FI72522C

FI72522C - Foerfarande foer framstaellning av gangliosidderivat.

Info

Publication number: FI72522C
Application number: FI822673A
Authority: FI
Inventors: Valle Francesco Della; Aurelio Romeo
Original assignee: Fidia Farmaceutici
Priority date: 1981-08-04
Filing date: 1982-07-30
Publication date: 1987-06-08
Also published as: FR2511005A1; ZA825586B; EP0072722A3; NO160518C; GR77228B; HU193151B; EP0072722A2; PT75369A; JPH01308292A; DK151967B; DE3271547D1; SG57887G; AR229853A1; ATE20238T1; JPH0211569B2; PT75369B; PL237770A1; CA1230596A; KR840000905A; NO822648L

Description

72522

Menetelmä gangliosidijohdannaisten valmistamiseksi -Förfarande för framställning av ganglio sidderivat Tämä keksintö koskee patenttivaatimuksen 1 5 johdannon mukaista menetelmää gangliosidien sisäisten e sterijohdannaist en valmistamiseksi ja niitä sisältäviä farmaseuttisia seoksia. Tämän keksinnön mukaisia farmaseuttisia seoksia käytetään sellaisten her-mostohäiriöiden hoidossa, jotka johtuvat onnettomuuksis-10 ta tai sairauksista, jotka ovat jollakin tavalla vahingoittaneet hermokudosta.

Gangliosidit ovat ryhmä glykosfingolipidejä ja niiden rakenne sisältää hiilihydraattiosan , johon on liittyneinä keramidi ryhmä ja sialihapporyhmä. Kiili-15 hydraattiosa sisältää vähintään yhden galaktoosi- tai glukoosiryhmän ja vähintään yhden N-asetyyliglukosamiini-tai N-asetyyligalaktosamiiniosan. Gangliosidin yleinen rakenne voidaan näin ollen esittää seuraavalla kaavalla: 20 - yksi mooli keramidia - vähintään yksi mooli galak-yksi mooli ^ toosia tai glukoosia sialihappoa ^ - vähintään yksi mooli N-ase- tyyliglukosami inia tai N- 25 asetyyligalaktosamiinia jossa kaikki ryhmät on sidottu toisiinsa glukos i di sidoksilla.

Lukuisia gangliosideja on tunnistettu ja niitä on havaittu esiintyvän erittäin paljon hermokudoksessa ja "5Π varsinkin aivokudoksessa. En tutkimukset ovat osoittaneet, että tärkein gangliosideistä löytyvä sialihapoc on N-asetyylineuramiinihappo (NANA) ja vähemmässä määrin N-glykosyylineuramiinihappo. Lukuisista identifioiduista 72522 gangliosideista seuraavien ganliosidien, merkitty kansainvälisillä symboleilla, on havaittu esiintyvän huomattavina määrinä naudan aivokudoksesta uutetuissa gangliosi-diseoksissa: 5 GDlb (16*>

Gal(1-5-.3)GalNAC(1-4.1)Gal (lA-1)Glc (1-4.1) Keramidi

NANA

CD

NANA

15 GTlb (19f»)

Gal (1^3) GalNAC () Gal (1-^*4) Glc (lAl) Keramidi

(I) CD

20 NANA NANA

CD

NANA

25 gM]_ (21$)

Gal (ΐΛ-3) GalNAC (lAH) Gal (ΐΛ·4 ) Glc (1-^1) Keramidi (I)

NANA

30 GDla (40%)

Gal (1—3)GalNAC (1^-4)Gal (1—4 ) Glc (1-^-1) Keramidi „ ® (i)

NANA NANA

II

3 72522 joissa Glc tarkoittaa glukoosia, GalNAC tarkoittaa N-asetyyligalaktosamiinia, Gal tarkoittaa galaktoosia, NANA tarkoittaa N-asetyylineuramiinihappoa ja sulkeissa oleva prosenttiluku tarkoittaa kyseisen gangliosidin 5 määrää, joka löytyy naudan aivokudoksesta uutetusta ganglios idi seokse sta.

On tunnettua, että gangliosideilla on tärkeä merkitys hermoston toiminnassa ja äskettäin on osoitettu, että gangliosidit ovat hyödyllisiä hoidettaessa peri-10 feerisen hermoston häiriöitä ja keskushermoston tauteja (Acta psychiat. Scand., 5j>, 102 ( 1977); Eur. Med. Phys., 13, 1 (1977); Ric. Sei. Educ. Perm. 9, 115 (1978); Adv.

Exp. Biol. 71» 275 ( 1976); Electromyogr. Clin. Neurophysiol. , 19 , 353 ( 1979 ); Minerva Medica, j6£, 3277 ( 1978 ); Minerva 15 Stomat., 27, 177 (1978); Med. del Lavoro, 68, 296 (1977); Brain Res. 197, 236 ( 1980 ) ) .

Gangliosidien hoitovaikutus näyttää muodostuvan pääasiassa siitä, että ne stimuloivat hermokudoksen pi-tuuskasvuilraiötä ja aktivoivat kalvoissa olevia hermo-20 ärsykkeiden johtumiseen vaikuttavia enstyymejä, kuten

Na+, K + -ATPaasi-entsyymiä (Brain Res., 197, 236 ( 19 8 0 ) ;

Leon et ai., J. of Neurochem. , 31_, 350 (19ÖI)). Gangliosidien stimuloima hermojen pituuskasvu puolestaan auttaa vahingoittuneen hermokudoksen regeneroitumista ja parane-25 mistä.

Jatkotutkimuksissa on yritetty löytää yhdisteitä, jotka olisivat gangliosideja tehokkaampia hermostohäi-riöiden hoidossa.

Nyt on tämän keksinnön mukaisesti havaittu, että 30 eräät gangliosidijohdannai set ovat pelkkiä gangliosi-dejä tehokkaampia hermojen pituuskasvua stimuloivia ja kalvoissa olevia hermoärsykkeiden johtumiseen vaikuttavia entsyymejä, kuten Na+,K+-ATPaasia aktivoivia aineita. Erityisesti on havaittu, että gangliosidien sisäiset 35 esteri johdannaiset ovat aktiivisia hermostosairauksien hoidossa, ja ne ovat aktiivisempia kuin lähtöaineina käytetyt gangliosidit. In vitro- ja in vivo-kokeet ovat 4 72522 osoittaneet, että sisäiset e sterijohdannaiset ovat lähtöainegangliosideja tehokkaampia hermokudoksen pituuskasvua stimuloivia ja kalvoissa olevia hermoärsyk-keiden johtumiseen vaikuttavia entsyymejä, kuten 5 Na ,K -ATPaasia aktivoivia aineita.

Vain joitakin gangliosidi en mahdollisista sisäisistä estereistä on eristetty tähän mennessä ja niitäkin vain pieniä määriä aivokudoksesta. Gangliosidien sisäiset esterit muodostuvat siten, että sialihapon kar- 10 hoksyyliryhmä reagoi saman gangliosidimolekyylin jonkun hiilihydr.aattiryhmän tai naapurina olevan toisen sialihapon hydroksyyliryhmän kanssa (j. of Neurochemistry, 3h, 1351 (198Ο), Bull, of Molecular Biology and Medicine, 3., 170 (1978)). Esimerkkinä voidaan mainita, että ganglio- 15 sidin yksi mahdollinen sisäinen esteri voidaan esittää seuraavalla kaavalla: 2C ? O H ? \ CH2-C-M A. // I HC-OH \ // ( I ) ]/ HC-OH V / ' l\ ch2oh / / l\H H/ /

H N|_V O

HO p / 2 5 O / ^h3 / / ^Η2)ΐ2

/ / CH

/ / 11

/ / CH OH / / CH-OH

30 HO0"20" 0„CH2°H W J {h-NH-CO-R! tn oi H H OH" H H N-CO-CH3H H 0H -

H

35 5 72522 jossa R sialihapporyhmässä on H tai OH ja R ^ keramidi-ryhmässä on rasvahappo, kuten öljyhappo, steariinihappo tai linoleenihappo.

Kaavan (i) mukainen gangliosidin sisäinen esteri-5 johdannainen on esimerkki sellaisesta johdannaisesta, jossa sialihapon karboksyy1iryhmä on liittynyt esteri-sidoksella yhden hiilihydraattiryhmän, tässä tapauksessa galaktoosin, hydroksyyliryhmään. Sisäisen esteri-sidoksen muodostuminen sekä sialihapporyhmän ja hiili-10 hydraattiryhmän välinen normaali glukosidisidos saavat aikaan laktonirenkaan, joka on tyypillisesti viisi- tai kuusijäseninen, ja joka on tunnusomainen gangliosidien sisäisten esteri johdannaisten rakenteelle. Kaava I on esitetty esimerkin vuoksi, ja onkin selvää, että muita 15 1aktonirenkäita, joissa on 5 tai useampia jäseniä, voidaan muodostaa, kun sialihapon karboksyyliryhmä es-teröityy hiilihydraattiyksikch hydroksyyliryhmän kanssa. Eräs rakenne voidaan esittää seuraavalla kaavalla (il): 20 (Π) o

o „ H

il 7 C

CH,-C-N a-0 \ l/fes \ 0 25 \h2 H/ -\ H1-Γ 0 H \

H° H Cll.-C-ύ J-k COOH

HVlfv 30 hH -\ R2 3 5 jossa R^ on h iil ihy draat t iyk s ikk ö , joka on gluko s i di s e s t i liittynyt sialihappoyksikköön.

6 72522

Vielä eräs gangliosidin mahdollinen sisäinen ester ij ohdannainen voidaan esittää seuraavalla rakennekaavalla (III): 5 (III)

10 I hc-oh \ X

HhC-ou \ \ ·

\ ch2oh / X

HO H Λ .o

15 0 H

S I? |_ / \ I CH,--C-N jjr_0H \ / 0 °--n\)\/ . i 20 HO H --— r3 25 jossa on hiilihydraattiyksikkö, johon naapurina oleva sialihappo on liittynyt esterisidoksella. Kaava III siis esittää gangliosidin sisäistä e sterijohdannaista, jossa sialihappo on liittynyt esterisidoksella viereiseen siali-happoon, joka puolestaan itse on liittynyt esterisidok- 30 sella hiilihydraattiyksikköön. Näin ollen on selvää, että edelläkuvatuista johdannaisista voidaan muodostaa monenlaisia muunnoksia sillä periaatteella, että ganglio-sidien sisäiset esterijohdannaiset muodostuvat tavallisesti hiilihydraattiosasta, vähintään yhdestä keramidi- 35 yksiköstä ja vähintään yhdestä sialihappoyksiköstä niin, että yksi tai useampi sialihappo on liittynyt esterisi-

II

7 72522 doksella hiilihydraattiyksikköön ja/tai yksi tai useampi sialihappo on liittynyt e st eri sidoksella naapurinaan olevaan sialihappoon. Näin ollen lukuisat gangliosidi-en sisäiset esterijohdannaiset ovat mahdollisia ja 5 edellämainitut on esitetty vain esimerkkitarkoituksessa.

Valmistusmenetelmä

Ennestään tunnetaan eräitä gangliosidien sisäisten esterijohdannaisten valmistusmenetelmiä, joista mainitaan 1Q mm. seuraavat: 1. Sisäisten esterien valmistus siten, että gangliosidien annetaan yksinkertaisesti vain seistä etikka-happo- tai trikloorietikkahappoliuoksessa (Sphingolipids, Sphingolipidoses and Allied Disorders, Adv. Exp. Med. Biol., 15 il, 95 (1972); J. Neurochem. 28, 1133 (1977)). Tämän menetelmän mukaisesti on tarpeen käyttää hyvin suurta etikkahappomäärää suhteessa gangliosidimäärään eikä gangliosidien täydellistä muuntumista saavuteta. Tästä syystä tarvitaan lopullinen puhdistusvaihe, joka tavalli-20 sesti suoritetaan ioninvaihtoharts in , kuten "Sephadex", avulla.

2. Vesiliuokoisen karbodi-imidin reaktio gangliosidien kanssa vesiliuoksessa (Carbohydr. Res. ll_, 3^ (1975)). Tässäkään menetelmässä ei saavuteta ganglio- 25 sidien täydellistä muuntumista, koska reaktio suorite taan vesiliuoksessa. Tätä menetelmää käyttämällä saavutetaan hyvin alhaiset saannot ja sisäisen e sterituotteen 1oppupuhdistus on tarpeen.

Tässä keksinnössä kuvataan uutta ja parannettua 39 gangliosidien sisäisten e sterijohdannaisten valmistusmenetelmää, jolla johdannaiset saadaan suurella saannolla. Keksinnönmukaisessa menetelmässä gangliosidit saatetaan reagoimaan laktoninmuodostusreagenssin kanssa vedettömässä orgaanisessa liuottimessa vedettömissä olosuhteissa.

35 Tässä keksinnössä käytettäviä sopivia orgaanisia liuottimia ovat mm. dimetyylisulfoksidi (DMSO), dimetyyliformamidi 8 72522 (DMF ) , sulfolaani, tetrahydrofuraani, dimetoksietaani ja pyridiini tai näiden seokset. Sopivia laktoninmuo-dostusreagensseja ovat mm. orgaanisiin liuottimiin liukenevat karbodi-imidit, kuten disykloheksyylikarbo-5 di-imidi , bentsyyli-isopropyylikarbodi-imidi ja bentsyyli-etyylikarbodi-imidi, 2-kloori-1-metyylipyridiniumsuolat, etoksiasetyleeni ja Woodward-reagenssi (N-etyyli-5-fenyyli-isoksatsolium-3'-sulfonaatti).

Täsmällisemmin sanottuna keksinnön mukaiselle 10 menetelmälle on tunnusomaista se, mikä on esitetty patenttivaatimuksen 1 tunnusmerkkiosassa.

Ennestään tunnetuissa menetelmissä, joissa gangliosidit saatetaan reagoimaan karbodi-imidin kanssa vesiliuoksessa, päästään hyvin alhaisiin sisäisten esterien saantoihin, kun 1 c, taas nyt on havaittu, että tämän keksinnön mukaisella menetelmällä, jossa gangliosidit saatetaan reagoimaan vedettömässä väliaineessa, saavutetaan hyvin suuria, so. käytännöllisesti katsoen kvantitatiivisia haluttujen sisäisten esterijohdannaisten saantoja, jotka ovat rat-2Q kaisevasti parempia kuin ennestään tunnetuilla menetelmillä saadut saannot. Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä lähtöaineina käytetyt ganglio sidiyhdist e et uutetaan nisäkkäiden, mieluimmin naudan, aivokudoksesta.

Seuraavilla esimerkeillä valaistaan tämän keksin-2^ nön mukaisia gangliosidi en sisäisten esterijohdannaisten valmistusmenetelmiä.

Esimerkki 1

Ganglio sidi seos saadaan uuttamalla naudan aivoista 30 ja 5 g tätä seosta liuotetaan 50 ml:aan dimetyy1isulfoksidia . Saatuun seokseen lisätään k g vedetöntä styree-nityyppistä hartsia (sulfonihappo) (50-100 mesh, H+-rauoto) ja saatua seosta sekoitetaan 30 minuuttia huoneen-1ärapötilassa. Tämä ioninvaihtohartsikäsittely muuntaa 35 kaikki gangliosidin karboksylaattiryhmät -COOK-ryhmiksi (karboksyyliryhmiksi). Karboksylaattiryhmien täydellinen muuntuminen varmistetaan sopivalla fysikaalisanalyyt-tisellä menetelmällä, kuten atomiabsorptiolla. Sitten li 9 72522 hartsi imusuodatetaan pois, liuokseen skoitetaan 1,5 g disykloheksyylikarbodi-imidiä ja annetaan seisoa 1 tunti. Saostunut disykloheksyyliurea suodatetaan pois, ja kun jäljellejääneeseen liuokseen sekoitetaan 100 ml aseto-5 nia, gangliosidin sisäinen esterijohdannainen saostuu tuotteena. Tällä menetelmällä saadaan k>6 g sisäistä esterituotettä (noin 90 - 95 % teoreettisesta arvosta).

Sisäisten esterijohdannaisten läsnäolo varmistetaan infrapunaspektroskooppisesti ja ohutkerroskromato-grafisesti.

IR-spektroskopia - Käytetään KBr-tablettia, esteri-laktonisidos saa aikaan kaistan kohdassa 1750 cm .

Ohutkerroskromatografia - Silikageelilevyt , liuo-tinsysteemi CHCl^/MeOH/OjS^CaCl^ ( 55:^5'· 10 tilav./tilav./ 15 tilav.), sisäisten esterien seoksen R^ on välillä 0,7 - 0,85· Lopputuotteiden R^ on suurempi kuin lähtö-aineseoksen R^.Kromatografis et tulokset osoittavat, että lähtöainetta ei ole lainkaan läsnä. Kun käsitellään 0,1 N natriumkarbonaattiliuoksella 1 tunti 60 °C:ssa, PO· esteri sidokset katkeavat ja saadaan alkuperäinen lähtöaine gangliosidi seos.

Esimerkki 2 9 g gangliosidi seosta (natriumsuola ) liuotetaan 25 80 ml:aan tislattua vettä ja liuos lasketaan pylvään läpi, jossa on täytteenä 20 g "Dowex 50 w x 8" (100-200 mesh, trietyyliammoniummuoto).

Saatu tuote, josta on poistettu vesi suurtyhjössä, liuotetaan (sonikaattorikylvyn avulla) 200 ml:aan vede-30 töntä tetrahydrofuraania, joka sisältää 8 ml trietyyli-ami inia.

Tämä liuos lisätään hitaasti 600 ml:aan vedetöntä tetrahydrofuraania (H tuntia), joka on Ho m M' 2-kloori-1-metyylipyridiumsuolan suhteen (anioni voi olla esim.

35 jodidi, tolueen i-l+ -sulf onaat t i , trifluorimetaanisulfo- naatti jne.), samalla jatkuvasti sekoittaen ja pitämällä yllä ä5 °C vakiolämpötilaa.

10 725 22

Reaktioaika 18 tuntia 1+ 5 °C:ssa.

Ylimääräinen reagenssi suodatetaan pois ja seos väkevöidään typpivirrassa , jäännös liuotetaan uudelleen 90 ml:aan kloroformi-metnaoliseosta (1:1) ja seostetaan 5 1*50 ml: aan asetonia. Lopuksi tuote kuivataan suurtyh- j ös sä.

Saanto - 7,9 g (89,7 % teoreettisesta saannosta).

Ohutkerroskromatografia - Silikageelilevyt, liuo-tinsysteemi klorofromi/metanoii/CaClg 0,3 % (55:^5:10), 10 sisäisten esterien seoksen R^. on välillä 0,7 - 0,85.

Lopputuotteiden on suuremoi kuin lähtöaineseoksen R^. Kromatografiset tulokset osoittavat, että lähtöainetta ei ole lainkaan läsnä. Kun käsitellään 0,1 N natrium-karbonaattiliuoksella 60 °C:ssa 1 tunti, esterisidokset 15 katkeavat ja saadaan alkuperäiset gangliosidiyhdisteet.

Ganglio sidi seoksen sisäisten esterien IR-spektri, joka mitataan KBr-tabletin avulla, osoittaa tyypillistä e steriabsorptiota kohdassa 1750 cm 20 Esimerkki 3 8g GM.j (natriumsuola ) liuotetaan 80 ml: aan tislattua vettä ja liuos lasketaan pylvään läpi, jossa on täytteenä 10 g "Dowex 50 w x 8" (100- 200 mesh, trietyyliammoniummuoto) 25 Saatu tuote, josta on poistettu vesi suurtyhjössä, liuotetaan (sonikaattorikylvyn avulla) 200 ml:aan vedetöntä tetrahydrofuraania, joka sisältää 8 ml trietyyli-ami in ia.

Tämä liuos lisätään hitaasti (L tuntia) 600 ml:aan 30 vedetöntä tetrahydrofuraania, joka on 20 raM 2-kloori- 1-metyylipyridiniumsuolan suhteen (anioni voi olla esim. jodidi, tolueeni-l+-sulfonaatti , trifluorimetaanisulfonaat-ti jne.), samalla jatkuvasti sekoittaen ja pitämällä yllä L5 °C vakiolämpötilaa.

35 Reaktioaika 18 tuntia 1+5 °C:ssa.

Ylimääräinen reagenssi suodatetaan pois ja seos 11 7 2 5 2 2 väkevöidään typpivirrassa, jäännös liuotetaan uudelleen 80 ml:aan kloroformi-metanoliseosta (1:1) ja saostetaan UOO ml :aan asetonia. Lopuksi tuote kuivataan suurtyhjössä.

Saanto - 7,0 g (88,^ % teoreettisesta arvosta)

Ohutkerroskromatografia - Silikageelilevyt, liuo-5 tinsysteemi kloroformi/metanoli/CaClg 0,3 % (55:^5:10), lopputuotteen R^. ( 0,70 ) ylittää lähtöaineen Rf-arvon (0,65). Kromatografiatulokset osoittavat, että lähtöainetta ei ole lainkaan läsnä. Kun käsitellään 0,1 K natriumkarbo-naattiliuoksella 60 °C:ssa 1 tunti, esterisidokset kat-10 keavat ja saadaan alkuperäiset gangliosidiyhdisteet.

GM :n sisäisen esterin IR-spektri , joka mitataan KBr-tablettien avulla, osoittaa tyypillistä esteriabsorp-tiota kohdassa 1750 cm .

1 5 Esimerkki k 9 g gangliosidiseosta (natriumsuola) liuotetaan 80 ml:aan tislattua vettä ja liuos lasketaan pylvään läpi, jossa on täytteenä 20 g "Dowex 50 w x 8" (100-200 mesh pyridiniummuoto).

20 Saatu tuote, josta on poistettu vesi suurtyhjös- sä, liuotetaan 800 ml:aan vedetöntä tetrahydrofuraania, jossa on k,2 g (60 mM) etoksiasetyleeniä.

Tätä seosta palautusjäähdytetään 3 tuntia, palau-tusjäähdytin jäähdytetään -10°C:een kosteussululla va-25 rustettuna.

Liuottimet ja ylimääräinen etoksiasetyleeni poistetaan, jäännös liuotetaan 80 ml:aan k1oroformi-metanoii— seosta (1:1) ja saostetaan i+00 ml : aan asetonia.

Saanto - 8,1 g (92,0 % teoreettisesta arvosta) 30 Ohutkerroskromatografia - Silikageelilevyt, liuo- tinsysteemi kloroformi/metanoii/CaCl^ 0,3 % (55:^5:10), sisäisten esterien seoksen R^ on välillä 0,7 - 0,85. Lopputuotteiden R on suurempi kuin lähtöaineseoksen R^..

35 12 72522

Kromatografiatulokset osoittavat, että lähtöainetta ei ole lainkaan Isänä. Kun käsitellään 0,1 N natrium-karbonaattiliuoksella 1 tunti 60 °C:ssa, esterisidok-set katkeavat ja saadaan alkuperäiset gangliosidiyh-5 disteet.

Gangliosidiseoksen sisäisten esterien IR-spektri, joka mitataan KBr-tablettien avulla, osoittaa tyypillistä esteriabsorptiota kohdassa 1750 cm 10 Esimerkki 5 8 g GM^ (natriumsuola) liuotetaan 80 ml:aan tislattua vettä ja saatu liuos lasketaan pylvään läpi, jossa on täytteenä 10 g "Dowex 50 w x 8" (100-200 mesh, pyridiniummuoto ) .

Tämä tuote, josta on poistettu vesi suurtyhjössä, liuotetaan 800 ml:aan vedetöntä tetrahydrofuraania, jossa on 2,1 g (30 mM) et ok siasetyleeniä.

Tätä seosta palautusjäähdytetään 3 tuntia, palautus jäähdytin jäähdytetään -10°C:een kosteussululla 20 varustettuna.

Liuottimet ja ylimääräinen etoksiasetyleeni poistetaan, jäännös liuotetaan 80 ml:aan kloroformi-metanoli-seosta (1:1) ja saostetaan U00 ml:aan asetonia.

Saanto - 7,2 g (91,0 % teoreettisesta arvosta) 25 Ohutkerroskromatografia - Silikageelilevyt, liuo- tinsysteemi kloroformi/metanoii/CaCl^ 0,3 % (55:^5:10), lopputuotteen R^. (0,70) ylittää lähtöaineen R^-arvon (0,65). Kromatogragiatulokset osoittavat, että lähtöainetta ei ole lainkaan läsnä. Kun käsitellään 0,1 N 30 natriumkarbonaattiliuoksella 1 tunti 60 °C:ssa, esteri- sidokset katkeavat ja saadaan alkuperäiset gangliosidi-yhdisteet.

GM^:n sisäisen esterin spektri, joka mitataan KBr-tablettien avulla, osoittaa tyypillistä esteri-35 absorptiota kohdassa 1750 cm 1.

'3 72522

Esimerkki 6 9 g gangliosidi seo sta (natriumsuola ) liuotetaan 80 ml:aan tislattua vettä ja liuos lasketaan pylvään läpi, jossa on täytteenä 20 g "Dowex 50 w x 8" (100-200 5 mesh, pyridiniummuoto).

Saatu tuote, josta on poistettu vesi suurtyhjössä, liuotetaan 200 ml:aan vedetöntä pyridiiniä ja liuos lisätään suspensioon, jossa on 5,52 g 10 mM) kahtais-ionista Woodward-reagenssia (N-etyyli~5~fenyyli-isoksat-10 solium-3'-sulfonaatti , Woodward et ai., J. Am. Chem. Soc.

8 3, 1010-1012, 1961) 200 ml:ssa vedetöntä pyridiiniä.

tätä reaktioseosta sekoitetaan 10 vuorokautta huoneen-lämpöt ilassa.

Kun ylimääräinen reagenssi on suodatettu pois ja liuotin on poistettu täysin, jäännös liuotetaan 90 ml:aan kloroformi-metanoliseosta (1:1) ja saostetaan U50 ml:aan asetonia.

Saanto - 7,2 g (81,8 % teoreettisesta arvosta)

Ohutkerroskromatografia - Si1ikageelilevyt, 20 liuotinsysteemi kloroformi/metanoli/CaCl^ 0,3 % (55:^5:10), sisäisten esterien seoksen on välillä 0,7 - 0,85-Lopputuotteiden R^, on suurempi kuin 1 äht öa in e s eok s en R^. Kromatografiatulokset osoittavat, että lähtöainetta ei ole lainkaan läsnä. Kun käsitellään 0,1 N ^5 natriumkarbonaattiliuok se11a 1 tunti 60 °C:ssa, esteri- sidokset katkeavat ja saadaan alkuperäiset gangliosidi-yhd i st e et.

Ganglio sidi seoksen sisäisten esterien IR-spektri, joka mitataan KBr-tablettien avulla, osoittaa tyypil-30 listä esteriabsorptiota kohdassa 1750 cm ^.

Esimerkki 7 8 g GM^ (natriumsuola) liuotetaan 80 ml:aan tislattua vettä ja liuos lasketaan pylvään läpi, jossa on 25 täytteenä 10 g "Dowex 50 w x 8" (100-200 mesh, pyridi-n iummuoto).

i1* 72522

Saatu tuote, josta on poistettu vesi suurtyhjossa, liuotetaan 200 ml:aan vedetöntä pyridiiniä ja liuos lisätään suspensioon, jossa on 1,26 g (5 mM) kahtaisionista Woodward-reagenssia (N-etyyli-5-fenyyli-isoksatsolium-3'-sulfonaatti) 200 ml:ssa vedetöntä pyridiiniä. Tätä 5 reaktioseosta sekoitetaan 10 vuorokautta huoneenlämpöti lassa .

Kun ylimääräinen reagenssi on suodatettu pois ja liuotin poistettu täysin, jäännös liuotetaan 80 ml:aan kloroformi-metanoliseosta (1:1) ja saostetaan i+00 ml :aan 10 asetonia.

Saanto - 6,3 g (79,5 % teoreettisesta arvosta)

Ohutkerroskromatografia - S ilikageelilevyt , liuo-tinsysteemi kloroformi/metanoli/CaCl^ 0,3 % (55:^5:10), Lopputuotteen (0,70) on suurempi kuin lähtöaineen R^, (0,65)· Kromatograf iatulokset osoittavat, että lähtöainetta ei ole lainkaan läsnä. Kun käsitellään 0,1 N natriumkarbonaattiliuoksella 1 tunti 60 °C:ssa, esterisidokset katkeavat ja saadaan alkuperäinen ganglio-sidi .

2 0 ....

GM^:n sisäisen esterin IR-spektri, joka mitataan KBr-tablettien avulla, osoittaa tyypillistä esteri-absorptiota kohdassa 1750 cm 1.

Farmakologiset omianisuudet 2 S · .. . .

y Vaikka ennestään tunnetaankin eräitä gangliosi- dien sisäisiä esterijohdannais ia ja niiden valmistusmenetelmiä, ei sen sijaan ole löydettävissä mitään aikaisempia mainintoja sisäisten esterijohdannaisten biologisesta aktiivisuudesta ja mahdollisesta farmaseut-30 tisesta käytöstä. Kuitenkin tämän keksinnön mukaisesti on havaittu gangliosidien sisäisillä esterijohdannaisilla on hyvin suuri aktiivisuus hermostosairauksien hoidossa, ja aktiivisuus on itse asiassa paljon suurempi kuin pelkkien gangliosidien aktiivisuus. Gangliosidien 35 sisäisiä esterijohdannaisia voidaan käyttää monien her- 15 725 22 mohäiriöiden hoidossa, mukaanlukien sairauksien tai onnettomuuksien aiheuttamat perifeerisen ja keskushermoston häiriöt. Yhdisteitä voidaan myös käyttää leikkauksen jälkeisessä hoidossa, joka seuraa hermoihin vaikuttanei-5 ta leikkauksia, kuten peräpukamaleikkausta.

Tämän keksinnön kohteena olevien gangliosid ien sisäisten e sterijohdannaisten hyviä farmakologisia ominaisuuksia voidaan arvioida vertaamalla ganglio sideihin seuraavien kokeiden avulla: 10 1. Hermosolujen viejähaarojen pituuskasvu krom- affiinikasvaimen solulinjassa (P C ^ ^) . , + + . ...

2. Hermosolujen kalvojen Na K -ATPaaslakt11visuu s 3. Elektroretinogrammin palautuminen sokaistu m i s e n jälkeen 1 5 1. Gangliosidien sisäisten e sterijohdannaisten vaikutus PC^2:n hermosolujen viejähaaran pituuskasvuun

Hermosolujen viejähaarojen pituuskasvua voidaan pitää hermosolujen paikallisena erilaistumisena ja 20 sitä hiokemiallista mekanismia, jolla gangliosidimoiee kyylit saavat aikaan mainitun vaikutuksen, voidaan tutkia soluvilj elmämall ilia in vitro (PC^ soluiin j a , joka on johdettu tri. P. Calissanon (C.N.R. -Laboratorio di Biologia Cellulare - Rooma, Italia) luovuttamasta 25 1A subkloonista)) ("Ganglioside s in Neurological and

Neuromuscular Function, Development and Repair" , toim.

M.M. Rapport ja A. Gorio, Raven Press, New York (1981)). Tässä mallissa gangliosideja tai gangliosidien sisäisiä esterijohdannaisia lisätään PC^^-viljelyalustaan yhdessä 30 hermojen kasvutekijän (NGF) kanssa, joka on spesifinen PC^2:n erilaistumista indusoiva tekijä, joka stimuloi hermosolujen viejähaaran pituuskasvua. Gangliosidien hermosolujen viejähaaran pituuskasvua situloivaa vaikutusta voidaan sitten verrata gangliosidien sisäisten es-35 terijohdannaisten stimuloivaan vaikutukseen.

ie 72522

Tarkemmin sanottuna soluja (100 000/levy) pidettiin 3T°C:ssa Hereus-inkubaattorissa (5 % CO^ ja ilmankosteus 95 %) levitettyinä kollageenilla päällystetylle kudosviljelmälle "Integrid Falcon"-levyillä (60 mm) 5 koostumukseltaan seuraavassa viljelyväliaineessa: 85 % RPM 16U0 (Gibco), 10 % lämmön avulla inaktivoitua hevosen seerumia (Gibco), 5 % sikiöasteella olevan vasikan seerumia (Gibco), 50 U/ral penisilliiiniä ja 25 mg/ml streptomysiiniä. Viljelyväliaine vaihdettiin ä8 tunnin 1 o välein.

Käissä olosuhteissa solut jakautuvat, mutta eivät muodosta hermosolujen viejähaaroja (neuriitteja). Kun lisätään NGF-tekijää (50 ng/ml), solujen lisääntyminen lakkaa ja alkaa muodostua viejähaaroja ja ilmetä erilais-15 tumista 5 ~ 10 vuorokauden kuluessa. Tämä vaikutus arvioitiin laskemalla 5· päivänä ja sen jälkeen joka toinen päivä niiden solujen lukumäärä, joissa on neuriitteja.

Gangliosideja ja niiden johdannaisia (1 mM) lisättiin viljelyväliaineeseen samanaikaisesti NGF:n kanssa 20 ja· niiden vaikutukset todettiin 7- ja 9· päivänä laske malla neuriitteja sisältävien solujen lukumäärä.

Neuriittien kasvun vertailukokeiden tulokset on esitetty taulukossa 1 yhteenvetona.

17 72522

Taulukko 1 - Gangliosidijohdannaisten vaikutus hermo solujen viejähaarojen kasvuun PC soluissa ^ Yhdiste Solu- Viljelyaine Väke- Neuriitteja si- linJa vyys sältävien solu jen määrä {%) 7.vrk 9-vrk

Vertailu PC „ Ö5# RPM 16 U 0, 31 39,7 10% lämmön 10 avulla inakt.

hevosen seerumia, 5% vasikan sikiön seerumia, 50 U/ml penisilliiniä , 25 mg/ml strep- ^ 5 tomysiiniä gangliosidit PC12 " 1 raM ^9,5 62,3 gangliosidien pc-]2 " 1 mM 56,3 69,2 sisäiset esterit 20 Saadut tulokset osoittavat , että tämän keksinnön mukaisilla gangliosidijohdannaisilla on kyky stimuloida hermosolujen pituuskasvua ja ne osoittautuivat ganglio-sideja paljon aktiivisemmiksi sekä 7· että 9· päivänä tapahtuneessa vaikutuksen arvioinnissa.

25 2. Gangliosidijohdannaisten vaikutushermosolujen kai- . + + . vojen Na ,K -ATPaasiaktuvisuuteen

Gangliosidien tai gangliosidien sisäisten esteri- johdannaisten kyky aktivoidi kaivon Na ,K -ATPaasientsyymiä 30 voidaan arvioida hermosolujen kalvovalmisteen avulla in vitro (J. of Neurochem, ks. edellä).

a. Rotan aivojen epäpuhtaan mitokondriojakeen (PQ-jae) valmistus

Pg-jae valmistettiin menetelmällä Morgan et ai., Biochem. Biophys. Acta 2h 1 , 737 ( 1971 ) · (Kaikki toi- ie 72522

menpiteet suoritettiin 0 - 1+ °C:ssa, arvot x g tarkoittavat keskimääräistä keskipakoisvoimaa). Koiraspuoliset, aikuiset Sprague Dawley-rotat (Charles River) (150-175 g) surmattiin ja niiden aivot poistettiin nopeasti ja pes-5 tiin jääkylmällä isotonisella liuoksella. Pikkuaivo -jen poistoleikkauksen jälkeen aivot homogenoitiin suorittamalla 12 ylösalaista iskua moottorilla toimivalla "Tefloniasi"-horaogenisaattorilla (ilmoitettu radiaali-nen välys 0,25 mm, 800 1/min) käyttämällä U tilavuutta 10 homogenointiliuosta (0,32 M sakkaroosi, joka oli 1 mM

kaliumfosfaattipuskurin ja 0,1 nM binatriumEDTA:n suhteen, pH 7j27). Homogenaatti laimennettiin 10-prosenttiseksi (paino/tilav.) homogenointiliuokseen, suodatettiin juusto-1iinakerro st en läpi ja sentrifugoitiin 15 minuuttia voi-1 5 maila 1000 x g.

Saatu pelletti pestiin alkuperäisellä tilavuudella homogenointiliuosta ja sentrifugoitiin kuten edellä. Yhdistettyjä emäliuoksia s emtrifugoitiin 25 minuuttia voimalla 17 500 x g (näitä gravitaatio-olosuhteita käy-20 tehtiin, jotta saavutettaisiin hermopäätteiden maksimaa linen rikastuminen jakeeseen) ja pelletti pestiin U kertaa 9 tilavuudella (joka kerta) homogenointiliuosta ja sentrifugoitiin (17 500 x g, 25 min). Lopullinen pelletti, jota nimitetään "P^-jakeeksi", sisältää pääaine-25 osina rikkoutumattomia mitokondroita ja hermopäätteitä.

Lopullinen pelletti suspendoitiin uudelleen tasalaatui-sesti sopivaan tilavuuteen homogenointiliuosta käyttämällä edellämainittua "Tefloniasi "-hornogenaattoria ja käytettiin määritykseen välittömästi. Varastoinnin ai-30 heuttamien epäyhtenäisyyksien välttämiseksi valmistet tiin tuore P2~jae aina ennen käyttöä. Pg-jakeiden gangliosidipitoisuus oli 33,9 - 2,8 (S.D.) nmol sidottua NeuAc/mg proteiinia.

35 b. ATPaasimääritys ATP-aasiaktiivisuus määritettiin spektrofotomet-

II

.,9 72522 risesti menetelmällä Wallic et ai., J. Pharm. Exptl.

Therap. 189·» *+3^ (197*0· Reaktioseoksen koostumus, ellei toisin ole ilmoitettu, oli seuraava: 50 mM

sakkaroosi, 0,2 mM binatrium EDTA (pH säädetty arvoon 5 7,*0, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2> 10 mM KC1, 2 mM fosfono- (enoli )pyruvaattimonokaliumsuola (PEP) (pH säädetty arvoon 70), 3 mM ATP, 50 mM TRIS-HC1, pH 70, 0,33 mM NADH, pyruvaatti-kinaasi (PK) (30 jig/ml) ja laktaatti-dehydrogenaasi (LDH) (10 jig/ml) lopullisen tilavuu-10 den ollessa 3 ml ja lopullisen pH:n 7,2. Reaktio käynnistettiin lisäämällä 50 - 75 Mg (proteiinina) P -jaetta.

+ + .... . .

Na ,K -ATPaasiaktiivisuus saatiin määrittämällä kokonais- 2+ .. . .

ATPaasin ja Mg :sta riippuvaisen ATPaasm välinen ero, -5 . .

kun läsnä oli 3x10 M ouabainia. Jokaiseen 15 yksittäiseen määritykseen tarvittiin aikaa 3 - 5 mi nuuttia .

ATPaasiaktiivisuus ilmoitettiin kansainvälisinä yksikköinä (IU) (yumol hydrolysoitua ATP:tä/mg prot ei in ia/min ) . Gangliosidijohdannaist en aktiivisuus (50 nM) mää-20 ritettiin sen jälkeen, kun oli inkuboitu hermosolujen kalvojen kanssa 2 tuntia 37 °C:ssa.

ATPaasiaktiivisuuden vertailukokeiden tulokset on esitetty yhteenvetona taulukossa 2.

25 Taulukko 2 - Gangliosidijohdannaisten vaikutus hermosolujen kalvojen Na+ ,K+-ATPaasiaktiivisuuteen

Yhdiste Inkuboin- Inkuboin- Väkevyys Na+,K+-ATP- tiaika tilämpö- , ..» aasiaktii- tila visuuden 30 lisäys {%) vertailu 120 min 37 °C - 100 gangliosidit 120 min 37 °C 50 1U2 gangliosi- 120 min 37 °C 50 . 172 dien sisäiset esterit 35 20 72522

Saadut tulokset osoittavat, että tämän keksinnön mukaiset gangliosidien sisäiset esterijohdannaiset kykenevät aktivoimaan hermosolujen kalvojen Na+,K+-ATPaasientsyyniä ja ne ovat paljon aktiivisempia 5 samoissa olosuhteissa ja samassa väkevyydessä kuin gangliosidit.

3. Gangliosidijohdannaisten vaikutus elektroretino-grammin palautumiseen sokaistumisen jälkeen 10 Gangliosidien tai gangliosidien sisäisten esterijoh- dannaisten kykyä kiihdyttää retinan sähköisen aktiivisuuden palautumista voidaan arvioida fysikaalisen vahingoittamisen (sokaistaminen) jälkeen. Tässä mallissa gangliosidit tai gangliosidien sisäiset esterijohdannaiset an-15 netaan parenteraalise sti (intravenoosise sti) ("Int.

Symposium on the Neurochemistry of the Retina", Athens, August 28 - September 1 (1979) (Communication)) (("Sa tellite Meeting on Biochemical and Pharmacological Implications of Gangliosides Functions", Cortona, 20 August 28 - 31 (1975) (Communications)).

Käytettiin koiraspuolisia New Zealand-kaneja , joiden paino oli välillä 1,9-2 kg. ("Int. Symp. on Neurochemistry of the Retina, Athens, August 28 -September 1 ( 1979) ) - 25 Sarveiskalvoane ste sia indusoitiin käsittelemällä paikallisesti 0 , H % :11a. novesiinilla. Elektroretino-gramrai rekisteröitiin käyttämällä sarveiskalvoelektrodi a (Henkesin mukaan), joka oli kiinnitetty hei kolla imulla. Referen s sie1ektrodin muodosti neula, 30 joka oli sijoitettu ihonalaisesti otsa-alueeseen.

Käytettiin Seuraavaa laitetta: vaihtovirtaesi- vahvistin 5A22N Tektronics (10 Hz tasavirtasuotimet);

Neuroaverager 1172 OTE Biomedica-anäly saattori; L800 Linseis recorder XY-plotteri; 1273 OTE Biomedica foto-35 simulaattori.

Foto simulointi suoritettiin käyttämällä viittä 21 72522 salamaa (0,2 W/s, kesto 10 sekuntia, taajuus 0,5 Hz). Rekisteröinnin perusaika oli 100 ms (esiasetus = 5).

Eläimiä pidettiin 30 minuuttia pimeässä huoneessa vakioilmassa, -lämpötilassa ja -melussa, jotta ne 5 tottuivat pimeyteen.

Suoritettiin seuraavat määritykset: 1. Kaikille eläimille suoritettiin 3 perusmääritystä viidentoista minuutin välein. Aaltojen a ja b (huipusta huippuun) keskiarvo laskettiin.

10 2. Sitten eläimiä sokaistiin 20 minuuttia käytä- mällä Schott Mainz KL 150B-lamppua, joka oli sijoitettu 1 cm päähän sarveiskalvoe1ektrodista.

Tämän ajanjakson jälkeen määritettiin elektroreti-nogrammin (ERG) palautuminen mittaamalla ERG:n amplitudi 15 20, Ho ja 60 minuutin kuluttua sokaistamisesta. Tämä mahdollista eläimen perustilan arvioinnin.

Sitten eläimille annettiin koeyhdisteitä ja 30 minuutin kuluttua niitä sokaistettiin uudestaan ja ERG rekisteröitiin olosuhteissa, jotka olivat ident-20 tiset edelläkuvattujen kanssa.

Yhdisteitä annettiin 33 nraol/kg intravenoosisesti. Elektroretinogratnmin palautumisen vertailukokeiden tuloksista on esitetty yhteenveto taulukossa 3.

25 Taulukko 3 - Gangliosidijohdannaisten vaikutus elektro- retinogrammin palautumiseen

Yhdiste Eläin Annos ERG:n palautuminen suhteessa i.v. verrokkeihin [%) 20 min H 0 min 60 min 30 gangliosidit kani 33 nmol/kg +5 +9.0 +13,0 gangliosidi- kani 33 nmol/kg +8 +12,7 +20,5 dien sisäiset esterit 25 Saadut tulokset osoittavat, että tämän keksinnön mukaiset sisäiset esterijohdannaiset kiihdyttävät elektro- 22 725 2 2 retinogrammien palautumista ja osoittavat suurempaa aktiivisuutta kuin gangliosidit kaikkina tutkittuina ajankohtina.

5 Terapeuttinen käyttö Tämän keksinnön mukaisia gangliosidien sisäisiä esteri johdannaisia voidaan käyttää lääkkeinä hermoston hoidossa ja varsinkin hoidettaessa perifeeristen hermojen häiriöitä ja keskushermoston tauteja.

Tarkemmin sanottuna gangliosidien sisäisiä esteri-johdannaisia voidaan käyttää sellaisten perifeerisen hermoston häiriöiden hoidossa, jotka johtuvat tapaturmista, puristuksesta, degeneroitumisesta tai toksisista infektioista, ja joissa tarvitaan hermojen regeneroitumisen 15 stimulaatiota ja hermo-lihastoiminnan palautumista, ja sellaisten keskushermoston häiriöiden hoidossa, jotka johtuvat tapaturmista, hapenpuutteesta, degeneroitumisesta tai toksisista infektioista, ja joissa toiminnan palautumiseen tarvitaan hermosolujen viejähaarojen kas-^ vun stimulointia.

Näitä häiriöitä on ennen hoidettu käyttämällä gangliosideja, mutta edelläkuvatut kokeet osoittavat, että gangliosidien sisäisillä esteri johdannaisilla on paljon suurempi aktiivisuus kuin pelkillä gangliosi-2 ö de i1la.

Tämän keksinnön mukaisia gangliosidien sisäisiä esteriyhdisteitä voidaan käyttää lääkeaineina farmaseuttisissa valmisteissa, jotka annetaan ihmisille tai eläimille intrarnuskulaarisesti, subkutaanisesti, intra-30 dermaalise sti, intravenoosise sti tai infuusioina. Valmisteet voivat olla yhdisteiden liuoksia tai sisältää yhdisteitä lyofi1isoituna jauheena yhdessä yhden tai useampien farmaseuttisesti hyväksyttävien kantaja-aineiden tai laimentimien kanssa ja mukana voi olla vä-35 liaineita, joilla pH on säädetty sopivaksi ja osmoot- li 23 7 2 5 2 2 tinen paine fysiologisia nesteitä vastaavaksi. Annetun annoksen suuruus riippuu halutusta vaikutuksesta ja halutusta antotavasta. Annos voi olla esimerkiksi (tällä ei haluta rajoittaa) välillä 0,05 - 5 mg vaikuttavaa ainetta ruumiinpainon kiloa kohti vuorokaudessa yksik-5 köannoksen ollessa välillä 0,05 - 2 mg ruumiinpainon kiloa kohti.

Tämän keksinnön mukaisissa terapeuttisissa seoksissa käytetään tavallisesti erilaisten gangliosidien sisäisten esterien seoksia, mutta voidaan myös tehdä "ί 0 sellaisia valmisteita, jotka sisältävät vain yhtä eris tettyä aktiivista johdannaista.

Taulukossa k esitetään esimerkin vuoksi farmaseuttisia valmisteita, jotka voidaan valmistaa liuosten muotoon hermostohäiriöiden hoitoa varten.

15

Taulukko h - Esimerkkejä farmaseuttisista injektioliuoksista

Valmiste no. 1 - Yksi 2 ml:n ampulli sisältää 20 - vaikuttava aine 5 mg - natriumkloridi 16 mg - sitraattipuskuri pH 6 tislatussa pyrogeenittömässä vedessä, täytetään 2 ml:ksi 25

Valmiste no. 2 - Yksi 2 ml:n ampulli sisältää - vaikuttava aine 50 mg - natriumkloridi 16 mg - sitraattipuskuri pH 6 tisla- 30 tussa pyrogeenittömässä vedessä, täytetään 2 mlrksi 2U 72522

Valmiste no. 3 - Yksi !+ ml : n lääkepullo sisältää - vaikuttava aine 100 mg - natriumkloridi 32 mg - s itraattipuskuri pH 6 tislatussa pyrogeeni11ömäs sä 5 vedessä, täytetään ^ ml:ksi

Taulukossa h esitetyt valmisteet voidaan antaa suoraan eläimille tai ihmisille millä tahansa edellä-mainitulla tavalla. Lisäksi seokset voivat sisältää 10 noin 2 - 50 paino-% vaikuttavaa ainetta.

Edelleen esimerkin vuoksi esitetään taulukossa 5 joitakin mahdollisia farmaseuttisia seossysteemejä, joita voidaan valmistaa herraostohäiriöiden hoitoa varten. Taulukossa 5 esitetyt farmaseuttiset seossysteemit 15 valmistetaan kahden lääkepullon systeemeinä. Ensimmäinen, vaikuttavan aineen sisältävä lääkepullo valmistetaan siten, että se sisältää noin 10 - 90 paino-? vaikuttavaa ainetta lyofi1isoituna·. jauheena ja lisäksi farmaseuttisesti hyväksyttävää laimennusainetta , 20 kuten glysiiniä tai mannitolia. Toinen on liuotinlääke- pullo, joka sisältää halutun määrän liuotinta, kuten natriumkloridi- ja sitraattipuskuriliuosta. Juuri ennen antamista molempien pullojen sisällöt sekoitetaan keskenään niin, että lyofi1isoitu vaikuttavan aineen jau-25 he liukenee nopeasti muodostaen injektioliuoksen. Sellaiset farmaseuttiset seossysteemit , joissa on lyofili-soidun vaikuttavan aineen jauheen sisältävä ensimmäinen lääkepullo, ovat etusijalle asetettavia tässä keksinnössä, koska vaikuttavana aineena toimivat gangliosi-30 dien sisäiset e sterijohdannaiset ovat stabiilimpia tässä muodossa kuin valmiina liuoksina olevina farmaseuttisina seoksina.

Il 2 5 725 22

Taulukko 5 - Esimerkkejä farmaseuttisista seossystee-meistä

Systeemi no. 1 5 a. Yksi 2 ml:n lyofiili sisältää -vaikuttava aine 5 mg -glysiini 30 mg b. Yksi 2 ml:n liuotinampulli sisältää - natriumkloridi 16 mg 10 - sitraattipuskuri tislatussa pyrogeenittömässä vedessä, täytetään 2 ml:ksi

Systeemi no. 2 - 15 a. Yksi 3 ml:n lyofiili sisältää - vaikuttava aine 5 mg - mannitoli ^0 mg b. Yksi 2 ml:n liuotinampulli sisältää - natriumkloridi 16 mg 20 - sitraattipuskuri tislatussa pyrogeenittömässä vedessä, täytetään 2 ml:ksi

Systeemi no. 3 _ 25 a. Yksi 3 ml:n lyofiiliampul1i sisältää -vaikuttavaaine 50 mg - glysiini 25 mg b. Yksi 3 ml:n liuotinampulli sisältää -natriumkloridi 2h mg 30 - sitraattipuskuri tislatussa pyrogeenittömässä vedessä, täytetään 3 ml:ksi 26 7 2 5 2 2

Systeemi no. it - a. Yksi 3 ml: n lyofii1iampul1i sisältää - vaikuttava aine 50 mg - mannitoli 20 mg b. Yksi 3 ml:n liuotinampulli sisältää 5 - natriumklori di 2k mg - sitraattipuskuri tislatussa pyrogeenittömässä vedessä, täytetään 3 ml:ksi 10 Systeemi no. 5 ~ a. Yksi 5 ml:n lyofii1ilääkepullo sisältää - vaikuttava aine 100 mg - glysiini 50 mg b. Yksi U ml:n liuotinampulli sisältää 15 - natriumkloridi 32 mg - sitraattipuskuri pH 6 tislatussa, pyrogeenittömässä vedessä, täytetään it ml:ksi 20 Systeemi no. 6 - a. Yksi 5 ml:n lyöfiililääkepulifiäl3isältää - vaikuttava aine 100 mg - mannitoli it 0 mg b. Yksi H ml:n liuotinampulli sisältää 25 - natriumkloridi 32 mg - sitraattipuskuri pH 6 tislatussa, pyrogeenittömässä vedessä, täytetään i* ml:ksi 30

Claims

27 725 22 Patenttivaatimukset :

1. Menetelmä gang1iosidien sisäisten esteri johdannaisten valmistamiseksi gangliosidistä tai gangliosidien s e ok - 5 sesta, jotka johdannaiset käsittävät (a) hii1ihydraa11io san , ainakin yhden keramidin ja ainakin yhden happotähteen, jolloin (b) hii1ihydraattiosa sisältää ainakin yhden N-asetyy-1iga1aktosamiini- tai N-as etyy1ig 1ukosamiinitähtee n ja aina- 10 kin yhden glukoosi- tai ga1aktoositähte en , ja (c) happotähde sisältää ainakin yhden N-asetyylineur-amiinihapon tai N-glyko1yy1ineuramiinihapon, ja (d) ainakin yhden happotähteen karboksyyliryhmä on sitoutunut yhden hiilihydraatin tai yhden happotähteen hyd- 15 roksyy1iryhmään 1aktonirenkaan muodostamiseksi, tunnettu siitä, että gangliosidi tai gang1iosidiseos tai tällaisen gangliosidin tai gang 1iosidiseok s en suola saatetaan vedettömässä orgaanisessa liuottimessa reagoimaan 1aktoninmuodostusreagen s sin, kuten orgaanisiin liuottimiin 20 liukenevan karbodi-imidin, 2-k 1 oori-1-metyy1ipyridinium- suolan, etok sia s ety1 eenin tai N-etyy1i-5-fenyy1i-iso-oksats -olium-31-sulfonaat in kanssa niin, että gangliosidin sisäiseen e sterijohdannais e en muodostuu ainakin yksi 1aktonisidos.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n - 25 nettu siitä, että (a) liuotetaan nisäkkäästä saatu gangliosidi tai gan-gliosidiseos vedettömään aproottiseen orgaaniseen liuottimeen, (b) lisätään ioninvaihtohartsi gan g 1iosidiin tai gangliosidi seokseen gangliosidien karboksylaatt iryhraien muutta- 30 miseksi karbok syy1iryhmik si, ja (c) käsitellään gangliosidia tai gang 1io sidis e o sta lak- toninmuodostusreagens sin, kuten orgaanisiin liuottimiin liukenevan karbodi-imidin, 2-k 1oori-1-m etyy1ipyridinium- suolan, etok sia s ety1 e enin tai N-etyy1i-5 - fe nyy1i-is o-ok s ats - 35 oiium-3'-sulfonaat in kanssa niin, että gangliosidin sisäiseen esterijohdannaiseen muodostuu ainakin yksi laktonisidos. 28 72522

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n -n e t t u siitä, että (a) saatetaan gangliosidi tai gangliosidiseos alttiiksi ioninvaihdolle gangliosidin karboksy1 aa11iryhmien muuntami- 5 seksi suoloikseen, kuten tertiaarisiksi typpisuo1 oik s ee n, (b) liuotetaan näin valmistettu gangliosidin tai gangliosi d i s e ok s en suola vedettömään orgaaniseen liuottimeen, ja (c) käsitellään gangliosidia tai gang1iosidise osta lak-toninmuodostusreagens sin, kuten orgaanisiin liuottimiin 10 liukenevan karbodi-imidin, 2-kloori-l-metyylipyridinium- suolan, etok sia s ety1 eenin tai N-etyy1i-5 - fenyy1i-is o-ok sats -olium-31-sulfonaat in kanssa niin, että gangliosidin sisäiseen e sterijohdannais een muodostuu ainakin yksi 1 aktonisidos.

4- Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetel- 15 mä, t u n n e t t u siitä, että gangliosidi tai gangliosidiseos uutetaan naudan aivoista.

5. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, t u n n e t t u siitä, että karbodi-imidi voi olla disyk 1 oheksyy1i-karbodi-imidi, bentsyy1i-is opropyy1i- 20 karbodi-imidi tai be ntsyy1ietyy1ikarbodi-imidi.

6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että orgaaninen liuotin voi olla dimetyy1isu1 fok sidi , dimetyy1iformamidi, sulfolaani, tetrahydrofuraani, dimetoksietaani tai pyridiini.

7. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, t u n - n e t t u siitä, että tertiaarisena typpisuolana käytetään trietyyliammonium- tai pyridiniumsuo1 aa.

8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sisäinen e sterijohdannai- 30 nen saostetaan asetonin avulla.

9. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 8 mukainen menetelmä, t u n n e t t u siitä, että valmistetaan gangliosidi- johdannainen, jonka hii 1 ihydraa11io san rakenne on: (Gal)(GalNAC)(Gal)(Glc)(Keramidi) jossa kaavassa 35 29 72522 Gal on ga1aktoositähde; GalNAC on N-as etyy1igalaktosamiinitähde , ja Glc on glukoositähde.

10. Jonkin patenttivaatimuksen 1-9 mukainen menetel-5 mä, t u n n e t t u siitä, että valmistetaan gangliosidi- johdannainen , jossa ainakin yksi N-as etyy1 in euramiinih appo on sitoutunut ainakin yhteen Ga1-tähte e s e en.

11. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 8 mukainen menetel mä, tunnettu siitä, että valmistetaan ainakin yksi 10 gangliosidijohdannainen, jonka rakenne on: (Gal)(GalNAC)(Gal)(Glc)(Keramidi) NANA 15 jossa kaavassa Gal on ga1aktoositähde, GalNAC on N-as etyy1iga1aktos amiinitähde, Glc on glukoositähde ja NANA on N-as etyy1ineuramiinihappotähde, 20 ja jossa NANA on e sterisitoutunut Galriin.

12. Jonkin patenttivaatimuksen 1-11 mukainen menetelmä, tunnet tu siitä, että valmistetaan gangliosidijohdannainen, jossa happo-osa koostuu N-as etyy1ineuramiini-haposta.

13. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 12 mukainen mene telmä, t u n n e t t u siitä, että valmistetaan gangliosidijohdannainen, jossa hiilihydraattiosa koostuu galak-toosi-, glukoosi- ja N-as etyy1iga1aktos amiini-o sista.

14. Jonkin patenttivaatimuksen 1-13 mukainen mene-30 telmä, tunnettu siitä, että valmistetaan gangliosidijohdannainen, joka on seuraavien yhdisteiden seos: (a) (Oal)(GalNAC)(Gal)(Glc)(Keramidi) NANA (h) (Gal)(GalNAC)(Gal)(Glc)(Keramidi) NANA NANA 35 72522 (c) (Gal)(GalNAC)(Gal)(Glc)(Keramidi) NANA NANA j a 5 (d) (Gal)(GalNAC)(Gal)(Glc)(Keramidi) NANA NANA NANA 1 0 J°ssa kaavassa Gal edustaa ga1aktoositähdettä, GalNAC edustaa N-as etyy1iga1akto s amiinitähde11ä , Glc edustaa g 1ukoo sitähde11ä ja NANA edustaa N-a s etyylίn euramiinih appotähde11ä , ^ ja jossa ainakin yksi NANA-tähde on esterisitoutunut galak-toositähteen hydrok syy1iryhmään ja/tai viereiseen NANA-tähteeseen 1aktoonirenka a n muodostamiseksi.

15. Jonkin patenttivaatimuksen 1-14 mukainen menetelmä, tunnet tu siitä, että valmistetaan gangliosi-20 dijohdannain en, jossa gangliosidin happotähteen jokainen karbok syy 1 iryhmä on esterisitoutunut hiilihydraatti-tähteen hydroksyyliryhmään tai johonkin happotähteeseen laktoni-sidoksen muodostamiseksi. 31 72522