JPS63267287A

JPS63267287A - ピロロキノリンキノンの精製法

Info

Publication number: JPS63267287A
Application number: JP30912586A
Authority: JP
Inventors: Akira Iwayama; 岩山　瑛; Satoshi Oohita; 聡大日田
Original assignee: Ube Industries Ltd
Current assignee: Ube Corp
Priority date: 1986-12-27
Filing date: 1986-12-27
Publication date: 1988-11-04

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、下記化学構造式（１）のピロロキノリンキノ
ンをＰＱＱ産生微生物培養液中から精製する方法に関す
る。

［従来技術の説明］ＰＱＱはキノ酵素のアポ型酵素をホロ化して酵素を活性
化する能力を有する。即ち、ＰＱＱはメタノール脱水素
配素、アルコール脱水素Ｍ素、アルデヒド脱水素酵素、
グリセリン脱水素面素、グルコース月凭水素酵素、アミ
ン脱水素酵素、コリン脱水素ａヶ素、及びその他の多く
の酸化還元酵素の補酵素として、生理学的に重要な低能
を有する物質である。

ところで、酸化還元酵素や転移酵素の補酵素、例えば、
チアミンピロリン酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフ
ェート、ピリドキサールホスフェート、フラビンアデニ
ンジヌクレオチド、フラビンモノヌクレオチド等は、そ
れぞれ、ビタミンＢ１、ニコチン酸、ビタミンＢ６、ビ
タミンＢ２等のビタミンを出発原料として必要とする。

従って、ＰＱＱは重要な酵素反応の補酵素となって礪能
していることから、未同定ではおるがＰＱＱもビタミン
作用を有する極めて重要な物質でおるといえる。いずれ
にせよ、ＰＱＱは補酵素として酵素反応又は物質代謝系
を活性化するものでおり、医薬品として重要な役割を果
す物質でおる。

従来、ＰＱＱ産生微生物の培養液中に含まれるＰＱＱを
Ｉｆ、　Ｆする方法としては、ジエチルアミンエチル（
ＤＥＡＥ）基で置換した親水性糖鎖からなる陰イオン交
換体、例えば、ＤＥＡＥセファデックスＡ−２５カラム
（ファルマシア社製）を用いたイオン交換クロマトグラ
フィー法［アグリ力ルチュアル・アンド・バイオロジカ
ル・ケミストリー（ＡＱｒ　ｉ　ｃ、Ｂ　ｉ　ｏ　ｌ、
Ｃｈｅｍ、）土足（２＞、５６１−５６５　（１９８４
）、特開昭５９−１１３８９６号公報及び特開昭６０−
２５１８５９号公報］、または親水性ポリスチレン系陰
イオン交換樹脂、例えば、アンバーリストＡ２１（ロー
ム・アンド・ハース社製）を用いたイオン交換クロマト
グラフィーと疎水基間の相互作用による分離を考えたシ
リカを用いる方法、例えば、セプパックＣ１８−シリカ
カートリッジ（ウォーターズ社製）を用いた高速液体ク
ロマトグラフィーとからなる方法［バイオケミカルジャ
ーナル（３ｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、）１８７．２２１’　−
２２６（１９８０）］がおるが、親水性ポリビニル系陰
イオン交換樹脂や非極性ハイポーラスポリマー系樹脂を
用いてＰＱＱを精製した例は見当たらない。この公知の
イオン交換クロマトグラフィー法では、ＰＱＱに混入す
る不純物の除去は困難でおる。また、工業的規模での大
量処理によるＰＱＱの精製は、この公知の高速液体クロ
マトグラフィー法では困難である。

［発明が解決しようとする問題点］本発明の目的は、医薬として用いることができる高純度
のＰＱＱを提供することである。即ち、ＰＱＱ産生微生
物の培養液中に含まれるＰＱＱを、従来のＰＱＱの精製
法の問題点を排除して、容易に、高純度かつ大量に得る
方法を提供することでおる。

［問題点を解決するための手段］本発明者らは、前記の問題点を解決するために鋭意研究
した結果、ＰＱＱ産生微生物の培養液中に含まれるＰＱ
Ｑを、高純度ＰＱＱ　（ＰＱＱ以外の成分としては無機
塩のみを含有する）として得ることができることを見出
した。

ざらに、ＰＱＱ産生微生物の培養液中に含まれるＰＱＱ
を、高純度ＰＱＱ　（ＰＱＱ以外の成分としては無機塩
のみを含有する）として得、これからざらに無は塩を除
去してＰＱＱのみを得ることができることを見出して、
本発明を完成した。

即ち、本発明は、ＰＱＱ産生微生物の培養液中に含まれ
るＰＱＱを、親水性ポリビニル系陰イオン交換樹脂を用
いて精製することを特徴とするＰＱＱの精製法に関する
。

さらに、本発明は、ＰＱＱ産生微生物の培養液中に含ま
れるＰＱＱを、親水性ポリビニル系陰イオン交換樹脂を
用いた後に、非極性ハイポーラスポリマー系樹脂を用い
て精製することを特徴とするＰＱＱの精製法に関する。

以下、本発明について、さらに詳しく説明する。

本発明において使用することのできるイオン交換樹脂と
しては、ジエチルアミンエチル（ＤＥＡＥ）基で置換し
た親水性ポリビニル系樹脂、具体的にはＤＥＡＥトヨパ
ール６５０（東洋曹達工業株式会社！’り、セパビーズ
ＦＰ−ＤＡ１３、ＦＰ−ＤＡ１２（三菱化成工業株式会
社製）などを挙げることができる。

また、本発明において使用する非極性ハイポーラスポリ
マー系樹脂とてしては、ＰＱＱ吸着吸着分能するものな
ら特に制限はないが、スチレンとジビニルベンゼンを主
成分とするか、他に少量の２−ビニルピリジンを添加し
て共重合したポリスチレン系の樹脂が望ましく、例えば
、ダイヤイオンＨＰ−１０，ＨＰ−２０，ＨＰ−２１、
ＨＰ−３０、ＨＰ−４０，ＨＰ−５０，５Ｐ−２０６，
５Ｐ−２０７，５Ｐ−８００，５Ｐ−９００（三菱化成
工業株式会社製）、アンバーライトＸＡＤ−２、ＸＡＤ
−４、ＸＡＤ−９（ローム・アンド・ハース社製）など
を挙げることができる。

イオン交換樹脂に吸着したＰＱＱ以外の夾雑物を除去す
る洗浄剤としては水が望ましく、また非極性ハイポーラ
スポリマー系樹脂に吸着したＰＱＱ以外の夾雑物を除去
する洗浄剤としては酸水溶液、好ましくは１）Ｈ２，０
の塩酸水溶液が使用される。　ＰＱＱを逐次的に溶出す
る溶出剤としては、イオン交換樹脂の場合には塩溶液が
、非極性ハイポーラスポリマー系樹脂の場合には水また
は水溶性有機溶媒が挙げられる。

塩溶液としてはＮａＣｕ　、ｋ（ｊ！なとの中性塩が、
０．５Ｍ以下の濃度で、更に好ましくは０．２５Ｍ以下
の濃度で使用される。

水溶性有機溶媒としてはメタノール、エタノールなどの
アルコール類が水に対して５０％以下１、　　好ましく
は３０％以下で用いられる。

［実施例］以下、本発明の実施例を具体的に説明する。なお、これ
らの実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。

実施例１シュードモナスＰ２−３　（微工研菌奇第７６００号）
の菌株をメタ／−／Ｌ、１０ｄ／Ｎ　、ＮａＮＯ３２９
／Ｎ　、　（ＮＨ４）　２３０４２９／、Ｑ　、　Ｋ２
ＨＰＯ４２３／１　、ＫＨ２ＰＯ４１’３／Ｍ　、Ｈ２
ＢＯ３０、５ｍＢ看、Ｃｕ５Ｏ４・５Ｈ２０ｏ。

０４ｍ！ｊ／ｆｌ　、ＭｎＳＯ４＃　Ｈ２０，０２ｍＥ
／ｆｌ、（ＮＨ４）　２　ＭＯＯ４ｏ、　２１ｎ３／ｆ
ｌ　、　ＺｎＳＯ４−７Ｈ２００，４ｍｙ／ｆｌ　、Ｃ
ａ（、Ｑ　２−２Ｈ２０１５ｍ３／ｆ：ｌ　、ＫＣｕ　
４０ｍｇ／ｆＪ　、　Ｆｅ５Ｏ４ｅ７Ｈ２０１ｍ’Ｊ／
ｆＪ　７３よびＭＣｌ５Ｏ４−７Ｈ２０５００ｍ３／、
！！　（マグネシウム金属換１５（Ｃ３／ｕ）の割合で
各成分を含む培地（蒸溜水で調整、ｐＨ７、Ｏ）を用い
て３０’Ｃで６日間培養し、菌体を遠心分離（８０００
ｒｐｍ、１０分間）シテ、培養液を１０ｇ得た（ＰＱＱ
は５５０ｍｙ含まれていた〉。この培養液をあらかじめ
水で洗浄しておいたＤＥＡＥ　トヨパール６５０Ｍ（東
洋曹達工業株式会社製）カラム（３Ｘ１１ｃｍ＞に流し
てＰＱＱを樹脂に吸着させた後、同カラムを５００ｍＩ
ｌの水で洗浄して非吸着物を除き、ついで０．２ＭＮａ
Ｃコ溶液でＰＱＱ溶出を行うと、ＰＱＱを含有する赤色
溶液画分３Ｎを得ることができた。

得られたＰＱＱは、　Ｈ−ＮＭＲ（溶媒にＤ２０を用い
た時の結果を第１図に示す＞、ＵＶスペクトル（第２図
に示す）、高速液体クロマトグラフィー（カラム：ＴＳ
Ｋゲル０ＤＳ１２０Ｔ　（東洋曹達工業株式会社製）、
溶離液：１２．５ｍＭＫＨ２ＰＯ４（リン酸でｐＨ２，
０に調整）／メタノール（８：３、Ｖ／Ｖ）、流速：Ｏ
，Ｍ／ｍｉｎ　、検出ＵＶ２４９ｎｍという条件で行な
った結果を第３図に示し、カラム：ＴＳＫゲルＤＥＡＥ
−２３Ｗ（東洋曹達工業株式会社製）、溶離液：０．５
ＭＫＣｕ−２ｍＭリン酸カリ緩衝液（ｐ　１−（７，０
）、流速：Ｏ，Ｍ／、検出：　ＵＶ２４９ｎｍという条
件で行なった結果を第４図に示す）、による分析から、
純粋でめった（但し、ＮａＣρを含有する）。

このＰＱＱ溶液を塩酸でｐＨ２，０に調整し、必らかし
めｐＨ２，０の塩酸水溶液で平衡化してあいたダイヤイ
オン５Ｐ２０７　（三菱化成工業株式会社製）カラム（
３Ｘ１２ｃｍ）に吸着させた。

Ｎａ　　が検出されなくなるまでＣ）Ｉ−（２，０の塩
酸水ｊ８液でカラムを洗浄した後、水で溶出を行い、Ｐ
ＱＱを含有する赤色溶液画分２ｐを（ｑた。本画分から
エバポレーターで水を留去してＰＱＱ粉末４５０ｍｇを
取得した。

得うｈ　ｔｃ　Ｐ　Ｑ　Ｑ　Ｌｔ、元素分析（Ｃ：４７
．３２％、Ｈ：２．４９％、Ｎニア、８７％）から、Ｐ
ＱＱ・−水和物（Ｃ１４Ｈ６Ｎ２０８−Ｈ２０）と同定
され、ＩＲスペクトル（ＫＢｒ法による結果を第５図に
示す）から純粋であった。なお、熱分析を行うと、試料
８．８９ｍｆｆのｉｔ減少が０．４５　ｍｇＸ’？めら
れ、これは水１分子の重量減少に相当していた。また、
ＰＱＱと共存するＮａ＋およびＣＦ−はＩＣＰ（プラズ
マ励起発光分光分析）及びイオンクロマトグラフィーに
よる分析から、Ｎａ　は１．０ｐｐｍ。

ＣＩ−は０．９ｐｐｍ　（ＰＱＱ５ｍｙを２５ａ２の水
溶液にしたもので測定）でおり、非常に高純度のＰＱＱ
を得ることができた。

実施例２実施例１と同様にして得た培養液（ＰＱＱは５２０ｙｔ
含まれていた）１０１を用い、ダイヤイオン５Ｐ２０７
カラムの溶出液としては２０％メタノールを用いて実施
例１と同様に処理して、ＰＱＱ粉末４００ｍｇを得た。

得られたＰＱＱは、’Ｈ−ＮＭＲ（溶媒に００を用いた
時の結果を第６図に示す）および元素分析（Ｃ：４７．
２１％、Ｈ：２．３６％、Ｎニア６９４％）から、ＰＱ
Ｑ・−水和物と同定された。また、ＰＱＱと共存するＮ
ａ　　およびＣＪＩ−は、ＩＣＰおよびイオン交換クロ
マトグラフィーによる分析から、Ｎａ＋は１．５ｐｐｍ
、（ｌｌ−は１．９ｐｐｍでおり、非常に高純度のＰＱ
Ｑを得ることができた。

実施例３実施例１と同様にして得た培養液（ＰＱＱは４７０／ｆ
ｆｇ含まれていた＞１０．１２を用い、ダイヤイオン５
Ｐ２０７の代りにダイハフイオンＨＰ−２０（三菱化成
工業株式会社製）を用いて実施例１と同様に処理し、Ｐ
ＱＱ扮末３５０ｍｇを１＠た。

得られたＰＱＱは、　Ｈ−ＮＭＲ（溶媒にＤ２０を用い
た時の結果を第７図に示す）、元素分析（Ｃ：４７．８
５％、Ｈ：２．３６％、Ｎニア。

８１％）からＰＱＱ−一水和物であった。またＮａ　は
１．　ＯｔＸ）ｍ、　Ｃ，Ｑ　　−は１．２ｐｐｍであ
り、非常に高純度のＰＱＱを得ることができた。

比較例１実施例１と同様にして得た培養液（ＰＱＱは５４０ｍｙ
含まれていた）１０１を用い、ＤＥＡＥトヨパール６５
０の代りにアンバーライトＩＲＡ９３（ローム・アンド
・ハース社製）を用いて実施例１と同様に処理し、ＰＱ
Ｑ４９０ｍｙを得た。

得られたＰＱＱは、元素分析から、Ｃ：４１゜８９％、
Ｈ：２．６８％、Ｎニア、０８％でおった。また、Ｎａ
　　は２９ｏｏｏｐｐｍ、Ｃ，ｌｌ−は２０　ｐｐｍで
必ッた（５ｍｙ／２５ｄ水溶液で測定）。

［発明の効果］本発明のＰＱＱ産生微生物の培養液中に含まれるＰＱＱ
を、親水性ポリビニル系陰イオン交換樹脂を用いて精製
することによって高純度ＰＱＱ（ＰＱＱ以外の成分とし
ては無機塩のみを含有する）を得ることができ、このＰ
ＱＱをざらに非極性ハイポーラスポリマー系樹脂を用い
て精製することによって無機塩を除去した高純度ＰＱＱ
のみを得ることができる。従って、これらの方法によっ
て高ＭＡ度ＰＱＱを得ることができるのみならず、工業
的規模でのＰＱＱの精製が可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１で得られたＰＱＱの’Ｈ−ＮＭＲスペ
クトルを示す図、第２図はそのＵｖスペクトルを示す図
、第３図及び第４図はその高速液体クロマトグラフィー
の結果を示す図、第５図はそのＩＲスペクトルを示す図
である。第６図は実施例２で得られたＰＱＱの１Ｈ−ＮＭＲスペ
クトルを示す図でおる。第７図は実施例３で得られたＰＱＱの１８−　ＮＭＲス
ペクトルを示す図である。特許出願人　　宇部興産株式会社第　１　図ＰＭ第　２　図波長（ｎｍ）第　３　図４０　　　３０　　　２０　　１０　　　０　　　（分
）第　４　図４０　　　３０　　　２０　　１０　　　０　　　（分
）第　５　口４０００　３６００　３２００　２ｆｌＯＯ２４００２
０００１６００１２００８００４００波数（ｃｍ−１）第　６　図ＰＭ第　７　図ＰＭ手続補正書昭和６３年３り上計日

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ピロロキノリンキノン産生微生物の培養液中に含
まれるピロロキノリンキノンを、親水性ポリビニル系陰
イオン交換樹脂を用いて精製することを特徴とするピロ
ロキノリンキノンの精製法。
（２）ピロロキノリンキノン産生微生物の培養液中に含
まれるピロロキノリンキノンを親水性ポリビニル系陰イ
オン交換樹脂を用いた後に、非極性ハイポーラスポリマ
ー系樹脂を用いて精製する特許請求の範囲第１項記載の
ピロロキノリンキノンの精製法。