JP5460874B2 - ７，２″−脱水プエラリンおよびその塩類誘導物およびその調製方法と応用 - Google Patents

Description

本発明はプエラリン誘導物およびその調製方法と応用に関するもので、特に７，２″−脱水プエラリンおよびその塩類誘導物およびその調製方法と応用に関するものであり、医薬技術分野に属する。

プエラリンはマメ科植物の野生のクズや、プエラリア・ロバータの根から抽出されるイソフラボングリコシドで、研究の結果、本品は遊離基の除去や(J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 7504-7509.)、血清コレステロールの低下(J. Nat. Prod. 2003, 66, 788-792.)、抗凝血および抗アレルギー反応(Biol. Pharm. Bull. 2002, 25, 1328-1332.)などの活性を持っていることが発現され、臨床上では冠状動脈心臓病や（中国中西医結合雑誌2003, 23,895-897.）、狭心症（中国中西医結合雑誌1998, 18, 282-284.)、心筋梗塞(Chinese Med. J. 1992, 105, 11-17.)、突発性聴力喪失（第一軍医大学学報 2002, 22, 1044-1045)およびアルコール中毒(Pharmacol. Biochem. Behav. 2003, 75, 593-606; Alcohol Clin. Exp. Res. 2003, 27, 177-185.)などの治療に使われている。

プエラリンが上記のような数多くの薬理活性があるため、人々はプエラリンおよびその誘導物に対して注目するようになっているが、プエラリンの経口投与吸収の生物利用度が低いので、経口投与剤型の応用は制限を受け、臨床上では主にプエラリン注射剤液剤型を使用している。応用の便利のために、プエラリンの溶解性と生物利用度の改善が必要とする。目下、関連文献の報道は主に構造の修飾又は特別剤型に及んでいる。楊若林らは嘗てプエラリンに対する一連のメチル、メトキシル、イソプロピル、ベンゾイル、トリフェニルメチルなどの誘導化を行い、ウサギの目血液流量試験の結果、構造修飾後の化合物中のアセチル化とトリフェニルメチルなど誘導物は血液流量を著しく増やした（中国薬科大学学報 1999, 30, 81-85.)。Dan Liらは酵素法を利用してプエラリンに対する幾つかのグリコシル化反応を行ったが、その誘導物の水溶性は明らかに改善された(Carbohydr. Res. 2004, 339, 2789-2797.) 。婁紅祥らはプエラリンに対する一連のアセチルサリシル誘導化を行ったが、血小板凝集活性試験の結果、７−アセチルサリシル・プエラリンはヒトの対外血小板の集合反応に非常に著しい分量依頼性抑制作用（IC₅₀=0.91mmol.L^-1)を示し、しかも、その抑制作用は、単独に相当分量のアスピリンとプエラリンを使用する場合に比べて、明らかに強かった(CN200410036070.9)。

報道によれば、数多くの Ｃ−グリコシルフラボン類化合物のフェノール性水酸基は、そのグリコシル部分の水酸基と分子内脱水反応が発生し、比較的強い生物活性を有する脱水誘導物が生成されるということである(Tetrahedron 2004, 60, 9357-9379; Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004,14,3201-3203;Org. Lett. 2009, 11, 2233-2236.)。しかし、検索の結果、７，２″-脱水プエラリン誘導物に関する報道は今までまだない。

プエラリンはＣ−グリコシルイソフラボンであり、４′位に弱酸性を示す水酸基をその活性基グループとしており、しかも、イソフラボンニュークリアスは平面構造であるため、我々はプエラリンのスペース構造を変えることのできる８位のグルコピラノシルグループを利用して構造の改良を行い、２″位の水酸基と７位の水酸基との分子内Mitsunobu反応によって、７，２″-脱水プエラリン(7, 2″-dehydrate puerarin)を合成した。

上記既存技術に対して、本発明にて解決しようとする技術問題として、その一は、プエラリンの経口投与吸収性が低く、臨床上注射剤だけに応用されている現状に対して、プエラリンの構造修飾誘導物ーー７，２″-脱水プエラリンおよびその塩類誘導物およびその調製方法を提供することで、その二は、７，２″-脱水プエラリンおよびその塩類誘導物を提供して、心臓・脳血管疾病の治療又は/と予防薬物の調製に応用させることである。その疾病としては、不整脈や、冠状動脈心臓病、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞などの心臓・脳血管疾病が含まれる。

本発明は次の技術ソリューションによって実現される。

本発明の７，２″-脱水プエラリンの構造式は次の式（Ｉ）のとおりである。

（Ｉ）

その中、ＲはＨである。

本発明の７，２″-脱水プエラリン塩類誘導物とは、７，２″脱水プエラリンの４′位水酸基と各種有機・無機アルカリとの反応によって生成される塩類誘導物を指し、 例えば、反応後、ＲはＮａ^＋、Ｋ^＋、

などのイオン中のいずれかである。

本発明の７，２″-脱水プエラリンの調製方法：プエラリンとＰＹ_３およびアゾ類化合物を１：（１〜４）：（１〜４）のモル比で混合し、有機溶剤の中で、分子内Mitsunobu反応を発生させることによって、式（Ｉ）の化合物が得られるが、通常のろ過、濃縮、シリカゲルカラムクロマトグラフィで、得られた７，２″-脱水プエラリンを分離純化する。その合成反応式は次のとおりである。

前記ＰＹ_３中のＹグループは、アリル、アルキル、ヘテロアリール、アルコキシル中のいずれかである。

前記アゾ類化合物はアゾジカルボン酸ジイソプロピル（ＤＩＡＤ）、アゾジカルボン酸ジエチルエステル（ＤＥＡＤ）、N,N,N‘,N’-テトラメチルアゾジカルボキシアミド（ＴＭＡＤ）又はアゾジホルムジピペリジン（ＡＤＤＰ）中のいずれかである。

前記有機溶剤はテトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロフォルム、ジメチルホルムアミド、トルエン、ベンゼン又はヘキサメチルリン酸トリアミド中のいずれかである。

本発明の７，２″-脱水プエラリン中の４′位の弱酸性を示す水酸基は、各種有機・無機強アルカリと反応し、７，２″-脱水プエラリンの塩類誘導物を生成するが、水溶性と安定性を増強し、その薬動学パラメータを改善させる。

本発明の７，２″-脱水プエラリンおよびその塩類誘導物は、心臓・脳血管疾病の治療又は/と予防薬物の調整に使われるが、前記疾病には不整脈や、冠状動脈心臓病、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞などの心臓・脳血管疾病が含まれる。

本発明の７，２″-脱水プエラリンおよびその塩類誘導物は、薬剤学上に記載のいずれかの剤型の薬物に作ることができるが、前記剤型において、好ましくは経口剤又は注射剤とする。

文献の報道によると、数多くのＣ−グリコシルフラボン類化合物のフェノール性水酸基は、そのグリコシル部分の水酸基と分子内脱水反応が発生し、比較的強い生物活性を有する脱水誘導物が生成されるということである(Tetrahedron 2004, 60, 9357-9379; Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004, 14, 3201-3203; Org. Lett. 2009, 11, 2233-2236.)。プエラリンはＣ−グリコシルイソフラボンであり、４′位は弱酸性を示す水酸基を活性グループとしており、イソフラボンニュークリアスは平面構造であるため、発明人はプエラリンのスペース構造を変えることのできる８位のグルコピラノシルグループを利用して構造の改良を行い、２″位の水酸基と７位の水酸基との分子内Mitsunobu反応によって、７，２″-脱水プエラリン(7, 2″-dehydrate puerarin)を合成した。

本発明の７，２″-脱水プエラリン誘導物はプエラリンと同様に、不整脈や、冠状動脈心臓病、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞などの各種心臓・脳血管疾病に対して優れた予防と治療作用があり、試験によれば、その一部の活性はプエラリンに比べて明らかに優れている。本発明の７，２″-脱水プエラリン誘導物はプエラリン自身び極性とスペース構造を変えることによって、化合物の水溶性に影響を与え、薬物の細胞膜透過機能を改善し、胃腸での吸収を増強し、プエラリンの経口投与生物利用度を向上することによって、目下臨床上でのプエラリン経口吸収生物利用度が低い欠陥を克服することができ、心臓・脳血管疾病の治療と予防薬の調製の面で優れた応用の前途を持っている。

生理食塩水組ＥＣＧである。 プロパンジオール溶媒胃内投与組ＥＣＧである。 プロパンジオール溶媒ｉｖ組ＥＣＧである。 プエラリン注射剤組ＥＣＧである。 ７，２″-脱水プエラリン胃内投与組ＥＣＧである。 ７，２″-脱水プエラリンｉｖ組ＥＣＧである。 ７，２″-脱水プエラリン^１ＨＮＭＲである。 ７，２″-脱水プエラリン^１３ＣＮＭＲである。 注：図１〜６の上方の標記は、それぞれ０．１％のＢａＣｌ_２を投与し始めた場合の心電図、０．１％のＢａＣｌ_２を投与した後の不整脈心電図、および０．１％のＢａＣｌ_２を投与し始め、３０ｍｉｎが経過した場合の心電図である。

７，２″-脱水プエラリンの調製
２．９ｇ（約７ｍｍｏｌ）のプエラリンをＮ_２の保護の下で２００ｍｌの無水テトラヒドロフランの中に溶かして、アイスバスの条件の下で、３．５ｍｌ（約１７．５ｍｍｏｌ）のアゾジカルボン酸ジイソプロピルと４．６ｇ（約１７．５ｍｍｏｌ）トリフェニルホスフィンを入れて、ゆっくりと室温まで温度を上げて、マグネチックミキサーで１６ｈ攪拌してから、濃縮、通常シリカゲルカラムクロマトグラフィ(CH₂Cl₂: CH₃OH = 13:1, 8:1)によって、２．４ｇの７，２″-脱水プエラリンが得られるが、その収率は８７．１％である。

７，２″-脱水プエラリンは白色粉末で、分子式はC₂₁H₁₈O₈で、構造式は式Ｉの通りで、分子量は３９８、mp 258.4〜260.1℃; ¹H NMR (600 MHz, CD₃OD): δ 8.23(d, 1H, J = 8.4 Hz), 8.21(s, 1H), 7.39(d, 2H, J = 8.4 Hz), 7.13(d, 1H, J = 8.4 Hz), 6.87(d, 2H, J = 8.4 Hz), 5.45(d, 1H, J = 3.6 Hz), 4.81(t, 1H, J = 3.6 Hz), 4.07 (dd, 1H, J = 4.8, 9.6 Hz), 3.87(dd, 1H, J = 2.4, 12.0 Hz), 3.65(m, 2H), 3.43(m, 1H); ¹³C NMR (150 MHz, CD₃OD): δ 61.8, 68.1, 72.1, 73.6, 79.1, 87.6, 110.1, 115.2, 116.2, 118.9, 122.9, 125.3, 129.9, 130.4, 153.3, 154.1, 157.8, 166.2, 176.8; HRMS(ESI) m/z calcd for C₂₁H₁₈O₈[M+Na]⁺ 421.0894, found 421.0893.（図７、図８のとおり）。

（Ｉ）

７，２”-脱水プエラリンの調製
２．９ｇ（約７ｍｍｏｌ）のプエラリンをＮ_２の保護の下で２００ｍｌの無水テトラヒドロフランの中に溶かして、アイスバスの条件の下で、２．４ｍｌ（約１４．０ｍｍｏｌ）のN,N,N‘,N’-テトラメチルアゾジカルボキシアミドと３．４ｇ（約１４．０ｍｍｏｌ）トリブチルホスフィンを入れて、ゆっくりと室温まで温度を上げて、マグネチックミキサーで１６ｈ攪拌してから、濃縮、通常シリカゲルカラムクロマトグラフィ(CH₂Cl₂: CH₃OH = 13:1, 8:1)によって、２．２ｇの７，２″-脱水プエラリンが得られるが、その収率は８１．４％である。

７，２”-脱水プエラリンの調製
２．９ｇ（約７ｍｍｏｌ）のプエラリンをＮ_２の保護の下で２００ｍｌの無水テトラヒドロフランの中に溶かして、アイスバスの条件の下で、１．６ｍｌ（約１０．５ｍｍｏｌ）のアゾジカルボン酸ジエチルエステルと２．８ｇ（約１０．５ｍｍｏｌ）トリフェニルホスフィンを入れて、ゆっくりと室温まで温度を上げて、マグネチックミキサーで１６ｈ攪拌してから、濃縮、通常シリカゲルカラムクロマトグラフィ(CH₂Cl₂: CH₃OH = 13:1, 8:1)によって、２．１ｇの７，２″-脱水プエラリンが得られるが、その収率は７７．５％である。

試験１
７，２″-脱水プエラリンの抗不整脈試験
（1）方法：健康な成年のWistarラット６０匹、オス、１８０〜２２０ｇを取って、体重別にランダムに生理食塩水組や、プロパンジオール溶媒胃内投与組、プロパンジオール溶媒ｉｖ組、プエラリン注射液組、７，２″-脱水プエラリン胃内投与組、７，２″-脱水プエラリンｉｖ組などに分けて、１０匹/組とする。静脈注射組は毎日１回、連続三日間投与し、胃内投与組は毎日２回、三日間投与する。生理食塩水組は対応する体積の０．９％塩化ナトリウム注射液を投与し、プロパンジオール溶媒胃内投与組の投与量は１４．３％のプロパンジオール１ｍｌ/１００ｇ、プロパンジオール溶媒静脈注射投与組の投与量は４０％のプロパンジオール０．５ｍｌ/１００ｇ、プエラリン注射液組の投与量は５０ｍｇ/ｋｇ、７，２″-脱水プエラリン胃内投与組の投与量は６０ｍｇ/ｋｇ、７，２″-脱水プエラリン静脈注射液組の投与量は３０ｍｇ/ｋｇとする。ラットの腹腔に１０％の抱水クロラール麻酔剤（０．３５ｍｌ/１００ｇ）を注射し、背中固定を取り、ＢＬ-４１０生物機能試験システムを接続し、心電の変化をモニタリングする。露出の大腿静脈に頭針を埋めて、連続で定速の注射ポンンプで、定速に０．１％のＢａＣｌ_２を注入する。分量は０．１ｍｌ/１００ｇ、スピードは０．６ｍｌ/ｍｉｎ。注射の際、時間を計算し始め、３０ｍｉｎ以内の心電図（ＥＣＧ）をモニタリング・記録し、不整脈の潜伏時間を記録し、不整脈の持続時間（３０ｍｉｎ以内に回復できない場合は３０ｍｉｎと記録）を記録する。各組ラットの間の差を比較し、ＳＰＳＳソフトで統計学分析を行い、Ｐ＜０．０５であれば統計学的差があると認める。

（2）結果：心電図は図１〜図６のとおりで、データは表１のとおりである。生理食塩水組に比べて、７，２″-脱水プエラリン胃内投与組と７，２″-脱水プエラリンｉｖ組は０．１％のＢａＣｌ_２誘導による不整脈潜伏時間がある程度伸ばされていたが、統計学的意味はなかった。生理食塩水組に比べて、７，２″-脱水プエラリン胃内投与組と７，２″-脱水プエラリンｉｖ組は不整脈持続時間に対して明らかな作用があって、不整脈持続時間を著しく短縮した（^**Ｐ＜０．０１）。陽性対照のプエラリン注射液組に比べても不整脈持続時間を著しく短縮し、著しい統計学的意味があった（^＃＃Ｐ＜０．０１、^＃Ｐ＜０．０５）。これだけでなく、７，２″-脱水プエラリンｉｖ組に比べて、７，２″-脱水プエラリン胃内投与組はさらに明らかな不整脈持続時間短縮作用を示し、７，２″-脱水プエラリンｉｖ組に比べて、さらに著しい効果があった。

結論：本発明の７，２″-脱水プエラリン誘導物は不整脈持続時間を著しく短縮し、水溶性に優れており、生物利用度が高い。

試験２
７，２″-脱水プエラリン誘導物の抗凝血試験
（1）方法：イエウサギ１匹を取って、重量を量り、耳静脈注射の方式で３％のネムブタール１ｍｌ/ｋｇを投与し、麻酔の後、頸動脈を分離して、遠心端を縛り、近心端にチューブを挿し込んで、２５ｍｌの血を取り、それぞれ、予め５０ｍｇ/ｍｌの蓚酸カリウムを入れた０．５ｍｌの試験管の中に入れて、均一に混ぜる。また、予め対応する薬物を入れた０．２５ｍｌの試験管２４本を取り、個々の試験管に上記ウサギ血０．９ｍｌを入れてから、それぞれ２ｍｇ/ｍｌのＣａＣｌ_２０．１ｍｌを入れて、均一に混ぜてから、直ちに３７±０．５℃の定温水バスに入れて、３０ｓごとに1回試験管を斜めに傾けて、凝血の終点時間（試験管をゆっくりと傾けて、血液が流出されない時点を終点とする）を観察・記録し、各組の間の凝血時間を比較し、ＳＰＳＳソフトで統計学的分析を行い、Ｐ＜０．０５であれば統計学的差があると認める。

（2）結果：データは表２のとおりで、生理食塩水に比べて、溶媒組および薬物組は凝血時間を明らかに伸ばし、統計学的差があった。陽性対照のプエラリン組に比べて、７，２″-脱水プエラリン薬物中の高分量組は凝血時間を著しく伸ばし、著しい統計学的差があった（^＃＃Ｐ＜０．０１）。プロパンジオール溶媒組に比べて、プエラリン組および７，２″-脱水プエラリン中の高分量組は凝血時間を著しく伸ばし、著しい統計学的差があった（^▲Ｐ＜０．０５、^▲▲Ｐ＜０．０１，^▲▲Ｐ＜０．０１）。

Claims (6)

1. 構造式が次の式（Ｉ）に示す化合物、およびその塩類誘導物であることを特徴する７，２″-脱水プエラリンおよびその塩類誘導物。
   

   

   （Ｉ）
   その中、ＲはＨで、
   前記７，２″-脱水プエラリン塩類誘導物とは、７，２″脱水プエラリンの４′位水酸基と各種有機・無機アルカリとの反応によって生成される塩類誘導物を指す。
2. 請求項１において、前記７，２″-脱水プエラリンの調製方法：プエラリンとＰＹ_３およびアゾ類化合物を１：（１〜４）：（１〜４）のモル比で混合し、有機溶剤の中で、分子内Mitsunobu反応を発生させることによって、７，２″-脱水プエラリン化合物が得られるが、通常のろ過、濃縮、シリカゲルカラムクロマトグラフィで、得られた７，２″-脱水プエラリンを分離純化するが、その中、ＰＹ_３中のＹグループは、アリル、アルキル、ヘテロアリール、アルコキシル中のいずれかであることを特徴とする７，２″-脱水プエラリンおよびその誘導物の調製方法。
3. 請求項２において、前記アゾ類化合物はアゾジカルボン酸ジイソプロピル、アゾジカルボン酸ジエチルエステル、N,N,N‘,N’-テトラメチルアゾジカルボキシアミド又はアゾジホルムジピペリジン中のいずれかであることを特徴とする調製方法。
4. 請求項２において、前記有機溶剤はテトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロフォルム、ジメチルホルムアミド、トルエン、ベンゼン又はヘキサメチルリン酸トリアミド中のいずれかであることを特徴とする調製方法。
5. 請求項１に記載の７，２″-脱水プエラリンおよびその塩類誘導物を含む、心臓・脳血管疾病の治療又は予防用薬物。
6. 請求項５において、経口投与剤又は注射剤であることを特徴とする薬物。

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