JPH01308292A - ガングリオシド誘導体の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 体の製造方法に関する。ガングリオシドの夛子内エステ
ル誘導体は、神経系に何らかの損傷を与茅る疾患や事故
に起因する神経系統夕疾病を治療ずカングリ芽シトはグ
リコ゛スフィンコリピドの一員であって、シアリン酸部
分およびセラミ目こ結合している炭水化物部分を有する
構造を持っている。この炭水化物部分は、少なくとも１
個のカラクトースまたは゛グルコース部分および少なく
とも１個のＮ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセガ
ングリオノドの一般的な構】遍は次の−ｉ式て４表すこ
とができる。

１分子のシアリン酸１−少なく゛とも１モルのＮ−’ア
ここで、全ての部分はクリコシト結合によって結合して
いる。

多数のカンクリオシドか確認されており、それらは特に
神経組゛織、とりわけ脳組織に豊富にあることか知られ
てい名。種々の研究の結果、カンクリオシド中の最も重
要なシアリン酸はＮ−アセチルノイラ゛ミン酸（ＮＡＮ
Ａ）であり、Ｎ−クリコリルノイラミン酸はさは坪重要
でないことがわかった。確認されてい′る多岐のプルグ
リオシトの内、国際的な記号で標゛識さ１”ｔた以下゛
のガングリオシドか、牛の脳組織から抽出されたガング
リオシド混合物中に多量存在する裏かわかった （以下、−余白） ＧＤ、ｂ（１６％） β　　　　　　　　β　　　　β　　　　βＧａ１（１
→３）ＧａｌＮＡＣ（］→４：）Ｇａｌ（１→４）Ｇｌ
ｃ（１−１）Ｃｅｒ↑ ＮＡＮＡ ↑ Ｎ、Ａ、Ｎ、Ａ ＧＴＩゎ（１９％） β　　　　　　　　β　゛　　β　　　　βＧａ１（１
−＋３）ＧａｌＮＡＣ（１→４）Ｇａｌ（１−＋４）Ｇ
ｌｃ（１→１）ＣｅｒＮ、ＡＮＡ、、　　　　　　、、
、ＮＡＮＡ（！ ＮＡＮＡ ＧＭｌ（２１％） β　　　　　泗　　　β　　　β Ｇａ１（１→３）ＧａｌＮ　Ａ　Ｃ（１−４）Ｃ；ａｌ
（１→４）Ｇ　１ｃ（１−＋Ｉ）ＣｅｒＡＮＡ ｑ児四±Ｕ刃う ここでＧｌｃはグルコース、Ｇａ１Ｎ、Ａ、ＣはＮ−ア
セチル力ラクトサミン、Ｇａｌはカラクトース、Ｃｅｒ
はセラミド、ＮＡＮＡはＮ−アセチル−ノイラミン酸を
表し、（）中の％は牛の脳組織から抽出されたカンクリ
オシド混合物中の各ガングリオシドの含有量を表す。

ガングリオシドが神経系で重要な役割を果たしているこ
とはよく知られており、また最近、ガングリオシドか中
枢神経系の病変および末梢神経系の疾病の治療に有用で
あることが報告された（Ａｃｔａｐｓｙｃｈｉａｔ、　
５ｃａｎｄ、　、　５５１０２．１９７７　；Ｅｕｒ、
　Ｍｅｄ、　ｐｈｙｓ、　、　１３　］、　１９７７；
Ｒｉｃ、　Ｓｃｉ、　Ｅｄｕｃ、　Ｐｅｒｍ、　９１１
５．１９７８；Ａｄｖ、　ＥＸｐ、　Ｂｉｏｌ、　７１
２７５．１９７６；Ｅｌｅｃｔｒｏｍｙｏｇｒ、　ＣＩ
　ｉｎ、　Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ、　、　１９３５
３．１９７９．λｌ１ｎｅｒｖａ　Ｍｅｄｉｃａ、　６
９３２７７、１９７８；Ｍｉｎｅｒｖａ　Ｓｔｏｍａｔ
、　、　２７１７７、１９７８；λｌｅｄ、ｄｅｌ　Ｌ
ａｖｏｒｏ、　６８２９６（１９７７）；Ｂｒａｉｎ　
Ｒｅｓ、　１９７２３６．１９８０゜）ガングリオシド
の治癒作用は、主として神経組織における成長現象を刺
激すること、および神経刺激伝達に関連する脱酵素、例
えば酵素（Ｎａ’。

Ｋ　”）Ａ　Ｔ　Ｐアーゼを活性化することにあると考
えられている（Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　、　耳ワ、　２
３６．１９８０；Ｌｅｏｎら、Ｊ。

ｏｆ　ＮｅｕｒＯｃｈｅｍ、　、　３７２５０．１９８
１）。

ガングリオシドで刺激された神経成長は、損傷を受けた
神経組織の治癒および再生を促進することになろう。

神経系の疾病を治癒するに当たり、ガングリオシドより
効果の大きい化合物を見い出そうとする研究かなされて
来た。

本発明者らは、ガングリオシドのある種の誘導体が、神
経成長刺激において、および神経刺激伝達に関係してい
る脱酵素、例えば酵素（Ｎａ”、Ｋ”）ＡＴＰアーセを
活性化する点に於て、ガングリオシドより活性か強いこ
とを見い出した。具体的には、ガングリオシド′の分子
内エステル誘導体か神経系の疾病を治療するのに特に有
効であり、もと＝７− のガングリオシドより活性か強いことを見い出した。イ
ンビボおよびインビＩ・口実験の結果、神経成長刺激に
おいて、そしてまた、神経伝達に関与している（Ｎａ”
、に’）ＡＴＰアーセ膜酵素を活性化する点において、
この分子内エステル誘導体はもとのガングリオシドより
も優れていることかわかった。

これまでに、ガングリオシドの分子内エステル誘導体と
思われる極く僅かな物質か、極く少■、脳組織から分離
されている。ガングリオシドの分子内エステルは、ンア
リン酸のカルボキシル基と、炭水化物部分の１つの炭水
化物または同じガングリオシド分子内のもう１つの隣接
するシ゛ｒリン酸の水酸基との反応によって形成される
（Ｊ、ｏｆＮｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　３４．１
３５Ｌ　１９８０．　Ｂｕｌｌ、　ｏｆＭｏｌｅｃｕｌ
ａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、　
３．１７０．１９７８）。ノＪ゛ングリＡ−シトの分子
内エステル誘導体の構造は、例えば次の様に表わすこと
が出来るが、これは勿論１つの例示に過きない。

＝８− 〆 上記式［＋］において、ノアリン酸部分のＲはＩ］また
は０１−１、セラミド基中のＲ１はオレイン酸、ステア
リン酸またはりソール酸の様な脂肪酸を表わす。

式［１］のカングリオ７Ｆ分子内エステル誘導体は、シ
アリン酸のカルボキシル基が炭水化物部分の１つ、具体
的にはガラクトースの水酸基とエステル結合しているも
のである。この分子内エステル結合が形成すると、ノア
リン酸と炭水化物部分との間の通常のクリコンド結合と
一緒になって、通常５または６員環のラクトン環が形成
される。

これか、ガングリオシドの分子内エステル誘導体の構造
の特徴である。式［＋］は例示的に示したものであり、
ノアリン酸のカルボキシル基か炭水化物部分の１つの水
酸基とエステル結合することによって５員環またはそれ
より大きいその他のラクトン環が形成し得ることに注意
すべきである。

既述した様に、ノアリン酸のカルボキシル基か、もとの
、ガングリオシドにおいてはそのノアリン酸がクリコン
ト結合によって結合している隣接するノアリン酸とエス
テル結合した場合にも、、ガングリオシドの分子内エス
テル誘導体か形成される。

この場合の構造は下式で表わずことかてきるここでＲ２
はシアリン酸部分にクリコント結合している炭水化物部
分を表わす。

もう１つのカンクリオシド分子内エステル誘導体は下記
の式［］ＴＩ］で表わすことかできる一Ｉ■− ０［１・ ここでＲ３は隣接するノアリン酸かエステル結合し−Ｃ
いる炭水化物部分を表わす。従ゲＣ１式［■］は１．ノ
アリン酸かそれに隣接するノアリン酸にエステル結合し
ており、そしてそれ自体は炭水化物部分にエステル結合
しているカンクリオント分子内エステル、透尋体を表わ
している。従つ−Ｃ１一般に、炭水化物部分、少なくと
も１個のセラミドおよび少なくとも１個のノアリン酸部
分から形成されて′おり、１個またはそれ以」二のノア
リン酸か炭水化゛物部分にエステル結合しており、そし
て＝１２− ／または１個またはそれ以」二のノアリン酸か隣接する
シアリン酸にエステル結合しているガングリオシド分子
内エステル誘導体であって、」−記した化合物の種々の
類縁体を形成させることができる。

即ぢ、ガングリオシドには多数の分子内エステル誘導体
が可能であって、前記したものはその例示に過きない。

ガングリオシド分子内エステル誘導体の製造方法として
は、以下のものが知られている１、ガングリオシドを酢
酸またはトリクロロ酢酸溶液中に入れて放置するたけて
分子内エステルを生成せしめるもの（Ｓｐｈｉｎｇｏｌ
　１ｐｉｄｓ、　Ｓｐｌ＋ｉｎｇｏｌ　１ｐｉｄｏｓｅ
ｓ　ａｎｄ　Ａ１１ｉｅｄ　Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、　Ａ
ｄｖ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　Ｂｉｏ１１９９５、１９
７２；Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、　２８１１３３．丁９７７
）。この方法によれは、ガングリオシドに対して非常に
高い比率の酢酸を使用しなければならず、また、、ガン
グリオシドを完全に変換することはできない。従って、
最終的に精製工程が必要であり、これは通常イオン交換
樹脂、例えばセファテックスを用いて行われる。

２　水性媒質中ての水溶性カルホンイミドとカンクリＡ
７１・との反応（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ、　Ｒｅｓ’、旧
３４４．１９７５）。この方法は、反応か水性媒質中で
行われるので、カンクリオシドを完全に変換することは
できない。この方法は収率が非常に悪く、最終的に分子
内エステル生成物を精製しなければならない。

本発明は、高収率でカングリオ／）・分子内エステル誘
導体を製造するだめの新規な方法、特に完全にラフ）・
ン化されたガンクリオント分子内エステル誘導体の製造
方法を提供するものである。即しその方法は、カンクリ
オシドまたはその塩を非水性有機溶媒中、ラクトン化試
薬と無水条件下で反応させることからなる。さらに詳し
くは、哺乳動物から得たカンクリオシドまたはガンクリ
オンｌ”／Ｕ合物をイオン交換樹脂で処理して該カング
リオ／１・のノＪルポキンレート基をカルボキシル基ま
たはその塩（３級窒素塩）に変換し、得られたガングリ
オシドまたはカングリオント混合物を、非水性有機溶媒
中、無水条件下、ラクトン化試薬と反応さ−Ｕ、次いて
カンクリオシド分子内エステル誘導体をアセトンで沈澱
せしめることからなる。本発明で使用される適当な有機
溶媒はンメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホ
ルムアミド（ＤＭ　Ｆ　）、テトラヒドロフラン、ジメ
トキシエタン、ピリジンおよびスルホラン並びにそれら
の混合物などである。好適なラフ！・ン化試薬としては
、有機溶媒に可溶のカルボジイミド類、例えばシンクロ
へキンル力ルポジイミド、ベンジルイソプロピルカルボ
ジイミド、およびペンジルエチル力ルホジイミド、２−
クロロ−１−メチル−ピリジニウム塩類、エトキシアセ
チレンおよびウッドワード試薬（Ｎ−エチル−５−フェ
ニルイソオキサゾリウム−３゛−スルホネート）などが
含まれる。ガングリオシドを水性媒質中でカルボジイミ
ドと反応させる先行技術の方法では、分子内エステル誘
導体の収率は非常に低いか、非水性媒質中でカンクリオ
シドを反応させる本発明方法では、所望の分子内エステ
ル誘導体の収率は先行技術における可能な収率よりも高
く、実質的に定量的であることがわかった。本発明方法
に於いて使用される出発物質としてのカンクリオシドは
、哺乳動物、最も好ましくは牛の脳組織から抽出される
。以下の実施例は、本発明方法によるカンクリオシドの
分子内エステル誘導体の１！８ν造法を例示するもので
ある。

失旌桝↓ 牛の脳からガングリオシド混合物を抽出し、その５ｇを
ＤＭＳＯ５０７Ｉρに溶解する。次いで無水のスチレン
型樹脂（スルホン酸８５０〜１００メツンユ、Ｔ−Ｉ　
”型）４ｇをこの混合物に加え、全体を室温で３０分間
撹拌する。イオン交換樹脂によるこの処理でガングリオ
シドの全てのカルボキシレート基はカルボキシル基（−
ＣＯ○Ｈ）に変換される。

適当な物理的分析、例えば原子吸光分析により全てのカ
ルボキシレートｘか変換されたかどうかを確認する。次
いで樹脂を吸引濾過し、溶液をジンクロヘキシル力ルホ
ジイミｌ”］　　５’ｉで処理し、１時間放置する。沈
澱したシンクロへキジルウ、レアを濾過して除き、残っ
た溶液をアセトン１００ｍＱ。

で処理するとカンクリオシドの分子内エステル誘導体か
沈澱する。収量４６９（理論値の約９０〜９５％）。

分子内エステル誘導体は赤外吸収スペクトルおよび薄層
クロマトグラフィーで確認する。

Ｉ　Ｒ（Ｋ　Ｂ　ｒ法）　　このエステル−ラクトン結
合は１７５　Ｑｃ７Ｉ−’に吸収を示す。

直置クロマトグラフィー　７リノノゲルプレー１・を用
い、ＣＨＣＣ３／ＭｅＯＨ１０，３％ＣａＣ（！、（容
量比　５５／４５／Ｉ　Ｏ）で展開した時の分子内エス
テル混合物のＲ７値は０７〜０．８５の範囲にある。こ
の目的生成物のＲ４値は、出発物質８合物のＲ１値より
高い。このクロマトグラフィーの結果、出発物質が存在
しないことがわかる。ＯＩＮ　Ｎａ２Ｃｏ、溶液を用い
て６０°Ｃて１時間処理するとエステル結合が開裂し、
出発物質として用いたガングリオシドの混合物が得られ
る。

実施例２ ガングリオシド混合物（ブートリウム塩）９ｇを蒸留水
８０Ｈに溶解し、Ｄｏｗｅｘ　５０ｗＸ　８（１００〜
２００メツシユのトリエチルアンモニウム型）２０９を
充填したカラムを通ず（この処理でガングリオノトの全
でのカルボキンレート基はトリエチルアンモニウム塩に
変換される）。高減圧下で脱水したこの生成物を、超音
波処理浴を使って、トリエチルアミン８靜を含む無水テ
トラヒドロフラン２ＣＩＯｚρに溶かす。この溶液を、
４ＱｚＭの２−クロロ−１−メチル−ピリンニウム塩（
アニオンは、例エバ沃素、トルエン−４−スルホ不−１
・、トリフルオロメタンスルホネートなとてあってよい
）を含有している無水テトラヒドロフラン６００１１１
２に、絶えず撹拌し、４５°Ｃの一定の温度に保ぢなか
ら、４時間で徐々に添加する。この反応を４５°Ｃで１
８時間行う。

過剰の試薬を濾過し、混合物を窒素気流下で濃縮し、残
留物をクロロホルム／メタノール（１１）の混合物９．
０　ｍＱ、に再溶解し、アセトン４５０７Ｉρ中で沈澱
させる。最後に生成物を高減圧下で乾燥する。収量７．
９ｇ（８９，７％） ／リカケル薄層クロマＩ・クラフィー（溶媒−クロロポ
ルム／メタノール／ＣａＣρ２（０３％）（５５：４５
：１０）の混合物）の結果、分子内エステル混合物のＲ
７値は０７〜０．８５の範囲にあった。この目的生成物
のＲ４値は、出発化合物混合物のＲ４値よりも高い。ク
ロマトグラフィーにより、出発物質の存在しないことが
わかる。Ｎａ２ＣＯ３の０．ＩＮ溶液により、６０°Ｃ
で１時間処理するとエステル結合が開裂して、もとのガ
ングリオシド化合物が得られる。

カングリオンド混合物の分子内エステルまたは内部エス
テルのｒＲスペクトルをＫＢｒ法で測定したところ、］
７７５０ｃｍに典型的なエステル吸収を示した。

実施例３ ＧＭ、（ナトリウム塩）８ｇを蒸留水８０ｆｆｇに溶解
し、ＤＯｗｅｘ　５０ＷＸ　８（１００〜２００メツシ
ユのトリエチルアンモニウム型）１０ｙを充填したカラ
ムに通ず。高減圧下で脱水したこの生成物を、超音波処
理浴を用いて、トリエチルアミン４ｎρを含有している
無水テ）・ラヒＩ・ロフラン２００７ｄに溶解する。

この溶液を、２０ｖｔＭの２−クロロ−１−メチルーピ
リ／ニウノ＼塩（ここで、アニオンは、例えば沃素、ｌ
−ルエンー４−スルボ不一＋−、トリフルオロメタンス
ルホ不−１・なとであってよい）を含有している無水テ
トラヒドロフラン６００靜に、絶えず撹拌し、４５°Ｃ
の一定温度に保ちながら４時間で徐々に添加する。この
反応を４５°Ｃで１８時間行う。

過剰の試薬を応過し、混合物を窒素気流中で濃縮し、残
留物をクロロポルム／メタノール（１：１）の混合物８
０叶に溶解し、アセトン４００好中で沈澱させる。最後
に生成物を高減圧下で乾燥する。収量７０９（収率８８
，４％） シリカケル薄層クロマトグラフィー（溶媒・クロロポル
ム／メタノール／ＣａＣρ２（０３％）（５５４５：１
０）の混合物）の結果、目的生成物のＲ４値（０７）は
出発物質のそれ（０，６５）より高かった。このクロマ
トクラフィーの結果から、出発物質か含まれていないこ
とかわかる。Ｎａ２ＣＯ３の０、ＩＮ溶液により６０°
Ｃで１時間処理すると、エステル結合か開裂し、もとの
ガングリオシド′が得られる。ＧＭ、の分子内エステル
のＩＲスペクトルをＫＢｒ法により測定すると、ｌ　７
５　Ｑｃ７＋−’に典型的なエステル吸収か見られた。

実施例４ ガングリオシド化合物（ナトリウム塩）９９を蒸留水８
０．ＩＲＱに溶解し、Ｄｏｗｅｘ　５０ｗｘ　８　（１
００〜２００メツシユのピリジニウム型）２０ｇを充填
したカラムに通す（この処理でガングリオシドの全ての
カルボキシレート基はピリジニウム塩に変換される）。

高減圧下で脱水したこの生成物を無水テトラヒドロフラ
ン８００＋１２とエトキンアセチレン４．　、２　？（
６０ｚＭ）に溶解する。この混合物を３時間還流する（
還流器は一１０’Ｃ：に冷却し、脱水バルブを備えつけ
る）。溶媒および過剰のエトキンアセチレンを除去した
後、残留物をクロロホルム／メタノール（］：］）の混
合物８０Ｍρに溶解し、アセトン４００叶中で沈澱させ
る。収量８゜１９（収率９２０％） シリカケル薄層クロマトグラフィー（溶媒−クロロポル
ム／メタノール／ＣａＣρ２（０，３％）（５５：４５
１．ＩＯ，）の混合物）の結果、分子内エステル混合物
のＲ４値は０７〜０８５てあった。最終生成物のＲ１値
は出発物質の混合物のＲ０値より高い。クロマトクラフ
ィーの結果、出発物質が含まれていないことかわかる。

Ｎａ２ＣＯ３の０．ＩＮ溶液を用いて、６０°Ｃで１時
間処理すると、エステル結合か開裂し、もとのカンクリ
オシド化合物か得られる。

カンクリオシド化合物の分子内エステルのＩＲスペク（
・ルをＫＢｒ法で測定したところ、１７５０ｃｔｒｒ７
’に典型的なエステル吸収か観察された。

実施例５ ＧＭ、（すトリウム塩）８９を蒸留水８０ｍρに溶解し
、Ｄｏｖｒｒ＊　　５０ＷＸ　８（］　ＩＯＯ〜２００
メ、シュのピリンニウム型）１０９を充填したカラムに
通す。

この生成物を高減圧下で脱水し、無水テトラヒドロフラ
ン８００靜とエトキシアセチレン２．］ｇ（３Ｑ、ｖＭ
）に溶解する。この混合物を３時間還流する（還流管を
一１０°Ｃに冷却し、脱水バルフを取りイ」ける）。

溶媒と過剰のエトキシアセチレンを除去した後、残留物
をクロロホルム／メタノール（１：１）の混合物８０ｍ
（！に溶解し、アセトン４０Ｏ１ｌｌＱ中で沈澱させる
。収量７２ｇ（収率９１．０％）シリカゲル薄層クロマ
トグラフィー（溶媒−りｏｏホルム／メタノール／　Ｃ
ａＣ（２２（０、３％）（５５：４５・１０）の混合物
）の結果、目的生成物のＲ２値（０，７０）は出発物質
のＲ７値（０，６５）より高いことがわかった。クロマ
トグラフィーにより、出発物質は含まれていないことが
わかる。Ｎａ、ＣＯ３のＯ，ＩＮ溶液で、６０°Ｃで１
時間処理すると、エステル結合か開裂し、もとのガング
リオシドが得られる。

ＧＭ、の分子内エステルのＩＲスペクトルをＫＢｒ法で
測定すると、１７５０ａｊＩ−’に典型的なエステルの
吸収が観察される。

実施例６ ガングリオシド混合物（すトリウム塩）９ｇを蒸留水８
０靜に溶解し、Ｄｏｗｅｘ　５０ｗｘ　８（］　ＩＯＯ
〜２００メツシュのピリジニウム型）２０９を充填した
カラムに通ず。この生成物を高減圧下で脱水し、無水ピ
リジン２０（ｈｌ＋（！に溶解し１、これを、無水ピリ
ジン２００１１ｅにツビッタ−イオン・ウッドワード試
薬（Ｎ−エチル−５−フェニルイソオキサゾリウム−３
”−スルポイ、−１・、Ｗｏｏｄ’ｗａｒｄｅｔａ１．
’、　Ｊ、　Ａｍ、　ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　８３１０
１０〜１’Ｏ１’２．１９６１）　５　、５２＠（］０
７ＮＭ）を入れた懸濁液に加える。゛この反応混合物を
室温で１０日間撹拌する。

過剰の試薬を痔過し、溶媒を完全に除去した後、残留物
をクロロポルム／メタノール（１１）９０ｙｔｔＱに溶
解し、アセトン４５”０ｚ１２中で沈＃きせる。

収量７２ｇ（収率８１．８％） シリカゲル薄層クロマトグラフィー（溶媒＝りｏｏポル
ム／メタノール／　ＣａＣ１２２（０、３％）（５５：
　ｒ５：　ｒｏ）の混合物）の結果、分子内エステル混
合物のＲ４値は０７〜０．８５であった。この目的生成
物のＲ，値は出発物質のＲ，値よりも高い。クロマトグ
ラフィーの結果から、出発物質は含まれていないことが
わかる。Ｎａ２ＣＯ３の０１Ｎ溶液で６０°Ｃて１時間
処理すると、エステル結合が開裂し、もとのガングリオ
シド化合物か得られる。

ガングリオシド混合物の分子内エステルのＩＲスペクト
ルをＫＢｒ法で測定したところ、１７５Ｑｃｙｐ−’に
典型的なエステル吸収が観察された。

実施例７ ＧＭ、’（ナトリウム塩）８ｇを蒸留水８０ｍＱに溶解
し、Ｄｏｗｅｘ　５０ＷＸ　８（１０’Ｏ〜２００メツ
シユのピリジニウム型）１０ｇを充填したカラムに通す
。

この生成物を高減圧下で脱水し、無水ピリジン２００順
に溶解し、これを、無水ピリジン２００ｆｆｆ２にツビ
ッタ−イオン・ウッドワード試薬１．’２６ｙ（５ｆｆ
Ｍ）を入れた懸濁液に加える。この反応混合物を室温で
１０日間撹拌する。

過剰の試薬を濾過し、溶媒を完全に除去してから残留物
をクロロホルム／メタノール（１：　１）混合物８０＝
Ｃに溶解し、アセトン４００　ｙｎＱ中で沈澱を析出さ
せる。収量６３ｇ（収率　７９５％）シリカゲル薄層ク
ロマトグラフィー（溶媒＝クロロポルム／メタノール／
ＣａＣρ２（０３％）（５５・／１５：１０）の混合物
）の結果、目的生成物のＲ，値（，０，７０）は出発物
質Ｒ４値（０，６５）より高いことかわかった。このク
ロマトグラフィーにより、出発物質は含まれていないこ
とがわかる。

Ｎａ、Ｃｏ３の０．ＩＮ溶液で、６０°Ｃて１時間処理
すると、エステル結合か開裂し、もとの、ガングリオシ
ドが得られる。

ＧＭ、の分子内エステルのＩＲスペクトルをＫＢｒ法で
測定したところ、１７５０ｃｍ−’に典型的なエステル
吸収か観察された。

ｕ学的性質 ガングリオシドの分子内エステル誘導体およびその製造
方法は先行文献に記載されているが、この分子内エステ
ル誘導体の生物学的活性または医薬としての利用可能性
については何ら記載されていない。本発明者らは、ガン
グリオシドの分子内エステル誘導体は神経系の疾病を冶
癒する極めて高い活性を有し、その活性はガングリオシ
ド自体よりもずっと高いことを見い出した。即ぢ、、ガ
ングリオシドの分子内エステル誘導体は、病気または事
故に起因する末梢系および用ゴ枢神経系の疾病を包含す
る種々の神経障害の治療に使用することができる。この
化合物はまた、神経に影響を与える手術、例えば痔核手
術の後の術後療法に使用することができる。

本発明に係るガングリオシド分子内エステル誘導体の優
れた薬理学的性質を、以下に列挙する試験法により、ガ
ングリオシドと比較、評価することができる　１　好ク
ローム性セルライン（ｐｃ、、）における軸索成長、２
　ノイロン膜（Ｎａ″に’）ＡＴＰアーセ活性、３　眩
輝（ｄａｚｚｌｉｎｇ）後のエレクトロレチノグラムの
回復。

ノイロンの分化と考えられており、ガングリオシド分子
が」−記効果を発揮する生化学的機構はインビトロで細
胞培養モデルを評価することにより研究することかでき
る（ｐｃ、、は叶Ｐ、　Ｃａｌ　１ｓｓａｎｏ（ＣＮ、
Ｒ−Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｏ　ｄｉ　Ｂｉｏｌｏｇｉａ
　Ｃｅ１ｌｕｌａｒｅ−ｃｌ−７、イタリア国）から供
給されたＩＡサブクローンから誘導した）（”Ｇａｎｇ
ｌｉｏｓｉｄｅｓ　ｉｎ　Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ　
ａｎｄ　、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌｌａｒ　Ｆｕｎｃｔ
ｉｏｎ、　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　Ｒｅｐａ
ｉｒｌｌ、Ｅｄ、　ｂｙＭ、Ｍ、Ｒａｐｐｏｒｔ　ａｎ
ｄ　Ａ、Ｇｏｒｉｏ、Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｃｓｓ、　Ｎｅ
ｗ　Ｙｏｒｋ、１９８１）。このモデルでは、ガングリ
オシドまたはガングリオシド分子内エステル誘導体を神
経成長因子（ｌｊＧＦ）、軸索成長を刺激するためのｐ
Ｃ，、、分化の特異的誘導物質と共にＰＣ，２培養培地
に添加する。次いてガングリオシドによって刺激される
軸索成長をガングリオシド分子内エステル誘導体によっ
て刺激されるそれと比較することかできる。

具体的には、セル（１００，０００／フツート）を′ラ
ウス（Ｉｌｅｒａｃｏｓ）インキュベータ（５％ＣＯ２
，９５％の水分を含んた空気）中、３７℃に保持し、コ
ラ−ケン被覆組織培養、ｆ３Ｑｚｇのインテグリド・フ
ァルコン・プレート（ＩｎＬｅｇｒｉｄ　Ｆａｌｃｏｎ
　Ｐｌａｔｅｓ）に置いた（以下の培養培地の存在下　
８５％ＲＰＭ　　］　６４０　（Ｇ　１ｂｃｏ）、１０
％加熱不活性化馬血清（Ｇ　１ｂｃｏ）、５％牛脂児血
清（Ｇｉｂｃｏ）、５０Ｕ／靜ペニジリンおよび２５ｚ
ｙ／＋ρストレプトマイン）。培地は４８時間毎に交換
した。

この様な条件下では、細胞は分裂するが軸索を形成しな
い。ＮＧＦ（５０％ｇ／ｆｆのを添加すると細胞は増殖
をやめ、５〜１０日以内に軸索を形成し、分化する。こ
の効果を、５白目およびその後１日おきに軸索を有する
細胞の数を数えることにより評価した。

力８ングリオシドおよびその誘導体（］ｆｆＭ）をＮＣ
，Ｆと同時に培養培地に添加し、７白目および９白目に
軸索を有する細胞の数を数えることによりその効果を評
価した。

■　軸索成長についての比較実験の結果を表１に示す。

（以下、余白） 以上の結果、本発明に係るガングリオシドの分子内エス
テルはノイロン成長刺激作用を有し、この作用は７白目
においても９白目においても、ガングリオシドよりも強
いことがわかった。

ガングリオシドまたはカングリオ／ト分子内エステルの
脱酵素（Ｎａ’、に’）Ａ’ＴＰアーゼ活性化能を、イ
ンビトロでのノイロン膜標本で評価スルことかできる（
Ｊ、□ｆｌ（ｅｕｒｏ、ｃｈｅｍ　　前記）。

実験材料および方法 ａ）　　ラット脳の粗ミトコンドリアフラクション（’
Ｐ２フラクンヨン）の調製 Ｐ２フラクションの調製はＭｏｒｇａｎらの方法に従っ
て行った（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙ’ｓ、　Ａ
ｃｔａ　２４１７３７．１９７１）（全ての操作は０〜
４°Ｃで行った。Ｘｇ値は平均遠心力を示す）。チャー
ルスリバー系のスプラギュードウレイ（Ｓｐｒａｇｕｅ
　Ｄａｗｌｅｙ）雄ラット（体重１５０〜１７５ｙ）を
回頭し、脳を素早く摘出して水冷等張液で洗浄した。小
脳を切除した後、脳を４倍容量のホモジナイズ溶液（０
，３２Ｍシュクロース含有１ｘＭ燐酸カリウム緩衝液お
よび０．、］、ｎＭ　ＥＤＴＡニナト明ウムオウム７．
２７）を用い、１２上下ストロークのモータ駆動テフロ
ン−カラスホモジナイザ−（表示半径すきま、０．２５
ｙｚｘ；　８００ｒ、　ｐ、　ｍ、　）でホモ／ナイス
゛し。ポモン不−１・をホモジナイズ用溶液で１０％に
希釈し、あらい綿布４枚で濾過し、１０００ｘｙで１５
分間遠心分離した。

得られたペレットを同し量のホモジナイズ用溶液で洗浄
し、」１記と同し様に遠心分離した。上澄液を合わせて
１．７，５００ｘｙで２５分間遠心分離しくこの重力条
件は、フラクンヨンか最も多量の神経終末を含有する様
にするために選択した）、ペレットを９倍容量のホモジ
ナイズ溶液て４同洗浄し、その都度１７．５００　ｘｙ
で２５分間遠心分離した。「Ｐ２フラクンヨン」と呼ぶ
最後のペレットは、主成分として、破壊されていないミ
トコンドリアと神経終末を含んでいる。この最後のペレ
ットを、適量のホモジナイズ用溶液に、前記のテフロン
−カラスポモシナイサーを用いて均一に再懸濁し、直ち
に分析に使用した。貯蔵による不都合を避けるために、
常に使用直前に新鮮なＰ２フラクンヨンを調製した。こ
のＰ２フラク／ヨン標本はＮｅｕΔｃ　／　ｖｔｇ蛋白
質に結合した３３９±２．８（Ｓ、Ｄ、）のカンクリオ
シド含量を有していた。

ｂ）ＡＴＰアーセ検定 ＡＴＰアーセ活性はＷａｌｌｉｃｋらの方法（Ｊ、　Ｐ
ｌ＋ａｒｍＥｘｐｔｌ、　Ｔｈｅｒａｐ、　１８９４３
４．１９７４）に従い、分光光度法によって測定した。

特に記載しない限り、反応混合物は５ＱｕＭンユクロー
ス、０．２ｚＭ　ＥＤＴＡ二ナトツナトリウム７．４に
調節）、１００Ｉ１Ｍ１００Ｉ１．５　ｍＭ　Ｍ　ｇ　
Ｃ（！　７、］０１１ＭＫｃρ、２７！Ｍポスホ（エノ
ール）ピルベート・モノカリウム塩（ＰＥＰ　）（ｐＨ
７、４に調節）、３ｚＭ　ΔＴＰ、５Ｃ）＋Ｍｌ−リス
塩酸ｐＨ７，４，０，３３ｍＭＮＡＤＨ、ピルベート−
キナーゼ（Ｐ　Ｋ）（３Ｑμｇ／ｍのおよびラクテート
−デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨＸＩＯμ９／ｎのからなり
、最終容量は３靜、最終ｐＨは７２であった。Ｐ２フラ
クション５０〜７５μ９（蛋白質として）を添加するこ
とにより反応を開始した。

（Ｎａ’、に’）ＡＴＰアーゼ活性は、全ＡＴＰアーゼ
と３Ｘ］、Ｏ−５ウーアバインの存在下で測定したＭ　
ｇ　２　’依存性ＡＴＰアーゼとの差から求めた。個々
の検定に要する時間は３〜５分であった。

ＡＴＰアー七活性は国際単位（ＩＵＸ加水分解されたＡ
　Ｔ　Ｐのμモル／蛋白質ｍｇ１分）で表わした。

ガンクリオフｌ−誘導体の活性（５０ｎＭ）はノイロン
膜と３７°Ｃで２時間イン牛ユへ一トシた後測定　しブ
こ。

精米　ＡＴＰアーセ活性に関する比較実験の結果を表２
に示す。

以上の実験の結果、本発明に係るガングリオシド分子内
エステル誘導体はノイ品ン膜醇素（Ｎａ”。

Ｋ　”）’Ａ　Ｔ　Ｐアーゼ活性化能を有し、その活性
は同じモル濃度条件下のカンクリオンドよりずっと高い
ことかわかった。

■ ガンクリオントまたはノノンクリオント分子内エステル
誘導体の、網膜電気活性回復促進能は、家兎に物理的損
傷（眩輝）を与える方法で評価することができる。この
モデルに於いては、ガングリオンドまたはガングリオシ
ド分子内エステル誘導体を非経口的に（静脈内に）投与
する（“’Ｉｎｔ、　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　ｔｈ
ｅ　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｒ
ｅｔｉｎａｌｌ、Ａｔｈｅｎｓ、Ａｕｇｕｓｔ　　２８
−５２８−５ｅｐｔｅ　　Ｌ　１９７９．（Ｃｏｍｍｕ
ｎｉｃａｔｉｏｎ））（”５ａｔｅｌｌｉｔｅ　Ｍｅｅ
ｔｉｎｇ　ｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｐ
ｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏ
ｎｓ　ｏｆ　Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ　ＦｕｎｃＬｉ
ｏｎｓ”、　Ｃｏｒｔｏｎａ、　Ａｕｇｕｓｔ　２８−
３１．１９７５．　（Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）
）。

実験材料および方法　体重１９〜２ｋｇのニューシーラ
ント産雄家兎を使用した（“’Ｉｎｔ、Ｓｙｍｐ　ｏｎ
ｔｈｅ、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ
　Ｒｅ１ｊｎａ、Ａｔｈｅｎｓ、Ａｕｇｕｓｔ　２８−
２８−３ｅｐｔｅ、ｒ　１．１９７９）。

０４％ノヘンン（ｎｏｖｅｓ　１ｎｅ）を局所投与して
角膜麻酔を行った。弱い吸盤を備えた各膜電極（Ｈｅｎ
ｋｅｓによる）を付けてエレクトロレチノグラム（網−
３５＝ 膜電位図）を記録した。対照電極は前頭域に皮下挿入し
た針であった。以下の装置を使用した　ＡＣ前増幅器’
、５　Ａ　２２　Ｎ　Ｔｅｋｔ”ｒｏｎｉｃｓ（１０Ｈ
”ｚ　ＤＣフィルター）’：　Ｎｅｕｒｏａｖｅｒａｇ
’ｅｒ”’ｉ　１．７２　０ＴＥ　Ｂ’ｉｏｍｅｄｉｃ
ａ分析器　Ｘ　Ｙ　’ｐｌ’ｏｔ’ｔｅｒ　Ｉ　８０　
’ＯＬ　ｉ’ｎ５ｅｉ”ｓ記録ｇｔ：］２７３０Ｔ　Ｅ
　　Ｂ　ｉｏｍｅｄｉｃａ光刺激装置。

光刺激は、周波数０５ヘルツ、１０秒間の０゜２ワット
／秒の５回の閃光で行った。記録のベースタイムは１．
　’Ｏ’Ｏｌｌ１ｓｅｃてあった（ｐｒｅ−ｓｅｔ４５
　）。

動物を暗所に３０分間入れ、一定の空気、温度および嵜
の条件下で暗さに順応させ、以下の測定を行った。　　
　　　　　　　　　　　　　　　　１　全ての動物につ
いて１５分毎に、３回べ一スコ刈］ロールを測定した。

汲’ａ＋ｂ（ピークからピーク）の平均を削算した。

２、次いて角膜電極からｌ　’ａｍの距′ｎ１［に置い
た５ｃｈｏ’ｔｔ’　Ｍａ’ｉｎｚ”　’ＫＩｌ　”１
”５”Ｏ′Ｂランプを使って、２０分間動物を眩輝（め
くらまし）した。

この後、眩輝後２０．４０および６０分後の工＝３６− レクトロレチ７グラム（ＥＲＧ）の強さを測定すること
により、ＥＲＧ回復を調べた。これによって、あるへき
動物の基礎状態を査定することかできた。

次いで動物を被験化合物で処理し、３０分後に再び眩輝
にイゴシ、前記と同じ条件下でＥＲＧを記録した。被験
化合物は３３ナノモルフｋｇの割合で静脈内注射した。

積朱　　エレク）・ロレチノグラム回復に関する比較実
験の結果を以下の表３に示す。

表旦　　エレクトロレチノクラム回復に及ぼすガングリ
オシト誘導体の影響＊ ＊使用動物、家兎 投与量：　３３ｎｍｏｌｅ／に９（静脈注射）以上の結
果から、本発明に係る分子内エステル誘導体はエレクト
ロレチノクラムに於ける回復を促進すること、およびそ
の活性は全実験期間中を通してカングリオントより強い
ことがわかった。

より詳しくは、本発明に係る分子内エステルガングリオ
ント誘導体は、外傷性、圧迫性、退化性または毒素感染
性の障害であって、神経再生刺激および神経筋肉機能の
回ｉ（か必要である末梢神経系の障害、および外傷性、
酸素欠乏性、退化性または毒素感染性の障害であって、
機能回復のためにノイロン成長の刺激が必要である中枢
神経系の障害の治療に使用することかてきる。

本発明に係るガングリオ／１ζ分子内エステル誘導体は
神経系、特に末梢神経障害および中枢神経系の疾病を治
すための種々の治療に医薬として（吏用することかでき
る。これらの障害には、以前はカンクリオ／Ｉ・か使わ
れて来たか、」−記の実験の結果、カンクリオントの分
子内エステル誘導体がガンクリオン！・自体よりもすっ
と活性の強いことか４つかった。

本発明に係るガングリオシド分子内エステル誘導体は、
筋肉内、皮下、皮肉、静脈内注射またはインフュージョ
ン用医薬製剤の形にして、ヒトおよび動物に投与するこ
とができる。この製剤は、本発明の化合物の溶液であっ
てもよく、本発明化合物の凍結乾燥粉末であってもよく
、そしてまた、それらは薬学的に許容し得る担体や希釈
剤を含んでいてもよく、さらに生体液と等張であって、
同じｐＨの緩衝液の形に調節されていてもよい。投Ｌｇ
量は所望の薬効および所望の投与ルートによって変わる
。投与量は、例えば、ＩＢ当たり体重１にｇ当たり活性
化合物０．０５〜５ｚｙとし、単位投与量を体重１ｋｇ
当たり０．０５〜２Ｉ１ｇ／に９とすることかできるか
、勿論これに限定されるものではない。

本発明に係る医薬製剤は、通常種々のガングリオシド分
子内エステル誘導体の混合物を使って製造されるか、単
一の活性成分だけを含むものであっもよい。

以下に、神経系の障害の治療用として溶液の形に製剤化
される医薬製剤の例を挙ける。

製剋刺１　２ｒｒｔＯのアンプル 活性成分５屑９および塩化プ用・リウム１６Ｈにパイロ
ンエンを含まない蒸留水を１吏っだクエン酸塩緩衝液（
ｐ＋−１６）を加えて２ｍ（！とする。

製剤刺ス　２１のアンプル 活性成分５０ｙｒｔ＆および塩化すトリウＡ１６ｍｇに
パイロジエンを含まない蒸留水を使ったクエン酸塩緩衝
液（ｐＨ６）を加えて２ｍｇとする。

製遡男多　４１のバイアル 活性成分］０Ｑｕｙおよび塩化ナトリウム３２ｍｇにパ
イロジエンを含まない蒸留水を使ったクエン酸塩緩衝液
（ｐ＋−１６）を加、えて４靜とする。

以」二の製剤は、前記ルートのいずれかで、ヒト及び動
物に直接投与することができる。更に、この製剤は活性
物質を約２％から約５０％含ませることができる。

神経系の障害の治療に使用できるその他Φ医薬組成物の
例を更に以下に示す。以下の製剤は２本のバイアルから
なっている。活性成分を含んでいる１番目のバイアルに
は、薬学的に許容し得る賦形剤、例えばグリノンおよび
マンニットと共に、約１０〜約９０重量％の活性成分の
凍結乾燥粉末か入っている。２番目の溶媒用バイアルに
は、所望量の溶媒、例えば塩化すトリウムおよびクエン
酸塩緩衝液を入れる。投与直前に２本のバイアル　　　
　　・の内容物を混合し、凍結乾燥活性物質粉末を素早
く溶解して注射溶液とする。ガングリオシド分子内エス
テル誘導体は溶液状態より凍結乾燥状態の方が安定であ
るので、この様な剤型は前記したちのより、より好まし
いものである。

製剤例４ ａ、　活性物質５ｚｙおよびクリンン３０ｕｙの凍結乾
燥物を入れた２ｆｆ＆アンプル。

ｂ、　塩化ナトリウム１６ｍ７にパイロンエンを含まな
い蒸留水を使ったクエン酸塩緩衝液を加えて２ｎρとし
た液を入れた２Ｍｇアンプル。

型側形 ａ　活性物質５２！９およびマンニット４０７１１９の
沖ｉ吉乾燥物を入れた３ｍ（！アンプル。

ｂ　塩化す］・リウム１６ｍ９にパイロンエンを含まな
い蒸留水を使ったクエン酸塩緩衝液を加えて２好とした
液を入れた２ｎρアンプル。

製剤例６ ａ　活性物質５０１１ｙおよびグリシン２５１１ｙの凍
結乾燥物を入れた３ｍ（！アンプル。

ｂ　塩化ナトリウム２４Ｒ９にパイロジエンを含まない
蒸留水を使ったクエン酸塩緩衝液を加えて３靜とした液
を入れた３靜アンプル。

製創刺Ｊ ａ　活性物質５０＋ｙおよびマンニラｌ−２０ｍｑの凍
結乾燥物を入れた３ｎρアンプル。

ｂ　塩化ナトリウム２４ｎ９にパイロジエンヲ含まない
蒸留水を使ったクエン酸塩緩衝液を加えて３ｆｆＣとし
た液を入れた３ｆｆＱ、アンプル。

製剤数置 ａ、　活性物質］００ｍｑおよびグリシン５０ｕｙの凍
結乾燥物を入れた５１１ρノ・イアル。

ｂ、塩化すトリウム３２ｍｙにパイロンエンを含まない
蒸留水を使ったクエン酸塩緩衝液（ｐＨ６）を加えて４
ｍ（ｌとした液を入れた４Ｍアンプル。

弊剋例） ａ、　活性物質］００ｕｇおよびマンニラｈ　４　Ｑ　
ｍｇの凍結乾燥物を入れた５Ｍバイアル。

ｂ　塩化すトリウム３２Ｉｌ！？にパイロンエンを含ま
ない蒸留水を使ったクエン酸塩緩衝液（ｐＨ６）を加え
て４ｍ夕とした液を入れた４次ｇアンプル。

特許出願人　　フィディーア・マンニラ・ベル・アチオ
ニ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ガングリオシド分子内エステル誘導体の製造法であ
   って、非水性有機溶媒中において、ガングリオシドある
   いはガングリオシド混合物、または該ガングリオシドあ
   るいはガングリオシド混合物の塩をラクトン化試薬と反
   応させてガングリオシド分子内に少なくとも１個のラク
   トン結合を形成させることを特徴とする製造法。 ２、ガングリオシド分子内エステル誘導体の製造法であ
   って、 （ａ）哺乳動物から得たガングリオシドまたはガングリ
   オシド混合物を非水性有機溶媒に溶解し、 （ｂ）該ガングリオシドまたはガングリオシド混合物に
   イオン交換樹脂を加えることによって該ガングリオシド
   のカルボキシレート基をカルボキシル基に変換し、 （ｃ）得られたガングリオシドまたはガングリオシド混
   合物をラクトン化試薬と反応させてガングリオシド分子
   内に少なくとも１個のラクトン結合を形成させることを
   特徴とする製造法。 ３、ガングリオシド分子内エステル誘導体の製造法であ
   って、 （ａ）ガングリオシドまたはガングリオシド混合物をイ
   オン交換にかけて該ガングリオシドのカルボキシレート
   基をその塩に変換し、 （ｂ）このようにして調製したガングリオシドまたはガ
   ングリオシド混合物の塩を非水性有機溶媒に溶解し、 （ｃ）該ガングリオシドまたはガングリオシド混合物の
   塩をラクトン化試薬と反応させてガングリオシド分子内
   に少なくとも１個のラクトン結合を形成させることを特
   徴とする製造法。 ４、塩がガングリオシドまたはガングリオシド混合物の
   ３級窒素塩である特許請求の範囲第３項に記載の製造法
   。 ５、塩がトリエチルアンモニウムまたはピリジニウムと
   の３級窒素塩である特許請求の範囲第４項に記載の製造
   法。 ６、有機溶媒がジメチルスルホキシド、ジメチルホルム
   アミド、スルホラン、テトラヒドロフラン、ジメトキシ
   エタンおよびピリジンからなる群から選ばれる特許請求
   の範囲第１項〜第５項のいずれかに記載の製造法。 ７、ラクトン化試薬が有機溶媒に可溶のカルボジイミド
   類、２−クロロ−１−メチル−ピリジニウム塩類、エト
   キシアセチレンおよびＮ−エチル−５−フェニルイソオ
   キサゾリウム−３′−スルホネートからなる群から選ば
   れる特許請求の範囲第１項〜第６項のいずれかに記載の
   製造法。 ８、カルボジイミドがジシクロヘキシルカルボジイミド
   、ベンジルイソプロピルカルボジイミドまたはベンジル
   エチルカルボジイミドである特許請求の範囲第７項に記
   載の製造法。 ９、ラクトン化試薬との反応の後、ガングリオシド分子
   内エステル誘導体をアセトンで沈澱せしめる特許請求の
   範囲第１項〜第８項のいずれかに記載の製造法。 １０、ラクトン化試薬との反応によってガングリオシド
   またはガングリオシド混合物を完全に変換し、完全にラ
   クトン化されたガングリオシド分子内エステル誘導体を
   生成させる特許請求の範囲第１項〜第９項のいずれかに
   記載の製造法。