CN111138524B - 一种从基因工程水稻种子中分离纯化低铁饱和度的重组人乳铁蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的是提供一种从基因工程水稻种子中分离纯化低铁饱和度的重组人乳铁蛋白(OsrhLF)的方法。首先从重组人乳铁蛋白基因工程水稻种子中提取含有重组乳铁蛋白的粗提取物,提取缓冲液包含50~100mM柠檬酸‑柠檬酸三钠、100~200mMNaCl,1~10mM EDTA‑2Na,pH为3.8~5.0;再将所得含有重组人乳铁蛋白的粗提取物经阳离子层析,获得纯度>95%的低铁饱和度乳铁蛋白产品。本发明的另一目的是提供一种从基因工程水稻中种子中提取低铁饱和度的重组人乳铁蛋白(OsrhLF)的方法,使用的提取液含有柠檬酸‑柠檬酸三钠和EDTA‑2Na,可显著降低提取OsrhLF的铁饱和度。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种从基因工程水稻种子中分离纯化低铁饱和度的重组人乳铁蛋白的方法。
背景技术
乳铁蛋白(LF)是一种非血红素铁结合糖蛋白,广泛存在于哺乳动物的外分泌液中,是人体防止感染的第一道防线,具有广谱抗菌作用,可以作用于细菌、真菌、原生动物、病毒。乳铁蛋白主要有“铁剥夺”、膜渗透、酶抑制及辅助抗菌等4种抑菌机制。(1)铁剥夺机制。几乎所有的细菌生长都需要铁,铁离子对细菌中的氧化酶是必须的。乳铁蛋白作为一种铁结合蛋白,可以与微生物竞争性的结合铁离子,从而使得微生物失去赖以生存的铁离子,进而导致微生物的死亡。这种依赖于铁的抑菌机制中,乳铁蛋白的活性取决于铁离子的饱和程度。一般来说,饱和度越低,抑菌活性越高。(2)膜渗透机制。乳铁蛋白带正电荷,与带负电荷的磷脂、核酸和脂多糖具有很强的亲和性,从而导致脂多糖的释放,进而破坏细菌的细胞质膜。(3)酶抑制机制。研究表明,乳铁蛋白对半胱氨酸蛋白酶有强烈的抑制作用,而半胱氨酸蛋白酶抑制剂可有效抑制金黄色葡萄球菌的生长。(4)辅助抗菌机制。乳铁蛋白可以通过改变细菌与寄主之间的关系.从而间接达到抗菌作用。
铁饱和度是乳铁蛋白制品的一项关键性指标,围绕低铁饱和度的乳铁蛋白的提取和制备有许多相关研究。专利CN102459328A公开了一种制备低铁饱和度的乳铁蛋白的方法,该方法包括使用水混溶性溶剂和酸剥夺乳铁蛋白的中的铁,然后利用超滤或渗滤去除铁、溶剂和酸,得到的乳铁蛋白的铁饱和度小于10%。其他一些关于降低乳铁蛋白的铁饱和度的研究结果涉及使用螯合剂和低pH环境来去除乳铁蛋白中的铁,但是得到的乳铁蛋白铁饱和度通常大于10%且不适宜商业化生产。
在专利《一种从水稻种子中分离纯化重组人乳铁蛋白的方法》(专利号:CN104109204B)中,我们介绍了一种从基因工程水稻中分离纯化乳铁蛋白的方法,但是该方法获得乳铁蛋白的铁饱和度70%~80%,远高于正常母乳或牛乳中15%~20%的铁饱和度。本发明是在上述专利的基础上,针对铁饱和度低的重组乳铁蛋白的制备方法,通过对提取工艺及层析工艺研究,建立一种大规模、高效、工艺简单地获得低铁饱和度乳铁蛋白的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种从基因工程水稻种子中分离纯化低铁饱和度的重组人乳铁蛋白(OsrhLF)的方法。
包括以下步骤:
1)从重组人乳铁蛋白基因工程水稻种子中提取含有重组人乳铁蛋白的粗提取物,提取缓冲液中含有50~100mM柠檬酸-柠檬酸三钠、100~200mMNaCl,1~10mM EDTA-2Na,pH为3.5~5.0;
2)将含有重组人乳铁蛋白的粗提取物经阳离子层析介质,获得纯度>95%的低饱和度乳铁蛋白产品;
进一步的上述方法包含以下步骤:
(1)将基因工程稻谷脱壳成半精米,研磨成80~100目的米粉。将米粉与提取缓冲液以1:5(重量/体积,kg/L)的比例混合,于15~35℃提取1~24小时。提取缓冲液的成分为:50~100mM柠檬酸-柠檬酸三钠、100~200mMNaCl,10mM EDTA-2Na,pH 3.8~5.0。将上述得到的混合物加入2~5%的珍珠岩进行压滤,压滤完毕后,滤液用0.5~2M NaOH或稀盐酸调pH至4.0~5.0,0.22μm滤膜过滤后即为OsrhLF的粗提取物即阳离子层析的上样液。
(2)采用SP Bestarose Big Beads层析介质进行纯化,具体包括以下步骤:
a)采用4~6个柱体积(CV)的pH为4.0~5.0的含有50~150mM柠檬酸-柠檬酸三钠、100~200mMNaCl,1~10mM EDTA-2Na的缓冲液以200~300cm/h的线性流速平衡层析柱;
b)以步骤(1)的粗提物为层析上样液,其中上样液pH为4.0~5.0、电导20~30mS/cm,上样体积20~40CV;
c)用pH为7.0~8.0的含有5~50mM PB,300-500mMNaCl的缓冲液,以200~300cm/h的线性流速进行洗脱杂蛋白,洗杂液体积5~7CV;
d)用pH为7.0~8.0的含有5~50mM PB,700~900mMNaCl的缓冲液,以200~300cm/h的线性流速进行重组乳铁蛋白的洗脱,收集含有OsrhLF的洗脱液,获得纯度高于95%的低铁饱和度的OsrhLF。
本发明的另一目的是提供一种从基因工程水稻种子中提取低铁饱和度的重组人乳铁蛋白的方法,具体包括:
(a)将基因工程稻谷脱壳成半精米,研磨成80~100目的米粉;
(b)将米粉与提取缓冲液以1:5(重量/体积,kg/L)的比例混合,于15~35℃提取1~24小时,提取缓冲液的成分为25~100mM柠檬酸-柠檬酸三钠、100~200mMNaCl,1~10mMEDTA-2Na,pH为3.8~5.0;
(c)将上述得到的混合物加入2~5%的珍珠岩进行压滤,得到含有重组人乳铁蛋白的提取液。
附图说明
图1SP BB载量测定层析紫外吸收图谱,其中,纵坐标表示:UV280检测值横坐标表示:层析体积(mL)。
图2SP BB载量测定层析样品的SDS-PAGE检测图。
图3不同提取pH下,层析上样液(A)及洗脱液(B)SDS-PAGE检测图。
图4不同提取温度下,层析上样液(A)及洗脱液(B)SDS-PAGE检测图。
图5不同提取时间下,层析上样液(A)及洗脱液(B)SDS-PAGE检测图。
具体实施方式
以下通过结合附图详细说明本发明。所提供的实施例仅是对本发明方法的举例说明,而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
以下实施例中使用的SP BestaroseBigBeads(SP BB)填料,生产商是博格隆(上海)生物技术有限公司;B1030层析柱,购自博格隆(上海)生物技术有限公司;其它材料或试剂如无特殊说明均为常规市售产品。
【实施例1】从转基因稻米中提取OsrhLF
将重组人乳铁蛋白基因工程稻谷(来源参考专利CN104109204B)脱壳成半精米,研磨成80~100目的米粉。将米粉与提取缓冲液以1∶5(重量/体积,kg/L)的比例混合,于25±2.5℃提取7±1h小时。提取缓冲液的成分为:100mM柠檬酸-柠檬酸三钠、150mMNaCl,10mMEDTA-2Na,pH 4.0。将上述得到的混合物加入2~5%的珍珠岩进行压滤,压滤完毕后,滤液用0.5-2M NaOH调节pH至5.0,经0.22μm滤膜过滤后得到OsrhLF的粗提取物即SP BB层析的上样液。
【实施例2】SP BB层析载量的测定
称取100g米粉加入500mL提取液,25℃搅拌提取7h。提取完毕后采用高速离心机10000g离心5min,上清液采用0.45μm微孔滤膜过滤,然后采用2M NaOH调节pH至5.0,0.22μm过滤后即为上样液。采用Tricorn 10层析柱,柱体积5ml,上样流速1.25mL/min;上样约120mL时开始采用分部收集器按照5mL/管(即1CV/管)开始自动收集,对收集的样品进行SDS-PAGE检测。图1显示,随着上样量的不断增加,穿透峰开始出现明显的抬升(如红色箭头所示)现象。从穿透液的SDS-PAGE检测结果来看(如图2),1-3管穿透液中几乎看不到目的蛋白条带,第15管(即37CV)可见较为明显的目的蛋白条带,因此SP BB的最大载量定为37CV(低于10%L,若按照10%穿透计算,则最大动态结合载量为19管即41CV)。37CV的最大载量,按照80%的上样量,最大上样量为30CV,即上样量不超过30CV。
【实施例3】不同提取pH对OsrhLF铁饱和度的影响
分别称取100g米粉加入500mL不同pH(pH 3.5、pH 3.8、pH 4.0、pH 4.5、pH 4.75、pH5.0)的提取液(含有100mM柠檬酸-柠檬酸三钠,150mMNaCl,10mM EDTA-2Na),25℃搅拌提取15h;提取完毕后采用高速离心机10000g离心5min,上清液采用0.45μm微孔滤膜过滤,然后采用2M NaOH调节pH至5.0,0.22μm过滤后即为上样液。采用B1030层析柱(柱高20cm、柱体积15mL、线性流速305cm/h)进行层析。采用4~6个柱体积(CV)pH为5.0的含有100mM柠檬酸-柠檬酸三钠、150mMNaCl,10mM EDTA-2Na的缓冲液以305cm/h的线性流速平衡层析柱;上样体积24CV;用pH为7.5的10mM PB,400mMNaCl缓冲液,以305cm/h的线性流速进行洗脱杂蛋白,洗杂体积5~7CV;用pH为7.0~8.0的10mM PB,800mMNaCl缓冲液,以305cm/h的线性流速进行洗脱,收集含有OsrhLF的洗脱液,对洗脱液进行SDS-PAGE、铁饱和度、SEC-HPLC分析,结果如表1所示。
表1不同提取pH条件下层析洗脱液中OsrhLF的测定
从图3可以看出,pH 3.5提取的目的蛋白量最少,其产量也仅为0.77g/kg,远远低于其它pH提取条件。当提取液pH从3.8逐渐升高至5.0,产品的SDS-PAGE电泳纯度有所下降,产量率及铁饱和度均有逐渐升高的趋势,其中pH 5.0的产量最高,可达5.64g/kg,铁饱和度15.35%。
【实施例4】不同提取温度对OsrhLF铁饱和度的影响
分别称取100g米粉加入500mL提取液(含有100mM柠檬酸-柠檬酸三钠,150mMNaCl,10mM EDTA-2Na),于不同温度下(20℃、22.5℃、25℃、27.5℃、30℃、)下搅拌提取15h;提取完毕后采用高速离心机10000g离心5min,上清液采用0.45μm微孔滤膜过滤,然后采用2M NaOH调节pH至5.0,0.22μ.过滤后即为上样液。采用B1030层析柱(柱高20cm、柱体积15mL、线性流速305cm/h)进行层析。采用4~6个柱体积(CV)pH为5.0的含有100mM柠檬酸-柠檬酸三钠、150mMNaCl,10mM EDTA-2Na的缓冲液以305cm/h的线性流速平衡层析柱;上样体积24CV;用pH为7.5的10mM PB,400mMNaCl缓冲液,以305cm/h的线性流速进行洗脱杂蛋白,洗杂体积5~7CV;用pH为7.0~8.0的10mM PB,800mMNaCl缓冲液,以305cm/h的线性流速进行洗脱,收集含有OsrhLF的洗脱液,对洗脱液的SDS-PAGE、铁饱和度、SEC-HPLC进行分析,结果如表2所示。
表2不同提取温度下层析洗脱液的测定
从表2及图4可以看出,20℃低温提取得到的OsrhLF铁饱和度最高,达到15.35%,而温度22.5~30℃下,铁饱和度无明显差异。提取温度对SDS-PAGE、SEC-HPLC、产量的检测结果无显著影响。
【实施例5】不同提取时间对OsrhLF铁饱和度的影响
分别称取100g米粉加入500mL提取液(100mM柠檬酸-柠檬酸三钠,
150mM NaCl,10mM EDTA-2Na,pH 4.0),25℃搅拌提取不同时间(5h、7h、9h、11h、13h、15h、17h);提取完毕后采用高速离心机10000g离心5min,上清液采用0.45μm微孔滤膜过滤,然后采用2M NaOH调节pH至5.0,0.22μm过滤后即为上样液。采用B1030层析柱(柱高20cm、柱体积15mL、线性流速305cm/h)进行层析。采用4~6个柱体积(CV)pH为5的含有100mM柠檬酸-柠檬酸三钠、150mM NaCl,10mM EDTA-2Na的缓冲液以305cm/h的线性流速平衡层析柱;上样体积24CV;用pH为7.5的10mM PB,400mM NaCl缓冲液,以305cm/h的线性流速进行洗脱杂蛋白,洗杂体积5~7CV;用pH为7.0~8.0的10mM PB,800mM NaCl缓冲液,以305cm/h的线性流速进行洗脱,收集含有OsrhLF的洗脱液,对洗脱液进行SDS-PAGE、铁饱和度、SEC-HPLC分析,结果如表3所示。
表3不同提取时间下层析收洗脱液的测定
从表3可以看出,随着提取时间的延长,铁饱和度逐渐降低,当提取时间为17h时,铁饱和度仅为5.35%,而当提取时间为5h时,铁饱和度为25%。SDS-PAGE(图5)、SEC-HPLC及产量方面,各提取条件无显著差别(11h产量略低属于检测偏差所致)。
Claims (10)
1.一种从基因工程水稻种子中分离纯化低铁饱和度的重组人乳铁蛋白的方法,依次包含以下步骤:
1) 从重组人乳铁蛋白基因工程水稻种子中提取含有重组人乳铁蛋白的粗提取物,提取缓冲液包含50~100mM柠檬酸-柠檬酸三钠、100~200mMNaCl,1~10mM EDTA-2Na,pH为3.5~5.0;
2) 将步骤1)所得含有重组人乳铁蛋白的粗提取物经阳离子层析,获得纯度>95%的低铁饱和度人乳铁蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法,其中步骤 1) 所述重组人乳铁蛋白粗提取物提取方法包括步骤:
i ) 将含有重组人乳铁蛋白的基因工程稻米粉碎后与提取缓冲液按重量/体积比kg /L=1:5混合,在15~35℃下提取1~24小时;
ii ) 将步骤i )的提取混合物过滤后调节pH至4.0~5.0,获得阳离子层析的上样液。
3.根据权利要求1或2所述的方法,所述提取液pH为3.8~5.0。
4.根据权利要求1或2所述的方法,从重组人乳铁蛋白基因工程水稻种子中提取含有重组人乳铁蛋白的温度为20~30℃。
5.根据权利要求1或2所述的方法,从重组人乳铁蛋白基因工程水稻种子中提取含有重组人乳铁蛋白的时间为5~24h。
6.根据权利要求1或2所述的方法,步骤2)中阳离子层析上样液的pH为5.0。
7.根据权利要求1所述的方法,阳离子层析介质选择使用SP Bestarose Big Beads填料。
8.根据权利要求1或7所述的方法,所述步骤2)的层析方法为:
a)采用4~6倍柱体积的pH为4.0~5.0的含有50~150mM柠檬酸-柠檬酸三钠、100~200mMNaCl,1~10mM EDTA-2Na的缓冲液以200~300cm/h的线性流速平衡层析柱;
b)以步骤1)的粗提物为层析上样液,其中上样液pH为4.0~5.0、电导20~30mS/cm,上样体积为20~40倍柱体积;
c)用pH为7.0~8.0的5~50mM PB,300-500mMNaCl缓冲液,以200~300cm/h的线性流速进行洗脱杂蛋白,洗杂液体积为5~7倍柱体积;
d)用pH为7.0~8.0的5~50mM PB,700~900 mMNaCl缓冲液,以200~300cm/h的线性流速进行洗脱重组人乳铁蛋白,收集含有OsrhLF的洗脱液。
9.根据权利要求8所述的方法,层析上样液的上样量不超过30倍柱体积。
10.一种从基因工程水稻种子中提取低铁饱和度的重组人乳铁蛋白的方法,包括以下步骤:
(1)将基因工程稻谷脱壳成半精米,研磨成80~100目的米粉;
(2)将米粉与提取缓冲液以重量/体积kg/L 为1:5的比例混合,于15~35℃提取1~24小时,提取缓冲液的成分为250~100mM柠檬酸-柠檬酸三钠、100~200mMNaCl,1~10mM EDTA-2Na,pH为3.8~5.0;
(3)将上述步骤(2)得到的混合物加入2~5%的珍珠岩进行压滤,得到含有重组人乳铁蛋白的提取液。
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GR01 | Patent grant | ||
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