FR2684675A1 - Nouveaux oligodesoxyribonucleotides presentant des proprietes anti-ischemiques et leur procede de preparation. - Google Patents
Nouveaux oligodesoxyribonucleotides presentant des proprietes anti-ischemiques et leur procede de preparation. Download PDFInfo
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Abstract
L'invention décrit de nouveaux oligodésoxyribonucléotides d'origine animale, présentant un poids moléculaire compris entre 4000 et 10000 Daltons, pouvant être obtenus par fractionnement des polydésoxyribonucléotides ou, autrement, par dépolymérisation chimique ou enzymatique d'acides désoxyribonucléiques à poids moléculaire élevé. Les nouveaux composés sont dotés d'une activité antiischémique significative.
Description
+ au Lua Lpe s Lom sap sawwos sa L a Jiua lmoddem a L 4 sa Snssap-o
auuoluaw anb Lw Lqo a Jlmwemed al Àanb Ltwaqs L-L Iue ae AAL 4 Dei L SE ap a Lq eó sn Ld dno Dneaq jne Le Ae L le enb Lw L 4 o ajaqqeied unp Jna Le A sea L Leap ue sn Ld aeap Lsuoo uo puenb 'slue odw L sanb LA Leue slL o d sal au 9 Juoo lnb eo inod LDL sa;j J Dap sa Due 2 sqns sap S 4 ue L; 9 óóp 4 uos Lnb sesodmoo sap ia Anoil qnad uo 'snssap-Lo a-4 uesgd O Ln Lao anb 9 L Le A^Jau L awaw ao suep k e j u 3 snssap-k D agnb Lpu L a 6 e Ld e L ap sea Lm LL sa L suep anl Ls a Le Lnog Lo W sp od un luequasaid 4 san 6 olowo 4 sap Lkoa Lonu- oq LIAXO Sap Ot Llo sa L *mwed a Ja L Lno Lleda LL ej aun luanq Lqsuoo SZ 4 snssep-Lo D auuo Ltuaw anb L 6 o Looew Jeqd al^A Lz De L e seu Lqsep la aouelodwtp anb LllLe Ue lLjo Jd un s Lo J el q que 4 uasaid e UOLI Ua AUL a 4 a Do uo Las sa Jaw A Lod sel Àsenb Lue 6 Bo slue^Los Op sa G Ladoidde sag Lkuenb ap UO Lq Lppe jed 'snualqo LSULE sep lkoa L Dnuoq Lj Axosapo 6 L lo O z sap UOL Iek Ld Loaid aunàp a L^,Ln S exnanbe xn L U Lt sap suep a^a Le ai Le Ln Da Low sp Lod e senb Lel Dn U Oq IAXO Sap sqp Le sap alqeleagd UOL 4 es L Ja M AlodepOp adeqq aun a Jpua Jdwo D op aunwwoo a Le Joua 6 anb Lsq L Jaqe Jeo el lue 4 uasaidsnssap-Lo sauuo Ll Ue Wsoppooid sal Sl anb 'leeu Lt Llajd al Ll e IL Dt;Lp alqa q L Op l I sanbtwaq Dst -_Lue squa 6 e awwoa sasodwoo xnea Anou sep UO Llesll Lln L lsa uo Lue^u ALa 4 o ap qa Cqo eane un Àuo Lleiedaid jna L e sau Ltsap OT sappooid se L la suoq Le P 000 'OT O OOO*' op lue L Le a 6 eld e L suep s Lidwoo a J Leln Dalow spod un;ueluesaid ela La Jnqeu au L 6,Ljop sapkqoa Lonu-oqk Axos Dpo 6 L lo xneanou ap auaouoouo UOL ue AUL uo,L e e j f'-d' @p apooid ina L le senb Lwa 3 qs L-t 4 ue sa L 6 id id- s lue-uasaid sap L Loelonuoqt I'xo ''ô'lo xnea Ano N T s Z 9 v 89 Z thymine/ cytosine + guanine, ou A+T/C+G, qui est indiqué ci- après (tableau I) et doit se situer dans une plage déterminée pour être par consequent considéré comme critique pour la définition de ses composés dans les limites de l'intervalle de poids moléculaire allant
de 4 000 à 10 000, qui est doté d'une activité anti-
ischémique significative et par conséquent se révèle
utile d'un point de vue thérapeutique.
L'état de l'art décrit déjà des polymères à faible poids moléculaire, obtenus par dépolymérisation d'acides désoxyribonucléiques naturels De toute façon, comme expliqué en détail en considérant ce qui va suivre, il n'est pas considéré d'une telle importance d'anticiper la nouveauté des oligodésoxyribonucléotides
ni d'en faire une question d'évidence.
Le EP-A-416677 décrit des usages cosmétiques de compositions contenant des polydésoxyribonucléotides d'origine naturelle, présentant un poids moléculaire compris entre 10 000 et 100 000 et, pour ce qui est de l'intérêt considéré ici, un rapport molaire purines/pyrimidines (G+A/C+T) englobé par les limites correspondantes indiquées pour le même paramètre de
cette invention (voir tableau I).
Cette description cependant n'est pas
considérée comme éliminer l'étape inventive du premier
objet de cette invention.
Par consequent, par exemple, il ne va pas être justifié du tout de considérer les nouveaux polymères comme de "simples" équivalents à faible poids moléculaire des polydésoxyribonuclêotides de cet art antérieur, étant donné que la plage citée ci-dessus des rapports molaires G+A/C+T, prise en tant que telle, inclus une classe très large de composés, comprenant à la fois les oligo- désoxyribonucléotides dotés d'une activité pharmacologique mentionnée ci-dessus et ceux qui ne présentent au lieu de cela qu'une activité à
peine existante.
Cette observation est d'ailleurs entièrement confirmée en considérant les valeurs et les plages de G+A/C+T prises en compte pour les composés de l'invention et indiquées dans le tableau I, conjointement avec ce qui est indiqué à la page 10 pour la préparation P 0067 D V qui, comme représenté dans le tableau IV ci-après, est, au lieu de cela, dotée d'une
faible activité anti-ischêmique.
Les considérations ci-dessus mènent à la conclusion sans ambiguïté que, dans le EP-A-416 677 ne sont indiquées aucune sorte d'informations pouvant éventuellement aider l'homme de l'art à sélectionner ou
à définir la classe de polymères qui y sont décrits.
Le WO 87/06235 indique des polydésoxyribonucléotides d'origine naturelle qui différent des substances qui constituent le premier objet de cette invention pour ce qui concerne les valeurs élevées à la fois des paramètres
d'hyperchromicité et de la rotation optique.
Sur cette question, il vaut la peine de noter que, dans la même demande de brevet, il est déjà décrit qu'en abaissant le poids moléculaire il se produirait
une diminution du paramètre d'hyperchromicité.
Cependant, il faut également reconnaître que le document ne donne, au lieu de cela, aucune information sur la façon dont c'est opérée la modification
concomitante de la rotation spécifique.
En outre, également dans le W O 87/06235, comme ce qui était dit pour le EP-A-416 677, aucune sorte de suggestion n'est donnée concernant les valeurs particulières ou les intervalles mutuels entre les rapports molaires A+T/C+G qui auraient été éventuellement trouvés importants pour mettre en
évidence l'activité décrite des composés.
Plutôt qu'a la lecture des indications ci-
dessus concernant les documents, il apparaît, dans le cadre d'une observation d'ordre plus général, que le rapport molaire A+T/C+G n'a même pas été considéré séparément pour opérer la caractérisation chimique de
ces polydésoxyribonucléotides.
De plus, le WO 87/06235 indique en outre une raison plus substantielle pour mettre en évidence le fait que la présente invention n'est pas chose évidente.
En fait, dans la description concernée à été
trouvée la constatation que les polymères à faible poids moléculaire des acides désoxyribonucléiques présentant des valeurs du paramètre d'hyperchromicité h inférieures à 10 manifesteraient une diminution importante de l'activité pharmacologique De plus il était également affirmé que h prend le plus souvent la valeur pour les oligodésoxyribonucléotides qui
présentent un poids moléculaire de 8 000.
Cette proposition tant directement à mener aux conclusions suivantes: a Les oligodésoxyribonucléotides présentant une valeur de h inférieure à 10 ne devraient avoir
aucune application thérapeutique.
b Plus particulièrement, étant donné que, dans la référence faite cidessus, la forte diminution de l'activité pharmacologique a été mise en relation avec les valeurs de h inférieures à 10, l'homme de l'art expérimenté aura certainement considéré que plus la valeur de h est faible, plus l'activité résiduelle est basse, principalement lorsque h = O, ce qui, selon le WO 87/06235 devrait correspondre, comme on l'a vu, à une poids moléculaire de 8000 pour ces polydésoxyribonucléotides. Ces deux conclusions sont en fait manifestement en contradiction avec les constations expérimentales de
cette invention, qui vont être mises en évidences ci-
après.
2684675
Les caractéristiques importantes physico-
chimiques et chimiques des nouveaux oligodésoxyribonucléotides sont indiquées au tableau I. Les plages de variation caractérisees ici sont généralement tirées du tableau II, à l'exception de la rotation spécifique, dont les limites ont été déterminées en prenant en considération le tableau II (limite: + 34 à + 48 ) conjointement avec les exemples: rotation spécifique de la préparation de P 0097 N mentionnée dans l'exemple 8 (+ 32,5 ) et de la
préparation P 0097 M indiquée dans l'exemple 9 (+ 30,9 ).
Les paramètres mentionnés dans le tableau I ont
été déterminés de la manière suivante.
La détermination du poids moléculaire pour des substances de la nature de celle de la présente invention dépend fortement du procédé adopté pour effectuer ces déterminations Dans le cas des procédés HPLC, le choix des standards de référence influence
fortement les résultats.
Pour la présente invention, les standards de référence ont été choisis en prenant en considération la similitude de la structure moléculaire ou de la configuration par rapport aux
oligodésoxyribonucléotides soumis à l'analyse.
Le poids moléculaire a été déterminé par HPLC, sur un chromatographe travaillant en phase liquide équipé de deux colonnes, Biosil O TSK 300 et Biosil(TSK 250 (Biorac J) montées en série et réglées par thermostat à une température de 30 C La solution composant la face mobile a été obtenue par dissolution de l'eau distillée des substances suivantes: Chlorure
de sodium 5,844 g, Na H 2 PO 4 Hz O 9,24 g, glycine 22,5 g.
Le volume a été porté ensuite à 950 ml, le p H ayant été corrigé pour atteindre 6,8 (par utilisation de Na OH 6 N), puis la solution a été diluée pour obtenir un
volume de i litre, à l'aide d'eau distillée.
46 OLOWJZU 3 Jo Sp Oqla W suep l e Dap am W Woo GULW 4 lp aa e 4 a Lo Lm W Oo Jadq<p a I Ja We Jedaq *SUO Lq Lp UOD saffl s OL suep UE oa u L alq e UOLL Lk U Eq De,1 ÀSLO O o @p Le 1 04 un aa;adal 9 la e uo Ll Los anbeq D ap uo Lloa Cu L, aseq ap i Lel OmJodde " o SN+e O O + anb L 4 Lods uo L Weo J 09 Tl Tq 008 O,1 + 3/9 +V
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000 ' 81 0091 ' 7: ue A Lns sp Lod Se L 4 u Lepuasaid Sll g uo Lln Los el suep anb s Lpue 4 '00000 Z '000 '9 b '000 '8 Sl 008 '1: 54 Ue A Ln S sea Le Lnza Low Sp Lod Sal lua Leq Ua Se Jd euqÂAS, Lod @p aqeuo O Lns Op Splepue 4 S t S@L V UOL 4 nl OS EL sued '% Z'0 O op UO Llei Ueouoo aun Ua (wn Lpos @p Las) auqj A Si Al Od ap aqeuo 4 Lns ep sp Jepue 4 S V nua;uo D 4 ue Xe xnap sep aunoeq 3 'a 6 e UUO Le P Al inod saas L Lqn OT 939 -uo g e y UOL 4 n Lo S e L a J Lp-q-;sa, o 'suo L:nlos xnad '(pa O;WL Lq sa L Io Ze Joqe SJGW l Od: Jnesstu Jnoó) nuuoo a J e ln D low splod un a Ae p-epueqs 9 a Llenb Sp (wn Lpos ep la S) euei Ai S lod sp aqeuojlns un ques L l Lln ue anioa óa aqa e auuoloo el @p a 6 e UU Oleal 1 -mu 09 Z ap 939 e E quanflta L ap anbt Ldo 9 q Lsuap El @p ainloal EL 4 h (a J;,l O 1,LW a L Jju 6 Ls lo W Uo L 14 ELA@^qeil) l OW 9 ep 91 oa Cu L U Oll U L 11 ue 4 g-L ep awnlo A el '-anu Lw Jed Lw S'O ap 4 Lea 4,q 9 p el s/9189,9 Z volume III, pages 708 à 712 (voir également page 3 de
WO 87/06235).
La rotation optique est déterminée sur un polarimètre automatique à la ligne D du sodium, en utilisant une solution de l'échantillon dans l'eau à 1 % de poids par volume (indication en poids sur une base sèche), réglée a la température de 20 C. Le calcul du rapport molaire de base A+T/C+G et de A+G/C+T a demandé la détermination préalable du pourcentage en poids correspondant de chaque base dans
l'échantillon correspondant d'oligodésoxyribonucléo-
tides Cette analyse a été faite par HPLC, sur une colonne à échange d'ions après hydrolyse de
l'échantillon comme décrit dans le EP-360 882.
Les processus par lequel ces substances peuvent être obtenues sont les suivants: précipitation par étapes du polymère, à partir de solutions aqueuses d'acétate de sodium à 0,8 M, contenant une quantité de 4 % en poids/volume de sels de polydésoxyribonucléotides de sodium d'un poids moléculaire compris dans la plage allant de 15 000 à 75.000 daltons Le processus a été effectué à la température de 20 C et la précipitation a été effectué par addition à la solution d'un alkyl alcool inférieur, choisi dans le groupe composé de l'alcool éthylique, propylique et isopropylique, en suivant les étapes indiquées ci-après: a Addition de 0,8 volume d'alcool à la solution 0,8 M d'acétate de sodium contenant 4 % en poids/volume de polydésoxyribonucléotides, de façon à précipiter la plus grande partie de la fraction de polydésoxyribonucléotides à poids moléculaire élevé, b à la solution hydroalcoolique obtenue au point a précédent et contenant 0,8 volumes d'alcool, on ajoute une quantité supplémentaire d'alcool, de manière à avoir globalement 1 volume de phase organique/volume de phase aqueuse initiale Le surnageant a ensuite été éliminé et le précipité formé, qui contient la fraction polydésoxyribonucl Eotide à poids moléculaire élevé a été adjointe par mélange aux polymères selon l'invention, récupérés puis traités de la façon indiquée à l'étape d. c Le surnageant de l'étape b précédente a été mélangé à une quantité supplémentaire d'alcool, de façon à avoir à la fin 2 volumes d'alcool/volume de solution tampon initiale d'acétate de sodium à 0,8 M du point a Dans ces conditions, il s'est produit une séparation puis une récupération des
oligodésoxyribonucléotides selon l'invention.
d Le précipité obtenu à l'étape b a été dissout dans de l'acétate de sodium a 0,8 M La fraction de polydésoxytibonucléotide à poids moléculaire élevé a été ensuite éliminée par précipitation par addition de 1 volume d'alcool/volume de solution aqueuse Le précipité a été éliminé par centrifugation et l'on a ajouté par mélange 3 la solution hydroalcoolique résiduelle de l'alcool, jusqu'à une quantité totale de solvant organique de 2 volumes/volume de phase aqueuse Le précipité ainsi formé et constitué par les oligonucl Eotides selon
l'invention a été récupéré.
Selon une méthode alternative de celle indiquée ci-dessus, on peut également opérer seulement une précipitation intermédiaire, par addition v la solution aqueuse initiale de i volume d'alcool Dans ces conditions, on a ajouté a surnageant un volume d'alcool supplémentaire, en obtenant ainsi la précipitation des polymères attendus Ce processus mène de toute manière
à des productions moindres.
Dépolymêrisation par voie thermique des sels de sodium des acides désoxyribonucléiques a poids moléculaire élevé, dans un tampon aqueux composé
d'acide ac Etique/acétate de sodium à 0,5 M et p H 4,1.
Ledit procédé a été effectué à une température variant de 65 C à 75 C, pendant une durée d'au moins 6 heures, de préférence inférieure à 10 heures, cette durée dépendant de toute façon du pois moléculaire de l'acide nucléique de départ La dépolymérisation a été effectuée par surveillance à intervalles fixés du poids moléculaire Le processus a été effectué jusqu'à ce que le poids moléculaire se situe dans les limites
concernées indiquées au tableau 1.
La concentration en acide désoxyribonucléique dans ledit tampon d'acétate de sodium à 0,5 M était de 4 % en poids/volume au, autrement, d'à peu près 12 % en poids/volume, tandis qu'il apparaît qu'avec la concentration plus élevée, les productions sont
quelques peu meilleures (voir exemples 6 à 11).
Le processus consiste en les étapes indiquées ci-après: a Dissolution d'acides désoxyribonucléiques à poids moléculaire élevé, puis addition de trihydrate d'acétate de sodium + acide acétique concentré ( 80 %)
pour donner au tampon la molarité et le p H requis.
b Chauffage de la solution aqueuse, visqueuse, obtenue au point a précédent à une température variant
de 65 C à 75 C, pendant une durée d'au moins 6 heures.
c Abaissement, à la fin du traitement thermique du point b, de la température à 30 C, correction du p H pour atteindre 7,8 à 8,0 à l'aide de Na OH à 30 %, puis nouveau chauffage à 85 C pendant 90 minutes. d Refroidissement de la solution à la température ambiante, correction du p H pour atteindre 6,5 à l'aide d'acide acétique concentré et précipitation des oligodésoxyribonicléotides par addition d'éthanol en une proportion variant entre 1,5
et 2 volumes/volume de solution aqueuse.
Dépolymérisation par désoxyribonucléase des acides désoxyribonucléiques à poids moléculaire élevé, puis étape d'ultrafiltration, afin de concentrer la solution. L'enzymolyse a été effectuée sur i % en poids/volume d'acides nucléiques à poids moléculaire élevé, pendant une durée de 24 heures, dans un tampon de phosphate de 0,1 M et de p H 7,0, en présence de chlorure de magnésium à 10 m M A la fin, l'étape d'ultrafiltration a été effectuée de la façon suivante: a Ultrafiltration de la solution sur une membrane ayant un pouvoir séparateur de 10000 daltons, jusqu'à ce que le volume de la solution soit réduit au
1/5 du volume initial.
b Dessalage de la solution de rétentat en opérant sa dialyse à volume constant (c'est-à-dire en ajoutant de l'eau à la solution afin de maintenir le volume égal au volume initial) contre un total de 5
volumes d'eau distillée.
c Concentration des perméats réunis, collectés à partir des étapes a et b précédentes, pour atteindre 1/5 du volume initial, par ultrafiltration sur une
membrane à pouvoir séparateur de 3000 daltons.
d Récupération des produits dissouts dans les rétentats de la première ultrafiltration (étape a, pouvoir séparateur de 10000 daltons) et, respectivement de la deuxième ultrafiltration (pouvoir séparateur de 3000 daltons), après avoir au préalable augmenté la salinité des solutions ci-dessus à une valeur de concentration en sel de 0,8 M, ce sel étant de préférence de l'acétate de sodium, puis précipitation par addition de 1,5 volumes d'éthanol/volume de phase aqueuse. En variante, au lieu des étapes d'ultrafiltration décrites ci-dessus, on peut opérer la concentration de la solution en suivant la procédure suivante: a ultrafiltration sur une membrane ayant un pouvoir séparateur de 3000 daltons, jusqu'a ce que le
volume du rétentat soit de 1/5 du volume initial.
b Dessalage de la solution de rétentat, on opérant sa dialyse à volume constant, contre un total
de 5 volume d'eau distillée.
c Récupération des produits dissouts du
rétentat, comme décrit ci-dessus, au point d.
Ledit processus apparait donner à peu près la même production que le processus précédent, avec comme
avantage une plus grande simplicité de la procédure.
Dans la totalité des procédures décrites ci-
dessus, le composé a été obtenu à partir de précipité
par déshydratation, broyage puis séchage.
Sur le tableau II est indiqué le profil analytique de ces préparations, utilisées dans les
essais pharmacologiques décrits ci-après.
La préparation d'oligodêsoxyribonuclêotide portant le code de laboratoire P 0067 D V ayant un poids moléculaire inférieur à 10000 et dotée d'une activité anti-ischémique bien inférieure que les polymères selon l'invention, a été obtenue par la méthode de fractionnement décrite à l'exemple 15 Cette préparation a présenté les données analytiques suivantes (base poids sec): poids moléculaire 6600, H 1,4,, A+T/G+C 1,494, A+G/T+C 0,914, rotation spécifique
+ 37,2.
Il faut dire que la même méthode de fractionnement qu'utilisée pour obtenir le P 0067 D Y, lorsqu'on applique à d'autres lots d'acides désoxyribonucléiques dépolymérisés, donne de toute
façon un produit présentant les mêmes caracté-
ristiques analytiques, c'est-à-dire présentant une valeur élevée du rapport A+T/G+C Une démonstration
appropriée est donnée à l'exemple 16.
Tableau II
Caractéristiques physico-chimiques et chimiques des préparations d'oligonucléotides ayant été utilisées dans les tests pharmacologiques En tête de chaque colonne est indiaué le code laboratoire
P 0085 C P 0085 D IV P 0085 M II P 0130 A
Poids moléculaire 8500 6400 9500 8000 h 9,4 3,9 9,0 3,5
A+T/G+C* 1,298 1,446 1,305 1,263
A+G/T+C* 0,908 0,849 0,917 0,806
rotation spécifique + 47,3 + 38,6 + 46,2 + 34,8 *rapport molaire
P 0130 0 P 0102 A P 0102 B
Poids moléculaire 9400 8000 4500 h 5,8 9,7 3,9
A+T/G+C* 1,230 1,230 1,110
A+G/T+C* 0,854 0,854 1,096
rotation spécifique + 36,2 + 36,2 + 47,3 *rapport molaire Sur le tableau III sont représentées les données de l'activité fibrinolytique des composés selon l'invention, de la préparation P 0067 D V et, à titre de comparaison, celle de l'agent fibrinolytique qu'est la plasmine, une enzyme dérivée d'un plasminogène Il faut mentionner ici que la
plasmine est utilisée dans la thérapie humaine.
L'activité a été exprimée en mcg de paranitroanilide (p NA) hydrolysé à partir des substrats de peptide S-2251
auquel le p NA est lié par une liaison covalente.
Ladite liaison présente une susceptibilité sélective à
l'action des agents fibrinolytiques.
lz Par suite de cela, la quantité de p NA dégagée dans la solution est directement liée à l'activité
fibrinolytique du composé essayé.
L'activité fibrinolytique a été testée in vitro, en utilisant le tripeptide S-2251 (H-D-valil-L- leucil-L-lysine paranitroanilide dihydrochlorure Kabi, Milan), tel que décrit pour l'essentiel par J H. Verheijen et Alii in "A simple sensitive spectrophotométric assay for extrinsic (tissue-type) plasminogen activator applicable to measurements in
plasma" Thromb Haemostas 48 ( 3) pages 266 â 269, 1982.
La fraction de plasma euglobuline a été préparée en collectant du sang ( 8 ml) à partir de la veine marginale de l'oreille d'un lapin, au moyen d'une seringue contenant déjà 2 ml de solution à 3,8 % en poids/volume de citrate tribasique de sodium Le plasma obtenu par centrifugation a été ensuite séparé en petits échantillons de 0,5 ml, et à chaque petit échantillon a été ajouté 1 ml de la solution d'oligonucléotide, de telle façon à la fin on ait les deux concentrations d'échantillons suivantes: 200 et 800 mcg/ml de plasma (mcg signifie microgrammes) On a ajouté aux solutions 0,1 ml de solution aqueuse d'urokinase ( 50 U/ml), afin de convertir le plasminogêne en plasmine On a ajouté de l'acide acétique pour porter le p H à 5,4 et le volume de la solution a été ajusté à 8,5 ml, à l'aide d'eau distillée froide à une température de + 4 C, de façon à obtenir la précipitation de l'euglobuline L'étape a été effectuée par transfert des tubes de test dans un réfrigérateur (+ 4 C) pendant 2 heures Il a été ensuite effectué une centrifugation pendant 10 minutes et l'on a séparé le surnageant Le résidu a été prélevé avec 0,3 ml de solution tampon de tris hydrochlorure et réglé à p H 7,4, en le mettant en suspension Aux 0,3 ml de la suspension ont été ajoutés 0,4 ml de tris hydrochlorure tampon puis a été effectuée une incubation pendant 10 autres minutes à 37 C Il a ensuite été ajouté le tripeptide S-2251 ( 8,25 mg de la substance dans 5 ml d'eau distillée) et l'on a opéré une incubation pendant 5 autres minutes à la même température L'enzymolyse a été bloquée par addition de 0,1 ml d'acide acétique à 1 % et de 0,6 ml de Na Cl 0,15 M La quantité de chromogêne dégagée dans les solution de test a été déterminée par spectrophotomêtrie La courbe de référence standard a été tracée à l'aide de plasmine bactérienne U S. (Biosintex) essayée dans le même test aux doses suivantes: 40, 80, 160, 320 mcg Les expériences ont été répétées un total de 6 fois, chaque fois en essayant l'échantillon et les quatre concentrations de
plasmine indiquées ci-dessus.
Les résultats sont indiqués sur le tableau III.
Une caractéristique générale peut être tirée des données du tableau III, en ce disant que les oligodésixyribonucléotides ayant un poids moléculaire inférieur à 10000 présentent une activité
fibrinolitique faible, voire nulle.
Ceci était de plus attendu au vu de
l'enseignement du WO 87/06235 L'activité anti-
ischémique a été mise en évidence ex vivo sur le coeur de lapin isolé et perfusé, tel que décrit dans son principe par P D Henry dans le document "Myocardial contracture and accumulation of mitochondrial calcium
in ischemia rabbit heart" Am J pysiol 233, 1977.
Les composés du test ont été perfusés en commençant 40 minutes avant l'occurrence ischémique, à la concentration de 400 mcg/ml et à un débit de
ml/minute.
Pendant la phase ischémique ( 40 minutes), le débit a été réduit à 0,2 ml/min A la fin de cette phase, le débit initial a été repris et maintenu pendant 20 autres minutes L'expérience a été répétée un total de 6 fois Pendant la phase ischémique et le reperfusion ayant suivi, la pression teledistolique ventriculaire gauche des coeurs traités a été déterminée et les valeurs opposées à celles des coeurs non traités (groupe de contrôle) On a indiqué sur le tableau IV les activités anti-ischêmiques des composés, déterminés par un examen, comme représenté sur ledit tableau, à la fois pendant la phase ischémique et pendant la phase de reperfusion venant ensuite Au vu dudit tableau, il est évident que les oligodésoxyribonucléotides satisfaisant au profil analytique défini au tableau I présentent une activité anti-ischémique Au contraire, la préparation POO 67 D V, ayant un rapport molaire de base A+T/G+C ( 1,494) sort des limites 1,100 1,455 définies au tableau I, ce qui est le signe d'une activité beaucoup
plus faible.
Tableau III
Activité fibrinolytique in vitro des nouveaux oligonucléotides évaluée sur le substrat chromogénique tripeptide C-2251 Composé mcg de paranitroaniline dégagée par le substrat S-2251 en 5 minutes Concentration du composé mcq/ml 800 mcg/ml
P 0085 C 0,25 0,16 0,89 0,38
P 0085 D IV 0,18 0,09 0,03 0,03
P 0085 M II O 2,49 0,70
P 0102 A 1,27 0,52 2,63 0,61
P 0102 B 0,87 0,57 0,56 0,27
P 0067 D V O non déterminé plasmine 6,70 * 27,01 * * Valeurs extrapolées à partir de l'équation de la ligne de régqression de la plasmine y = -0,26 + 0,034 x (r = 1)
16 2684675
Tableau IV
Activité anti-ischémique ex-vivo des nouveaux oligonucléotides Composé % d'inhibition / dégâts ischémiques ischémie induite expérimentalement phase ischémique phase de reperfusion
P 0085 C 67 80
P 0085 D IV 66 77
POO 85 M II 68 79
P 0102 A 61 69
P 0102 B 42 60
P 0130 A 63 74
P 0130 C 57 66
P 0067 D V 23 37
Les significations de ces données peuvent être mieux comprises en prenant en considération le fait que lorsque dans ledit modèle d'expérimentation, l'ischémie cardiaque est provoquée par la diminution du débit du liquide de perfusion, le coeur a été touché par un endommagement qui est mis en évidence fonctionnellement par la contraction ventriculaire Dans la phase de reperfusion venant ensuite, lors du rétablissement des conditions initiales de débit, il a été provoqué une détérioration même pire, étant donné que, conjointement avec l'augmentation de la pression diastolique, déjà observée dans la phase précédente, il se produit un
commencement simultané d'arythmies cardiaques.
A partir des données du tableau IV, on tire la conclusion que, dans la phase de reperfusion finale, les oligonucléotides selon l'invention offrent une protection substantielle contre l'ischémie induite de façon expérimentale, maintenant ainsi une activité contractile sensiblement normale du coeur, avec une
réduction de sa résistance diastolique.
En conséquence de ce qui a été démontré ci-
dessus, on tire la conclusion que les nouveaux composés peuvent être exploités utilement dans la thérapie de
l'ischémie cardiaque. D'autres objets de l'invention sont les forme de dosage contenant comme
principe actif les nouvelles substances Lesdites formulations peuvent être supposées pour une administration à la fois parentérale
et orale.
Les compositions parentérales peuvent se présenter sous la forme de solutions stériles et apyrogénêtiques, en ampoules scellées, ou, autrement, de liophylisates contenus dans les bouteilles scellées, à dissoudre extemporanément dans des solvants stériles aqueux. On peut utiliser comme solvants aqueux des solutions isotoniques confectionnées avec des tampons classiques (citrates, phosphates et analogue),
conjointement avec des conservateurs connus.
Les formulations orales peuvent être disponibles sous forme de pilules, pilules revêtues,
capsules gélatine, granulés.
Lesdites formes de dosage peuvent être
préparées suivant les techniques connues.
Par exemple, des formes de dosage oral peuvent être préparées par compression directe de poudres ou granulés et peuvent contenir des liants, des
lubrifiants et des agents de désagrégation connus.
Les formes de dosage destinée à une administration parentérale peuvent contenir de 40 à mg/ml de principe actif, de préférence de 80 à mg/ml (pour les liophylisates des cas précédents, se référer à la concentration finale de la substance dans le solvant stérile), ceux destinés à l'administration orale sont situés entre 200 et 1500 mg
par dose unitaire.
Exem ple i Isolation des oligonucléotides selon la présente invention (préparations P 0085 C et P 0085 M II) par précipitation fractionnée à partir d'une solution aqueuse de défibrotide en présence d'acétate de sodium,
par addition d'éthanol.
420 g de défibrotide (lot 82) ont été dissouts dans 10,5 1 (concentration finale 4 % en poids/volume) et l'on a ajouté 1155 g de trihydrate d'acétate de sodium ( 0,8 M) La température de la solution a été réglée à 20 C 0,8 volume d'éthanol à 95 % ont été ensuite ajoutés Le surnageant a été récupéré par centrifugation (le précipité constitué de polydésoxyribonucléotides à poids moléculaire élevé a été séparé) et l'on a ajouté 0,2 volumes d'éthanol (volume total phase organique/phase aqueuse = 1) Une nouvelle centrifugation a été effectuée Le précipité a été récupéré, déshydraté, séché et broyé On a récupéré globalement 97,6 g (préparation P 0085 B, consistant en un mélange des oligodésoxyribonucléotides selon l'invention conjointement avec des polydésoxiribonucléotides) On a ajouté encore de l'alcool au surnageant, de manière à obtenir 2 volume de solvant organique/volume de phase aqueuse On a
ainsi récupéré 40,5 g de solide (préparation P 0085 C).
97,6 g de P 0085 B ont été dissouts dans 2,4 1 d'eau distillée et l'on a ajouté 269,5 g de trihydrate d'acétate de sodium La température de la solution a été réglée à 20 C 1 volume d'éthanol a été ajouté et la suspension ainsi obtenue a été centrifugée On a ajouté encore de l'alcool au surnageant, de manière à obtenir un rapport final de 2 entre la quantité globale d'éthanol et celle de la solution aqueuse On a ensuite
récupéré 31,2 g (préparation P 0085 M II).
La quantité totale d'oligodésoxyribonucléotides récupérés, c'est-à-dire P 0085 C+P 0085 M II, a été de
71,7 g ( 17,1 %).
S Exemple 2 Isolation des oligonucléotides (préparation POO 85 D IV) par précipitation fractionnée avec l'éthanol, en présence d'acétate de sodium à partir
d'une solution aqueuse contenant de la dêfribotide.
20 g de la préparation de défibrotide d'un poids moléculaire de 17000 daltons ont été dissouts dans 500 ml d'eau distillée 55 g de trihydrate d'acétate de sodium ont été ajoutés et la température
de la solution claire résultante a été réglée à 20 C.
500 ml ( 1 volume) d'éthanol a été ensuite ajouté et le précipité collecté par centrifugation à 3000 t/min pendant 5 minutes On a ajouté au surnageant 500 ml d'éthanol (c'est-à-dire 2 volumes au total par rapport à celui de la phase aqueuse) La matière solide a été
récupérée, déshydratée, broyée et séchée dans un four.
On a obtenu 2,10 g Production: 10,5 %.
Exemple 3
Isolation des oligonucléotides (préparation P 0085 D V) par précipitation fractionnée à l'éthanol en présence d'acétate de sodium à partir d'une solution
aqueuse d'un polydésoxyribonucléotide.
g du sel de sodium d'un polydésoxyribonucléotide d'un poids moléculaire de 43000 daltons ont été dissouts dans 500 ml d'eau distillée On a ensuite suivi la procédure décrite dans l'exemple 2 précédent On a obtenu 1,46 g à la fin (production 7, 6 %) La substance ainsi isolée présentait les caractéristiques analytiques suivantes (données reposant sur une base de poids sèche): poids moléculaire 6700, h 34, A+T/G+C 1,375, G+A/T+ C 0,825,
rotation spécifique + 43,4.
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spécifique + 32,5.
Exemple 9
Préparation des nouvelles substances, par dépolymérisation dans un tampon aqueux à base d'acétate
de sodium/acide acétique (préparation P 0097 M).
g d'acide désoxyribonucléique à poids moléculaire élevé ont été traités comme indiqué dans l'exemple 8, tandis qu'au lieu de cela la durée de la dépolymérisation a été ramenée à 16 heures et la précipitation opérée par addition de 2 volumes d'éthanol 35,5 g de produit ont été obtenus (production 71 %) Les données analytiques (données reposant sur une base de poids sèche) ont été les suivantes: poids moléculaire 6200, h 1,0, A+T/G+C
1,167, G+A/T+C 0,830, rotation spécifique + 30,9.
Ex.mple 10 Préparation des oligonucléotides, par dépolymérisation dans un tampon aqueux à base d'acétate
de sodium/acide acétique (préparation P 0123 B).
g d'acide désoxyribonucléique à poids
moléculaire élevé ont été dissouts dans 660 ml d'eau.
La dissolution a été ensuite effectuée avec accompagnement d'un chauffage modéré 53,5 g de C Hu COO Na 3 H 2 O et 127 ml de CH 3 COOH à 80 % ont ensuite
été ajoutés.
Le p H final était de 4,1 et le concentration finale en polymère de 12,7 % en poids (molarité saline 0,5 M) La solution résultante a ensuite été traitée à C pendant 16 heures puis traitée comme décrit dans qeawied @p L 8 So aloall OD e L Jo suoq Lep OOOOT ap uo u edas ap Lo^nod un lueluesed S aue Aqtau aun ans uoe L e Ln Jed I Le Lut wan lo np S/l e q Lnpap ela e uo L 4 n Los e L ap aen Lo^ a L 'u L 4 e L y 'sa$naq Z uepuad 3 o Lt q as Low Azua aun lan;Doa e uo 'aqniq asea L Dnuoqki Axosep ap 6 i 9 'g 'alueose Ledo qa asnanbst A ea Le ULJ uotn Los e L E qqnore e uo O ú *w 01 uosea Euqauo D ua z L 3 6 W np queuequoo qa L Hd ap NW '0 ee aqedsoqd uodweq ap L I suep S 4 noss Lp 9 @ 9 quo 9 aa Lp ae Le Ln Dolom splod e P senb Llalnuoqk J Axos$p sapk De sep wn Lpos ap Las ap 6 01 (U'ZOI Od 4 a Si V*ZOI Od suo Lejedajd) as Pp L Dnuoqj Axospp aunp ueaow ne 9 ^a Le a 9 Le Ln Da Low sp Lod E sanb L 3 Lo Dnuoq Ljxosap sap Loe sap enb Lqemhzue uol Ies L Ae W Xlodep Jed e UO Lq U@AUL,L Uo Las saplioalonuo 6 t Lo sap uo Lqejeda Jd * S ú+ 9 nb L;L Oeads UO Le O O J SL 840 3 + 1/V+ 9 e SOú 4 ' I+O/1 +V e 64 T q '000 t e JL Ln Da Lom sp Lod: saque^Ans se L 919, uo (a 4 oas splod ap aseq aun ans quesodae saguuop) sanbh L Leue saauuop sel Sl Àsnuaqo a 99 quo qknpo Jd ap 6 6 '58 'sacnhe zz q egax L 9,9 e UO Lqe SL lawh Lodep el ap aaÀnp el '0 T aldwaxa L suep gnb Lpu L a W Wo D sal Le J 919 Uo 9 A^L 9 ea e Ln Do L Oto sp Lod e anb Lp L Dnuoq Ljxospp ap oep 6 001 (q'EZT Od uo Lipiedaid) enbt Lqpe ap I De/wn Lpos ap 01 aqel,9 opp aseq q xnanbe uodweq un suep uo Lqes Ljaw Lodop jed sap L oglon UO 6 tlo sap uo Lqe Jeda Jd l,d i -àaàx 6 '8 ú+ enb L k Dads uo L Eo O J > 60 O 3 + 1/V+ 9 etj T L 3 + 9/1 +v 'N'9 q '00 08 ai Lelnat Low splod: saque A Lns se L,a quo (aq 4 as sp Lod op aseq aun jns luesode J seauuop) sanb Llh Leu E sa Guuop sel ((% 9 uo Lionpoid) snuaqqo,aa quo qlnpoid ap 6 g 98 Z'9 a Ldwaxae, s/9 e 99 Z Le concentré (rétentat) a été dessalé en lui faisant subir une dialyse à un volume constant avec 1 1 d'eau et une précipitation avec addition de 22 g de trihydrate d'acétate de sodium ( 0,8 M), puis addition de 1, 5 volume d'éthanol. 4,88 g de produit ont été obtenus (production
49 %) (préparation P 102 A).
Les perméats provenant de l'ultrafiltration mentionnée ci-dessus et des étapes de dessalage ont été unis et concentrés à 1/5 du volume initial, par ultrafiltration sur une membrane présentant un pouvoir
de séparation de 3000 daltons.
La solution a ensuite été dessalée en lui faisant subir une dialyse à volume constant avec 5
volumes d'eau puis une lyophilisation.
24,7 g de produit ont été obtenus (production
%) (préparation P 102 B).
Exermp lie 13 Préparation des oligonucléotides, par dépolymérisation enzymatique des acides désoxyribonucléiques à poids moléculaire élevé au moyen
d'une désoxyribonucléase.
(préparations 0186/91220 A et 0186/91220 B).
5,5 g de sel de sodium des acides désoxyribonucléiques à poids moléculaire élevé ont été dissouts dans 1 1 de tampon phosphate à 0,1 M, de p H 7 et contenant du Mg Cl; en concentration 10 m M On a
ensuite suivi la procédure de l'exemple 12 précédent.
A partir de la solution de rétentat, on a obtenu 1,14 g ( 20, 7 %) de composé ( 0186/91220 A) présentant les données analytiques (données reposant sur une base de poids sèche) suivantes: poids moléculaire 5000, h 5,4, A+T/G+C 1,266, G+A/T+C 1,106,
rotation spécifique + 37,4.
Exempl,,14 Préparation des oligonucléotides, par dépolymérisation enzymatique des acides désoxyribonucléiques à poids moléculaire élevé (préparation 0186/91217). 11 g des acides désoxyribonucléiques à poids moléculaire élevé ont été dissouts dans 1,1 1 du tampon indiqué à l'exemple précédent La digestion a été effectuée par utilisation de la désoxyribonucléase selon la procédure de l'exemple 12 Le volume de solution a ensuite été réduit 1/5 du volume initial, par ultrafiltration sur une membrane présentant un pouvoir de séparation de 3000 daltons La solution a ensuite été dessalée en lui faisant subir une dialyse à volume constant avec 5 volumes d'eau, puis la solution a été salée et précipite comme décrit pour l'exemple 12 pour la préparation du PO 102 A On a obtenu à la fin 8,25 g ( 75 %) d'un produit ayant les caractéristiques suivantes (données reposant sur une base de poids sèche): poids moléculaire 5600, h 5,8, A+T/G+C 1, 140,
G+A/T+C 1,010, rotation spécifique + 41,5.
*Exemple 15
Méthode utilisée pour obtenir P 0067 D V. 68 litres des liqueurs mères provenant de la précipitation des polydésoxyribonucléotides obtenues par dépolymérisation d'acides désoxyribonucléiques à poids moléculaire élevé (préparation de défibrotide, lot 73) selon la méthode décrite dans le WO/87/06235 et contenant encore une quantité théorique de 1250 g d'acides désoxyribonucléiques, i partir de tampon d'acétate en solution aqueuse et 1,5 partie d'éthanol se sont vu ajouter encore 13,6 1 ( 0,5 part) du même solvant organique Le poids du précipité ainsi obtenu
état de 36,4 g.
6 m g wn Lsau 6 ew ap a 4 leeals 6 WLe O Lep LOLLOD wnt Do L Ls @p ap XO Lp O O 6 mw SL'9 S asooe L 6 t O 5 ú sap Lloa L Dnuoqkj Axosapo 6 Lu O Àsainp au Lqe Ll 6 sa Lnsde 3 lejo e 6 esn inod anb Lqnaoewmeqd uo Lqsodwo 3 Lm 8 5 Lda 5 LW C;"z @alltks Lp nea 6 W zgeo aeozuaq xojpÀq'd L Adoid 6 W úS Tl aqeozuaq Axoip Aq'd L Aqqaw 6 W s Z wn Lpos Liz ap aqeqlo ap aqe Jp qkp Oz 6 W O SZ @sap Loa Lonuoq LJ Axosepo 6 LlO e Le Jaqueied UOL e SLLL N inod enb L Ina Deoieqd uot 4 lsodwo 3 6 'SúE+ anib Ljk Dds tio Lleloj l'T 16 e O 3 + 1/V+ 9 '805 T 3 + 9/1 +V '0 q '0019 @ Le Ln 3 @ Lom sp Lod (aqo 95 S sp Lod @p aseq aun ins;uesodae saeuuop) Sae Ue A Lns senb Lt A Leue sonb LISL Jaq DEJED sel qu e AI'd 900 d uo Lqejedaid ap B 8 'NS nuelqo z 9 qe l I 'SI a Ldwaxel suep Ol amwoo S a *Le 9 a a luo sanb Lolnuoq, i Axospp sap Loep 6 O SZI @p anbtioagq 9 qquenb aun @ 1 o O u@ queue; uoo la SEZ 90/LS/OM e L suep ajk L 4 ogp apoqlgw e L uo Les (Zt o L epj; olq Lqp @p uo Lqe Jedagd) ^A 9 le e J LE n De l OW splod P senb Lalonuoq Li Axosap sep Lkep uo Lqes Lam Lodep jed S senue;qo sepk Lioalnuoq Lj xosap A Lod sap uo L Ld Logkd e L op queue Aoad sa Jam sinenb LL sap sael LL 89 AI d'L 900 d i Luazqo inod eass L Ln apoqqg W s/9 e 99 Z
Claims (21)
1 Oligodésoxyribonucléotides d'origine naturelle caractérisé par les paramètres analytiques suivants: Poids moléculaire 4000 à 10000, h 10 A+T/C+G 1,100 à 1,455, A+G/C+T 0, 800 à 1,160, rotation
spécifique + 30 à + 48 .
2 Procédé de préparation d'oligodésoxyribo-
nucleotides selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdits composés sont obtenus par précipitation, opérée par étape, à 20 , à partir de 0,8 M de solutions aqueuses d'acétate de sodium de sel de sodium de polydêsoxyribonucléotide, par addition d'un alkyl
alcool inférieur.
3 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit alkyl alcool inférieur est choisi dans le groupe composé des alcools éthylique,
propylique et isopropylique.
4 Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que ledit alkyl alcool inférieur est
l'alcool éthylique.
Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la quantité de sel de sodium polydésoxyribonucléotide est de 4 % en poids par unité
de volume.
6 Procédé selon l'ensemble des
revendications 2 et 5, caractérisé en ce que le dit sel
de sodium polydêsoxyribonucléotide présente un poids moléculaire compris dans la plage allant de 15000 à
75000 daltons.
7 Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le polydésoxyribonucléotide est
la défibrotide.
8 Procédé selon l'ensemble des
revendications 2 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend
les étapes suivantes: a Addition de 0,8 volume d'alcool à la solution 0,8 M d'acétate de sodium contenant 4 % en
poids par unité de volume de polydésoxyribonucléotides.
b Addition supplémentaire à la dite solution hydroalcoolique d'une quantité supérieure d'alcool, de manière à présenter globalement un volume de phase organique par volume de phase aqueuse de départ et ensuite 61 élimination du surnageant avec récupération du
précipité formé.
c Mélange du surnageant provenant de l'étape b précédente avec un quantité supplémentaire d'alcool de façon à avoir deux volumes d'alcool par volume de la solution tampon aqueuse d'acétate de sodium 0,8 M de départ, du point a et récupération de la substance
ayant été séparée dans ces conditions.
d Mise en solution du précipité obtenu à l'étape b de l'acétate de sodium à 0,8 M, addition de un volume d'alcool par volume de solution aqueuse, élimination du précipité formé par centrifugation, mélange de la solution hydroalcoolique subsistant, avec de l'alcool, pour obtenir un total de deux volumes d'alcool par volume de la phase aqueuse et récupération
du précipité.
9 Procédé selon l'une quelconque des
revendications 2 à 7, caractérisé en ce qu'il a été
effectué une precipitation intermédiaire par addition, à la solution de départ de polydésoxyribonucléotides, d'un volume d'alcool et le surnageant se voyant en outre ajouter un volume d'alcool pour obtenir de cette
façon la précipitation des polymères.
Procédé de préparation des composés de la revendication 1, caractérisé en qu'il est effectué par dépolymérisation sous l'effet de la chaleur des sels de sodium de acides désoxyribonucléiques de poids moléculaire élevé dans une un tampon aqueux composé
d'acide acétique/acétate de sodium à 0,5 M, à p H 4,1.
11 Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il est effectué à des températures variants de 65 C à 75 C pendant une durée d'au moins 6 heures, selon le poids moléculaire de 1 'acide nucléique de départ. 12 Procédé selon 1 'une quelconque des
revendications 10 à 11, caractérisé en ce que la
dépolymérisation est effectuée jusqu'a ce que le poids moléculaire tombe dans une plage comprise entre 4000 et
10000 daltons.
13 Procédé selon l'une quelconque des
revendications 10 à 12, caractérisé en ce que la
concentration en acide désoxyribonucléique dans ledit tampon d'acétate de sodium à 0,5 M est de 4 % en poids par unité de volume ou, autrement, d'à peu près 12 % en
poids par volume.
14 Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que la concentration de l'acide
désoxyribonucléique est d'à peu près 12 %.
15 Procédé selon l'ensemble des
revendications 10 et 14, caractérisé en ce qu'il
consiste en les étapes suivantes: a Dissolution d'acide désoxyribonucléique à poids moléculaire élevé, puis addition d'acétate trihydrate de sodium plus d'acide acétique concentré ( 80 %) pour produire la concentration molaire et le p H
requis pour le tampon.
b Chauffage de la solution aqueuse obtenue au point a précédent, à une température variant entre 65 C à 75 C pendant une durée de moins de 6 heures c Abaissement à la fin du traitement thermique de la température à 30 C, correction du p H pour atteindre 7,8 à 8,0 à l'aide de Na OH à 30 %, puis, de
nouveau, chauffage à 85 C pendant 90 minutes.
d Refroidissement de la solution à la température ambiante, correction du p H à 6,5 à l'aide d'acide acétique concentré et précipitation des oligodésoxyribonucléotides par addition d'éthanol en une proportion variant entre 1,5 et 2 volumes/volume de
solution aqueuse.
16 Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que la durée du chauffage à une température variant de 65 â 75 C est inférieure à 10 heures. 17 Procédé d'obtention des oligodésoxyribonucléotides selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste en une dépolymêrisation enzymatique des acides désoxyribonucléiques à poids moléculaire élevé par utilisation de désoxyribonucléase suivie d'une étape
d'ultra-filtration afin de concentrer la solution.
18 Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que l'enzymolise avec désoxyribonucléase est effectué sur 1 % en poids par volume de solutions d'acide nucléique à poids moléculaire élevé, pendant une durée de 24 heures, dans un tampon â base de phosphate de 0,1 M et de p H 7, en présence de chlorure de magnésium en concentration 10 m M. 19 Procédé selon l'ensemble des
revendications 17 et 18, caractérisé en ce que la
concentration par ultra-filtration est effectuée selon les étapes suivantes: a Ultra-filtration de la solution pour retenir l'enzymolyse (rétentat), sur une membrane ayant un pouvoir séparateur de 10000 jusqu'a ce que la solution est un volume qui soit du 1/5 de la solution
de départ.
b Dessalage de la solution de rétentat par dialyse de cette dernière à un volume constant,
l'aide de 5 volumes d'eau distillée.
c Concentration des perméats réunis, collectés à partir des étapes précédentes a et b, pour arriver â 1/5 du volume de départ, par ultrafiltration sur une
membrane à pouvoir séparateur de 3000 daltons.
d Récupération des produits dissouts des solutions concentrées à partir des rétentats venant de la première (étape a) et seconde (étape c) ultrafiltration. Procédé selon l'ensemble des
revendications 17 et 18, caractérisé en ce que la
concentration de la solution est effectuée selon les étapes suivantes: a Ultra-filtration sur une membrane présentant un pouvoir séparateur de 3000 daltons jusqu'à ce que le
volume de rétentat atteigne 1/5 du volume de départ.
b Dessalage de la solution de rétentat en opérant sa dialyse à un volume constant avec 5 volumes
d'eau distillée.
c Récupération des produits dissous à partir
des rêtentats.
21 Procédé selon l'ensemble des
revendications 19 et 20, caractérisé en ce que la
récupération des produits dissouts est effectuée par précipitation, après avoir salée la solution jusqu'a une valeur 0,8 M de concentration en sel puis avoir
ajouté 1,5 volumes d'éthanol.
22 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le sel ajouté est de l'acétate de sodium. 23 Procédé selon l'une quelconque des
revendications 2 à 9, 10 à 16, 17 à 22, caractérisé en
ce que le produit est obtenu à partir du précipitat,
par déshydratation, broyage et séchage.
24 Oligodésoxyribonucléotides selon la
revendication 1, pour utilisation comme médicament.
Utilisation des oligonucléotides selon la revendication 1, pour la préparation de médicaments
ayant une action anti-ischémique.
26. utilisation des oligodésoxyribonucléotides selon la revendication 1, pour la préparation des médicaments destinés à la thérapie des états d'ischémie cardiaque. 27 -Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles contiennent comme principe actif les oligodésoxyribonucléotides selon la revendication 1, conjointement avec les véhicules et excipients usuels, préparées sous forme appropriée en vue d'une
administration parentérale et orale.
28 Compositions pharmaceutiques destinées à un usage parentérale, selon la revendication 27, caractérisée en ce qu'elles contient les oligodésoxyribonucléotides en une quantité variant de
40 à 160 mg/ml.
29 Compositions pharmaceutiques selon la revendication 28, caractérisées en ce que la quantité
de principe actif est comprise entre 80 et 160 mg/ml.
Compositions pharmaceutiques pour usage oral selon la revendication 27, caractérisées en ce qu'elles contient une quantité de principe actif, destinée à un dosage unitaire, variant de 200 à 1500 mg/ml.
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