CN101170918A

CN101170918A - 生物活性组合物的高压处理

Info

Publication number: CN101170918A
Application number: CNA2006800157995A
Authority: CN
Inventors: 蒂莫西·约瑟夫·卡罗尔; 哈斯穆克·安巴拉尔·帕特尔; 米格尔·亚历杭德罗·冈萨雷斯-马丁; 詹姆士·威廉·德克尔; 迈克尔·安东尼·科利特; 马克·威廉·柳伯斯
Original assignee: Fonterra Cooperative Group Ltd
Current assignee: Fonterra Cooperative Group Ltd
Priority date: 2005-03-08
Filing date: 2006-03-08
Publication date: 2008-04-30
Also published as: CN101237785A

Abstract

本发明涉及压力处理包含至少一种生物活性组分的生物活性组合物，以防止至少一种不想要的微生物的生长，同时使至少一种生物活性组分保持在期望的活性水平的方法。所述生物活性组分选自一种或多种蛋白或蛋白水解物、一种或多种脂质或脂质水解物、一种或多种碳水化合物、一种或多种益生因子或其混合物。压力处理是在约350MPa至1000MPa的预定压力下进行。

Description

生物活性组合物的高压处理

发明领域

[0001]本发明涉及生物活性组合物的高压处理，尤其涉及压力处理生物组合物，以防止至少一种不想要的微生物生长，同时使至少一种生物活性组分保持在期望的活性水平的方法。

背景

[0002]提供具有有用保存期的安全产品的同时保持生物活性的要求限制了在食品或其它可摄取的产品中递送生物活性组分(例如蛋白质、脂质或其水解物以及益生微生物)。具有有用保存期的产品即具有良好的保存性并且不易腐坏。

[0003]期望递送生物活性组分，这至少是因为这些组分在摄取时具有生理活性，以及这些组分能够具有积极的健康效益，其包括但不限于骨骼健康、免疫效益、抗炎活性、心脏健康和癌症治疗功效。

[0004]确保有用保存性的传统方法对食品等的生物活性具有消极影响。特别是热处理的方法，对生产商业化的无菌生物活性产品并非都适用。例如，对商业化乳制品中的免疫球蛋白的分析显示尽管60-75％的免疫球蛋白可在巴氏灭菌法处理后得以保存，但是在UHT或罐装(蒸发处理)的牛奶中，免疫球蛋白的水平几乎可以忽略不计(Li-Chan et al，1995)。通过使用比罐装产品稍低的温度加热可完成对酸性食品的商用灭菌，但是在加热时，免疫球蛋白由于酸化而对变性的敏感性有所加剧(Dominguez等人，2001)。

[0005]益生微生物是当将其以足够量给予时，赋予寄主健康效益的微生物。活益生微生物显示出生物活性作用，而失活益生微生物可以以稳定、工艺上较少限制的使用和配售形式提供生物活性。在应用中，活微生物因其不想要的活性(例如酶或酸分泌)而不合需要，失活微生物更有利于仍然提供生物活性，而不具有由于其生存性而产生的不想要的活性。国际PCT申请WO 2004/032655报导了使用高压处理来减少食品由细菌引起的损坏和/或提供所消费食品的安全，同时保留可存活的期望的培养菌。

[0006]生物活性产品、成分和食品生产中的一些方法可导致部分或全部丧失生物活性。就基于乳制品的成分和食品而言，可影响到生物活性的涉及加热的步骤包括热巴氏灭菌法(thermal pasteurisation)、匀浆化(homogenisation)、热化(thermalisation)、蒸发和干燥。就食品加工而言，可影响生物活性的加热步骤的实例包括发酵前的热处理，UHT处理、干馏、热填充和热包装。在食品生产过程中，生物活性组分通常经历一道或者多道这样的加热步骤。这对于乳制品尤其如此，其中处理通常包括最初的巴氏灭菌步骤，并且其通常还包括包装和销售前的进一步加热步骤。Korhonen等人(1998)报道称，加热到60℃至90℃的温度范围使蛋白质变性，因此降低了生物活性蛋白的活性。

[0007]用巴氏灭菌乳所生产的产品的干燥可用于改善保存性，同时损失高达40％的免疫球蛋白(Li-Chan，1995)，但是其商业应用限于直接食用(例如奶片)或新鲜产品(例如酸乳酪)，其中干燥过的生物活性成分基本上不再进行后续加热。由于干燥和加热所造成的损失可通过补充具有所关注的生物活性的中间产品或最终产品来补偿，但是这可能增加末端消费者的费用。

[0008]现已报导，使用约350MPa以上压力的压力处理可使肉制品、蔬菜和水果类产品(例如分别为熟火腿、鳄梨产品和果汁)的保存性达到商业上有益的改进。然而，Huppertz等人(2002)报道称，高压使乳中的乳清蛋白变性。此外，Korhonen等人(1998)报道称，在多数情况下，约500MPa或以上压力的压力处理使蛋白质不可逆地变性。Felipe等人(1997)报道了在500MPa压力下山羊乳中发生可测量水平的免疫球蛋白变性。

[0009]Masuda等人(2000)报道称，大于等于400MPa的压力无法用于改善牛初乳的保存性，因为这样的压力可使免疫球蛋白质变性。

[0010]Tonello等人(1992)报道称，可使用200MPa压力处理2小时可用来保持至少85％的免疫球蛋白活性，尽管初乳中的微生物含量仅下降了2个对数周期。在63℃时同样的处理能够使微生物含量下降到检测限以下(超过7个对数周期)，但这样处理会导致至少50％的免疫球蛋白活性丢失。

[0011]存在对能够为诸如食品或其它可摄取产品等的生物活性产品提供商业上可用的食品保存性，同时保持至少一种生物活性组分的生物活性的处理方法的需求。

[0012]因此，本发明的目的旨在提供在防止不想要的微生物生长的同时将至少一种生物活性组分至少保持在期望的活性水平的改良方法或可供选择的方法，或至少向公众提供可用的选择。

发明概述

[0013]本发明涉及维持或提高生物活性组合物的保存性，同时使至少一种存在于所述组合物中的生物活性组分至少保持在期望的活性水平的方法。

[0014]因此，本发明一方面涉及处理生物活性组合物以维持或提高其保存性的方法，其包括：

(a)选择生物活性组合物，该组合物包含至少一种选自下列组分的生物活性组分：一种或多种蛋白质、一种或多种脂质、一种或多种蛋白质水解物、一种或多种脂质水解物、一种或多种碳水化合物、或一种或多种益生因子或其混合物，所述至少一种生物活性组分在约350MPa至1000MPa的预定压力和约3.0至8.0的pH下进行压力处理后能够保持期望的活性水平；以及

(b)在所述预定压力和pH下对所述组合物进行压力处理以防止可能存在于所述组合物中的不想要的生物体生长，同时使至少一种生物活性组分至少保持在期望的活性水平。

[0015]本发明的另一方面涉及处理生物活性组合物以维持或提高其保存性的方法，其包括：

(a)选择生物活性组合物，该组合物包含至少一种选自下列组分的生物活性组分：一种或多种蛋白质、一种或多种脂质、一种或多种蛋白质水解物、一种或多种脂质水解物、一种或多种碳水化合物、或一种或多种益生因子或其混合物，所述至少一种生物活性组分在约350MPa至1000MPa的预定压力和约3.0至8.0的pH以及约0至5分钟的停留时间进行压力处理后能够保持期望的活性水平；以及

(b)在所述预定压力、pH和停留时间下对所述组合物进行压力处理以防止可能存在于所述组合物中的不想要的生物体生长，同时使至少一种生物活性组分至少保持在期望的活性水平。

[0016]本发明的另一方面涉及处理益生组合物的方法，其包括：

(a)选择包含一种或多种益生微生物菌株的组合物，该益生微生物具有一种或多种益生因子，所述益生因子在约350MPa至1000MPa的预定压力下进行压力处理后能够至少保持在期望的活性水平；以及

(b)在所述预定压力下对所述组合物进行压力处理以防止一种或多种益生微生物菌株生长，同时使一种或多种益生因子至少保持在期望的活性水平。

[0017]本发明的另一方面涉及处理益生组合物的方法，其包括：

(a)选择包含一种或多种益生微生物菌株的组合物，该益生微生物选自一种或多种嗜酸乳酸杆菌菌株(Lactobacillus acidophilus)、一种或多种鼠李糖乳杆菌菌株(Lactobacillus rhamnosus)、或一种或多种动物双歧杆菌Lactis亚种菌株(Bifidiobacterium animalissubsp.lactis)或其混合物，所述一种或多种益生微生物菌株具有一种或多种益生因子，所述益生因子在约350MPa至1000MPa的预定压力下进行压力处理后能够至少保持在期望的活性水平；以及

[0018]以下实施方案可涉及上文或下文所描述的任何方面。

[0019]所述组合物可以是液体，其包括固体在液体中形成的混悬液。组合物可以是产品或成分。优选地，为维持或改善食品的保存性对所述组合物所进行的处理包括为减缓、延迟、防止或消除至少一种不想要的微生物的生长所进行的处理，优选为减缓、延迟、防止或消除全部不想要的微生物的生长所进行的处理。

[0020]在一实施方案中，处理后的需氧菌平板计数(APC)为小于或等于约100,000、75,000、50,000、25,000、10,000、5,000、1,000、100或10集落形成单位每毫升(cfu/ml)，优选小于或等于约50,000cfu/ml。

[0021]在一实施方案中，一种或多种蛋白质可以是重组的、合成的或天然存在的蛋白质或其混合物。

[0022]在一实施方案中，至少一种生物活性组分选自乳铁蛋白、溶菌酶、一种或多种IgA、一种或多种IgD、一种或多种IgE、一种或多种IgG、一种或多种IgM、一种或多种乳衍生的生长因子、TGF β1、TGF β2、一种或多种益生因子或其混合物。

[0023]在另一实施方案中，至少一种生物活性组分包含一种或多种益生因子。

[0024]在另一实施方案中，生物活性组合物包含乳品蛋白组合物。本实施方案中的至少一种生物活性组分优选地选自乳铁蛋白、溶菌酶、一种或多种IgA、一种或多种IgD、一种或多种IgE、一种或多种IgG、一种或多种IgM、一种或多种乳衍生的生长因子、TGF β1或TGF β2或其混合物。

[0025]在另一实施方案中，生物活性组合物选自初乳MPC、初乳MPI、初乳WPC、初乳WPI、MPC、MPI、WPC、WPI、超免疫MPC、超免疫MPI、超免疫WPC或超免疫WPI或其混合物。本实施方案中的至少一种生物活性组分优选地选自乳铁蛋白、溶菌酶、一种或多种IgA、一种或多种IgD、一种或多种IgE、一种或多种IgG、一种或多种IgM、TGFβ1或TGFβ2或其混合物。

[0026]在另一实施方案中，生物活性组分选自乳铁蛋白、溶菌酶、一种或多种免疫球蛋白(包括一种或多种IgA、IgD、IgE、IgG或IgM或其混合物、或一种或多种对不同表位特异的IgA，IgD，IgE，IgG或IgM)、糖巨肽、一种或多种生长因子(包括一种或多种乳衍生的生长因子)、TGFβ1、TGFβ2、一种或多种益生因子、一种或多种非极性脂质、或一种或多种极性脂质(例如一种或多种磷脂、鞘脂、神经节苷脂、或神经酰胺或其混合物)或其混合物。在优选的实施方案中，生物活性组份选自乳铁蛋白、溶菌酶、一种或多种IgA、一种或多种IgD、一种或多种IgE、一种或多种IgG、一种或多种IgM、一种或多种乳衍生的生长因子、TGFβ1、TGFβ2、一种或多种益生因子、一种或多种非极性脂质、一种或多种磷脂、一种或多种鞘脂、一种或多种神经节苷脂或一种或多种神经酰胺或其混合物。在可供选择的优选实施方案中，生物活性组份选自乳铁蛋白、一种或多种IgA、一种或多种IgG、一种或多种IgM、TGFβ1、TGFβ2或一种或多种益生因子或其混合物。

[0027]在一实施方案中，所述组合物包含生物活性组分、基本上由生物活性组分组成或由生物活性组分组成，所述生物活性组分选自乳铁蛋白、溶菌酶、一种或多种免疫球蛋白(包括一种或多种IgA、IgD、IgE、IgG或IgM或其混合物、或一种或多种对不同表位特异的IgA，IgD，IgE，IgG或IgM)、糖巨肽、一种或多种生长因子(包括一种或多种乳衍生的生长因子、包括TGFβ1和TGFβ2)或一种或多种益生因子或其混合物。

[0028]在另一实施方案中，所述组合物包含生物活性组分、基本上由生物活性组分组成或由生物活性组分组成，所述生物活性组分选自一种或多种非极性脂质、一种或多种诸如磷脂、鞘脂、神经节苷脂或神经酰胺的极性脂质或其混合物。

[0029]在一实施方案中，所述组合物包含至少约0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％，5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％或100％重量的生物活性组分，所述组合物基本上由至少约0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％，5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％或100％重量的生物活性组分组成，或所述组合物由至少约0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％，5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％或100％重量的生物活性组分组成，所述生物活性组分选自乳铁蛋白、溶菌酶、一种或多种免疫球蛋白(包括一种或多种IgA、IgD、IgE、IgG或IgM或其混合物、或一种或多种对不同表位特异的IgA，IgD，IgE，IgG或IgM)、糖巨肽、生长因子(包括乳衍生的生长因子、包括TGFβ1和TGFβ2)或一种或多种益生因子或其混合物。

[0030]在一实施方案中，所述组合物富含基本上由或由生物活性组分组成的组合物，所述生物活性组分选自乳铁蛋白、溶菌酶、一种或多种免疫球蛋白(包括一种或多种IgA、IgD、IgE、IgG或IgM或其混合物、或一种或多种对不同表位特异的IgA，IgD，IgE，IgG或IgM)、糖巨肽、生长因子(包括乳衍生的生长因子、包括TGFβ1和TGFβ2)、包含至少约1％w/w免疫球蛋白的组合物、通过为提高抗体水平而对动物进行接种所制得的产品、免疫乳或一种或多种益生因子或其混合物。即，将基本上由或由生物活性成分组成的组合物加入到组合物中以提高生物活性组分的浓度，所述生物活性组分选自乳铁蛋白、溶菌酶、一种或多种免疫球蛋白(包括一种或多种IgA、IgD、IgE、IgG或IgM或其混合物、或一种或多种对不同表位特异的IgA，IgD，IgE，IgG或IgM)、糖巨肽、生长因子(包括乳衍生的生长因子、包括TGFβ1和TGFβ2)、包含至少约1％w/w免疫球蛋白的组合物、通过为提高抗体水平而对动物进行接种所制得的产品(超免疫乳或超免疫初乳)、免疫乳或一种或多种益生因子或其混合物。

[0031]在一实施方案中，所述益生因子选自一种或多种细菌DNA基序、一种或多种细菌表面蛋白、一种或多种细菌小分子有机酸、或一种或多种细菌细胞壁组分或其混合物。

[0032]在一实施方案中，所述不想要的生物体选自一种或多种细菌(包括益生菌)、一种或多种真菌、一种或多种霉菌或者一种或多种酵母菌和一种或多种藻类或其混合物。在一实施方案中，所述不想要的生物体为腐败菌，其选自一种或多种细菌、一种或多种真菌、一种或多种霉菌、一种或多种酵母菌或者一种或多种藻类或其混合物。在一实施方案中，所述不想要的生物体为病原体，其选自一种或多种细菌、一种或多种真菌、一种或多种霉菌、一种或多种酵母菌或者一种或多种藻类或其混合物。在可供选择的实施方案中，所述不想要的生物体包含益生生物体和任选地附加不想要的生物体。

[0033]在一实施方案中，所述不想要的生物体或所述益生微生物选自乳酸菌(Lactobacillus)、链球菌(Streptococcus)、乳球菌(Lactococcus)、明串珠菌(Leuconostoc)、片球菌(Pediococcus)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、丙酸杆菌(Propionibacterium)、肠球菌(Enterococcus)或芽胞杆菌(Bacillus)或其混合物。在另一实施方案中，所述微生物选自嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)、德氏乳杆菌保加利亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、两歧双歧杆菌(Bifidiobacterium bifidum)、短双歧杆菌(Bifidiobacterium breve)、婴儿双岐杆菌(Bifidobacterium infantis)、动物双歧杆菌Lactis亚种(Bifidiobacterium animalis subsp.lactis)、长双岐杆菌(Bifidobacteriumlongum)、或嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)或其混合物。

[0034]在另一实施方案中，所述不想要的生物体或所述益生微生物选自鼠李糖乳杆菌HN001(Lactobacillus rhamnosus HN001)(AGALNM 97/09514)、动物双歧杆菌Lactis亚种HN019(Bifidiobacteriumanimalis subsp.lactis HN019)(AGAL NM 97/09513)、嗜酸乳杆菌HN017(Lactobacillus acidophilus HN017)(AGAL NM 97/09515)、鼠李糖乳杆菌HN067(Lactobacillus rhamnosus HN067)(AGAL NM97/01925)(US 6,379,663中对其全部进行了描述)、约氏乳杆菌NCC533(Lactobacillus johnsonii NCC533)(La1)(CNCM I-1225)、鼠李糖乳杆菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG)(ATCC 53103)、养乐多代田菌(Lactobacillus casei Shirota)(FERM-P4751)、嗜酸乳杆菌NCFM(Lactobacillus acidophilus NCFM)(ATCC 700396)、植物乳杆菌299v(Lactobacillus plantarum 299v)(DSMZ 9843)、干酪乳杆菌DN114001(Lactobacillus casei DN114001)(CNCM I-1518)、唾液乳杆菌UCC4331(Lactobacillus salivarius UCC4331)(NCIMB 40829)、动物双歧杆菌Lactis亚种BB12(Bifidiobacterium animalis subsp.lactis BB12)(ATCC27536和DSMZ 10140)、或婴儿双岐杆菌35624(Bifidobacteriuminfantis35624)(NCIMB 41003)或其混合物。优选的不想要的有机体或益生微生物包括鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)HN001、动物双歧杆菌Lactis亚种HN019(Bifidiobacterium animalis subsp.lactisHN019)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)HN017、或鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)HN067或其混合物。

[0035]在一实施方案中，所述益生微生物为失活益生微生物。失活益生微生物可以是不能存活的、不能存活但仍具有代谢活性的或死亡的。

[0036]在一实施方案中，所述组合物包含一种或多种不想要的微生物，例如一种或多种细菌(包括一种或多种益生细菌)、一种或多种真菌、一种或多种霉菌、一种或多种酵母菌、或一种或多种藻类或其混合物。应当理解，在一实施方案中，本方明所使用的方法优选地旨在防止至少一种不想要的微生物的生长。然而，所述方法通常以预防疾病为目的实施，实际上可能并没有任何不想要的生物体存在。在这种情况下，实施所述方法来维持或改善食品保存性，或实施所述方法以遵守食品安全要求、现行生产质量管理规范或法规要求。无论不想要的微生物是否存在，本发明所使用的压力处理方法使至少一种生物活性组分保持在期望的活性水平，并且该方法用于维持或提高食品的保存性。

[0037]因此，所述方法优选地防止至少一种不想要的微生物生长，同时使至少一种生物活性组分至少保持在期望的活性水平。

[0038]在一实施方案中，所述组合物是乳，包括绵羊乳、山羊乳、猪乳、鼠乳、水牛乳、骆驼乳、牦牛乳、马乳、驴乳、驼马乳(llama milk)、牛乳或人乳或其混合物。所述乳优选为牛乳。

[0039]在另一实施方案中，所述组合物包含乳品蛋白质或所述组合物是乳品成分。乳品蛋白组合物或乳品成分优选为重组的或新鲜的全脂乳、重组的或新鲜的脱脂乳、再生的全脂奶粉或脱脂奶粉、脱脂乳浓缩物、脱脂乳分离物、全脂奶粉或脱脂奶粉、脱脂乳渗余物(retentate)、炼乳、酪乳、超滤乳渗余物、乳蛋白浓缩物(MPC)、乳蛋白分离物(MPI)、脱钙乳蛋白浓缩物、脱钙乳蛋白分离物、低脂乳、低脂乳蛋白浓缩物、低脂乳蛋白分离物、初乳、初乳分馏物(colostrumfraction)、初乳蛋白浓缩物(CPC)、初乳乳蛋白浓缩物、初乳乳蛋白分离物，初乳乳清、初乳乳清蛋白浓缩物，初乳乳清蛋白分离物、来自初乳的免疫球蛋白分馏物、乳清、乳清蛋白浓缩物(WPC)、乳清蛋白分离物(WPI)、甜乳清、乳酸乳清、无机酸乳清、再生的乳清粉、超免疫乳、超免疫乳蛋白浓缩物，超免疫乳蛋白分离物、超免疫乳清、超免疫乳清蛋白浓缩物、超免疫乳清蛋白分离物、超免疫初乳、超免疫初乳乳蛋白浓缩物、超免疫初乳乳蛋白分离物、超免疫初乳乳清、超免疫初乳乳清蛋白浓缩物、超免疫初乳乳清蛋白分离物、由任何乳或初乳工业生产液流衍生的组合物、由任何乳或初乳工业生产液流的超滤或微过滤所获得的渗余物或渗透物衍生的组合物、或由任何乳或初乳工业生产液流的色谱分离所获得的穿透的或吸附的分馏物衍生的组合物、或这些组合物中任一组合物的全部或部分水解物或其混合物。

[0040]所述乳品蛋白组合物或乳品成分优选源自奶牛、绵羊、山羊、猪、鼠、水牛、骆驼、牦牛、马、驴、驼马或人、或者上述各种源乳品蛋白组合物或乳品成分的混合物。

[0041]在另一实施方案中，益生组合物是乳品组合物，例如上文所描述的那些组合物。

[0042]在一实施方案中，所述组合物在进行压力处理前经巴氏灭菌、干燥、蒸发或过滤(包括膜过滤)。

[0043]在另一实施方案中，所述期望的活性水平是未处理的对照的活性的至少约35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或1 00％，可用的范围可选自这些值中的任意值之间(例如，约35％至约100％、约50％至约100％、约60％至约100％、约70％至约100％、约80％至约100％以及约90％至约100％)。优选地，所述至少一种生物活性组分为蛋白并且通过ELISA、流式细胞计、HPLC或BiaCore来测定所保持的活性。优选地，所述至少一种生物活性组分为脂质并且通过流式细胞计、气相色谱法(GC)或HPLC来测定所保持的活性。优选通过流式细胞计或PBMC分泌细胞因子检测法来测定所述的益生菌活性。优选地，所述期望的活性水平是未处理的对照的活性的至少约35％、是未处理的对照的活性的至少约50％、是未处理的对照的活性的至少约60％、是未处理的对照的活性的至少约70％、是未处理的对照的活性的至少约80％、或是未处理的对照的活性的至少约90％、95％、99％或100％。

[0044]在一实施方案中，所述处理压力选自至少约350MPa、360MPa、370MPa、380MPa、390MPa、400MPa、410MPa、420MPa、430MPa、440MPa、450MPa、460MPa、470MPa、480MPa、490MPa、500MPa、510MPa、520MPa、530MPa、540MPa、550MPa、560MPa、570MPa、580MPa、590MPa、600MPa、610MPa、620MPa、630MPa、640MPa、650MPa、660MPa、670MPa、680MPa、690MPa、700MPa、750MPa、800MPa、850MPa、900MPa、950MPa和1000MPa或更高，可用的范围可选自这些值中的任意值之间(例如，约350MPa至约400MPa、约350MPa至约450MPa、约350MPa至约500MPa、约350MPa至约550MPa、约350MPa至约600MPa、约350MPa至约650MPa约350MPa至约700MPa、约350MPa至约750MPa、350MPa至约800MPa、约350MPa至约850MPa、约350MPa至约900MPa、约350MPa至约950MPa以及约350MPa至约MPa、约400MPa至约1000MPa、约450MPa至约1000MPa、约500MPa至约1000MPa、约550MPa至约1000MPa、约600MPa至约1000MPa、约650MPa至约1000MPa、约700MPa至约1000MPa、约750MPa至约1000MPa、约800MPa至约1000MPa、约850MPa至约1000MPa、约900MPa至约1000MPa、约950MPa至约1000MPa、约500MPa至约550MPa、约500MPa至约600MPa、约500MPa至约650MPa、约500MPa至约700MPa、约500MPa至约750MPa、约500MPa至约800MPa、约550MPa至约800MPa、约600MPa至约800MPa、约650MPa至约800MPa、约700MPa至约800MPa、约750MPa至约800MPa、约400MPa至约800MPa、约400MPa至约750MPa、约400MPa至约700MPa、约400MPa至约650MPa、约400MPa至约600MPa、约450MPa至约800MPa、约450MPa至约750MPa、约450MPa至约700MPa、约450MPa至约650MPa、约450MPa至约600MPa、约500MPa至约800MPa、约500MPa至约750MPa、约500MPa至约700MPa、约500MPa至约650MPa、约500MPa至约600MPa、约525MPa至约675MPa、约550MPa至约650MPa和约575MPa至约625MPa)。所述处理压力优选为至少约350MPa、400MPa、450MPa、500MPa或600MPa。

[0045]在可供选择的实施方案中，其中所述组合物优选包含益生生物体，所述处理压力选自至少约500MPa、510MPa、520MPa、530MPa、540MPa、550MPa、560MPa、570MPa、580MPa、590MPa、600MPa、610MPa、620MPa、630MPa、640MPa、650MPa、660MPa、670MPa、680MPa、690MPa和700MPa，可用的范围可选自这些值中的任意值之间(例如，约500MPa至约550MPa、约500MPa至约600MPa、约500MPa至约650MPa、约500MPa至约700 MPa、约550MPa至约700MPa、约600MPa至约700MPa、约650MPa至约700MPa和约550MPa至约650MPa)。所述处理压力优选为至少约550MPa、600MPa或650MPa。

[0046]在一实施方案中，当对所述组合物进行压力处理时，其pH小于约5.0，优选小于约4.6、更优选为约3.0至约4.6，最优选为约3.5至约4.1。

[0047]在另一实施方案中，当对所述组合物进行压力处理时，其pH至少为约3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0或更大，以及可用的范围可选自这些值中的任意值之间(例如，约pH3.0至约pH4.5、约pH3.0至约pH5.0、约pH3.0至约pH5.5、约pH3.0至约pH6.0、约pH3.0至约pH6.5、约pH3.0至约pH7.0、约pH3.0至约pH7.5、约pH3.0至约pH8.0、约pH3.1至约pH4.9、约pH3.2至约pH4.8、约pH3.3至约pH4.7、约pH3.4至约pH4.6、约pH3.5至约pH4.5、约pH3.6至约pH4.4、约pH3.7至约pH4.3、约pH3.8至约pH4.2和约pH3.9至约pH4.1)。或者，在另一实施方案中，在压力处理前将所述组合物的pH调节到上述所列出的pH或pH范围中。

[0048]在一实施方案中，所述方法在环境温度下进行。所述压力处理优选在至少约0℃、4℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃或60℃的温度下进行，以及可用的范围可选自这些值中的任意值之间(例如，约5℃至约40℃)。在一实施方案中，所述温度为约0℃至约40℃。在另一实施方案中，所述温度为约4℃至约25℃。

[0049]在一实施方案中，可使所述处理压力持续约1秒至约30分钟的处理时间。所述处理时间优选地选自约1秒、5秒、10秒、20秒、30秒、60秒、90秒、120秒、150秒、180秒、210秒、240秒、270秒或300秒或约0.5分钟、1分钟、1.5分钟、2分钟、2.5分钟、3分钟、3.5分钟、4分钟、4.5分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟或60分钟，以及可用的范围可选自这些值中的任意值之间(例如，约1分钟至约10分钟、约1分钟至约5分钟或约2分钟至约4分钟)。

[0050]在另一实施方案中，在处理时间内使处理压力基本上保持为常数。在另一实施方案中，在处理时间内将压力从环境压力(通常为大气压力)升高至处理压力，然后再回到环境压力。环境压力通常为大气压力。

[0051]应当理解，在一实施方案中，上文列出的一段处理时间是将压力从大气压力升高到处理压力然后再返回大气压力所用的时间。从而，在一实施方案中，1分钟的处理时间是指在1分钟内将压力从大气压力升高到处理压力，然后再返回大气压力。

[0052]应当理解，在另一实施方案中，上文列出的一段处理时间是将压力维持在所述处理压力下的时间(“停留时间”)。从而，在一实施方案中，1分钟的处理时间是指将压力维持在所述处理压力1分钟。因此，在本实施方案中，0分钟处理时间(或“不停留”)是指将压力升高至所述处理压力但是不停留，然后压力再返回至大气压力。在本实施方案中，优选的处理时间包括0分钟(不停留)、0.5分钟、1分钟、1.5分钟、2分钟、2.5分钟、3分钟、3.5分钟、4分钟、4.5分钟、5分钟、5.5分钟、6分钟、6.5分钟、7分钟、7.5分钟、8分钟、8.5分钟、9分钟、9.5分钟和10分钟。优选地，使所述压力维持约0分钟、0.5分钟、1分钟、1.5分钟、2分钟、2.5分钟、3分钟、3.5分钟、4分钟、4.5分钟或5分钟，或者使所述压力维持约0分钟、0.5分钟、1分钟、1.5分钟、2分钟、2.5分钟或3分钟，或者约0分钟。

[0053]在一可供选择的实施方案中，总处理时间小于约0.5分钟、1分钟、1.5分钟、2分钟、2.5分钟、3分钟、3.5分钟、4分钟、4.5分钟、5分钟、5.5分钟、6分钟、6.5分钟、7分钟、7.5分钟、8分钟、8.5分钟、9分钟、9.5分钟和10分钟。也就是说，将压力从环境压力(通常为大气压力)升高然后再返回环境压力所用的时间小于约0.5分钟、1分钟、1.5分钟、2分钟、2.5分钟、3分钟、3.5分钟、4分钟、4.5分钟、5分钟、5.5分钟、6分钟、6.5分钟、7分钟、7.5分钟、8分钟、8.5分钟、9分钟、9.5分钟和10分钟。所述时间优选小于约8分钟、优选小于约7分钟、优选小于约6分钟或优选小于约5分钟。

[0054]在另一实施方案中，所述组合物可以进行附加的压力处理。处理压力可以从一处理压力变为另一处理压力，而无需首先返回至大气压力。每一压力处理可在单独的处理时间内进行。从而，在一实施方案中，将压力从环境压力升高至第一处理压力维持第一处理时间，然后将所述压力转变为第二处理压力维持第二处理时间。优选地，第一处理时间比第二处理时间长。优选地，第一处理时间比第二处理时间短。在另一实施方案中，在所述处理时间内将压力升高至第一处理压力，然后再转变为第二处理压力。

[0055]在一实施方案中，使所述组合物在并入产品前处于处理压力下。在另一实施方案中，使所述组合物在并入产品后处于处理压力下。从而，所述方法还包括使组合物在并入产品前或后处于处理压力下。在另一实施方案中，使所述组合物在包装前处于处理压力下。在另一实施方案中，使所述组合物在包装后处于处理压力下。从而，所述方法还包括在包装前或后使组合物处于处理压力下。

[0056]在一实施方案中，所述组合物还包含稳定剂。优选的稳定剂选自下列树胶：槐豆胶、瓜尔胶、黄原胶、肉桂胶、魔芋粉(konjacflour)、β葡聚糖、他拉胶、阿拉伯树胶(gum Arabic)、结冷胶、羧甲基纤维素、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、黄蓍胶、刺梧桐胶、阿拉伯树胶(gum acacia)、壳聚糖、arabinoglactins、藻酸盐、果胶、角叉菜胶、或欧车前或其混合物。稳定剂优选为果胶或羧甲基纤维素(CMC)或其混合物。

[0057]在另一实施方案中，所述组合物还包含疏水配体。所述疏水配体优选地选自十六酸、肉豆蔻酸、亚麻油酸、共轭亚油酸(CLA)、一种或多种磷酯、一种或多种缩醛磷脂酰胆碱、一种或多种鞘磷脂、一种或多种神经节苷酯、丁酸、一种或多种ω-3脂肪酸(包括但不限于二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA))、一种或多种植物甾醇、一种或多种植物甾醇酯、一种或多种植物甾醇乙酸酯、一种或多种ω-6脂肪酸(包括但不限于鱼油)、脂溶性疏水维生素(包括维生素A[视黄醇]和维生素D)、番茄红素、或十二烷基硫酸钠或其混合物。在本实施方案中，所述组合物的pH优选为约5.0至8.0。

[0058]在另一实施方案中，所述组合物还包含至少一种附加的生物活性蛋白质、脂质、蛋白水解物、脂质水解物或碳水化合物或其混合物。该组合物包括但不限于如上所述的乳品蛋白组合物或乳品成分。

[0059]在另一实施方案中，所述组合物还包含至少一种附加的生物活性组分，该组分选自乳铁蛋白、溶菌酶、一种或多种免疫球蛋白(包括一种或多种IgA、IgD、IgE、IgG或IgM或其混合物、或一种或多种对不同表位特异的IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)、糖巨肽、生长因子(包括乳衍生的生长因子、包括TGFβ1和TGFβ2)、包含至少约1％w/w免疫球蛋白的组合物、通过为提高抗体水平而对动物进行接种所制得的产品(超免疫乳或超免疫初乳)、免疫乳或一种或多种益生因子或其混合物。

[0060]在另一实施方案中，所述组合物还包含至少一种附加的生物活性组分，该组分选自一种或多种非极性脂质或一种或多种诸如一种或多种磷脂、一种或多种鞘脂、一种或多种神经节苷脂或一种或多种神经酰胺的极性脂质或其混合物。

[0061]在另一实施方案中，所述组合物还包含至少约1％w/w的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白包含一种或多种IgA、IgD、IgE、IgG或IgM或其混合物、一种或多种对不同表位特异的IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。

[0062]在一实施方案中，所述组合物或产品为食品。所述食品优选为酸化饮料或碳酸饮料。所述食品优选为包括凝固型(set)、搅拌型、调味型、水果型以及益生菌型(probiotic)酸乳酪在内的酸乳酪，法国白芝士(fromage frais)，新鲜优格芝士(petit suisse)，粗制脱脂酸奶干酪(quarg)，发酵食品或饮料，酸化饮料或乳制品。所述食品优选为果冻。

[0063]在一实施方案中，处理压力为约400MPa、500MPa、600MPa或700MPa，处理时间为1分钟、2分钟、3分钟或不停留。在另一实施方案中，处理压力为约350MPa至约500MPa，处理时间为约0分钟至约5分钟。所述组合物或产品优选为酸乳酪。

[0064]在另一实施方案中，处理压力为约400MPa至约700MPa，处理时间为约0分钟至约5分钟。所述组合物或产品优选为发酵饮料。

[0065]在另一实施方案中，处理压力为约400MPa至约700MPa，处理时间为约0分钟至约10分钟。所述组合物或产品优选为酸性饮料、液体浓缩物(包括凝胶)或酸乳酪。

[0066]在另一实施方案中，处理压力为约350MPa至约800MPa，处理时间为约0分钟至约10分钟，所述组合物或产品的pH为约pH3.0至约pH7.0。

[0067]在一实施方案中，所述生物活性组分是免疫球蛋白或乳铁蛋白；所述产品或组合物的pH为约pH3.0值约pH5.0，优选为约pH3.8至约pH4.5，优选为约pH4.1；所述处理压力为约550MPa至650MPa，优选为600MPa；以及所述处理时间选自1分钟、2分钟或3分钟或不停留。

[0068]在另一实施方案中，所述生物活性组分是乳铁蛋白；所述产品或组合物的pH为约pH3.5至pH4.5，优选为pH4.1；所述处理压力为约550MPa至650MPa，优选600MPa；以及所述处理时间选自1分钟、2分钟或3分钟或不停留。

[0069]在另一实施方案中，所述生物活性组合物是初乳MPC或初乳WPC；所述生物活性组分是免疫球蛋白，优选为IgG；所述产品或组合物的pH为约pH3.5至pH7.0，优选为pH3.5至pH5.0，优选为pH4.1；所述处理压力为约550MPa至650MPa，优选为600MPa；以及所述处理时间选自1分钟、2分钟或3分钟或不停留。

[0070]在另一实施方案中，所述生物活性组合物是初乳MPC或初乳WPC；所述生物活性组分是乳铁蛋白；所述产品或组合物的pH为约pH3.5至pH7.0，优选为pH3.5至pH5.0，优选为pH4.1；所述处理压力为约550MPa至650MPa，优选为600MPa；以及所述处理时间选自1分钟、2分钟或3分钟或不停留。

[0071]在另一实施方案中，所述生物活性组分是免疫乳或免疫乳蛋白浓缩物或免疫乳乳清蛋白浓缩物；所述产品或组合物的pH为约pH3.5至pH7.0，优选为pH3.5至pH5.0，优选为pH4.1；所述处理压力为约550MPa至650MPa，优选为600MPa；以及所述处理时间选自1分钟、2分钟或3分钟或不停留。

[0072]在另一实施方案中，所述生物活性组分是免疫乳或免疫乳蛋白浓缩物或免疫乳乳清蛋白浓缩物；所述生物活性组分是免疫球蛋白，优选为IgG；所述产品或组合物的pH为约pH3.5至pH4.5，优选为pH4.1；所述处理压力为约550MPa至650MPa，优选为600MPa；以及所述处理时间选自1分钟、2分钟或3分钟或不停留。

[0073]在另一实施方案中，所述生物活性组分是免疫乳或免疫乳蛋白浓缩物或免疫乳乳清蛋白浓缩物；所述生物活性组分是乳铁蛋白；所述产品或组合物的pH为约pH3.5至pH4.5，优选为pH4.1；所述处理压力为约550MPa至650MPa，优选为600MPa；以及所述处理时间选自1分钟、2分钟或3分钟或不停留。

[0074]在另一实施方案中，所述生物活性组分是一种或多种IgG，所述处理压力为约550MPa至650MPa，所述pH为约3.0至5.0，以及所述停留时间为约0分钟或1分钟、2分钟或3分钟。

[0075]在一实施方案中，所述生物活性组合物是生物活性乳品蛋白组合物，所述生物活性组分是IgG或乳铁蛋白，所述压力为约350MPa至650MPa，优选为350MPa至550MPa，所述pH为约3.2至4.5，以及所述停留时间为约0分钟、1分钟、2分钟或3分钟。

[0076]在另一实施方案中，所述生物活性组合物是初乳MPC，所述生物活性组分是IgG，所述压力为约350MPa至650MPa，所述pH为约3.2至4.5，以及所述停留时间为约0分钟、1分钟、2分钟或3分钟。

[0077]在另一实施方案中，所述生物活性组合物是初乳MPC，所述生物活性组分是IgG，所述压力为约550MPa至650MPa，所述pH为约3.8，以及所述停留时间为约0分钟、1分钟、2分钟或3分钟。

[0078]在另一实施方案中，所述生物活性组合物是初乳MPC，所述生物活性组分是IgG，所述压力为约550MPa至650MPa，所述pH为约3.2至7.0，以及所述停留时间为约0分钟、1分钟、2分钟或3分钟。

[0079]在另一实施方案中，所述生物活性组合物是初乳脱脂奶粉，所述生物活性组分是IgG，所述压力为约350MPa至650MPa，所述pH为约3.2至5.5，以及所述停留时间为约0分钟、1分钟、2分钟或3分钟。

[0080]在另一实施方案中，所述生物活性组合物是初乳脱脂奶粉，所述生物活性组分是IgG，所述压力为约550MPa至650MPa，所述pH为约3.2至5.5，以及所述停留时间为约0分钟、1分钟、2分钟或3分钟。

[0081]在另一实施方案中，所述生物活性组合物是初乳乳清，所述生物活性组分是IgG，所述压力为约350MPa至650MPa，所述pH为约3.2至5.5，以及所述停留时间为约0分钟、1分钟、2分钟或3分钟。

[0082]在另一实施方案中，所述生物活性组合物是初乳乳清，所述生物活性组分是IgG，所述压力为约550MPa至650MPa，所述pH为约3.2至5.5，以及所述停留时间为约0分钟、1分钟、2分钟或3分钟。

[0083]在另一实施方案中，所述生物活性组合物是初乳乳清超滤渗余物，所述生物活性组分是IgG，所述压力为约550MPa至650MPa，所述pH为约3.2至5.5，以及所述停留时间为约0分钟、1分钟、2分钟或3分钟。

[0084]在另一实施方案中，所述生物活性组合物是超免疫乳、超免疫乳蛋白浓缩物或超免疫乳清蛋白浓缩物、超免疫初乳、超免疫初乳乳蛋白浓缩物或超免疫初乳乳清蛋白浓缩物，所述生物活性组分是IgA、IgG、IgM或乳铁蛋白，所述压力为约550MPa至650MPa，所述pH为约3.2至5.5，以及所述停留时间为约0分钟、1分钟、2分钟或3分钟。

[0085]在另一实施方案中，所述生物活性组分是乳铁蛋白，所述压力为约550MPa至650MPa，所述pH为约3.0至7.5，以及所述停留时间为约0分钟、1分钟、2分钟或3分钟。

[0086]在另一实施方案中，所述生物活性组分是TGF-β1或TGF-β2，所述压力为约550MPa至650MPa，所述pH为约3.0至8.0，以及所述停留时间为约0分钟、1分钟、2分钟或3分钟。

[0087]在另一实施方案中，所述生物活性组合物是酸乳酪，所述生物活性组分是乳铁蛋白，所述压力为约450MPa至650MPa，所述pH为约3.5至5.0，以及所述停留时间为约0分钟、1分钟、2分钟或3分钟。

[0088]在另一实施方案中，所述生物活性组合物是饮料，所述生物活性组分是IgG，所述压力为约550MPa至650MPa，所述pH为约3.0至5.0，以及所述停留时间为约0分钟、1分钟、2分钟或3分钟。

[0089]在另一实施方案中，所述生物活性组合物是果冻，所述生物活性组分是乳铁蛋白，所述压力为约550MPa至650MPa，所述pH为约3.0至5.0，以及所述停留时间为约0分钟、1分钟、2分钟或3分钟。

[0090]本发明的另一方面涉及根据本发明的方法处理的或生产的组合物。本发明的另一方面涉及根据本发明的方法处理的或生产的益生组合物。

[0091]本发明的另一方面涉及根据本发明的方法处理的或生产的组合物在诸如食品、饮料、食品添加剂、饮料添加剂、膳食补充剂、营养品、医疗食品(medical food)、营养药品(nutraceutical)、药剂或药物等的可食用产品制造中的用途。

[0092]本发明的另一方面涉及包含一种或多种益生微生物的组合物或基本上由一种或多种益生微生物组成，并且根据本发明的方法处理的组合物，该益生微生物选自一种或多种嗜酸乳杆菌菌株(actobacillus acidophilus)、一种或多种德氏乳杆菌保加利亚种菌株(Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus)、一种或多种干酪乳杆菌菌株(Lactobacillus casei)、一种或多种卷曲乳杆菌菌株(Lactobacilluscrispatus)、一种或多种约氏乳杆菌菌株(Lactobacillus johnsonii)、一种或多种植物乳杆菌菌株(Lactobacillus plantarum)、一种或多种罗伊氏乳杆菌菌株(Lactobacillus reuteri)、一种或多种鼠李糖乳杆菌菌株(Lactobacillus rhamnosus)、一种或多种唾液乳杆菌菌株(Lactobacillussalivarius)、一种或多种两歧双歧杆菌菌株(Bifidiobacterium bifidum)、一种或多种短双歧杆菌菌株(Bifidiobacterium breve)、一种或多种婴儿双岐杆菌菌株(Bifidobacterium infantis)、一种或多种动物双歧杆菌Lactis亚种菌株(Bifidiobacterium animalis subsp.Lactis)、一种或多种长双岐杆菌菌株(Bifidobacterium longum)、一种或多种嗜热链球菌菌株(Streptococcus thermophilus)或其混合物。

[0093]在本发明的另一方面涉及包含一种或多种益生微生物的组合物或基本上由一种或多种益生微生物组成，并且根据本发明的方法处理的组合物，该益生微生物选自鼠李糖乳杆菌HN001(Lactobacillus rhamnosus HN001)、动物双歧杆菌Lactis亚种HN019(Bifidiobacterium animalis subsp.lactis HN019)、嗜酸乳杆菌HN017(Lactobacillus acidophilus HN017)或鼠李糖乳杆菌HN067(Lactobacillus rhamnosus HN067)或其混合物。

[0094]本发明的另一方面涉及包含乳铁蛋白、溶霉菌、一种或多种IgA、一种或多种IgD、一种或多种IgE、一种或多种IgG、一种或多种IgM、一种或多种生长因子、TGFβ1、或TGFβ2或其混合物，或基本上由乳铁蛋白、溶霉菌、一种或多种IgA、一种或多种IgD、一种或多种IgE、一种或多种IgG、一种或多种IgM、一种或多种生长因子、TGFβ1、或TGFβ2或其混合物组成，并且根据本发明的方法处理的组合物。本发明的另一方面涉及包含乳铁蛋白、一种或多种IgA、一种或多种IgG、一种或多种IgM、TGFβ1、或TGFβ2或其混合物，或基本上由乳铁蛋白、一种或多种IgA、一种或多种IgG、一种或多种IgM、TGFβ1、或TGFβ2或其混合物组成，并且根据本发明的方法来处理的组合物。

[0095]本发明的另一方面涉及本发明的组合物在食品、饮料、食品添加剂、饮料添加剂、膳食补充剂、营养品、医疗食品、营养药品、药剂或药物的制造中的用途，所述用途优选对有需要的个体进行处理，优选对有需要的个体的免疫系统进行激发。从而，本发明的另一方面涉及激发有需要的个体的免疫系统的方法，包括将本发明的组合物进行给药。

[0096]本发明的其它方面涉及包含约0.1mg/ml至1000mg/ml的乳铁蛋白和小于约50,000cfu/ml的微生物的压力处理的组合物、包含约1mg/ml至1000mg/ml的乳铁蛋白和小于约50,000cfu/ml的微生物的压力处理后的组合物、包含约0.1mg/ml至1000mg/ml的IgG和小于约50,000cfu/ml的微生物的压力处理后的组合物、包含约1mg/ml至1000mg/ml的IgG和小于约50,000cfu/ml的微生物的压力处理后的组合物、包含约0.1mg/ml至1000mg/ml的乳铁蛋白和小于约50,000cfu/ml的微生物的压力处理后的果冻、包含约0.1mg/ml至1000mg/ml的乳铁蛋白和小于约50,000cfu/ml的微生物的压力处理后的酸乳酪、包含约0.1mg/ml至1000mg/ml的乳铁蛋白和小于约50,000cfu/ml的微生物的压力处理后的饮料、包含约1mg/ml至1000mg/ml的乳铁蛋白和小于约50,000cfu/ml的微生物的压力处理后的果冻、包含约1mg/ml至1000mg/ml的乳铁蛋白和小于约50,000cfu/ml的微生物的压力处理后的酸乳酪、包含约1mg/ml至1000mg/ml的乳铁蛋白和小于约50,000cfu/ml的微生物的压力处理后的饮料、包含约0.1mg/ml至1000mg/ml的IgG和小于约50,000cfu/ml的微生物的压力处理后的果冻、包含约0.1mg/ml至1000mg/ml的IgG和小于约50,000cfu/ml的微生物的压力处理后的酸乳酪、包含约0.1mg/ml至1000mg/ml的IgG和小于约50,000cfu/ml的微生物的压力处理后的饮料、包含约1mg/ml至1000mg/ml的IgG和小于约50,000cfu/ml的微生物的压力处理后的果冻、包含约1mg/ml至1000mg/ml的IgG和小于约50,000cfu/ml的微生物的压力处理后的酸乳酪、包含约1mg/ml至1000mg/ml的IgG和小于约50,000cfu/ml的微生物的压力处理后的饮料。这类组合物的pH和对其进行处理的压力可选自上文所描述的范围。

[0097]本发明的其它方面涉及包含一种或多种不能存活的益生微生物培养物和小于约50,000cfu/ml的微生物的压力处理后的组合物；包含一种或多种不能存活的益生微生物培养物和小于约50,000cfu/ml的微生物的压力处理后的组合物，该益生微生物培养物选自一种或多种嗜酸乳杆菌菌株(Lactobacillus acidophilus)、一种或多种德氏乳杆菌保加利亚种菌株(Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus)、一种或多种干酪乳杆菌菌株(Lactobacillus casei)、一种或多种卷曲乳杆菌菌株(Lactobacillus crispatus)、一种或多种约氏乳杆菌菌株(Lactobacillus johnsonii)、一种或多种植物乳杆菌菌株(Lactobacillusplantarum)、一种或多种罗伊氏乳杆菌菌株(Lactobacillus reuteri)、一种或多种鼠李糖乳杆菌菌株(Lactobacillus rhamnosus)、一种或多种唾液乳杆菌菌株(Lactobacillus salivarius)、一种或多种两歧双歧杆菌菌株(Bifidiobacterium bifidum)、一种或多种短双歧杆菌菌株(Bifidiobacterium breve)、一种或多种婴儿双岐杆菌菌株(Bifidobacterium infantis)、一种或多种动物双歧杆菌Lactis亚种菌株(Bifidiobacterium animalis subsp.Lactis)、一种或多种长双岐杆菌菌株(Bifidobacterium longum)、或一种或多种嗜热链球菌菌株(Streptococcusthermophilus)或其混合物；包含一种或多种不能存活的益生微生物培养物和小于约50,000cfu/ml的微生物的压力处理后的组合物，该益生微生物培养物选自鼠李糖乳杆菌HN001(Lactobacillus rhamnosusHN001)、动物双歧杆菌Lactis亚种HN019(Bifidiobacterium animalissubsp.lactis HN019)、嗜酸乳杆菌HN017(Lactobacillus acidophilusHN017)、或鼠李糖乳杆菌HN067(Lactobacillus rhamnosus HN067)或其混合物；以及包含不能存活的鼠李糖乳杆菌HN001(Lactobacillusrhamnosus HN001)的培养物和小于约50,000cfu/ml的微生物的压力处理后的组合物。这类组合物的pH和对其进行处理的压力可选自上文所描述的范围。

[0098]若有的话，本文将上文和下文中所引用的所有申请、专利和出版物的全部公开内容引入作为参考。

[0099]本发明所公开的供参考的数字范围(例如，1至10)还旨在将本范围内供参考的全部有理数(例如，1、1.1、2、3、3.9、4、5、6、6.5、7、8、9和10)与本范围内任意有理数范围(例如，2至8、1.5至5.5以及3.1至4.7)合并在一起，并且因此本发明所清楚公开的所有范围的子范围是清楚公开的。仅列举具有特定意图的实例，并且认为所列举的最低值和最高值之间全部可能的数值联合是以相似方式在本申请中清楚声明的。

附图的简要描述

[0100]图1比较了83.5℃热处理保持3分钟后保留在酸化乳品饮料(pH3.5时含3.6％蛋白质)中的免疫球蛋白片断(如用HPLC所测定的)与600MPa压力处理保持3分钟后保留在酸化乳品饮料中的免疫球蛋白片断。

[0101]图2的四幅图显示了不同pH下，热处理(85℃/10分钟)和压力处理(600MPa/3分钟停留时间)对(A)6％w/v初乳乳清组合物、(B)6％w/v初乳乳清超滤渗余物组合物(10kDa超滤)、(C)6％w/v初乳脱脂奶粉组合物以及(D)6％w/v初乳MPC组合物的不同IgG组分的效果。

[0102]图3的两幅图显示了(A)7％w/v HI-MPC组合物和(B)7％w/v HI-WPC组合物样品在压力处理(600MPa/不停留和600MPa/3分钟停留时间)和热处理(85℃/10分钟)后剩余的IgA、IgG、IgM和乳铁蛋白(LF)水平(％)。结果表达为未处理的对照样品的IgA、IgG、IgM和乳铁蛋白水平的百分比。

[0103]图4的两幅图显示了7％w/v WPC组合物样品在未处理、压力处理(600MPa/3分钟)和热处理(75℃/5分钟)后剩余的IgG和乳铁蛋白(LF)水平。

[0104]图5显示了对6％w/v乳铁蛋白溶液样品进行如下压力处理后剩余的LF水平：(1)对照、(2)600MPa/5分钟、(3)600MPa/15分钟、(4)600MPa/30分钟、(5)600MPa/45分钟、(6)75℃/5分钟、(7)85℃/5分钟和(8)90℃/5分钟。

[0105]图6显示了在不同pH下，对6％w/v乳铁蛋白溶液样品进行如下所示的压力处理或热处理后剩余的LF水平(％)：600MPa/5分钟、600MPa/15分钟、600MPa/30分钟、600MPa/45分钟或85℃/5分钟。结果表达为未处理的对照样品的乳铁蛋白水平的百分比。

[0106]图7的两幅图显示了7％w/v HI-WPC溶液样品在热处理或压力处理后剩余的生长因子(TGFβ1和TGFβ2)的水平。

[0107]图8的流程图概述了对照LF酸乳酪、热处理的LF酸乳酪和HPP处理的LF酸乳酪的制造过程。

[0108]图9显示了对照LF酸乳酪、热处理的LF酸乳酪和HPP处理的LF酸乳酪中剩余的LF水平。

[0109]图10的流程图概述了标准(热处理)酸性饮料、未处理的(对照)酸性饮料和HPP处理的酸性饮料的制造过程。

[0110]图11显示了对照酸性饮料、热处理的酸性饮料和HPP处理的酸性饮料中剩余的IgG水平。

[0111]图12的流程图概述了对照(未处理)LF果冻和HPP处理的LF果冻的制造过程。

[0112]图13显示了对照LF果冻和HPP处理的LF果冻中剩余的LF水平。

[0113]图14是显示人体外PBMC响应鼠李糖乳杆菌HN001(Lactobacillus rhamnosus HN001)(HN001)处理产生IFN-γ的箱线图，其中每一箱表示中位数(水平线)的上四分位间距和下四分位间距，垂直线表示总范围以及星号表示离散数据，图14显示了无HN001(仅培养基)培养的PBMC、用存活的HN001(HN001活)培养的PBMC、用热灭活的HN001(HN001热)培养的PBMC或用UHP灭活的HN001(HN001 UHP)培养的PBMC响应鼠李糖乳杆菌HN001(Lactobacillusrhamnosus HN001)处理产生IFN-γ的结果。

[0114]图15是显示了人体外PBMC响应HN001处理产生IL-10的箱线图。

[0115]图16的箱线图比较了人体外PBMC对在pH7.4的PBS缓冲液(UHP-pH7.4)中或在pH5.0的乙酸盐缓冲液(UHP-pH5.0)中经UHP(600MPa/3分钟)灭活的HN001的响应而产生IL-10和其对活HN001(活)或热灭活HN001(热)的响应而产生IL-10的对比。

[0116]图17是10张热处理(90℃/1分钟至4分钟-上排)的或压力处理(600MPa/1分钟至4分钟-下排)的补加疏水配体的7％w/vWPC样品的PAGE凝胶的照片。在每一凝胶中，每一道对应的处理时间如下所示：道1：未处理的对照；道2：1分钟；道3：2分钟；道4：3分钟；以及道5：4分钟。将高分子量聚集体标记为“(i)”、将IgG标记为“(ii)”和将乳铁蛋白标记为“(iii)”。

发明的简要描述

1.定义

[0117]关于生物活性组分的“活性”是指生物活性组分在摄取时具有生理活性，当通过任何方法(优选口服)对动物，特别是包括人类在内的哺乳动物进行给药时，该活性能够具有积极的健康效益。对不同生物活性组分活性的评定如下所示。

[0118]关于保留活性(retaining activity)是指压力处理的生物活性组分所保留的活性是未处理的对照的活性的至少约35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％，可用的范围可选自这些值中的任意值之间(例如，约35％至约100％、约50％至约100％、约60％至约100％、约70％至约100％、约80％至约100％以及约90％至约100％)。

[0119]在某些实例中，蛋白质活性与正确的蛋白质折叠相关。研究显示，UHT(超热处理的)乳中的天然LF和铁负载的LF的变性影响了其与不同种类细菌结合的能力并且降低了其相互作用的能力(Paulsson等人，1993)。因此，可使用分析技术来测定活性，该分析技术给出所关注的蛋白质的结构完整性的信号。诸如放射免疫扩散法(RID)、表面等离子共振法(SPR)和亲合性HPLC-MC等的免疫测定要求IgG在进行测量前保持完整。在酶联免疫吸收剂分析(ELISA)中，正确折叠的IgG或LF被抗体所束缚，并且能够使用酶联比色剂(enzyme-linked colorimetric agent)对其进行检测和显象。Li等人，2003中也提供了热处理的超免疫乳产品的生物活性丢失的信息。因此，某些实施方案中，通过在压力处理前或后测定蛋白质正确折叠的量来提供保留活性的评定。生物活性组分优选为蛋白质，并且优选通过如下所述的ELISA、流式细胞计、HPLC或BiaCore来评定保留活性。

[0120]脂质的生物活性与完整脂质或脂肪酸分子相关。对脂质组合物进行干馏(于120℃热处理15分钟)使所述组合物产生过量褐变(色变)，这是由于磷脂降解造成的。例如，将100g NZMP磷脂(PC 500)样品和200g的无水乳脂肪样品在600MPa下压力处理0分钟、3分钟或15分钟，或者将所述样品在120℃下干馏20分钟。干馏后，磷脂样品变为深褐色(未显示数据)。相反，压力处理的样品保持不变(未显示数据)。生物活性组分优选为脂质，并且优选通过气相色谱法(GC)或HPLC来测定保留活性。

[0121]可通过使用如下所述的ELISA、流式细胞计、HPLC或BiaCore，或者使用体外或体内分析测定合乎需要的肽的存在来测定水解物的保留的生物活性。

[0122]在一实施方案中，所述活性是益生活性。益生活性如下所述。所述生物活性组分优选为益生菌，并且优选通过PBMC分泌细胞因子检测法来测定益生活性。

[0123]本说明书和权利要求中所用术语“包含”指“至少部分由......组成”。当解释本说明书和权利要求中包含该术语的叙述时，在每一叙述中以该术语起始的特征都必须存在，但是其它特征也可以存在。诸如“包含(comprise)”和“包含(comprised)”的相关术语以相同方式来解释。

[0124]本发明所使用的术语“生物活性组合物”或“生物活性产品”或“生物活性成分”是指因存在生物活性组分而具有生物活性的组合物或产品或成分，其包括食品和食物成分。虽然优选的实施方案集中在食品和食物成分上，尤其集中在乳制品和乳品成分上，但是应当理解，本发明也用于处理任何包含生物活性组分的组合物或产品或成分，包括非食物的药品，例如口服给药或肠胃外给药的药品。还应理解，在某些实施方案中，所述生物活性产品为并入到其它产品中的成分。可用的食品或食物成分包括任何可食用产品或成分，其包括饮料(包括酸化饮料、碳酸饮料、消耗液体和凝胶)、营养药品和用于这些产品的成分。应当理解，在某些实施方案中，所述食品为并入到其它产品中的成分。所述生物活性组合物还可以是药物组合物。

[0125]所述组合物可以是液体，其包括固体在液体中形成的混悬液(包括糊或浆)。这类组合物的实例包括浓缩物(包括凝胶)、饮料(包括酸化饮料和碳酸饮料)、果冻或酸乳酪。

[0126]生物活性组合物的实例包括乳品蛋白组合物和诸如以上所描述的那些乳品成分。

[0127]本发明所使用的术语“生物活性组分”是指在摄取时具有生理活性的一种或多种蛋白质(包括天然产生的蛋白质或其变体，例如重组蛋白质、合成蛋白质以及修饰蛋白质)、一种或多种脂质(包括修饰脂质)、一种或多种蛋白水解物、一种或多种脂质水解物、一种或多种碳水化合物(包括修饰的碳水化合物)或其混合物，当通过任何方法(优选口服)对动物，特别是包括人类在内的哺乳动物进行给药时，该生物活性组分能够具有积极的健康效益。Sambrook等人，(1989)描述了重组蛋白的制备。

[0128]生物活性蛋白的实例包括但不限于乳铁蛋白、溶菌酶、免疫球蛋白(包括IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)、糖巨肽以及生长因子(包括乳衍生的生长因子，包括TGFβ1和TGFβ2)。

[0129]生物活性蛋白水解物的实例包括但不限于酪蛋白水解物，乳清蛋白水解物。该乳清蛋白水解物包括水解乳清，水解乳清蛋白浓缩物(WPC)，水解乳清蛋白分离物(WPI)或独立水解的乳清蛋白，例如α乳清蛋白、β乳清蛋白、蛋白胨、免疫球蛋白(包括IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)、糖巨肽、生长因子(例如TGFβ1和TGFβ2)、牛血清清蛋白、乳铁蛋白和乳过氧化物酶。其它实例包括如WO 99/65326和WO 02/19837中所描述的那些水解物、从乳清水解物中分离的ACE肽(如WO 02/19837中所描述的那些水解物)。蛋白水解物可按以下所描述的来制备。

[0130]生物活性脂质的实例包括但不限于非极性脂质和诸如磷脂、鞘脂、神经节苷脂和神经酰胺等的极性脂质。

[0131]含有至少一种生物活性蛋白、脂质、蛋白水解物、脂质水解物、或碳水化合物或其混合物的生物活性组合物的实例包括如以上所描述的乳品蛋白组合物和乳品成分。

[0132]生物活性组合物的实例还包括但不限于包含至少约1％w/w免疫球蛋白的组合物，其中所述免疫球蛋白包含一种或多种IgA、IgD、IgE、IgG和IgM；通过为提高抗体水平而对动物进行接种所制得的产品；以及免疫乳。

[0133]术语“停留时间”是指优选的实施方案，其中处理时间为将压力维持在处理压力的时间。例如，1分钟的停留时间是指所述压力在处理压力下维持1分钟。0分钟的停留时间(或“不停留”)是指将所述压力升高至处理压力但不停留，然后再返回至环境压力(通常为大气压)。在本实施方案中，优选的处理时间包括0分钟(不停留)、0.5分钟、1分钟、1.5分钟、2分钟、2.5分钟、3分钟、3.5分钟、4分钟、4.5分钟、5分钟、5.5分钟、6分钟、6.5分钟、7分钟、7.5分钟、8分钟、8.5分钟、9分钟、9.5分钟和10分钟。应当理解，虽然不特意使所述压力维持在处理压力，但是由于所使用设备的性质，可以有非常短的停留期(可能若干毫秒)。这种非常短的停留期不太可能对所述方法的实施具有实质上的影响。

[0134]本发明所使用的术语“保存性”是指随着时间的流逝，组合物抑制不想要的微生物生长的能力。未热处理的组合物或者非如本发明所提供的供选择的可接受方法处理的组合物不太可能具有商业上可接受的保存性。关于维持保存性是指本发明的方法在延长压力处理组合物的保存期上与热处理对照至少同样有效。关于提高(increasing)或提高(increased)、或改善(improving)或改善(improved)保存性是指与未处理组合物相比，所述组合物抑制不想要的微生物随着时间的流逝而生长的能力有所提高。提高的保存性优选地导致诸如延长的保存期和提高的耐温度变化能力等性质。温度变化(例如从冷藏库中取出)能够诱导任何残存的细菌的生长。

[0135]优选地，根据需氧菌平板计数(APC)来测定保存性。APC是用于估计样品中细菌密度的细菌计数方法，其还被称为总平板计数(Total Plate Count)、标准平板计数(Standard Plate Count)或总活菌数(Total Viable Count)。将样品采集、混合、稀释、并接种在适于检测待研究细菌(例如，食品或乳品污染物，例如大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙门氏菌(Salmonellae)、志贺菌(Shigellae)、大肠菌、酵母菌和霉菌、嗜温性孢子、嗜热性孢子)的琼脂培养基中。APC的结果是在32℃下接种并孵育72小时后1毫升样品中产生的集落生成单位数(cfu/ml)。对于不含有某些可存活的培养物的新鲜乳制品高度优选50,000cfu/ml或更小的APC。具有50,000cfu/ml或更高的APC的产品不太可能具有可接受的保存性，除非存在的生物体是特别适合于所述产品的生物体之一-后一类型的产品实例包括酸乳酪或发酵产品，其中可存活培养物是合乎需要的。

[0136]因此，在一实施方案中，优选的方法是其中在处理后的需氧菌平板计数(APC)小于或等于约100,000、75,000、50,000、25,000、10,000、5,000、1,000、100或10集落生成单位每毫升(cfu/ml)的方法。APC优选小于约50,000 cfu/ml。

[0137]术语“乳铁蛋白”指任何非糖基化或糖基化的野生型哺乳动物的，优选牛或人的乳铁蛋白氨基酸序列或其变体。

[0138]术语“乳衍生的生长因子”意在包括哺乳动物的乳或初乳中，优选牛乳或牛初乳中发现的任何生长因子，例如胰岛素样生长因子I(IGF-I)、胰岛素样生长因子II(IGF-II)、转化生长因子β1(TGF-β1)、转化生长因子β2(TGF-β2)、血小板衍生的生长因子(PDGF)和肝素结合生长因子。其还包括表皮生长因子。

[0139]术语“压力处理”指超高压力(UHP)处理。通常接受的这类处理所使用的压力至少为100MPa。这也被称为“高压”处理、“高静水压”(HHP)或“高压处理”(HPP)。“压力处理的”产品是那些经UHP处理的产品；即，在至少100MPa，优选在至少约350MPa、400MPa、450MPa、500MPa、600MPa、700MPa或800MPa(或在如上所述的范围内的其它值)的压力下压力处理。

[0140]术语“益生活性”指某些微生物刺激免疫系统的能力。本领域技术人员已知测量益生微生物活性的类型和水平的方法；参见，例如Mercenier等人，(2004)；Leyer等人，(2004)或Cummings等人(2004)。优选通过PBMC分泌细胞因子检测法来测定益生活性。

[0141]关于保持益生活性是指减毒益生微生物或被消灭的益生微生物仍具有有效的益生活性。虽然没有清楚指明负责介导益生活性的细菌分子，然而可能备选的分子包括细菌DNA基序、表面蛋白、小分子有机酸以及诸如脂磷壁酸和肽聚糖的细胞壁组分。假定这些分子与寄主免疫系统的组分相互作用，产生免疫调节效果。优选地，保留活性是未处理的对照的活性的至少约35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％，可用的范围可选自这些值中的任意值之间(例如，约35％至约100％、约50％至约100％、约60％至约100％、约70％至约100％、约80％至约100％以及约90％至约100％)。

[0142]术语“益生因子”指负责介导益生活性的细菌分子，包括但不限于细菌DNA基序、表面蛋白、小分子有机酸或诸如脂磷壁酸和肽聚糖等的细胞壁组分或其混合物。如上文所指出的，虽然这些分子没有被清楚地指明，但是如果存在益生生物体，则存在这类分子。

[0143]术语“个体”指动物，优选为哺乳动物、更优选为哺乳伴侣动物(mammalian companion animal)或人。伴侣动物优选包括猫、狗和马。

[0144]术语“不想要的微生物”指压力处理前可生长在组合物中的全部微生物。虽然这种生长是不合需要的，但是包括不能存活的微生物、减毒微生物或已死亡的微生物在内的微生物以不生长状态的存在可以是不影响结果的或合乎需要的。

[0145]关于防止不想要的微生物的生长是指基本上减缓、延迟或消灭诸如细菌(包括益生菌)、真菌、霉菌、酵母菌和藻类等微生物的生长。微生物并不全是导致酸败的原因或其不都是病原体。能够通过视觉检查或使用本领域公知的标准技术来评价不想要的微生物的生长，所述标准技术包括但不限于显微镜法、染色法、PCR、细胞分选法(cell sorting)等(参见Lund等人，2000)。压力处理后，组合物的APC优选小于或等于约100,000cfu/ml、75,000cfu/ml、50,000cfu/ml、25,000cfu/ml、10,000cfu/ml、5,000cfu/ml、1,000cfu/ml、100cfu/ml或10cfu/ml，优选小于约50,000cfu/ml。

[0146]如上所述，未热处理的或未压力处理的组合物不太可能具有商业上可接受的保存性。换句话说，由于没有采取步骤来防止不想要的微生物的生长，所以未处理组合物的保存性通常是不可接受的。当采取这样的步骤处理后，所述保存性将得到改善。小于或等于约100,000、75,000、50,000、25,000、10,000、5,000、1,000、100或10集落生成单位每毫升(cfu/ml)，优选小于约50,000cfu/ml的处理后需氧菌平板计数(APC)，将减缓、延迟或消灭任何存在的生物体对保存性的影响能力。结合低pH或结合冷藏(在低于约10℃，优选低于约4℃的温度下贮存)或结合这两种方法，将进一步减缓、延迟或消灭其影响保存性的能力。

[0147]在使用益生微生物的实施方案中，益生微生物的生长是不想要的，但是益生微生物的存在是合乎需要的。因此，在本实施方案中关于防止不想要的微生物的生长是指基本上减缓、延迟或消灭不想要的益生微生物的生长。优选地，压力处理将减弱益生微生物的毒性；或更优选地，压力处理将杀灭益生微生物，同时保持至少期望水平的益生活性。

[0148]在一实施方案中，益生微生物是失活益生微生物，然而其仍保持至少期望水平的益生活性。失活益生微生物可以是不能存活的、不能存活但仍具有代谢活性的或死亡的，然而在所有的情况中，其仍保持至少期望水平的益生活性。

[0149]在另一实施方案中，益生微生物在压力处理前是失活益生微生物。本实施方案中的压力处理防止了其它不想要的微生物的生长，同时使存在的益生因子保持益生活性。

[0150]术语“变体”指天然存在(例如等位基因变体)或非天然存在(例如人工产生的突变体)的蛋白质，其通过一种或多种氨基酸的增加、删除或取代而不同于蛋白质的主要野生型氨基酸序列。

[0151]通常，当根据下述实例进行测定时，蛋白质变体普遍具有定性的生物活性。此外，这些变体可共享的同一性为至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。术语“变体”的释义中还包括同源物。同源物通常为来自不同物种的蛋白质，但是基本上共享与初始蛋白质相同的生物功能或活性。

[0152]优选的变体蛋白质与野生型序列的同一性优选为至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％，优选为至少约90％、95％或99％。通过使用从NCBI(ftp:∥ftp.ncbi.nih.gov/blast/)公开获得的BLAST软件(2.2.12版；2005年8月28日)(Tatusova等人，(1999)；McGinnis等人，(2004))比较备选氨基酸序列能够测定同一性。

[0153]在不显著改变其生物活性的情况下，对一个或若干个氨基酸进行的保守置换也很有用。技术人员知道进行表型无声氨基酸置换的方法(参见例如Bowie等人，(1990))。

2.生物活性组合物的压力处理

[0154]本发明人指出，在一定条件下，对包含生物活性组分的生物活性组合物在达到商业上可用的保存性，同时保持生物活性组分的生物活性的条件下进行压力处理是可能的。在实施例1中，与热处理后丧失50％以上的活性相比较，在对生物活性产品(基于初乳的饮料)进行压力处理后，生物活性组分丧失仅4％以下的生物活性。

[0155]通过实例，可将根据本发明处理的生物活性组合物在压力处理的产品或成分中输送；添加到不再进行后续热处理的产品或成分中；或者添加到进行后续压力处理的产品或成分中。

[0156]本发明人还指出，进行压力处理的益生微生物保持刺激免疫系统的能力。因此，压力处理是防止益生微生物生长于该生长不合乎需要的应用中的可用的工具。

[0157]本发明人还指出，使用疏水配体能使生物活性组分在pH为约7.0，优选pH为约5.0至8.0下进行UHP处理，同时其所保持的活性水平比该配体不存在时所获得的活性水平高。

[0158]因此，如本文所描述的，本发明涉及维持或提高生物活性组合物的保存性，同时使至少一种存在于所述组合物中的生物活性组分至少保持在期望的活性水平的方法。本发明还涉及处理益生组合物以防止益生微生物生长，同时至少维持期望水平的益生活性的方法。

[0159]虽然压力处理不限于此，但是用于本发明方法的可用的压力处理优选包括以下步骤：

(i)将待压力处理的组合物放入压力容器的腔室内并密封该腔室；

(ii)将腔室内的压力升高至预设压力(“处理压力”)；

(iii)使腔室在该压力下保持预定的时间，包括小于1分钟(“停留时间”)；

(iv)释放腔室压力；以及

(v)取出压力处理的组合物。

[0160]可使用间歇处理或者连续处理设备遵照这样的方案进行。

[0161]应当理解，在处理过程中，压力处理可导致组合物或产品或成分的温度波动。因此，压力处理过程中所参考的优选温度是指升高压力前组合物的温度。

[0162]根据本发明预先确定所使用的处理压力的一种方法是选择生物活性组合物并将其置于适于控制一种或多种不想要的微生物的处理压力下进行处理。如果需要，出于测定的目的，可使用不想要的微生物来接种所述组合物。然后按照本文所述来测定生物活性组合物的保留生物活性。

[0163]根据本发明预先确定所使用的处理压力的另一方法是选择生物活性组合物并将其置于使至少一种生物活性组分至少保持在期望的活性水平的处理压力下进行处理。然后可根据本文所述来测定任何不想要的微生物的生长或生物活性组分的活性或上述两者，例如通过测定处理后的需氧菌平板计数。参见例如，Lund等人，(2000)的测定微生物生长的方法。还可以使用这些测定方法通过改变pH和停留时间确定防止不想要的微生物的生长并保留至少期望水平的生物活性的条件的联合，如下文所例示。

3.生物活性组分的生物活性

[0164]优选地，根据本发明方法处理或制备的生物活性组合物使至少一种生物活性组分至少保持在期望的活性水平。在一优选的实施方案中，期望的活性水平等于或大于对生物活性组合物进行热处理所保持的活性水平。例如，与未处理的对照中的生物活性组分的活性相比，生物活性组合物的热处理使至少一种生物活性组分保持至多34％的活性，如实施例1所示。相反，本发明的方法提供的生物活性组合物中至少保持约34％或更多活性的生物活性组合物，如实施例1中所示。对于某些生物活性组合物，热处理甚至更为有害。

[0165]因此，取决于应用，在一实施方案中，与未处理的对照中的生物活性组分的活性相比，优选至少保持约35％活性的至少一种生物活性组分。优选至少保持约35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％活性的至少一种生物活性组合物，优选的范围可选自这些值中的任意值之间(例如，约70％至约100％)。

[0166]在可供选择的实施方案中，优选地，生物活性组分所保持的活性是热处理的生物活性组分的至少约10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％，优选的范围可选自这些值中的任意值之间(例如，约100％至约400％)。

[0167]可通过公知的用于测定选定生物活性组合物的选定活性的方法来测定根据本发明进行压力处理前和压力处理后的生物活性组合物的生物活性，例如上文和下文中所描述的那些方法。

[0168]测量生物活性的可接受的方法的实例包括但不限于HPLC、基于细胞的测定、基于酶的测定、ELISA测定、流式细胞计量法(正成为ELISA之外的选择)、放射免疫测定和使用动物模型的体内测定。

[0169]例如，测量乳铁蛋白的生物活性的可接受方法包括但不限于色谱法(Palmano等人，2002)、包括ELISA在内的免疫技术(Desmazeau，1993)和生物传感器免疫测定法(Indyk等人，2005)。

[0170]如下文实施例中所述，可测定免疫球蛋白和生长因子的生物活性。

[0171]本领域技术人员已知测量益生微生物的生物活性的类型和水平的方法。参见，例如Mercenier等人，(2004)；Leyer等人，(2004)；Cummings等人，(2004)以及下文所描述的PBMC分泌细胞因子检测法。

4.生物活性组合物

[0172]乳汁不仅是婴儿的全部营养来源，而且提供生理上生物活性组分的丰富来源，因而被称为“天然药物”。除提供完整的营养之外，乳还在青少年的成长、保护和治疗恢复中起到重要的作用。健康的成年人通常仅需要乳的营养功效，但是对处于慢性疾病的疾病状态中的成年人，源自乳的生物活性在疾病的预防和治疗方面可提供更多。所述乳优选为绵羊乳、山羊乳、猪乳、鼠乳、水牛乳、骆驼乳、牦牛乳、马乳、驴乳、驼马乳、牛乳或人乳，以及更优选为牛乳。已知乳品蛋白质是免疫刺激物。

[0173]初乳是在标准乳的产生开始之前，分娩后立即产生的头乳(pre-milk)。来自母牛的最佳的初乳在产犊后第一个6小时内获得，但能够在产犊后的前两天里采集初乳。最佳的初乳与分娩约48小时后同一奶牛的乳中所发现的相比通常含有两倍以上的乳固体物，以及4倍的蛋白质。最佳的初乳中的消化酶、免疫球蛋白(包括IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)、细胞活素、干扰素、生长因子、糖蛋白、富含脯氨酸的肽以及维生素A、D、E和K的浓度均比标准乳高。可按照Elfstrand等人，2002所描述的方法来制备初乳蛋白浓缩物(MPC)和初乳乳清蛋白浓缩物(WPC)。

[0174]乳和初乳衍生物和其制造方法是本领域公知的。通常通过联合离心法(为了除去脂肪)、酪蛋白沉降法(使用酸或酶)、过滤法(为了除去乳糖、矿物质和水，或任选地除去蛋白质)、色谱法(为了纯化蛋白组分)来获得这些衍生物，这些衍生物包括重组的或新鲜的全脂乳、重组的或新鲜的脱脂乳、再生的全脂或脱脂奶粉、脱脂乳浓缩物、脱脂乳分离物、全脂奶粉或脱脂奶粉、脱脂乳渗余物、炼乳、酪乳、超滤乳渗余物、乳蛋白浓缩物(MPC)、乳蛋白分离物(MPI)、脱钙乳蛋白浓缩物、脱钙乳蛋白分离物、低脂乳、低脂乳蛋白浓缩物、低脂乳蛋白分离物、初乳、初乳分馏物、初乳蛋白浓缩物(CPC)、初乳乳蛋白浓缩物、初乳乳蛋白分离物，初乳乳清、初乳乳清蛋白浓缩物，初乳乳清蛋白分离物、来自初乳的免疫球蛋白分馏物、乳清、乳清蛋白浓缩物(WPC)、乳清蛋白分离物(WPI)、甜乳清、乳酸乳清、无机酸乳清、再生的乳清粉、源自任何乳或初乳工业生产液流的组合物、源自通过任何乳或初乳工业生产液流的超滤或微过滤所获得的渗余物或渗透物的组合物、或源自通过任何乳或初乳工业生产液流的色谱分离所获得的穿透的或吸附的分馏物的组合物、或这些组合物中任一组合物的全部或部分水解物或其混合物。参见例如Dairy Processing Handbook(乳制品加工手册)(Tetra Pak Processing Systems，Lund，Sweden，1995)。其它的这类衍生物包括上述的乳品蛋白组合物和乳品成分。

[0175]乳中发现的蛋白质包括免疫球蛋白(包括IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)、生长因子、牛血清白蛋白(BSA)、α乳白蛋白、β乳球蛋白和大量酪蛋白，它们全部是磷蛋白。除酪蛋白以外，这些蛋白还存在于乳清中。已知乳包含多种有丝分裂蛋白和可直接涉及骨再建的蛋白。通过阳离子交换色谱法可从乳或乳清中回收生长因子(IGF-胰岛素样生长因子、TGF-转化生长因子等)、免疫球蛋白(包括IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)、BSA和某些β乳球蛋白。某些生长因子作为中性蛋白被回收。酪蛋白糖巨肽(CGMP)是可通过阴离子交换回收的的酸性蛋白片断。骨桥蛋白是存在于所有体液(包括乳)中的高度磷酸化和糖基化的蛋白质。

[0176]CGMP是在乳酪制作过程的粗质凝乳酶介导的酪蛋白凝固步骤(通过凝乳酶的作用)中由，κ-酪蛋白释放的肽，该肽存在于称作甜乳清或乳酪乳清的乳清片段中。CGMP有时简单地被称作GMP(糖巨肽)。乳酪乳清蛋白包含15-20％的CGMP。如WO 00/49885所报道的，CGMP被提出作为一种乳中的骨健康促进成分。

[0177]通过用乳酸菌发酵或者通过在酪蛋白酸盐或农家干酪(cottage cheese)和意大利乳清干酪的制造过程中，直接加入乳酸来生产乳酸乳清。通过在酪蛋白酸盐制造过程中加入无机酸来生产无机酸乳清。乳酸乳清和无机酸乳清不包含CGMP。这两种方法的原理是将pH降至约4.6使酪蛋白沉淀，而不是使用凝乳酶的作用形成沉淀。因此，任何未暴露在凝乳酶中的乳制品不含CGMP。

[0178]乳清是乳酪或酪蛋白制造的副产品，源自乳清的蛋白产品可基于其蛋白含量进行分类，其包括含有至少30％蛋白的乳清蛋白浓缩物(WPC)，至含有至少90％蛋白的乳清蛋白分离物(WPI)(Huffman，1996；IDF，1998)。薄膜超滤和膜渗滤(diafiltration)通常用于这类产品的制造，以便在干燥前将乳清蛋白浓缩并纯化至25％-35％的固体，在本领域中将源自薄膜超滤步骤的蛋白浓缩物称为渗余物。乳清蛋白是包含若干个独立蛋白质(包括但不限于α乳清蛋白、β乳清蛋白、

蛋白胨、免疫球蛋白(包括IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)、糖巨肽、生长因子(例如TGFβ1和TGFβ2)、牛血清白蛋白、乳铁蛋白和乳过氧化物酶)的集合术语，并且在本发明中可包括全体乳清蛋白或其片段。Zadow(1992)和Sienkiewicz等人(1990)描述了适于乳清的工业生产的方法。生产WPC和WPI的方法是本领域公知的并且在US Dairy ExportCouncil Reference Manual for U.S.Whey and Lactose Products．Chapter7：Whey Products-Definition，Composition，Functions(美国乳清和乳糖产品的美国乳品出口协会参考手册，第七章：乳清产品一定义、组合物、功能)；Page，J.，Meyer，D.，Haines，B.，Lagrange，V.和Kenney,A.(Eds)，American Dairy Products Institute(美国乳制品研究所)，Elmhurst，IL，USA，(2004年6月)(还可从http:∥www.usdec.org/files/pdfs/US08D_04.pdf在线获得)中对其进行了讨论。还可参见Dairy Processing Handbook(乳制品加工手册)(TetraPak Processing Systems，Lund，Sweden，1995)。已知乳品蛋白质是免疫刺激物。

[0179]通过使用来自病原体的抗原使产生孕育乳(pregnant milk)的哺乳动物免疫以提高该初乳和乳中的特异性抗体来制备超免疫乳和超免疫初乳(参见Korhonen等人，2000中这类方法的综述)。根据上文参考的公知方法可制备超免疫产品的蛋白浓缩物。超免疫乳和超免疫初乳是公知的免疫刺激物(Korhonen等人，2000)。超免疫乳和超免疫初乳可像普通的乳和初乳一样处理，产生下列衍生物，例如超免疫乳蛋白浓缩物、超免疫乳蛋白分离物、超免疫乳清、超免疫乳清蛋白浓缩物、超免疫乳清蛋白分离物、超免疫初乳、超免疫初乳乳蛋白浓缩物、超免疫初乳乳蛋白分离物、超免疫初乳乳清、超免疫初乳乳清蛋白浓缩物、或超免疫初乳乳清蛋白分离物，或其混合物。

[0180]乳铁蛋白是存在于哺乳动物乳和初乳中的80kDa的铁结合的糖蛋白。牛乳和牛初乳中的乳铁蛋白浓度分别为大约0.2mg/ml和1.5mg/ml。它具有多种生物学功能，包括对铁代谢、免疫功能和胚胎发育的调节。乳铁蛋白对一批病原体具有抗微生物活性，包括革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌、酵母菌和真菌。乳铁蛋白的抗微生物作用基于其结合铁的能力，而铁对于病原体的生长是必需的。乳铁蛋白还抑制若干种病毒的复制，并且其还通过结合细菌膜上脂多糖的脂质A组分来增加某些细菌对抗生素和溶菌酶的敏感性。

[0181]通过阳离子交换色谱，然后通过超滤和渗滤可从乳中分离乳铁蛋白。除野生型乳铁蛋白自身外，可用的变体还包括牛乳铁蛋白变体bLf-a和bLf-b(Tsuji等人，(1989)；Yoshida等人，(1991))。可用的变体还包括糖基化和非糖基化形式的乳铁蛋白(Pierce等人，(1991)；Metz-Boutigue等人，(1984)；van Veen等人，(2004))以及糖基化突变体(具有不同的糖基化位点或不同的糖基侧链)。可用的乳铁蛋白片段包括N叶片段和C叶片段(Baker等人，2002)和保留乳铁蛋白结合袋的任何其它乳铁蛋白多肽，例如截短的乳铁蛋白多肽。还可以通过公知的合成方法来产生乳铁蛋白的变体或片段(例如参见Kimmerlin等人，2005)。或者，乳铁蛋白多肽或其功能性变体或片段能够通过已确立的合成Fmoc化学法来产生，如Viejo-Diaz等人，(2003)所描述的人kaliocin-1和乳铁蛋白肽衍生的肽；以及Nguyen等人，(2005)所描述的牛乳铁蛋白肽(lactoferricin peptide)；以及van der Kraan等人，(2004)所描述的Lactoferrampin和更短片段。

[0182]下述是从牛乳中分离乳铁蛋白的示例性程序。新鲜的脱脂乳(7L，pH6.5)在4℃下以5ml/分钟的流速通过用超纯水(milli Q water)平衡的300ml的S Sepharose Fast Flow柱。用2.5倍床体积的水洗去未结合蛋白，并用约2.5倍床体积的、浓度分别为0.1M、0.35M和1.0M的氯化钠将结合蛋白逐步洗脱。收集1M氯化钠洗脱所得的粉红乳铁蛋白条带作为单一片段，并用超纯水透析，然后冻干。将该冻干粉溶解在25mM、pH6.5磷酸钠缓冲液中，并在S Sepharose Fast Flow柱中，以3ml/分钟的流速、使用上述缓冲液中至1M的氯化钠梯度进行再层析。将含有经过凝胶电泳和反相HPLC分析确定具有足够纯度的乳铁蛋白的片段合并在一起，透析并冻干。在pH8.6、含0.15M氯化钾的80mM磷酸二钾溶液中，通过在Sephacryl 300上进行凝胶过滤得到最终纯化的乳铁蛋白。合并所选择的片段，用超纯水透析并冻干。HPLC分析结果和对于铁饱和形式的乳铁蛋白其光谱比值(280nm/465nm)为～19或更低的事实表明该制备所得的乳铁蛋白纯度大于95％。

[0183]通过选择合适的具有已知特异性裂解的酶，例如胰蛋白酶、糜蛋白酶，并通过pH值、温度、孵育时间以及酶和底物的比例来控制/限制蛋白质水解能够制备水解物。使用特异性内肽酶能够对这样分离的肽进行精制。通常，SDS-PAGE可用于通过将水解物与分子量标准对比来估计水解程度。大小排阻层析可用于分离水解物中的不同种类，并估计分子量的分布情况(distribution profile)。蛋白水解物，尤其是乳品蛋白水解物是公知的免疫刺激物。

[0184]通过实例，按照本发明处理的组合物或产品可传输至压力处理的产品或成分中；加入至不再进行后续热处理的产品或成分中；或加入至进行后续压力处理的产品或成分中。

[0185]为了降低对存在于按照本发明处理的组合物中的蛋白质的不想要的影响，在所述组合物是液体的某些实施方案中，加入稳定剂是合乎需要的。例如，为了稳定任何存在于该组合物中的酪蛋白。因此，在一实施方案中，所述组合物还包含稳定剂，例如选自下列的胶质：槐豆胶、瓜尔胶、黄原胶、肉桂胶、魔芋粉、β葡聚糖、他拉胶、阿拉伯树胶(gum Arabic)、结冷胶、羧甲基纤维素、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、黄蓍胶、刺梧桐胶、阿拉伯树胶(gum acacia)、壳聚糖、arabinoglactins、藻酸盐、果胶、角叉菜胶、或欧车前或其混合物。稳定剂优选为果胶或羧甲基纤维素(CMC)。根据需要，按照本发明的方法处理的组合物优选包含约0.01％、0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％w/v或更高的稳定剂。

[0186]为了使生物活性组分在约中性pH下稳定，在某些实施方案中，一种或多种疏水性配体包含在所述组合物中是合乎需要的。疏水性配体的存在允许生物活性组分在约pH7.0下，优选在约pH5.0至pH8.0下进行压力处理，同时其所保持的活性水平比在缺少该配体下易于获得的生物活性组分的活性水平高。不希望被理论限制，申请人相信这些配体在该生物活性组分中与疏水袋(hydrophobic pocket)结合，在压力处理过程中，降低了其对变性的敏感性。因此，在某些实施方案中，所述组合物还包含一种或多种选自下列的疏水性配体：十六酸、肉豆蔻酸、亚麻油酸、共轭亚油酸(CLA)、一种或多种磷酯、一种或多种缩醛磷脂酰胆碱、一种或多种鞘磷脂、一种或多种神经节苷酯、丁酸、一种或多种ω-3脂肪酸(包括但不限于二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA))、一种或多种植物甾醇、一种或多种植物甾醇酯、一种或多种植物甾醇乙酸酯、一种或多种ω-6脂肪酸(包括但不限于鱼油)、脂溶性疏水维生素(包括维生素A[视黄醇]和维生素D)、番茄红素、或十二烷基硫酸钠或其混合物，这是合乎需要的。在本实施方案中，组合物的pH优选为约5.0至8.0。

[0187]本发明使用的产品配方的实例包括饮料(包括酸化饮料和碳酸饮料)、酸乳酪和果冻。这些产品可按照下文所述的方法配制，并按照上文和实施例中所述的方法进行评价。因此，本发明还涉及包含约0.1mg/ml至1000mg/ml的乳铁蛋白和小于约50,000cfu/ml的微生物的压力处理的组合物，以及包含约1mg/ml至1000mg/ml的乳铁蛋白和小于约50,000cfu/ml的微生物的压力处理的组合物。本发明还涉及包含约0.1mg/ml至1000mg/ml的IgG和小于约50,000cfu/ml的微生物的压力处理的组合物，以及包含约1mg/ml至1000mg/ml的IgG和小于约50,000cfu/ml的微生物的压力处理的组合物。所述组合物可以是压力处理的果冻、压力处理的酸乳酪或压力处理的饮料。通过本发明描述的方法可测定乳铁蛋白或IgG浓度以及微生物计数。

[0188]本发明还涉及如上文所述的包含一种或多种不能存活的益生微生物培养物和小于约50,000cfu/ml的微生物的压力处理的组合物。通过本发明描述的方法可确定微生物计数。在一实施方案中，组合物包含至少约0.1mg/ml，优选约0.1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、100mg/ml、200mg/ml、200mg/ml、400mg/ml、500mg/ml、600mg/ml、700mg/ml、800mg/ml、900mg/ml或1000mg/ml的生物活性组分，可用的范围可选自这些值中的任意值之间(例如，约0.1mg/ml至1000mg/ml、约1mg/ml至1000mg/ml、约2mg/ml至1000mg/ml、约3mg/ml至1000mg/ml、约4mg/ml至1000mg/ml、约5mg/ml至1000mg/ml以及约10mg/ml至1000mg/ml)。

[0189]参照以下实施例，现对本发明的各个方面以非限制性方式来进行说明。

实施例

[0191]所有乳制品得自Fonterra Co-operative Group Limited，NewZealand。就热处理而言，将4ml样品移至8ml的具螺旋帽的Wheaton玻璃瓶中，使之在30℃下平衡约5-10分钟，然后将其浸入到油浴中，维持在75℃或85℃，并震动10分钟，然后在冰中快速冷却10分钟。在4℃下贮存样品直至分析。

样品分析

[0192]使用一种或多种选自目测法、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、HPLC、BiaCore或ELISA的技术来测定作为热处理或压力处理结果的IgG、IgM、IgA、生长因子或LF的定性和定量变化。还就压力处理前以及压力处理后各种微生物的存在(包括需氧菌平板数、大肠菌数、酵母菌和霉菌数、嗜温性孢子数、嗜热性孢子数以及其它)对样品进行测定。

1.ELISA：根据制造商的说明书执行。

2.HPLC-MC：通过Copestake等人，2006所描述的HPLC-MC方法将样品稀释并对其进行分析。酪蛋白能够干扰由HPLC分析的IgG的精确度。为了确立对初乳产品的IgG分析的更精确以及可再现的方法，使用预先除去酪蛋白的高性能液相色谱法(HPLC-负离子酪蛋白(minuscasein)或HPLC-MC)。这确保了所测量的IgG浓度更接近地反映了RID、SPR和其它免疫测定法的测量。

3.BiaCore：将样品稀释在PBS缓冲液中并使用Indyk和Filonzi(2005)所描述的BiaCore仪对其进行分析。通过参考标准曲线而获得定量，所述标准曲线是使用高纯度牛乳铁蛋白或IgG而建立的。

4.PAGE：使用Manderson等人(1998)所描述的方法对所选样品(还原性的和非还原性的)进行十二烷基硫酸钠(SDS)PAGE测定。

5.微生物分析：按照NZTM2 43.1-APC(需氧菌平板计数)；NZTM248.1-大肠菌数；NZTM2 60.1-嗜热菌数(thermophilic count)；NZTM259.1-嗜温性孢子数；以及NZTM2 61.1-酵母菌和霉菌数来进行微生物分析，所有方法均来自NZTM 2：New Zealand Dairy IndustryMicrobiological Methods Manual (NZTM 2：新西兰乳品加工业微生物方法手册)(Publishing Solutions Limited，P.O.Box 983，Wellington，NewZealand)，基于International Dairy Federation(国际乳品业联合会)和AOAC International methods(AOAC国际方法)。

实施例1：含有初乳成分的溶液

[0193]将含有80％蛋白(以及6.6％免疫球蛋白)的初乳乳蛋白浓缩物粉末(Fonterra Co-operative Group Limited)溶于水中并用乳酸将pH调节至3.5，得到3.6％的蛋白溶液。然后分别在83.5℃或600MPa下对溶液样品进行热处理或压力处理，保持3分钟，通过HPLC测量经处理的饮料中免疫球蛋白的量，并与未处理溶液中免疫球蛋白的量进行比较。结果如图1所示。来自Stansted Fluid Power Ltd，UK的HPP装置用于全部实施例。

实施例2：含有初乳MPC成分的溶液

[0194]将初乳MPC溶于0.3％w/v的果胶溶液中来制备6％w/v的初乳MPC的原液。对初乳原液样品进行酸化得到一系列pH值，并且在85℃下对其进行热处理并保持10分钟或如下文所述对其进行压力处理。通过HPLC-MC测定相同pH下每一热处理样品或压力处理样品相对于未处理对照的剩余免疫球蛋白G(IgG)。在600MPa进行压力处理后还可使用大肠杆菌、酵母菌和霉菌感染溶液并对这些生物体进行计数。

[0195]在pH3.3下，与热处理的初乳保留2％的IgG相比，在400MPa下进行压力处理并保持3分钟的初乳样品保留67％的IgG。

[0196]在pH4.1下，与热处理的初乳保留2％的IgG相比，在600MPa下进行压力处理并保持3分钟的初乳样品保留37％的IgG。

[0197]在pH3.5下，与热处理的初乳保留2％的IgG相比，在600MPa下进行压力处理并保持3分钟的初乳样品保留34％的IgG。

[0198]在pH4.1下，与热处理的初乳保留2％的IgG相比，在500MPa下进行压力处理并保持1分钟的初乳样品保留91％的IgG。

[0199]如表1A所总结的，在pH4.1下，与热处理的初乳保留2％的IgG相比，在400MPa、500MPa和600MPa下进行压力处理并未停留的初乳样品在400MPa下保留100％的IgG、在500MPa下保留91％的IgG以及在600MPa下保留48％的IgG。比较这些样品的微生物量并总结于表1A。根据需氧菌平板计数(APC)法得到未处理的对照制品具有9×10³cfu/mL的大肠菌数，估计100cfu/mL的嗜温性孢子数以及大于1×10⁶ cfu/mL的酵母菌/霉菌和集落。与之相比，在500MPa或600MPa下压力处理且不停留的样品中未检出大肠菌或酵母菌/霉菌。在600MPa下，未检出嗜温性孢子或APC。在500MPa下，有估计20cfu/mL的嗜温性孢子和27cfu/mL的APC。在400MPa下，有估计40cfu/mL的嗜温性孢子和2100cfu/mL的APC。

[0200]表1B显示了600MPa下，跨pH范围的剩余免疫球蛋白活性以及大肠菌数、酵母菌数和霉菌数。

表1A：HPP的6％w/v的MPC样品(pH4.1)的剩余IgG和APC

压力	剩余IgG％	APC[cfu/mL]
压力	剩余IgG％	APC[cfu/mL]	未处理	100	＞1,000,000^*
400MPa/不停留	100	2100	未处理	100	＞1,000,000^*
400MPa/不停留	100	2100	500MPa/不停留	91	27
600MPa/不停留	48	未检出	500MPa/不停留	91	27

^*pH调节前测定

表1B：在不同停留时间和pH值、600MPa下，压力处理后的剩余免疫球蛋白活性和微生物数

pH	停留时间(分钟)	IgG[％]	大肠菌数[cfu/mL]	酵母菌/霉菌数[cfu/mL]
pH	停留时间(分钟)	IgG[％]	大肠菌数[cfu/mL]	酵母菌/霉菌数[cfu/mL]	6.8	未处理	100	18,000,000^*	300,000^*
3.3	0	40	未检出	未检出	6.8	未处理	100	18,000,000^*	300,000^*

	123	333335	未检出未检出未检出	未检出未检出未检出
	123	333335	未检出未检出未检出	未检出未检出未检出	3.5	0123	45363634	未检出未检出未检出未检出	未检出未检出未检出未检出
3.8	0123	55403834	未检出未检出未检出未检出	未检出未检出未检出未检出	3.5	0123	45363634	未检出未检出未检出未检出	未检出未检出未检出未检出
3.8	0123	55403834	未检出未检出未检出未检出	未检出未检出未检出未检出	4.1	0123	48644037	未检出未检出未检出未检出	未检出未检出未检出未检出

^*感染的

实施例3：不同pH下的初乳MPC成分

将来自实施例2原液的初乳样品酸化到pH3.5至4.1，在400MPa至600MPa(不停留)下压力处理，并与热处理的制剂进行比较。在所有的情况下，与压力处理后保留45％-100％的剩余IgG相比，热处理后保留的剩余IgG为约2％。pH越高，剩余IgG越高。结果总结于表2。

表2：热处理或压力处理的6％w/v的初乳MPC的剩余IgG(％)

压力	pH3.5	pH3.8	pH4.1
压力	pH3.5	pH3.8	pH4.1	未处理	100	100	100
85℃/10分钟	2	2	2	未处理	100	100	100
85℃/10分钟	2	2	2	400MPa/不停留	75	92	100
500MPa/不停留	54	73	91	400MPa/不停留	75	92	100
500MPa/不停留	54	73	91	600MPa/不停留	45	56	48

实施例4：不同成分的效果

通过HPLC-MC来分析在不同pH值下进行热处理(85℃/10分钟)和压力处理(600MPa/3分钟停留)的由部分初乳成分制备的初乳溶液的剩余IgG活性。结果如图2所示，(A)初乳乳清(CW)、(B)初乳乳清UF渗余物(CWUFR)(使用具有10kDa分子量截留值的UF膜对凝乳酶乳清进行超滤)、(C)初乳脱脂奶粉以及(D)初乳MPC。在热处理制品中的剩余IgG量始终低于10％。

[0203]与用其它成分配制的溶液相比，初乳乳清UF渗余物成分(图2B)在压力处理后显示较大的IgG损失。然而，在pH5.2或更低时，压力处理的初乳脱脂奶粉制剂中仍保持可用的IgG水平。

[0204]在pH5.2或更低时，在所有的其它压力处理的制剂中基本上保留了IgG水平。特别是在pH4.1或更低时的初乳脱脂奶粉制剂(图2C)和初乳MPC制剂(图2D)，以及在pH3.8时的初乳乳清制剂(图2A)，其剩余的IgG均大于约90％。初乳乳清在pH6.7时的剩余IgG水平(图2A)也在可用的水平(约70％)。

实施例5：来自超免疫(HI)初乳的成分

[0205]配制两份7％w/v的超免疫(HI)初乳原液，一份用超免疫初乳乳蛋白浓缩物(HI-MPC)来配制，一份用超免疫初乳乳清蛋白浓缩物(HI)来配制。将这些原液样品调节至pH4.6，并且在85℃下热处理，维持10分钟；或在600MPa下压力处理，不停留；或在600MPa下压力处理，维持3分钟。在处理和计数前，将样品在环境温度下贮存一周以进行微生物计数。测定所选择的生物活性蛋白的剩余水平，如前所述，用ELISA和乳铁蛋白BiaCore测定免疫球蛋白IgG、IgA以及IgM。用需氧菌平板计数(APC)法对微生物进行计数，如表3所示。在400MPa下并且不停留的处理后，HI-MPC的APC减少了4个对数级，HI-WPC的APC减少了3个对数级。在600MPa下并且维持3分钟的处理后，HI-MPC的APC减少了5.8个对数级，HI-WPC的APC减少了大于5.6个对数级。

[0206]然后将处理后的样品在20℃下维持6周，再进一步进行计数以测定感染的微生物的生长。这些结果如表4所示。图3显示了剩余的生物活性蛋白水平(所示的pH均为4.1)。

[0207]在85℃下热处理10分钟的样品中保留非常少(2％-3％)的剩余IgA。相反，压力处理的样品具有高得多的剩余IgA活性(80％-85％的剩余IgA)。

[0208]对IgM观察到几乎相似的趋势，显示与在600MPa下不停留或600MPa下维持3分钟的压力处理后的样品的剩余IgM活性大于95％相比，热处理样品的剩余IgM活性(保留约1％的剩余IgM)仅为可忽略的量。

表3：压力处理和热处理的HI-MPC和HI-WPC的APC[cfu/ml]

成分	对照	400MPa不停留	600MPa维持3分钟	85℃维持10分钟
成分	对照	400MPa不停留	600MPa维持3分钟	85℃维持10分钟	HI-MPC pH4.6	18,000,000	460	30	未做
HI-WPC pH4.6	370,000	300	未检出	未做	HI-MPC pH4.6	18,000,000	460	30	未做
HI-WPC pH4.6	370,000	300	未检出	未做	HI-MPC pH6.9	18,000,000	25,000,000	54,000	7
HI-WPC pH6.9	370,000	1,600	20	2	HI-MPC pH6.9	18,000,000	25,000,000	54,000	7

表4：表3的样品在20℃下维持6周后的APC[cfu/ml]

成分	对照	400MPa不停留	600MPa维持3分钟	85℃维持10分钟
成分	对照	400MPa不停留	600MPa维持3分钟	85℃维持10分钟	HI-MPC pH4.6	变质	10	10	10
HI-WPC pH4.6	变质	20	未检出	未检出	HI-MPC pH4.6	变质	10	10	10
HI-WPC pH4.6	变质	20	未检出	未检出	HI-MPC pH6.9	变质	变质	变质	变质
HI-WPC pH6.9	变质	变质	50	未检出	HI-MPC pH6.9	变质	变质	变质	变质

实施例6：低pH对生物活性的影响

[0209]通过将适量的WPC粉末溶解在超纯水中来制备7％w/v的商用乳清蛋白浓缩物(WPC)溶液。将每一溶液的pH分别调节至3.8、5.2、6.0、6.7和7.5，然后在600MPa下压力处理该溶液，维持3分钟或在75℃下热处理该溶液，维持5分钟，使用如前所述的BiaCore法分析剩余IgG和乳铁蛋白含量。结果如图4所示。

[0210]剩余IgG活性在热处理样品中的范围是5％至35％。相反，在600MPa下压力处理3分钟的样品(图4A)显示50％-95％的剩余IgG。与在高pH(例如pH6.7或更高)下进行压力处理的样品相比，在低pH下进行压力处理的样品显示相对较高的剩余IgG。类似地，与在600MPa下压力处理维持3分钟的样品中60％-90％的剩余乳铁蛋白活性相比，热处理的WPC溶液中剩余乳铁蛋白活性为5％和70％(图4B)。与在高pH(例如pH6.0或更高)下进行压力处理的样品相比，低pH下进行压力处理的样品显示相对较高的剩余LF(％)。

实施例7：在pH4.0下乳铁蛋白是高度耐压的

[0211]图5显示了在400MPa下，压力处理5分钟至50分钟的稀LF溶液(0.2％w/v，pH4.0)的非还原性SDS PAGE(道1：未处理的对照；道2：400MPa/5分钟；道3：400MPa/10分钟；道4：400MPa/20分钟；道5：400MPa/30分钟；道6：400MPa/40分钟；道7：400MPa/50分钟)。凝胶显示，在400MPa下，延长压力处理前后的LF的谱带强度(band intensity)基本上保持不变。这些结果显示，即使延长对所述溶液的压力处理时间，LF在该压力下还是高度耐压的。

实施例8：在不同pH下含有乳铁蛋白的溶液

[0212]将乳铁蛋白粉末溶解在超纯水中并轻轻搅拌2-3小时来制备乳铁蛋白溶液(6％w/v)。将该溶液调节至pH3.3、3.8、4.1或7.0，并分别进行压力处理(600MPa维持至多45分钟)或热处理(85℃维持5分钟)。用BiaCore法测定剩余的乳铁蛋白并示于图6。乳铁蛋白溶液的颜色可表征蛋白质铁结合能力，该能力可被处理逆向影响。天然乳铁蛋白的6％溶液为约15％铁饱和的，且为深橙色，而铁饱和度为0％的脱乳铁蛋白溶液是无色的。在pH3.8、4.8和7.0时，同样用还原性SDS-PAGE和非还原性SDS-PAGE对压力处理的溶液(600MPa，维持5分钟或30分钟)和热处理的溶液(85℃或90℃维持10分钟)进行比较。

[0213]在pH7.0、75℃或更高的温度下进行5分钟的热处理后，剩余的乳铁蛋白很少。在3.3至4.1的pH范围加热的样品显示较高的剩余乳铁蛋白(图6)，而在600MPa下，压力处理一定的停留时间后，剩余乳铁蛋白含量在同样的pH值下始终保持很高。

[0214]与未处理的对照相比，在75℃下热处理5分钟，在3.8-7.0的pH范围导致颜色显著变浅，表明铁结合的或定向铁结合的乳铁蛋白减少(表5)。应注意，在pH3.3时，乳铁蛋白的铁结合能力降低。在85℃或更高的温度下热处理5分钟导致所述pH范围内的颜色显著变浅。在pH7.0时形成厚沉淀，这表明大部分的乳铁蛋白已变性。

表5：热处理作为pH的函数对天然乳铁蛋白的影响

处理条件：	pH：
	pH：					3.3	3.8	4.0	5.2	7.0
	对照	透明	++	++	+++	3.3	3.8	4.0	5.2	7.0	+++
75℃/5分钟	对照	透明	++	++	+++	透明	几乎透明	+	++	++	+++
75℃/5分钟	85℃/5分钟	透明	透明	透明	透明	透明	几乎透明	+	++	++	厚ppt
90℃/5分钟	85℃/5分钟	透明	透明	透明	透明	透明	透明	透明	透明	厚ppt	厚ppt

“+”符号表示肉眼观察到的颜色深度。“+”符号越少表明铁结合越少。

[0215]相反，与未处理的对照相比较，在600MPa下压力处理至多45分钟未造成颜色变化或混浊，除了pH3.8和pH4.0的那些样品，其颜色与较高pH值的溶液相当(表6)。

表6：压力处理作为pH的函数对天然乳铁蛋白的影响

处理条件：	pH：
	pH：	3.3	3.8	4.0	5.2	7.0

对照	透明	++	++	+++	+++
对照	透明	++	++	+++	+++	600MPa/5分钟	透明	+++	+++	+++	+++
600MPa/10分钟	透明	+++	+++	+++	+++	600MPa/5分钟	透明	+++	+++	+++	+++
600MPa/10分钟	透明	+++	+++	+++	+++	600MPa/30分钟	透明	+++	+++	+++	+++
600MPa/45分钟	透明	+++	+++	+++	+++	600MPa/30分钟	透明	+++	+++	+++	+++

[0216]根据上文提到的SDS-PAGE凝胶(未显示)，热处理的溶液有聚合和聚集的迹象，或在分离凝胶的起点捕获，或在堆积凝胶内捕获，或作为根本不进入凝胶的大聚合物。在pH3.8和pH4.8时存在无法渗入到非还原性凝胶中，且不存在于还原性凝胶中的聚集物。这表明该聚集是由热诱导的聚合产生的。在pH7时保留的乳铁蛋白几乎无法测量。相反，压力处理的溶液显示其与未处理的对照几乎没有变化。

[0217]还用酵母菌和霉菌感染调节至pH3.3、3.8、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0的乳铁蛋白溶液(6％w/v)，然后在600MPa下压力处理0分钟、5分钟和15分钟。未处理的对照中的酵母菌和霉菌计数和压力处理后样品中的酵母菌和霉菌计数显示，未处理的对照的酵母菌和霉菌数为190,000(cfu/ml)，而在所研究的全部压力处理和全部pH范围中进行压力处理后的样品中未检出酵母菌和霉菌。

实施例9：含有生长因子的溶液

[0218]在pH6.9时，通过将HI-WPC粉末溶解在超纯水中来制备HI-WPC(7％w/v)溶液。然后在600MPa下对该溶液进行压力处理且不停留，或在600MPa下对该溶液进行压力处理且维持3分钟，或在85℃下对该溶液进行热处理10分钟。相对于未处理的对照，对压力处理和热处理的样品的两种主要牛初乳生长因子TGF β1和TGF β2进行分析。结果如图7(A)TGF β1和(B)TGF β2所示。热处理样品的剩余TGF β1生长因子为27％，未检出TGF β2生长因子。相反，压力处理且维持3分钟的样品的两种生长因子为93％-99％。

实施例10：含有乳铁蛋白的酸乳酪

[0219]用图8所示的三种不同方法来制备乳铁蛋白酸乳酪。在第一方法(标准酸乳酪)中，在热处理前将乳铁蛋白加入到所述乳中；在第二方法(对照)中，在发酵后将乳铁蛋白加入到酸乳酪中；以及在第三方法(HPP法)中，在发酵后将乳铁蛋白加入到酸乳酪中，并在500MPa下对增强的酸乳酪进行压力处理且不停留。测量酸乳酪的最终pH值为4.50。用BiaCore法测定酸乳酪中的乳铁蛋白，结果如图9所示。标准热处理的乳铁蛋白酸乳酪的剩余乳铁蛋白活性为1％-2％(相对于对照法)。相反，压力法得到的剩余乳铁蛋白为80％。在4℃下贮存130天后，分析压力处理的酸乳酪的酸败微生物。根据需氧菌平板计数未检出大肠菌，有60个嗜温性孢子集落，未检出葡萄球菌(staphylococci)、酵母菌或霉菌以及约10个集落。相反，未处理的对照产品在制备的21天内大量变质，产生气体和臭味。

实施例11：含有免疫球蛋白的饮料

[0220]如图10所示由初乳乳清浓缩物来制备含有免疫球蛋白(3％IgG)的酸化饮料(pH4.0)。在85℃下对饮料热处理10分钟，或在600MPa下对该饮料进行压力处理并维持3分钟。相对于未处理的对照，用HPLC-MC法测定剩余IgG。结果如图11所示。通过热处理方法制备的饮料的剩余IgG低于检测限。相反，与对照相比，用压力处理制备的饮料保留了约90％的剩余IgG(％)。在4℃下贮存130天后，分析在500MPa下压力处理且不停留的产品的酸败微生物。根据需氧菌平板计数未检出大肠菌，有2个嗜温性孢子集落，未检出葡萄球菌、酵母菌或霉菌或集落。相反，未处理的对照产品在制备的21天内大量变质，产生气体和臭味。

实施例12：含有乳铁蛋白的果冻

[0221]如图12所述由乳铁蛋白粉末来制备pH3.8的水果味果冻。在600MPa下对该果冻压力处理3分钟，通过BiaCore法对其剩余乳铁蛋白和未处理的对照样品进行比较。结果如图13所示。与未处理的对照果冻相比，压力处理的果冻的剩余乳铁蛋白超过90％。在冷藏130天后，分析该产品的酸败微生物。根据需氧菌平板计数未检出大肠菌、嗜温性孢子、葡萄球菌、酵母菌或霉菌或集落。相反，未处理的对照产品在制备的21天内大量变质，产生气体和臭味。

实施例13：益生微生物的压力处理

灭活益生菌的制备

[0222]在37℃下，将来自1∶100接种物的鼠李糖乳杆菌HN001(Lactobacillus rhamnosus HN001)(AGAL保藏号NM97/09514，1997年8月18日；Cross等人，2002)在1升的静态MRS培养液中生长18h。除非另有说明，培养物生长后，所有步骤在冰上进行。该培养物在冷的无菌PBS中洗涤一次，并以150ml的最终总体积重新悬浮在该无菌PBS中，获得约2×10¹⁰cfu/ml的估计浓度。然后将其分为五等份，每份30ml，置于50ml的标准聚丙烯离心管中，将其中的三份进行如下处理：

[0223]热灭活的HN001-将30ml的细胞于70℃时在水浴中孵育30分钟，然后移至冰上。然后将500μl的这些热处理细胞进一步稀释在PBS中，获得1×10⁸cfu/ml的估计浓度，将400μl的该热处理细胞分散在Nalgene冷存管中，在液氮中骤冷并在-80℃贮存直至PBMC分泌细胞因子测定使用。

[0224]活HN001-除了不接受热处理之外，与热处理细胞精确相同地处理30ml的细胞。

[0225]UHP灭活HN001-将30ml的细胞进一步等分，放入Beckman离心管中，密封，在600MPa下压力处理并停留3分钟。处理后，将压力处理的细胞注入新的50ml Stansted离心管中并混合。然后将500μl的这些细胞进一步稀释在PBS中，获得1×10⁸cfu/ml的估计浓度，将400μl的该细胞分散在Nalgene冷存管中，在液氮中骤冷并在-80℃贮存直至PBMC分泌细胞因子测定使用。

人外周血单核细胞(PBMC)的制备

[0226]在获得知情同意后，从志愿者处采集全血样品。将血采集到装有肝磷脂作为抗凝血剂的管中。将20ml的等份移至50ml的无菌管中并用无菌PBS稀释至35ml。用约15ml的Ficoll-Hypaque(d＝1.077)是稀释的血沉在下面，并在室温下以1500g离心20分钟。从界面采集PBMC，而红细胞和嗜中性白细胞沉积在球状沉淀物(pellet)上。将采集的PBMC在PBS中稀释至少2倍，然后通过离心将其制成球状(以400g离心5分钟)。将上清液吸出后，将PBMC重新悬浮在50mlPBS中，移出一部分以进行计数。基于细胞数，将剩余的PBMC稀释在RPMI 1640/10％FCS中，得到1×10⁶细胞/ml的最终浓度，并将2ml的细胞混悬液放入无菌Falcon 2054管中。

细菌/PBMC协同培养

[0227]将制备的细菌制品解冻并剧烈涡旋。将细菌稀释在PBS中，并以20μl等份加入到PBMC培养物中，得到1×10⁶cfu/ml的最终浓度或对于灭活细菌制剂得到1×10⁶灭活cfu/ml的最终浓度。作为细胞因子产品的阳性对照，将1μg/ml的细菌脂多糖(LPS)或25ng/ml的佛波醇12-肉豆蔻酯-13-乙酯(PMA)和1μg/ml的伊屋诺霉素加入到PBMC中。作为阴性对照，PBMC管中无添加剂。全部管于37℃孵育24h，通过离心法采集上清液。在用ELISA进行细胞因子水平的分析前，将上清液暂时贮存在-20℃。

[0228]根据制造商的说明书，使用匹配捕获和检测抗体对(R&DSystems Inc.，Minneapolis，MN)通过ELISA来测定上清液的干扰素-γ(Ifn-γ)和白细胞介素-10(IL-10)的水平。如果适合，将上清液在稀释试剂中稀释，使得特定的细胞因子水平保持在ELISA标准曲线的检测范围内。

HN001灭活的测定

[0229]为了测定热处理或UHP处理的灭活程度，在PBS稀释前对未处理的HN001细胞和处理的HN001细胞进行平板计数。如表7所示，UHP对细胞的杀灭效果比热处理稍强。但是，两种方法均导致大的杀伤率，所测定的可培养细胞数比初始培养物的可培养细胞数低至少5个对数级。

表7：热处理和UHP对HN001生存力的影响

处理	cfu/ml	对数杀灭(log Kill)
处理	cfu/ml	对数杀灭(log Kill)	未处理	2×10¹⁰	-
热处理	2×10⁵	5.0	未处理	2×10¹⁰	-
热处理	2×10⁵	5.0	600MPa	6×10⁴	5.5

PBMC对灭活HN001的细胞因子响应

[0230]测定由上文所述的体外PBMC产生的IFN-γ和IL-10作为益生生物活性的标记。从一组健康个体(n＝13)得到的外周血中分离出PBMC，用1∶1比例的活细菌或等量死细胞来培养等份的PBMC。24h后，取出培养上清液并通过ELISA分析该上清液的IFN-γ和IL-10水平。通过ANOVA和多重比较的Bonferroni法来分析每一处理对每一个体的结果，认为p＜0.05是具有统计学意义的。

[0231]Cross等人2002及其他人的研究表明，IFN-γ可在介导益生菌活性中起作用。如图14所示，PBMC在单独培养基中生长24小时后几乎不产生可测量的IFN-γ。然而，暴露在UHP灭活的HN001中的PBMC所产生的IFN-γ比单独培养基中的PBMC(p＝0.006)或与热灭活的HN001协同培养的PBMC(p＝0.013)所产生的IFN-γ显著增多，但其与用活HN001处理的PBMC(p＝0.91)的IFN-γ水平相似。尽管与单独培养基和热灭活HN001处理所产生的IFN-γ相比，响应于活HN001所产生的IFN-γ有增长的趋势，但是该结果不具有统计学意义(分别为p＝0.23和p＝0.45)。

[0232]通常认为IL-10是抑制TH1 T细胞发育和抑制包括IFN-γ在内的多种细胞因子的产生的抗炎细胞因子。近来，IL-10因其在缓解包括肠易激综合征(IBS)在内的慢性炎症疾病上的潜在作用而成为许多临床研究的焦点。如图15所示，生长在单独培养基中的PBMC仅产生少量的IL-10。与单独培养基中的PBMC所产生的IL-10(p＝0.0001)相比，PBMC与HN001协同培养导致所产生的IL-10显著增长。在热灭活HN001的使用导致IL-10相对于活HN001(p＝0.12)接近统计显著性的减少的同时，UHP灭活的HN001的使用导致IL-10水平显著高于单独培养基中的PBMC(p＜0.0000)和与热灭活的HN001协同培养的PBMC(p＝0.013)，而近似于与活HN001培养的PBMC(p＝0.97)的IL-10水平。因此，在压力处理后，益生因子仍保留活性。

[0233]模拟处理的UHP HN001(即除了暴露在增加的压力以外，用与UHP处理HN001相同的方式处理的HN001细胞)，其在体外PBMC刺激细胞因子产生的能力方面与活HN001无显著不同。

实施例14：pH对HN001灭活的影响

[0234]两份来自1∶100接种物的HN001培养物在37℃下生长18h。将一份培养物用pH5.0的乙酸钠/乙酸缓冲液(根据Perrin&Dempsey，1974配制)洗涤一次，然后以1.6×10¹¹cfu/ml的浓度重新悬浮。除了用pH7.4的PBS来替代pH5.0的乙酸钠/乙酸缓冲液外，对另一份培养物进行相同处理。各取两等份的每组细胞放入Beckman离心管中，密封并压力处理3分钟，于4℃下过夜贮存，然后用平板计数来测定灭活程度(表8)。

表8：pH对鼠李糖乳杆菌HN001(Lactobacillus rhamnosus HN001)灭活的影响

压力(MPa)	HN001的cfu
	HN001的cfu		乙酸钠/乙酸缓冲液-pH5.0	PBS缓冲液-pH7.4
	无压力处理	1.6E+11	乙酸钠/乙酸缓冲液-pH5.0	PBS缓冲液-pH7.4	1.6E+11
200	无压力处理	1.6E+11	1.6E+11	n.d.	1.6E+11
200	250	1.3E+11	1.6E+11	n.d.	n.d.
300	250	1.3E+11	8.8E+10	1.1E+11	n.d.
300	350	8.2E+09	8.8E+10	1.1E+11	n.d.
400	350	8.2E+09	3.3E+09	2.3E+10	n.d.

450	1.1E+07	n.d.
450	1.1E+07	n.d.	500	1.2E+05	2.8E+06
550	＜10	n.d.	500	1.2E+05	2.8E+06
550	＜10	n.d.	600	＜10	170
700	n.d.	50	600	＜10	170

n.d.-未做。

实施例15：pH在HPP处理过程中对HN001的影响

[0235]将HN001细菌细胞重新悬浮在PBS(pH7.4)中或乙酸盐缓冲液(pH5.0)中，通过压力处理灭活(600MPa/3分钟)，并如上文所述通过测定人体外PBMC刺激IL-10产生的能力对其生物活性与活HN001以及热处理HN001的生物活性进行比较。

[0236]图16显示了三个个体的组合结果。在pH7.4或pH5.0时响应压力处理灭活的HN001所产生的IL-10水平与对活HN001所观测的IL-10水平无显著不同，但是其IL-10水平与热灭活HN001相比有显著提高(分别为p＝0.043和p＝0.037)。

实施例16：配体结合对生物活性保持力的提高

[0237]pH6.8时，配制乳清蛋白浓缩物(WPC)在水中的2％溶液(Alacen 342，Fonterra Co-operative Group Ltd.)。将下列疏水性配体分别加入到WPC溶液中(其与蛋白的摩尔比为1∶1)：共轭亚油酸、十二烷基硫酸钠、维生素A和十六酸。然后在600MPa下对该溶液压力处理，维持1分钟、2分钟、3分钟或4分钟，或者在90℃下对该溶液热处理1分钟、2分钟、3分钟或4分钟。在SDS-PAGE凝胶上评估IgG、乳铁蛋白和高分子量蛋白聚集体的水平，并在图17中将其与未处理的对照溶液和无配体加入的2％WPC溶液进行比较。

[0238]带的强度表示存在于溶液中的蛋白质单体的量。在未处理的对照样品中(道1)，标记为(i)的区域为高分子量聚集体，标记为(ii)的带为IgG，标记为(iii)的带为乳铁蛋白。在热处理样品中(上排)，IgG和乳铁蛋白带的强度基本上被减弱，表明蛋白质的聚集和单体蛋白质的减少。这是蛋白变性和聚集的结果。无论疏水性配体存在(B-E)或不存在(A)，该聚集可在热处理的样品中观察到。

[0239]相反，无配体的压力处理的WPC溶液显示减弱的强度(A，道2至道5)，而加入不同疏水性配体的压力处理后的WPC溶液(B-E)显示基本上较高的强度。

[0240]向含有生物活性的溶液中加入疏水性配体可使在中性pH附近、压力处理后的生物活性的保持力增强。

实施例17

[0241]制备具有ACE-I(血管紧张素转化酶抑制)活性的乳清蛋白水解物溶液(6％w/v)并调节至pH3.5、4.5或7.0。对样品进行压力处理(600MPa维持3分钟或600MPa维持10分钟)或热处理(85℃维持10分钟或90℃维持10分钟)，将所测定的ACE-I活性和微生物含量与未处理的对照进行比较。根据D.W.Cushman和H.S.Cheung(1971)的方法，使用FAPGG作为底物来测定ACE-I活性。

[0242]结果显示，与未处理的对照相比较，压力处理和热处理的样品的大肠菌数、酵母菌和霉菌、需氧菌平板数、嗜温性孢子和嗜热菌数均减少超过3个对数级。压力处理和热处理样品的ACE-I活性在未处理的对照的ACE-I活性的+/-2标准偏差内，其在统计学上没有区别。

工业应用

[0243]本发明的方法可用于防止供食品和健康产业使用的组合物中不想要的微生物的生长，同时避免或最小化对可能存在的生物活性组分的影响。

[0244]本领域技术人员理解，本发明仅通过说明的方式来提供以上描述，而本发明不限于此。

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Claims

1.处理生物活性组合物以维持或提高其保存性的方法，其包括：

(a)选择组合物，所述组合物包含至少一种选自下列组分的生物活性组分：一种或多种蛋白、一种或多种脂质、一种或多种蛋白水解物、一种或多种脂质水解物、一种或多种碳水化合物、或一种或多种益生因子或其混合物，所述至少一种生物活性组分能够在约350MPa至1000MPa的预定压力和约3.0至8.0的pH下进行压力处理后保持期望的活性水平；以及

(b)在所述预定的压力和pH下对所述组合物进行压力处理以防止可能存在于所述组合物中的不想要的生物体的生长，同时使所述至少一种生物活性组分至少保持在期望的活性水平。

2.处理生物活性组合物以维持或提高其保存性的方法，其包括：

(a)选择组合物，所述组合物包含至少一种选自下列组分的生物活性组分：一种或多种蛋白、一种或多种脂质、一种或多种蛋白水解物、一种或多种脂质水解物、一种或多种碳水化合物、或一种或多种益生因子或其混合物，所述至少一种生物活性组分在约350MPa至1000MPa的预定压力和约3.0至8.0的pH以及约0至5分钟的停留时间进行压力处理后能够保持期望的活性水平；以及

(b)在所述预定压力、pH和停留时间下对所述组合物进行压力处理以防止可能存在于所述组合物中的不想要的生物体的生长，同时使所述至少一种生物活性组分至少保持在期望的活性水平。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述生物活性组分选自乳铁蛋白、溶菌酶、一种或多种IgA、一种或多种IgD、一种或多种IgE、一种或多种IgG、一种或多种IgM、一种或多种生长因子、TGFβ1、TGFβ2、一种或多种益生因子、一种或多种非极性脂质、一种或多种磷脂、一种或多种鞘脂、一种或多种神经节苷脂、或一种或多种神经酰胺或其混合物。

4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述生物活性组分选自乳铁蛋白、一种或多种IgA、一种或多种IgG、一种或多种IgM、TGF β1、TGF β2、或一种或多种益生因子或其混合物。

5.如权利要求1或2所述的方法，其中所述组合物基本上由选自下列组分的生物活性组分组成：乳铁蛋白、溶菌酶、一种或多种IgA、一种或多种IgD、一种或多种IgE、一种或多种IgG、一种或多种IgM、一种或多种生长因子、TGFβ1、TGFβ2、一种或多种非极性脂质、一种或多种磷脂、一种或多种鞘脂、一种或多种神经节苷脂、或一种或多种神经酰胺或其混合物。

6.如权利要求1或2所述的方法，其中所述组合物基本上由一种或多种益生因子组成。

7.处理生物活性组合物以维持或提高其保存性的方法，其包括：

(a)选择组合物，所述组合物包含至少一种选自下列组分的生物活性组分：乳铁蛋白、溶菌酶、一种或多种IgA、一种或多种IgD、一种或多种IgE、一种或多种IgG、一种或多种IgM、一种或多种生长因子、TGFβ1、TGFβ2、或一种或多种益生因子或其混合物，所述至少一种生物活性组分在约350MPa至1000MPa的预定压力和约3.0至8.0的pH下进行压力处理后能够保持期望的活性水平；以及

(b)在所述预定压力和pH下对所述组合物进行压力处理以防止可能存在于所述组合物中的不想要的生物体的生长，同时使所述至少一种生物活性组分至少保持在期望的活性水平。

8.处理生物活性组合物以维持或提高其保存性的方法，其包括：

(a)选择组合物，所述组合物包含至少一种选自下列组分的生物活性组分：乳铁蛋白、溶菌酶、一种或多种IgA、一种或多种IgD、一种或多种IgE、一种或多种IgG、一种或多种IgM、一种或多种生长因子、TGFβ1、TGFβ2、或一种或多种益生因子或其混合物，所述至少一种生物活性组分在约350MPa至1000MPa的预定压力和约3.0至8.0的pH下以及约0至5分钟的停留时间进行压力处理后能够保持期望的活性水平；以及

9.处理生物活性组合物以维持或提高其保存性的方法，其包括：

(a)选择组合物，所述组合物包含至少一种选自一种或多种益生因子的生物活性组分，所述至少一种生物活性组分在约350MPa至1000MPa的预定压力和约3.0至8.0的pH下进行压力处理后能够保持期望的活性水平；以及

10.处理生物活性组合物以维持或提高其保存性的方法，其包括：

(a)选择组合物，所述组合物包含至少一种选自一种或多种益生因子的生物活性组分，所述至少一种生物活性组分在约350MPa至1000MPa的预定压力和约3.0至8.0的pH下以及约0至5分钟的停留时间进行压力处理后能够保持期望的活性水平；以及

11.如权利要求9或10所述的方法，其中所述不想要的生物体包括益生生物体和任选的一种或多种另外的不想要的生物体。

12.如权利要求9、10或11所述的方法，其中所述益生因子选自一种或多种细菌DNA基序、一种或多种细菌表面蛋白、一种或多种细菌小分子有机酸、或一种或多种菌细胞壁组分或其混合物。

13.处理生物活性组合物以维持或提高其保存性的方法，其包括：

(a)选择乳品蛋白组合物，所述组合物包含至少一种选自下列组分的生物活性组分：乳铁蛋白、溶菌酶、一种或多种IgA、一种或多种IgD、一种或多种IgE、一种或多种IgG、一种或多种IgM、一种或多种生长因子、TGFβ1、或TGFβ2或其混合物，所述至少一种生物活性组分在约350MPa至1000MPa的预定压力和约3.0至8.0的pH下进行压力处理后能够保持期望的活性水平；

14.处理生物活性组合物以维持或提高其保存性的方法，其包括：

(a)选择乳品蛋白组合物，所述组合物包含至少一种选自下列组分的生物活性组分：乳铁蛋白、溶菌酶、一种或多种IgA、一种或多种IgD、一种或多种IgE、一种或多种IgG、一种或多种IgM、一种或多种生长因子、TGFβ1、或TGFβ2或其混合物，所述至少一种生物活性组分在约350MPa至1000MPa的预定压力和约3.0至8.0的pH下以及约0至5分钟的停留时间进行压力处理后能够保持期望的活性水平；以及

15.处理生物活性组合物以维持或提高其保存性的方法，其包括：

(a)选择来自初乳MPC、初乳MPI、初乳WPC、初乳WPI、MPC、MPI、WPC、WPI、超免疫MPC、超免疫MPI、超免疫WPC、或超免疫WPI或其混合物的组合物，所述组合物包含至少一种选自下列组分的生物活性组分：乳铁蛋白、溶菌酶、一种或多种IgA、一种或多种IgD、一种或多种IgE、一种或多种IgG、一种或多种IgM、TGF β1、或TGFβ2或其混合物，所述至少一种生物活性组分在约350MPa至1000MPa的预定压力和约3.0至8.0的pH下进行压力处理后能够保持期望的活性水平；以及

16.处理生物活性组合物以维持或提高其保存性的方法，其包括：

(a)选择来自初乳MPC、初乳MPI、初乳WPC、初乳WPI、MPC、MPI、WPC、WPI、超免疫MPC、超免疫MPI、超免疫WPC、或超免疫WPI或其混合物的组合物，所述组合物包含至少一种选自下列组分的生物活性组分：乳铁蛋白、溶菌酶、一种或多种IgA、一种或多种IgD、一种或多种IgE、一种或多种IgG、一种或多种IgM、TGFβ1、或TGFβ2或其混合物，所述至少一种生物活性组分在约350MPa至1000MPa的预定压力和约3.0至8.0的pH下以及约0至5分钟的停留时间进行压力处理后能够保持期望的活性水平；以及

17.如权利要求1至16中任一权利要求所述的方法，其中所述不想要的生物体选自一种或多种细菌、一种或多种真菌、一种或多种霉菌、一种或多种酵母菌或一种或多种藻类或其混合物。

18.处理益生组合物的方法，其包括：

(a)选择包含一种或多种益生微生物菌株的组合物，所述益生微生物具有一种或多种益生因子，所述益生因子在约350MPa至1000MPa的预定压力下进行压力处理后能够至少保持在期望的活性水平；以及

(b)在所述预定压力下对所述组合物进行压力处理以防止所述一种或多种益生微生物菌株的生长，同时使一种或多种益生因子至少保持在期望的活性水平。

19.如权利要求1至18中任一权利要求所述的方法，其中所述不想要的生物体或所述益生微生物选自嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillusacidophilus)、德氏乳杆菌保加利亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、两歧双歧杆菌(Bifidiobacterium bifidum)、短双歧杆菌(Bifidiobacterium breve)、婴儿双岐杆菌(Bifidobacterium infantis)、动物双歧杆菌Lactis亚种(Bifidiobacterium animalis subsp.lactis)、长双岐杆菌(Bifidobacterium longum)、或嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)或其混合物。

20.如权利要求1至18中任一权利要求所述的方法，其中所述不想要的生物体或所述益生微生物选自鼠李糖乳杆菌HN001(Lactobacillus rhamnosus HN001)、动物双歧杆菌Lactis亚种HN019(Bifidiobacterium animalis subsp.lactis HN019)、嗜酸乳杆菌HN017(Lactobacillus acidophilus HN017)、鼠李糖乳杆菌HN067(Lactobacillusrhamnosus HN067)、约氏乳杆菌NCC533(Lactobacillus johnsoniiNCC533)(La1)、鼠李糖乳杆菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG)、养乐多代田菌(Lactobacillus casei Shirota)、嗜酸乳杆菌NCFM(Lactobacillus acidophilus NCFM)、植物乳杆菌299v(Lactobacillusplantarum 299v)、干酪乳杆菌DN114001(Lactobacillus caseiDN114001)、唾液乳杆菌UCC4331(Lactobacillus salivarius UCC4331)、动物双歧杆菌Lactis亚种BB12(Bifidiobacterium animalis subsp.lactisBB12)、或婴儿双岐杆菌35624(Bifidobacterium infantis 35624)或其混合物。

21.处理益生组合物的方法，其包括：

(a)选择组合物，所述组合物包含一种或多种选自下列菌株的益生微生物菌株：一种或多种嗜酸乳酸杆菌菌株(Lactobacillusacidophilus)、一种或多种鼠李糖乳杆菌菌株(Lactobacillus rhamnosus)、或一种或多种动物双歧杆菌Lactis亚种菌株(Bifidiobacterium animalissubsp.lactis)或其混合物，所述一种或多种益生微生物菌株具有一种或多种益生因子，所述益生因子在约350MPa至1000MPa的预定压力下进行压力处理后能够至少保持在期望的活性水平；以及

22.如权利要求1至21中任一权利要求所述的方法，其中所述不想要的生物体或所述益生微生物选自鼠李糖乳杆菌HN001(Lactobacillus rhamnosus HN001)、动物双歧杆菌Lactis亚种HN019(Bifidiobacterium animalis subsp.lactis HN019)、嗜酸乳杆菌HN017(Lactobacillus acidophilus HN017)、或鼠李糖乳杆菌HN067(Lactobacillus rhamnosus HN067)或其混合物。

23.如权利要求1至22中任一权利要求所述的方法，其中所述不想要的生物体或所述益生微生物是鼠李糖乳杆菌HN001(Lactobacillus rhamnosus HN001)。

24.如权利要求18至21中任一权利要求所述的方法，其中使所述压力维持约0分钟、0.5分钟、1分钟、1.5分钟、2分钟、2.5分钟、3分钟、3.5分钟、4分钟、4.5分钟、5分钟、5.5分钟、6分钟、6.5分钟、7分钟、7.5分钟、8分钟、8.5分钟、9分钟、9.5分钟或10分钟。

25.如权利要求1至24中任一权利要求所述的方法，其中所述压力为约350MPa至850MPa。

26.如权利要求1至24中任一权利要求所述的方法，其中所述压力为约350MPa至800MPa。

27.如权利要求1至24中任一权利要求所述的方法，其中所述压力为约350MPa至750MPa。

28.如权利要求1至24中任一权利要求所述的方法，其中所述压力为约350MPa至700MPa。

29.如权利要求1至24中任一权利要求所述的方法，其中所述压力为约350MPa至650MPa。

30.如权利要求1至24中任一权利要求所述的方法，其中所述压力为约400MPa至800MPa。

31.如权利要求1至24中任一权利要求所述的方法，其中所述压力为约400MPa至700MPa。

32.如权利要求1至24中任一权利要求所述的方法，其中所述压力为约400MPa至600MPa。

33.如权利要求1至24中任一权利要求所述的方法，其中所述压力为约500MPa至800MPa。

34.如权利要求1至24中任一权利要求所述的方法，其中所述压力为约500MPa至700MPa。

35.如权利要求1至24中任一权利要求所述的方法，其中所述压力为约500MPa至600MPa。

36.如权利要求1至24中任一权利要求所述的方法，其中所述压力为约550MPa至650MPa。

37.如权利要求1至36中任一权利要求所述的方法，其中所述组合物的pH为约3.0至7.0。

38.如权利要求1至36中任一权利要求所述的方法，其中所述组合物的pH为约3.0至6.0。

39.如权利要求1至36中任一权利要求所述的方法，其中所述组合物的pH为约3.0至5.0。

40.如权利要求1至36中任一权利要求所述的方法，其中所述组合物的pH为约3.2至4.8。

41.如权利要求1至36中任一权利要求所述的方法，其中所述组合物的pH小于约4.6。

42.如权利要求1至41中任一权利要求所述的方法，其中所述期望的活性水平至少为未处理对照的活性的约35％。

43.如权利要求1至41中任一权利要求所述的方法，其中所述期望的活性水平至少为未处理对照的活性的约50％。

44.如权利要求1至41中任一权利要求所述的方法，其中所述期望的活性水平至少为未处理对照的活性的约60％。

45.如权利要求1至41中任一权利要求所述的方法，其中所述期望的活性水平至少为未处理对照的活性的约70％。

46.如权利要求1至41中任一权利要求所述的方法，其中所述期望的活性水平至少为未处理对照的活性的约80％。

47.如权利要求1至41中任一权利要求所述的方法，其中所述期望的活性水平至少为未处理对照的活性的约90％、95％、99％或100％。

48.如权利要求1至47中任一权利要求所述的方法，其中使所述压力维持约0分钟、0.5分钟、1分钟、1.5分钟、2分钟、2.5分钟、3分钟、3.5分钟、4分钟、4.5分钟或5分钟。

49.如权利要求1至47中任一权利要求所述的方法，其中使所述压力维持约0分钟、0.5分钟、1分钟、1.5分钟、2分钟、2.5分钟或3分钟。

50.如权利要求1至47中任一权利要求所述的方法，其中使所述压力维持约0分钟。

51.如权利要求1至50中任一权利要求所述的方法，其中所述方法包括对组合物进行压力处理，然后将所述组合物加入到产品中。

52.如权利要求1至50中任一权利要求所述的方法，其中所述方法包括将组合物加入到产品中，然后对所述产品进行压力处理。

53.如权利要求1至50中任一权利要求所述的方法，其中所述方法包括对组合物进行压力处理，然后包装所述组合物。

54.如权利要求1至50中任一权利要求所述的方法，其中所述方法包括包装组合物，然后对所述包装后的组合物进行压力处理。

55.如权利要求1至54中任一权利要求所述的方法，其中所述组合物还包含稳定剂。

56.如权利要求55所述的方法，其中所述稳定剂选自槐豆胶、瓜尔胶、黄原胶、肉桂胶、魔芋粉、β葡聚糖、他拉胶、阿拉伯树胶、结冷胶、羧甲基纤维素、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、黄蓍胶、刺梧桐胶、阿拉伯树胶、壳聚糖、arabinoglactins、藻酸盐、果胶、角叉菜胶、或欧车前或其混合物。

57.如权利要求1至56中任一权利要求所述的方法，其中所述组合物还包含疏水性配体。

58.如权利要求57所述的方法，其中所述疏水性配体选自十六酸、肉豆蔻酸、亚麻油酸、共轭亚油酸、一种或多种磷酯、一种或多种卵磷脂、一种或多种鞘磷脂、一种或多种神经节苷酯、丁酸、一种或多种ω-3脂肪酸、一种或多种植物甾醇、一种或多种植物甾醇酯、一种或多种植物甾醇乙酰化物、一种或多种ω-6脂肪酸、维生素A、维生素D、番茄红素、或十二烷基硫酸钠或其混合物。

59.如权利要求57或58所述的方法，其中所述组合物的pH为约5.0至8.0。

60.如权利要求1至59中任一权利要求所述的方法，其中所述组合物为饮料。

61.如权利要求1至59中任一权利要求所述的方法，其中所述组合物为酸化饮料。

62.如权利要求1至59中任一权利要求所述的方法，其中所述组合物为酸乳酪。

63.如权利要求1至59中任一权利要求所述的方法，其中所述组合物为果冻。

64.如权利要求1所述的方法，其中所述组分为一种或多种IgG，所述处理压力为约350MPa至650MPa，所述pH为约3.0至5.0，以及所述停留时间为约0分钟或1分钟、2分钟或3分钟。

65.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物为初乳MPC，所述组分为IgG，所述处理压力为约350MPa至650MPa，所述pH为约3.0至5.0，以及所述停留时间为约0分钟、1分钟、2分钟或3分钟。

66.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物为初乳MPC，所述组分为IgG，所述处理压力为约350MPa至650MPa，所述pH为约3.0至5.0，以及所述停留时间为约0分钟、1分钟、2分钟或3分钟。

67.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物为初乳脱脂奶粉，所述组分为IgG，所述处理压力为约350MPa至650MPa，所述pH为约3.0至5.0，以及所述停留时间为约0分钟、1分钟、2分钟或3分钟。

68.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物为初乳乳清，所述组分为IgG，所述处理压力为约350MPa至650MPa，所述pH为约3.0至5.0，以及所述停留时间为约0分钟、1分钟、2分钟或3分钟。

69.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物为初乳乳清UF渗余物，所述组分为IgG，所述处理压力为约350MPa至650MPa，所述pH为约3.0至5.0，以及所述停留时间为约0分钟、1分钟、2分钟或3分钟。

70.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物是超免疫乳、超免疫乳蛋白浓缩物或超免疫乳清蛋白浓缩物、超免疫初乳、超免疫初乳乳蛋白浓缩物或超免疫初乳乳清蛋白浓缩物，所述组分为IgA、IgG、IgM或乳铁蛋白，所述压力为约350MPa至650MPa，所述pH为约3.2至5.5，以及所述停留时间为约0分钟、1分钟、2分钟或3分钟。

71.如权利要求1所述的方法，其中所述组分为乳铁蛋白，所述压力为约350MPa至650MPa，所述pH为约3.0至7.5，以及所述停留时间为约0分钟、1分钟、2分钟或3分钟。

72.如权利要求1所述的方法，其中所述组分为TGF-β1或TGF-β2，所述压力为约350MPa至650MPa，所述pH为约3.0至8.0以及所述停留时间为约0分钟、1分钟、2分钟或3分钟。

73.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物为酸乳酪，所述组分为乳铁蛋白，所述压力为约350MPa至500MPa，所述pH为约3.5至4.6以及所述停留时间为约0分钟、1分钟、2分钟或3分钟。

74.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物为饮料，所述组分为IgG，所述压力为约350MPa至650MPa，所述pH为约3.0至5.0以及所述停留时间为约0分钟、1分钟、2分钟或3分钟。

75.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物为果冻，所述组分为乳铁蛋白，所述压力为约350MPa至650MPa，所述pH为约3.0至5.0以及所述停留时间为约0分钟、1分钟、2分钟或3分钟。

76.如权利要求1至75中任一权利要求所述的方法，其中在所述压力处理后，所述组合物的需氧菌平板数小于或等于约50,000cfu/ml。

77.根据权利要求1至76中任一权利要求所述的方法进行处理的组合物。

78.如权利要求77所述的组合物，其为饮料、果冻或酸乳酪。

79.如权利要求78所述的组合物，其为饮料。

80.如权利要求78所述的组合物，其为果冻。

81.如权利要求78所述的组合物，其为酸乳酪。

82.根据权利要求1至76中任一权利要求所述的方法进行处理的益生菌组合物。

83.包含一种或多种益生微生物的组合物，所述益生微生物选自一种或多种嗜酸乳杆菌菌株(actobacillus acidophilus)、一种或多种德氏乳杆菌保加利亚种菌株(Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus)、一种或多种干酪乳杆菌菌株(Lactobacillus casei)、一种或多种卷曲乳杆菌菌株(Lactobacillus crispatus)、一种或多种约氏乳杆菌菌株(Lactobacillus johnsonii)、一种或多种植物乳杆菌菌株(Lactobacillusplantarum)、一种或多种罗伊氏乳杆菌菌株(Lactobacillus reuteri)、一种或多种鼠李糖乳杆菌菌株(Lactobacillus rhamnosus)、一种或多种唾液乳杆菌菌株(Lactobacillus salivarius)、一种或多种两歧双歧杆菌菌株(Bifidiobacterium bifidum)、一种或多种短双歧杆菌菌株(Bifidiobacterium breve)、一种或多种婴儿双岐杆菌菌株(Bifidobacterium infantis)、一种或多种动物双歧杆菌Lactis亚种菌株(Bifidiobacterium animalis subsp.Lactis)、一种或多种长双岐杆菌菌株(Bifidobacterium longum)、或一种或多种嗜热链球菌菌株(Streptococcusthermophilus)或其混合物，并且根据权利要求1至76中任一权利要求所述的方法对所述组合物进行处理。

84.基本上由一种或多种益生微生物组成的组合物，所述益生微生物选自一种或多种嗜酸乳杆菌菌株(actobacillus acidophilus)、一种或多种德氏乳杆菌保加利亚种菌株(Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus)、一种或多种干酪乳杆菌菌株(Lactobacillus casei)、一种或多种卷曲乳杆菌菌株(Lactobacillus crispatus)、一种或多种约氏乳杆菌菌株(Lactobacillus johnsonii)、一种或多种植物乳杆菌菌株(Lactobacillus plantarum)、一种或多种罗伊氏乳杆菌菌株(Lactobacillusreuteri)、一种或多种鼠李糖乳杆菌菌株(Lactobacillus rhamnosus)、一种或多种唾液乳杆菌菌株(Lactobacillus salivarius)、一种或多种两歧双歧杆菌菌株(Bifidiobacterium bifidum)、一种或多种短双歧杆菌菌株(Bifidiobacterium breve)、一种或多种婴儿双岐杆菌菌株(Bifidobacterium infantis)、一种或多种动物双歧杆菌Lactis亚种菌株(Bifidiobacterium animalis subsp.Lactis)、一种或多种长双岐杆菌菌株(Bifidobacterium longum)、或一种或多种嗜热链球菌菌株(Streptococcusthermophilus)或其混合物，并且根据权利要求1至76中任一权利要求所述的方法对所述组合物进行处理。

85.包含一种或多种益生微生物的组合物，所述益生微生物选自鼠李糖乳杆菌HN001(Lactobacillus rhamnosus HN001)、动物双歧杆菌Lactis种HN019(Bifidiobacterium animalis subsp.lactis HN019)、嗜酸乳杆菌HN017(Lactobacillus acidophilus HN017)、或鼠李糖乳杆菌HN067(Lactobacillus rhamnosus HN067)或其混合物，并且根据权利要求1至76中任一权利要求所述的方法对所述组合物进行处理。

86.基本上由一种或多种益生微生物组成的组合物，所述益生微生物选自鼠李糖乳杆菌HN001(Lactobacillus rhamnosus HN001)、动物双歧杆菌Lactis亚种HN019(Bifidiobacterium animalis subsp.lactisHN019)、嗜酸乳杆菌HN017(Lactobacillus acidophilus HN017)、或鼠李糖乳杆菌HN067(Lactobacillus rhamnosus HN067)或其混合物，并且根据权利要求1至76中任一权利要求所述的方法对所述组合物进行处理。

87.组合物，其包含乳铁蛋白、溶菌酶、一种或多种IgA、一种或多种IgD、一种或多种IgE、一种或多种IgG、一种或多种IgM、一种或多种生长因子、TGFβ1、或TGFβ2或其混合物，并且根据权利要求1至76的任一权利要求所述的方法对所述组合物进行处理。

88.组合物，其基本上由乳铁蛋白、溶菌酶、一种或多种IgA、一种或多种IgD、一种或多种IgE、一种或多种IgG、一种或多种IgM、一种或多种生长因子、TGFβ1、或TGFβ2或其混合物组成，并且根据权利要求1至76中任一权利要求所述的方法对所述组合物进行处理。

89.组合物，其包含乳铁蛋白、一种或多种IgA、一种或多种IgG、一种或多种IgM、TGFβ1或TGFβ2或其混合物，并且根据权利要求1至76中任一权利要求所述的方法对所述组合物进行处理。

90.组合物，其基本上由乳铁蛋白、一种或多种IgA、一种或多种IgG、一种或多种IgM、TGFβ1或TGFβ2或其混合物组成，并且根据权利要求1至76中任一权利要求所述的方法对所述组合物进行处理。

91.权利要求77至90中任一权利要求所述的组合物在制备食品、饮料、食品添加剂、饮料添加剂、膳食补充剂、营养品、医疗食品、营养药品、药剂或药物中的用途。

92.权利要求77至90中任一权利要求所述的组合物在制备用于治疗有需要的个体的食品、饮料、食品添加剂、饮料添加剂、膳食补充剂、营养品、医疗食品、营养药品、药剂或药物中的用途。

93.权利要求77至90中任一权利要求所述的组合物在制备用于刺激有需要的个体的免疫系统的食品、饮料、食品添加剂、饮料添加剂、膳食补充剂、营养品、医疗食品、营养药品、药剂或药物中的用途。

94.刺激有需要的个体的免疫系统的方法，其包括将权利要求77至90中任一权利要求所述的组合物给予所述个体。

95.压力处理的组合物，其包含约0.1mg/ml至1000mg/ml的乳铁蛋白和小于约50,000cfu/ml的微生物。

96.压力处理的果冻，其包含约0.1mg/ml至1000mg/ml的乳铁蛋白和小于约50,000cfu/ml的微生物。

97.压力处理的酸乳酪，其包含约0.1mg/ml至1000mg/ml的乳铁蛋白和小于约50,000cfu/ml的微生物。

98.压力处理的饮料，其包含约0.1mg/ml至1000mg/ml的乳铁蛋白和小于约50,000cfu/ml的微生物。

99.压力处理的组合物，其包含约1mg/ml至1000mg/ml的乳铁蛋白和小于约50,000cfu/ml的微生物。

100.压力处理的果冻，其包含约1mg/ml至1000mg/ml的乳铁蛋白和小于约50,000cfu/ml的微生物。

101.压力处理的酸乳酪，其包含约1mg/ml至1000mg/ml的乳铁蛋白和小于约50,000cfu/ml的微生物。

102.压力处理的饮料，其包含约1mg/ml至1000mg/ml的乳铁蛋白和小于约50,000cfu/ml的微生物。

103.压力处理的组合物，其包含约0.1mg/ml至1000mg/ml的IgG和小于约50,000cfu/ml的微生物。

104.压力处理的果冻，其包含约0.1mg/ml至1000mg/ml的IgG和小于约50,000cfu/ml的微生物。

105.压力处理的酸乳酪，其包含约0.1mg/ml至1000mg/ml的IgG和小于约50,000cfu/ml的微生物。

106.压力处理的饮料，其包含约0.1mg/ml至1000mg/ml的IgG和小于约50,000cfu/ml的微生物。

107.压力处理的组合物，其包含约1mg/ml至1000mg/ml的IgG和小于约50,000cfu/ml的微生物。

108.压力处理的果冻，其包含约1mg/ml至1000mg/ml的IgG和小于约50,000cfu/ml的微生物。

109.压力处理的酸乳酪，其包含约1mg/ml至1000mg/ml的IgG和小于约50,000cfu/ml的微生物。

110.压力处理的饮料，其包含约1mg/ml至1000mg/ml的IgG和小于约50,000cfu/ml的微生物。

111.压力处理的组合物，其包含一种或多种非存活的益生微生物培养物和小于约50,000cfu/ml的微生物。

112.压力处理的组合物，其包含一种或多种非存活的益生微生物培养物和小于约50,000cfu/ml的微生物，所述非存活的益生微生物培养物选自一种或多种嗜酸乳杆菌菌株(actobacillus acidophilus)、一种或多种德氏乳杆菌保加利亚种菌株(Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus)、一种或多种干酪乳杆菌菌株(Lactobacillus casei)、一种或多种卷曲乳杆菌菌株(Lactobacillus crispatus)、一种或多种约氏乳杆菌菌株(Lactobacillus johnsonii)、一种或多种植物乳杆菌菌株(Lactobacillus plantarum)、一种或多种罗伊氏乳杆菌菌株(Lactobacillusreuteri)、一种或多种鼠李糖乳杆菌菌株(Lactobacillus rhamnosus)、一种或多种唾液乳杆菌菌株(Lactobacillus salivarius)、一种或多种两歧双歧杆菌菌株(Bifidiobacterium bifidum)、一种或多种短双歧杆菌菌株(Bifidiobacterium breve)、一种或多种婴儿双岐杆菌菌株(Bifidobacterium infantis)、一种或多种动物双歧杆菌Lactis亚种菌株(Bifidiobacterium animalis subsp.Lactis)、一种或多种长双岐杆菌菌株(Bifidobacterium longum)、或一种或多种嗜热链球菌菌株(Streptococcusthermophilus)或其混合物。

113.压力处理的组合物，其包含一种或多种非存活的益生微生物培养物和小于约50,000cfu/ml的微生物，所述非存活的益生微生物培养物选自鼠李糖乳杆菌HN001(Lactobacillus rhamnosus HN001)、动物双歧杆菌Lactis亚种HN019(Bifidiobacterium animalis subsp.lactisHN019)、嗜酸乳杆菌HN017(Lactobacillus acidophilus HN017)、鼠李糖乳杆菌HN067(Lactobacillus rhamnosus HN067)、约氏乳杆菌NCC533(Lactobacillus johnsonii NCC533)(La1)、鼠李糖乳杆菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG)、养乐多代田菌(Lactobacillus caseiShirota)、嗜酸乳杆菌NCFM(Lactobacillus acidophilus NCFM)、植物乳杆菌299v(Lactobacillus plantarum 299v)、干酪乳杆菌DNll4001(Lactobacillus casei DN114001)、唾液乳杆菌UCC4331(Lactobacillussalivarius UCC4331)、动物双歧杆菌Lactis亚种BB12(Bifidiobacteriumanimalis subsp.lactis BB12)、或婴儿双岐杆菌35624(Bifidobacteriuminfantis 35624)或其混合物。

114.压力处理的组合物，其包含一种或多种非存活的益生微生物培养物和小于约50,000cfu/ml的微生物，所述非存活的益生微生物培养物选自鼠李糖乳杆菌HN001(Lactobacillus rhamnosus HN001)、动物双歧杆菌Lactis亚种HN019(Bifidiobacterium animalis subsp.lactisHN019)、嗜酸乳杆菌HN017(Lactobacillus acidophilus HN017)、或鼠李糖乳杆菌HN067(Lactobacillus rhamnosus HN067)或其混合物。

115.压力处理的组合物，其包含非存活的鼠李糖乳杆菌HN001(Lactobacillus rhamnosus HN001)和小于约50,000cfu/ml的微生物。

116.如权利要求95至115中任一权利要求所述的组合物，在约350MPa至850MPa的压力下对其进行压力处理。

117.如权利要求95至115中任一权利要求所述的组合物，其pH为约3.0至8.0。

118.如权利要求95至115中任一权利要求所述的组合物，其中所述乳铁蛋白、IgG或非存活的益生微生物所保持的活性至少是未处理对照的约35％。

119.如权利要求95至115中任一权利要求所述的组合物，其中所述乳铁蛋白、IgG或非存活的益生微生物所保持的活性至少是未处理对照的约70％。