SU1161511A1 - Способ осаждени нуклеиновых кислот из растворов,содержащих фосфатный буфер - Google Patents

Abstract

1. СПОСОБ ОСАВДЕНИЯ НУКЛЕ (Л ИНОВЫХ КИрЛОТ ИЗ РАСТВОРОВ, СОДЕРЖАс ЩИХ ФОСФАТНЫЙ БУФЕР с концентрацией солей 0,3 М, путем обработки раствора этиловым или изопропиловым спиртом, отличающийс  тем, что, с целью сокращени  длительности и упрощени  процесса, раста вор перед обработкой спиртом титруют 16 М формиатным буфером, имеющим ел рН 2,9-3,0, до значени  рН раствора ,3,5-3,6. 2. Способ по п. 1,отличающий с   тем, что дл  осаждени  дезсксирибонуклеиновой кислоты обрабатывают раствор одним объемом спирта , а дл  осаждени  рибонуклеиновой кислоты - двум  объемами спирта. j

Description

Изобретение относитс  к усовершенствованному способу вьзделени  нуклеиновых кислот, а именно к способу осаждени  спиртом дезоксирибонуклбиновой (ДНК), и рибонуклеиновой (РНК) кислот из растворов в присутствии фосфатного буфера, который представл ет собой водный раствор со лей NaH2.P04. и ., и КНа.РОф. Спирты, такие как этанол и изопропанол ,.широко используютс  дл  пр мого осаждени  биополимеров и их компонентов DI частности нуклеотидов , олигонуклеотидов и нуклеиновы5с кислот, из их водных растворов. Это наиболее распространенный и прос той метод, который примен ют при про мьшшенном производстве нуклеиновых кислот. Однако если в растворе присутствуют соли фосфатного буфера,то вслед ствие их нерастворимости в 50-70%-но этаноле получение осадка нуклеиновой кислоты без примеси солей невозможно Известен способспиртового осажде ни  нуклеиновых кислот, который заключаетс  в предварительном диализе раствора нуклеиновых кислот дл  удалени  солей фосфатного буфера с nor следующим осаждением этанолом /jZ . Недостатками способа  вл ютс  его длительность (ТВ-часовой диализ), а также то, что при диализе происходит частична  потер  биополимеров, св занна  с их сорбцией на диализной мембране. Известен также способ осаждени  нуклеиновых кислот из растворов в присутствии фосфатного буфера, заключаюпцйс  в добавлении бромистого центилтриметиламмони  (цетавлона) .в количестве 4 мГ на 1 мг ДНК. Выход составл ет 95% 3. Однако необходимость проводить в дальнейшем очистку полученного продукта от цетавлона , включающую растворение осадка, центрифугирование и двухкратное пере осаждение этанолом, приводит к умень шению выхода продукта. Наиболее близким к изобретению по технической сущности  вл етс  способ осаждени  нуклеиновых кислот, в част ности ДНК, из растворов, содержащих фосфатный буфере концентрацией солей приблизительно 0,24 М, путем обработки 1 мл исходного раствора 0,1 мл 0,5 М раствора хлорида кальци  и 1 мл этанола, отделени  образовавшегос  осадка, представл ющего собой смесь фосфата кальци  и ДНК, центрифугированием , обработки его этилендиамином дл  растворени  солей кальци  и диализа растворенных солей. ДНК осаждают этанолом после добавлени  хлорида натри  до концентрации NaCl в смеси 0,2 М. Дл  получени  растворов ДНК, содержащих фосфатный буфер с концентрацией солей 0,24 М, исходный раствор обычно разбавл ют водой. Выход полученной ДНК не указан 4 . Основными недостатками этого метода  вл ютс  длительность стадии диализа и трудоемкость стадий перерастворени  и центрифугировани . Цель изобретени  - сокращение длительности и упрощение процесса. Поставленна  цель достигаетс  тем, что согласно способу осаждени  нуклеиновых кислот из растворов, содержащих фосфатный буфер с концентрацией солей 0,3 М, раствор перед обработкой этиловым или изопропиловым спиртом титруют 16М формиатным буфером, имеющим рН 2,9-3,0 до значени  рН раствора 3,5-3,6. При этом дл  осаждени  ДНК обрабатывают раствор одним объемом спирта , а дл  осаждени  РНК - двум  объемами спирта. Обычно снижение концентрации солей натрий-Лосфатного буфера осуществл ют путем разбавлени  исходного или охлаждени  его до О С с последующим сливом надосадочной жидкости. Снижение концентрации солей калийфасфатного буфера достигаетс  разбавлением исходного раствора, поскольку гидроортофосфат и дигидроортофосфат кали  обладают больдией растворимостью, чем фосфорнокислые соли натри , и при охлаждении не выпадают в осадок. При исходных значени х концентрации солей ниже0,3М первую стадию вообще опускают. Дл  осаждени  ДНК обычно используют один объем спирта, а при осаждении РНК два объема. Известно, что при комнатной температуре 50%-на  денатураци  ДНК имеет место при рН 2,9 4Д. Кроме того, согласно 5 наличие в растворе 50-70% этанола понижает темпеРУтуру плавлени  ДНК, что эквивалентно повышению кислотности денатурации на 0,125-0,35 ед., т.е. до значени  рН 3,15-3,25. Поэтому титрование растворов ДНК или РНК, содержащих фосфатный буфер, заканчивают, когда рН раствора достигает 3,5-3,6, что выше значени  денатурации. Значение рН более высокие, чем 3,6, использовать нецелесообразно, так как это приводит к снижению растворимости солей Ьосфатного буфера в водноспиртовой смеси и затрудн ет процес осаждени . Дл  титровани  используют формиатный буфер, имеющий рН 2,9-3,0. Нижн   граница рН буфера 2,9 подобрана с таким расчетом, чтобы при подкислении, которое осуществл етс  путем добавлени  формиатного буфера к раствору нуклеиновой кислоты при одновременном перемешивании с. помощью магнитной мешалки, не произош ла денатураци  биополимера. При зна чении рН, которое имеет используемы дл  титровани  буфер, денатураци  дезоксирибонуклеиновой кислоты, например , протекает за дес тки секунд Но поскольку перемешивание раствора и выравнивание рН происходит за период времени, который меньше на целый пор док, то биополимер после такой обработки остаетс  в нативном состо нии. Однако значение рН можно снизить Так, согласно }титрование раствора ДНК провод т с помощью концентрированной сол ной кислоты (т.е. рН титрующего агента ниже 2,9). Титрование растворами, рН которых ниже критического значени  2,9, при котором начинаетс  денатураци  ДНК, осложн ет проведение процесса. Дл  предотвращени  длительного локальног понижени  рН титрующий агент добавл ют в микроколичествах (капилл ром) при крайне интенсивном перемешивании на магнитной мешалке. Это увеличивае трудоемкость метода и делает его неприемлемым дл  работы с. большими объемами нуклеиновых кислот, так как объем добавл емого титрующего агента и скорость перемешивани  станов тс  критическими моментами. Верхний предел значений рН формиатного буфера выбран с таким расчетом , чтобы максимально снизить раз бавление раствора нуклеиновой кислот при титровании, а следовательно, уменьшить потери целевых продуктов , при спиртовом осаждении. Установлено, что при использовании формиатного буфера со значением рН 3,1-3,2 возрастает необходимый дл  титровани  объем этого буфера, а выход ДНК и РНК при последующем осаждении спиртом снижаетс . Буфер со значением рН 3,5 нельз  использовать, поскольку при этом не удаетс  осадить нуклеиновые кислоты спиртом в присутствии фосфатного буфера. Выбор дл  осаждени  формиатиого буфера, а не глицин-НС1 или фталатНС1 буферов, у которых диапазон значений рН включает 2,9-3,0 OQ обусловлен тем, что растворимость в воде глицина йфталевой кислоты значительно ниже, чем муравьиной кислоты. (Максимальна  концентраци  глицин-НС1 буфера не превышает 3 М, концентраци  фталат-НС1 буфера ниже. При подкислении раствори нуклеиновых кислот, содержащего фосфатный буфер необходимо добавл ть большой объем подкисл ющего агента, что ведет к разбавлению растворов ДНК и РНК, в результате чего снижаетс  выход нуклеиновых кислот при спиртовом осаждении и возрастает расход этилового (или изопропилового) спирта. Дл  титровани  растворов необходимо использовать наиболее концентрированный формиатный буфер, максимальна  концентраци  которого 16М. Уменьшение концентрации буфера нецелесообразно, так как при этом возрастает разбавление титруьмого раствора нуклеиновой кислоты и, как результат этого, Ьнижаетс  выход целевых продуктов, а расход используемого Дл  осаждени  спирта возрастает. Таким образом, существенным отличием предлагаемого способа  вл етс  . титрование растворов, содержащих фос-фатный буфер, перед обработкой спиртом 16 М формиатным буфером, имеющим рН 2,9-3,0, до значени  рН раствора 3,5-3,6. Качество получаемых согласно предлагаемому способу препаратов ДНК и РНК провер ли хроматографическими и спектроскопическими методами. На фиг. 1 прелставлены результаты анализа хроматографической очистки на гидроксиапатите исходного препарата ДНК печени крысы в присутстии примесей РНК; на фиг.2 - то же. исходного препарата дрожжевой РНК; на фиг.З то же, ДНК печени крысы после спиртового осаждени  из фосфатного буфера с предварительным подкислением; на фиг.4 - то же, дрож жевой РНК после спиртового осаждени  из фосфатного буфера с предварительным подкислением; на фиг.З - крива  плавлени  ДНК печени крысы после спиртового осаждени  из фосфатного буфера с предварительным подкислением . Препараты ДНК и РНК, получаемые согласно предлагаемому способу провер ли на нативность и степень чистоты . Нативность указанных биополимеров устанавливали по концентрации элюции с гидроксиапатита, а также по гиперхромному эффекту и температуре плавлени . Известно, что при элюции с гидроксиапатита линейным градиентом концентрации Na-фосфатного буфера (NaФБ ) нативна  ДНК элюируетс  при концентрации последнего, превьшающей . 0,2 М, в то врем  как РНК и денатурированна  ДНК элюируютс  при белее низкой концентрации Na-ФБ (0,130 ,15 М). Следует отметить, что лри наличии смеси нативной и денатурированной ДНК соответствующие им пики полностью раздел ютс . Показано, что концентраци  элюци ДНК составл ет 0,23 М, а РНК - 0,14 0,15 М На-ФБ рН 6,86 (фиг. 1 и 2). После спиртового осаждени  ДНК и РН из фосфатного буфера .с предваритель ным подкислением 16 М формиатным бу фером полученные осадки биополимеро раствор ли и проводили их повторную хроматографию. Как видно из фиг. 3 и 4, концентраци  элюции как ДНК, так и РНК не измен етс  после осажд ни  предложенным способом. ДНК и РНК элюируютс  одиночными пиками соответственно в области 0,23 М и 0,14 М Na-ФБ, что говорит о нативно ти и гомогенности этих препаратов. Спектрофотометрическое определение гиперхромизма получаемых соглас предложенному способу образцов ДНК при нагревании последних до 100° С с последующим добавлением формальде гида и охлаждением дало значение гиперхромного эффекта от 39,4 до 40 что характерно дл  нативных ДНК. Та кое же значение гиперхромного эффек получено при плавлении препаратов ДНК, полученных после спиртового осаждени  из фосфатного буфера с предварительным подкислением, на спектрофотометре СФ-4. Температура плавлени  Т составила 86,б С, что также характерно только дл  нативных ДНК С. Крива  плавлени  ДНК печени крысы . в растйоре, содержащем 0,15 М NaCl и 0,015 М цитрата Na (рН 7,3), изображена на фиг.5. Чистота препаратов ДНК и РНК определ лась их спектральными характеристиками . Препарат нуклеиновой кислоты считаетс  чистым, если дл  его спектра выполн ютс  соотношени  Еаео/Ег50 1,8; Еа.ео/Е„о 2 (Е - оптическа  плотность при длине волны, равной 7 И . В таблице приведены спектральные характеристики препаратов ДНК печени крысы и дрожжевой РНК д0 и после осаждени . Как видно из таблицы, обработка формиатным буфером перед осуждением не загр зн ет препаратов нуклеиновых кислот. Наоборот , спектральные характеристики ДНК и РНК после спиртового осаждени  из фосфатного буфера с предварительным подкислением по сравнению со спектральными характеристиками исходных препаратов несколько улучшаютс . Пример Т. Осаждение ДНК из растворов, содержащих 0,5 М фосфатный буфер (рН 6,9). 15 мл раствора ДНК печени крысы (0,18 мг/мл; 3,6 о.с.) мл; 2,7-10-з г), Содержащего Na-фосфатный буфер в концентрации 0,5 М охлаждают в химическом стакане до 0°С и выдерживают при этой температуре в течение 10 мин. При этом выпадают кристаллы солей фосфорной кислоты, после чего надосадочную жидкость осторожно сливают в чистый химический стакан. Концентраци  буфера при этом снижаетс  доО,3 М. ; Слитый раствор титруют 16 М формиатным буфером рН 3,0 при перемешивании с помощью магнитной мешалки. Перемешивание прекращают, когда рН титруемого раствора достигает значени  3,5. После окончани  титровани  к раствору ДНК добавл ют 17,5 мл этанола. Выпадает осадок ДНК, его собирают. Получают 2,45 10-3 г (94%) ДНК. Пример 2. Осаждение ДНК из растворов, содержащих 0,25 М Na-фосфатный буфер (рН 7,0).

14,8 мл раствора печени крысы (0,045 мг/мл; 0,9 о.с./мл; 0,6710 г), содержащего 0,25 М Na-фосфатный буфер, титруют в химическом стакане формиа:тным буфером (16 М, рН 2,9), перемешива  раствор при помощи магнитной мешалки, до значени  рН 3,5. .Затем к раствору добавл ют 16 мл изопропанола, собирают выпавший осадок. Получают 0,54-10 г (80%) ДНК.

Пример 3. Осаждение РНК из растворов, содержащих 0,15 М Na-фЬсфатный буфер (рН 7,0).

Сзгммарный пул фракций, содержащих РНК дрожжей и собранных после хроматографии на оксиапатите, представл ет собой раствор РНК (10,0115 мг/м 2,3 о.с./мл; 1,49510- г) вО,15М Na-фосфатном буфере, рН 7,0. 13 мл этого раствора подкисл ют 16 М формиатным буфером на рН-метре -до значени  рН 3,5 при перемепшвании на магнитной мешалке. Затем приливают к раствору РНК 27 мл этанола и выдер живают при в течение 1 ч. Выпавший осадок РНК собирают центрифугированием (18 тыс. об./мин) в течение 10 мин. Выход РНК составл е 1,230-10- г (82,5%).

Пример 4. Осаждение -ДНК из растворов, содержащих 0,5 М К-фосфатный буфер (рН 7,2).

15 мл раствора ДНК печени свиньи (10,10 мг/мл; 2 о.с./мл; 1,5«10- г) содержащего 0,5 М К-фосфатный буфер (рН 7,2), предварительно разбавл ют дистиллированной водой в 2 раза.

После подкислени  формиатным буфером на рН-метре до рН 3,56 с одновременным перемешиванием раствора магнитной мешалкой добавл ют 32,4мл этанола.

Осадок отдел ют, выход ДНК -10- г (84,5%).

Таким образом, предлагаемый способ осаждени  нуклеиновых кислот позвол ет быстро и с высоким выходом вьщел ть ДНК или РНК из растворов, содержащих фосфатный буфер, осуществл етс  при любом объеме раствора и не требует длительного и трудоемкого диализа.

Препарат

ДНК печени

крысы до

осаждени 

ДНК печени крысы после осаждени  предлагаемым способом

РНК дрожжей до осаждени 

РНК дрожжей после осаждени  предлагаемым способом

Спектральные характеристики

/Е,

acf - 8.V5

2.60

2,2

2,3

2,17

2,2

999 f/ff iXf-f/ u/ooft€tifi/o

НЪ CM Ч S «Sf Ъ- «Ъ

«О to CM Cb

c ctf cs C5 a ,

Htf09Z 9W3QHUfei/a У13М9911ПШид

9 Н «f yoftfsttfo

1 « ,

Г«. U tn 4- to м tf- е ъ с аГ

ffffggZ ndu 9u/9Offtuoift/ ttoMaahnuuf)

I

0.7

0.6 0.5

I

ОЛ O.S

о

0.2 0.1

О 1 Ъ 5 1 9

11 /3 5 17 19

Номер

Фиг.Ъ

0.22 0.20

UW J

I «74 I O.f2

|a/ .os

0.06 §:

ff.04I

ff.02

4S

7

I

10 т 18 22 26 30 J« 3ff Фиг. F:i 2§ i§ § Cs - - o es «a ggi ndu «twootfwoi/u teotfMhnuit/Q cs- af 2 Jg 5 ci . r СГ . e f

Claims (2)

1. СПОСОБ ОСАЖДЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ИЗ РАСТВОРОВ, СОДЕРЖАЩИХ ФОСФАТНЫЙ БУФЕР с концентрацией солей ^0,3 М, путем обработки раствора этиловым или изопропиловым спиртом, отличающийся тем, что, с целью сокращения длительности и упрощения процесса, раст' вор перед обработкой спиртом титруют

16 М формиатным буфером, имеющим pH 2,9-3,0, до значения pH раствора ,3,5-3,6.

2. Способ поп. ^отличающийся тем, что для осаждения дезоксирибонуклеиновой кислоты обрабатывают раствор одним объемом спирта, а для осаждения рибонуклеиновой кислоты - двумя объемами спирта.

мьппленном кислот.

Однако вуют соли