CN109929817A - 一种脂肪氧合酶制备与纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种脂肪氧合酶的制备与纯化方法，该制备方法包括以下步骤：（1）将大豆粉碎溶解，通过盐析法得到粗酶提取物；（2）阴离子交换层析：采用阴离子交换层析，利用分段洗脱的方法对粗提物进行初步纯化；（3）亲和柱层析：采用亲和柱层析进一步分离与纯化得到较纯的脂肪氧合酶。本方法的优点是：方法工艺分离效果好，得到的酶活性高，回收率高，生产成本低，可工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体地说是一种脂肪氧合酶制备与纯化方法。
背景技术
脂肪氧合酶又称脂肪氧化酶, 脂氧酶, 属于氧化还原酶, 是一类含非血红素铁的蛋白质, 能专一催化具有顺, 顺4-烯结构的多不饱和脂肪酸, 通过分子内加氧, 形成具有共轭双键的氢过氧化衍生物, 可导致果蔬加工制品产生不良的风味, 油脂和含油食品在贮藏和加工过程中色、香、味发生劣变等。但脂肪氧合酶作为绿色食品添加剂可改善小麦粉品质, 在食品、化工等领域都有应用, 其研究对现代食品、工业、发酵等行业的发展具有重要意义。在医药行业中，脂肪氧合酶能催化生成各种类花生酸物质，在癌症预防和治疗中发挥重要作用，有望成为新的抗癌药物作用靶点。
目前国内外对脂肪氧合酶的提取与纯化方法的研究也有很多，初步提取脂肪氧合酶的方法主要有水浸提法、盐析法及共沉淀法3种，进一步分离提纯的方法主要有有机溶剂沉淀法、聚合物沉淀法、双相分离法、透析、离子交换柱层析、凝胶过滤以及各种电泳技术分离和鉴定，还包括基因重组技术获得重组脂肪氧合酶，由于植物中含有的色素、杂蛋白和糖类物质等比较丰富，给后续的纯化过程带来麻烦，因此需要一种较为简单有效的方法来进行纯化，已达到高回收率和更高的酶活力。
发明内容
本发明提供了一种脂肪氧合酶的制备与纯化方法，该制备方法包括以下步骤：
（1）粗提取：将大豆利用机械粉碎至120目,然后按料液比1:3-1:10加入0.01-0.05mol/l磷酸盐缓冲液（pH=7.0）混合搅拌，4500r/min离心20min，取上清液加入固体硫酸铵使其中硫酸铵浓度为30%-50%并加入氨水调节pH 6.0-8.0，摇匀，静置2-5h, 4500r/min离心10-40min，弃去上清，将沉淀物用蒸馏水溶解后用截留分子量为10-15KDa的超滤膜进行超滤得粗酶提取液。
（2）初步纯化：用0.01-0.05mol/l磷酸盐缓冲液，pH 7.0-8.5平衡阴离子交换层析柱（DEAE-sephadex型）1-3h，流速为1-8mL/min，将粗提液缓慢上样，分别用含0.1mol/LNaCl、0.5mol/L NaCl的0.05-0.2mol/l磷酸盐缓冲液，pH 7.0-8.5以1-8mL/min的流速分段洗脱，收集并合并洗脱液。
（3）再纯化：用2个柱体积的磷酸盐缓冲液对CH-Sepharose 4B型亲和层析柱进行平衡，将步骤（2）纯化后合并的样品上样到色谱柱上，流速控制在1-8mL/min并用0.1-0.5mol/l Tris缓冲液，pH 4.0-6.5以5-10mL/min的流速进行洗脱，，用紫外分光光度计进行检测，洗脱至OD值≤0.2为止，停止收集流出液。
（4）冷冻真空干燥：将上述产品进行冷冻真空干燥，得到干燥后的酶产品。
本发明的目的与积极效果是：本方法通过采用分步纯化，分段洗脱，加上几种常见的分离手段，经过几步纯化步骤就可以达到较好的分离纯化目的，在纯化过程中，反应条件温和，试剂毒性低，对人体和环境基本无危害，成本低，适合工业化生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
（1）粗提取：将10kg大豆利用机械粉碎至120目,然后按料液比1:3加入0.01mol/l磷酸盐缓冲液（pH=7.0）混合搅拌，4500r/min离心10min，取上清液加入固体硫酸铵使其中硫酸铵浓度为30%并加入氨水调节pH 6.0，搅拌，静置2h,4500r/min离心20min，弃去上清，将沉淀物用蒸馏水溶解后用截留分子量为10KDa的超滤膜进行超滤得粗酶提取液。
（2）初步纯化：用0.01mol/l磷酸盐缓冲液，pH 7.0平衡阴离子交换层析柱（DEAE-sephadex型）1h，流速为2mL/min，将粗提液缓慢上样，分别用含0.1mol/L NaCl、0.5mol/LNaCl的0.05mol/l磷酸盐缓冲液，pH 7.0以2mL/min的流速分段洗脱，收集并合并洗脱液。
（3）再纯化：用2个柱体积的磷酸盐缓冲液对CH-Sepharose 4B型亲和层析柱进行平衡，将步骤（2）纯化后合并的样品上样到色谱柱上，流速控制在2mL/min并用0.1mol/lTris缓冲液，pH 4. 5以5mL/min的流速进行洗脱，用紫外分光光度计进行检测，洗脱至OD值≤0.2为止，停止收集流出液。
（4）将上述产品进行冷冻真空干燥，得到干燥后的酶产品2.26kg。
实施例2
（1）粗提取：将10kg大豆利用机械粉碎至120目,然后按料液比1:6加入0.03mol/l磷酸盐缓冲液（pH=7.0）混合搅拌，4500r/min离心25min，取上清液加入固体硫酸铵使其中硫酸铵浓度为40%并加入氨水调节pH 7.0, 搅拌，静置3h, 4500r/min离心20min，弃去上清，将沉淀物用蒸馏水溶解后用截留分子量为12KDa的超滤膜进行超滤得粗酶提取液。
（2）初步纯化：用0.03mol/l磷酸盐缓冲液，pH 8.0平衡阴离子交换层析柱（DEAE-sephadex型）2h，流速为5mL/min，将粗提液缓慢上样，分别用含0.1mol/L NaCl、0.5mol/LNaCl的0.1mol/l磷酸盐缓冲液，pH 7.0以5mL/min的流速分段洗脱，收集并合并洗脱液。
（3）用2个柱体积的磷酸盐缓冲液对CH-Sepharose 4B型亲和层析柱进行平衡，将步骤（2）纯化后合并的样品上样到色谱柱上，流速控制在5mL/min并用0.25mol/l Tris缓冲液，pH 5.0以8mL/min的流速进行洗脱，，用紫外分光光度计进行检测，洗脱至OD值≤0.2为止，停止收集流出液。
（4）将上述产品进行冷冻真空干燥，得到干燥后的酶产品3.23kg。
实施例3
（1）粗提取：将10kg大豆利用机械粉碎至120目,然后按料液比1:10加入0.05mol/l磷酸盐缓冲液（pH=7.0）混合搅拌，4500r/min离心40min，取上清液加入固体硫酸铵使其中硫酸铵浓度为50%并加入氨水调节pH8.0,搅拌，静置5h, 4500r/min离心20min，弃去上清，将沉淀物用蒸馏水溶解后用截留分子量为15KDa的超滤膜进行超滤得粗酶提取液。
（2）初步纯化：用0.05mol/l磷酸盐缓冲液，pH 8.5平衡阴离子交换层析柱（DEAE-sephadex型）3h，流速为8mL/min，将粗提液缓慢上样，分别用含0.1mol/L NaCl、0.5mol/LNaCl的0.15mol/l磷酸盐缓冲液，pH 7.0以8mL/min的流速分段洗脱，收集并合并洗脱液。
（3）再纯化：用2个柱体积的磷酸盐缓冲液对CH-Sepharose 4B型亲和层析柱进行平衡，将步骤（2）纯化后合并的样品上样到色谱柱上，流速控制在8mL/min并用0.5mol/lTris缓冲液，pH 6.5以10mL/min的流速进行洗脱，用紫外分光光度计进行检测，洗脱至OD值≤0.2为止，停止收集流出液。
（4）将上述产品进行冷冻真空干燥，得到干燥后的酶产品2.47kg。
以上所述，仅是本发明的代表性实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (6)
1.一种脂肪氧合酶的制备与纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
粗提取：将大豆利用机械粉碎至120目,然后按料液比1:3-1:10加入磷酸盐缓冲液（pH=7.0）混合搅拌，离心，取上清液加入固体硫酸铵使其浓度为30%-50%并加入氨水调节pH6.0-8.0，搅拌，静置，离心，弃去上清，将沉淀物用蒸馏水溶解得粗酶提取液；
初步纯化：阴离子交换层析柱用平衡缓冲液平衡1-3h，流速为1-8mL/min，将粗提液缓慢上样，分别用含0.1mol/L NaCl、0.5mol/L NaCl的洗脱缓冲液以1-8mL/min的流速分段洗脱，收集并合并洗脱液；
再纯化：将经阴离子交换层析纯化后合并的样品上样到亲和层析柱上，并用洗脱液以5-10mL/min的流速进行洗脱，收集洗脱液；
冷冻真空干燥：将上述产品进行冷冻真空干燥，得到干燥后的酶产品。
2.根据权利要求1所述的制备与纯化方法，其特征在于步骤（1）中含超滤步骤，其中选用截留分子量为10-15KDa的超滤膜。
3.根据权利要求1所述的制备与纯化方法，其特征在于步骤（2）中阴离子交换层析柱的介质为DEAE-纤维素、DEAE-葡萄糖凝胶、DEAE-琼脂糖凝胶中的一种。
4.根据权利要求1所述的制备与纯化方法，其特征在于步骤（2）中平衡缓冲液为0.01-0.05mol/l磷酸盐缓冲液，pH 7.0-8.5；洗脱缓冲液为0.05-0.2mol/l磷酸盐缓冲液，pH7.0-8.5。
5.根据权利要求1所述的制备与纯化方法，其特征在于步骤（3）中, 亲和层析柱的介质为Sepharose、硅胶或壳聚糖中的一种。
6.根据权利要求1所述的制备与纯化方法，其特征在于步骤（3）中,洗脱液为0.1-0.5mol/l Tris缓冲液，pH 4.0-6.5。
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