JPH03501563A - リボヌクレオチド混合物の調製方法 - Google Patents
リボヌクレオチド混合物の調製方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
リボヌクレオチド混合物の調製方法
発明の分野
本発明は医学に関し、そしてより詳しくは1.リボヌクレオチド混合物の調製方
法に関する。
壁板網膜アビオトロフィーは、進行性の視力低下および失明により特徴づけられ
る人間の遺伝病の一種である。この病気はかなりありふれており、その発生率は
人口1000人当り0.2〜5人に及ぶ。この壁板網膜アビオトロフィーの高い
発生率にもかかわらず、それを治療する有効な手段がない。
従来技術において知られるのは、治癒性質を有するリボヌクレオチド混合物の調
製方法である(Bulleten eksperim。
biologii i medit、5yny、 1989. Moseow+
kg、 p、23 26)。
この方法によれば、5−10■/祇の濃度のリボ核酸が45°Cの温度にて1時
間膵リボヌクレアーゼで処理される。
前記方法はあまり有効でない。得られたりボヌクレオチド混合物は、タンパク質
、高分子発熱性物質を含むので、外用にのみ適用され得る。該製剤の経口投与は
、そのヌクレオチドの著しい分解を引き起こし、従って該製剤の治癒効果が低下
する。
リボ核酸を膵リボヌクレアーゼで加水分解し、そして得られた加水分解物を透析
し、最終生成物の単離および濃縮を行うことにより、リボヌクレオチド混合物を
調製する別の方法が従来技術において知られている(Vest、nik Aka
d、 Med、 NaukSSSR+ 1971. Meditsina、 N
o、7+p−6369) o このようにして調製された混合物の収率は、40
−43重量パーセンI・である。
前記方法は低収率を有し、低および高分子発熱性化合物による汚染のために最終
生成物の純度が不十分である。この製剤の筋肉投与は、非常に苦痛を伴い、そし
て大部分の患者において体温上昇およびアレルギー反応を引き起こす。結膜下投
与は、耳下腺リンパ節の肥大および圧痛を伴う眼球結膜の充血および水腫を引き
起こす。
発明の開示
本発明は、最終生成物の収率を増加させ、品質を向上させ、そして発熱性を取り
除き得る改良された方法を提供する課題に基づく。
この課題は、膵ヌクレアーゼにょろりボ核酸の加水分解、加水分解物からのりボ
ヌクレオチド画分の単離、次いで最終生成物の単離によるリボヌクレオチド混合
物の調製方法を提供することにより解決され、ここで本発明によれば、リボ核酸
をpH4,5−5,6で加水分解し、次いで50−150人の孔径を有する膜上
で加水分解物からりボヌクレオチド画分を分離する。
−最終生成物の収率を増加させるために、加水分解を62−65°Cの温度で行
うことが推薦される。
温度が62°Cを下回れば、膵リボヌクレアーゼによる酵素的加水分解が遅(な
り;温度が65°Cを超えると、酵素が部分的に変性し、結果として加水分解が
不完全である。
微生物の繁殖を防ぐために、リボヌクレオチド画分の分離前に、加水分解物に1
5−30容量パーセントの量でエタノールを添加することが推められる。加水分
解物に添加されるエタノールの量が15容量パーセントよりも低い場合、微生物
の増殖がゆっくり起こる。エタノールの割合が30パーセントの上限を超えれば
、リボヌクレオチドが部分的に沈澱する。
リボヌクレオチド画分は、好ましくは20−30°Cの温度および0.15−0
.4 MPaの圧力において膜上で分離すべきである。
0.15 MPaの未満の圧力および20°C未満の温度下での混合物の濾過は
、生成物の収率を増加させることなしに該工程の時間を実質的に延長させ、微生
物による汚染が起こり得る。圧力がQ、 4 MPaを超え、そして温度が30
°Cを超えると、最終生成物の組成が変化し、そして膜が破壊され得る。最終生
成物は、本発明によれば、リボヌクレオチド画分を8−100倍容エタノールで
沈澱せしめ、次いで該溶媒を除去し、そして最終生成物を乾燥することにより、
単離される。リボヌクレオチド混合物を8−100倍容エタノールで沈澱せしめ
、溶媒を除去し、残りの混合物を0.55−0.66バーセントの塩化ナトリウ
ム溶液中に3.3−3.7重量パーセントの濃度に溶解し、得られた溶液を20
00−2200人の孔径の膜を通して78−98kPaの圧力で濾過することに
より、最終生成物が単離され得る。リボヌクレオチド混合物の沈澱を8倍容未満
の量のエタノールで行えば、低分子の発熱性不純物が完全には除去されない、ア
ルコールの容量が100倍容超えても、この方法の正の効果は増加しない。
3.7重量パーセントよりも大きいりボヌクレオチドの濃度を有する製剤は顕著
な発熱作用をもたらし、一方3.3重量パーセントよりも小さい濃度を有する製
剤の投与は多量の液体を必要とし、患者にとって望ましくない。
2000人よりも小さい孔径を有する膜により濾過を行うと、この工程が遅くな
り、2200人を超える孔径を通した濾過は、発熱物質含量を増加させ、そして
該製剤を不規格にする。
提案される方法は、既知の方法と比較して最終生成物の収率を8−15パーセン
ト増加させ、そして最終生成物の品質を改良し、発熱物質不含有にする。
発明を実施する最良の形式
酵母の核酸を蒸留水に懸濁する。アルカリの添加により、溶液のp)lを4.5
−5.5に調整する。次いで該溶液に膵リボヌクレアーゼを添加し、混合物を6
2−65°Cに加熱し、そしてこの温度でリボ核酸を加水分解する。加水分解の
終了後、加水分解物を冷却し、エタノールを添加し、そして混合物を撹拌する。
次いでミクロフィルター上で微細な沈澱物を分離する。
透明な溶液を、50−150人の孔径を有する膜を通して、好ましくは20−3
0°Cの温度および0.15−0.4 ?lPaの圧力において、限外濾過によ
り分画し、該濃縮物に蒸留水を加え、そして濾液の別の部分を得る。収得した限
外濾過液にエタノールを撹拌下で添加する。混合物を静置しておき、次に上滑を
デカンテーションし、一方法澱物を少量のエタノールで洗い、これをフィルター
上で分離し、そして沈澱物を乾燥する。最終生成物は溶液であることもでき、乾
燥素材であることもできる。
8−10倍容のエタノールでの最初の沈澱後に単離されたりポヌクレオチド混合
物を、3.3−3.7重量パーセントの濃度になるように0.55−0.65パ
ーセントの塩化ナトリウム溶液に溶解する。得られた溶液を、78 98kPa
の圧力下で2000−2200人の孔径を有する膜に通過させる。
調製された最終生成物は、白色またはわずかに黄色を帯びた非晶質粉末であり、
水および塩化ナトリウム水溶液に易溶−チルに不溶である。この製剤は、モノ−
オリゴリボヌクレオチドの混合物(ヘクタマーを含む)であり、主要画分(40
重量パーセントまで)はジヌクレオチドである。
このようにして調製されたりボヌクレオチド混合物を臨床的に試験した。この試
験は、視野の測定、網膜電位図、暗適応、および視力の測定を含んだ、該調製物
を2500人の患者において試験した。処置は10−15日間連続で与えられた
。4−6時間間隔の2回の注射により、毎日150−200■の製剤を筋向的に
投与した。
2500人の患者のうち、467人を長期間処置し、4〜14年(それ以上)間
観察した。
長期に渡る観察の結果は、深刻な進行性の病気が安定化したか、または患者の6
0パーセントにおいて改善を伴い安定化したことを示す。患者は主観的に野外お
よび室内における見当識の改善を報告した。
本発明のより良い理解のために、実際的な実施態様の例を説明のために次に記載
する。
例1
70gの酵母核酸を430−の蒸留水に溶解し、溶液のp)Iを2N NaOH
で5.1に調整する。次に140■の膵リボヌクレアーゼを添加し、そして65
″Cの温度で5時間加水分解を行う、加水分解物の全容量は465mである。こ
の混合物を25−35°Cに冷却し、そして120mのエタノールを添加する。
沈澱した物質をフィルター上で分離し、そして濾液を0.411Paの圧力およ
び30°Cの温度下において、100人の孔径を有するアセチルセルロースy<
この膜の濾過面積は100dである)に通す。
得られた濾液は360dの容量である。濾過残渣に70mの水を2回添加し、更
に140iの濾液部分を得る。収集した濾液部分(500,d)を5J2(10
倍容)のエタノールと混合し、得られた混合物を0〜+4°Cの温度に冷却し、
去してこの温度を4時間維持する。沈澱物をフィルター上で分離し、0.360
fのエチルアルコールで洗浄し、そして真空乾燥菌中で乾燥する。
最終生成物の収量は36gである。
びに230im、260imおよび280imの波長における吸光度(A)は次
のようである:
A 260/230 3.15
A 260/280 1.60
最終生成物の組成は、重量パーセントで次のようである:ヌクレオシド −1.
5
モノヌクレオチド 25.6
ジヌクレオチド 28.1
トリヌクレオチド 23.8
テトラヌクレオチド 12.8
ペンタヌクレオチドおよび
高級オリゴヌクレオチド 合計で100パーセントまで。
例2
67gの酵母核酸を400mの蒸留水に溶解し、溶液のpHを2N NaOHで
4.5に調整する0次に130■の膵リボヌクレアーゼを添加し、そして62°
Cの温度で5時間加水分解を行う、加水分解物の全容量は430iである。 2
5−35°Cに冷却された加水分解物に64.5dのエタノールを添加し、そし
て混合物を濾過する。次に、20°Cの温度および0.3 MPaの圧力下で、
150人の孔径を有するアセチルセルロース膜(濾過面積100d )に該濾液
を通過させる。6時間で380dの濾液が得られる。
濾過残渣に65−の水を添加し、更に65dの濾液を得る。濾液の全容量は44
5iである。それを3.6!のエタノールと混合し、沈澱した物質をフィルター
上で分離し、0.32のエタノールで洗浄し、そして真空乾燥菌中で乾燥する。
最終生成物の収量は39gである。
λ260nsmおよびpH2における比吸光度E =240゜pH7並びに23
0im、260imおよび280n+++の波長における吸光度(A)は次のよ
うである:
A 260/230 3.90
A 260/280 1.70
最終生成物の組成は、重量パーセントで次のようである:ヌクレオシド 4.8
モノヌクレオチド 19.3
ジヌクレオチド 23.1
トリヌクレオチド 20.2
テトラヌクレオチド 16.9
ペンタヌクレオチドおよび
高級オリゴヌクレオチド 合計で100パーセントまで。
例3
77gの酵母核酸を460−の蒸留水に溶解し、溶液のp)Iを2N NaOH
で5.2に調整する0次に150■の膵リボヌクレアーゼを添加し、そして65
℃の温度で5時間加水分解を行う。加水分解物の全容量は500dである。この
混合物を25−35°Cに冷却し、そして150dのエーテルを添加する。沈澱
した物質をフィルター上で分離し、そして濾液を0.2 MPaの圧力および2
5゛Cの温度下において4時間に渡り50人の孔径を有するアセチルセルロース
膜(濾過面積100cffl)に通す。濾液(5601d)を8倍容(4,54
2)のエタノールと混合し、そして得られた混合物をO〜+4°Cの温度に冷却
し、この温度を4時間維持する。沈澱物をフィルター上で分離し、0.4!のエ
タノールで洗浄し、そして真空乾燥菌中で乾燥する。
最終生成物の収量は40gである。
びに230im、260imおよび280ig*の波長における光吸収比は次の
ようである:
A 260/230 4
A 260/280 1.55゜
最終生成物の組成は、重量パーセントで次のようである:ヌクレオラド 2.1
モノヌクレオチド 12.6
ジヌクレオチド 25.2
トリヌクレオチド 24.2
テトラヌクレオチド 18.5
ペンタヌクレオチドおよび
高級オリゴヌクレオチド 合計で100パーセントまで。
例4
例1に記載のようにして、酵母核酸を加水分解し、そしてリボヌクレオチド画分
を分離する。沈澱物(36gの乾燥混合物)を蒸留水中0.6パーセントの塩化
ナトリウム水溶液(958城)に溶解し、そして撹拌して完全に溶解させる。得
られた黄色溶液を脱脂綿とカーゼフィルターに通し、次いで98kPaの圧力下
で2000人の孔径を有する膜に通す。リボヌクレオチド溶液を無菌条件下で無
彩色ガラスアンプル(3mlり中に入れ、そして119°Cの温度で34分間オ
ートクレーブ処理する。
最終生成物中のりボヌクレオチドの濃度は3.3パーセントであり;比重は1.
01である。このようにして調製された生成物は、非毒性で、無菌で、そして発
熱物質を含まない、その組成は例1において指摘されたものと同じである。
例5
酵母核酸の加水分解およびリボヌクレオチド画分の分離は、例2に記載のように
して行われる。沈澱物(乾燥質量39g)を蒸留水中の0.55パーセントの塩
化ナトリウム溶液(995IR1)に溶解し、完全に溶解するまで混合する。得
みれた黄色溶液を脱脂綿とカーゼ布に通し、次いで78kPaの圧力下で220
0人の孔径を有する膜に通す。リボヌクレオチド溶液を無菌条件下で無彩色ガラ
スアンプル(3−)中に入れ、そして122”Cの温度で32分間オーI・クレ
ープ処理する。最終生成物中のりボヌクレオチドの濃度は3.7バーセントであ
り、比重は1.008である。この最終生成物は非毒性であり、無菌であり、そ
して発熱物質を含まない。その組成は、例2において指摘されたものと同じであ
る。
産業上の利用可能性
火傷および疾患を治療するためにも利用できる。
該方法は、他の生物活性物質、例えば個々のオリゴヌクレオチドおよびそれらの
混合物、低分子タンパク質、ペプチド等を調製するためにも適当である。
国際調査報告
Claims (6)
- 1.リボヌクレオチド混合物の調製方法であって、膵リボヌクレアーゼによる酵 母リボ核酸の加水分解、得られた加水分解物からのリボヌクレオチド画分の分離 、次いで最終生成物の単離を含んで成り、前記酵母リボ核酸の加水分解が4.5 〜5.5のpHにて行われ、そして前記加水分解物からのリボヌクレオチド画分 の単離が50〜150Åの孔径を有する膜上で行われることを特徴とする方法。
- 2.前記加水分解が62〜65℃にて行われることを特徴とする、請求項1に記 載の方法。
- 3.前記リボヌクレオチド画分の分離の前に、加水分解物に加水分解物容量の1 5−30パーセントの量においてエタノールが添加されることを特徴とする方法 。
- 4.前記リボヌクレオチド画分が20〜30℃の温度および0.15〜0.4M Paの圧力において膜上で分離されることを特徴とする、請求項1または2に記 載の方法。
- 5.前記最終生成物が、8〜10倍容のエタノールを用いてリボヌクレオチド画 分を沈澱せしめ、次いで溶媒を除去しそして最終生成物を乾燥することにより単 離されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 6.前記最終生成物が、8〜10倍容のエタノールを用いてリボヌクレオチド画 分を沈澱せしめ、次いで溶媒を除去し、該混合物を0.55〜0.65パーセン トの塩化ナトリウム溶液中に3.3〜3.7重量パーセントの濃度に溶解し、そ して得られた溶液を78〜98kPaの圧力下で2000−2200Åの孔径を 有する膜を通して濾過することにより得られることを特徴とする、請求項1に記 載の方法。
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