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Nouveaux oligodésoxyribonucléotides à activité anti- ischémique et leur préparation
La présente invention concerne de nouveaux oligodésoxyribonucléotides d'origine naturelle, qui possèdent un poids moléculaire compris entre 4000 et 10000 daltons, ainsi que les procédés permettant de les obtenir.
L'invention a aussi pour objet l'utilisation des nouveaux composés à titre d'agents anti-ischémiques.
A titre préliminaire, il faut mentionner ici que les procédés précités ont pour caractéristique générale commune de comporter une étape de dépolymérisation préalable d'acides désoxyribonucléiques naturels, de poids moléculaires élevés, dans des milieux aqueux, suivie de la précipitation des oligodésoxyribonucléotides ainsi obtenus par l'addition de proportions appropriées de solvants organiques.
Les polymères de la présente invention répondant au profil analytique indiqué et, possédant l'activité pharmacologique susmentionnée, constituent une famille particulière parmi tous les oligodésoxyribonucléotides homologues d'un poids moléculaire se situant dans la plage indiquée plus haut.
En effet, dans cet intervalle, comme on le montrera dans la suite du présent mémoire, on peut trouver des composés qui diffèrent des substances ici décrites par le profil analytique précité, plus spécialement quant aux valeurs d'un paramètre chimique et par l'activité anti-ischémique bien plus faible.
Le paramètre chimique mentionné plus haut est le rapport de la somme des moles adénine + thymine/cytosine + guanine, ou AT+T/C+G, dont la plage indiquée dans la suite du présent mémoire (tableau I), doit être considéré comme critique pour définir les composés qui se situent dans l'intervalle des poids moléculaires de 4000
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à 10000 et qui sont dotés d'une activité anti-ischémique notable et sont, par conséquent, intéressants du point de vue thérapeutique.
L'état de la technique décrit déjà des polymères de faibles poids moléculaires, que l'on obtient par la dépolymérisation d'acides désoxyribonucléiques naturels.
En tout état de cause, comme on l'expliquera amplement dans les considérations qui vont suivre, ils ne sont pas réputés être pertinents quant à anticiper la nouveauté des nouveaux oligodésoxyribonucléotides, ou quant à les rendre par ailleurs évidents.
EP-A-416677 indique les utilisations cosmétiques de compositions contenant des polydésoxyribonucléotides d'orgine naturelle, qui possèdent un poids moléculaire compris entre 10000 et 100000 et qui possèdent, dans la mesure où cela est d'intérêt ici, un rapport molaire purines/pyrimidines (G+A/C+T) compris dans les limites correspondantes indiquées à propos du même paramètre de la présente invention (voir tableau I).
Cette description n'est cependant pas réputée supprimer l'étape inventive du premier objet de la présente invention.
Par conséquent, par exemple, il ne serait pas du tout justifié de considérer les nouveaux polymères comme étant de"simples"équivalents par le poids moléculaire des polydésoxyribonucléotides de cette technique antérieure, étant donné que la plage précitée du rapport molaire G+A/C+T, considéré en tant que tel, donne naissance à une très importante classe de composés, y compris à la fois les oligodésoxyribonucléotides doués de l'activité pharmacologique susmentionnée et ceux qui, au contraire, ne sont qu'à peine actifs. Cette observation est en outre pleinement confirmée en considérant les valeurs et les plages de G+A/C+T indiquées pour les composés de l'invention dans le tableau I en même temps
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que celles indiquées à la page 13 pour la préparation P0067.
D V, qui, comme présenté dans le tableau IV qui suit, n'est au contraire douée que d'une faible activité anti-ischémique.
Les considérations susmentionnées amènent à la conclusion non ambiguë, que dans EP-A-416677, on ne donne aucune information de quelque nature qu'elle soit qui pourrait éventuellement aider le spécialiste à choisir ou par ailleurs définir la classe des polymères décrits dans le présent mémoire descriptif. WO 87/06235 décrit des polydésoxyribonucléotides d'origine naturelle, qui diffèrent des substances qui forment le premier objet de la présente invention par des valeurs supérieures tant du paramètre d'hyperchromicité que du pouvoir rotatoire.
Il vaut ici la peine d'être mentionné que dans cette demande de brevet, il est déjà décrit que le paramètre d'hyperchromicité diminue avec l'abaissement du poids moléculaire. Cependant, il faut également bien se rendre compte que le document ne donne, au contraire, aucune information sur la manière dont le pouvoir rotatoire se modifie concomitamment.
De même, dans WO 87/06235, tout comme dans le cas de EP-A-416677, on ne trouve aucune quelconque suggestion quant aux valeurs particulières de n'importe quel intervalle du rapport molaire A+T/C+G ayant finalement trouvé de l'importance pour la mise en évidence de l'activité révélée des composés.
De la lecture des documents auxquels on vient de se référer ci-dessus, il semble que l'on arrive à l'observation plus générale que le rapport molaire A+T/C+G n'y est pas pris en considération, même de manière éloignée, pour la caractérisation chimique de tels polydésoxyribonucléotides.
En outre, WO 87/06235 ne fournit, de surcroît, aucune base substantielle qui soutiendrait la non évi-
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dence de la présente invention.
Comme une matière de fait dans la description pertinente, on trouve l'indication que des polymères à faibles poids moléculaires d'acides désoxyribonucléiques possédant des valeurs du paramètre d'hyperchromicité h inférieures à 10, feraient preuve d'une diminution considérable de l'actiivté pharmacologique. En outre, il est également affirmé que h est pratiquement égal à 0 pour des oligodésoxyribonucléotides possédant un poids moléculaire de 8000.
Ces propositions ont directement conduit aux conclusions suivantes : a. Les oligodésoxyribonucléotides possédant une valeur de h inférieure à 10, ne comportent pas d'applica- tions thérapeutiques ; b. De manière plus particulière, étant donné que le décroissement impressionnant de l'activité pharma- cologique indiqué dans les références susmention- nées est mis en relation avec des valeurs de h in- férieures à 10, le spécialistes avisé aura cer- tainement considéré que plus faible est la valeur de h, plus faible est l'activité résiduelle, prin- cipalement lorsque h = 0, ce qui correspondrait, selon WO 87/06235, comme on l'a vu, à un poids moléculaire de tels polydésoxyribonucléotides de
8000.
Ces deux conclusions sont, en fait, manifestement en contraste avec les découvertes expérimentales de la présente invention que l'on va décrire dans la suite du présent mémoire. Les caractéristiques physicochimiques et chimiques pertinentes ou intéressantes des nouveaux oligodésoxyribonucléotides sont indiquées dans le tableau I.
Les plages de variation qui sont indiquées dans ce
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tableau I sont généralement tirées du tableau II, à l'exception du pouvoir rotatoire dont les limites ont été déterminées en prenant en considération le tableau II (limites : +34 à +48 ) en même temps que des exemples : pouvoir rotatoire de la préparation P0097. N dont il est question dans l'exemple 8 (+32, 50) et de la préparation POO97. M dont il est question dans l'exemple 9 (+30, 9 ).
On a déterminé les paramètres présentés dans le tableau I comme suit.
La détermination du poids moléculaire pour des substances de la nature de celles qui font l'objet de la présente invention, dépend fortement du procédé adopté pour cette détermination. Dans les cas de méthodes à HPLC (chromatographie en phase liquide sous pression élevée ou à haute performance), le choix des standards de référence influence puissamment les résultats. Aux fins de la présente invention, les standards de référence ont été choisis en tenant compte de la similitude de configuration ou de structure moléculaire eu égard aux oligodésoxyribonucléotides subissant l'analyse.
On a déterminé le poids moléculaire par HPLC, à l'aide d'un chromatographe à phase liquide, équipé de deux colonnes, Biosil TSK 300 et BiosilR TSK 250 (Bio-
EMI5.1
a radR), montées en série, maintenues thermostatiquement à 300C. La solution constituant la phase mobile fut obtenue en dissolvant les substances suivantes dans de l'eau
EMI5.2
distillée : 5, 844 g de chlorure de sodium, 9, 24 g de NaH2P04H20, 22, 5 g de glycine. On a ensuite amené le volume à 950 ml, on a corrigé le pH à 6,8 (NaOH 6 N) et on a alors dilué la solution jusqu'à l litre à l'aide d'eau distillée.
Le débit était de 0,5 ml/minute, volume d'échantillon injecté de 6 mcl (l'abréviation mcl désigne des microlitres) et la densité optique de l'effluent fut lue
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à 260 nm.
On a procédé à l'étalonnage de la colonne en utilisant des standards de polystyrènesulfonate (sels de sodium) d'un poids moléculaire connu (fournisseur : Polymers Laboratories Limited). On a utilisé deux solutions, à savoir la solution A et la solution B, pour procéder à l'étalonnage. Chacune de ces deux solutions contenait notamment 4 standards à une concentration de 0,25%. Dans la solution A, le quatre standards de polystyrènesulfonate possédaient les poids moléculaires suivants : 1800,8000, 46000,200000, tandis que les valeurs correspondantes pour la solution B étaient les suivantes : 4600,18000, 100000,400000.
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Tableau I
EMI7.1
<tb>
<tb> Limites <SEP> de <SEP> variation <SEP> des <SEP> paramètres <SEP> analytiques <SEP> qui <SEP> caractérisent <SEP> les <SEP> oligodésoxyribonucléotides <SEP> de <SEP> la <SEP> présente <SEP> invention
<tb> Poids <SEP> moléculaire <SEP> 40000-10000
<tb> h <SEP> 10
<tb> A+T/C+G* <SEP> 1, <SEP> 100-1, <SEP> 455
<tb> A+G/C+T* <SEP> 0, <SEP> 800-1, <SEP> 160
<tb> Pouvoir <SEP> rotatoire <SEP> + <SEP> 30 <SEP> + <SEP> 48
<tb> * <SEP> rapports <SEP> molaires <SEP> des <SEP> bases
<tb>
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On a répété à trois reprises en tout l'injection de chaque solution.
On a injecté l'échantillon dans les mêmes conditions.
On a déterminé le paramètre d'hyperchromicité h de la manière décrite dans l'ouvrage Methods of Enzymology vol. III pages 708-712 (voir aussi page 3 de WO 87/06235).
On a déterminé le pouvoir rotatoire à l'aide d'un polarimètre automatique, raie D du sodium, en utilisant une solution d'échantillon à 1% p/v (sur base pondérale sèche) dans de l'eau, maintenue de manière thermostatique à 20oC.
La calcul du rapport molaire des bases A+T/C+G et A+G/C+T exigea la détermination préalable du pourcentage pondéral pertinent de chaque base dans l'échantillon d'oligodésoxyribonucléotide correspondant. Cette analyse s'effectua par HPLC sur une colonne échangeuse d'ions, après hydrolyse de l'échantillon de la manière décrite dans EP 360882.
Les procédés par lesquels on peut obtenir ces substances sont les suivants :
Précipitation échelonnée du polymère à partir de solutions aqueuses d'acétate de sodium 0,8 M, con- tenant une quantité de 4% p/v de sels de sodium des polydésoxyribonucléotides possédant un poids molé- culaire situé dans l'intervalle de 15000 à 75000 daltons. On a entrepris le procédé à la température de 200C et on a réalisé la précipitation par l'ad- dition à la solution d'un alcool alkylique infé- rieur, choisi dans le groupe formé par l'alcool éthylique, l'alcool propylique et l'alcool isopro- pylique, selon les étapes indiquées ci-dessous :
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a.
Addition de 0,8 volume d'alcool à la solution d'acétate de sodium 0,8 M contenant 4% p/v de polydésoxyribonucléotides, afin de précipiter la plus grande partie de la fraction de poly- désoxyribonucléotides de poids moléculaires supérieurs. b. A la solution hydroalcoolique obtenue au cours de la mise en oeuvre de l'étape a. précédente, contenant 0,8 volume d'alcool, on a ajouté davantage d'alcool afin d'obtenir, en tout, un volume de phase organique/volu- me de phase aqueuse de départ. On a alors éliminé la couche surnageante et on a récupé- ré le précipité formé, qui contenait la frac- tion de polydésoxyribonucléotides de poids moléculaires supérieurs en mélange aux poly- mères de l'invention et on l'a traitée de la manière décrite dans l'étape d. qui suit. c.
On a mélangé la couche surnageante de l'étape b. précédente à une quantité supplémentaire d'alcool de manière à obtenir, à la fin, deux volumes d'alcool/volume de la solution aqueu- se tampon à l'acétate de sodium 0,8 M de l'étape a. Dans ces conditions, les oligodé- soxyribonucléotides de l'invention se séparè- rent et furent ensuite récupérés. d. On a dissous le précipité obtenu lors de la mise en oeuvre de l'étape b. dans de l'acé- tate de sodium 0,8 M. On a ensuite enlevé la fraction de polydésoxyribonucléotides de poids moléculaires supérieurs par précipita- tion en ajoutant un volume d'alcool/volume de solution aqueuse.
On a séparé le précipité par centrifugation et on a mélangé la solu- tion hydroalcoolique résiduelle à de l'al-
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cool jusqu'à une quantité totale de solvant organique de 2 volumes/volume de la phase aqueuse. On a récupéré le précipité ainsi formé, constitué des oligonucléotides selon l'invention.
Conformément à un autre procédé que celui décrit ci-dessus, on peut également n'effectuer seulement qu'une précipitation intermédiaire par l'addition à la solution aquesue de départ de 1 volume d'alcool.
Dans ces conditions, on a mélangé la couche surnageante à un autre volume d'alcool, de manière à provoquer ainsi la précipitation des polymères attendus. Ce procédé ne conduit, en tout état de cause, qu'à des rendements inférieurs.
Dépolymérisation thermique des sels de sodium des acides désoxyribonucléiques de poids moléculaires élevés dans un tampon aqueux à l'acide acétique/acétate de sodium 0,5 M de pH 4,1.
On a réalisé ce procédé à une température variant de 65 C à 75 C pendant une durée d'au moins 6 heures, de préférence inférieure à 10 heures, laquelle période dépendait de toute manière du poids moléculaire de l'acide nucléique de départ. On a suivi la dépolymérisation en surveillant le poids moléculaire du polymère à intervalles fixes. On a réalisé le procédé jusqu'à ce que le poids moléculaire tombât dans les limites pertinentes ou intéressantes présentées dans le tableau I.
La concentration en acide désoxyribonucléique dans le tampon à l'acétate de sodium 0,5 M précité était de 4% p/v ou, par ailleurs, d'environ 12% p/v, parce qu'il apparut que les rendement sont quelquepeu meilleurs à la concentration supérieure (voir exemple 6-+1).
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Le procédé comprenait les étapes suivantes : a. Dissolution d'acides désoxyribonucléiques de poids moléculaires élevés et addition subsé- quente d'acétate de sodium trihydraté + acide acétique concentré (80%) pour conférer au tampon le pH et la molarité nécessaires. b. Chauffage de la solution aqueuse et visqueuse obtenue à l'étape a. précédente jusqu'à une température variant de 65 à 750C pendant une période d'au moins 6 heures. c. A la fin du traitement thermique de l'étape b., abaissement de la température à 30oC, correction du pH jusqu'à 7,8-8, 0 avec NaOH à
30% et rechauffage jusqu'à 85 C pendant 90 minutes. d.
Refroidissement de la solution jusqu'à la température ambiante, correction du pH à 6,5 à l'aide d'acide acétique concentré et préci- pitation des oligodésoxyribonucléotides par l'addition d'éthanol dans un rapport variant de 1,5 à 2 volumes/volume de solution aqueu- se.
Dépolymérisation par la désoxyribonucléase des acides déosxyribonucléiques à poids moléculaires élevés et mise en oeuvre d'une étape d'ultrafiltration subséquente dans le but de concentrer la solution.
On a procédé à l'enzymolyse sur 1% p/v d'acides nucléiques de poids moléculaires élevés pendant une période de 24 heures, dans un tampon au phosphate 0,1 M de pH 7,0, en présence de chlorure de magnésium 10 mM. Après l'étape d'ultrafiltration, on a procédé aux opérations suivantes :
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a. Ultrafiltration de la solution sur une mem- brane possédant une coupe de 10000 daltons jusqu'à ce que le volume de la solution fût réduit de 1 : 5 par rapport au volume de dé- part. b. Dessalage de la solution du rétentat en dia- lysant celle-ci à volume cosntant (c'est-à- dire en ajoutant de l'eau à la solution pour maintenir le volume identique à celui de départ) vis-à-vis de 5 volumes d'eau distil- lée, comme un tout. c.
Concentration des perméats réunis, recueillis à partir des étapes précédentes a. et b., jusqu'au cinquième du volume de départ par ultrafiltration sur une membrane à coupe de
3000 daltons. d. Récupération des solutés dissous dans les rétentats de la première (étape a, coupe
10000 daltons) et, respectivement, de la seconde (étape c, coupe 3000 daltons) ultra- filtrations par un salage préalable des solutions susmentionnées jusqu'à une concen- tration en sel de 0,8 M, sel qui était de préférence l'acétate de sodium et précipita- tion subséquente par l'addition de 1,5 volume d'éthanol/volume de phase aqueuse.
En alternative, au lieu des deux étapes d'ultrafiltration susmentionnées, on pouvait aussi réaliser la concentration de la solution selon le procédé suivant : a. Ultrafiltration sur une membrane à coupe de
3000 daltons jusqu'à ce que le volume du rétentat fut ramené au cinquième de celui de
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départ. b. Dessalage de la solution de rétentat en la dialysant à volume constant vis-à-vis de 5 volumes comme un tout d'eau distillée. c. Récupération du soluté du rétentat comme décrit plus haut à l'étape d.
Les procédés précités semblent donner environ le même rendement que le premier cité, avec pour avantage une mise en oeuvre plus simple.
Dans tous les procédés précités décrits, on a ensuite obtenu le composé à partir du précipité par déshydratation, broyage et séchage subséquent.
Dans le tableau II on a indiqué le profil analytique des préparations qui ont été utilisées dans les essais pharmacologiques qui vont être décrits ci-dessous.
La préparation d'oligodésoxyribonucléotides, code de laboratoire P0067. D V, possédant un poids moléculaire inférieur à 10000 et manifestant une activité antiischémique bien inférieure à celle des polymères selon l'invention, a été obtenue selon le procédé de fractionnement décrit dans l'exemple 15. Cette préparation montra les données analytiques suivantes (sur base pondérale sèche) : poids moléculaire : 6600, h : 1,4, A+T/G+C 1,494, A+G/T+C 0,914, pouvoir rotatoire + 37,2.
Il vaut la peine de signaler que lorsque la même méthode de fractionnement utilisée pour obtenir P0067. D V, lorsqu'elle fut appliquée à d'autres lots d'acides désoxyribonucléiques dépolymérisés, donna de toute manière un produit avec les mêmes caractéristiques analytiques, c'est-à-dire possédant une valeur élevée du rapport molaire A+T/G+C. une démonstration appropriée est donnée dans l'exemple 16.
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Tableau II
EMI14.2
<tb>
<tb> Caractéristiques <SEP> physicochimiques <SEP> et <SEP> chimiques <SEP> de <SEP> préparations <SEP> d'oligonucléotides <SEP> qui <SEP> ont
<tb> été <SEP> utilisées <SEP> dans <SEP> les <SEP> essais <SEP> pharmacologiques. <SEP> Dans <SEP> l'en-tête <SEP> de <SEP> chaque <SEP> colonne <SEP> on <SEP> a <SEP> indiqué <SEP> le <SEP> code <SEP> de <SEP> laboratoire.
<tb>
P0085.D <SEP> P0085. <SEP> D <SEP> IV <SEP> P0085.M <SEP> H <SEP> P0130.A <SEP> P0130.C <SEP> P0102.A <SEP> P0102 <SEP> B
<tb> Poids <SEP> moléculaire <SEP> 8500 <SEP> 6400 <SEP> 9500 <SEP> 8000 <SEP> 9400 <SEP> 8000 <SEP> 4500
<tb> h <SEP> 9.4 <SEP> 3.9 <SEP> 9.0 <SEP> 3.5 <SEP> 5.8 <SEP> 9.7 <SEP> 3.9
<tb> A#T/Gi## <SEP> 1.298 <SEP> 1.446 <SEP> 1.305 <SEP> 1.263 <SEP> 1.230 <SEP> 1.120 <SEP> 1.110
<tb> A#G/T#C <SEP> # <SEP> 0.908 <SEP> 0.849 <SEP> 0.917 <SEP> 0.806 <SEP> 0.854 <SEP> 1.150 <SEP> 1.096
<tb> Pouvoir <SEP> notatoire <SEP> #47.3# <SEP> # <SEP> 38.6# <SEP> #46.2# <SEP> #34.8# <SEP> #36.2# <SEP> #46.8# <SEP> #47.3#
<tb> * <SEP> Rapport <SEP> molaire
<tb>
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Dans le tableau III sont rassemblés les données de l'activité fibrinolytique des composés selon l'invention, de la préparation P0067.
D V et par comparaison, celle de l'agent fibrinolytique qu'est la plasmine, à savoir une enzyme protéolytique provenant du plasminogène. Il vaut la peine de signaler ici que la plasmine est aussi utilisée en thérapie humaine.
On a exprimé l'activité sous forme de mcg de paranitroanilide (pNA) hydrolysés à partir du substrat peptidique S-2251 auquel du pNA est lié par covalence.
Cette liaison est sélectivement sensible à l'action d'agents fibrinolytiques.
Par conséquent, la quantité de pNA libérée dans la solution est directement proportionnelle à l'activité fibrinolytique du composé testé.
On a testé l'activité fibrinolytique in vitro, en utilisant le tripeptide S-2251 (dichlorhydrate de H-Dvalyl-L-leucyl-L-lysine paranitroanilide Kabi-Milan comme sensiblement décrit par J. H. Verheijen et coll. dans"A simple sensitive spectrophotometric assay for extrinsic (tissue-type) plasminogen activator applicable to measurements in plasma"Thromb. Haemostas. 48 (3) 266-269 1982.
La fraction d'euglobine de plasma fut préparée en collectant du sang (8 ml) de la veine marginale d'une oreille d'un lapin à l'aide d'une seringue contenant déjà 2 ml d'une solution à 3,8% p/v de citrate de sodium tribasique. On a ensuite subdivisé le plasma obtenu par centrifugation en fractions aliquotes de 0,5 ml et on a ajouté, à chaque fraction aliquote, l ml de la solution d'oligonucléotide de façon à ce qu'à la fin on obtient les deux concentrations d'échantillon suivantes : 200 et 800 mgc/ml de plasma (mcg désigne des microgrammes). Aux solutions, on a ajouté 0,1 ml d'une solution aqueuse d'urokinase (50 U/ml) pour convertir le plasminogène en
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plasmine.
On a ensuite ajouté de l'acide acétique pour amener le pH à 5,4 et on a alors ajusté le volume de la solution à 8,5 ml avec de l'eau distillée froide à +4 C afin d'obtenir une précipitation d'euglobine. On a complété cette étape d'un transfert des tubes à essai dans un réfrigérateur (+4 C) pendant deux heures. On a alors procédé à une centrifugation pendant 10 minutes et on a éliminé la couche surnageante. On a repris le résidu par 0,3 ml d'une solution de trischlorhydrate servant de tampon à pH de 7,4, de façon à obtenir une suspension. A 0,3 ml de la suspension ainsi obtenue, on a ajouté 0,4 ml du tampon au trischlorhydrate et on a incubé le tout à 370C pendant 10 minutes supplémentaires.
On a ensuite ajouté le tripeptide S-2251 (8,25 mg de la substance dans 5 ml d'eau distillée) et on a procédé à l'incubation à la même température pendant 5 minutes supplémentaires. On a bloqué l'enzymolyse par l'addition de 0,1 ml d'acide acétique à 1% et 0,6 ml de NaCl 0,15 M. On a déterminé la quantité de chromogène libérée dans les solutions d'essai par spectrophotométrie. On a dressé une courbe standard de référence avec de la plasmine bactérienne U. S. (Biosintex) titrée au cours du même test aux doses suivantes : 40,80, 160 et 320 mcg. On a répété en tout 6 fois les expériences, en titrant à chaque fois l'échantillon et les 4 concentrations en plasmine indiquées plus haut.
Les résultats obtenus apparaissent dans le tableau III.
Une caractéristique générale que l'on peut retirer des données du tableau III réside dans le fait que les oligodésoxyribonucléotides possédant un poids moléculaire inférieur à 10000 manifestent une activité fibrinolytique faible, sinon nulle.
Ceci pouvait être prévu au surplus déjà en raison de l'enseignement de WO 87/06235. L'activité anti-isché-
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mique a été réalisée ex vivo sur le coeur de lapin isolé et sous perfusion, fondamentalement de la manière décrite par P. D. Henry dans l'article"Myocardial contracture and accumulation of mitochondiral in ischemia rabbit heart"Am. J. physiol. 233,1977.
On a opéré des perfusions avec les composés testés en commençant 40 minutes avant l'évènement ischémique à la concentration de 400 mcg/ml et au débit de 20 ml/minute.
Au cours de la phase ischémique (40 minutes), on a réduit le débit à 0,2 ml/min. A la fin de cette phase, on a restauré le débit de départ et on l'a maintenu pendant 20 minutes supplémentaires. On a répété 6 fois l'expérience en tout. Au cours de la phase ischémique et de la reperfusion subséquente, on a déterminé la pression télédiastolique ventriculaire des coeurs traités et on a rapporté les valeurs aux coeurs non traités (groupe témoin). Dans le tableau IV apparaissent les activités anti-ischémiques des composés examinés, tels que présentés dans ledit tableau, tant au cours de la phase ischémique que de la phase de reperfusion subséquente. Il ressort de toute évidence de ce tableau que les oligodésoxyribonucléotides répondant au profil analytique présenté dans le tableau I, manifestent une activité anti-ischémique notable.
Au contraire, la préparation P0067. D V, qui possédait un rapport molaire des bases A+T/G+C (1,494) en dehors des limites de 1,100 - 1, 455 présentées dans le tableau I, ne manifestait qu'une activité de ce genre bien plus faible.
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Tableau III
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<tb>
<tb> Activité <SEP> fibrinolytique <SEP> in <SEP> vitro <SEP> des <SEP> nouveaux <SEP> oligonucléotides, <SEP> évaluée <SEP> sur <SEP> le <SEP> substrat <SEP> tripeptide <SEP> S-2251
<tb> chromogène
<tb> Composé <SEP> mcg <SEP> de <SEP> paranitroaniline <SEP> libérée <SEP> à <SEP> partir
<tb> Composé <SEP> du <SEP> substrat <SEP> S-2251 <SEP> en <SEP> 5 <SEP> minutes
<tb> Concentration <SEP> du <SEP> composé
<tb> 200 <SEP> mc <SEP> g/ml <SEP> 800 <SEP> mc <SEP> g/ml
<tb> P0085.C <SEP> 0.25 <SEP> ¯ <SEP> 0.16 <SEP> 0.89 <SEP> ¯ <SEP> 0.38
<tb> P0085. <SEP> 0 <SEP> IV <SEP> 0.18 <SEP> ¯ <SEP> 0.09 <SEP> 0.03 <SEP> ¯ <SEP> 0. <SEP> 03
<tb> P0085. <SEP> MII <SEP> 0 <SEP> 2. <SEP> 49 <SEP> ¯ <SEP> 0.70
<tb> P0102. <SEP> A <SEP> 1.27 <SEP> ¯ <SEP> 0. <SEP> 52 <SEP> 2.63 <SEP> ¯ <SEP> 0.61
<tb> P0102. <SEP> B <SEP> 0.
<SEP> 87 <SEP> ¯ <SEP> 0.57 <SEP> 0. <SEP> 56 <SEP> + <SEP> 0. <SEP> 27
<tb> !
<tb> P0067. <SEP> 0 <SEP> V <SEP> 0
<tb> 6.70 <SEP> * <SEP> 27.01 <SEP> *
<tb> Valeurs <SEP> extrapolées <SEP> à <SEP> partir <SEP> de <SEP> l'équation <SEP> de <SEP> la <SEP> ligne'
<tb> de <SEP> régression <SEP> de <SEP> la <SEP> plasmine <SEP> y <SEP> =-0, <SEP> 26 <SEP> + <SEP> 0,0341x <SEP> (r <SEP> =1)
<tb>
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Tableau IV
EMI19.1
<tb>
<tb> Activité <SEP> anti-ischémique <SEP> ex <SEP> vivo <SEP> des <SEP> nouveaux <SEP> oligonucléoties
<tb> % <SEP> d'inhibition <SEP> vis-à-vis <SEP> d'un <SEP> domComposé <SEP> mage <SEP> ischémique
<tb> Ischémie <SEP> expérimentalement <SEP> induite
<tb> Phase <SEP> ischémique <SEP> Phase <SEP> de <SEP> reperfusion
<tb> P0085.C <SEP> 67 <SEP> 80
<tb> P0085.D <SEP> IV <SEP> 66 <SEP> 77
<tb> P0085.
<SEP> M <SEP> I@ <SEP> 68 <SEP> 79
<tb> P002. <SEP> A <SEP> 61 <SEP> 69
<tb> P0102. <SEP> B <SEP> 42 <SEP> 60
<tb> 5 <SEP> P0130. <SEP> A <SEP> 63 <SEP> 74
<tb> P0130.C <SEP> 57 <SEP> 66
<tb> P0067. <SEP> D <SEP> V <SEP> 23 <SEP> 37
<tb> @
<tb>
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Les significations de ces données peuvent être mieux comprises en prenant en considération que lorsque ladite ischémie cardiaque de modèle expérimental est provoquée par réduction de l'écoulement du liquide servant à la perfusion, le coeur est frappé d'un dommage qui peut être mis en évidence fonctionnellement par la contraction ventriculaire.
Au cours de la phase de reperfusion qui suit, lors du rétablissement des conditions de débit initiales, un endommagement plus grave encore est provoqué, étant donné qu'en même temps que l'élévation de la pression diastolique, déjà observée au cours de la phase précédente, il y a une survenue concurrente d'arrhytmies cardiaques.
On peut tirer comme conclusion des données du tableau IV qu'au cours de la phase de reperfusion finale, les oligonucléotides selon la présente invention confèrent une protection substantielle contre l'ischémie expérimentalement induite, en conservant par conséquent sensiblement l'activité de contraction régulière du coeur avec réduction de la résistance diastolique de celui-ci.
En conséquence de ce qui a été démontré précédemment, on peut conclure que les nouveaux composés peuvent être exploités avec intérêt pour la thérapie de l'ischémie cardiaque.
D'autres objets de l'invention sont des formes de dosage contenant les nouvelles substances à titre de principes actifs. Ces compositions peuvent être destinées tant à l'administration parentérale qu'orale.
Les compositions pour l'administration parentérale peuvent se présenter sous la forme de solutions stériles et apyrogènes dans des ampoules hermétiquement fermées ou scellées, ou, par ailleurs, de lyophilisas contenus dans des bouteilles hermétiquement fermées et à dissoudre de manière extamporanée dans des solvants aqueux
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stériles.
A titre de solvants aqueux, on peut utiliser des solutions isotoniques préparées avec des tampons classiques (citrates, phosphates et analogues), ainsi qu'avec des conservateurs connus.
Les compositions destinées à l'administration par la voie orale peuvent se présenter commodément sous forme de comprimés, de comprimés enrobés, de granules ou de gélules en gélatine.
Lesdites formes de dosage peuvent être préparées selon des techniques connues.
Les formes de dosage convenant à l'adminsitration par la voie parentérale peuvent contenir de 40 à 200 mg/ml de principe actif, de préférence de 80 à 160 mg/ml de principe actif (pour les lyophilisats, les chiffres précédents se rapportent à la concentration finale de la substance dans le solvant stérile), tandis que celles destinées à l'administration par la voie orale peuvent contenir de 200 à 1500 mg d'ingrédient actif par dose unitaire.
Exemple 1 Isolement des oligonucléotides conformes à la présente invention (préparations P0085. C et P0085. M II) par précipitation fractionnée à partir d'une solution aqueuse de défibrotide en présence d'acétate de sodium et par addition d'éthanol.
On a dissous 420 g de défibrotide (lot 82) dans 10,5 1 (concentration finale 4% p/v) et on a ajouté 1155 g d'acétate de sodium trihydraté (0, 8 M). On a maintenu la solution à 20 C de manière thermostatique. On a ensuite ajouté 0,8 volume d'éthanol à 95%. On a récupéré la couche surnageante par centrifugation (on a jeté le précipité constitué de polydésoxyribonucléotides de poids moléculaire élevé) et on l'a additionnée de 0,2
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volume d'éthanol (volume total phase organique/phase aqueuse = 1). On a de nouveau opéré une centrifugation.
On a récupéré le précipité, on l'a déshydraté, séché et broyé. En tout, on a récupéré 97,6 g (préparation P0085. B, constituée d'un mélange des oligodésoxyribonucléotides de l'invention et de polydésoxyribonucléotides). On a ajouté davantage de méthanol à la couche surnageante afin d'obtenir deux volumes de solvant organique/volume de phase aqueuse. On a ainsi récupéré 40,5 g d'un solide (préparation P0085. C).
On a dissous 97,6 g de P0085. B dans 2,45 1 d'eau distillée et on y a ajouté 269 g d'acétate de sodium trihydraté. On a maintenu la solution à 20 C de manière thermostatique. On a ajouté 1 volume d'éthanol et on a centrifugé la suspension ainsi obtenue. On a ajouté davantage d'éthanol à la couche surnageante afin de parvenir à un rapport final de 2 entre la quantité totale d'éthanol et celle de la solution aqueuse. On a ainsi récupéré 31,2 g (préparation P0085. M. II).
La récupération totale d'oligodésoxyribonucléotides, c'est-à-dire P0085. C + P0085. M II, fut de 71,7 g (17,1%).
Exemple 2 Isolement d'oligonucléotides (préparation P0065. D IV) par précipitation fractionnée avec de l'éthanol, en présence d'acétate de sodium, à partir d'une solution aqueuse contenant du défibrotide.
On a dissous 20 g d'une préparation de défibrotide, d'un poids moléculaire de 17000 daltons, dans 500 ml d'eau distillée. On a ajouté 55 g d'acétate de sodium trihydraté et on a maintenu la solution limpide ainsi obtenue à 20 C par voie thermostatique. On a ensuite ajouté 500 ml (1 volume) d'éthanol et on a recueilli le précipité par centrifugation à 3000 tpm pendant 5 minu-
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tes. On a ajouté 500 ml d'éthanol à la couche surnageante (c'est-à-dire deux volumes en tout par rapport au volume de la phase aqueuse). On a récupéré le solide, déshydraté, broyé et séché dans un four. On a ainsi obtenu 2,10 g de produit avec un rendement de 10,5%.
Exemple 3 Isolement d'oligonucélotides (préparation P0085. D V) par précipitation fractionnée avec de l'éthanol, en présence d'acétate de sodium, à partir d'une solution aqueuse d'un polydésoxyribonucléotide.
On a dissous 20 g du sel de sodium d'un polydésoxyribonucléotide, d'un poids moléculaire de 43000 daltons, dans 500 ml d'eau distillée, on y a ensuite fait suivre le procédé décrit dans l'exemple 2 précédent. On a obtenu 1,46 g à la fin de l'expérience (rendement 7,3%).
La substance ainsi isolée possédait les caractéristiques analytiques suivantes (données sur une base pondérale sèche) : poids moléculaire : 6700, h 3,4, A+T/G+C 1,375, G+A/T+C 00,825 pouvoir rotatoire 43,4.
Exemple 4 Isolement d'oligonucléotides (préparation P0085. D VI selon le procédé de l'exemple 2.
On a traité 20 g de défibrotide (lot 157), d'un poids moléculaire de 26200 daltons, selon l'exemple 2. On a récupéré 1, 54 g de produit (rendement 7,7%) à la fin de l'expérience. Les données analytiques (sur base pondérale sèche) furent les suivantes : poids moléculaire : 5900, h 5,7, A+T/G+C 1,343, A+G/T+C 0,835, pouvoir rotatoire + 41,6.
Exemple 5 Isolement d'oligonucléotides (préparation P0085. D VII) par précipitation fractionnée avec de l'éthanol, en
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présence d'acétate de sodium, à partir d'une solution aqueuse d'un polydésoxyribonucléotide.
On a dissous 20 g du sel de sodium d'un polydésoxyribonucléotide, d'un poids moléculaire de 75000 daltons, dans 500 ml d'eau distillée. On a ensuite procédé de la manière décrite dans l'exemple 2. On a obtenu 0,78 g (3,9%) d'un composé qui possédait les caractéristiques suivantes (données sur une base pondérale sèche) : poids moléculaire : 6100, A+T/G+C 1,415, G+A/C+T 0,860, pouvoir rotatoire + 43,6.
Exemple 6 Préparation des oligonucléotides selon l'invention par la dépolymérisation chimique dans un tampon aqueux à l'acétate de sodium/acide acétique (préparation P0130. A).
On a dissous 800 g d'acide désoxyribonucléique de poids moléculaire élevé (poids moléculaire supérieur à 700.000) dans 5280 ml d'eau sous chauffage modéré. On a ajouté 426,4 g d'acétate de sodium trihydraté, puis 1016 ml d'acide acétique à 80% (acide acétique concentré) afin de corriger le pH à 4,1, puis on a chauffé la solution visqueuse (concentration en polymère finale 12,7% p/v, molarité en acétate de sodium 0,5 M) à 750C pendant 6 heures. Au bout de cette période, on a ramené la température à 30 C, on a corrigé le pH à 7,8-8, 0 avec du NaOH à 30% et on a rechauffé la solution à 85 C pendant 90 minutes. Après refroidissement, on a amené le pH à 6,5 avec de l'acide acétique à 80%.
On a ensuite opéré une précipitation par l'addition de 1,5 volume d'éthanol/volume de phase aqueuse. On a lavé, broyé et séché le solide récupéré pesant 745 g (rendement : 93, 1%).
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Exemple 7 Préparation des oligonucléotides conformes à l'invention par la dépolymérisation chimique dans un tampon aqueux à l'acétate de sodium/acide acétique (préparation PO. 130. C).
On a traité 800 g d'acide désoxyribonucléique de poids moléculaire élevé de la manière décrite dans l'exemple 6. A la fin de l'opération, on a obtenu 756 g de produit (rendement : 95,6%).
Exemple 8 Préparation des nouvelles substances par dépolymérisation dans une solution tampon à l'acide acétique/acétate de sodium (préparation POO97. N).
On a dissous 50 g d'acides nucléiques à poids moléculaires élevés, à la température de 70 C, dans 1 litre d'eau. On a ensuite ajouté 80 g de HH3COONa3H20 et
EMI25.1
190 ml de CH3COOH à 80% (pH final : 4, 1) (concentration en polymère : 4% p/v, molarité de l'acétate de sodium : 0, 5 M). On a chauffé la solution ainsi obtenue à 70 C pendant 24 heures. On a ensuite procédé au refroidissement et on a abaissé la température à 30 C et on a ensuite suivi le processus décrit dans l'exemple précédent 6. On a obtenu 33,5 g de produit (rendement 67%). Analyse (sur base pondérale sèche) : poids moléculaire 8100, h 5,3, A+T/G+C 1,037, A+G/T+C 0,865, pouvoir rotatoire + 32,5.
Exemple 9 Préparation des nouvelles substances par dépolymérisation dans un tampon aqueux à l'acide acétique/acétate de sodium (préparation POO97. M).
On a traité 50 g d'acides nucléiques de poids moléculaires élevés de la manière décrite dans l'exemple 8, cependant que l'on ramena la durée de dépolymérisa-
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tion à 16 heures et que l'on procéda à la précipitation par l'addition de deux volumes d'éthanol. On a récupéré 35,5 g de produit (rendement : 71%). Analyse (sur base pondérale sèche) : poids moléculaire : 6200, h 1,0, A+T/G+C 1,167, A+G/T/C 0,830, pouvoir rotatoire + 30,9.
Exemple 10
Préparation des nouvelles substances par dépolymérisation dans un tampon aqueux à l'acide acétique/acétate de sodium (préparation P0123. B).
On a dissous 100 g d'acides nucléiques de poids moléculaires élevés dans 660 ml d'eau. On a ensuite réalisé la dissolution sous chauffagé modéré. On a ajouté 53,5 g de CH3COONa. 3H20 et 127 ml d'acide acétique à 80% dans l'ordre indiqué.
Le pH final fut de 4,1 et la concentration en polymère de 12,7% p/v (molarité du sel : 0,5 M). On a alors chauffé la solution ainsi obtenue à 165 C pendant 16 heures et on l'a finalement traitée de la manière décrite dans l'exemple 6. On a ainsi obtenu 78,6 g de produit présentant l'analyse suivante (sur base pondérale sèche) : poids moléculaire 9400, h 6,4, A+T/G+C 1,174, A+G/T+C 0,941, pouvoir rotatoire + 38,9.
Exemple 11 Préparation des nouvelles substances par dépolymérisation dans un tampon aqueux à l'acide acétique/acétate de sodium (préparation P0123. H).
On a traité 100 g d'acides désoxyribonucléiques de poids moléculaires élevés de la manière décrite dans l'exemple 10. On a fixé la durée de la dépolymérisation à 22 heures. On a ainsi obtenu 85,9 g de produit présentant l'analyse suivante (sur base pondérale sèche) : poids moléculaire 7000, h 1,9, A+T/G+C 1,305, A+G/T+C 0,875, pouvoir rotatoire + 35,4.
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Exemple 12 Préparation des oligonucléotides conformes à l'invention par la dépolymérisation enzymatique d'acides désoxyribonucléiques de poids moléculaires élevés à l'aide d'une désoxyribonucléase (préparations P0102. A et P0102. B).
On a dissous 10 g du sel de sodium d'acides nuécléiques de poids moléculaires élevés dans 1 litre de tampon au phosphate 0,1 M et au MgCl-, 10 mM de pH 7.
On a ajouté 3,67 g de désoxyribonucléase brute à la solution finale visqueuse et opalescente. On a procédé à l'enzymolyse à 370C pendant 24 heures. Après cette période, on a réduit le volume de la solution au cinquième du volume de départ par ultrafiltration sur une membrane possédant une coupe de 10000 daltons. On a recueilli 0,8 litre de perméat.
On a dessalé le concentré (rétentat) en le dialysant à volume constant vis-à-vis de 1 litre d'eau et on l'a précipité par l'addition de 22 g d'acétate de sodium trihydraté (0,8 M), suivie de 1,5 volume d'éthanol. On a ainsi obtenu 4,88 g (rendement : 49%) de produit (préparation P0102. A).
On a réuni les perméats de l'ultrafiltration et des étapes de dessalage susmentionnées et on les a concentrés au cinquième du volume de départ par ultrafiltration sur une membrane à coupe de 3000 daltons.
On a ensuite dessalé la solution en la dialysant à volume constant vis-à-vis de 5 volumes d'eau et on l'a lyophilisée.
On a ainsi obtenu 24,7 g (rendement : 25%) de produit (préparation P0102. B).
Exemple 13 Préparation des oligonucléotides par la dépolymérisation enzymatique d'acides désoxyribonucléiques de poids moléculaires élevés à l'aide de désoxyribonucléase (pré-
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parations 0186/9120A et 0186/01220B).
On a dissous 5,5 g du sel de sodium d'acides désoxyribonucléiques de poids moléculaires élevés dans 1 litre d'un tampon au phosphate 0,1 M de pH 7 contenant 10 mM de MgCl. On a ensuite suivi le mode opératoire de l'exemple 12 précédent.
A partir de la solution de rétentat, on a obtenu 1,14 g (20,7%) de composé (0186/91220A) possédant les caractéristiques analytiques suivantes (données sur une base pondérale sèche) : poids moléculaire : 5000, h 5,4, A+T/C+G 1,266, A+G/T+C 1,106, pouvoir rotatoire + 39,1.
A partir de la solution de perméat on a obtenu 2,20 g (40%) du composé (0186/91220. B) possédant les caractéristiques suivantes (données sur une base pondérale sèche) : poids moléculaire : 4600, h 0,8, A+T/G+C 1,168, A+G/T/C 1,087, pouvoir rotatoire +37,4.
Exemple 14 Préparation des oligonucléotides par la dépolymérisation enzymatique d'acides désoxyribonucléiques de poids moléculaires élevés (préparation 0186/91217).
On a dissous 11 g d'acides nucléiques de poids moléculaires élevés dans 1,1 litre du tampon indiqué dans l'exemple précédent. On a procédé à la digestion en utilisant une désoxyribonucléase, selon le procédé de l'exemple 12. On a ensuite réduit le volume de la solution au cinquième du volume de départ par ultrafiltration sur une membrane à coupe de 3000 daltons. Après dessalage du rétentat par sa dialyse à volume constant vis-à-vis de 5 volumes d'eau distillée, on a salé la solution et on l'a précipitée de la manière décrite dans l'exemple 12 à propos de la préparation P0102. A. A la fin de l'opération on a obtenu 8,5 g (75%) d'un produit possédant les caractéristiques suivantes (données sur une base pondérale sèche) : poids moléculaire : 5600, h
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5,8, A+T/G+C 1,140, A+G/T+C 1,010, pouvoir rotatoire + 41,5.
Exemple 15 Méthode utilisée pour obtenir P0067. D V.
1,68 partie des liqueurs-mères provenant de la précipitation de polydésoxyribonucléotides obtenus par la dépolymérisation d'acides désoxyribonucléiques de poids moléculaires élevés (préparation de défibrotide lot n 73) selon le procédé décrit dans WO/87/06235 et contenant encore une quantité théorique de 1250 d'acides désoxyribonucléiques, 1 partie d'une solution aqueuse tampon à l'acétate et 1,5 partie d'éthanol, furent additionnés de 13,6 litres supplémentaires (0,5 partie) du même solvant organique. Le produit ainsi précipité pesait 36,4 g.
Exemple 16 Isolement de la préparation P0067. D IV.
1,68 partie des liqueurs-mères provenant de la précipitation de polydésoxyribonucléotides obtenus par la dépolymérisation d'acides désoxyribonucléiques de poids moléculaires élevés (préparation de défibrotide lot n 72) selon le procédé décrit dans WO 87/06235et contenant encore une quantité théorique de 1250 g d'acides désoxyribonucléiques, fut traitée de la manière décrite dans l'exemple 15. On a ainsi obtenu 34,8 g de préparation P0067. D IV possédant les caractéristiques analytiques suivantes (données sur base pondérale sèche) : poids moléculaire : 6100, h 0, A+T/G+C 1,508, A+C/T+C 0,917, pouvoir rotatoire + 35,9.
Exemple 17 Composition pharmaceutique destinée à l'administration parentérale.
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Ampoules scellées
EMI30.1
<tb>
<tb> oligodésoxyribonucléotides <SEP> 250 <SEP> mg
<tb> citrate <SEP> trisodique <SEP> dihydraté <SEP> 25 <SEP> mg
<tb> p-hydroxybenzoate <SEP> de <SEP> méthyle <SEP> 3,13 <SEP> mg
<tb> p-hydroxybenzoate <SEP> de <SEP> propyle <SEP> 0,62 <SEP> mg
<tb> eau <SEP> distillée <SEP> 2,5 <SEP> ml
<tb>
Exemple 18 Composition pharmaceutique destinée à l'administration par la voie orale
EMI30.2
<tb>
<tb> Gélules <SEP> en <SEP> gélatine <SEP> dure
<tb> oligodésoxyribonucléotides <SEP> 350 <SEP> mg
<tb> lactose <SEP> 56,75 <SEP> mg
<tb> bioxyde <SEP> de <SEP> silicium <SEP> colloîdal <SEP> 0,7 <SEP> mg
<tb> stéarate <SEP> de <SEP> magnésium <SEP> 3 <SEP> mg
<tb>