CN100398643C - 一种层析纯化玉米sod的方法 - Google Patents

Abstract

一种层析纯化玉米SOD的方法，其特征是经离心得SOD粗提液；SOD粗提液用硫酸铵二次饱离心后，将沉淀重溶，透析留取上清液，将金属螯合亲和层析介质溶涨，装柱，再用硫酸铜溶液进行螯合；金属离子与金属螯合亲和层析介质充分结合后用蒸馏水洗去未结合的金属离子，然后用磷酸钠缓冲液洗脱至平衡；玉米SOD粗提液上样、洗脱。本发明具有吸附量大、分离条件温和、通用性强，且具专一性。可简化酶蛋白纯化工艺，使药用酶成本降低可达30%。采用本发明工艺制备的玉米SOD组分单一、回收率及纯化倍数均较高，分别为29.4%和307倍。是一种高效、快速的纯化方法，适合于大规模、工业化生产。得到的玉米SOD耐热性强、pH适应范围较广，适合医药工业应用。

Description

一种层析纯化玉米SOD的方法

技术领域

本发明涉及一种酶的分离纯化方法，特别是一种金属螯合亲和层析纯化玉米SOD方法。

背景技术

超氧化物歧化酶(SOD)是生物体内清除超氧阴离子自由基的唯一的酶，是一种很有前途的药用酶。玉米中SOD的含量十分丰富，是世界三大作物之一，以玉米为生产原料，运用生物工程技术制备SOD制剂，可使这一农作物的附加值提高20倍以上，经济与社会效益十分可观。目前，玉米SOD复合酶的规模化生产工艺已较为成熟，但其纯化问题尚未解决，成为限制其作为药用酶的障碍。药用蛋白质的分离纯化一般采用层析方法进行。凝胶过滤是基于分子量大小的分离纯化方法，该法具有设备简单、操作方便、重复性好和样品回收率高等特点。缺点是分辨率低、分离效果较差。在SOD分离纯化方面，凝胶过滤主要作为初步分离方法而与其它色谱方法同时应用。离子交换层析一般用于分离各种可解离的物质。离子交换层析被广泛的用于SOD的分离与纯化。但利用该法纯化SOD的纯化倍数通常为50左右，回收率较低。

金属螯合亲和层析是最近二十几年发展起来的一种新的分离技术，它利金属离子与某些含有巯基或咪唑基的氨基酸配位的特性选择性地分离对金属离子有亲和作用的蛋白质。这种层析方法具有一定的专一性。该法具有设备简单、吸附量大、分离条件温和、通用性强和具有相对专一性等特点。一般而言，其专一性高于离子交换层析。金属螯和亲和层析用于SOD的分离与纯化方面已有报道，其中纳米尔等的的研究表明，利用金属螯合亲和层析与凝胶过滤和离子交换结合的方法，能够将紫草中的SOD纯化300倍。国内外尚未有利用金属螯合亲和层析纯化玉米SOD的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效快速的玉米SOD的纯化方法，利用金属离子与某些含有巯基或咪唑基的氨基酸配位的特性选择性地分离对金属离子有亲和作用的超氧化物歧化酶，专一性强，纯化工艺简单，非常适合制备药用玉米SOD。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

本发明提供的层析纯化玉米SOD的方法，其特征是：

A.取玉米籽粒用自来水洗净后于28℃-30℃温度培养箱中浸泡24小时、发芽24小时，用蒸馏水清洗干净，加入0.05mol/L磷酸二氢钾-磷酸氢二钾提取缓冲液，用胶体磨充分研磨，4000转/分钟离心得SOD粗提液；将SOD粗提液先用40％的硫酸铵饱和0.5小时，8000转/分钟离心后，用90％的硫酸铵饱和2小时，8000转/分钟再离心20分钟，将沉淀重溶，以蒸馏水透析12小时；将透析液8000转/分钟离心20分钟，留取上清液，即为SOD浓缩液，此SOD浓缩液为玉米SOD粗酶液。

B.将金属螯合亲和层析介质Chealating Sepharose Fast Flow溶涨，采用自然沉降法装柱，再用0.1摩尔浓度的硫酸铜溶液进行螯合；金属离子与金属螯合亲和层析介质Chealating Sepharose FastFlow充分结合后用蒸馏水洗去未结合的金属离子，然后用pH6.8的磷酸钠缓冲液洗脱至平衡；所述的磷酸钠缓冲液内含0.5摩尔浓度氯化钠；

C、玉米SOD粗酶液上样于平衡后的层析介质，洗脱，收集活性组分即为纯化的玉米SOD。

本发明工艺过程如下：

玉米籽粒→浸泡、发芽→匀浆→离心→盐析→透析→亲和层析→洗脱→收集酶液

本发明和现有技术相比，具有如下优点：

1.设备简单、吸附量大、分离条件温和，可在常温下进行。

2.通用性强，可用于其它来源SOD的分离纯化。

3.本发明提供的层析方法具有一定的专一性。可简化酶蛋白纯化工艺，使药用SOD成本降低30％，使玉米这一农副产品附加值可提高20倍。

4.本发明所采用工艺制备玉米SOD，活性强、回收率及纯化倍数均较高，分别为29.4％和307倍。

5.高效、快速，适合于大规模、工业化生产。

6.制备得到的玉米SOD纯度好、耐热性强、pH适应范围较广，适合医药工业应用。

具体实施方式

取玉米籽粒500公斤，用自来水洗净后于28℃-30℃恒温培养箱中浸泡24小时、发芽24小时，用蒸馏水清洗干净，加入1000升、0.05摩尔浓度的磷酸二氢钾-磷酸氢二钾提取缓冲液，用胶体磨充分研磨，4000转/分钟离心，上清液即为酶的粗提液。将SOD粗提液先用40％的硫酸铵饱和0.5小时，8000转/分钟离心后，用90％的硫酸铵饱和2小时，8000转/分钟再离心20分钟，将沉淀重溶，以蒸馏水透析12小时。将透析液8000转/分钟离心20分钟，留取上清液，即为SOD浓缩液，此SOD浓缩液为玉米SOD粗酶液。

将金属螯合亲和层析介质(Chealating Sepharose Fast Flow，MCAC)20克溶涨，采用自然沉降法装柱，再用245毫升、0.1摩尔浓度的硫酸铜溶液进行螯合。金属离子与金属螯合亲和层析介质充分结合后用340毫升水洗去未结合的金属离子，然后用500毫升、0.1摩尔浓度pH6.8的磷酸钠(内含0.5摩尔浓度氯化钠)缓冲液洗脱至平衡。

将玉米SOD粗酶液上样于平衡后的层析介质，洗脱，收集活性组分即为纯化的玉米SOD。

工艺实施结果：本发明纯化玉米SOD，纯化倍数307倍，回收率为29.4％，可达到电泳纯。玉米SOD在pH7-9、80℃以下范围内稳定，最适温度为40℃、最适pH为8，适合医药工业应用。

Claims (1)

1.一种层析纯化玉米SOD的方法，其特征在于：

A.取玉米籽粒用自来水洗净后于28℃-30℃温度培养箱中浸泡24小时、发芽24小时，用蒸馏水清洗干净，加入0.05mol/L磷酸二氢钾-磷酸氢二钾提取缓冲液，用胶体磨充分研磨，4000转/分钟离心得SOD粗提液；将SOD粗提液先用40％的硫酸铵饱和0.5小时，8000转/分钟离心后，用90％的硫酸铵饱和2小时，8000转/分钟再离心20分钟，将沉淀重溶，以蒸馏水透析12小时；将透析液8000转/分钟离心20分钟，留取上清液，即为SOD浓缩液，此SOD浓缩液为玉米SOD粗酶液；

B.将金属螯合亲和层析介质Chealating Sepharose Fast Flow溶涨，采用自然沉降法装柱，再用0.1摩尔浓度的硫酸铜溶液进行螯合；金属离子与金属螯合亲和层析介质Chealating Sepharose FastFlow充分结合后用蒸馏水洗去未结合的金属离子，然后用pH6.8的磷酸钠缓冲液洗脱至平衡；所述的磷酸钠缓冲液内含0.5摩尔浓度氯化钠；

C、玉米SOD粗酶液上样于平衡后的层析介质，洗脱，收集活性组分即为纯化的玉米SOD。