JP5962254B2

JP5962254B2 - 高品質ピロロキノリンキノンの製造方法

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Publication number: JP5962254B2
Application number: JP2012143986A
Authority: JP
Inventors: 優典玉腰; 坂本　斉; 斉坂本; 池本　一人; 一人池本
Original assignee: Mitsubishi Gas Chemical Co Inc
Current assignee: Mitsubishi Gas Chemical Co Inc
Priority date: 2012-06-27
Filing date: 2012-06-27
Publication date: 2016-08-03
Anticipated expiration: 2032-06-27
Also published as: JP2014005259A

Description

本発明は、式（１）で示す構造を含むピロロキノリンキノンの高品質の製造方法に関する。

ピロロキノリンキノン（以下、ＰＱＱと略すことがある。）は新しいビタミンの可能性があることが提案されて注目を集めている（例えば、非特許文献１参照）。ＰＱＱは細菌に限らず、真核生物のカビ、酵母に存在し、補酵素として重要な働きを行っている。また、ＰＱＱについて近年までに細胞の増殖促進作用、抗白内障作用、肝臓疾患予防治療作用、創傷治癒作用、抗アレルギー作用、逆転写酵素阻害作用およびグリオキサラーゼＩ阻害作用−制癌作用、神経線維再生作用など多くの生理活性が明らかにされている。

ＰＱＱは、発酵法（特許文献１）などにより製造することが可能である。しかし、これらの方法で得られるＰＱＱは水や不純物の含量が多く、安定で純度の高いＰＱＱの結晶を得る技術が求められていた。特に発酵法で作られるＰＱＱは微生物を使用するため、培養液には菌体、菌体破砕物、分泌物に由来する高分子不純物が発生しその除去が課題である。特にタンパク成分が多くその除去が問題であった。タンパク成分は精製時の不純物としてカラムクロマトグラフィーへの閉塞等の製造上に問題を生じさせる。

また、不純物として含有すると、まれにではあるがアレルギー成分としてもその除去は求められている。これまでにｐＨを下げることでタンパク質を析出させ、遠心分離によって除去する方法が知られている。（特許文献２）。しかし、この方法はタンパク質の残留がまだかなりあり、精製方法として十分でない。また、この方法で得られるＰＱＱ溶液を使用すると難溶性不純物が発生し、他の精製工程に不具合を生じさせる危険性があった。そのため、タンパク成分の高度の除去ができる方法が求められている。これまでに高純度でないＰＱＱを含む食品について限外濾過も使用できるとなっているが、具体的な例はなく、高純度品の製造ではない。（特許文献３）

特許第２７５１１８３号公報特公平７−１１３０２４号公報特開２００５−０８０５０２号公報

Nature, vol422, 24 April, 3003, p832

高品質なＰＱＱ類の製造方法を提供することである。また、高品質なＰＱＱ類又はその塩に関する。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、以下に示す項目によって、本発明を完成させるに至った。
［１］ピロロキノリンキノン類を含む溶液を限外ろ過膜でろ過する工程を含むピロロキノリンキノン類の製造方法。
［２］ピロロキノリンキノン類が式（２）の構造を有する化合物又は式（３）の構造を有する化合物若しくはこれらの塩である、［１］記載の製造方法。
（一般式１、２において、Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３は、それぞれ独立して、水素原子、フェニル基、炭素数１〜６のアルキル基、アラルキル基、アルキルアリール基、アルケニル基及びアルキニル基から選ばれる。）
［３］式（２）の構造を有する化合物又は式（３）の構造を有する化合物の塩が、アルカリ金属塩である、［２］記載の製造方法。
［４］ピロロキノリンキノン類を含む溶液がピロロキノリンキノン培養液であることを特徴とする［１］〜［３］いずれか記載の製造方法。
［５］ピロロキノリンキノン類を含む溶液がピロロキノリンキノン培養液をｐＨを２から８に調整して析出物を除去した後の溶液であることを特徴とする［１］から［３］いずれか記載の製造方法。
［６］ピロロキノリンキノン類を含む溶液がピロロキノリンキノン培養液をｐＨを２から８に調整して析出物を除去した後の溶液を再結晶することによって得られた結晶を溶解させた溶液であることを特徴とする［１］から［３］いずれか記載の製造方法。
［７］限外ろ過膜がクロスフロー型であることを特徴とする［１］から［６］いずれか記載の製造方法。
［８］限外ろ過膜でろ過したピロロキノリンキノン類を含む溶液を再結晶又はクロマトグラフィーで精製する工程を更に含む［１］から［７］いずれか記載のピロロキノリンキノン類の製造方法。
［９］［１］から［８］に記載の方法で得られた含有タンパク質が０．５重量％以下のピロロキノリンキノン類。

本発明により、高純度で安定なＰＱＱ類の製造方法を提供し、さらにその高品質なＰＱＱ類を提供できる。

濾過装置

本発明は、ＰＱＱ類を含む溶液を限外ろ過膜を用いてろ過することによって高品質なＰＱＱ類を製造する方法である。

本発明において、ＰＱＱ類とは、式（２）の構造を有する化合物又は式（３）の構造を有する化合物若しくはこれらの塩を示す。
（一般式１において、Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３は、それぞれ独立して、水素原子、フェニル基、炭素数１〜６のアルキル基、アラルキル基、アルキルアリール基、アルケニル基及びアルキニル基から選ばれる。）
式（２）の構造を有する化合物又は式（３）の構造を有する化合物の塩としては、アルカリ金属塩が挙げられ、具体的にはナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、リチウム塩が挙げられる。また、その置換数は、モノ、ジ、トリいずれでもよい。水溶液で使用する際にはこれらのカチオンの混合した状態で使用することもできる。

ＰＱＱ類を含む溶液は、ＰＱＱ類を生産する微生物を培養して得られ、菌体を含んだ培養液を用いても構わないが、菌体やタンパク質成分を除去した液を使用するのが好ましい。溶液に含まれるタンパク量を下げることは膜ろ過への負担を下げることで、膜の長寿命化につながり好ましい。使用する微生物としては、ＰＱＱ類を生産する微生物であれば、特に制限はない。
より好ましくはさらに再結晶を行い析出した結晶を溶かした溶液である。また、これに加えて活性炭と接触させた溶液でも良い。

菌体の除去方法としては、遠心分離をすることで可能である。
タンパク質成分の除去方法としては、ｐＨを２−８にして析出する物質を除き、タンパク量を少なくした溶液である。好ましくは４前後に下げることによってタンパク質成分が析出し、除去可能である。タンパク質成分を除去した液は高分子成分の含量が少なく、保存安定性が向上するため、長時間安定に扱うのにより適している。

ろ過する溶液のＰＱＱ類の濃度は０．０１から３０ｇ／L, 好ましくは０．５から１０ｇ／Lである。この濃度範囲とすることで、析出することなく、良好な濾過速度並びにＰＱＱ回収率を維持することが出来る。濃度が低い場合には培養液の濃縮をおこなって使用することができる。
ろ過する溶液に含まれるタンパク質の濃度には制限がないが、好ましくは０．０００１から１０ｇ／Ｌである。この濃度範囲であれば、不溶成分が生じることなく、配管が詰まることなく、好ましい。この範囲より低い場合は、このような方法をとるまでもなく除去できる可能性が高い。

限外ろ過膜は、分子量１０〜１００ｋＤａを除ける様に、分画サイズが１３ｋＤａ以下であることが好ましい。より好ましくは１０ｋＤ以下である。
例えば、生体成分が吸着し難い、親水性スルホン系高分子膜、親水性芳香族エーテル系高分子膜、親水性フッ素系高分子膜、親水性オレフィン系高分子膜、セルロース系膜、（メタ）アクリル系高分子膜、（メタ）アクリロニトリル系高分子膜、ビニルアルコール系高分子膜などが挙げられる。好ましくは、親水性スルホン系高分子膜が良い。

限外濾過に使用する膜ろ過方式は全量ろ過方式、クロスフローろ過方式どちらも使用可能である。全量ろ過方式は膜供給水の全量をろ過する方式であり、定期的に洗浄を行う必要がある。これに対して、クロスフローろ過方式は膜面に対し平行な流れを作ることで膜供給水中の物質が膜面に堆積する現象を抑制しながらろ過を行う方式であるため、長時間の運転が可能であり好ましい。クロスフローろ過方式は一般に膜面流速が高いほど膜面への付着物質の堆積が抑制されるので高いろ過流束が得られ、膜汚染防止の点では高膜面流速が好ましい。
モジュールに溶液を流す際の循環量については、ろ過膜面積1ｍ²当たり１０Ｌ／ｍｉｎ以上の範囲で行うのが好ましい。この範囲とすることで、中空糸内に蓄積する濾物の吹き払い効果が十分に得られるため、好適である。

限外ろ過膜に使用する溶液のｐＨは１−１２であればよく、より使用しやすいのは２から８である。
ｐＨ調整のために加える酸の種類は特に制限されないが、塩酸、臭化水素酸、沃化水素酸、過塩素酸、硝酸、硫酸などの無機酸、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、トリクロロ酢酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などの有機酸などが挙げられ、その中でも塩酸が好ましい。
ｐＨ調整のために加える塩基の種類は特に制限されないが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、アンモニア、炭酸アンモニウム、コリン、テトラメチルアンモニウムハイドロキサイド等が使用できる。

ＰＱＱ類を含む溶液を、再結晶を行い析出した結晶を溶かした溶液とする場合は、水溶性有機溶媒や塩を加えることによって再結晶することもできる。水溶性有機溶媒としてはメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、アセトン、アセトニトリル、メトキシエタノール、メトキシプロパノール等が入手しやすく使用しやすい。塩としては塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化リチウム、塩化セシウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等が使用しやすい。
水溶性有機溶媒と塩を使う方法の両方を組み合わしてもよい。また、さらに濃縮して行ってもよい。温度については、液の凍結が発生しない限り特に制限はないが、ー３０℃〜８０℃の範囲がエネルギー効率が良く好ましい。
水溶性有機溶媒を添加した後、必要に応じて攪拌し、その後静置するのが好ましい。攪拌時間は、例えば、５分〜７日とすることができる。静置時間は、例えば、５分〜１５日とすることができる。

限外濾過で除去しきれなかったタンパク量は低く、その後の精製は一般的なカラムクロマトグラフィーや再結晶法で精製することができる。カラムクロマトグラフィーとしては、ＤＥＡＥーSephadex （ジエチルアミノエチル系陰イオン交換樹脂−セフアデツクス以下同様）（フアルマシア社、登録商標）Ａ−25カラムに吸着後、ＫＣｌ溶液で溶出する方法（M.Ameyama et al.,Agric.Biol.Chem.,第48巻、p.561〜565（1984））のようなイオン交換樹脂での精製が使用できる。さらにその後、また、塩化ナトリウムや塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウムを使用する塩析による溶解度を下げる方法、エタノール、メタノール、プロパノール、アセトニトリルのような貧溶媒を加えて結晶を析出させる方法が使用できる。または懸濁、もしくは溶液状態でｐＨを変えて溶解度を変えて析出させる方法も使用できる。

本発明の製造方法で得られるＰＱＱ類は、含まれるタンパク質成分が０．５重量％以下と純度が高く、医薬または機能性食品の有効成分として好適に使用することができる。
形態としては、皮膚外用剤、注射剤、経口剤、坐剤等の形態、又は日常食する飲食物、栄養補強食、各種病院食等が挙げられる。
調製の際は適宜賦型剤、滑沢剤、結合剤、可塑剤等の添加剤を用いてよい。
液剤としては水、果糖、ブドウ糖等の糖類、落下生油、大豆油、オリーブ油等の油類、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等のグリコール類を用いることができる。
錠剤、カプセル剤、顆粒剤などの固形剤の賦型剤としては乳糖、ショ糖、マンニット等の糖類、
滑沢剤としてはカオリン、タルク、ステアリン酸マグネシウム等、崩壊剤としてデンプン、アルギン酸ナトリウム、
結合剤としてポリビニルアルコール、セルロース、ゼラチン等、界面活性剤としては脂肪酸エステル等、
可塑剤としてグリセリン等を例示することができるが、これらに限定されるものではない。必要に応じて溶解促進剤、充填剤等を加えてもよい。

ＰＱＱ類は、単独でも、他の素材と組み合わせても使用でき、組み合わせ可能な素材としては、ビタミンＢ群、ビタミンＣおよびビタミンＥ等のビタミン類、アミノ酸類、アスタキサンチン、α-カロテン、β-カロテン等のカロテノイド類、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸等のω３脂肪酸類、アラキドン酸等のω6脂肪酸類などが例示されるが、これらに限定されるものではない。

以下に実施例及び調製例を揚げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例および調製例のみに限定されるものではない。

ピロロキノリンキノンジナトリウムは三菱ガス化学製を使用した。また、特に断りがない限り、和光製試薬を使用した。
本実施例および比較例において、ＵＶ測定は、ＨＩＴＡＣＨＩＵ−２０００Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを使用して測定した。
ＰＱＱ分析
装置：島津製作所、高速液体クロマトグラフィー、ＬＣ−２０Ａ
カラム：ＹＭＣ−ＰａｃｋＯＤＳ−ＴＭＳ（５μｍ）、１５０x４．６ｍｍＩ．Ｄ.
測定温度：４０℃
検出：２６０ｎｍにおける吸光度
溶離液：１００ｍＭＣＨ_３ＣＯＯＨ／１００ｍＭＣＨ_３ＣＯＯＮＨ_４ (30/70, pH5.1)
溶出速度：１．５ｍＬ／ｍｉｎ
タンパク分析
Bradford法
Bio-rad社Bradford試薬を使用し５９５ｎｍ吸光度を測定し、その値からタンパク含量を決定した。なお、検量線はγ-グロブリンの希釈系列液で作成した。
原料のＰＱＱ含有培養液は以下のようにして得た。

比較例１ＰＱＱ含有溶液の作製
特許公報２６９２１６７号の実施例１に基づき、ＤＳＭ−１８６９株を培養して、３Ｌジャーを使用して得られた培養液を実験に使用することにした。
培養液を５０００Ｇで遠心分離して、菌体を除去し、ＰＱＱを含有する培養液を得た。
培養液中のタンパク質の電気泳動
培養液から得られるタンパク質をアルカリＳＤＳ法で分析した。グリセリン３５％（Ｖ／Ｖ）, ナトリウムドデシル硫酸２％（Ｗ／Ｖ）、トリスヒドロキシメチルアミン10ｍＭ、ジチオトレイトール５０ｍＭ、エチレンジアミンテトラアセテート２ｍＭ、ブロモフェノールブルー０．００５％（Ｗ／Ｖ）、ｐＨ８．８の変性液と培養液を等量混合し、９５℃上・１０分間インキュベートした。その後、アトー社のｅ−ＰＡＧＥＬＥ−Ｔ５２０Ｌゲルに１８μlずつアプライし、電流２０ｍＡ条件で1時間程度泳動した。なお、泳動バッファーはアトー社のEz Runを用いた。
泳動後、ＣＢＢ染色を行った後、純水とセルロースにて脱色した。
その結果、主に７０ＫＤaのタンパク質がふくまれることが分かった。
この培養液に硫酸を加えｐＨを4にして室温で1日保存した。これを遠心分離して析出物を除去した。この遠心分離した溶液をさらにｐＨを３．５にして食塩を１Ｍになるように添加して室温で一晩保存すると赤色結晶が析出した。これをリン酸バッファーで再溶解してｐＨ７．５にして０．２％の活性炭を加えて濾過するとＰＱＱ４．１ｇ／Ｌ（ＬＣ純度９７％）でタンパク量０．０３ｇ／L（重量比につき、ＰＱＱ１００に対し、タンパク量０．７３）であった。

実施例１限外濾過膜分子量１３ｋＤａ以上カット
実験に使用する装置を図１に示す。
中空糸でできたクロスフローモジュール１にはポンプ２よりタンク３からのタンパク含有液が入り、循環する。その循環液の一部が中空糸から濾過されてタンク４にろ液として供給される。
中空糸製できたクロスフローモジュール旭化成社製ＡＣＰ−００５３Ｄ（１２０ｃｍ^２）を使用し、循環量１．５Ｌ／ｍｉｎ、溶出量０．１２Ｌ／ｍｉｎで上記の溶液（ｐH７、重量比につき、ＰＱＱ１００に対し、タンパク量０．７３）を濾過した。
その結果、ろ液はＰＱＱ４．１ｇ／Ｌ（ＬＣ純度９７％）でタンパクは検出されなかった。
本発明によりタンパク質の含まないＰＱＱ溶液を作ることができた。
さらにこの溶液をカラムクロマトグラフィーで精製処理を行い、溶出液を食塩１．５Ｍに加えることで再結晶した。この結晶中にタンパク質は検出されず、ＬＣ純度９９％以上であった。

実施例２、比較例２保存試験
実施例２：実施例１で作製した限外濾過後の溶液を３週間室温で保存した。析出物はなく、安定な溶液であった。
比較例２：限外ろ過膜処理前の溶液を３週間室温で保存した。黒色の析出物があり、カラムクロマトグラフィーの閉塞を起こした。

実施例３原料タンパク量２．５ｇ／Ｌ
比較例１と同様に培養した液の菌を遠心分離してＰＱＱ含有溶液を用意した。この溶液のｐＨ７，ＰＱＱ濃度１．３ｇ／Ｌ（ＬＣ純度８３％）でタンパク量２．５ｇ／Ｌ（重量比につき、ＰＱＱ１００に対し、タンパク量１９２）を原料としてモジュールスペクトラム・ラボ社製のＸ１１Ｓ１０００４Ｐモジュールを使用し、注先に入れ、ピストンを動かしてモジュール間を往復させた。モジュール内から中空糸外にしみ出し、濾液を回収した。
ＰＱＱ濃度１．３ｇ／Ｌ（ＬＣ純度８３％）でタンパク量０．２１ｇ/L（重量比につき、ＰＱＱ１００に対し、タンパク量１６）であった。限外ろ過膜を使用することで９２％のタンパクが除去されていた。

実施例４原料タンパク量０．８６ｇ/L
比較例１と同様に培養した液の菌を遠心分離した後、硫酸でｐＨ４にした。析出物を濾過してＰＱＱ濃度３．２ｇ／Ｌ（ＬＣ純度８５％）でタンパク量０．８６ｇ/L（重量比につき、ＰＱＱ１００に対し、タンパク量２７）を含む液を用意した。
この溶液をクロスフロー用モジュール（旭化成ＡＣＰ１０１０Ｄ）で、循環量１７Ｌ／min, 溶出量１．４L/minで上記の溶液（ｐH７）を濾過した。ＰＱＱ濃度３．２ｇ／Ｌ（ＬＣ純度８５％）であり、タンパク除去率は９８．８％以上（重量比につき、ＰＱＱ１００に対し、タンパク量０．５以下）であった。このように限外ろ過膜を使用することでタンパク質を含まない高品質の溶液を用意することができる。

実施例５限外濾過５０ｋＤａ
実施例３と同様に実験を行った。この時のモジュールはスペクトラムラボ社のＸ１５５１０００４Ｎを使用した。ＰＱＱ濃度１．３ｇ／Ｌ（ＬＣ純度８３％）でタンパク量０．２１ｇ/L（重量比につき、ＰＱＱ１００に対し、タンパク量１６）であった。限外ろ過膜を使用することで９２％のタンパクが除去されていた。

実施例６限外濾過１００ｋＤａ
実施例３と同様に実験を行った。この時のモジュールはスペクトラムラボ社のＸ１ＡＢ１０００４ＢＮを使用した。ＰＱＱ濃度１．３ｇ／Ｌ（ＬＣ純度８３％）でタンパク量０．３０ｇ／Ｌ（重量比につき、ＰＱＱ１００に対し、タンパク量２３）であった。限外ろ過膜を使用することで８８パーセントのタンパクが除去されていた。限外ろ過膜も膜の通過分子量が上がるとタンパクの除去率が低下する。しかし、原料の２．５ｇ／Ｌよりも大幅に下げる効果を有していた。

本発明の製造方法は、食品、医薬品、化粧品の用途に広く使用することが可能である。

１：中空糸でできたクロスフローモジュール
２：ポンプ
３：タンク（原料）
４：タンク（ろ液）

Claims

ピロロキノリンキノン培養液をｐＨを２から８に調整して析出物を除去した後の溶液を限外ろ過膜でろ過する工程と、
限外ろ過膜でろ過した式（２）の構造を有する化合物又は式（３）の構造を有する化合物若しくはこれらの塩を含む溶液をクロマトグラフィーで精製する工程を含む式（２）の構造を有する化合物又は式（３）の構造を有する化合物若しくはこれらの塩の製造方法。
（式（２）、（３）において、Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３は、それぞれ独立して、水素原子、フェニル基、炭素数１〜６のアルキル基、アラルキル基、アルキルアリール基、アルケニル基及びアルキニル基から選ばれる。）
式（２）の構造を有する化合物又は式（３）の構造を有する化合物の塩が、アルカリ金属塩である、請求項１記載の製造方法。
限外ろ過でろ過する工程がピロロキノリンキノン培養液をｐＨを２から８に調整して析出物を除去した後の溶液を再結晶することによって得られた結晶を溶解させた溶液を限外ろ過する工程であることを特徴とする請求項１又は２記載の製造方法。
限外ろ過膜でろ過する工程に使用する膜ろ過方式がクロスフローろ過方式であることを特徴とする請求項１から３いずれか記載の製造方法。