta del mevalonato (MVA); y
a) expresar una o más enzimas exógenas de la ruta de la DXS y/o sobreexpresar una o más enzimas endógenas de la ruta de la DXS.
En una descripción, el microorganismo parental del que deriva el microorganismo recombinante es capaz de fermentar un sustrato que comprende CO para producir acetil-CoA, pero no de convertir la acetil-CoA en ácido mevalónico o pirofosfato de isopentenilo (IPP) y el microorganismo recombinante está adaptado para expresar una o más enzimas implicadas en la ruta del mevalonato.
El microorganismo puede adaptarse para expresar o sobreexpresar la una o más enzimas mediante cualquier número de métodos recombinantes, incluyendo, por ejemplo, aumentando la expresión de genes naturales dentro del microorganismo (por ejemplo, introduciendo un promotor más fuerte o constitutivo para dirigir la expresión de un gen), aumentando el número de copias de un gen que codifica una enzima particular mediante la introducción de ácidos nucleicos exógenos que codifican y se adaptan para expresar la enzima, introduciendo un ácido nucleico exógeno que codifica y se adapta para expresar una enzima que no se encuentra naturalmente dentro del microorganismo parental.
En una divulgación, la una o más enzimas son de la ruta del mevalonato (MVA) y se seleccionan del grupo que consiste en:
a) Tiolasa (EC 2.3.1.9),
b) HMG-CoA sintasa (EC 2.3.3.10),
c) HMG-CoA reductasa (EC 1.1.1.88),
d) Mevalonato quinasa (EC 2.7.1.36),
e) Fosfomevalonato quinasa (EC 2.7.4.2),
f) Mevalonato difosfato descarboxilasa (Ec 4.1.1.33), y
g) una variante funcionalmente equivalente de una cualquiera de las mismas.
En una realización, las una o más enzimas son de la ruta de la DXS, se seleccionan del grupo que consiste en: a) 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato sintasa DXS (EC:2.2.1.7),
b) 1-desoxi-D-xilulosa 5-fosfato reductoisomerasa DXR (EC:1.1.1.267),
c) 2-C-metil-D-eritritol 4-fosfato citidililtransferasa IspD (Ec :2.7.7.60),
d) 4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol quinasa IspE (EC:2.7.1.148),
e) 2-C-metil-D-eritritol 2,4-ciclodifosfato sintasa IspF (EC:4.6.1.12),
f) 4-hidroxi-3-metilbut-2-en-1-il difosfato sintasa IspG (EC:1.17.7.1), y
g) 4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasa (Ec :1.17.1.2).
En una divulgación adicional, una o más enzimas adicionales exógenas o endógenas son expresadas o sobreexpresadas para dar como resultado la producción de un compuesto terpénico y/o su precursor, en donde la enzima exógena que se expresa, o la enzima endógena que se sobreexpresa se selecciona del grupo que consiste en:
a) geraniltranstransferasa Fps (EC:2.5.1.10),
b) heptaprenil difosfato sintasa (EC:2.5.1.10),
c) octaprenil-difosfato sintasa (EC:2.5.1.90),
d) isopreno sintasa (EC 4.2.3.27),
e) isopentenil-difosfato delta-isomerasa (EC EC 5.3.3.2),
f) farneseno sintasa (EC 4.2.3.46 / EC 4.2.3.47), y
g) una variante funcionalmente equivalente de una cualquiera de las mismas.
Solo a modo de ejemplo, la información de secuencia de cada una de las enzimas se da en las figuras en la presente memoria.
Las enzimas para usar en los microorganismos de la invención pueden proceder de cualquier fuente adecuada, que incluye diferentes géneros y especies de bacterias, u otros organismos. Las enzimas pueden proceder de Staphylococcus aureus.
En una realización, la enzima isopreno sintasa (ispS) procede de Poplar tremuloides. En una realización adicional, tiene la secuencia de ácido nucleico ilustrada en la SEQ ID NO: 21 en lo sucesivo, o es una de sus variantes funcionalmente equivalente.
En una divulación, la enzima desoxixilulosa 5-fosfato sintasa procede de C. autoethanogenum, ser codificada por la secuencia de ácido nucleico ilustrada en la SEQ ID NO: 1 y/o la secuencia de aminoácidos ilustrada en la s Eq ID NO: 2 en lo sucesivo, o es una de sus variantes funcionalmente equivalente.
En una divulgación, la enzima 1-desoxi-D-xilulosa 5-fosfato reductoisomerasa DXR procede de C. autoethanogenum y está codificada por la secuencia de ácido nucleico ilustrada en la SEQ ID NO: 3, o es una de sus variantes funcionalmente equivalente.
En una divulgación, la enzima 2-C-metil-D-eritritol 4-fosfato citidililtransferasa IspD procede de C. autoethanogenum y está codificada por la secuencia de ácido nucleico ilustrada en la SEQ ID NO: 5, o es una de sus variantes funcionalmente equivalente.
En una divulgación, la enzima 4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol quinasa IspE procede de C. autoethanogenum y está codificada por la secuencia de ácido nucleico ilustrada en la SEQ ID NO: 7, o es una de sus variantes funcionalmente equivalente.
En una divulgación, la enzima 2-C-metil-D-eritritol 2,4-ciclodifosfato sintasa IspF procede de C. autoethanogenum y está codificada por la secuencia de ácido nucleico ilustrada en la SEQ ID NO: 9, o es una de sus variantes funcionalmente equivalente.
En una divulgación, la enzima 4-hidroxi-3-metilbut-2-en-1-il difosfato sintasa IspG procede de C. autoethanogenum y está codificada por la secuencia de ácido nucleico ilustrada en la SEQ ID NO: 11, o es una de sus variantes funcionalmente equivalente.
En una divulgación, la enzima 4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasa procede de C. autoethanogenum y está codificada por la secuencia de ácido nucleico ilustrada en la SEQ ID NO: 13, o es una de sus variantes funcionalmente equivalente.
En una divulgación, la enzima mevalonato quinasa (MK) procede de Staphylococcus aureus subsp. aureus Mu50 y está codificada por la secuencia de ácido nucleico ilustrada en la SEQ ID NO: 51 en lo sucesivo, o es una de sus variantes funcionalmente equivalente.
En una divulgación, la enzima fosfomevalonato quinasa (PMK) procede de Staphylococcus aureus subsp. aureus Mu50 y está codificada por la secuencia de ácido nucleico ilustrada en la SEQ ID NO: 52 en lo sucesivo, o es una de sus variantes funcionalmente equivalente.
En una divulgación, la enzima mevalonato difosfato descarboxilasa (PMD) procede de Staphylococcus aureus subsp. aureus Mu50 y está codificada por la secuencia de ácido nucleico ilustrada en la s Eq ID NO: 53 en lo sucesivo, o es una de sus variantes funcionalmente equivalente.
En una divulgación, la enzima isopentenil-difosfato delta-isomerasa (idi) procede de Clostridium beijerinckii y está codificada por la secuencia de ácido nucleico ilustrada en la SEQ ID NO: 54 en lo sucesivo, o es una de sus variantes funcionalmente equivalente.
En una divulgación, la enzima tiolasa (thIA) procede de Clostridium acetobutylicum ATCC824 y está codificada por la secuencia de ácido nucleico ilustrada en la SEQ ID NO: 40 en lo sucesivo, o es una de sus variantes funcionalmente equivalente.
En una divulgación, la enzima es una enzima tiolasa y es una acetil-CoA c-acetiltransferasa (vraB) derivada de Staphylococcus aureus subsp. aureus Mu50 y está codificada por la secuencia de ácido nucleico ilustrada en la SEQ ID NO: 41 en lo sucesivo, o es una de sus variantes funcionalmente equivalente.
En una divulgación, la enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA sintasa (HMGS) procede de Staphylococcus aureus subsp. aureus Mu50 y está codificada por la secuencia de ácido nucleico ilustrada en la s Eq ID NO: 42 en lo sucesivo, o es una de sus variantes funcionalmente equivalente.
En una divulgación, la enzima hidroximetilglutaril-CoA reductasa (HMGR) procede de Staphylococcus aureus subsp. aureus Mu50 y está codificada por la secuencia de ácido nucleico ilustrada en la SEQ ID NO: 43 en lo sucesivo, o es una de sus variantes funcionalmente equivalente.
En una divulgación, la enzima geraniltranstransferasa (ispA) procede de Escherichia coli cepa K-12 subcepa MG1655 está codificada por la secuencia de ácido nucleico ilustrada en la SEQ ID NO: 56 en lo sucesivo, o es una de sus variantes funcionalmente equivalente.
En una divulgación, la enzima heptaprenil difosfato sintasa procede de C. autoethanogenum y está codificada por la secuencia de ácido nucleico ilustrada en la SEQ ID NO: 17, o es una de sus variantes funcionalmente equivalente. En una divulgación, la enzima poliprenil sintetasa procede de C. autoethanogenum y está codificada por la secuencia de ácido nucleico ilustrada en la SEQ ID NO: 19, o es una de sus variantes funcionalmente equivalente. En una divulgación, la enzima alfa-farneseno sintasa (FS) procede de Malus x domestica y está codificada por la secuencia de ácido nucleico ilustrada en la SEQ ID NO: 57 en lo sucesivo, o es una de sus variantes funcionalmente equivalente.
La enzimas y variantes funcionales de uso en los microorganismos se pueden identificar por ensayos conocidos para un experto en la técnica. En divulgaciones particulares, la enzima isopreno sintasa se puede identificar por el método indicado por Silver et al. (1991, Plant Physiol. 97: 1588-1591) o Zhao et al. (2011, Appl Microbiol Biotechnol, 90:1915-1922). En una divulgación particular adicional, la enzima farneseno sintasa se puede identificar por el método indicado por Green et al., 2007, Phytochemistry; 68:176-188. En una divulgación particular adicional, las enzimas de la ruta del mevalonato se pueden identificar por el método indicado en Cabano et al. (1997, Insect Biochem. Mol. Biol. 27: 499-505) para la HMG-CoA sintasa, por Ma et al. (2011, Metab. Engin., 13:588-597) para la enzima HMG-CoA reductasa y mevalonato quinasa, Herdendorf y Miziorko (2007, Biochemistry, 46: 11780-8) para la fosfomevalonato quinasa, y Krepkiy et al. (2004, Protein Sci. 13: 1875-1881) para la mevalonato difosfato descarboxilasa. Ma et al., 2011, Metab. Engin., 13:588-597. La 1-desoxi-D-xilulosa 5-fosfato sintasa de la ruta de la DXS se puede ensayar usando el método indicado por Kuzuyama et al. (2000, J. Bacteriol. 182, 891-897). También se pueden identificar genes de la ruta de la DXS y el mavalonato usando inhibidores tales como fosmidomicina o mevinolina, como describen Trutko et al. (2005, Microbiology 74: 153-158).
En una realización, el microorganismo comprende uno o más ácidos nucleicos exógenos adaptados para aumentar la expresión de uno o más ácidos nucleicos endógenos y cuyos uno o más ácidos nucleicos endógenos codifican una o más de las enzimas mencionadas antes en la presente memoria. En una descripción, el uno o más ácidos nucleicos exógenos adaptados para aumentar la expresión es un elemento regulador. En una descripción, el elemento regulador es un promotor. En una descripción, el promotor es un promotor constitutivo que es preferiblemente altamente activo bajo condiciones de fermentación apropiadas. También se podrían usan promotores inducibles. En una divulgación preferida, el promotor se selecciona del grupo que comprende un conjunto génico de Wood-Ljungdahl o promotores del operón de la fosfotransacetilasa/acetato quinasa. Los expertos en la técnica apreciarán que otros promotores que pueden dirigir la expresión, preferiblemente un alto nivel de expresión en condiciones de fermentación apropiadas, serían eficaces como alternativas.
En una realización, el microorganismo comprende uno o más ácidos nucleicos exógenos que codifican y están adaptados para expresar una o más de las enzimas mencionadas antes en la presente memoria. En una realización, los microorganismos comprenden uno o más ácidos nucleicos exógenos que codifican y están adaptados para expresar al menos dos, al menos de las enzimas. En otras realizaciones, el microorganismo comprende uno o más ácidos nucleicos exógenos que codifican y están adaptados para expresar al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve o más de las enzimas.
En una realización particular, el microorganismo comprende uno o más ácidos nucleicos exógenos que codifican una enzima de la invención.
El microorganismo puede comprender uno o más ácidos nucleicos exógenos. Cuando se desea transformar el microorganismo parental con dos o más elementos genéticos (tal como genes o elementos reguladores (por ejemplo un promotor)) pueden estar contenidos en uno o más ácidos nucleicos exógenos.
En una realización, el uno o más ácidos nucleicos exógenos es una construcción o vector de ácido nucleico, en una realización particular un plásmido, que codifica una o más enzimas mencionadas en lo que antecede en cualquier combinación.
Los ácidos nucleicos exógenos pueden permanecer extracromosómicos después de la transformación del microorganismo parental o pueden integrarse en el genoma del microorganismo parental. Por consiguiente, pueden incluir secuencias de nucleótidos adicionales adaptadas para ayudar a la integración (por ejemplo, una región que permite la recombinación homóloga e integración dirigida en el genoma del hospedante) o expresión y replicación de una construcción extracromosómica (por ejemplo, origen de replicación y otros elementos o secuencias reguladoras).
En una descripción, los ácidos nucleicos exógenos que codifican una o más enzimas como se menciona en lo que antecede, comprenderán además un promotor adaptado para promover la expresión de la una o más enzimas codificadas por los ácidos nucleicos exógenos. En una descripción, el promotor es un promotor constitutivo que es preferentemente altamente activo bajo condiciones de fermentación apropiadas. También se podrían usan promotores inducibles. En descripciones preferidas, el promotor se selecciona del grupo que comprende un conjunto génico de Wood-Ljungdahl y promotores de la fosfotransacetilasa/acetato quinasa. Los expertos en la técnica apreciarán que otros promotores que pueden dirigir la expresión, preferiblemente un alto nivel de expresión en condiciones de fermentación apropiadas, serían eficaces como alternativas.
En una realización, el ácido nucleico exógeno es un plásmido de expresión.
En una realización particular, el microorganismo parental se selecciona del grupo de bacterias acetógenas carboxidotróficas. En algunas realizaciones el microorganismo se selecciona del grupo que comprende Clostridium autoethanogenum, Clostridium jungdahlii, Clostridium ragsdalei, Clostridium carboxidivorans, Clostridium drakei, Clostridium scatologenes, Clostridium aceticum, Clostridium formicoaceticum, Clostridium magnum, Butyribacterium metilotrophicum, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Blautia producta, Eubacterium limosum, Moorella thermoacetica, Moorella thermautotrophica, Sporomusa ovata, Sporomusa silvacetica, Sporomusa sphaeroides, Oxobacterpfennigii, y Thermoanaerobacter kiuvi.
En una realización particular, el microorganismo parental se selecciona del conjunto de clostridios acetógenos, etanologénicos, que comprenden C. autoethanogenum, C. jungdahlii, y C. ragsdalei y aislados relacionados. Estos incluyen pero no se limitan a cepas de C. autoethanogenum JAI-1T (DSM10061) [Abrini J, Naveau H, Nyns E-J: Clostridium autoethanogenum, sp. nov., una bacteria anaerobia que produce etanol a partir de monóxido de carbono. Arch Microbiol 1994, 4: 345-351], C. autoethanogenum LBS1560 (DSM19630) [Simpson SD, Forster RL, Tran PT, Rowe MJ, Warner IL: "Novel bacteria and methods thereof'. Patente internacional 2009, WO/2009/064200], C. autoethanogenum LBS1561 (DSM23693), C. jungdahlii PETCT (DSM13528 = ATCC 55383) [Tanner RS, Miller LM, Yang D: "Clostridium jungdahlii sp. nov., an Acetogenic Species in Clostridial rRNA Homology Group I". Int J Syst Bacteriol 1993, 43: 232-236], C. jungdahlii ERI-2 (ATCC 55380) [Gaddy JL: "Clostridium stain which produces acetic acid from waste gases". patente de EE.UU. 1997, 5.593.886], C. jungdahlii C-01 (ATCC 55988) [Gaddy JL, Clausen EC, Ko C-W: "Microbial process for the preparation of acetic acid as well as solvent for its extraction from the fermentation broth". patente de EE.UU., 2002, 6.368.819], C. jungdahlii O-52 (ATCC 55989) [Gaddy JL, Clausen EC, Ko C-W: "Microbial process for the preparation of acetic acid as well as solvent for its extraction from the fermentation broth". patente de EE.UU., 2002, 6.368.819], C. ragsdalei P11T(ATCC BAA-622) [Huhnke RL, Lewis RS, Tanner RS: "Isolation and Characterization of novel Clostridial Species". Patente internacional 2008, WO 2008/028055], aislados relacionados tales como "C. coskatii" [Zahn et al - "Novel ethanologenic species Clostridium coskatii" (Solicitud de patente de EE.UU. número US20110229947)] y "Clostridium sp. " (Tyurin et al., 2012, J. Biotech Res. 4: 1-12), o cepas mutadas tales como C. jungdahlii OTA-1 (Tirado-Acevedo O. "Production of Bioethanol from Synthesis Gas Using Clostridium jungdahlii". Tesis doctoral, North Carolina State University, 2010). Estas cepas forman un subconjunto dentro del conjunto I de ARNr de clostridio y su gen de ARNr 16S es más de 99% idéntico con un contenido de GC bajo similar de aproximadamente 30%. Sin embargo, la reasociación de ADN-ADN y los experimentos de huella dactilar de ADN mostraron que estas cepas pertenecen a diferentes especies [Huhnke RL, Lewis RS, Tanner RS: "Isolation and Characterization of novel Clostridial Species". Patente internacional 2008, WO 2008/028055].
Todas las especies de este conjunto tienen una morfología y tamaño similares (las células en crecimiento logarítmico son entre 0,5-0,7 x 3-5 pm), son mesófilas (temperatura de crecimiento óptima 30-37°C) y estrictamente anaerobias [Tanner RS, Miller LM, Yang D: "Clostridium jungdahlii sp. nov., an Acetogenic Species in Clostridial rRNA Homology Group I". Int J Syst Bacteriol 1993, 43: 232-236; Abrini J, Naveau H, Nyns E-J: "Clostridium autoethanogenum, sp. nov., an anaerobic bacterium that produces ethanol from carbon monoxide". Arch Microbiol 1994, 4: 345-351; Huhnke RL, Lewis RS, Tanner RS: "Isolation and Characterization of novel Clostridial Species". Patente internacional 2008, WO 2008/028055]. Además, comparten todos los mismos rasgos filogenéticos principales, tal como un mismo intervalo de pH (pH 4-7,5, con un pH inicial óptimo de 5,5-6), crecimiento autótrofo fuerte en gases que contienen CO con velocidades de crecimiento similares y un perfil metabólico similar con etanol y ácido acético como el producto final de fermentación principal, y pequeñas cantidades de 2,3-butanodiol y ácido láctico formados en determinadas condiciones. [Tanner RS, Miller LM, Yang D: "Clostridium jungdahlii sp. nov., an Acetogenic Species in Clostridial rRNA Homology Group I". Int J Syst Bacteriol 1993, 43: 232-236; Abrini J, Naveau H, Nyns E-J: "Clostridium autoethanogenum, sp. nov., an anaerobic bacterium that produces ethanol from carbon monoxide". Arch Microbiol 1994, 4: 345-351; Huhnke RL, Lewis RS, Tanner RS: "Isolation and Characterization of novel Clostridial Species". Patente internacional 2008, WO 2008/028055]. La producción de indol se observó también con las tres especies. Sin embargo, las especies se diferencian en el uso de sustratos de diferentes azúcares (p. ej. ramnosa, arabinosa), ácidos (p. ej. gluconato, citrato), aminoácidos (p. ej. arginina, histidina), u otros sustratos (p. ej. betaína, butanol). Además, se encontró que algunas de las especies eran auxótrofas para ciertas vitaminas (por ejemplo, tiamina, biotina), mientras que otras no.
En una realización, el microorganismo acetógeno carboxidotrófico parental se selecciona del grupo que consiste en Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium ragsdalei, Clostridium carboxidivorans, Clostridium drakei, Clostridium scatologenes, Butyribacterium limosum, Butyribacterium metilotrophicum, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Blautia producta, Eubacterium limosum, Moorella thermoacetica, Moorella thermautotrophica, Oxobacter pfennigii y Thermoanaerobacter kiuvi.
En una realización particular, el microorganismo parental se selecciona del grupo de Clostridia carboxidotróficos que comprende Clostridium autoethanogenum, Clostridium jungdahlii, Clostridium ragsdalei, Clostridium carboxidivorans, Clostridium drakei, Clostridium scatologenes, Clostridium aceticum, Clostridium formicoaceticum, Clostridium magnum.
En una realización, el microorganismo se selecciona de un grupo de clostridios carboxidotróficos que comprenden las especies C. autoethanogenum, C. jungdahlii, y "C. ragsdalei" y aislados relacionados. Estos incluyen, pero no se limitan a C. autoethanogenum JAI-1T (DSM10061) (Abrini, Naveau, y Nyns, 1994), C. autoethanogenum LBS1560 (DSM19630) (WO/2009/064200), C. autoethanogenum LBS1561 (DSM23693), C. Ijungdahlii PETCT (DSM13528 = ATCC 55383) (Tanner, Miller, y Yang, 1993), C. Ijungdahlii ERI-2 (ATCC 55380) (patente de EE.UU. 5.593.886), C. Ijungdahlii C-01 (ATCC 55988) (patente de EE.UU. 6.368.819), C. ljungdahlii O-52 (ATCC 55989) (patente de EE.UU. 6.368.8l9), o "C. ragsdalei P11T" (ATCC BAA-622) (WO 2008/028055), y aislados relacionados tales como "C. coskatii" (patente de EE.UU. 2011/0229947), "Clostridium sp. MT351" (Michael Tyurin y Kiriukhin, 2012) y sus cepas mutantes tales como C. ljungdahlii OTA-1 (Tirado-Acevedo O. "Production of Bioethanol from Synthesis Gas Using Clostridium ljungdahlii." Tesis doctoral, North Carolina State University, 2010).
Estas cepas forman un subconjunto dentro del conjunto I de ARNr de clostridio (Collins et al., 1994), que tiene una identidad de al menos 99% en el nivel del gen de ARNr 16S, aunque son distintas especies como se determina por reasociación de ADN-ADN y experimentos de huella dactilar de ADN (WO 2008/028055, patente de EE.Uu .
2011/0229947).
Las cepas de este conjunto están definidas por características comunes, que tienen tanto genotipo como fenotipo similar, y todas comparten el mismo modo de conservación de energía y metabolismo fermentador. Estas cepas de este conjunto carecen de citocromos y conservan energía por un complejo Rnf.
Todas las cepas de este conjunto tienen un tamaño de genoma de aproximadamente 4,2 Mpb (Kopke et al., 2010) y una composición de GC de aproximadamente 32% en moles (Abrini et al., 1994; Kopke et al., 2010; Tanner et al., 1993) (documento WO 2008/028055; patente de EE.UU. 2011/0229947), y operones de genes clave esenciales conservados que codifican las enzimas de la ruta Wood-Ljungdahl (monóxido de carbono deshidrogenasa, formiltetrahidrofolato sintetasa, metilen-tetrahidrofolato deshidrogenasa, formil-tetrahidrofolato ciclohidrolasa, metilentetrahidrofolato reductasa, y monóxido de carbono deshidrogenasa/acetil-CoA sintasa), hidrogenasa, formiato deshidrogenasa, complejo Rnf (rnfCDGEAB), piruvato:ferredoxina oxidorreductasa, aldehído:ferredoxina oxidorreductasa (Kopke et al., 2010, 2011). Se ha encontrado que la organización y número de genes de la ruta Wood-Ljungdahl, responsables de la absorción de gas, son los mismos en todas las especies, a pesar de las diferencias en las secuencias nucleicas y de aminoácidos (Kopke et al., 2011).
Las cepas tienen todas morfología y tamaño similares (las células en crecimiento logarítmico son entre 0,5-0,7 x 3-5 |jm), son mesófilos (temperatura de crecimiento óptimo entre 30-37°C) y estrictamente anaerobios (Abrini et al., 1994; Tanner et al., 1993)(documento WO 2008/028055). Además, comparten todos los mismos rasgos filogenéticos principales, tal como un mismo intervalo de pH (pH 4-7,5, con un pH inicial óptimo de 5,5-6), crecimiento autótrofo fuerte en gases que contienen CO con velocidades de crecimiento similares y un perfil metabólico con etanol y ácido acético como el producto final de fermentación principal, con pequeñas cantidades de 2,3-butanodiol y ácido láctico formados en determinadas condiciones (Abrini et al., 1994; Kopke et al., 2011; Tanner et al., 1993). Sin embargo, las especies se diferencian en el uso de sustratos de diferentes azúcares (p. ej. ramnosa, arabinosa), ácidos (p. ej. gluconato, citrato), aminoácidos (p. ej. arginina, histidina), u otros sustratos (p. ej. betaína, butanol). Algunas de las especies se encontró que eran auxótrofas para determinadas vitaminas (p. ej., tiamina, biotina) mientras que otras no lo eran. Se ha mostrado la reducción de ácidos carboxílicos a sus correspondientes alcoholes en una variedad de estos organismos (Perez, Richter, Loftus, y Angenent, 2012).
Por lo tanto, los rasgos descritos no son específicos a un organismo como C. autoethanogenum o C. ljungdahlii, sino más bien rasgos generales para clostridios sintetizadores de etanol, carboxidotróficos. Por lo tanto, la invención se puede prever para trabajar con estas cepas, aunque puede haber diferencias de rendimiento.
Los microorganismos acetógenos carboxidotróficos recombinantes de la invención se pueden preparar a partir de un microorganismo acetógeno carboxidotrófico original y uno o más ácidos nucleicos exógenos usando cualquier número de técnicas conocidas en la materia para la producción de microorganismos recombinantes. A modo de ejemplo solo, la transformación (que incluye transducción o transfección) se puede lograr por electroporación, electrofusión, ultrasonidos, transformación mediada por polietilenglicol, conjugación o competencia química y natural. Se describen técnicas de transformación adecuadas, por ejemplo, en Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T: Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbour Labrotary Press, Cold Spring Harbour, 1989.
Se ha descrito la electroporación por varios acetógenos carboxidotróficos como C. ljungdahlii (Kopke et al., 2010; Leang, Ueki, Nevin, y Lovley, 2012) (PCT/NZ2011/000203; WO2012/053905), C. autoethanogenum (PCT/NZ2011/000203; WO2012/053905), Acetobacterium woodii (Stratz, Sauer, Kuhn, y Dürre, 1994) o Moorella thermoacetica (Kita et al., 2012) y es un método estándar usado en muchos clostridios tales como C. acetobutylicum (Mermelstein, Welker, Bennett, y Papoutsakis, 1992), C. cellulolyticum (Jennert, Tardif, Young, y Young, 2000) o C. thermocellum (MV Tyurin, Desai, y Lynd, 2004).
Se ha descrito la electrofusión para el acetógeno Clostridium sp. MT351 (Tyurin y Kiriukhin, 2012).
La inducción por profago se ha descrito para acetógeno carboxidotrófico así como en el caso de C. scatologenes (Prasanna Tamarapu Parthasarathy, 2010, Development of a Genetic Modification System in Clostridium scatologenes ATCC 25775 for Generation of Mutants, Masters Project Western Kentucky University).
La conjugación se ha descrito como el método de elección para el acetógeno Clostridium difficile (Herbert, O'Keeffe, Purdy, Elmore, y Minton, 2003) y muchos otros clostridios incluyendo C. acetobuylicum (Williams, Young, y Young, 1990).
En una realización, la cepa original usa CO como la única fuente de carbono y energía.
En una realización el microorganismo parental es Clostridium autoethanogenum o Clostridium ljungdahlii. En una realización particular, el microorganismo es Clostridium autoethanogenum DSM23693. En otra realización particular, el microorganismo es Clostridium ljungdahlii DSM13528 (o ATCC55383).
Ácidos nucleicos
También se describen uno o más ácidos nucleicos o construcciones de ácidos nucleicos útil en la generación de un microorganismo recombinante desvelado.
En una realización, el ácido nucleico comprende secuencias que codifican una o más de las enzimas en la ruta de la DXS, que cuando se expresa en un microorganismo permite que el microorganismo produzca uno o más terpenos y/o sus precursores por fermentación de un sustrato que comprende CO. En una realización particular, la invención proporciona un ácido nucleico que codifica dos o más enzimas que cuando se expresan en un microorganismo permiten que el microorganismo produzca uno o más terpenos y/o sus precursores por fermentación del sustrato que comprende CO. En una realización, un ácido nucleico codifica tres, cuatro, cinco o más de dichas enzimas. En una realización, la una o más enzimas codificadas por el ácido nucleico son de la ruta del mevalonato (MVA) y se seleccionan del grupo que consiste en:
a) Tiolasa (EC 2.3.1.9),
b) HMG-CoA sintasa (EC 2.3.3.10),
c) HMG-CoA reductasa (EC 1.1.1.88),
d) Mevalonato quinasa (EC 2.7.1.36),
e) Fosfomevalonato quinasa (EC 2.7.4.2),
f) Mevalonato difosfato descarboxilasa (Ec 4.1.1.33), y
g) una variante funcionalmente equivalente de una cualquiera de las mismas.
En una realización, la una o más enzimas codificadas por el ácido nucleico son de la ruta de la DXS y se seleccionan del grupo que consiste en:
a) 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato sintasa DXS (EC:2.2.1.7),
b) 1-desoxi-D-xilulosa 5-fosfato reductoisomerasa DXR (EC:1.1.1.267),
c) 2-C-metil-D-eritritol 4-fosfato citidililtransferasa IspD (Ec :2.7.7.60),
d) 4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol quinasa IspE (EC:2.7.1.148),
e) 2-C-metil-D-eritritol 2,4-ciclodifosfato sintasa IspF (EC:4.6.1.12),
f) 4-hidroxi-3-metilbut-2-en-1-il difosfato sintasa IspG (EC:1.17.7.1), y
g) 4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasa (Ec :1.17.1.2).
En una divulgación adicional, el ácido nucleico codifica una o más enzimas adicionales que son expresadas o sobreexpresadas para dar como resultado la producción de un compuesto terpénico y/o su precursor, en donde la enzima exógena que se expresa, o la enzima endógena que se sobreexpresa se selecciona del grupo que consiste en:
a) geraniltranstransferasa Fps (EC:2.5.1.10),
b) heptaprenil difosfato sintasa (EC:2.5.1.10),
c) octaprenil-difosfato sintasa (EC:2.5.1.90),
d) isopreno sintasa (EC 4.2.3.27),
e) isopentenil-difosfato delta-isomerasa (EC EC 5.3.3.2),
f) farneseno sintasa (EC 4.2.3.46 / EC 4.2.3.47), y
g) una variante funcionalmente equivalente de una cualquiera de las mismas.
Las secuencias de aminoácidos de ejemplo y secuencias de ácidos nucleicos que codifican cada una de las enzimas anteriores se proporcionan en la presente memoria o se pueden obtener de GenBank como se menciona en lo que antecede. Sin embargo, los expertos en la técnica apreciarán fácilmente secuencias de ácidos nucleicos alternativas que codifican enzimas o sus variantes funcionalmente equivalentes, teniendo en cuenta la información contenida en la presente memoria, en GenBank y otras bases de datos, y el código genético.
En una descripción adicional, el ácido nucleico que codifica la tiolasa (thIA) derivada de Clostridium acetobutylicum ATCC824 es codificada por la secuencia de ácido nucleico ilustrada en la SEQ ID NO: 40 en lo sucesivo, o es una de sus variantes funcionalmente equivalente.
En una descripción adicional, el ácido nucleico que codifica la tiolasa en donde la tiolasa es la acetil-CoA cacetiltransferasa (vraB) derivada de Staphylococcus aureus subsp. aureus Mu50 es codificada por la secuencia de ácido nucleico ilustrada en la SEQ ID NO: 41 en lo sucesivo, o es una de sus variantes funcionalmente equivalente. En una descripción adicional, el ácido nucleico que codifica la 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA sintasa (HMGS) derivada de Staphylococcus aureus subsp. aureus Mu50 es codificada por la secuencia de ácido nucleico ilustrada en la SEQ ID NO: 42 en lo sucesivo, o es una de sus variantes funcionalmente equivalente.
En una descripción adicional, el ácido nucleico que codifica la hidroximetilglutaril-CoA reductasa (HMGR) derivada de Staphylococcus aureus subsp. aureus Mu50 es codificada por la secuencia de ácido nucleico ilustrada en la SEQ ID NO: 43 en lo sucesivo, o es una de sus variantes funcionalmente equivalente.
En una descripción adicional, el ácido nucleico que codifica la mevalonato quinasa (MK) derivada de Staphylococcus aureus subsp. aureus Mu50 es codificada por la secuencia de ácido nucleico ilustrada en la SEQ ID NO: 51 en lo sucesivo, o es una de sus variantes funcionalmente equivalente.
En una descripción adicional, el ácido nucleico que codifica la fosfomevalonato quinasa (PMK) derivada de Staphylococcus aureus subsp. aureus Mu50 es codificada por la secuencia de ácido nucleico ilustrada en la SEQ ID NO: 52 en lo sucesivo, o es una de sus variantes funcionalmente equivalente.
En una descripción adicional, el ácido nucleico que codifica la mevalonato difosfato descarboxilasa (PMD) derivada de Staphylococcus aureus subsp. aureus Mu50 es codificada por la secuencia de ácido nucleico ilustrada en la SEQ ID NO: 53 en lo sucesivo, o es una de sus variantes funcionalmente equivalente.
En una descripción adicional, el ácido nucleico que codifica la desoxixilulosa 5-fosfato sintasa derivada de C. autoethanogenum, es codificada por la secuencia de ácido nucleico ilustrada en la SEQ ID NO: 1 y/o la secuencia de aminoácidos ilustrada en la SEQ ID NO: 2 en lo sucesivo, o es una de sus variantes funcionalmente equivalente. En una descripción, el ácido nucleico que codifica la 1-desoxi-D-xilulosa 5-fosfato reductoisomerasa DXR (EC:1.1.1.267) tiene la secuencia SEQ ID NO: 3, o es una de sus variantes funcionalmente equivalente.
En una descripción, el ácido nucleico que codifica la 2-C-metil-D-eritritol 4-fosfato citidililtransferasa IspD (EC:2.7.7.60) tiene la secuencia SEQ ID NO: 5, o es una de sus variantes funcionalmente equivalente.
En una descripción, el ácido nucleico que codifica la 4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol quinasa IspE (EC:2.7.1.148) tiene la secuencia SEQ ID NO: 7, o es una de sus variantes funcionalmente equivalente.
En una descripción, el ácido nucleico que codifica la 2-C-metil-D-eritritol 2,4-ciclodifosfato sintasa IspF (EC:4.6.1.12) tiene la secuencia SEQ ID NO: 9, o es una de sus variantes funcionalmente equivalente.
En una descripción, el ácido nucleico que codifica la 4-hidroxi-3-metilbut-2-en-1-il difosfato sintasa IspG (EC:1.17.7.1) tiene la secuencia SEQ ID NO: 11, o es una de sus variantes funcionalmente equivalente.
En una descripción, el ácido nucleico que codifica la 4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasa (EC:1.17.1.2) tiene la secuencia SEQ ID NO: 13, o es una de sus variantes funcionalmente equivalente.
En una descripción adicional, el ácido nucleico que codifica la geraniltranstransferasa (ispA) derivada de Escherichia coli cepa K-12 subcepa MG1655 es codificada por la secuencia de ácido nucleico ilustrada en la SEQ ID NO: 56 en lo sucesivo, o es una de sus variantes funcionalmente equivalente.
En una descripción, el ácido nucleico que codifica la heptaprenil difosfato sintasa tiene la secuencia SEQ ID NO: 17, o es una de sus variantes funcionalmente equivalente.
En una descripción, el ácido nucleico que codifica la octaprenil-difosfato sintasa (EC:2.5.1.90) en donde la octaprenil-difosfato sintasa es poliprenil sintetasa es codificada por la secuencia SEQ ID NO: 19, o es una de sus variantes funcionalmente equivalente.
En una descripción, el ácido nucleico que codifica la isopreno sintasa (ispS) derivada de Poplar tremuloides se ilustra en la SEQ ID NO: 21 en lo sucesivo, o es una de sus variantes funcionalmente equivalente.
En una descripción adicional, el ácido nucleico que codifica la isopentenil-difosfato delta-isomerasa (idi) derivada de Clostridium beijerinckii es codificada por la secuencia de ácido nucleico ilustrada en la SEQ ID NO: 54 en lo sucesivo, o es una de sus variantes funcionalmente equivalente.
En una descripción adicional, el ácido nucleico que codifica la alfa-farneseno sintasa (FS) derivada de Malus x domestica es codificada por la secuencia de ácido nucleico ilustrada en la SEQ ID NO: 57 en lo sucesivo, o es una de sus variantes funcionalmente equivalente.
En una descripción, los ácidos nucleicos comprenderán además un promotor. En una descripción, el promotor permite la expresión constitutiva de los genes bajo su control. Sin embargo, también se pueden usar promotores inducibles. Los expertos en la técnica apreciarán fácilmente promotores. Preferiblemente, el promotor puede dirigir un nivel alto de expresión en condiciones de fermentación adecuadas. En una descripción particular, se usa un promotor de grupo de Wood-Ljungdahl. En otra realización, se usa un promotor de fosfotransacetilasa/acetato quinasa. En otra divulgación, un promotor de piruvato:ferredoxina oxidorreductasa, un promotor de operón de complejo Rnf o un promotor de operón de ATP sintasa. En una descripción particular, el promotor es de C. autoethanogenum.
Los ácidos nucleicos pueden permanecer extracromosómicos tras la transformación de un microorganismo parental o se pueden adaptar para la integración en el genoma del microorganismo. Por consiguiente, los ácidos nucleicos pueden incluir secuencias de nucleótidos adicionales adaptadas para ayudar a la integración (por ejemplo, una región que permite la recombinación homóloga e integración dirigida en el genoma del hospedante) o expresión estable y replicación de una construcción extracromosómica (por ejemplo, origen de replicación, promotor y otras secuencias reguladoras).
En una descripción, el ácido nucleico es una construcción o vector de ácido nucleico. En una descripción particular, la construcción o vector de ácido nucleico es una construcción o vector de expresión, sin embargo, están abarcadas por la invención otras construcciones y vectores, tales como los usados para la clonación. En una descripción particular, la construcción o vector de expresión es un plásmido.
Se apreciará que una construcción/vector de expresión puede contener cualquier número de elementos reguladores además del promotor así como genes adicionales adecuados para la expresión de otras proteínas si se desea. En una descripción, la construcción/vector de expresión incluye un promotor. En otra descripción, la construcción/vector de expresión incluye dos o más promotores. En una descripción particular, la construcción/vector de expresión incluye un promotor para cada gen a expresar. En una descripción, la construcción/vector de expresión incluye uno o más sitios de unión ribosómicos, preferiblemente un sitio de unión ribosómico para cada gen a expresar.
Los expertos en la técnica apreciarán que las secuencias de ácidos nucleicos y las secuencias de construcciones/vectores descritas en la presente memoria pueden contener nucleótidos conectores convencionales tales como los requeridos para los sitios de unión a ribosomas y/o los sitios de restricción. Tales secuencias enlazadoras no deben ser interpretadas como requeridas y no proporcionan una limitación en las secuencias definidas.
Los ácidos nucleicos y las construcciones de ácido nucleico, incluyendo las construcciones/vectores de expresión, se pueden construir usando cualquier número de técnicas estándar en la técnica. Por ejemplo, se pueden usar técnicas de síntesis química o recombinante. Dichas técnicas se describen, por ejemplo, en Sambrook et al, (Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989). Se describen técnicas de ejemplo adicionales en la sección de ejemplos en lo sucesivo. Esencialmente, los genes individuales y los elementos reguladores estarán operativamente unidos entre sí de tal manera que los genes se puedan expresar para formar las proteínas deseadas. Los expertos en la técnica apreciarán los vectores adecuados para su uso en la invención. Sin embargo, a modo de ejemplo, los siguientes vectores pueden ser adecuados: vectores pMTL80000, pIMP1, pJIR750 y los plásmidos ilustrados en la sección de Ejemplos en la presente memoria después.
Se apreciará que los ácidos nucleicos pueden tener cualquier forma adecuada, incluyendo ARN, ADN o ADNc. Son organismos hospedantes desvelados, particularmente microorganismos, e incluyendo virus, bacterias y levaduras, que comprenden uno o más de los ácidos nucleicos descritos en la presente memoria.
Métodos de producción de organismos
El uno o más ácidos nucleicos exógenos se pueden suministrar a un microorganismo original como ácidos nucleicos desnudos o se pueden formular con uno o más agentes para facilitar el proceso de transformación (por ejemplo, ácido nucleico conjugado con liposoma, un organismo en el que está contenido el ácido nucleico). El uno o más ácidos nucleicos pueden ser ADN, ARN o combinaciones de los mismos, si es adecuado. En algunas divulgaciones se pueden usar inhibidores de restricción; véase, por ejemplo, Murray, N.E. et al. (2000) Microbial. Molec. Biol. Rev.
64, 412.)
Los microorganismos desvelados se pueden preparar a partir de un microorganismo parental y uno o más ácidos nucleicos exógenos usando cualquier número de técnicas conocidas en la materia para la producción de microorganismos recombinantes. A modo de ejemplo solo, la transformación (que incluye transducción o transfección) se puede lograr por electroporación, ultrasonidos, transformación mediada por polietilenglicol, competencia química y natural, o conjugación. Se describen técnicas de transformación adecuadas, por ejemplo, en Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T: Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbour Labrotary Press, Cold Spring Harbour, 1989.
En ciertas divulgaciones, debido a los sistemas de restricción que son activos en el microorganismo a transformar, es necesario metilar el ácido nucleico que se va a introducir en el microorganismo. Esto se puede hacer usando una variedad de técnicas, incluyendo las descritas a continuación e ilustradas además en la sección de ejemplos en lo sucesivo.
A modo de ejemplo, en una divulgación, se produce un microorganismo recombinante por un método que comprende las siguientes etapas:
b) introducción de un microorganismo lanzadera de (i) una construcción/vector de expresión como se describe en la presente memoria, y (ii) una construcción/vector de metilación que comprende un gen de metiltransferasa; c) expresión del gen de metiltransferasa;
d) aislamiento de una o más construcciones/vectores a partir del microorganismo lanzadera; e,
e) introducción de una o más construcciones/vectores en un microorganismo destino.
En una divulgación, el gen de metiltransferasa de la etapa B se expresa de forma constitutiva. En otra divulgación, la expresión del gen de metiltransferasa de la etapa B es inducida.
El microorganismo lanzadera es un microorganismo, preferiblemente un microorganismo de restricción negativa, que facilita la metilación de las secuencias de ácido nucleico que componen la construcción/vector de expresión. En una descripción particular, el microorganismo lanzadera es E. coli, Bacillus subtillis o Lactococcus lactis de restricción negativa.
La construcción/vector de metilación comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una metiltransferasa. Una vez que la construcción/vector de expresión y la construcción/vector de metilación se introducen en el microorganismo lanzadera, es inducido el gen de metiltransferasa presente en la construcción/vector de metilación. La inducción puede ser cualquier sistema promotor adecuado aunque en una descripción particular, la construcción/vector de metilación comprende un promotor lac inducible y es inducido por la adición de lactosa o un análogo de la misma, más preferiblemente de isopropil-p-D-tio-galactósido (IPTG). Otros promotores adecuados incluyen los sistemas ara, tet o T7. En una descripción adicional, el promotor de la construcción/vector de metilación es un promotor constitutivo.
En una descripción particular, la construcción/vector de metilación tiene un origen de replicación específico para la identidad del microorganismo lanzadera, de modo que cualquiera de los genes presentes en la construcción/vector de metilación son expresados en el microorganismo lanzadera. Preferiblemente, la construcción/vector de expresión tiene un origen de replicación específico para la identidad del microorganismo de destino de modo que cualquier gen presente en la construcción/vector de expresión se expresa en el microorganismo de destino.
La expresión de la enzima metiltransferasa da como resultado la metilación de los genes presentes en la construcción/vector de expresión. La construcción/vector de expresión después se puede aislar del microorganismo lanzadera de acuerdo con uno cualquiera de una serie de métodos conocidos. A modo de ejemplo solo, se puede usar la metodología descrita en la sección de ejemplos en lo sucesivo para aislar la construcción/vector de expresión.
En una descripción particular, se aíslan simultáneamente ambas construcciones/vectores.
La construcción/vector de expresión puede introducirse en el microorganismo de destino usando cualquier número de métodos conocidos. Sin embargo, a modo de ejemplo, se puede usar la metodología descrita en la sección de ejemplos en lo sucesivo. Dado que la construcción/vector de expresión está metilado, las secuencias de ácido nucleico presentes en la construcción/vector de expresión pueden ser incorporadas al microorganismo de destino y expresadas con éxito.
Está previsto que se pueda introducir un gen de metiltransferasa en un microorganismo lanzadera y ser sobreexpresado. Por lo tanto, en una descripción, la enzima metiltransferasa resultante se puede recoger usando métodos conocidos y usar in vitro para metilar un plásmido de expresión. La construcción/vector de expresión puede entonces introducirse en el microorganismo de destino para la expresión. En otra descripción, se introduce el gen de metiltransferasa en el genoma del microorganismo lanzadera seguido de introducción de la construcción/vector de expresión en el microorganismo lanzadera, se aíslan una o más construcciones/vectores a partir del microorganismo lanzadera y después se introduce la construcción/vector de expresión en el microorganismo de destino.
Se prevé que la construcción/vector de expresión y la construcción/vector de metilación como se ha definido anteriormente se pueden combinar para proporcionar una composición objeto de la memoria. Dicha composición tiene utilidad particular para evitar mecanismos barrera de restricción para producir microorganismos recombinantes. En una descripción particular, la construcción/vector de expresión y/o la construcción/vector de metilación son plásmidos.
Los expertos en la técnica apreciarán una serie de metiltransferasas adecuadas para usar en la producción de microorganismos. Sin embargo, a modo de ejemplo se puede usar la metiltransferasa del fago OT1 de Bacillus subtilis y la metiltransferasa descrita en los ejemplos en lo sucesivo. En una descripción, la metiltransferasa tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6o, o es una de sus variantes funcionalmente equivalente. Los ácidos nucleicos que codifican metiltransferasas adecuadas serán fácilmente evidentes teniendo en cuenta la secuencia de la metiltransferasa deseada y el código genético. En una descripción, el ácido nucleico que codifica una metiltransferasa es como describe en los ejemplos en lo sucesivo (por ejemplo, el ácido nucleico de SEQ ID NO: 63, o es una de sus variantes funcionalmente equivalente).
Se puede usar cualquier número de construcciones/vectores adaptados para permitir la expresión de un gen de metiltransferasa, para generar una construcción/vector de metilación. Sin embargo, a modo de ejemplo, se puede usar el plásmido descrito en la sección de ejemplos en lo sucesivo.
Métodos de producción
La divulgación proporciona un método para la producción de uno o más terpenos y/o sus precursores, y opcionalmente uno o más de otros productos, por fermentación microbiana que comprende fermentar un sustrato que comprende CO usando un microorganismo recombinante de la invención. Preferiblemente, el uno o más terpenos y/o sus precursores son el producto de fermentación principal. Los métodos de la invención se pueden usar para reducir las emisiones atmosféricas totales de carbono de un procedimiento industrial.
Preferiblemente, la fermentación comprende las etapas de fermentar de forma anaerobia un sustrato en un biorreactor para producir al menos uno o más terpenos y/o uno de sus precursores usando un microorganismo recombinante de la divulgación.
En una divulgación, el uno o más terpenos y/o sus precursores, se seleccionan de ácido mevalónico, IPP, pirofosfato de dimetilalilo (DMAPP), isopreno, pirofosfato de geranilo (GPP), pirofosfato de farnesilo (FPP) y farneseno.
En lugar de producir isopreno directamente a partir de los intermedios clave de terpenoides IPP o DMAPP y después usarlos para la síntesis de terpenos de cadenas más largas, también se pueden sintetizar terpenos de cadena más larga tales como monoterpenoides C10 o sesquiterpenoides C15, directamente a través de la geraniltransferasa (véase la tabla 6). A partir de la unidad estructural sesquiterpenoide C15 farnesil-PP se puede producir farneseno, que de forma similar al etanol, se puede usar como combustible para el transporte.
En una divulgación el método comprende las etapas de:
(a) proporcionar un sustrato que comprende CO a un biorreactor que contiene un cultivo de uno o más microorganismos de la divulgación; y
(b) fermentar de forma anaerobia el cultivo en el biorreactor para producir al menos uno o más terpenos y/o sus precursores.
En una divulgación el método comprende las etapas de:
a) capturar el gas que contiene CO producido como resultado del procedimiento industrial;
b) fermentación anaerobia del gas que contiene CO para producir el al menos uno o más terpenos y/o sus precursores mediante un cultivo que contiene uno o más microorganismos de la divulgación.
En una realización de la invención, el sustrato gaseoso fermentado por el microorganismo es un sustrato gaseoso que contiene CO. El sustrato gaseoso puede ser un gas residual que contiene CO obtenido como un subproducto de un procedimiento industrial, o de alguna otra fuente tal como de humos de escape de automóvil. En algunas realizaciones, el procedimiento industrial se selecciona del grupo que consiste en la fabricación de productos de metales ferrosos, tales como una acería, fabricación de productos no ferrosos, procesos de refinación de petróleo, gasificación de carbón, producción de energía eléctrica, producción de negro de carbón, producción de amoníaco, producción de metanol y fabricación de coque. En estas realizaciones, el gas que contiene CO puede capturarse del procedimiento industrial antes de emitirse a la atmósfera, usando cualquier método conveniente. El CO puede ser un componente de gas de síntesis (gas que comprende monóxido de carbono e hidrógeno). El CO producido de procedimientos industriales normalmente se quema para producir CO2 y por lo tanto, la invención tiene utilidad particular en la reducción de las emisiones gaseosas de CO2 de efecto invernadero y producción de un terpeno para usar como un biocombustible. Dependiendo de la composición del sustrato que contiene CO gaseoso, puede ser conveniente tratarlo para eliminar cualquier impureza indeseada, tal como partículas de polvo antes de introducirlo a la fermentación. Por ejemplo, el sustrato gaseoso se puede filtrar o depurar por métodos conocidos.
Se apreciará que para el cultivo de las bacterias y CO hasta que se produzcan al menos uno o más terpenos y/o sus precursores, además de gas sustrato que contiene CO, será necesario alimentar medio nutriente líquido adecuado para el biorreactor. El sustrato y medio se pueden alimentar al biorreactor en una forma continua, discontinua o discontinua alimentada. Un medio nutriente contendrá vitaminas y minerales suficientes para permitir el crecimiento del microorganismo usado. Los medios anaerobios adecuados para la fermentación para producir un terpeno y/o uno de sus precursores usando CO son conocidos en la técnica. Por ejemplo, se describen medios adecuados en Biebel (2001). En una descripción de la invención, el medio es como se describe en la sección de ejemplos en lo sucesivo.
La fermentación debería llevarse a cabo convenientemente en condiciones adecuadas para que se produzca la fermentación de CO a al menos uno o más terpenos y/o sus precursores. Las condiciones de reacción que deberían considerase incluyen presión, temperatura, caudal de gas, caudal de líquido, pH del medio, potencial rédox del medio, velocidad de agitación (si se usa un reactor de tanque agitado continuo), nivel de inoculo, concentraciones de sustrato gaseoso máximo para asegurar que el CO en la fase líquida no se convierte en limitante, y concentraciones de producto máximas para evitar la inhibición de producto.
Además, a menudo es conveniente aumentar la concentración de CO de una corriente de sustrato (o presión parcial de CO en un sustrato gaseoso) y por lo tanto aumentar la eficacia de las reacciones de fermentación cuando el CO es un sustrato. El trabajo a mayores presiones permite un aumento significativo de la velocidad de transferencia de CO de la fase gaseosa a la fase líquida, donde puede ser absorbido por el microorganismo como una fuente de carbono para la producción de al menos uno o más terpenos y/o sus precursores. Esto a su vez significa que el tiempo de retención (definido como el volumen líquido en el biorreactor dividido entre el caudal de gas de entrada) se puede reducir cuando los biorreactores se mantienen a presión elevada en lugar de a presión atmosférica. Las condiciones de reacción óptimas dependerán en parte del microorganismo particular usado. Sin embargo, en general, se prefiere que la fermentación se lleve a cabo a presión mayor que la presión ambiente. Además, puesto que una velocidad dada de conversión de CO a al menos uno o más terpenos y/o sus precursores es en parte una función del tiempo de retención del sustrato, y alcanzar un tiempo de retención deseado a su vez dicta el volumen necesario de un biorreactor, el uso de sistemas presurizados puede reducir en gran medida el volumen del biorreactor necesario, y por consiguiente el coste de capital del equipo de fermentación. Según los ejemplos dados en la patente de EE.UU. n° 5.593.886, el volumen del reactor se puede reducir en proporción lineal a los aumentos de la presión de trabajo del reactor, es decir, los biorreactores que trabajan a 10 atmósferas de presión necesitan solo una décima parte del volumen de los que trabajan a 1 atmósfera de presión.
A modo de ejemplo, los beneficios de llevar a cabo una fermentación de gas a etanol a presiones elevadas se han descrito. Por ejemplo, el documento WO 02/08438 describe fermentaciones de gas a etanol realizadas a presiones de 2,11 kg/cm2 (30 psig) y 5,27 kg/cm2 (75 psig), dando productividades de etanol de 150 g/L/día a 369 g/L/día respectivamente. Sin embargo, se encontró que fermentaciones de ejemplo realizadas usando medios y composiciones de gas de entrada similares a presión atmosférica, producen entre 10 y 20 veces menos etanol por litro por día.
Es conveniente también que la velocidad de introducción del sustrato gaseoso que contiene CO sea tal que asegure que la concentración de Co en la fase líquida no se convierte en limitante. Esto se debe a que una consecuencia de condiciones limitadas por el CO puede ser que el uno o más productos sean consumidos por el cultivo.
La composición de las corrientes de gas usadas para alimentar una reacción de fermentación puede tener un impacto importante en la eficacia y/o en los costes de esta reacción. Por ejemplo, el O2 puede reducir la eficacia de un proceso de fermentación anaerobio. El procesamiento de gases no deseados o innecesarios en etapas de un proceso de fermentación antes o después de la fermentación, puede aumentar la carga en dichas etapas (p. ej., donde la corriente de gas es comprimida antes de entrar en un biorreactor, se puede usar energía innecesaria para comprimir gases que no son necesarios en la fermentación). Por consiguiente, puede ser conveniente tratar las corrientes de sustrato, en particular corrientes de sustrato obtenidas de fuentes industriales, para separar componentes no deseados y aumentar la concentración de los componentes convenientes.
Un cultivo de una bacteria de la invención puede mantenerse en un medio de cultivo acuoso. Preferiblemente, el medio de cultivo acuosos es un medio de crecimiento microbiano anaerobio mínimo. Los medios adecuados son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. n° 5.173.429 y 5.593.886 y el documento WO 02/08438, y como se describe en la sección de ejemplos más adelante en este documento.
Los terpenos y/o sus precursores, o una corriente mixta que contiene uno o más terpenos, sus precursores y/o uno o más de otros productos, se pueden recuperar del caldo de fermentación por métodos conocidos en la técnica, tales como destilación o evaporación fraccionada, pervaporación, separación por corriente gaseosa y fermentación extractiva, que incluye por ejemplo, extracción líquido-líquido.
En algunas divulgaciones, el uno o más terpenos y/o sus precursores y uno o más productos se recuperan del caldo de fermentación separando continuamente una parte del caldo del biorreactor, separando las células microbianas del caldo (convenientemente por filtración), y recuperando uno o más productos del caldo. Los alcoholes se pueden recuperar convenientemente, por ejemplo, por destilación. La acetona se puede recuperar, por ejemplo, por destilación. Cualquier ácido producido se puede recuperar, por ejemplo, por adsorción sobre carbón activado. Las células microbianas separadas preferiblemente se devuelven al biorreactor de fermentación. El permeado exento de células que queda después de haber separado todos los alcoholes y ácidos, preferiblemente también se devuelve al biorreactor de fermentación. Se pueden añadir nutrientes adicionales (tales como vitamina B) al permeado exento de células para recargar el medio nutriente antes de devolverlo al biorreactor.
Además, si el pH del caldo se ajustó como se ha descrito antes para potenciar la absorción de ácido acético en el carbón activado, el pH debería reajustarse a un pH similar al del caldo en el biorreactor de fermentación, antes de devolverlo al biorreactor.
Ejemplos
La invención ahora se describirá con más detalle con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplo 1 - Expresión de la isopreno sintasa en C. autoethanogenum para la producción de isopreno a partir de CO
Los autores de la invención han identificado los genes de la biosíntesis de terpenos en acetógenos carboxidotróficos tales como C. autoethanogenum y C. jungdahlii. Se modificó genéticamente un organismo recombinante para producir isopreno. El isopreno es emitido de forma natural por algunas plantas tales como el álamo para proteger las hojas de la radiación UV. Se llevó a cabo la optimización de codones del gen de la isopreno sintasa (EC 4.2.3.27) del álamo y se introdujo en un acetógeno carboxidotrófico C. autoethanogenum para producir isopreno a partir de CO. La enzima lleva el intermedio clave DMAPP (difosfato de dimetilalilo) de la biosíntesis de terpenoides a isopreno en una reacción irreversible (Fig. 1).
Cepas y condiciones de crecimiento:
Todas las etapas de subclonación se llevaron a cabo en E. coli usando cepas convencionales y condiciones de crecimiento como se ha descrito antes (Sambrook et al, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbour Labrotary Press, Cold Spring Harbour, 1989; Ausubel et al, Current protocols in molecular biology, John Wiley & Sons, Ltd., Hoboken, 1987).
C. autoethanogenum DSM10061 y DSM23693 (un derivado de DSM10061) se obtuvieron de DSMZ (La colección alemana de microorganismos y cultivos celulares, InhoffenstralJe 7 B, 38124 Braunschweig, Alemania). El cultivo se llevó a cabo a 37°C usando condiciones y técnicas estrictamente anaerobias (Hungate, 1969, Methods in Microbiology, vol. 3B. Academic Press, Nueva York: 117-132; Wolfe, 1971, Adv. Microb. Physiol., 6: 107-146). Se usó el medio PETC químicamente definido sin extracto de levadura (Tabla 1) y 2,11 kg/cm2 (3o psi) de gas residual de acería que contenía monóxido de carbono (recogido de la acería de nueva Zelanda en Glenbrook, NZ; composición: 44% de CO, 32% de N2, 22% de CO2, 2% de H2) como la única fuente de carbono y energía.
Tabla 1
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continuación
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Construcción del plásmido de expresión:
En esta invención se usaron técnicas de ADN recombinante y clonación molecular convencionales (Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T: Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, 1989; Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K: Current protocols in molecular biology. John Wiley & Sons, Ltd., Hoboken, 1987). Se realizó la optimización de codones de la isopreno sintasa de Poplar tremuloides (AAQ16588.1; GI:33358229) (SEQ ID NO: 21) y se sintetizó. Se usó una región de promotor de la piruvato:ferredoxina oxidorreductasa de C. autoethanogenum (s Eq ID NO: 22) para expresar el gen. El ADN genómico de Clostridium autoethanogenum DSM23693 se aisló usando un método modificado por Bertram y Dürre (1989). Se recogió un cultivo de 100 ml de toda la noche (6000 xg, 15 min, 4°C), se lavó con tampón de fosfato de potasio (10 mM, pH 7,5) y se suspendió en 1,9 ml de tampón STE (Tris-HCl 50 mM, EDTA 1 mM , Sacarosa 200 mM; pH 8,0). se añadieron 300 pl de lisozima (-100.000 U) y la mezcla se incubó a 37°C durante 30 min, seguido de la adición de 280 pl de una solución de SDS al 10% (p/v) y otra incubación durante 10 min. El ARN se digirió a temperatura ambiente mediante la adición de 240 j l de una solución de EDTA (0,5 M, pH 8), 20 |j I de Tris-HCl (1 M, pH 7,5) y 10 j I de RNasa A (Fermentas Life Sciences). A continuación, se añadieron 100 j I de proteinasa K (0,5 U) y se produjo la proteolisis durante 1-3 horas a 37°C. Finalmente, se añadieron 600 j I de perclorato de sodio (5 M), seguido de una extracción con fenol-cloroformo y una precipitación con isopropanol. La cantidad y calidad de ADN se inspeccionaron espectrofotométricamente. La secuencia promotora de la piruvato:ferredoxina oxidorreductasa se amplificó por PCR usando los oligonucleótidos Ppfor-Notl-F (SEQ ID NO: 23: AAGCGGCCGCAAAATAGTTGATAATAATGC) y Ppfor-Ndel-R (SEQ ID NO: 24: TACGCATATGAATTCCTCTCCTTTTCAAGC) usando la ADN polimerasa de alta fidelidad iProof (Bio-Rad Laboratories) y el siguiente programa: desnaturalización inicial a 98°C durante 30 segundos, seguido de 32 ciclos de desnaturalización (98°C durante 10 segundos), reasociación (50-62°C durante 30-120 segundos) y alargamiento (72°C durante 30-90 segundos), antes de una etapa de extensión final (72°C durante 10 minutos).
Construcción del plásmido de expresión de la isopreno sintasa:
La construcción de un plásmido de expresión se llevó a cabo en E. coli DH5a-T1R (Invitrogen) y XL1-Blue MRF' Kan (Stratagene). En una primera etapa, la región de promotor Ppfor se clonó en el vector lanzadera de E. coli-Clostridium pMTL85141 (FJ797651.1; Nigel Minton, University of Nottingham; Heap et al., 2009) usando los sitios de restricción Notl y Ndel, generando el plásmido pMTL85146. Como una segunda etapa, se clonó ispS en pMTL85146 usando los sitios de restricción NdeI y EcoRI, dando como resultado el plásmido pMTL 85146-ispS (Fig. 2, SEQ ID NO: 25).
Transformación y expresión en C. autoethanogenum
Antes de transformación, el ADN se metiló in vivo en E. coli usando un híbrido de metiltransferasa tipo II sintetizado (SEQ ID NO: 63) coexpresado en un plásmido de metilación (SEQ ID NO: 64) diseñado a partir de los genes de metiltransferasa genes de C. autoethanogenum, C. ragsdalei y C. Ijungdahlii como se describe en la patente de EE.UU. 2011/0236941.
Tanto el plásmido de expresión como el plásmido de metilación se transformaron en las mismas células que E. coli XL1-Blue MRF' Kan de restricción negativa (Stratagene), lo cual se debe posiblemente a sus orígenes de replicación de Gram-(-) compatibles (número de copias alto de ColE1 en el plásmido de expresión y número de copias bajo de p15A en el plásmido de metilación). La metilación in vivo se indujo por adición de IPTG 1 mM, y los plásmidos metilados se usaron en el kit Plasmid Midi Kit de QIAGEN (QIAGEN). La mezcla resultante se usó para los experimentos de transformación con C. autoethanogenum DSM23693, pero solo el plásmido de expresión abundante (alto número de copias) tiene un origen de replicación de Gram-(+) (repL) dejando que se replique en clostridias.
Transformación en C. autoethanogenum:
Durante el experimento de transformación completo, C. autoethanogenum DSM23693 se cultivó en medio PETC (Tabla 1) complementado con extracto de levadura 1 g/L y fructosa 10 g/L así como 2,11 kg/cm2 (30 psi) de gas residual de acería (recogido en el sitio de la acería de Nueva Zelanda, en Glenbrook, NZ; composición: 44% de CO, 32% de N2, 22% de CO2, 2% de H2) como fuente de carbono.
Para hacer células competentes, se subcultivaron 50 ml de cultivo de C. autoethanogenum DSM23693 en medio de nueva aportación durante 3 días consecutivos. Estas células se usaron para inocular 50 ml de medio PETC que contenía DL-treonina 40 mM a una DO600nm de 0,05. Cuando el cultivo alcanzó una DO600nm de 0,4, las células se transfirieron a una cámara anaeróbica y se recuperaron a 4.700 x g y 4°C. El cultivo se lavó dos veces con tampón de electroporación enfriado con hielo (sacarosa 270 mM, MgCl21 mM, fosfato sódico 7 mM, pH 7,4) y finalmente se suspendió en un volumen de 600 pl de tampón de electroporación de nueva aportación. Esta mezcla se transfirió a una cubeta de electroporación previamente enfriada con una separación de los electrodos de 0,4 cm, que contenía 1 pg de la mezcla de plásmido metilados y se aplicaron pulsos inmediatamente usando un sistema de electroporación Gene pulser Xcell (Bio-Rad) con los siguientes ajustes: 2,5 kV, 600 O y 25 pF. Se lograron constantes de tiempo de 3,7-4,0 ms. El cultivo se transfirió a 5 ml de medio de nueva aportación. La regeneración de las células se controló a una longitud de onda de 600 nm usando un espectrofotómetro Spectronic Helios Epsilon (Thermo) equipado con un tubo de objetivo. Después de una disminución inicial en la biomasa, las células empezaron a crecer de nuevo. Una vez que la biomasa se había duplicado desde este punto, se recogieron las células, se suspendieron en 200 pl de medio de nueva aportación y se cultivaron en placas de PETC selectivas (que contenían agar Bacto™ al 1,2% (BD)) con los antibióticos adecuados claritromicina 4 pg/ml o tioanfenicol 15 pg/ml. Después de 4-5 días de la inoculación con 2,11 kg/cm2 (30 psi) de gas de acería a 37°C, las colonias eran claramente visibles.
Las colonias se usaron para inocular antibióticos en 2 ml de medio PETC. Cuando se produjo el crecimiento, los cultivos se ampliaron de escala hasta un volumen de 5 ml y más tarde de 50 ml con 2,11 kg/cm2 (30 psi) de gas de acería como única fuente de carbono.
Confirmación de la transformación satisfactoria:
Para verificar la transferencia de ADN, se llevó a cabo un plásmido miniprep a partir de 10 ml de volumen de cultivo usando el kit de miniprep de plásmido Zyppy (Zymo). Puesto que la calidad del plásmido aislado no era suficiente para una digestión de restricción debido a la actividad de exonucleasa clostridial [Burchhardt y Dürre, 1990], se llevó a cabo una PCR con el plásmido aislado con la pareja de oligonucleótidos colE1-F (SEQ ID NO: 65: CGTCAGACCCCGTAGAAA) más colE1-R (SEQ ID NO: 66: CTCTCCTGTTCCGACCCT). La PCR se llevó a cabo usando el kit de PCR iNtRON Maximise Premix (Intron Bio Technologies) con las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 94°C durante 2 minutos, seguido de 35 ciclos de desnaturalización (94°C durante 20 segundos), reasociación (55°C durante 20 segundos) y elongación (72°C durante 60 segundos), antes de una etapa de extensión final (72°C durante 5 minutos).
Para confirmar la identidad de los clones, se aisló ADN genómico (véase antes) de cultivos de 50 ml de C. autoethanogenum DSM23693. Se llevó a cabo una PCR contra el gen ARNr 16S usando los oligonucleótidos fD1 (SEQ ID NO: 67: CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCCTGGCTCAG) y rP2 (SEQ ID NO: 68: CCCGGGATCCAAGCTTACGGCTACCTTGTTACGACTT) [Weisberg et al., 1991] y el kit de PCR iNtRON Maximise Premix (Intron Bio Technologies) con las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 94°C durante 2 minutos, seguido de 35 ciclos de desnaturalización (94°C durante 20 segundos), reasociación (55°C durante 20 segundos) y elongación (72°C durante 60 segundos), antes de una etapa de extensión final (72°C durante 5 minutos). Los resultados de secuenciación eran al menos 99,9% frente al gen de ARNr 16s (rrsA) of C. autoethanogenum (Y18178, GI:7271109).
Expresión del gen de la isopreno sintasa
Se llevaron a cabo experimentos de qRT-PCR para confirmar la expresión satisfactoria del gen de la isopreno sintasa introducido en C. autoethanogenum.
Un cultivo que albergaba el plásmido de la isopreno sintasa pMTL 85146-ispS y un cultivo de control sin el plásmido, se desarrollaron en frascos de suero de 50 ml y medio PETC (tabla 1) con 2,11 kg/cm2 (30 psi) de gas residual de acería (recogido del sitio de Nueva Zelanda en Glenbrook, NZ; composición: 44% de CO, 32% de N2, 22% de CO2, 2% de H2) como la única fuente de carbono y energía. Se tomaron muestras de 0,8 ml durante la fase de crecimiento logarítmico a una DO600nm de aproximadamente 0,5 y se mezclaron con 1,6 ml de reactivo de protección de ARN (Qiagen). La mezcla se centrifugó (6.000 x g, 5 min, 4°C), y el sedimento celular se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenó a -80°C hasta la extracción del ARN. El ARN se aisló usando el RNeasy Mini Kit (Qiagen) de acuerdo con el protocolo 5 del manual. La rotura de las células se llevó a cabo pasando la mezcla a través de una jeringa 10 veces, y se eluyó en 50 pl de agua exenta de RNasa/DNasa. Después de tratamiento con DNasa I usando el kit DNA-free™ (Ambion), se llevó a cabo entonces la etapa de transcripción inversa usando el kit de transcriptasa inversa SuperScript III (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). El ARN se comprobó usando un dispositivo Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU.), fluorómetro Qubit (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y por electroforesis en gel. Se llevó a cabo un control no RT para cada par de oligonucleótidos. Todas las reacciones de qRT-PCR se llevaron a cabo por duplicado usando un sistema de detección de color simple MyiQ™ (Bio-Rad Labratories, Carlsbad, CA, EE.u U.) en un volumen de reacción total de 15 pl con 25 ng de molde de ADNc, 67 nM de cada oligonucleótido (tabla 2), y 1x iQ™ SYBR® Green Supermix (Bio-Rad Labratories, Carlsbad, CA, EE.UU.). Las condiciones de reacción fueron 95°C durante 3 min, seguido de 40 ciclos de 95°C durante 15 s, 55°C durante 15 s y 72°C durante 30 s. Para la detección de la dimerización de oligonucleótidos u otros artefactos de amplificación, se llevó a cabo un análisis de curva de fusión inmediatamente después de completarse la qPCR (38 ciclos de 58°C a 95°C a 1°C/s). Se incluyeron dos genes de mantenimiento (guanilato quinasa y formiato tetrahidrofolato ligasa) para cada muestra de ADNc para la normalización. La determinación de la expresión relativa de genes se llevó a cabo usando la herramienta Relative Expression Software Tool (REST©) 2008 V2.0.7 (38). Se usaron diluciones seriadas de ADNc que abarcaban 4 unidades logarítmicas para generar curvas de referencia y las eficacias de amplificación relativas resultantes para calcular la concentración de ARNm.
T l 2: li n l i r RT-P R
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Aunque no se observó amplificación con la cepa de tipo natural usando la pareja de oligonucleótidos de ispS, se midió una señal con la pareja de oligonucleótidos de ispS para la cepa que llevaba el plásmido pMTL 85146-ispS, confirmando la expresión satisfactoria del gen ispS.
Ejemplo 2 - Expresión de la Isopentenil-difosfato delta-isomerasa para la conversión entre los precursores de terpenos clave DMAPP (difosfato de dimetilalilo) y IPP (difosfato de isopentenilo)
La disponibilidad y el equilibrio de los precursores DMAPP (difosfato de dimetilalilo) y IPP (difosfato de isopentenilo) es crucial para la producción de terpenos. Mientras que la ruta de la DXS sintetiza tanto el IPP como el DMAPP por igual, en la ruta del mevalonato el único producto es el IPP. La producción de isopreno solo requiere que esté presente el precursor DMAPP junto con una isopreno sintasa, mientras que para la producción de terpenos superiores y terpenoides, se requiere tener cantidades iguales de IPP y DMAPp disponibles para producir geranilo-PP por una geraniltransferasa.
Construcción del plásmido de expresión de la isopentenil-difosfato delta-isomerasa:
Un gen de la isopentenil-difosfato delta-isomerasa idi de C. beijerinckii (Gene ID:5294264), que codifica la isopentenil-difosfato delta-isomerasa (YP_001310174.1), se clonó en la dirección 3' de ispS. El gen se amplificó usando el oligonucleótido Idi-Cbei-SacI-F (SEQ ID NO: 26: GTGAGCTCGAAAGGGGAAATTAAATG) y Idi-Cbei-KpnI-R (SEQ ID NO: 27: ATGGTACCCCAAATCTTTATTTAGACG) a partir del ADN genómico de C. beijerinckii NCIMB8052, obtenido usando el mismo método descrito antes para C. autoethanogenum. El producto de la PCR se clonó en el vector pMTL 85146-ispS usando los sitios de restricción SacI y Kpnl para dar el plásmido pMTL85146-ispS-idi (SEQ ID NO: 28). El marcador de resistencia a antibiótico se intercambio de catP a ermB (liberado del vector pMTL82254 (FJ797646.1; Nigel Minton, University of Nottingham; Heap et al., 2009) usando las enzimas de restricción PmeI y FseI para formar el plásmido pMTL85246-ispS-idi (Fig. 3).
La transformación y expresión en C. autoethanogenum se llevó a cabo como se ha descrito para el plásmido pMTL 85146-ispS. Después de transformación satisfactoria, se llevó a cabo el experimento de crecimiento en 50 ml en frascos de suero de 50 ml y medio PETC (tabla 1) con 2,11 kg/cm2 (30 psi) de gas residual de acería (recogido de la acería en Nueva Zelanda, en Glenbrook, Nz ; composición: 44% de CO, 32% de N2, 22% de CO2, 2% de H2) como la única fuente de carbono y energía. Para confirmar que el plásmido se había introducido de forma satisfactoria, se llevó a cabo la miniprep del plásmido de ADN de transformantes como se ha descrito previamente. La PCR frente al plásmido aislado usando parejas de oligonucleótidos que se dirigen a colE1 (colE1-F: SEQ ID NO: 65: CGTCAGACCCCGTAGAAA y colE1-R: SEQ ID NO: 66: CTCTCCTGTTCCGACCCT), ermB (ermB-F: SEQ ID NO: 106: TTTGTAATTAAGAAGGAG y ermB-R: SEQ ID NO: 107: GTAGAATCCTTCTTCAAC) e idi (Idi-Cbei-SacI-F: SEQ ID NO: 26: GTGAGCTCGAAAGGGGAAATTAAATG y Idi-Cbei-KpnI-R: SEQ ID NO: 27: ATGGTACCCCAAATCTTTATTTAGACG) confirmaron el éxito de la transformación (figura 8). De forma similar, se extrajo el ADN genómico de estos transformantes, y al amplicón de ARNr 16S resultante usando los oligonucleótidos fD1 y rP2 (véase antes) confirmaron 99,9% de identidad frente al gen de ARNr 16S de C. autoethanogenum (Y18178, GI:7271109).
La confirmación de la expresión del gen satisfactoria se llevó a cabo como se ha descrito antes usando una pareja de oligonucleótidos frente al gen de la isopentenil-difosfato delta isomerasa idi (idi-F, SEQ ID NO: 71: ATA CGT GCT GTA GTC ATC CAA GAT A e idiR, SEQ ID NO: 72: TCT TCA AGT TCA CAT GTA AAA CCC A) y una muestra de un frasco de suero del experimento de crecimiento con C. autoethanogenum que lleva el plásmido pMTL 85146-ispS-idi. También se observó una señal para el gen de la isopreno sintasa ispS (Fig. 14).
Ejemplo 3 - Sobreexpresión de la ruta de la DXS
Para mejorar el flujo a través de la ruta de la DXS, se sobreexpresaron los genes de la ruta. La etapa inicial de la ruta, que convierte la piruvato D-gliceraldehído-3-fosfato (G3P) en desoxixilulosa 5-fosfato (DXP/DXPS/DOXP), es catalizada por una desoxixilulosa 5-fosfato sintasa (DXS).
Construcción del plásmido de expresión para la sobreexpresión de DXS:
El gen dxs de C. autoethanogenum se amplificó a partir del ADN genómico con los oligonucleótidos Dxs-SalI-F (SEQ ID NO: 29: GCAGTCGACTTTATT AAAGGGATAGATAA) y Dxs-XhoI-R (SEQ ID NO: 30: TGCTCGAGTTAAAATATATGACTTACCTCTG) como se ha descrito para otros genes anteriormente. Después el gen amplificado se clonó en el plásmido pMTL85246-ispS-idi con SaiI y XhoI para producir el plásmido pMTL85246-ispS-idi-dxs (SEQ ID NO: 31 y Fig. 4). La secuenciación del ADN usando los oligonucleótidos dados en la tabla 3 confirmó la clonación satisfactoria de ispS, idi, y dxs sin mutaciones (Fig. 5). Los genes ispS y idi son como se describen en el ejemplo 1 y 2 respectivamente.
Figure imgf000026_0001
Transformación y expresión en C. autoethanogenum
La transformación y expresión en C. autoethanogenum se llevó a cabo como se ha descrito para el plásmido pMTL 85146-ispS. Después de transformación satisfactoria, se llevó a cabo un experimento de crecimiento en 50 ml en frascos de suero de 50 ml y medio PETC (tabla 1) con 2,11 kg/cm2 (30 psi) de gas residual de acería (recogido de la acería en Nueva Zelanda, en Glenbrook, Nz ; composición: 44% de CO, 32% de N2, 22% de CO2, 2% de H2) como la única fuente de carbono y energía. La confirmación de la expresión de geles se llevó a cabo como se ha descrito antes a partir de una muestra recogida a DO600nm = 0,75. Se usó la pareja de oligonucleótidos dxs-F (SEQ ID NO: 73: ACAAAGTATCTAAGACAGGAGGTCA) y dxs-R (SEQ ID NO: 74: GATGTCCCACATCCCATATAAGTTT) para medir la expresión del gen dxs tanto en la cepa de tipo natural como en la cepa que lleva el plásmido pMTL 85146-ispS-idi-dxs. Los niveles de ARNm en la cepa que lleva el plásmido se encontró que eran más de 3 veces mayores comparados con el tipo natural (Fig. 15). Se normalizó la biomasa antes de la extracción de ARN.
Ejemplo 4 - Introducción y expresión de la ruta del mevalonato
La primera etapa de la ruta del mevalonato (Fig. 7) es catalizada por una tiolasa que convierte dos moléculas de acetil-CoA en acetoacetil-CoA (y HS-CoA). Esta enzima se ha expresado satisfactoriamente en los acetógenos carboxidotróficos Clostridium autoethanogenum y C. Ijungdahlii por los mismos autores de la invención (patente de EE.UU. 2011/0236941). Se han diseñado construcciones para los demás genes de la ruta del mevalonato.
Construcción del plásmido de expresión del mevalonato:
Se usaron ADN recombinante y técnicas de clonación molecular convencionales (Sambrook, J., y Russell, D., Molecular cloning: A Laboratory Manual 3a Ed., Cold Spring Harbour Lab Press, Cold Spring Harbour, NY, 2001). En los tres genes necesarios para la síntesis del mevalonato a través de la parte superior de la ruta del mevalonato, es decir, la tiolasa (thlA/vraB), HMG-CoA sintasa (HMGS) y HMG-CoA reductasa (HMGR), se realizó la optimización de codones como un operón (Pptaack-thlA/vraB-HMGS-Patp-HMGR).
El promotor del operón de la fosfotransacetilasa/acetato quinasa (Ppta-ack) de C. autoethanogenum (SEQ ID NO: 61) se usó para la expresión de la tiolasa y HMG-CoA mientras que se usó la región de promotor de la ATP sintasa (Patp) de C. autoethanogenum para la expresión de la HMG-CoA reductasa. Se sintetizaron dos variantes de tiolasa, thIA de Clostridium acetobutylicum y vraB de Staphylococcus aureus, y se flanquearon con los sitios de restricción Ndel y EcoRI para la subclonación adicional. Tanto la HMG-CoA sintasa (HMGS) como la HMG-CoA reductasa (HMGR) se sintetizaron a partir de Staphylococcus aureus y se flanquearon por los sitios de restricción EcoRI-SacI y KpnI-XbaI respectivamente para la subclonación adicional. Todas las secuencias de ADN optimizadas usadas se dan en la tabla 4.
Figure imgf000027_0001
El promotor de la ATP sintasa (Patp) junto con la hidroximetilglutaril-CoA reductasa (HMGR) se amplificaron usando los oligonucleótidos pUC57-F (SEQ ID NO: 46: AGCAGATTGTACTGAGAGTGC) y pUC57-R (SEQ ID NO: 47: ACAGCTATGACCATGATTACG) y pUC57- Patp-HMGR como molde. El fragmento amplificado de 2033 pb se digirió con SacI y XbaI y se ligó en el vector lanzadera de E. coli-Clostridium pMTL 82151 (FJ7976; Nigel Minton, University of Nottingham, Reino Unido; Heap et al., 2009, J Microbiol Methods. 78: 79-85) dando como resultado el plásmido pMTL 82151-Patp-HMGR (SEQ ID NO: 76).
La 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA sintasa (HMGS) se amplificó a partir del plásmido sintetizado de codones pGH-seq3.2 usando los oligonucleótidos EcoRI-HMGS_F (SEQ ID NO: 77: AGCCGTGAATTCGAGGCTTTTACTAAAAACA) y EcoRI-HMGS_R (SEQ ID NO: 78: AGGCGTCTAGATGTTCGTCTCTACAAATAATT). El fragmento amplificado de 1391 pb se digirió con SacI y EcoRI y se ligó en el plásmido previamente creado pMTL 82151-Patp-HMGR para dar pMTL 82151-HMGS-Patp-HMGR (SEQ ID NO: 79). El plásmido creado pMTL 82151-HMGS-Patp-HMGR (SEQ ID NO: 79) y el operón de codones optimizados de 1768 pb de Pptaack-thlA/vraB se cortaron ambos con NotI y EcoRI. Se llevó a cabo un ligado y posteriormente se transformó en XL1-Blue MRF' Kan de E. coli dando como resultado pMTL8215- Pptaack-thlA/vraB-HMGS-Patp-HMGR (SEQ ID NO: 50).
En los cinco genes necesarios para la síntesis de intermedios clave de terpenoides a partir del mevalonato por la ruta del mevalonato inferior, es decir, la mevalonato quinasa (MK), fosfomevalonato quinasa (PMK), mevalonato difosfato descarboxilasa (PMD), isopentenil-difosfato delta-isomerasa (idi) e isopreno sintasa (ispS) se realizó la optimización de codones por ATG:Biosynthetics GmbH (Merzhausen, Alemania). La mevalonato quinasa (MK), fosfomevalonato quinasa (PMK) y mevalonato difosfato descarboxilasa (PMD) se obtuvieron de Staphylococcus aureus.
La región de promotor del complejo RNF (Prnf) de C. autoethanogenum (SEQ ID NO: 62) se usó para la expresión de la mevalonato quinasa (MK), fosfomevalonato quinasa (PMK) y mevalonato difosfato descarboxilasa (PMD), mientras que la región de promotor de la piruvato:ferredoxina oxidorreductasa (Pfor) de C. autoethanogenum (SEQ ID NO: 22) se usó para la expresión de la isopentenil-difosfato delta-isomerasa (idi) e isopreno sintasa (ispS). Todas las secuencias de ADN usadas se dan en la tabla 5. El Prnf-MK de codones optimizados se amplificó a partir del plásmido sintetizado pGH- Prnf-MK-PMK-PMD con los oligonucleótidos NotI-XbaI-Prnf-MK_F (SEQ ID NO: 80: ATGCGCGGCCGCTAGGTCTAGAATATCGATACAGATAAAAAAATATATAATACA G) y SalI-Prnf-MK_R (SEQ ID NO: 81: TGGTTCTGTAACAGCGTATTCACCTGC). Después el gen amplificado se clonó en el plásmido pMTL83145 (SEQ ID NO: 49) con NotI y SalI para producir el plásmido pMTL8314-Prnf-MK (SEQ ID nO: 82). Este plásmido resultante y el fragmento de codones optimizados de 2165 pb PMK-PMD posteriormente se digirió con SalI y HindIII. Se llevó a cabo un ligado dando como resultado el plásmido pMTL 8314-Prnf-MK-PMK-PMD (SEQ ID NO: 83). Se creo el plásmido de expresión de isopreno sin la ruta del mevalonato ligando la isopreno sintasa (ispS) flanqueada por los sitios de restricción AgeI y NheI al plásmido de farneseno previamente creado, pMTL 8314-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS (SEQ ID nO:91) para dar como resultado el plásmido pMTL8314-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispS (SEQ ID NO:84). El plásmido final de expresión de isopreno, pMTL 8314-Pptaack-thlA-HMGS-Patp-HMGR-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispS (SEQ ID NO:. 58, figura 10) se crea ligando un fragmento de 4630 pb de Pptaack-thlA-HMGS-Patp-HMGR de pMTL8215-Pptaack-thlA-HMGS-Patp-HMGR (SEQ ID NO: 50) con pMTL 8314-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispS (SEQ ID NO: 84) usando los sitios de restricción NotI y XbaI.
Figure imgf000028_0001
Ejemplo 5 - Introducción de la farneseno sintasa en C. autoethanogenum para la producción de farneseno a partir de CO por la ruta del mevalonato
En lugar de producir isopreno directamente a partir de los intermedios clave de terpenoides IPP o DMAPP y después usarlos para la síntesis de terpenos de cadenas más largas, también se pueden sintetizar terpenos de cadena más larga tales como monoterpenoides C10 o sesquiterpenoides C15, directamente a través de la geraniltransferasa (véase la tabla 6). A partir de la unidad estructural sesquiterpenoide C15 farnesil-PP se puede producir farneseno, que de forma similar al etanol, se puede usar como combustible para el transporte.
Construcción del plásmido de expresión del farneseno:
En los dos genes necesarios para la síntesis del farneseno a partir de IPP y DMAPP por la ruta del mevalonato, es decir, la geraniltranstransferasa (ispA) y alfa-farneseno sintasa (FS) se realizó la optimización de codones. La geraniltranstransferasa (ispA) se obtuvo de Escherichia coli cepa K-12 subcepa MG1655 y la alfa-farneseno sintasa (FS) se obtuvo de Malus x domestica. Todas las secuencias de ADN usadas se dan en la tabla 6. Se amplificó idi de codones optimizados a partir del plásmido sintetizado pMTL83245-Pfor-FS-idi (SEQ ID NO: 85) por las rutas del mevalonato idi_F (SEQ ID NO: 86: AGGCACTCGAGATGGCAGAGTATATAATAGCAGTAG) y idi_R2 (SEQ ID NO:87: AGGCGCAAGCTTGGCGCACCGGTTTATTTAAATATCTTATTTTCAGC). El gen amplificado se clonó después en el plásmido pMTL83245-Pfor con XhoI y HindIII para producir el plásmido pMTL83245-Pfor-idi (SEQ ID NO: 88). Este plásmido resultante y el fragmento de codones optimizados de 1754 pb de la farneseno sintasa (FS) posteriormente se digirieron con HindIII y NheI. Se llevó a cabo un ligado dando como resultado el plásmido pMTL83245-Pfor-idi-FS (SEQ ID NO: 89). El fragmento de 946 pb de ispA y pMTL83245-Pfor-idi-FS después se digirieron con AgeI y HindIII y se ligaron para crear el plásmido resultante pMTL83245-Pfor-idi-ispA-FS (SEQ ID NO: 90). El plásmido de expresión de farneseno sin la ruta del mevalonato superior se creó ligando el fragmento de 2516 pb Pfor-idi-ispA-FS de pMTL83245-Pfor-idi-ispA-FS a pMTL 8314-Prnf-MK-PMK-PMD para dar el plásmido pMTL 8314-Pmf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS (SEQ ID NO: 91). El plásmido final de expresión de farneseno pMTL8314S-thlA-HMGS-Patp-HMGR-Pmf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS (SEQ ID NO: 59 y figura 18) se crea ligando el fragmento de 4630 pb de Pptaack-thlA-HMGS-Patp-HMGR de pMTL8215- Pptaack-thlA-HMGS-Patp-HMGR (SEQ ID NO: 50) con pMTL 8314-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS (SEQ ID NO: 91) usando los sitios de restricción NotI y XbaI.
T l : n i l l mi x r i n f rn n l r l m v l n
Figure imgf000029_0001
________________
Transformación en C. autoethanogenum
La transformación y expresión en C. autoethanogenum se llevó a cabo como se describe en el ejemplo 1.
Confirmación de la transformación satisfactoria
La presencia de pMTL8314-Prnf-MK-PMK-PMD-Pfor-idi-ispA-FS (SEQ ID NO: 59) se confirmó por PCR de colonia usando los oligonucleótidos repHF (SEQ ID NO: 92:AAGAAGGGCGTATATGAAAACTTGT) y catR (SEQ ID NO: 93: TTCGTTTACAAAACGGCAAATGTGA) que amplifican selectivamente una parte del replicón garm positivo y la mayor parte del gen cat en los plásmidos de la serie pMTL831xxx. Dando una banda de 1584 pb (figura 16).
Expresión de la ruta del mevalonato inferior en C. autoethanogenum
Confirmación de la expresión de los genes de la ruta del mevalonato inferior de la mevalonato quinasa (MK SEQ ID NO: 51), fosfomevalonato quinasa (PMK SEQ ID NO: 52), mevalonato difosfato descarboxilasa (PMD SeQ ID NO: 53), Isopentil-difosfato delta-isomerasa (idi; SEQ ID nO: 54), geraniltranstransferasa (ispA; SEQ ID NO: 56) y farneseno sintasa (FS SEQ ID NO: 57) se hizo como se ha descrito antes en el ejemplo 1. Usando los oligonucleótidos citados en la tabla 7.
Tabla 7: Lista de oligonucleótidos usados para la detección de la expresión de los genes en la ruta del mevalonato inf ri r r n l l mi MTL 14Prnf-MK-PMK-PMD-Pf r-i - A-F E ID N : 1
Figure imgf000029_0002
Los datos de la Rt-PCR que confirman la expresión de todos los genes en la ruta del mevalonato inferior se muestra en la figura 18, estos datos también se resumen en la tabla 8.
Tabla 8: Valores de CT medios para los genes de la mevalonato quinasa (MK SEQ ID NO: 51), fosfomevalonato quinasa (PMK SEQ ID NO: 52), mevalonato difosfato descarboxilasa (PMD SeQ ID NO: 53), isopentil-difosfato deltaisomerasa (idi SEQ ID NO: 54), geraniltranstransferasa (ispA SEQ ID NO: 56) y farneseno sintasa (FS SEQ ID NO: 57). para dos muestras independientes tomadas de los dos cultivos iniciadores para el experimento de alimentación de mevalonato véase a continuación .
Figure imgf000029_0003

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un método de producción de isopreno, que comprende:
(I) obtener un sustrato gaseoso que comprende monóxido de carbono y/o dióxido de carbono de un procedimiento industrial seleccionado del grupo que consiste en fabricación de productos de metales ferrosos, fabricación de productos no ferrosos, refinación del petróleo, gasificación de carbón, producción de energía eléctrica, producción de negro de carbón, producción de amoníaco, producción de metanol y fabricación de coque; y
(II) poner el sustrato gaseoso que comprende monóxido de carbono y/o dióxido de carbono en contacto con un microorganismo recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica isopreno sintasa, para permitir el microorganismo recombinante para producir isopreno del monóxido de carbono y/o dióxido de carbono;
en donde el microorganismo recombinante se prepara introduciendo un ácido nucleico que codifica isopreno sintasa en un microorganismo parental Clostridium autoethanogenum, Clostridium Ijungdahlii, Clostridium ragsdalei, Clostridium carboxidivorans, Clostridium drakei, Clostridium scatologenes, Clostridium aceticum, Clostridium formicoaceticum, Clostridium magnum, Butyribacterium methylotrophicum, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Blautia producta, Eubacterium limosum, Moore- lla thermoacetica, Moorella thermautotrophica, Sporomusa ovata, Sporomusa silvacetica, Sporomusa sphaeroides, Oxobacter pfennigii o Thermoanaerobacter kiuvi.
2. El método según la reivindicación 1, en donde el sustrato gaseoso comprende monóxido de carbono e hidrógeno, o dióxido de carbono e hidrógeno.
3. El método de la reivindicación 2, en donde el sustrato gaseoso es un gas de síntesis.
4. El método según una cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde el microorganismo recombinante comprende además un ácido nucleico que codifica una enzima exógena que actúa en una ruta de mevalonato, en donde el microorganismo recombinante es capaz de producir isopentenil difosfato a través de la ruta de mevalonato.
5. El método según la reivindicación 4, en donde el ácido nucleico que codifica la enzima exógena que actúa en la ruta de mevalonato se selecciona de mevalonato quinasa, mevalonato difosfato descarboxilasa, fosfomevalonato quinasa, tiolasa, 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A (HMG-CoA) reductasa y HMG-CoA sintasa.
6. El método según la reivindicación 4 o 5, en donde la ruta de mevalonato es de levadura.
7. El método según la reivindicación 6, en donde la levadura es Saccharomyces.
8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde el microorganismo recombinante comprende además un ácido nucleico que codifica al menos una enzima que actúa en una ruta de DXS, en donde la ruta de DXS:
(a) no está presente de forma natural en el microorganismo parental; o
(b) está presente de forma natural en el microorganismo parental.
9. El método según la reivindicación 8, en donde el ácido nucleico que codifica al menos una enzima que actúa en la ruta de DXS se selecciona de 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato sintasa DXS, 1-desoxi-D-xilulosa 5-fosfato reductoisomerasa DXR, 2-C-metil-D-eritritol 4-fosfato citidililtransferasa IspD, 4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol quinasa IspE, 2-C-metil-D-eritritol 2;4-ciclodifosfato sintasa IspF, 4-hidroxi-3-metilbut-2-en-1-il difosfato sintasa IspG y 4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato reductasa.
10. El método según una cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde la isopreno sintasa procede de una planta.
11. El método según una cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde el ácido nucleico que codifica isopreno sintasa es:
(a) una secuencia representada por la SEQ ID NO: 21; o
(b) una secuencia que tiene una identidad de 90 % o más con la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 21.
12. El método según una cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde el ácido nucleico tiene codones optimizados.
13. El método según una cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde:
(a) el ácido nucleico está incorporado en el genoma del microorganismo recombinante; y/o
(b) el ácido nucleico está incorporado en un plásmido.
14. El método según una cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde el microorganismo recombinante se selecciona de Clostridium autoethanogenum y Clostridium Ijungdahlii.
15. Uso del microorganismo recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones previas en un método para producir isopreno, que comprende:
(I) obtener un sustrato gaseoso que comprende monóxido de carbono y/o dióxido de carbono de un procedimiento industrial seleccionado del grupo que consiste en fabricación de productos de metales ferrosos, fabricación de productos no ferrosos, refinación del petróleo, gasificación de carbón, producción de energía eléctrica, producción de negro de carbón, producción de amoníaco, producción de metanol y fabricación de coque; y
(II) poner el sustrato gaseoso que comprende monóxido de carbono y/o dióxido de carbono en contacto con dicho microorganismo recombinante, para producir isopreno del monóxido de carbono y/o dióxido de carbono.
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