LU88197A1 - Nouveaux oligodesoxyribonacleotides ayant une activite anti-ischemique et methode de preparation de ceux-ci. - Google Patents
Nouveaux oligodesoxyribonacleotides ayant une activite anti-ischemique et methode de preparation de ceux-ci. Download PDFInfo
- Publication number
- LU88197A1 LU88197A1 LU88197A LU88197A LU88197A1 LU 88197 A1 LU88197 A1 LU 88197A1 LU 88197 A LU88197 A LU 88197A LU 88197 A LU88197 A LU 88197A LU 88197 A1 LU88197 A1 LU 88197A1
- Authority
- LU
- Luxembourg
- Prior art keywords
- volume
- solution
- molecular weight
- alcohol
- preparation
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 52
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 52
- 230000000694 effects Effects 0.000 title description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 80
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 59
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 55
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 claims description 28
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 26
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 24
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 24
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 24
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 claims description 23
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 22
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 21
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 claims description 21
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 19
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 18
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 18
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 17
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 16
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 14
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 14
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 claims description 14
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 13
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- 230000002253 anti-ischaemic effect Effects 0.000 claims description 12
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 claims description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 11
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 claims description 9
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 9
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 9
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 8
- BDKLKNJTMLIAFE-UHFFFAOYSA-N 2-(3-fluorophenyl)-1,3-oxazole-4-carbaldehyde Chemical compound FC1=CC=CC(C=2OC=C(C=O)N=2)=C1 BDKLKNJTMLIAFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 claims description 7
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 claims description 7
- JNWFIPVDEINBAI-UHFFFAOYSA-N [5-hydroxy-4-[4-(1-methylindol-5-yl)-5-oxo-1H-1,2,4-triazol-3-yl]-2-propan-2-ylphenyl] dihydrogen phosphate Chemical group C1=C(OP(O)(O)=O)C(C(C)C)=CC(C=2N(C(=O)NN=2)C=2C=C3C=CN(C)C3=CC=2)=C1O JNWFIPVDEINBAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 7
- 229960004120 defibrotide Drugs 0.000 claims description 7
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 7
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 7
- 229940087562 sodium acetate trihydrate Drugs 0.000 claims description 7
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 claims description 6
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 claims description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 5
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 claims description 5
- 125000005233 alkylalcohol group Chemical group 0.000 claims description 4
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 3
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 claims description 3
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 claims description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 3
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 claims description 2
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 claims description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 2
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims description 2
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims description 2
- -1 isopropyl alcohols Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 2
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims 13
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 claims 4
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 claims 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 claims 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 claims 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims 1
- 238000009938 salting Methods 0.000 claims 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 9
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 6
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000003480 fibrinolytic effect Effects 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 2
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 2
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 239000007903 gelatin capsule Substances 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 2
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 208000031225 myocardial ischemia Diseases 0.000 description 2
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 description 2
- 239000011970 polystyrene sulfonate Substances 0.000 description 2
- 230000010410 reperfusion Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004135 Bone phosphate Substances 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 206010062575 Muscle contracture Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 1
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005686 Serum Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010045362 Serum Globulins Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 206010003119 arrhythmia Diseases 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 150000001860 citric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229940075614 colloidal silicon dioxide Drugs 0.000 description 1
- 208000006111 contracture Diseases 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000035487 diastolic blood pressure Effects 0.000 description 1
- 230000003205 diastolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 210000005240 left ventricle Anatomy 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 1
- 239000006186 oral dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 229940021222 peritoneal dialysis isotonic solution Drugs 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 229960002796 polystyrene sulfonate Drugs 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000004405 propyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 235000010232 propyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N propylparaben Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003303 reheating Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000002861 ventricular Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
Description
REVENDICATION DE LA PRIORITE de la demande de brevet / du modèle d'utilité ITALIE 09 DECEMBRE 1991 MI 91 A 003294 Mémoire Descriptif déposé à l'appui d'une demande de
BREVET D'INVENTION au
Luxembourg
au nom de : CRINOS INDUSTRIA FARMACOBIOLOGICA SPA
Piazza XX Settembre, 2 1-22079 VILLA GUARDIA (COMO) /Italie pour: NOUVEAUX OLIGODESOXYRIBONUCLEOTIDES AYANT UNE ACTIVITE ANTI-ISCHEMIQUE ET METHODE DE PREPARATION DE CEUX-CI.
NOUVEAUX OLIGODESOXYRIBONUCLEOTIDES AYANT UNE ACTIVITE ANTI-ISCHEMIQUE ET METHODE DE PREPARATION DE CEUX-CI
La présente invention concerne de nouveaux oligodésoxyribonucléotides d'origine naturelle ayant un poids moléculaire compris entre 4000 et lOOOOdaltons et les procédés de préparation de ceux-ci.
Un autre objet de la présente invention est l'utilisation des nouveaux composés comme agents antiischémiques .
Il convient tout d'abord de mentionner que les procédés précités ont pour caractéristique commune générale de comporter une étape préliminaire de dépolymérisation des acides désoxyribonucléiques naturels à poids moléculaire élevé en milieu aqueux, suivie de la précipitation des oligodésoxyribonucléotides ainsi obtenus par l'addition de quantités appropriées de solvants organiques.
Les polymères de la présente invention constituent une famille particulière parmi tous les oligodésoxyribonucléotides homologues ayant un poids moléculaire élevé situé dans la gamme mentionnée ci-dessus, et cela à la fois à cause du profil analytique correspondant et de l'activité pharmacologique précitée.
En effet, comme on le démontrera ci-après, on peut trouver dans ce même intervalle des composés différents des substances décrites ici pour ce qui concerne le profil analytique correspondant, et plus particulièrement pour ce qui concerne les valeurs d'un paramètre chimique et pour ce qui concerne l'activité anti-ischémique qui est beaucoup moindre.
Le paramètre chimique précité est le rapport de la somme des moles adénine + thymine / cytosine + guanine, ou encore A+T/C+G, dont la gamme de valeur mentionnée ci-dessous (tableau 1) doit donc être considérée comme un élément critique pour définir ces composés dans l'intervalle de poids moléculaire 4000 -10.000 et qui présentent une activité anti-ischémique significative et qui sont donc utiles d'un point de vue thérapeutique.
Dans l'état actuel de la technique, on connaît déjà des polymères à faible poids moléculaire obtenus par la dépolymérisation des acides désoxyribonucléiques naturels. En tout cas, et comme expliqué en détail dans la discussion ci-après, ces polymères ne sont pas considérés comme constituant des antériorités valables par rapport à l'originalité des nouveaux oligodésoxy-ribonucléotides et ne constituent pas non plus une raison évidente de l'existence de ceux-ci .
Le document EP-A-416677 décrit des utilisations cosmétiques de compositions contenant des polydésoxy-ribonucléotides d'origine naturelle dont le poids moléculaire est compris entre 10.000 et 100.000 et, ce qui est intéressant dans le cas présent, un rapport molaire purines/pyrimidines (G+A/e+T) situé dans les limites correspondantes présentées pour le même paramètre dans le cadre de la présente invention (voir tableau 1).
Toutefois, cette publication n'est pas considérée comme supprimant le caractère original du premier objectif de la présente invention.
En effet, il ne serait pas du tout justifié par exemple de considérer les nouveaux polymères comme de simples équivalents à poids moléculaire faible des polydésoxyribonucléotides connus dans la technique antérieure, vu que la gamme précitée du rapport molaire G+A/C+T considérée comme telle s'applique à une très vaste classe de composés, y compris à la fois les oligodésoxyribonucléotides présentant l'activité pharmacologique mentionnée ci-dessus et d'autres qui ne sont que très faiblement actifs.
Cette observation est d'ailleurs complètement confirmée si l'on considère les valeurs et les intervalles de valeurs de G+A/C+T indiquées pour les composés de la présente invention et reproduites au tableau I en les comparant à ce qui est indiqué en page 10 pour la préparation du P0067.D V qui, comme le montre le tableau IV ci-après, présente au contraire une faible activité anti-ischémique.
Les considérations précitées permettent de conclure sans hésitation que le document EP-A-416677 ne donne aucune information pouvant éventuellement aider un spécialiste de cette technique à choisir ou à définir autrement la classe de polymères décrite par la présente invention.
Le document WO 87/06235 décrit des polydésoxyribonucléotides d'origine naturelle qui diffèrent des substances constituant le premier objet de la présente invention par des valeurs plus élevées du paramètre d'hyperchromicité et la rotation optique.
Il est utile de remarquer à ce sujet que la même demande de brevet mentionne déjà qu'une diminution du poids moléculaire provoquerait une décroissance du paramètre d'hyperchromicité. Toutefois, il convient également de reconnaître que ce document ne donne aucune information sur les modifications possibles concomitantes de la rotation spécifique. D'autre part, tant le document WO/87/06235 que le document EP-A-416677 ne font aucune suggestion pour ce polydésoxyribonucléotides connus dans la technique antérieure, vu que la gamme précitée du rapport molaire G+A/C+T considérée comme telle s'applique à une très vaste classe de composés, y compris à la fois les oligodésoxyribonucléotides présentant l'activité pharmacologique mentionnée ci-dessus et d'autres qui ne sont que très faiblement actifs.
Cette observation est d'ailleurs complètement confirmée si l'on considère les valeurs et les intervalles de valeurs de G+A/C+T indiquées pour les composés de la présente invention et reproduites au tableau I en les comparant à ce qui est indiqué en page 10 pour la préparation du P0067.D V qui, comme le montre le tableau IV ci-après, présente au contraire une faible activité anti-ischémique.
Les considérations précitées permettent de conclure sans hésitation que le document EP-A-416677 ne donne aucune information pouvant éventuellement aider un spécialiste de cette technique à choisir ou à définir autrement la classe de polymères décrite par la présente invention.
Le document WO 87/06235 décrit des polydésoxyribonucléotides d'origine naturelle qui diffèrent des substances constituant le premier objet de la présente invention par des valeurs plus élevées du paramètre d'hyperchromicité et la rotation optique.
Il est utile de remarquer à ce sujet que la même demande de brevet mentionne déjà qu'une diminution du poids moléculaire provoquerait une décroissance du paramètre d'hyperchromicité. Toutefois, il convient également de reconnaître que ce document ne donne aucune information sur les modifications possibles concomitantes de la rotation spécifique. D'autre part, tant le document WO/87/06235 que le document EP-A-416677 ne font aucune suggestion pour ce qui concerne les valeurs particulières ou tout intervalle des valeurs du rapport molaire A+T/C+G qui présenteraient une importance pour mettre en évidence 1'activité des composés ainsi décrite. L'examen des deux documents précités aboutit au contraire à la conclusion plus générale que le rapport molaire A+T/C+G n'y a pas été considéré, même d'une manière éloignée, pour la caractérisation chimique de ces polydésoxyribonucléotides.
De plus, le document WÛ-87/06235 fournit un autre motif plus substantiel pour démontrer le caractère non évident de la présente invention.
En fait, la présente description comporte l'indication que les polymères à faible poids moléculaire des acides désoxyribonucléiques ayant des valeurs du paramètre d'hyperchromicité h inférieures à 10 doivent présenter une nette diminution de 1'activité pharmacologique. D'autre part, on indique également que h est presque égal à zéro pour les oligodésoxyribo-nucléotides ayant un poids moléculaire égal à 8000.
Ces propositions permettent de tirer immédiatement les conclusions suivantes : a. Les oligodésoxyribonucléotides ayant une valeur de h inférieure à 10 ne doivent pas avoir d'applications thérapeutiques. b. Plus particulièrement, comme dans la référence précitée ladite diminution remarquable de l'activité pharmacologique a été mise en relation avec le fait que les valeurs de h deviennent inférieures à 10, tout spécialiste expérimenté aurait certainement considéré que plus faible est la valeur de h et moindre est l'activité résiduelle, et surtout lorsque h = O, ce qui devrait correspondre, d'après le document WO 87/06235, à un poids moléculaire de 8000 pour ces polydésoxyribonucléotides , comme déjà indiqué -
Ces deux conclusions sont manifestement contraires aux découvertes expérimentales de la présente invention qui seront présentées ci-après.
Les caractéristiques physico-chimiques et chimiques intéressantes des nouveaux oligodésoxyribo-nucléotides sont indiquées au tableau I.
Les intervalles de variation qui y sont indiqués proviennent généralement du tableau II, sauf pour la rotation spécifique dont les limites ont été déterminées en prenant en considération le tableau II (limites :+34-+ 48°C) ainsi que des exemples de rotation spécifique de la préparation P0097.N mentionnée à l'exemple 8 (+ 32,5e) et pour la préparation P0097.M mentionnée à l'exemple 9 (+ 30,9).
Les paramètres indiqués au tableau I ont été déterminés de la manière suivante.
La détermination du poids moléculaire des substances de la nature de celles de la présente invention dépend dans une large mesure de la méthode adoptée pour cette détermination. Dans le cas des méthodes HPLC, le choix des standards de référence influence fortement les résultats.
Pour la présente invention, les standards de référence ont été choisis en tenant compte de la similitude de la structure moléculaire ou de la configuration par rapport aux oligodësoxyribonuclëotides à soumettre à l'analyse.
Le poids moléculaire a été déterminé par HPLC avec un chromatographe liquide équipé de deux colonnes
BiosilR TSK 300 et BiosilR TSK 250 (BioradR) montées en série et thermostatisées à 30°C. La solution constituant la phase mobile a été obtenue en dissolvant les substances suivantes dans l'eau distillée: chlorure de sodium 5,844 g, NaH2P04*H20 9,24 g, glycine 22,5 g. Le volume a ensuite été porté à 950 ml, le pH corrigé à 6,8 (avec NaOH 6 N), puis la solution a été diluée jusqu'à 1 litre avec de l'eau distillée.
Le débit était égal à 0,5 ml/minute et le volume d'échantillon injecté = 6 mcl (l'abréviation mcl signifie microlitres) et la densité optique de l'effluent était égale à 260 nm. L'étalonnage de la colonne a été effectué en utilisant des standards de sulfonate de polystyrène (sels sodiques) ayant un poids moléculaire connu (fournisseur : Polymers Laboratories Limited). On a utilisé deux solutions, à savoir les solutions A et B pour l'étalonnage. Chacune des deux contenait 4 standards à une concentration de 0,25%.Dans la solution A, les quatre sulfonates de polystyrène avaient les poids moléculaires suivants : 1800, 8000, 46.000, 200.000, tandis que dans la solution B, ils avaient les poids moléculaires suivants : 4600, 18.000, 100.000, 400.000.
TABLEAU I
LIMITES DE VARIATION DES PARAMETRES ANALYTIQUES CARACTERISANT LES OLIGODESOXYRIBONUCLEOTIDES DE LA PRESENTE INVENTION
L'injection de chaque solution a été répétée trois fois dans l'ensemble. L'échantillon a été injecté dans les mêmes conditions.
Le paramètre d'hyperchromicité h a été déterminé par la manière décrite dans "Methods of Enzymology", volume III, pp. 708-712 (voir également page 3 de WO 87/06235).
La rotation optique a été déterminée sur un polarimètre automatique pour la raie du D sodium en utilisant un échantillon de solution dans l'eau à 1% en poids par volume (sur base du poids sec) thermostatisé à 20*C.
Le calcul du rapport molaire de base A+T/C+G et A+G/C+T nécessitait la détermination préliminaire du pourcentage pondéral correspondant de chaque base dans l'échantillon correspondant d'oligodésoxyribonucléotides. L'analyse a été effectuée par HPLC sur une colonne échangeuse d'ions après hydrolyse de l'échantillon, de la manière décrite dans EP 360882.
Les procédés permettant d'obtenir ces substances sont les suivants : - Précipitation par étapes du polymère dans des solutions aqueuses d'acétate de sodium 0,8 M contenant une quantité de sels sodiques de polydésoxyribonucléotides égale à 4% de poids en volume ayant un poids moléculaire compris dans l'intervalle 15.000 - 75.000 daltons. Le procédé a été mis en oeuvre à la température de 20ec et la précipitation a été réalisée en ajoutant à la solution un alcool alkylique inférieur choisi dans le groupe constitué des alcools éthylique, propylique et isopropylique, conformément aux étapes mentionnées ci-dessous : a. addition de 0,8 volume d'alcool à la solution d 'acétate de sodium 0,8 M contenant 4% poids/ volume de polydésoxyribonucléotides, afin de précipiter la majeure partie de la fraction de polydésoxyribonucléotides à poids moléculaire élevé. b. A la solution hydraalcoolique obtenue au point a. ci-dessus et contenant 0,8 volume d'alcool, on ajoute plus d'alcool afin d'obtenir au total un volume de phase organique par volume de phase aqueuse intiale. Le liquide surnageant est ensuite éliminé et le précipité formé contenant la fraction de polydésoxyribonucléotides à poids moléculaire élevé mélangée aux polymères de la présente invention est récupéré et traité ensuite de la manière décrite à l'étape d. ci-après. c. Le liquide surnageant de l'étape b. précédente est mélangé à une quantité supplémentaire d'alcool, de façon à obtenir finalement 2 volumes d'alcool par volume de solution aqueuse initiale de tampon d 'acétate de sodium 0,8 M obtenue au point a. Dans ces conditions, les oligodésoxyribonucléotides de la présente invention se séparent et sont ensuite récupérés. d. Le précipité obtenu à l'étape b. est dissous dans l'acétate de sodium 0,8 M. La fraction de polydésoxyribonucléotides à poids moléculaire élevé est ensuite éliminée par précipitation en ajoutant un volume d'alcool par volume de solution aqueuse. Le précipité est éliminé par centrifugation et la solution aqueuse alcoolique restante est mélangée avec de l'alcool pour obtenir une quantité totale de solvant organique égale à 2 volumes par volume de la phase aqueuse. Le précipité ainsi formé est constitué des oligonucléotides de la présente invention est alors récupéré.
Conformément à une méthode en variante distincte de celle mentionnée ci-dessus, on pourrait également réaliser seulement une précipitation intermédiaire en ajoutant un volume d'alcool à la solution aqueuse initiale. Dans ces conditions, le liquide surnageant est mélangé à un volume d'alcool supplémentaire et on obtient ainsi par précipitation les polymères recherchés. En tout cas, ce procédé donne lieu à des rendements plus faibles. Dépolymérisation thermique des sels sodiques des acides désoxyribonucléiques à poids moléculaire élevé dans une solution aqueuse de tampon acide acétique/acétate de sodium 0,5 M, pH 4,1.
Ledit procédé est réalisé à une température variant entre 65eC et 75eC pendant une durée d'au moins 6 heures, et de préférence inférieure à 10 heures, cette durée dépendant en tout cas du poids moléculaire de l'acide nucléique de départ. La dépolymérisation est contrôlée en déterminant le poids moléculaire du polymère à des intervalles fixes . Le procédé est poursuivi jusqu'à ce que le poids moléculaire soit réduit dans les limites correspondantes indiquées au tableau I.
La concentration de l'acide désoxyribonucléique dans ledit tampon d'acétate de sodium 0,5 M est égale à 4% poids/volume ou autrement égale à environ 12% poids/ volume lorsqu'il s'avère qu'une concentration plus élevée donne lieu à des résultats quelque peu meilleurs (voir exemples 6 - 11). Le procédé comporte les étapes suivantes : a. Dissolution des acides désoxyribonucléiques à poids moléculaire élevé et addition subséquente d'acétate de sodium trihydratë + acide acétique concentré (80%) pour obtenir la molarité et le pH du tampon requis. b. Chauffage de la solution aqueuse visqueuse obtenue au point a. précédent,à une température variant entre 65°C et 75°C pendant une durée d'au moins 6 heures. c. Diminution,à la fin du traitement thermique, du point b. de la température jusqu'à 30°C, correction du pH jusqu'à 7,8 à 8,0 avec NaOH 30%, puis nouveau chauffage à 85°C pendant 90 minutes, d. Refroidissement de la solution à température ambiante. Correction du pH jusqu'à 6,5 avec de l'acide acétique concentré et précipitation des oligodésoxyribonucléotides par addition d'éthanol avec un rapport variant entre 1,5 et 2 volumes par volume de solution aqueuse. - Dépolymérisation par désoxyribonucléase des acides désoxyribonucléiques à poids moléculaire élevé et étape ultérieure d'ultrafiltration afin de concentrer la solution. L'enzymolyse est effectuée sur des acides nucléiques à poids moléculaire élevé à 1% poids/volume pendant une durée de 24 heures dans un tampon de phosphate 0,1 M à pH 7,0, en présence de chlorure de magnésium 10 mM. A la fin, l'étape d'ultrafiltration est effectuée comme suit : a. Ultrafiltration de la solution sur une membrane ayant une limite de coupure de 10.000 daltons, jusqu'à ce que le volume de la solution soit réduit jusqu'à 1/5 du volume initial. b. Dessalement de la solution retenue par dialyse de celle-ci sous volume constant (c'est-à-dire par addition d'eau à la solution, afin de maintenir le volume de celle-ci identique au volume initial) par rapport à 5 volumes au total d'eau distillée. c. Concentration de l'ensemble des liquides ayant traversé la membrane et recueillis au cours des étapes précédentes a. et b. jusqu'à 1/5 du volume initial, par ultrafiltration sur une membrane ayant une limite de coupure de 3.000 daltons. d. Récupération des substances dissoutes dans les liquides retenus à la première étape (coupure à 10.000 daltons, étape a.) et à la deuxième étape (coupure à 3.000 daltons,étape c.) d'ultrafiltration en ajoutant au prélable du sel aux solutions précitées jusqu'à une concentration de sel = 0,8 M, ledit sel étant de préférence de l'acétate de sodium et précipitation ultérieure par addition de 1,5 volume d'éthanol par volume de phase aqueuse.
En variante, au lieu des deux étapes d'ultrafiltration mentionnées ci-dessus, la concentration de la solution peut être effectuée en utilisant la méthode suivante: a. Ultrafiltration sur une membrane à limite de coupure de 3.000 daltons, jusqu'à ce que le volume de liquide retenu soit égal à 1/5 du volume initial. b. Dessalement de la solution retenue par dialyse de celle-ci sous volume constant vis-à-vis de 5 volumes au total d'eau distillée. c. Récupération des substances dissoutes du liquide retenu de la manière décrite ci-dessus au point d.
Ledit procédé permet d'obtenir à peu près le même rendement que le précédent, avec pour avantage que le mode opératoire est plus simple.
Dans tous les procédés décrits ci-desus, le composé est obtenu ensuite en traitant le précipité par déshydratation, broyage et séchage ultérieur.
Le tableau II indique le profil analytique de ces préparations, qui ont été utilisées pour des essais pharmacologiques qui seront décrits ci-dessous.
Le code de laboratoire P0067.D V de la préparation d'oligodésoxyribonucléotides ayant un poids moléculaire inférieur à 10.000 et présentant une activité anti-ischémique beaucoup plus faible que les polymères de la présente invention est obtenu par la méthode par fractionnement décrite à l'exemple 15. Cette préparation présente les données analytiques suivantes (sur base de poids sec) : poids moléculaire 6600; H 1,4; A+T/G+C 1,494; A+G/T+C 0,914, rotation spécifique + 37,2.
Il convient de mentionner que la même méthode de fractionnement utilisée pour obtenir P0067.D V donne en tout cas un produit ayant les mêmes caractéristiques analytiques, c'est-à-dire ayant une valeur élevée du rapport molaire A+T/G+C lorsqu'on l'applique à d'autres lots d'acides désoxyribonucléiques dépolymérisés. Une démonstration appropriée est donnée à l'exemple 16.
TABLEAU II
Caractéristiques physico-chimiques et chimiques des préparations d'oligonucléotides utilisées pour les essais pharmacologiques. Le code de laboratoire est indiqué en tête de , rhamip r.nl nnnp
* Rapport molaire.
Le tableau III indique les données de l'activité fibrinolytique des composés de la présente invention, de la préparation P0067.D V et à titre de comparaison de la plasmine, agent fibrinolytique, un enzyme protéolytique dérivé du plasminogène. Il est intéressant de mentionner que la plasmine est également utilisée en thérapeutique humaine. L'activité a été exprimée en mcg de paranitroanilide (pNA) hydrolysée en partant du substrat de peptide S-2251 auquel pNA est lié par covalence.
Ladite liaison est sélectivement susceptible d'être soumise à l'action des agents fibrinolytiques.
Par conséquent, la quantité de pNA dégagée dans la solution est en rapport direct avec l'activité fibrinolytique du composé essayé. L'activité fibronolytique a été vérifiée in vitro en utilisant le tripeptide S-225 (dichlorhydrate de H-D-valil-L-leucil-L-lysine paranitroanilide Kabi-Milan) de la manière décrite essentiellement par J.H. Verheijen et Alii dans "A simple sensitive spectrophotometric assay for extrinsic (tissue-type) plasminogen activator applicable to measurements in plasma" Thromb. Haemostas 48 (3) 266-269 (1982).
La fraction en globuline du plasma a été préparée en recueillant du sang (8 ml) de la veine marginale de l'oreille du lapin au moyen d'une seringue contenant déjà 2 ml d'une solution de citrate de sodium tribasique à 3,8% poids/volume. Le plasma obtenu par centrifugation est alors divisé en parties aliquotes de 0,5 ml et on ajoute à chaque partie aliquote 1 ml de la solution d'oligonucléotides de façon à obtenir finalement les deux concentrations d'échantillons suivantes : 200 et 800 mcg/ml de plasma (mcg signifie microgrammes). On ajoute aux solutions 0,1 ml de solution aqueuse d'urokinase (50 U./ml) pour transformer le plasminogène en plasmine. On ajoute de l'acide acétique afin de porter le pH à 5,4,puis le volume de la solution est porté à 8,5 ml en ajoutant de l'eau distillée à +4eC afin de provoquer la précipitation de l'euglobuline. L'étape est complétée en transférant les tubes à essai dans un réfrigérateur (+4°c) pendant 2 heures. La centrifugation est effectuée ensuite pendant 10 minutes et le liquide surnageant est éliminé. Le résidu est repris par 0,3 ml de la solution tampon de trichlorhydrate à pH 7,4 afin d'obtenir une suspension. On ajoute à 0,3 ml de la suspension 0,4 ml de tampon de trichlorhydrate et on fait incuber ensuite pendant encore 10 minutes à 37°C. On ajoute ensuite le tripeptide S-2251 (8,25 mg de la substance dans 5 ml d'eau distillée) et on la fait incuber à la même température pendant encore 5 minutes. On interrompt l'enzymolyse en ajoutant 0,1 ml d'acide acétique à 1% et 0,6 ml de NaCl 0,15 M. La quantité de chromogènes dégagée dans les solutions d'essai est déterminée par spectrophotométrie. La courbe standard de référence est obtenue en utilisant de la plasmine bactérielle U.S. (Biosintex) essayée suivant le même essai avec les doses suivantes : 40, 80, 160 et 320 mcg. Les essais sont répétés six fois au total, chaque échantillon étant essayé ainsi que les 4 concentrations précitées de plasmine.
Les résultats sont indiqués au tableau III.
Une caractéristique générale découlant des données du tableau III est que les oligodésoxyribonucléo tides ayant un poids moléculaire inférieur à 10.000 présentent une activité fibrinolytique faible, voire même nulle. D'ailleurs, ceci pouvait déjà être prévu, compte tenu de l'enseignement du document WO 87/06235. L'activité anti-ischémique a été mesurée ex-vivo sur des coeurs de lapins isolés et perfusés, de la manière décrite essentiellement par P.D. Henry dans le document " Myocardial contracture and accumulation of mitochondrial calcium in ischemia rabbit heart", Am. J. physiol. 233, 1977.
Les composés d'essai ont été perfusés en commençant 40 minutes avant l'évènement ischémique, à la concentration de 400 mcg/ml et avec un débit de 20 ml/ minute.
Pendant la phase ischémique (40 minutes), le débit a été réduit à 0,2 ml/minute. A la fin de cette phase, le débit initial a été rétabli et maintenu pendant encore 20 minutes. L'essai a été répété 6 fois au total. Pendant la phase ischémique et la re-perfusion ultérieure, la pression télédiastolique du ventricule gauche des coeurs traités a été déterminée ainsi que les valeurs relatives au groupe non traité (groupe témoin).
Le tableau IV indique les activités anti-ischémiques des composés à l'examen et déterminées, comme l'indique ledit tableau, à la fois pendant la phase ischémique et après la phase de re-perfusion. Ledit tableau montre clairement que les oligodésoxyribonucléotides présentant le profil analytique indiqué au tableau I présentent une activité anti-ischémique significative. Au contraire, la préparation P0067.D V ayant un rapport molairee de base A+T/G+C (1,494) en-dehors des limites 1,100 - 1,455 indiquées au tableau I, présente une activité beaucoup plus faible.
TABLEAU III
Activité fibrinolytique in vitro des nouveaux oligonucléotides évaluée sur le substrat chromogène de tripeptide S-2251
TABLEAU IV
La signification de ces données peut être mieux comprise si l'on prend en considération le fait que, dans ledit modèle expérimental, l'ischémie cardiaque est provoquée en diminuant le débit de liquide de perfusion, le coeur étant atteint par un dommage qui est mis fonctionnellement en évidence par la contraction ventriculaire. Au cours de la phase ultérieure de reperfusion lorsqu'on rétablit les conditions initiales de débit, on provoque un dommage encore plus grave vu qu'il se produit non seulement une augmentation de la pression diastolique déjà observée au cours de la phase précédente mais également l'apparition concomitante d'arythmie cardiaque.
Les données du tableau IV permettent de tirer la conclusion que, au cours de la phase finale de reperfusion, les oligonucléotides de la présente invention assurent une protection notable contre l'ischémie provoquée expérimentalement et maintiennent donc essentiellement l'activité de contraction régulière du coeur avec réduction de la résistance diastolique de celui-ci.
En conséquence de ce qui vient d'être démontré ci-dessus, on peut conclure que les nouveaux composés peuvent être utilement utilisés pour la thérapie de l'ischémie cardiaque. D'autres objectifs de la présente invention concernent les formes de dosage contenant les nouvelles substances comme principe actif. Lesdites formulations peuvent être utilisées par administration orale ou parentérale.
Les compositions parentérales peuvent se présenter sous forme de solutions stériles et apyrogénétiques en ampoules scellées, ou sinon sous forme de lyophilisats contenus dans des bouteilles scellées, à dissoudre au moment voulu dans des solvants aqueux stériles.
Les solvants aqueux à utiliser peuvent être des solutions isotoniques préparées en utilisant des tampons classiques (citrates, phosphates et analogues) et des préservants connus.
Des formulations orales peuvent être disponibles sous forme de pastilles,de pastilles enduites, de capsules de gélatine et de granulés.
Lesdites formes de dosage peuvent être préparées en utilisant des techniques connues.
Par exemple, des formes de dosage orales peuvent être préparées en comprimant directement des poudres ou des granulés et elles peuvent contenir des liants, des lubrifiants et des agents de désagrégation connus.
Les formes de dosage pour administration parentérale peuvent contenir de 40 à 200 mg/ml du principe actif, et de préférence de 80 à 160 mg/ml (pour les lyophilisats, les chiffres précédents se rapportent à la concentration finale de la substance dans le solvant stérile), tandis que les concentrations pour administration orale sont comprises entre 200 et 1500 mg par dose unitaire. EXEMPLE 1. Séparation des oligonucléotides conformes à la présente invention (préparations P0085.C et P0085.M II) par précipitation fractionnée dans une solution aqueuse de défibrotide en présence d'acétate de sodium par addition d'éthanol.
On dissout 420 g de défibrotide (lot 82) dans 10,5 1 (concentration finale 4% poids/volume) et on ajoute 1155 g d'acétate de sodium trihydratë (0,8 M). La solution est thermostatisée à 20°C. On ajoute ensuite 0,8 volume d'éthanol à 95%. Le liquide surnageant est récupéré par centrifugation (le précipité constitué de polydësoxyribonucléotides à poids moléculaire élevé est éliminé) et on ajoute 0,2 volume d'éthanol (volume total de la phase organique/phase aqueuse = 1). On effectue à nouveau une centrifugation. Le précipité est récupéré, déshydraté, séché et broyé. On recueille dans l'ensemble 97,6 g (préparation P0085.B, constituée d'un mélange des oligodésoxyribonucléotides de la présente invention avec des polydësoxyribonucléotides). On ajoute encore de l'éthanol au liquide surnageant afin d'obtenir 2 volumes de solvant organique par volume de phase aqueuse. On récupère ainsi 40,5 g d'un solide (préparation P0085.C).
On dissout 97,6 g de P0085.B dans 2,45 1 d'eau distillée et on ajoute 269,5 g d'acétate de sodium trihydraté. La solution est thermostatisée à 20eC.
On ajoute ensuite 1 volume d'éthanol et la suspension obtenue est centrifugée. On ajoute encore de l'éthanol au liquide surnageant afin d'obtenir un rapport final de la quantité totale d'éthanol à la quantité de solution aqueuse = 2. On récupère alors 31,2 g (préparation P0085.M II).
La quantité totale d'oligodésoxyribonucléotides recueillie, c'est-à-dire P0085.C + PQ085.M II, est égale à 71,7 g (17,1%). EXEMPLE 2. Séparation des oligonucléotides (préparation P0085.D IV) par précipitation fractionnée avec de l'éthanol en présence d'acétate de sodium dans une solution aqueuse contenant du défibrotide.
On dissout dans 500 ml d'eau distillée, 20 g d'une préparation de défibrotide ayant un poids moléculaire de 17.000 daltons. On ajoute 55 g d'acétate de sodium trihydraté et la solution transparente obtenue est thermostatisée à 20eC. On ajoute ensuite 500 ml (1 volume) d'éthanol et le précipité est recueilli par centrifugation à 3000 t/m pendant 5 minutes. On ajoute au liquide surnageant 500 ml (c'est-à-dire au total 2 volumes par rapport au volume de la phase aqueuse) d'éthanol. Le solide est récupéré, déshydraté, broyé et séché dans une étuve. On obtient ainsi 2,10 g avec un rendement de 10,5%. EXEMPLE 3. Séparation des oligonucléotides (préparation P0085.D V) par précipitation fractionnée par l'éthanol en présence d'acétate de sodium dans une solution aqueuse de polydésoxyribonucléotides.
On dissout dans 500 ml d'eau distillée 20 g de sel sodique de polydésoxyribonucléotide ayant un poids moléculaire de 43.000 daltons. On applique ensuite la méthode décrite à l'exemple 2 précédent. On obtient ainsi finalement 1,46 g (rendement 7,3%). La substance ainsi isolée a les caractéristiques analytiques suivantes (données rapportées au poids sec) : poids moléculaire 6700; h 3,4; A+T/G+C 1,375; G+A/T+C 0,825; rotation spécifique +43,4. EXEMPLE 4. Séparation des oligonucléotides (préparation P0085.D VI) par la méthode de l'exemple 2.
On traite 20 g de défibrotide du lot ne 157 ayant un poids moléculaire de 26.200 de la même manière qu'audit exemple. On recueille finalement 1,54 g (rendement 7,7%). Les données analytiques (données sur base du poids sec) sont les suivantes : poids moléculaire 5900; h 5,7; A+T/G+C 1,343; A+G/T+C 0,835; rotation spécifique +41,6. EXEMPLE 5. Sépararation des oligonucléotides (préparation P0085.D VII) par précipitation fractionnée à l'éthanol en présence d'acétate de sodium dans une solution aqueuse de polydésoxyribonucléotide.
On dissout dans 500 ml d'eau distillée 20 g du sel sodique de polydésoxyribonucléotide ayant un poids moléculaire de 75.000 daltons. On applique ensuite la méthode décrite à l'exemple 2 ci-dessus. On obtient ainsi 0,78 g (3,9%) d'un composé ayant les caractéristiques suivantes (données sur base du poids sec) : poids moléculaire 6100; h 7,1; A+t/G+C 1,415; G+A/C+T 0,860; rotation spécifique +43,6. EXEMPLE 6.
Préparation des oligonucléotides de la présente invention par dépolymérisation chimique dans un tampon aqueux d'acétate de sodium et d'acide acétique (préparation PO130.A)
On dissout 800 g d'acide désoxyribonucléique à poids moléculaire élevé (poids moléculaire supérieur à 700.000) dans 5280 ml de H20 avec chauffage modéré. On ajoute 426,4 g d'acétate de sodium trihydraté puis 1,016 ml d'acide acétique à 80% (acide acétique concentré) sont ensuite ajoutés afin de porter le pH à 4,1, puis la solution visqueuse (concentration finale de polymère 12,7%, poids en volume; concentration molaire d'acétate de sodium 0,5 M) est chauffée à 75eC pendant 6 heures. Après cette période, la température est abaissée jusqu'à 30°C et le pH est porté à 7,8 - 8,0 avec NaOH 30% et la solution est chauffée à nouveau à 85eC pendant 90 minutes. Après refroidissement, le pH est porté à 6,5 avec CH3COOH à 80%. On réalise la précipitation en ajoutant 1,5 volume d'éthanol par volume de phase aqueuse. Le solide récupéré est lavé, broyé et séché. On obtient ainsi 745 g (rendement 93,1%). EXEMPLE 7.
Préparation des oligonucléotides de la présente invention par dépolymérisation chimique dans un tampon aqueux d'acétate de sodium et d'acide acétique (préparation P0.130.C).
On traite 800 g d'acide désoxyribonucléique à poids moléculaire élevé de la même manière qu'à l'exemple 6. On obtient finalement 765 g de produit (rendement 95,6%). EXEMPLE 8.
Préparation des nouvelles substances par dépolymérisation dans une solution tampon d'acide acétique et d'acétate de sodium (préparation P0097.N).
On dissout 50 g d'acides nucléiques à poids moléculaire élevé à une température de 70ec dans 1 1 d'eau. On ajoute ensuite 80 g de CH3C00Na.3H20 et 190 ml de CH3COOH 80% (pH final 4,1) (concentration de polymère 4% poids/volume; concentration molaire de l'acétate de sodium 0,5 M). La solution obtenue est chauffée pendant 24 h à 70eC. On refroidit ensuite et la température est abaissée à 30eC, puis on opère de la manière décrite à l'exemple 6 précédent. On obtient 33,5 g de produit (rendement 67%). La composition (sur base du poids sec) est la suivante : poids moléculaire .8100; h 5j3; A+T/G+C 1,037; A+G/T+C 0,865; rotation spécifique +32,5. EXEMPLE 9.
Préparation des nouvelles substances par dépolymérisation en tampon aqueux d'acide acétique et d'acétate de sodium (préparation P0097.M).
On traite 50 g d'acides nucléiques à poids moléculaire élevé de la manière décrite à l'exemple 8, mais la durée de dépolymérisation est réduite à 16 heures et la précipitation est obtenue en ajoutant 2 volumes d'éthanol. On récupère 35,5 g (rendement 71%). Analyses (sur base du poids sec) : poids moléculaire 6200; h 1,0; A+T/G+C 1,167; A+G/T+C 0,830; rotation spécifique +30,9. EXEMPLE 10.
Préparation des oligonucléotides par dépolymérisation dans un tampon aqueux d'acide acétique et d'acétate de sodium (préparation P0123.B).
On dissout 100 g d'acides nucléiques à poids moléculaire élevé dans 660 ml de H20. On effectue la dissolution avec chauffage modéré. On ajoute dans l'ordre 53,5 g de CH3C00Na.3H20 et 127 ml d'acide acétique à 80%.
Le pH final est égal à 4,1 et la concentration de polymère est égale à 12,7% poids/volume (concentration molaire du sel 0,5 M). La solution obtenue est ensuite chauffée à 65°C pendant 16 heures et est ensuite traitée de la manière décrite à l'exemple 6. On obtient 78,6 g de produit. Analyse (sur base du poids sec) : poids moléculaire 9400; h 6,4; A+T/G+C 1,174; A+G/T+C 0,941; rotation spécifique +38,9. EXEMPLE 11.
Préparation des oligonucléotides par dépolymérisation dans un tampon aqueux d'acide acétique et d'acétate de sodium (préparation P0123.H).
On traite 100 g d'acides désoxyribonucléiques à poids moléculaire élevé de la manière décrite à propos de l'exemple 10. La durée de la dépolymérisation est fixée à 22 heures. On obtient 85,9 g. Analyse (sur base du poids sec) : poids moléculaire 7000; h 1,9; A+T/G+C 1,305; A+G/T+C 0,875; rotation spécifique +35,4. EXEMPLE 12.
Préparation des oligonucléotides selon la présente invention par dépolymërisation enzymatique des acides désoxyribonucléiques à poids moléculaire élevé au moyen de la désoxyribonucléase (préparations PO102.A et PO102.B).
On dissout 10 g de sel sodique d'acides nucléiques à poids moléculaire élevé dans 1 1 de tampon de phosphate 0,1 M pH 7 et MgCl2 10 mM.
On ajoute à la solution visqueuse et opalescente finale 3,67 g de désoxyribonucléase brute. On effectue l'enzymolyse à 37°C pendant 24 heures. A la fin, le volume de la solution est réduit au 1/5 du volume initial par ultrafiltration sur une membrane ayant une limite de coupure de 10.000 daltons. On recueille 0,8 1 de liquide ayant traversé la membrane.
Le concentré (liquide retenu) est dessalé par dialyse de celui-ci à volume constant vis-à-vis de 1 1 d'eau et est précipité en ajoutant 22 g d'acétate de sodium trihydraté (0,8 M) suivi de 1,5 volume d'éthanol.
On obtient 4,88 g (rendement 49%) (préparation PO102.A).
Les liquides ayant traversé la membrane au cours des étapes précitées d'ultrafiltration et de dessalement sont mélangés et concentrés jusqu'à 1/5 du volume initial par ultrafiltration sur une membrane ayant une limite de coupure de 3000 daltons.
La solution est ensuite dessalée par dialyse de celle-ci à volume constant vis-à-vis de 5 volumes d'eau et elle est lyophilisée.
On obtient 24,7 g (rendement 25%) (préparation PO102.B). EXEMPLE 13.
Préparation des oligonucléotides par dépolymérisation enzymatique d'acides désoxyribonucléiques à poids moléculaire élevé au moyen de la désoxyribonucléase (préparations 0186/91220A et 0186/91220B).
On dissout 5,5 g du sel sodique d'acides désoxyribonucléiques à poids moléculaire élevé dans 1 1 de tampon de phosphate 0,1 M pH 7 contenant 10 mM de MgCl2. On applique ensuie la méthode de l'exemple précédent 12.
On obtient dans la solution retenue 1,14 g (20,7%) du composé (0186/91220.A) ayant les caractéristiques analytiques suivantes (données sur base du poids sec) : poids moléculaire 5000; h 5,4; A+T/C+G 1,266; A+G/T+c 1,106; rotation spécifique +39,1.
De la solution ayant traversé la membrane, on retire 2,20 g (40%) du composé (0186/91220.B) ayant les caractéristiques suivantes; (données sur base du poids sec) ; poids moléculaire 4600; h 0,8; A+T/G+C 1,168; A+G/T+C 1,087; rotation spécifique +37,4. EXEMPLE 14.
Préparation des oligonucléotides par dépolymérisation enzymatique des acides désoxyribonucléiques à poids moléculaire élevé (préparation 0186/91217).
On dissout 11 g d'acides nucléiques à poids moléculaire élevé dans 1,1 1 du tampon mentionné à l'exemple précédent. On effectue la digestion en utilisant de la désoxyribonucléase suivant la méthode de l'exemple 12. Le volume de la solution est ensute réduit à 1/5 du volume initial par ultrafiltration sur une membrane ayant une limite de coupure de 3000 daltons. Après dessalement du liquide retenu par dialyse de celui-ci sous volume constant vis-à-vis de 5 volumes d'eau distillée, la solution est salée et précipitée de la manière décrite à l'exemple 12 dans la préparation de PQ102.A. On obtient finalement 8,25 g (75%) d'un produit ayant les caractéristiques suivantes (données sur base du poids sec) : poids moléculaire 5600; h 5,8; A+T/G+C 1,140; A+G/C+T 1,010; rotation spécifique +41,5. EXEMPLE 15. Méthode utilisée pour obtenir P0067.D V.
On ajoute à 68 1 des liqueurs-mères provenant de la précipitation des polydésoxyribonucléotides obtenus par dépolymérisation de l'acide désoxyribonucléique à poids moléculaire élevé (préparation de défibrotide, lot n° 73) suivant la méthode décrite dans le document WO/87/06235 et contenant encore une quantité théorique de 1250 g d'acides désoxyribonucléiques, 1 partie de solution aqueuse de tampon acétate et 1,5 partie d'éthanol, une quantité supplémentaire de 13,6 1 (0,5 partie) du même solvant organique et le produit ainsi précipité a un poids de 36,4 g. EXEMPLE 16. Séparation de la préparation P0067.D IV.
On traite, comme à l'exemple 15, 68 1 des liqueurs-mères provenant de la précipitation des polydésoxyribonucléotides obtenus par dépolymérisation des acides désoxyribonucléiques à poids moléculaire élevé (préparation de défibrotides, lot ne 72) suivant la méthode décrite dans le document WO/87/06235 et contenant encore une quantité théorique de 1250 g d'acides désoxyribonucléiques. On obtient ainsi 34,8 g de la préparation P0067.D IV ayant les caractéristiques analytiques suivantes (données sur base du poids sec) : poids moléculaire 6100; h 0; A+T/C+G 1,508; A+G/T+C 0,917; rotation spécifique +35,9. EXEMPLE 17.
Composition pharmaceutique pour application parentérale. Ampoules scellées. oligodésoxyribonucléotides 250 mg citrate trisodique dihydraté 25 mg p-hydroxybenzoate de méthyle 3,13mg p-hydroxybenzoate de propyle 0,62mg eau distillée 2,5 ml EXEMPLE 18.
Composition pharmaceutique pour utilisation orale.
Capsules de gélatine dure. oligodésoxyribonucléotides 350 mg lactose 56,75 mg dioxyde de silicium colloïdal 0,7 mg stéarate de magnésium 3 mg
Claims (30)
1. Désoxyribonucléotides d'origine naturelle, caractérisés par les paramètres analytiques suivants : poids moléculaire 4000 - 10.000, h 10, A+T/C+G 1,100 -1,455, A+G/C+T 0,800 - 1,160, rotation spécifique +30° -+48".
2. Procédé de préparation des oligodésoxy-ribonucléotides de la revendication 1, caractérisé en ce que lesdits composés sont obtenus par précipitation par étapes à 20"C dans des solutions aqueuses d'acétate de sodium 0,8 M de sels sodiques de polydésoxyribo-nucléotides par addition d'un alcool alkylique inférieur.
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit alcool alkylique inférieur est choisi dans le groupe constitué des alcools éthylique, propylique et isopropylique.
4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que ledit alcool alkylique inférieur est de l'alcool éthylique.
5. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la quantité de sel sodique de polydésoxyribonucléotides est égale à 4% poids/volume.
6. Procédé selon les revendications 2 et 5, caractérisé en ce que ledit sel sodique de polydésoxy-ribonucléotides a un poids moléculaire compris dans l'intervalle de 15.000 à 75.000 daltons.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le polydésoxyribonucléotide est du défibrotide.
8. Procédé selon les revendications précédentes 2 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a. addition de 0,8 volume d'alcool à la solution d'acétate de sodium 0,8 M contenant 4% poids/ volume de polydésoxyribonucléotides. b. Addition supplémentaire à ladite solution hydro-alcoolique d'une quantité supplémentaire d'alcool afin d'obtenir au total un volume de phase organique pour un volume de phase aqueuse intiale et élimination ultérieure du liquide surnageant avec récupération du précipité formé. c. Mélange du liquide surnageant provenant de l'étape b. précédente avec une quantité supplémentaire d'alcool, de façon à obtenir 2 volumes d'alcool par volume de solution aqueuse initiale de tampon d'acétate de sodium 0,8 M obtenue au point a. et récupération de la substance séparée dans ces conditions. d. Mise en solution du précipité obtenu à l'étape b. dans de l'acétate de sodium 0,8 M, addition de 1 volume d'alcool par volume de la solution aqueuse, élimination du précipité formé par centrifugation, mélange de la solution aqueuse alcoolique restante avec de l'alcool pour obtenir au total 2 volumes d'alcool par volume de phase aqueuse et récupération du précipité.
9. Procédé selon les revendications 2 à 7, caractérisé en ce qu'on effectue une précipitation intermédiaire en ajoutant un volume d'alcool à la solution initiale de polydésoxyribonucléotides et en ajoutant au liquide surnageant une quantité supplémentaire de 1 volume d'alcool, de façon à provoquer ainsi la précipitation des polymères.
10. Procédé de préparation des composes de la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est réalisé par dépolymërisation thermique des sels sodiques des acides désoxyribonucléiques à poids moléculaire élevé dans une solution aqueuse tampon d'acide acétique/acétate de sodium 0,5 M, pH 4,1.
11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il est réalisé à une température variant entre 65"C et 75°C pendant une durée d'au moins 6 heures, dépendant du poids moléculaire de l'acide nucléique de départ.
12. Procédé selon les revendications 10 et 11, caractérisé en ce que la dépolymérisation est effectuée jusqu'à ce que le poids moléculaire tombe dans l'intervalle de 4000 à 10.000 daltons.
13. Procédé selon les revendications 10 à 12, caractérisé en ce que la concentration de l'acide désoxyribonucléique dans ledit tampon d'acétate de sodium à 0,5 M est égale à 4% poids/volume, ou sinon est égale à environ 12% poids/volume.
14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que la concentration de l'acide désoxyribonucléique est égale à environ 12%.
15. Procédé selon les revendications 10 à 14, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a. Dissolution des acides désoxyribonucléiques à poids moléculaire élevé et addition ultérieure d'acétate de sodium trihydraté et d'acide acétique concentré (80%) pour obtenir la concentration molaire et le pH du tampon requis. b. Chauffage de la solution aqueuse obtenue au point a. précédent, à une température variant entre 65eC et 75°C pendant une période d'au moins 6 heures. c. Diminution, à la fin du traitement thermique, de la température jusqu'à 30°C, correction du pH jusqu'à 7,8 - 8,0 avec NaOH 30%, puis nouveau chauffage à 85°C pendant 90 minutes. d. Refroidissement de la solution jusqu'à température ambiante. Correction du pH jusqu'à 6,5 avec de l'acide acétique concentré et précipitation des oligodésoxyribonucléotides par addition d'éthanol suivant un rapport variant entre 1,5 et 2 volumes par volume de la solution aqueuse.
16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que la durée de chauffage à une température variant entre 65°C et 75 eC est inférieure à 10 heures.
17. Préparation des oligodésoxyribonucléotides de la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comporte une dépolymérisation enzymatique des acides désoxyribonucléiques à poids moléculaire élevé en utilisant de la désoxyribonucléase avec une étape ultérieure d'ultrafiltration afin de concentrer la solution.
18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que cette enzymolyse par la désoxyribonucléase est effectuée dans des solutions d'acide nucléique à poids moléculaire élevé à 1% en poids/volume pendant une durée de 24 heures dans un tampon de phosphate 0,1 M pH 7, en présence de chlorure de magnésium 10 mM.
19. Procédé selon les revendications 17 et 18, caractérisé en ce que la concentration par ultrafiltration est réalisée suivant les étapes suivantes : a. Ultrafiltration de la solution provenant de 1'enzymolyse (liquide retenu) sur une membrane ayant une limite de coupure de 10.000, jusqu'à ce que le volume de la solution soit égal à 1/5 du volume initial. b. Dessalement de la solution retenue par dialyse de celle-ci sous volume constant vis-à-vis de 5 volumes d'eau distillée. c. Concentration de l'ensemble des liquides ayant traversé la membrane et recueillis aux étapes précédentes a. et b. jusqu'à 1/5 du volume initial, par ultrafiltration sur une membrane ayant une limite de coupure de 3.000 daltons. d. Récupération des substances dissoutes des solutions concentrées des liquides retenus provenant respectivement de la première ultrafiltration (étape a.) et de la deuxième ultrafiltration (étape c.).
20. Procédé selon les revendications 17 et 18/ caractérisé en ce que la concentration de la solution est réalisée en utilisant les étapes suivantes : a. Ultrafiltration sur une membrane ayant une limite de coupure de 3000 daltons, jusqu'à ce que le volume de liquide retenu soit égal à 1/5 du volume initial. b. Dessalement de la solution retenue par dialyse de celle-ci sous volume constant vis-à-vis de 5 volumes d'eau distillée. c. Récupération des substances dissoutes dans les liquides retenus.
21. Procédé selon les revendications 19 et 20, caractérisé en ce que cette récupération des substances dissoutes est effectuée par précipitation, par salage préalable de la solution jusqu'à une concentration de sel égale à 0,8 M et par addition ultérieure de 1,5 volume d'éthanol.
22. Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que le sel ajouté est de l'acétate de sodium.
23. Procédé selon les revendications 2-9, 10-16, 17-22, caractérisé en ce que le produit est* obtenu en partant du précipité par déshydratation, broyage et séchage.
24. Oligodésoxyribonucléotides selon la revendication 1 à utiliser comme médicament.
25. Utilisation des oligonucléotides de la revendication 1 pour la préparation de médicaments ayant une activité anti-ischémique.
26. Utilisation des désoxyribonucléotides de la revendication 1 pour la préparation de médicaments pour la thérapie des états d'ischémie cardiaque.
27. Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles contiennent comme principe actif les désoxyribonuclëotides de la revendication 1 ainsi que les véhicules et excipients usuels préparés sous des formes appropriées pour l'administration orale et parentérale.
28. Composition pharmaceutique pour utilisation parentérale selon la revendication 27, caractérisée en ce qu'elle contient les désoxyribonuclëotides en quantités variant entre 40 et 160 mg/ml.
29. Compositions pharmaceutiques selon la revendication 28, caractérisées en ce que la quantité de principe actif est comprise entre 80 et 160 mg/ml.
30. Composition pharmaceutique pour utilisation orale selon la revendication 27, caractérisée en ce qu'elle contient des quantités de principe actif variant entre 200 et 1500 mg/ml par dose unitaire.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ITMI913294A IT1252174B (it) | 1991-12-09 | 1991-12-09 | Oligodesossimibonucleotidi ad attivita' antiischemica e procedimenti per il loro ottenimento |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| LU88197A1 true LU88197A1 (fr) | 1993-05-17 |
Family
ID=11361289
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| LU88197A LU88197A1 (fr) | 1991-12-09 | 1992-12-08 | Nouveaux oligodesoxyribonacleotides ayant une activite anti-ischemique et methode de preparation de ceux-ci. |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6046172A (fr) |
| EP (1) | EP0558833A3 (fr) |
| JP (1) | JPH05247083A (fr) |
| CN (1) | CN1073448A (fr) |
| AU (1) | AU655087B2 (fr) |
| BE (1) | BE1008163A5 (fr) |
| BR (1) | BR9204931A (fr) |
| CA (1) | CA2083416A1 (fr) |
| CH (1) | CH685298A5 (fr) |
| FR (1) | FR2684675B1 (fr) |
| GR (1) | GR1002143B (fr) |
| IL (1) | IL103757A (fr) |
| IT (1) | IT1252174B (fr) |
| LU (1) | LU88197A1 (fr) |
| MX (1) | MX9207137A (fr) |
| PT (1) | PT101113A (fr) |
| ZA (1) | ZA928878B (fr) |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1271685B (it) * | 1994-08-03 | 1997-06-04 | Crinos Industria Farmaco | Impiego dei polidesossiribonucleotidi nelle neuropati diabetiche |
| CA2259041A1 (fr) * | 1997-04-28 | 1998-11-05 | Arsinur Burcoglu | Traitement de l'infection par vih et de ses infections opportunistes |
| DE69928778T2 (de) | 1999-06-08 | 2006-07-06 | Gentium S.P.A., Villa Guardia | Anwendung von Komplexen von kationischen Liposomen und Polydeoxyribonukleotiden wie Arzneimitteln |
| CA2500996C (fr) * | 2002-10-01 | 2010-11-09 | Truck-Lite Co., Inc. | Projecteur a diodes electroluminescentes et ensemble projecteur |
| US7270723B2 (en) * | 2003-11-07 | 2007-09-18 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Microporous breathable elastic film laminates, methods of making same, and limited use or disposable product applications |
| ITMI20031714A1 (it) * | 2003-09-05 | 2005-03-06 | Gentium Spa | Formazioni ad azione antitumorale. |
| JP5714203B2 (ja) * | 2005-03-03 | 2015-05-07 | ゲンチウム エスピーエー | 血管新生依存性腫瘍を治療するためのデフィブロチドおよび／またはオリゴデオキシリボヌクレオチド |
| ITMI20050336A1 (it) * | 2005-03-03 | 2006-09-04 | Gentium Spa | Formulazione ad attivita' anti-tumorale |
| EP1872787A1 (fr) * | 2006-06-27 | 2008-01-02 | Gentium S.p.A. | Utilisation de defibrotide pour l'inhibition de l'heparanase |
| EP1982722A1 (fr) * | 2007-04-16 | 2008-10-22 | Gentium S.p.A. | Utilisation de oligotide pour le traitement de maladies rénales |
| EP2103689A1 (fr) | 2008-03-19 | 2009-09-23 | Gentium S.p.A. | Oligonucléotides phosphodiesters synthétiques et leurs utilisations thérapeutiques |
| JP6069209B2 (ja) | 2010-11-12 | 2017-02-01 | ジェンティウム ソシエタ ア レスポンサビリタ リミタータ | 移植片対宿主病（ｇｖｈｄ）の予防および／または治療に使用するためのデフィブロタイド |
| RU2627177C2 (ru) | 2012-06-22 | 2017-08-03 | Джентиум С.Р.Л. | Способ определения биологической активности дефибротида, основанный на применении эуглобулина |
| EP3026122A1 (fr) | 2014-11-27 | 2016-06-01 | Gentium S.p.A. | Procédé à base cellulaire pour déterminer la puissance de défibrotide |
| JP2020530004A (ja) | 2017-08-03 | 2020-10-15 | ジャズ ファーマシューティカルズ アイルランド リミテッド | 核酸を高濃度で含む製剤 |
| WO2019200251A1 (fr) | 2018-04-12 | 2019-10-17 | Jazz Pharmaceuticals, Inc. | Défibrotide pour la prévention et le traitement du syndrome de libération de cytokines et de la neurotoxicité associée à l'immunodéplétion |
| US20220023533A1 (en) | 2018-12-07 | 2022-01-27 | Jazz Phrmaceticals Ireland Limited | Subcutaneous delivery of high concentration formulations |
| US20230190783A1 (en) | 2020-02-28 | 2023-06-22 | Jazz Pharmaceuticals Ireland Limited | Delivery of low viscosity formulations |
| US20230086833A1 (en) | 2020-04-17 | 2023-03-23 | Jazz Pharmaceuticals Ireland Limited | Defibrotide treatment for the prevention of organ rejection and injury |
| WO2022234101A1 (fr) | 2021-05-06 | 2022-11-10 | Jazz Pharmaceuticals Ireland Limited | Défibrotide pour le traitement et la prévention du syndrome de détresse respiratoire aiguë |
Family Cites Families (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB808296A (en) * | 1955-10-05 | 1959-02-04 | Roland Vercambre | Process for the extraction of nucleic acid and for the preparation of the salts thereof |
| DE1142365B (de) * | 1955-10-05 | 1963-01-17 | Roland Vercambre | Verfahren zur Gewinnung von Nucleinsaeure und deren Salze aus Fischmilch |
| FR1245818A (fr) * | 1959-11-27 | 1960-10-03 | Procédé de préparation d'acides désoxyribonucléiques à haut degré de polymérisation | |
| FR1408585A (fr) * | 1964-09-22 | 1965-08-13 | Schwarz Biores | Isolement et purification de bases hétérocycliques |
| US3899481A (en) * | 1970-11-03 | 1975-08-12 | Crinos Industria Farmaco | Process for the controlled partial degradation of deoxyribonucleic acid extracted from animal organs |
| IT1043823B (it) * | 1970-11-03 | 1980-02-29 | Prephar | Procedimento per l estrazione di acidi nucleici da organi animali |
| JPS5217040B2 (fr) * | 1972-12-07 | 1977-05-12 | ||
| SU780444A1 (ru) * | 1979-06-25 | 1985-04-23 | Специальное Конструкторско-Технологическое Бюро Биологически Активных Веществ Главного Управления Микробиологической Промышленности При Совете Министров Ссср | Способ получени дезоксирибонуклеиновой кислоты |
| US4417046A (en) * | 1981-08-24 | 1983-11-22 | Eli Lilly And Company | Process for isolating oligonucleotide product from a coupling reaction mixture |
| DE3308932A1 (de) * | 1983-03-12 | 1984-09-13 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur abtrennung von ribonukleinsaeuren aus einer loesung, die desoxyribonukleinsaeuren enthaelt |
| SU1161511A1 (ru) * | 1983-07-01 | 1985-06-15 | Институт биоорганической химии АН БССР | Способ осаждени нуклеиновых кислот из растворов,содержащих фосфатный буфер |
| JPS6036493A (ja) * | 1983-08-08 | 1985-02-25 | Nippon Zeon Co Ltd | 保護された核酸関連物質の分離法 |
| IT1206341B (it) * | 1984-02-16 | 1989-04-14 | Crinos Industria Farmaco | Composizione farmaceutica per il trattamento dell'ischemia acuta del miocardio. |
| US4605644A (en) * | 1985-02-07 | 1986-08-12 | Regents Of The University Of Minnesota | Method for stimulating recovery from ischemia employing ribose and adenine |
| IT1190313B (it) * | 1986-04-17 | 1988-02-16 | Crinos Industria Farmaco | Procedimento per l'ottenimento di polidesossiribonucleotidi chimicamente definiti e riproducibili e prodotto farmacologicamente attivo risultante |
| AU618723B2 (en) * | 1986-10-06 | 1992-01-09 | University Of Virginia Alumni Patents Foundation, The | Use of an adenosine, hypoxanthine and ribose-containing solution for improved protection of the heart during surgery |
| US4833239A (en) * | 1987-01-29 | 1989-05-23 | Genetics Institute, Inc. | Method for the isolation and purification of DNA molecules |
| US5063162A (en) * | 1987-04-24 | 1991-11-05 | Hoffmann-La Roche Inc. | Process for isolating nucleic acids utilizing protease digestion |
| WO1990014416A1 (fr) * | 1989-05-22 | 1990-11-29 | Genetics Institute, Inc. | Composition amelioree d'isolement et de purification d'acide nucleique et procede d'utilisation ameliore |
| IT1232318B (it) * | 1989-09-07 | 1992-01-28 | Crinos Industria Farmaco | Composizioni ad uso topico contenenti acidi nucleici depolimerizzati per la cosmesi della pelle e del corpo. |
| US4997932A (en) * | 1989-11-13 | 1991-03-05 | Boehringer Mannheim Corporation | Method and kit for purifying nucleic acids |
-
1991
- 1991-12-09 IT ITMI913294A patent/IT1252174B/it active IP Right Grant
-
1992
- 1992-11-16 IL IL10375792A patent/IL103757A/xx not_active IP Right Cessation
- 1992-11-17 ZA ZA9228878A patent/ZA928878B/xx unknown
- 1992-11-20 CA CA002083416A patent/CA2083416A1/fr not_active Abandoned
- 1992-11-26 GR GR920100527A patent/GR1002143B/el unknown
- 1992-11-27 AU AU29685/92A patent/AU655087B2/en not_active Ceased
- 1992-12-02 EP EP92203723A patent/EP0558833A3/en not_active Withdrawn
- 1992-12-04 US US07/985,726 patent/US6046172A/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-12-07 PT PT101113A patent/PT101113A/pt not_active Application Discontinuation
- 1992-12-08 BE BE9201080A patent/BE1008163A5/fr not_active IP Right Cessation
- 1992-12-08 CH CH3759/92A patent/CH685298A5/fr not_active IP Right Cessation
- 1992-12-08 BR BR9204931A patent/BR9204931A/pt not_active Application Discontinuation
- 1992-12-08 LU LU88197A patent/LU88197A1/fr unknown
- 1992-12-09 FR FR9214810A patent/FR2684675B1/fr not_active Expired - Fee Related
- 1992-12-09 CN CN92113711A patent/CN1073448A/zh active Pending
- 1992-12-09 MX MX9207137A patent/MX9207137A/es unknown
- 1992-12-09 JP JP4329713A patent/JPH05247083A/ja active Pending
-
1995
- 1995-08-03 US US08/510,622 patent/US5646127A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-01-31 US US08/594,522 patent/US5646268A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GR1002143B (en) | 1996-02-16 |
| US6046172A (en) | 2000-04-04 |
| PT101113A (pt) | 1994-02-28 |
| FR2684675A1 (fr) | 1993-06-11 |
| MX9207137A (es) | 1993-08-01 |
| EP0558833A2 (fr) | 1993-09-08 |
| ITMI913294A1 (it) | 1993-06-09 |
| JPH05247083A (ja) | 1993-09-24 |
| CN1073448A (zh) | 1993-06-23 |
| CH685298A5 (fr) | 1995-05-31 |
| BE1008163A5 (fr) | 1996-02-06 |
| BR9204931A (pt) | 1993-06-15 |
| GR920100527A (el) | 1994-03-31 |
| AU655087B2 (en) | 1994-12-01 |
| US5646127A (en) | 1997-07-08 |
| IL103757A (en) | 1997-02-18 |
| FR2684675B1 (fr) | 1996-10-18 |
| US5646268A (en) | 1997-07-08 |
| EP0558833A3 (en) | 1995-09-06 |
| CA2083416A1 (fr) | 1993-06-10 |
| ZA928878B (en) | 1993-06-22 |
| ITMI913294A0 (it) | 1991-12-09 |
| AU2968592A (en) | 1993-06-10 |
| IT1252174B (it) | 1995-06-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| LU88197A1 (fr) | Nouveaux oligodesoxyribonacleotides ayant une activite anti-ischemique et methode de preparation de ceux-ci. | |
| EP0037319B1 (fr) | Mucopolysaccharides possédant des propriétés biologiques, leur préparation et leur application en tant que médicaments | |
| EP1625135B1 (fr) | Composition de fondaparinux sodique de haute purete | |
| FR2680368A1 (fr) | Alpha-glycosyl-quercetine, son procede de preparation et ses utilisations. | |
| FR2597481A1 (fr) | Procede pour obtenir des polydesoxyribonucleotides chimiquement definis et reproductibles. | |
| CN113061594B (zh) | 转氨酶突变体、固定化转氨酶及用于制备西他列汀的用途 | |
| WO2018023205A1 (fr) | Procédé de purification de mononucléotide nicotinamide | |
| Oke et al. | Advances in the application of deep eutectic solvents based aqueous biphasic systems: An up-to-date review | |
| JP2003534349A (ja) | （ｓｓ，ｒｓ）−ｓ−アデノシル−ｌ−メチオニンの薬剤として許容される塩の調製方法 | |
| CH639396A5 (fr) | Substance dite ''ks-2-b'' et procede pour sa fabrication. | |
| EP0242301B1 (fr) | Procédé de purification d'antigènes protéiques de bactéries appartenant au genre Bordetella, en vue de l'obtention d'un vaccin acellulaire | |
| CH636888A5 (fr) | Heparines purifiees et leur preparation. | |
| JP3055565B2 (ja) | シクロデキストリン精製工程 | |
| TW200825070A (en) | Purification of mupirocin | |
| JPS62249956A (ja) | カルニチンの精製方法 | |
| RU2618341C1 (ru) | Способ получения окисленного декстрана | |
| FR2669340A1 (fr) | Composes a liberation progressive d'oligomeres de la glucosamine, procede de preparation et applications. | |
| FR2731162A1 (fr) | Procede d'extraction d'au moins un actif a partir de cellules vegetales indifferenciees | |
| JPS59190921A (ja) | 抗ウイルス活性物質 | |
| JP2630949B2 (ja) | アミノ酸高含有物質の無味・無臭化方法 | |
| FR2617403A1 (fr) | Procede de preparation de derives des acides nucleiques et procede de preparation d'une composition medicale les contenant | |
| CA1177428A (fr) | Procede d'obtention d'un peptide a partir des cultures d'un trematode et emploi comme medicament de ce peptide | |
| BE1003486A5 (fr) | Procede d'obtention de l'inhibiteur de la neuraminidase du virus de la grippe. | |
| Rahul et al. | COMPEXATION OF POORLY WATER SOLUBLE DRUG WITH CYCLODEXTRIN | |
| FR2693208A1 (fr) | Procédé d'obtention d'une composition enzymatique d'origine végétale ainsi que composition obtenue par la mise en Óoeuvre de ce procédé. |