Opis patentowy opublikowano: 88 05 31 143207 Int. Cl4 C07H 17/04 Twórca wynalazku Uprawniony z patentu: Fidia S.p.A., Abano Terme (Wlochy) Sposób wytwarzania estrów wewnetrznych gangliozydów PrzeoMotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia estrów wewnetrznych gangliozydów.Srodki farmaceutyczne zawierajace powyzsize zwiazki isa stosowane do leczenia zaburzen ukladu neinwowego (bedacych nastepstwem wypadków lub chorób, w wyniku których nastapilo uszkodzenie tkanki nerwowej.Gangliozydy sa igrupa glikosflingoliipidów. W ich strukturze czesc weglowodanowa laczy sie z cera- midem d kwaserm sjalowytm. Czesc weglowodano¬ wa obejmuje co najimniej jedna jednostke gadak- tozy lub glukozy i co najimnilej jedna jednostke N^acetylbglukotzamliny lub N-acetylogalaktozamiiny.Sumaryczna strukture gangliozyidu mozna przed¬ stawic nastepujacymi wzorem: jeden mol kwasu spadowego — jeden mol ceramidu — co najmniej jeden mol galaktozy lulb glukozy — co najimniej jeden mol Nnacetyloglukozaiminy lub Nnaceitylogalaktoz- aimliny Wszystkie jednostki powyzszej struktury sa po¬ laczone wiazaniami glikoizydowymii. zidentyfikowano liczne gangliozydy. Wystepuja one szczególnie obficie w fflkance nerwowej, zwla¬ szcza w tkance mózgowej. Rózne badania wyka¬ zaly, ze najwazniejszymi sposród kwasów sjalo- 10 15 20 25 30 2 wyich znajdowanych w gangltlozyidiach sa kwas N- -acetylo-neuraimlinowy (NANA) i, w mniejszym stopniu, kwas N^iikolonauramdnowy. Sposród licznych zidentyfikowanych gangliiiozyidów, rw zna¬ cznych ilosciach znaleziono w mieszaninie ganglio- zydów wyekstrahowanej z tkanki mózgowej wolu ponizsze, oznaczone ich miedzynarodowymi eym- bolami: GDib (16Vt) ifi p p p Gal(1^3i)GalNAC(l^XM(l^Gl^^ 3 (i) NANA li NANA GTlb (19Vt) P P fi P Gal(1^3)GamAC(1^4Gial(1^4)Gac01^1)Cexamid 3 (!) NANA (1) NANA (i) NANA 143 207143 207 3 Omi tólV.) fi p fi e CktiCt+fiOGaiNAlCW (!) . NANA GDlft (40*/i) P fi (fi : P li;" . GaJ(l^^GamAC(11^4)G^i(1^4)Gac(l^l)Ceramiid (!) (!) NANA NANA Gic oznacza glukoze, GaUNAC oznacza N-acety- logalaktozamine, 'Gai oznacza galaktoze. NANA oznacza kwas N^etyflbHneur.aminowy, a podane w nawiasach - procenty oznaczaja ilosci, w jakich poszczególne gangliozydy sa znajdowane w mie- sza^inie,wlye|kSitraho(wianej z tkanki mózgowej wolu.Wiadomo, ze gangliozydy odgrywaja wazna role w ukladzie nerwowym, a ostatnio wykazano, ze gangliozydy sa uzyteczne w leczeniu zaburzen ob¬ wodowego ukladu nerwowego i schorzen central¬ nego ukladu nerwowego (Acta jpsychiait., Scand., 55„ 1102 (19T77); Eur. M)ed. PShys. 1$, 1, (1*977); Ric Sc*. Ed,uC. Perm, 0, \115, C1976); Adv. Exp. Biol. 71, 2.75 (1976); Electroimyogr. Ciin. Neurophysiol., 19, 353, (1979); Minerva Medica,, 60, 3277 (1978); Mi- nerva Stomat., 27, 177,, (19)78); Med1. dei Lavoro, 68, 296, (1077); Brain Res-. 197, 236,, (1980)).Czynnosc lecznicza gangliozydów polega glównie na stymuiowaniiu zjawisk odrastania w tkance nerwowej i aktywowaniu enzymów membrano¬ wych bioracych udzial w przenoszeniu badzców nerwowych,, takich jak enzym (Na+, K+) ATPaza (Bratm Ries,, 1197/23a ildl8lQ; Leon i inni, J. otf Neu- rochem^, 3fy, 390 przez gangliozydy isprzyja regeneracji i leiczeniu uszkodzonej tkanki nerwowej.Dalsze 'badania poswiecono poszukiwaniom zwiazków, które moglyby 'byc jeszcze efektywniej¬ sze niz, gangliozydy w leczeniu zaburzen ukladu nerwowego.Obecnie stwierdzono, ze pewne pochodne gan¬ gliozydów sa aktywniejsze niz same gangliozydy w stymulowaniu odrastania tkanki nerwowej i aktywowaniu enzymów membran bioracych udzial w przenoszeniu bodzców nerwowych, takich jak enzym (!Na+, K+)-ATTPaza. Szczególnie aktywne i aktywniejsze niz wyjsciowe gangliozydy macie¬ rzyste sa w leczeniu zaburzen ukladu nerwowego estry (wewnetrzne gangliozydów. Badania in vitro i dn vivo- wykazaly;, ze estry wewnetrzne ganglio- zydów sa aktywniejsze niz macierzyste gangliozy¬ dy w stymulowaniu odrastania tkanki nerwowej i aktywowaniu enzymu miemjbranowegio i(Na+, K+) ATPazy, bioracego udzdal w przenoszeniu bodz¬ ców nerwowych.(Dotychczas wyodrebniono jedynie niektóre spo¬ sród mozliwycfe wewnetrznych estrów gangiiozy- dów a. tfoanki' mózgowej i to W bandlzo malych ilosciach, fisfta^- wewnetrzne gangliozydów powsta¬ ja w reafecji miedzy griupa karboksylowa jednost¬ ki kwasu sjalowego z grupa wodorotlenowa jed- 10 15 20 25 30 35 40 50 55 60 65 nej z jednostek weglowodanowych lub innej przyleglej jednostki kwasu sjalowego w tej samej czasteczce gangliozydiu (J. of Neurocliejmistry, 314, 1351, (1980), Buli. of Molecular Biolo^y and Me- dicihe, A, 170,, (1978)). Przykladowo, jeden z mozli¬ wych wewnetrznych estrów gangliozydów moze byc przedstawiony wzorem 1, w któr^in R w jed¬ nostce kwasu sjalowego oznacza aitom wodoru lub grupe wodorotlenowa, a Ri w grupfó Ceramido- wej oznacza grupe alkilowa kwasu tluszczowego, takiego jak olejowy, .stearynowy lub linolenowy.Wewnetrzny ester giangliozydu o wzorze 1 jest przykladem pochodnej., w której grupa karboksy¬ lowa kwasu sjalowego jest zwiazana estrowo z grupa wodorotlenowa jednej z jednostek' weglo¬ wodanowych,, w danym przypadku gaj&ktozy. Wy¬ tworzenie wewnetrznego wiazania estrowego, lacz¬ nie z normalnym wiazaniem glikozyclowytm mie¬ dzy kwasem sjalowym,, a jednostka weglowodano¬ wa stwarza pierscien laktonowy, tyjpowo 5- lub 6-czlonowy, charakterystyczny dla pochodnych gangliozydów typu wewnetrznego estru. Nalezy zauwazyc, ze oprócz struktury przedstawionej przykladowo wzorem 1 mozliwe jest utworzenie innych piersicieni daktonowych, piecie- lub wiecej czlonowych,, przez .zwiazanie grupy karboksylowej z któras" z grup wodorotlenowych jednostka we¬ glowodanowej.Jak wyzej zauwazono, pochodne gangliozydów typu estru wewnetrznego moga powstac równiez pnzez estrowe zwiazanie kwasu sjalowego z inna przylegla jednostka kwasu sjalowego, do której pierwsza jednostka jest przylaczona w wyjsciowym gangdiozydzie .wiazaniem gMkozydbwym. Taka stru¬ kture mozna przedstawic wzorem 2, w którym Ra oznacza jednostke weglowodanowa zwiazana gli- kozydowo z jednostka kwasu sjalowego.Inny mozliwy wewnetrzny ester gangMozydu, przedstawia wzór 3, w którym R3 oznacza jednost¬ ke weglowodanowa, z która zwiazany jest estrowo kwas sjadowy. Wzór 3 przedstawia wiec wewnetrz¬ ny ester gangliozydy w którym kwas sjaiowy jest zwiazany estrowo z przyleglym kwasem sja- lowyim,, który*-z kolei zwiazany jest estrowo z jednostka weglowodanowa. Widoczna jest wiec mozliwosc licznych wariantów wyzej opisanych pochodnych, w których wewnetrzny ester powsta¬ je z czesci weglowodanowej,, co najmniej jednego ceramidu i co najmniej jedynego kwasu sjalowego i w których jedna luft) wiecej jednostek kwasu sjalowego jest zwiazana estrowo iz jednostka we¬ glowodanowa i/lub jedna lulb wiecej jednostek kwasu sjalowego jest zwiazana estrowo z przy¬ legla jednostka kwasu sjalowego.Tak wiec sposobem wedlug wynalazku mozna otrzymac liczne wewnetrzne estry gangliczjyidów, a zwiaizki przedstawione wzorami 1 do' 3 podane sa jedjnnie przykladowo.Z obecnego stanu techniki znane sa miedzy in¬ nymi nastepujace sposoby wytwarzania wewnetrz¬ nych estrów ganglio^dów: jl. Wytworzenie ^we^i^csnego estru przez zwy¬ kle pozostawienie mn&i&wdu w roztworze kwasu octowego lub /kwasu^%:^|^ilorooctowego (Sphfimgo- lipids,, Sphfingoldpiidoses and Ailied' Ddsorders, Adv,143 207 ao 15 Exp. Mad. Bdol, 10* 0(5 (1972); J. Neurochem. 28, 1133, (10(77)). W sposobie ityim konieczne jesit pro¬ wadzenie reajkcjd przy bardzo wysofctlm stosunku kwasu octowego do gangliozydu i nie uzyskuje sie, pelnej tran^lormacji gangliozydu. & Reakcja jffizpuszczalnego w wodzie karbodwu- in^lidu z gang(jj#zydu tw srodowisku wodnym (Car- bpfcydr. Res. "$|, 344, 019^5)). Rófwniez w tym spo- cobae nie uzyifcuje sie pelnej transforimaciji gan- |jj|#zyidiu, gdygj, reakcje przeprowadza sie w srodo- ^|fku wodnymi Wydajnosc produktu jest -bardzo Xttfika i koniiej^taie jest oczyszczanie produktu — wjgwneitrznego estru.JJSfcOsobem wedlug wynalazku oitrzymiulje sie estry ^wnetrzne gjanglaozydów zawierajace czesc we- Ijfowodanowa., co nagmniej jedno ugrupowanie cer- fmidu i co najmniej jedno (ugrupowanie kwasu, Pjtóy czyim wymieniona czesc weglowodanowa elgejmiuijle co jjiajirnniej jedno- ugrupowanie N-iace- ^ogalaJfctozo||E$ny lub N-acetylb gdukozaminy i 20 po najimnieg Ipteio ugrupowanie glukozy lulb ga- Jaktozy, wyfli|gnione ugrupowanie kwasu obejmu¬ je co najmnj$| jeiden kwas Nnacetyloneiurajmino- wy lulb kwas ilnglllikoliloneuranTdnowy, oraz grupa jcarboksylowa co najimniej jednego z wymdenio- *» giych ugrupowan kwasu jest zwiazana estrowo z grupa hydrpj^gylowa jednego z wymienionych we¬ glowodanów albo jednego z wymienionych ugru¬ powan kwiasli z utworzeniem pierscienia laktono¬ wego. Zwiazjfrt sa iznane, jednakze dotychczasowe 30 sposoby icth ^brtwarzania opisane powyzej nie po¬ zwalaly na olizyimanie jch z wysoka wydajnoscia.Sposób wejcjftug wynalazku, który jest nowy, eli¬ minuje te w$de i pozwala na uzyskanie produktu z wysoka Wydajnoscia prawie ilosciowa, przy czym otrzyn^iine pochodne sa calkowicie zlaktoni- zowane.Sposób ]wr|dlug wynalazku polega na tym, ze poddaje sifj gangliozyd lulb mieszanine gangliozy- dcW wyizoj^wane ze ssaków rozpuszcza sie w niewodnym rozpuszczalniku organicznym, nastep¬ nie grupy jjjarboksylanowe gangliozydow przepro¬ wadza sie fy grupy karboksylowe lub. ich sól, za Tkanka ssaka I ekstrakcja Wyekstrahowane gangliozydy SchematA I 35 40 pomoca wymiany jonowej, zas na otrzymany gain- gliozyd lub mieszanine gangliozydow dziala sie odczynnikiem laktonilzujajcyirn, przy czym W' otrzy¬ manych estrach wewnetrznych tworzy sie co naj¬ mniej jedno wiazanie laktonowe. Jako odczynnik lakitondzujjacy stosuje sie zjwiazek inny niz kwas octowy lub kwas trójchiorooictoiwy.Otrzymany pro¬ dukt ewentualnie oczyszcza sie przez wytracanie, korzystnie acetonem. . Sposób wedlug wynalazku moze byc w praktyce wykonywany Wedlug dwóch korzystnych warian¬ tów, miedzy którymi róznica polega na dzialaniu odczynnikiem laktonizujacym na gangiliozyd za¬ wierajacy grupe karboksylowa "(co przedstawiono na ponizszymi schemacie, czesc A) lub na sól gan¬ gliozydu z zasada taka np. jak (trzeciorzedowa zasada azotowa (schemat, czesc B).Tak wiec, jeden 0 korzystnych wariantów spo¬ sobu wedlug wynalazku polega na Itym, ze roz¬ puszcza sie gangliozyd lub mieszanine gangliozy¬ dow otrzymana ze ssaka w niewodnym aprotono- wym rozpuszczalniku organicznym, nastepnie do¬ daje si'e zywice jonowymienna do wymienionego gangliozydu lub mieszaniny gangliozydow, przez co grupy j^arlboksylanowe przeksztalca sie w gru<- py karboksylowe, po czym poddaje sie wymienio¬ ny gangliozyd lub mieszanine dzialaniu odczynni¬ ka laktonizuijacego z utworzeniem co najmniej jednego wiazania laktonowego w* otrzymanych estrach wewnetrznych gangliozydow.Drugi z korzystnych wariantów polega na tym, ze poddaje sie gangliozyd lub mieszanine ganglio* zydóiw wymianie jonowej przez; co przeksztalca sie grupy karboksylowe w wymienionych gangllo- zydach w ich sole*, nastepnie rozpuszcza sie tak wytworzona sól gangliozydu lub mieszaniny gan¬ gliozydow w niewodnym rozpuszczalniku orga¬ nicznym,, po czym poddaje sie wymieniona sól ganigliozydu lufo mieszaniny gangliozydow reakcji z odczynnikiem laktonizuaacymj, z utworzeniem co najmniej jednego wiazania laktonowego w otrzy¬ manych estrach wewnetrznych gamgiliozydów. 1 Dzialanie zywica •typu styrenu j.Gangiiozyd-OOOiH (grupy karboksylowe) I Dzialanie odczynnikiem i laktonizujacym Estry wewnetrzne gangliozydow (w roztworze) I Wytracanie i acetonem Estry wewnetrzne gangliozydow (w postaci wytraconej) Schennat (grupy karboksyianowe) Schemat B Zastosowanie wymiany jonowej wymiany anionowej (np. forma soli trzeciorzedowej) Sól ganglioizydzu 'zasada azotowa) . ¦ 4- ' Dzialanie odlczynnikiem laktonizujajcym Estry wewnetrzne ganglfiozydów i(jw roztworze) I Wytracanie. i acetonem Estry wewnetrzne gangliozydow (w postaci wytraconej)143 207 8 Schieimatycizny przebieg powyzszych obu warian¬ tów przedstawia nastejpujajcy schemat: Nalezy wyjasnic, ze w wariancie wedlug sche- maitu A dzialanie zywica jonitowa typu styrenu przeksztalca wszystkie grupy karboksylanowe COO- gangldozydu W grupy karboksylowe -OOOH.Korzystnymi rozpujszczalindkaimd organicznymi odpowiednimi db uzycia w1 sposobie wedlug wyna¬ lazku sa dwuimetylosuifotlenek (DMSO), dwuime- tyioitormaimid (iDMF), sufofblan, czterowodorofuiran, dlwiuimieitokByetan, pirydyna d dch mieszaniny. Od- powfiedndimd odczynnikami laktonizujacymd sa kar- bodwiudmddy roepuiszczialne w organicznych roz¬ puszczalnikach, takie jak dwucyfcloheksylbkiarbo- dwujimdd, benzyloizopropylokarbodwudinfid i: ben- zyloeltloksykarlbodwufiimdd, sole SKihioro-ilHmeltylopi- rycfyindowe, eitoksyaceityien i odczynnik Woodwar- da (N-e^ylb^-jfenyloiizoksazoliowy^^ulfonian).Ganglldozyóty wyjsciowe^w sposobie wedlug wy¬ nalazku sa ekstrahowane z tkanki mózgowej ssa¬ ków, najkorzystniej fwolu.Wlasciwosci farmakologiczne Pewne wewnetrzne estry gangliozydów i sposo¬ by dch wyitwarzania omówiono w dotychczasowym stanie technika, jednakze dotychidzas nde omówiono biologicznej czynnosci i' mozliwych farmaceutycz¬ nych zastosowan tych pochodnych. Obecnie stwierdzono, ze wewnetrzne estry gangliozydów sa wysoce, akitywne w leczeniu zaburzen ukladu nerwowego, a aktywnosc ich jest iznacznie wyz¬ sza od aktywnosci samych gangldozydów. We¬ wnetrzne estry gangliozydow imtoga byc stosowane do leczenia róznorodnych zaburzen nerwowych, w ityim zaburzen obwodowego i centralnego ukladu nerwowego wywolanych (ohoroibamd lu|b wypadka- md. Zwiazkli moga byc stosowane w teraipdi po¬ operacyjnej, po chdrorgii naruszajacej nerwy, jak chirurgia zylaków odbytnicy.Wyzszosc farmakologicznych wlasciwosci we- wnejtrznych estrów gangliozydow, których wytwa- fzanie stanowi przedmiot wynalazku, mozna oce¬ nic przez porównanie z gangiibzydami, w naste¬ pujacych próbach: II. Namnazanie neurytów w szczepie komórek pheocromocitoma {PC12) 2. Aktywnosc (Na+, K+)ATPazy w membranie neuronowej 10 15 20 25 35 40 .3. Powrót elektroretinograimu do wyjsciowego po oslepieniu 1. Wplyw wewnetrznych estrów gangldozydów na namnazanie neuryltów PCi2 Miaterial i metoda Za namnazanie neurytów mozna przyjac zloka¬ lizowane róznicowanie neuronów, a biochemiczny mechanizm jakim czasteczki ganglibzydu wywolu¬ ja powyzszy efekt mozna badaic oceniajac model hodowli komórkowej dii vdtro (Ldnia koimórkbwa PCi2 pochodzaca z subklbnu 1A dostarczonego przez Dr. P. Caldssano (CjNjR. Lalbioraitorio dli Bio¬ logia CelMare — Roma, Wlochy)) CGangliosides in Neuroiogical and Neuromuscudar TTunction, De- yelojpment and Repadr", wydawca M.M. Rapport i A. Gorio, Raven Press, New York <198)l)i). W tym modelu gangllioizydy luib wewnetrzne esitry gangldo¬ zydów dodaje sie do pozywki hodowlanej,, lacznie z czynnikiem wzrostowym nerwu flNGF), specy¬ ficznym indiuktorem róznicowania PC12, w celu stymulacji namnazania neurytów. Stymulacje na- mnazania neurytów wywolana przez gangldozydy mozna nastepnie porównac ze stymulacja we¬ wnetrznymi estrami gangldozydów.Komórki (lOO 066 komórek/plytka) utrzymywano w 37°C w inkubatorze Heraeus (5% CG2 i 96% nawilzonego powietrza). Hodowle prowadzono na 60 mim plytkach Integriid Falcon Plates w pozyw¬ ce o skladzie: 85% RPM 1640 (GiLbco), 1'0% in- aktywow^nego termicznie osocza kbniskiegio (Gib- co), 5% osocza plodu krowiego (iGibco), 56 jedho- s-tek/miL penicyliny i 26 mgi^ml streptomycyny. Ho¬ dowle bankowa powlekano kolagenem.W takich warunkach komórki dziela sie, lecz nie tworza neurytów. Dodanie NGF (56 mg/ml) powoduje w ciagu 5—10 dni zatrzymanie prolife¬ racji, wytworzenie neurytów i ich róznicowanie.Efekt ten oceniano przez oznaczanie liczby komó¬ rek z neurytami poclzawszy od 5 dnia, a nastepnie co drugi dzien.Laiciznie z lNGF ido hodowli dodawano ganglib- zydy i ich pochodne i(;l miM)„ a ich dzialanie oce¬ niano 7 i 9 dnia*, oznaczajac liczbe komórek za¬ wierajacych neuryty.Wyniki badan porównawczych nad mamnaza- niem neurytów zsumowano w labflicy 1.Tablica 1 • Wp^yw pochodnych gangliozydow na formowanie neurytów w komórkach PCi2 Zwiazek Ldnia komór¬ kowa Pozywka Steze¬ nie liczba komórek z neurytami, % 7 dtzden 9 dzien kontrola ganglioizydy wewnetrzne estry gangliozydow PCi, PCia PCij 85% RPM 1646, 1i0°/o in- aktywowianego termicznie osocza konskiego, 5% oso¬ cza plodu krowiego-, 50 jjedinostek/ml penicyliny, 25 ingi^ml streptomycyny l^imM 1 imM 31 49,5 56,3 35,7 62,3 69,2143 207 10 Otrzymane wyniki wykazuja ze wytwarzane sposobem- wedlug wynalazku wewnetrzne estry gangliózydów maja zdolnosc stymulacja fonmowa- nda neuronów i sa w tym zakresie aktywniejsze ndz gangliozydy, zarówno po 7 jak i po 9 dniach. *2. Wplyw pochodnych gangliózydów na aktyw¬ nosc (iNa+, K+)-ATPazy w membranie neurono¬ wej Zdolnosc gangliózydów lulb ich wewnetrznych estrów do aktywowania enzymu (membranowego (!Na+, K+)ATPazy imoznai ocenic in viitro na pre¬ paracie memibrany neuronowej (J. of Neurochem., wyzej cytowany odnosnik).Materialy li imeitodiy a) Preparat' surowej frakcji mitochondrialnej mózgu szczura (frakcja PJ ' .Proceidura stosowana do preparowania frakcji P2 pochodzi od' opisanej przez Morgana i innych, Blochem. Biophyis. A operacje przeprowadzano iw 0—4°C; wartosci x g sa srednimi wartosciami sily odsrpdkowej). Do¬ rosle samce szczurów rasy Sprague Dawley (Charles River) (wagi ciala ISO—«175 g), dekapito- wano, szybko usunieto mózgi i przemyto izoto- nicznym roztworem oziebionym lodeim. Po wycie¬ ciu mózdzków mózgi homogenizowano dwunasto¬ ma nuichamd w góre i w dól napedzanego silni¬ kiem homogienlizaitora z teflonu i szkla (nominalna szczelina promieniowa Q$5 mm; 800 obrotów na miniuite), przy uzyciu. 4 objetosci roztworu homo- genizacyjnego (i0j32 M roztwór sacharozy zawie¬ rajacy 1 mM buforu fosforanu potasu i 04 mM dwusodowego EDTA, pH 7,27). Homogenizat roz¬ cienczono do 10% (waga/objetosc) w roztworze homogenizacyjnym, przesaczono przez 4 warstwy tkaniny ido odciskania sera i w ciagu 15 minut wirowano przy 1000 x g.Otrzymany material przemyto taka sama jak wyjsciowa objetoscia roztworu homogenizacyjne- go i wirowano jak wyzej. Polaczone supernatanty wirowano przy 17 500 x g„ w ciagu 26 minut (te warunki grawitacyjne stosowano w celu maksy¬ malnego wzbogacenia zakonczen nerwowych we frakcji), a otrzymany material staly czterokrotnie przemyto 9 objetosciami roztworu homogemiza- cyjnego i odwirowano (17 9010 x g„ w ciagu 25 mi¬ nut). Material koncowy, zwany „frakcja P2" za¬ wiera jako glówne skladniki niepoprzerytwane mi- tochondria i zakonczenia nerwowe. Koncowy ma¬ terial jednorodnie zawieszono w odpowiedniej ob¬ jetosci roztworu homogenizacyjnego i natychmiast uzyto w oznaczeniu. Dla zapobiezenia bledom zwiazanym z przechowywaniem, przed uzyciem za kazdym razem sporzadzano swieze frakcje P2.Preparaty frakcji P2 mdialy zawartosc gangliozy- dów 33„9±3,8 (SJD.) nmoii zwiazanego NeuAc/mg bialka. b. Oznaczanie ATPa/zy Czynnosc ATPazy oznaczano spekltroifiotometry- cznie, wedlug Wallick i inni., J. Bharm. Ex|ptl.Therap. 169, 434 (1974). Mieszanina reakcyjna sklau dala sie, jezeli nie zaznaczono inaczej, z 59 mM sacharozy, Ofi mM dwusoriowego EDPA (dopro¬ wadzony do pH 7„4, 100 mM NaCl, 5 mM MgCU, 10 mM KO, 2 mM monopotasowej soli kwasu fbsfofenol^irogronowego pH 7,,4)„ 3. mM ATP, 50 mM TRIS-Od pH 7,4; 0„33 mM NAiDH, kinazy pirogronianowlej (PK) (30 5 ugi/mi) i dehydrogenazy mieczanowej (LDH) (10 \ug/\rrn) w koncowej objetosci 3 ml i o koncowym pH 7,2. Reakcje zainicjowano dodaniem 5b—fJ5 pig (jako bialko) frakcji P2. Aktywnosc (Nat, Kt) ATPiazy obliczono jako róznice miedzy sumiarycz-* 1° na ATPaza a Mg2+Hzalezna ATPaza, mierzona w obecnosci 3X10-6 M strofantyny G. Czas mctyw!* dualnej próby wynosil 3^5 minut.Aktywnosc ATPazy wyrazano w miedzynarodo¬ wych jednostkach (IU) (jjjm hydrolizowianego ATI*/ 15 /mg bialka/mlinuta).Aktywnosc pochodnych gangliózydów (50 mM) oznaczano po inkubacji membranami nemronowy- imi w 37°C., w ciagu 2 godzin.Wyniki porównawczych oznaczen aiktyiwnoscl' 20 ATPazy zsumowano w tablicy 2.Tablica 2 Wplyw pochodnych gangliózydów na (Na+, K+) ATPaze membrany neuronowej 25 30 35 40 Zwiazek kontrola ganglio- zydy wewnetrz¬ ne estry gangliózy¬ dów Czas inkubacji 120 minut 120 minut 120 minut Tempe¬ ratura inku¬ bacji 37°C 37°C 37°C Steze¬ nie (nM) __ 50 50 P/i zwiejk- szenia aktyw¬ nosci (Na+, K+) ATPazy 100 142 174 50 Otrzymane wyindki swiadcza, ze wewnetrzne estry gangliózydów, wytwarzane sposobem wedlug wynalazku, maja zdolnosc atotywowainUa: enzymiu: 45 membrany neuronowej (Na.+, K+)A51[Pazy i -rjML; aktywniejsze od gangliózydów w tym-samym sie- zeniu molowym. 3. Wplyw pochodnych ganglitozyicfów na (ptowsót elektroreitinograimu do wyflsctiowego po o&ejpdenlki: Zdolnosc gangliozydólw luib ich wewnejteznych: estrów do odzyskiwania elektcyczneij aktywnosci siartkówki mozna ocenic po fizycznym jlej zndaacize-; niu (oslepieniu) u królika. W tym modelu gangjio- zydy lub ich wewnetrzne estry podaje sie pozaje~ 55 litowo (dozylnie) (,Jnt. Symposdum on the Neuco- chemdstry of .the Retina", Ateny, 26 sierpnia — 1 wrzesnia 1979, komunikat), (,,Satellliite Meeting on Biocihemical and Pihiarmacologdcal ImpHcations of Gangliosiides Fumetions", Contona, 28 sierpien— 60 311 sierpien (tL97i5) komunikaty). l Metody i materialy. Stosowano samce królika rasy New Zealand wagi 1,9 do 2 kg (JmL Symfr. on the Neurochemdistry of the Retina, 28 Bdterp*- nia .— 1 wrzesnia 1976).• Znieczulenie rogówkowe wywolywano jmsfejfceo-143 207 ii 12 10 wym jtodawaniem 0,4°/o noVesine. Elektroretino- grami rejestrowano przez przylozenie elektrody rogówkowej (wg Henkesa) i zprnocowanie jej za pomoca lekkiego ssania.* Elektrode odniesienia sta¬ nowila igla wprowadzona podskórnie w obszar czolowy.Uzyto nastepujacej aparatury: aimpMkator pra¬ du znamiennego 5AE2N Tektronics (10 Htz, filtry pradu stalego); analizator Neuroaverager 1172 OTE Riomedica; rejestrator wykresu XY L800 Ldnsefis; fotostyimulator 1273 OTE Biomedica.Fotostymuiacje przeprowadzano piecioma bly¬ skami 0„i2 wait/sek czas trwania 10 sekund, czesto¬ tliwosc 0,5 Hz. Ozas podstawowy do rejestracji 13 wynosi 1O0 msek (nastawienie poczatkowe = 5).Zwierzeta utrzymywano w ciemnym poimieszcze- niu w ciagu 30 mi^ult,.' adaffstujac; i'e do ciemnosci w warunkach stalego powietrza, temperatury i halasu. * Przeprowadzono nastepujace oznaczenia: wowego. W szczególnosci mozna je stosowac do leczenia zaburzen obwodowego ukladu nerwowe¬ go wywolanymi urazami, uciskiem, degeneracja i zatruicieimnzakiazeniem, gdlzie konieczna jest rege¬ neracja nerwu i odtworzenie funkcji neuiromies- niowej oraz zaburzen centralnego ujkiadu nerwo¬ wego wywolanymi urazami, niedotlenieniem, de¬ generacja i zaitruciem-lzakazeniem, gdzie koniecz¬ na jest stymulacja formowania, neuronów dla przywrócenia funkcji. Zaburzenia te byly dotych¬ czas leczone gangliozydacmi, jednakze wyzej opdsa- ne próby wykazaly, ze wewnetrzne estry — po¬ chodne gangliozydów sa aktywniejsze niz same ganglijozydy.Wewnetrzne estry ganigliozydów mozna stoso¬ wac jako substancje czynna srodków farmaceu¬ tycznych podawanych ludziom lub zwierzetom, do¬ miesniowo, podskórnie lub sródskórnie, przez inie¬ kcje dozylna lub wlew. Srodki moga miec postac roiztworów zwiazków lub liofilizowanego proszku zwiazków, lacznie z jednym lufo kilkoma farma- Tablica 3 Wplyw pochodnych gangliozydów na po/wrót elektroretinogramu do wyjsciowego Zwiazek gangliozydy wewnetrzne estry ganglio¬ zydów Zwierzeta Dawka dozylna % powrotu ERG do wyjsciowego w odniesieniu do kontrolli 20 miln 40 imiin 60 min królik królik 33 nmol 3<3 nmol!/kg :+5 +0 +'9,0 +12,7 + 13,0 +(20^5 1. U kazdego ze zwierzat oznaczono trzy kon¬ trole podstawowe, w odstepach po 15 minut. Obli¬ czono srednie z fal a+fo (pik do piku!). 2. Nastepnie zwierzeta poddano oslepianiu w ciagu 20 minut, stosujac lampe Scho/tt Madjnz KLlSOiB umiejscowiona w odleglosci 1 cm od eiek- \ trody rogówkowej.Po tym okresie oznaczono powr6t elektroretino¬ gramu (ERG) do wyjsciowego,, /przez pomiar am¬ plitudy ERG w 20, 40 i 60 minut .po okresie osle¬ piania. Uniozliwilo to ocene podstawowej kon¬ dycja zwierzecia.Z kolei zwierzetom podlano zwiazki i po uply¬ wie 3i0 minut ponownie ipoddano je oslepianiu, rejestrujac ERG w sposób identyczny jak po¬ przednio.ZwfiaizM podawano w dawce 313 nmolii/kg,, iniek¬ cja dozylna.Wymsiki badan porównawczych nad- powrotem elektroretinogramu do wyjsciowego zsuirriowania w tablicy 3.Otrzymane wyniki swiadcza, ze wytwarzane sposobem wedlug wynalazku wewnetrzne estry przyspieszaja powrót elektroretinogramu do wyj¬ sciowego i wykazuja wiejksza aktywnosc niz gan¬ gliozydy we wszystkich badanych przypadkacn.(Stosowanie lecznicze Wewnetrzne estry gangliozydów mozna stoso¬ wac jako leki' w róznego rodzaju terapii ukladu nerwowego, zwlaszcza zaburzen obwodowego ukla¬ du nerwowego i schorzen centralnego uikladu ner- 40 45 50 55 60 ceuitycznie dopuszczalnymi nosnikami lub rozcien¬ czalnikami, zawartymi w -buforowanych srodowi¬ skach o oidlpowiedmim pH i izotoinicznymi z ply¬ nami fizjologicznymi,. Podawana dawka beidlzie za¬ lezec od zadanego efektu i zadanej drogi poda¬ wania. Dla przykladu (nie ograniczajacego) dawka moze wynosic od 0,05 do 5 mg substancji czynnej na kg wagi ciata dziennie, a dawka jednostkowa od' 0j05 do 2 mgi/kg wagi ciala dziennie.-Srodki lecznicze sporzadza sie zwykle z miesza¬ niny róznych wewnetrznych estrów gangliozydów, lecz moga one zawierac tylko jedna,, izolowana pochodna.Sposób wedkig wynalazku wytwarzania wewne¬ trznych estrów pochodnych gangliozydów jest ilu¬ strowany ponizszymi przykladami. iP r z y k l a, id I. Mieszanine gangliozydów otrzy¬ muje sie przez ekstrakcje z mózgu wolu,, 5 g mie¬ szaniny rozpuszcza sie w 50 ml DMSO. Dodaje sie 4 g bezwodnej sulfonowanej zywicy styreno¬ wej (o rozjdnoibnieoiu wedlug skali sitowej 5—100, forma H+) i calosc miesza sie w ciagu 30 minut w temperaturze pokojowej, Obróbka zywica joni¬ towa przeprowadza calosc grup karfooksylanowych gangliozydu w grupy -COOH (karboksylowe). Pel¬ na konwersje grup kanboksylanowych potwierdza sie Oidjpowiednia fiifzyczna metoda analityczna, np. absorpcja atomowa. Zywice odsacza sie pod zmniejszonym cisnieniem,, a roztwór zadiaje 1,5 g dwuicykloheksylokarbodwudmidu i pozostawia, w ciaigu godziny w spoczynku. Wyitracony cJwwyklo-143 207 13 14 heksylomc^znak odsacza sie, a rozitwór .zadaje 100 ml acetonu,, powodujac wytracenie produktu — wewnetrznego estru gamgliozydu. Uzyskuje sie 4,6 g produktu, co odpowiada, okolo 90—£5M war¬ tosci teoretycznej.Obecnosc, wewnetrznego esitru . potwierdza sie spektroskopia w podczerwieni i chromatografia cienkowarstwowa.Spektroskopia IR — w tabletce KBr, absorpcja wiazania estrowonlaktonowego przy 1760 cm-1.Chromatografia cienkowarstwowa — na plyt¬ kach z zelem krzemionkowym, w ukladzie CHGI3- (MeOH)i0|,3ty© CaCli (55 : 415 :10, objetosciowo), Rf mlieszaniny wewnetrznych estrów 0t,7 do- 0,85. War¬ tosci Rf produktów koncowych sa wyzsze od war¬ tosci Rf mieszaniny zwiazków wyjsciowych. Chro¬ matografia wykazuje calkowity brak materialu wyjsciowego. Przez dzialanie 0,ylN roztworem Na^003 w 60°C w ciagu godziny rozcina sie wia¬ zania estrowe, otrzymujac mieszanine wyjsciowych gangiiozydów.(Przyklad II. 9 g mieszaniny gangiiiozydów (soli sodowych) rozpuszcza " sie w 80 m/l diestylo- wanej wody i przepuszcza przez kolumne napel¬ niona 20 g Dowex 50 w x 8 (rozdrobnienie 1'00— 200 wedlug skali sitowej,, postac trójetyilbamino- wa).Powyzszy produkt odwadnia sie pod wysoka próznia i rozpuszcza dprzy uzyciu'kapieli sonifi- kujajcej) w 2)00 ml bezwodnego czterowodorofura- nu zawierajacego 8 ml trójetyloamdny. Roztwór powoli dodaje sie do bezwodnego czterowodoro- furanu (w ciagu 4 godzin) zawierajacego 40 mM soli 2-ic;hioro-|lHm(e1tylopirydyiniowej (w której anio¬ nem jest np. jodek, pntoluenosudfonian, trójrtfluoro- metanosulfonian Ltd.),, przy ciaglym mieszaniu i w stalej temperaturze 45°C.Reakcje prowadzi sia w ciagu 18 godzin w 45°C.Odsacza sie nadmiar odczynnika, a mieszanine odparowuje w strumieniu azotu. Pozostalosc roz¬ puszcza sie w 90 ml mieszaniny 1:1 chloroform^ /metanol i zadaje 450 imi acetonu. Produkt kon¬ cowy suszy sie pod wysoka próznia.(Wydajnosc — 1J9 g (89„7*/q wartosci teoretycz¬ nej)," ¦¦ , •Chromatografia cienkowarstwowa. Na plytkach z zelem krzemionkowym, w ukladzie CHCI3- (MeOH)Os3°/o GaCl3 (55:45:10),, Rf mieszaniny we¬ wnetrznych estrów 0,7 do 0,85. Wartosci Rf pro¬ duktów koncowych sa wyzsze od wartosci Rf, mie¬ szaniny zwiazków wyjsciowych. Chromatografia wykazuje calkowity brak materialu wyjsciowego.Przez dzialanie 0,1N roztworem Na^X3 w 60°C w ciagu godziny rozcina sie Wiazania estrowe, otrzymujac mieszanine wyjsciowych gangiiozydów.Widmo IR wewnetrznych estrów mieszaniny gangiiozydów wykazuje typowa absorpcje estro¬ wa przy 1750 cm-1 (pastylka KBr).Przyklad III. 8 g GMi (sól sodowa) rozpusz¬ cza sie w 80 md destylowanej wody i przepuszcza przefc kolumne zv10 g Dowex 50 w x 8 (rozdrob¬ nienie 100—200 wedlug skali sitowej, postac trój- etyloamoniowaj.Powyzszy produkt odwadnia sie pod wysoka próznia i rozpuszcza (jprzy uzyciu kapieli sonifi- foujaicej) w 200 ml bezwodnego 6aterowo nu zawierajacego 8 ml trójetyloamdny. Roztwór powoli dodaje sie do ©00 ml * bezwodnego cztero- wodorofiuranu zawierajaicego1 2- * -l^meitylopiryidyiniowej (np. jodku, p-toluenosulflo- nianu, trójfluorometanosuifoniainu itd.), przy ciag¬ lym mieszaniu, utrzymujac stala temperature 45°£.Rieakcje prowadzi sie w ciagu 18 godzin- w 45°C.Odsacza sie nadmiar odczynnika, a mieszanine 10 odparowuje w strumieniu azotu. Pozostalosc roz¬ puszcza sie w 80 ml mieszaniny 1:1 chtoroforim/ ' /metanol i zadaje 400 ml acetonu. Produkt suszy sie pod wysoka próznia./Wydajnosc — 7,0 g (08,4*/o wartosci teoretycz- 15 nej).Chromatografia cienkowarstwowa. Na plytkach z zelem krzemionkowym, w ukladziLe chloroform/ /meknol/0,,31% Cada (55 :45 :10), Rf produktu kon¬ cowego (0„70) jest wyzsze od Rf zwiaizteu wyjsAo- 20 wego (0,,j6i5). Chromatografia wykazuje calkowity, brak materialu wyjsciowego, dzialajac 0,ilN roz¬ tworem NaaCOs w 60°C w cdagiu godziny rozcina sie wiazanie estrowe, otrzymujac wyjsciowy gah- gliozyd. , 25 Widmo IR wewnetrznego estru GMi w tabletce KBr, wykazuje typowa a«bso 1750 cm-1.-Przyklad iv; 9 g mieszaniny gangiiiozydów (soli sodowych) rozpuszcza sie w 80 ml destylo- » wanej wody i przepuszcza .przez kolumne z 20 g Dowex 50 w x 8 (rozdrobnienie 100—200 wedlug skali sitowej, postac pirydyniowa).Produkt odwadnia sie pod wysoka próznia i rozpuszcza w 800 md bezwodnego oziterowodorofu- 35 ramu i 4,2 g (60 mM) etofcsyacetylenu. Mieszanine utrzymuje sie w ciagu 3 godzin we wrzeniu pod chlodnica zwrotna. Chlodnice ozdabia sie do —10% i wyposaza w zawór odwadniajacy. 1P0 odpedzeniu rozpuszczalników i nadmiaru 40 etoksyacetylenu pozostalosc rozplaszcza sie w 80 ml mieszaniny 1:1 chlforoformt|metanol i zadaje 400 mfl acetonu, wytracajac produkt;. , Wydajnosc —-84 g (0"2°/o wartosci teore^yicznej) Chromatografia cienkowairstwowa. Na plytkach 45 z zelem krzemionkowym,, w tdtlaidztte chloroform/ /metanol/O^/o CaCl2 (55 :46 : W), .Rf mieszaniny wewnetrznych estrów wynosi od 0,7 do 0,85. R| produktów koncowych przewyzsza Rf mieszaniny. zwiazków wyjsciowych. Cihiromaitograiflia wykazuje «• calkowity brak materialu wyjsciowego. Dzialajac QjHN roztworem TCadCQ3 w 60°C w ciagu godziny roizicina sie wiazania estrowe, otrzymujac wyjscio¬ we giangliozyidy. - v Widmo IR wewnetrznych" estrów mias&aniny ss gangiiozydów, w pastylce KBr, wykazoije tflpowia absorpcje estrowa przy 1750 cm--1.Przyklad V. 8 g GMi (sól sodowa) rb^pu^z- cza sie w 80 mi destylowanej wody i przepuszcza pnzez kolumne z 10 g Dowex 50 w x 8 (roz.dirob- «o nienie 100—2100 wedlug skali sitowej, postac piry¬ dyniowa).Produkt odwadnia sie pod wysoka próznia i roz¬ puszcza w 800 ml bezwodnego czterowodorojDuranu i 2,1 g (ao mM) atoksyacetylenu. Mieszanine ui!rzy~ W muje sie w ciagu 3 godzin, we wrzeniu pod chlód-143 207 1S 16 nica zwrotna. Ghlóidnice oziebia sie do —10°C i wyposaza w zawór odwadniajacy. tPo odpedzeniu rozpuszczalników i nadmiaru eto- ksyacetylenu pozostalosc rozpuszcza sie -w 80 ml n»eszaniny 1 : mi tacfeitonu.Wydajnosc — 7,2 g (Oli,0% wartosci teoretycz¬ nej).ClhroiniattogiraLia cienkowarstwowa. Na plytkach z zelem krzemionkowym,, w ukladzie chloroform/ ^meftanolilO^P/o CaCl2 (95:46:10), Rf produktu kon¬ cowego (fl,7i0) jest wyzsze od Rf zwiazku wyjscio¬ wego (0,65). Ohromaitograifiia wy(kazuje calkowity brak materialu wyjsciowego. Dzialajac OyliN roz¬ tworem Na^C03 w ciagu godziny w G0°C rozcina Sie wiazanie estrowe, ofcrzyimjuijac wyjsciowy gan¬ gliozyd'. ¦ ' , fWddimo IR wewnetrznego estru GMi, w tabletce KBr wykazuje typowa absorpcje estrowa przy 1760 cni"1.Przyklad VI. 9 g mieszainiLny gamgliozydów (sole sodowe) rozpuszcza sie w 80 mi destylowa¬ nej wody i przepuszcza przez koluimne z 20 g DoWex 50 w x 8 (rozdrobnienie 100—000 wedlug skali sitowej;, postac pdrydyndowa).Produkt odwadnia sie pod wysoka próznia i rozpuszcza w 2O0 ml bezwodnej pirydyny,, a roz¬ twór dodaje do zawiesiny 5;52 g (i!0 mM) zwitlter- jowiamego odczynnika Woodwarda (N-etylo^-feny- lodzioiksazoiliLOHS^uiifonian, Woodward i inni., J. Am.Chem. Soc. 83, 1010—a012, 1961) w 200 ma bez¬ wodnej pirydyny. Calosc miesza sie w ciagu 10 dni w temperaturze pokojowlej.Po odsaczeniu nadlmiaru odczynnika i calkowi- tym odpedzeniu rozpuszczalnika pozostalosc roz¬ puszcza sie w 9»0 md mieszaniny 1 : ii chloroform/ ^matasnol i wy-traca 450 oni acetonu.Chromatografia cienkowarstwowa. Na plytkach z zelem krzemionkowym, w ukladzie chloroform/ teeitanoWySP/d CaCfla (56 :46 :10), Rf mieszaniny wewnetrznych estrów wynosi 0„7 do 0,86. Hf pro¬ duktów koncowych jest wyzsze od Rf mieszaniny zwdajzków wyjsciowych. Chromatografia wykazuje calkowity br-ajk zwiazków wyjsciowych. Dzialajac -AtliN roztworem Nta^COs w ciagu godlziny w 60°C rozcina sie wiazania estrowe, otrzymujac wyjscio¬ we gangldozydy. , jWidimo - IR wewnetrznych estrów mieszaniny •gangliozydów, w pastyilce KBr, wykazuije typowa absorpcje estrowa przy 1750 cm-1.Przyklad VII: 8 g GMi (soli sodowej) roz¬ puszcza sie w 80 ml destylowanej wody i prze¬ puszcza przez kolunme z 10 g Dowex 50 w x 8 (irozdrobindende 100^-200 wedlug skali sitowej), po^ stac pdryitfyniowa.Produkt odwadnia sie pod wysoka próznia i roz¬ puszcza w bezwodnej pirydynie, a roztwór dodaje do zawiesiny 1,26 g (5 mM) zwdftiterjonowego od¬ czynnika Woodwarda flN^etylonS-ifenyioizolksazoillo- -3'-suilfonian) w 200 ml bezwodnej pirydyny. Ca¬ losc miesza sie w ciagu 10 dni w temperaturze 5 pokojowej.Po odsaczeniu nadmiaru odczynnika i calkowi¬ tym odpedzeniu rozpuszczalnaJka pozostalosc roz¬ puszcza sie w 80 mi mieszaniny 1:1 chloroform/ ^metanol i wytraca 400 ml acetonu. 10 Wydajnosc — 6,3 g (7©,,5°/o wartosci teoretycz¬ nej).Chromatografia cienkowarstwowa. Na plytkach z zelem krzemionkowym,, w ukladziie chloroform/ /nuetanoli,10,30/o CaCd2 (55 : 45 : li0)„ Rf produktu kon- 15 cowego (0„7i0) jest wyzsze od Rf zwiazku wyjscio¬ wego (0,65). Chromatografia wyjkazuije calkowity brak materialu wyjsciowego. Dzialajac 0,1N roz¬ tworem Na^Os w ciagu godziny rozcina, sie wia¬ zania estrowe, otrzymujac wyjsciowy gangliozyd. 20 Widmo IR wewnetrznego estru GMi„ w pastyl¬ ce KRr, wykazuje typowa absorpcje estrowa przy 1750 cm-1. 25 PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL