CN104130310A - 一种谷胱甘肽的分离纯化方法 - Google Patents

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赵镇雷
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Abstract

本发明属于生物化工技术领域，涉及一种谷胱甘肽的分离纯化方法。过程包括将酵母发酵液离心，收集酵母，加入50-90℃热水提取5-30min，调节提取液的pH值为1.5-3.0，将提取液进行过滤或离心，收集提取液；提取液依次采用超滤法和纳滤法去除大分子和小分子的杂质；纳滤浓缩液采用强酸性阳离子交换树脂吸附谷胱甘肽，然后用含有氨水的甲醇或乙醇水溶液进行洗脱，将洗脱液减压浓缩，加入三倍体积的95％的乙醇进行沉淀，沉淀物冷冻烘干，得到纯度95％以上的谷胱甘肽产品。

Description

一种谷胱甘肽的分离纯化方法
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，涉及到谷胱甘肽这种不稳定的小分子多肽的生产，尤其是将膜分离和树脂吸附相结合的分离纯化方法。
背景技术
还原型谷胱甘肽(Glutathione，简称GSH)是一种由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸脱水缩合而成的具有重要生理功能的活性三肽化合物。广泛存在于各种生物细胞中，其主要活性部位是半胱氨酸的巯基和特殊的γ-肽键，是生物体中的一种重要的抗氧化剂。GSH可以清除体内自由基，有保护肝脏、解毒、抗氧化、抗衰老、增强免疫力等多种生理功能，被誉为“长寿因子和抗衰因子”。
GSH的生产方法主要有四种，分别是：萃取法、发酵法、酶法和化学合成法。微生物发酵法具有反应条件温和、步骤简单、成本低、转化效率高、生产速率快等优势，是目前GSH生产的主要方法。酵母一直是研究的首选，其中酿酒酵母最为常见，相关的文献报道也最多。从酵母中提取GSH的方法有：热水抽提、沸水抽提、微波处理、冻融法处理、超声波处理、甲酸抽提、乙醇抽提、液氨抽提、盐法抽提、乙酸乙酯浸提等。其中热水抽提法经济清洁，不污染产品，也不需要分离除去添加的提取剂，易与后续的纯化方法相衔接，工业化生产更容易实现。纯化方法主要有铜盐法、树脂法(离子交换法、合成汞树脂法、大孔吸附树脂法)、电渗析法、反胶束萃取法、双水相法(双水相分配结合温度诱导相分离法)等。铜盐法需要通入H2S气体，有毒，操作环境差；因为提取液中含有大量的带电荷的杂质，单纯的树脂法，选择性差，能同时吸附大量的杂质，后续沉淀出的产品纯度低；电渗析法耗能高，选择性也差；反胶束和双水相萃取法离工业化生产有一定的距离，比较适合理论性研究。目前我国还没有适合工业化生产的成熟的分离纯化谷胱甘肽技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种工业上易于实现的谷胱甘肽分离纯化方法，采用超滤膜和纳滤膜法先分离去除大量的大分子和小分子杂质，既可以减轻后续树脂分离的负荷，又可以增加产品的纯度，树脂吸附后，采用含有氨水的甲醇或乙醇水溶液进行洗脱，洗脱液浓缩时，可以同时去除氨水和有机溶剂，不会在产品中残留，也提高了终产品的纯度。
本发明技术方案所采用的生产工艺过程为：酵母发酵液——离心或过滤——热水抽提——膜分离去除杂质——离子交换树脂吸附分离——洗脱液浓缩——乙醇沉淀——冷冻干燥。
具体路线是：将酵母发酵液离心，收集酵母，加入50-90℃热水提取5-30min，调节提取液的pH值为1.5-3.0，将提取液进行过滤或离心，收集提取液；提取液依次采用超滤法和纳滤法去除大分子和小分子的杂质；纳滤浓缩液采用强酸性阳离子交换树脂吸附谷胱甘肽，然后用含有氨水的甲醇或乙醇水溶液进行洗脱，将洗脱液减压浓缩，加入三倍体积的95％的乙醇进行沉淀，沉淀物冷冻烘干，得到纯度95％以上的谷胱甘肽产品。
本发明的效果益处是：
(1)热水抽提法经济清洁，不污染产品，也不需要分离除去添加的提取剂，易与后续的纯化方法相衔接。
(2)超滤和纳滤膜法可以去除大部分的大分子和小分子的杂质，减轻了后续树脂吸附的负荷，同时增加产品的纯度。
(3)谷胱甘肽稳定性较差，特别是不耐热，膜法分离在常温下进行，可以减少谷胱甘肽的损失。
具体实施方式
以下结合技术方案，详细叙述本发明的具体生产步骤：
(1)将酵母发酵液离心，收集酵母，按固液比1∶40，加入50-90℃热水提取7min，调节提取液的pH值为2.0，提取完毕，将提取液在4800r/min下离心10min，去除酵母沉淀物，收集提取液。
(2)提取液先采用超滤膜法去除大分子的蛋白质、多糖等杂质，超滤膜的截留分子量为10,000Da，操作压力0.1Mpa，透过液再采用纳滤膜过滤的方法去除大部分的小分子杂质，膜的截留分子量为270Da，操作压力为0.5Mpa。
(3)以步骤(2)的纳滤浓缩液为原料，采用Amberlite120型强酸性阳离子交换树脂吸附谷胱甘肽，流速0.5BV/h，吸附达到穿透点后，先用蒸馏水冲洗柱子，然后用含氨水质量百分比为2％的60％的甲醇或乙醇水溶液进行洗脱，流速1BV/h。
(4)将洗脱液减压浓缩，然后加入三倍体积的95％的乙醇进行沉淀，沉淀物冷冻烘干，得到的谷胱甘肽产品，纯度达95％以上。

Claims (3)

1.一种谷胱甘肽的分离纯化方法，其特征在于提取液通过膜法分离去除大部分的杂质，减轻后续树脂吸附的负荷并增加选择性，通过以下步骤实现：
(1)将酵母发酵液离心，收集酵母，加入50-90℃热水提取5-30min，调节提取液的pH值为1.5-3.0，将提取液进行过滤或离心，收集提取液。
(2)提取液采用超滤法去除大分子的蛋白质、多糖等杂质，然后采用纳滤膜过滤的方法去除大部分的小分子氨基酸、单糖类、无机盐等杂质。
(3)以步骤(2)的纳滤浓缩液为原料，采用强酸性阳离子交换树脂吸附谷胱甘肽，流速0.5-1.0BV/h，吸附达到穿透点后，先用蒸馏水冲洗柱子，然后用含氨水质量百分比为1-5％的50-80％的甲醇或乙醇水溶液进行洗脱，流速1BV/h。
(4)将洗脱液减压浓缩，然后加入三倍体积的95％的乙醇进行沉淀，沉淀物冷冻烘干，得到的谷胱甘肽产品，纯度达95％以上。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在树脂吸附之前先用膜分离的方法去除大部分的大分子和小分子杂质。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中超滤膜的截留分子量为5,000-10,000Da，纳滤膜的截留分子量为200-270Da。
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