CN105062982B - 一种以废弃海绵为载体的固定化芽胞漆酶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种固定化芽胞漆酶及其制备方法，属于固定化技术领域。其以废弃海绵为载体，使用聚乙烯亚胺接枝，再通过双功能交联剂将芽胞共价结合到海绵上。本发明提供的固定化芽胞漆酶易于分离，可重复使用多次；该方法制备过程简单，原料价格低廉，易于生产，而且可以有效解决废弃海绵的回收再利用的问题。此外，本发明所提供的固定化芽胞漆酶可反复应用于染料脱色，并保持较高的脱色能力。
Description
技术领域
本发明涉及酶的固定化领域，具体涉及一种固定化芽胞漆酶及其制备方法。
背景技术
漆酶(laccase)是一种含铜多酚氧化酶，可以氧化酚类物质和非酚类物质而不会对环境造成污染，是一种理想的生物催化剂。漆酶的用途非常广泛，在染料脱色、饮料处理，制浆漂白以及生物传感器等方面尤显优势。漆酶广泛存在于真菌、细菌、植物和昆虫中。漆酶的特点因来源不同而略有不同。细菌漆酶的研究还不多，已有的研究表明其是一种耐热耐碱的漆酶，在高温碱性的环境中比其他来源的漆酶更具优势。芽胞杆菌属所产的芽胞漆酶是最具代表性的细菌漆酶，目前仍鲜有芽胞漆酶固定化的经验。因为芽胞既不是细胞，不是菌丝体，也不是单个蛋白质，所以传统的细胞和酶的固定化技术并不完全适用于芽胞的固定化。选择一个合适的固定化载体是芽胞固定化的第一步，然而，这个过程需要投入大量的精力。
海绵用作菌体固定化的载体仍是一种较新的尝试。聚乙烯醇海绵，也称为PVA吸水海绵，通常采用缩醛化、发泡成型和接枝聚合的方法制成，是众多种海绵中的一类，在医疗、美容和清洁领域有广泛运用。然而这种材料在废弃后通常成为了垃圾，既污染环境，也造成了资源浪费。聚乙烯醇海绵孔径小，吸水量大，切割制成颗粒后在水中分散性良好，将其用作固定化载体不仅解决了废弃聚乙烯醇海绵的环境污染和资源浪费的问题，还为酶的固定化提供了一种独特的载体，从而使得该固定化酶在特定的应用中显示其独特的优势。
将芽胞固定化在废弃海绵上，无论于海绵的废物处理还是这种新兴的耐碱耐热的漆酶来说，都是一种新的发明。这种固定化在废弃海绵上的芽胞漆酶将是一种非常经济、极具应用价值的固定化芽胞漆酶。
发明内容
本发明旨在提供一种固定化芽胞漆酶及其制备方法。
所述固定化芽胞漆酶通过以下步骤来制备：
(1)制备芽胞杆菌属菌株所产的芽胞；
(2)海绵的预处理：将废弃海绵切割成2×2×2mm小块，95％乙醇浸泡过夜，反复洗涤，干燥至恒重；
(3)聚乙烯亚胺涂敷与芽胞固定化：将预处理好的海绵按10－50mg/ml浸于水中，加入聚乙烯亚胺水溶液(0.1－2.0mg/ml)处理3－12h，然后用去离子水洗涤3次，收集聚乙烯亚胺涂敷好的海绵，自然干燥过夜；
(4)加入芽胞悬液使终浓度为1.0－10.0mg/ml(湿重)，添加戊二醛交联剂(体积浓度为0.4－4％)，并在4－40℃，pH 5.0－9.0的缓冲液，50－250r/min条件下固定8－24h；
(5)回收：芽胞与聚乙烯亚胺接枝的海绵经混合固定化处理后，过滤，用缓冲液冲洗1－5次，分别收集上清液和固定化芽胞，保藏于0－40℃。
①将产漆酶的芽胞杆菌属菌株在37℃条件下在生孢培养基上培养2－7d；
②以离心转速为6000－12000r/min，离心时间为5－30min的条件对上述培养物进行离心，收集芽胞；
③水洗芽胞0－3次；
④水洗所得的芽胞加入溶菌酶使其终浓度为0.1－2.0mg/ml，在37℃条件下保温0.5－3h。
⑤溶菌酶处理后，离心，先后经1M NaCl和1M KCl洗，6000－12000r/min离心5－30min收集芽胞。
⑥对芽胞进行湿重称量，用去离子水重悬芽胞，浓度为10mg/ml－100mg/ml。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述的芽胞制备方法，菌株培养时间为2d，离心转速为8000r/min，离心时间为10min，水洗芽胞1次，所加溶菌酶终浓度为1mg/ml，在37℃条件下保温的时间为2h。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)也可以不经乙醇浸泡。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)所述聚乙烯亚胺水溶液终浓度为1mg/ml，处理时间为6h。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)聚乙烯亚胺涂敷的海绵、芽胞以及戊二醛的含量分别为30mg/ml，5mg/ml(湿重)以及2％(体积浓度)。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)加入交联剂后，在37℃，0.1M柠檬酸磷酸盐缓冲液(pH 7.5)，200r/min条件下固定12h。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中可用水代替固定化过程中使用的缓冲液。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)加入的交联剂可以是碳二亚胺盐酸盐，其处理方法为加入碳二亚胺盐酸盐使其终浓度为0.2－2.0mg/ml，并使用超声波振荡5－30min，使其充分散；加入芽胞悬液使终浓度为1.0－10.0mg/ml(湿重)，再使用超声波处理10－60min，并在4－40℃，pH 5.0－9.0缓冲液，50－250r/min条件下固定8－24h。
在本发明的一种实施方式中，碳二亚胺盐酸盐的终浓度为0.4mg/ml，前后两次超声波处理的时间分别为10min和30min。
所述的海绵包括但不限于聚乙烯醇海绵。
所述芽胞漆酶是指芽胞杆菌属菌株所产的具漆酶活性的芽胞，芽胞的产生菌株包括但不限于Bacillus pumilus W3。
所述的固定化芽胞漆酶可以应用于染料脱色。
本发明的有益效果在于：(1)本发明提供了一种结合牢固的固定化芽胞漆酶，这种固定化芽胞漆酶在水中分散性和亲水性好，有利于酶促反应的进行，而且体积较大，易于分离，可重复使用多次；(2)本发明提供了一种有效的芽胞漆酶固定化方法，该方法操作简便，对操作条件要求不高，易于生产；(3)本发明提供的固定化方法可以有效解决废弃海绵的回收再利用的问题；(4)本发明所提供的固定化芽胞漆酶可反复应用于染料脱色，并保持较高的脱色能力。
附图说明
图1：以戊二醛为交联剂时聚乙烯亚胺的最适添加量；
图2：以戊二醛为交联剂时最适固定化pH；
图3：固定化芽胞漆酶的操作稳定性。
具体实施方式
漆酶酶活测定方法：称取0.1g固定化芽胞漆酶置于3.5ml柠檬酸磷酸盐缓冲液(0.1M，pH 6.8)中，在37℃保温15min，添加丁香醛连氮(0.05mM)反应5min，然后冰水浴10min以终止反应，取上清液在525nm处检测吸光值。
活力按每g湿重芽胞固定后的回收活力计算，公式如下：
回收活力(U/g)＝ΔA·106·V体/(Δt·ε·b·m酶)
其中，ΔA表示反应时间内吸光度值的差；V体表示反应体系的体积(l)；Δt表示反应时间；ε表示摩尔消光系数，ε525＝6.5×104l·mol–1·cm–1；b表示光程长度，b＝1cm；m酶为参与反应的固定化芽胞漆酶的重量(g)。
脱色率用分光光度法在各染料的最大吸收波长处进行检测，各染料的最大吸收波长分别为λ＝630nm(甲基绿)，λ＝435nm(甲基红)和λ＝531nm(酸性红1)。
脱色率＝(对照组吸光值－实验组吸光值)/对照组吸光值×100％
实施例1芽胞漆酶的制备
将产漆酶的芽胞杆菌属菌株在37℃条件下在生孢培养基上培养2天，以8000r/min的转速对上述培养物离心10min，收集芽胞；水洗芽胞1次；水洗所得的芽胞加入溶菌酶使其终浓度为1mg/ml，在37℃条件下保温2h；然后离心并弃去上清，沉淀先后经1M NaCl和1MKCl洗，8000r/min离心10min，对芽胞进行湿重称量，用去离子水重悬芽胞，浓度为100mg/ml。
实施例2固定化方法1
将废弃海绵切割成2×2×2mm小块，95％乙醇浸泡过夜，反复洗涤，干燥至恒重；将预处理好的海绵按20mg/ml浸于水中，加入聚乙烯亚胺水溶液(终浓度为0.1mg/ml)处理6h，然后用去离子水洗涤3次，收集聚乙烯亚胺涂敷好的海绵，自然干燥过夜；加入芽胞悬液于水中，使终浓度为5mg/ml(湿重)，添加戊二醛交联剂(体积浓度为0.4％)，并在37℃固定24h；过滤，用缓冲液冲洗3次，分别收集上清液和固定化芽胞，测得酶活为0.77U/g。
实施例3固定化方法2
将废弃海绵切割成2×2×2mm小块，95％乙醇浸泡过夜，反复洗涤，干燥至恒重；将预处理好的海绵按20mg/ml浸于水中，加入聚乙烯亚胺水溶液(终浓度为1.0mg/ml)处理6h，然后用去离子水洗涤3次，收集聚乙烯亚胺涂敷好的海绵，自然干燥过夜；加入芽胞悬液于水中，使终浓度为5mg/ml(湿重)，添加戊二醛交联剂(体积浓度为0.4％)，并在37℃固定24h；过滤，用缓冲液冲洗3次，分别收集上清液和固定化芽胞，测得酶活为1.50U/g。
实施例4固定化方法3
将废弃海绵切割成2×2×2mm小块，95％乙醇浸泡过夜，反复洗涤，干燥至恒重；将预处理好的海绵按20mg/ml浸于水中，加入聚乙烯亚胺水溶液(终浓度为2.0mg/ml)处理6h，然后用去离子水洗涤3次，收集聚乙烯亚胺涂敷好的海绵，自然干燥过夜；加入芽胞悬液于水中，使终浓度为5mg/ml(湿重)，添加戊二醛交联剂(体积浓度为0.4％)，并在37℃固定24h；过滤，用缓冲液冲洗3次，分别收集上清液和固定化芽胞，测得酶活为0.76U/g。
实施例5固定化方法4
将废弃海绵切割成2×2×2mm小块，95％乙醇浸泡过夜，反复洗涤，干燥至恒重；将预处理好的海绵按30mg/ml浸于水中，加入聚乙烯亚胺水溶液(终浓度为1.0mg/ml)处理6h，然后用去离子水洗涤3次，收集聚乙烯亚胺涂敷好的海绵，自然干燥过夜；加入芽胞悬液使终浓度为5mg/ml(湿重)，添加戊二醛交联剂(体积浓度为0.4％)，并在37℃，pH 5.0的条件下固定24h；过滤，用缓冲液冲洗3次，分别收集上清液和固定化芽胞，测得酶活为1.13U/g。
实施例6固定化方法5
将废弃海绵切割成2×2×2mm小块，95％乙醇浸泡过夜，反复洗涤，干燥至恒重；将预处理好的海绵按30mg/ml浸于水中，加入聚乙烯亚胺水溶液(终浓度为1.0mg/ml)处理6h，然后用去离子水洗涤3次，收集聚乙烯亚胺涂敷好的海绵，自然干燥过夜；加入芽胞悬液使终浓度为5mg/ml(湿重)，添加戊二醛交联剂(体积浓度为0.4％)，并在37℃，pH 7.5的条件下固定24h；过滤，用缓冲液冲洗3次，分别收集上清液和固定化芽胞，测得酶活为2.06U/g。
实施例7固定化方法6
将废弃海绵切割成2×2×2mm小块，95％乙醇浸泡过夜，反复洗涤，干燥至恒重；将预处理好的海绵按30mg/ml浸于水中，加入聚乙烯亚胺水溶液(终浓度为1.0mg/ml)处理6h，然后用去离子水洗涤3次，收集聚乙烯亚胺涂敷好的海绵，自然干燥过夜；加入芽胞悬液使终浓度为5mg/ml(湿重)，添加戊二醛交联剂(体积浓度为0.4％)，并在37℃，pH 9.0的条件下固定24h；过滤，用缓冲液冲洗3次，分别收集上清液和固定化芽胞，测得酶活为1.23U/g。
实施例8固定化方法7
将废弃海绵切割成2×2×2mm小块，并按40mg/ml浸于水中，加入聚乙烯亚胺水溶液(终浓度为1.0mg/ml)处理12h，然后用去离子水洗涤3次，收集聚乙烯亚胺涂敷好的海绵，自然干燥过夜；加入芽胞悬液使终浓度为3mg/ml(湿重)，添加戊二醛交联剂(体积浓度为2％)，并在37℃，pH 7.5的条件下固定12h；过滤，用缓冲液冲洗3次，分别收集上清液和固定化芽胞，测得酶活为1.08U/g。
实施例9固定化方法8
将废弃海绵切割成2×2×2mm小块，并按40mg/ml浸于水中，加入聚乙烯亚胺水溶液(终浓度为1.0mg/ml)处理12h，然后用去离子水洗涤3次，收集聚乙烯亚胺涂敷好的海绵，自然干燥过夜；加入碳二亚胺盐酸盐使其终浓度为0.4mg/ml，并使用超声波振荡10min，使其充分分散；加入芽胞悬液使终浓度为5mg/ml(湿重)，再使用超声波处理30min，并在37℃，pH 7.0缓冲液，200r/min条件下固定24h；过滤，用缓冲液冲洗3次，分别收集上清液和固定化芽胞，测得酶活为2.57U/g。
实施例10固定化芽胞漆酶的操作稳定性
称取由实施例8制备得到的干重固定化芽胞漆酶0.05g置于4ml反应体系中，以丁香醛连氮为底物检测其酶活，每次反应完毕后，在旋转振荡器上振荡5min，洗涤3次，重新加入反应体系检测酶活。重复使用7次仍达最初活力的86.09％。
实施例11固定化芽胞漆酶应用于染料脱色
称取由实施例5制备得到的干重固定化芽胞漆酶0.1g投入试管中，依次加入介体2,2'-联氮基-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(0.1mM)，染料(终浓度分别为100mmg/ml(甲基绿)和50mmg/ml(甲基红和酸性红1)，最后加入0.1M柠檬酸磷酸盐缓冲液(pH 7.0)使其最终反应体系为4ml。将混合反应液放入摇床，在200r/min，37℃条件下脱色24h。最终染料脱色率分别为87.13％，55.43％和75.89％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (7)
1.一种固定化芽胞漆酶，其特征在于，以废弃聚乙烯醇海绵为载体，通过共价结合作用将芽胞漆酶固定在海绵纤维表面，所述芽胞漆酶是指芽胞杆菌属菌株所产的具漆酶活性的芽胞，其具体制备方法包括以下步骤：
(1)制备芽胞杆菌属菌株所产的芽胞；
(2)海绵的预处理：将废弃海绵切割成2×2×2mm小块，95％乙醇浸泡过夜，反复洗涤，干燥至恒重；
(3)聚乙烯亚胺涂敷与芽胞固定化：将预处理好的海绵按10－50mg/ml浸于水中，用0.1-2.0mg/ml聚乙烯亚胺水溶液处理3－12h，然后用去离子水洗涤3次，收集聚乙烯亚胺涂敷好的海绵，自然干燥过夜；
(4)加入芽胞悬液使终浓度为湿重1.0－10.0mg/ml，添加体积浓度为0.4－4％的戊二醛交联剂，并在4－40℃，pH 5.0－9.0缓冲液，50－250r/min条件下固定8－24h；
(5)回收：芽胞与聚乙烯亚胺接枝的海绵经混合固定化处理后，过滤，用缓冲液冲洗1－5次，分别收集上清液和固定化芽胞，保藏于0－40℃。
2.权利要求1所述的固定化芽胞漆酶，其特征在于，步骤(2)也可以不经乙醇浸泡。
3.权利要求1所述的固定化芽胞漆酶，其特征在于，步骤(3)所述聚乙烯亚胺水溶液终浓度为1mg/ml，处理时间为6h。
4.权利要求1所述的固定化芽胞漆酶，其特征在于，步骤(4)聚乙烯亚胺涂敷的海绵、芽胞以及戊二醛的含量分别为30mg/ml，湿重5mg/ml以及体积浓度2％。
5.权利要求1所述的固定化芽胞漆酶，其特征在于，步骤(4)加入交联剂后，在37℃，0.1M、pH 7.5柠檬酸磷酸盐缓冲液，200r/min条件下固定12h。
6.权利要求1所述的固定化芽胞漆酶，其特征在于，步骤(4)加入的交联剂也可以是碳二亚胺盐酸盐，其处理方法为，加入碳二亚胺盐酸盐使其终浓度为0.2－2.0mg/ml，并使用超声波振荡5－30min，使其充分散；加入芽胞悬液使终浓度为湿重1.0－10.0mg/ml，再使用超声波处理10－60min，并在4－40℃，pH 5.0－9.0缓冲液，50－250r/min条件下固定8－24h。
7.权利要求6所述的固定化芽胞漆酶，其特征在于，碳二亚胺盐酸盐的终浓度为0.4mg/ml，前后两次超声波处理的时间分别为10min和30min。
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