CN106008703A - 一种从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法 - Google Patents
一种从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106008703A CN106008703A CN201610526579.4A CN201610526579A CN106008703A CN 106008703 A CN106008703 A CN 106008703A CN 201610526579 A CN201610526579 A CN 201610526579A CN 106008703 A CN106008703 A CN 106008703A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lactoferrin
- resin
- bovis seu
- seu bubali
- purity low
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 102000010445 Lactoferrin Human genes 0.000 title claims abstract description 79
- 108010063045 Lactoferrin Proteins 0.000 title claims abstract description 79
- CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N l-phenylalanyl-l-lysyl-l-cysteinyl-l-arginyl-l-arginyl-l-tryptophyl-l-glutaminyl-l-tryptophyl-l-arginyl-l-methionyl-l-lysyl-l-lysyl-l-leucylglycyl-l-alanyl-l-prolyl-l-seryl-l-isoleucyl-l-threonyl-l-cysteinyl-l-valyl-l-arginyl-l-arginyl-l-alanyl-l-phenylal Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N 0.000 title claims abstract description 79
- 229940078795 lactoferrin Drugs 0.000 title claims abstract description 79
- 235000021242 lactoferrin Nutrition 0.000 title claims abstract description 79
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 235000020247 cow milk Nutrition 0.000 title claims abstract description 7
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 58
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims abstract description 40
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims abstract description 40
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 24
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims abstract description 20
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 19
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 claims abstract description 19
- -1 Fe3+ ions Chemical class 0.000 claims abstract description 18
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 claims abstract description 14
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims abstract description 12
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 36
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 25
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 22
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 19
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 16
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 claims description 12
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 10
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 8
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 claims description 8
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 8
- 230000008961 swelling Effects 0.000 claims description 8
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims description 7
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims description 7
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims description 7
- 108010023244 Lactoperoxidase Proteins 0.000 claims description 6
- 102000045576 Lactoperoxidases Human genes 0.000 claims description 6
- 229940057428 lactoperoxidase Drugs 0.000 claims description 6
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 claims description 5
- UTSYWKJYFPPRAP-UHFFFAOYSA-N n-(butoxymethyl)prop-2-enamide Chemical compound CCCCOCNC(=O)C=C UTSYWKJYFPPRAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- JRMUNVKIHCOMHV-UHFFFAOYSA-M tetrabutylammonium bromide Chemical compound [Br-].CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC JRMUNVKIHCOMHV-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methoxy-5-methylphenyl)ethanamine Chemical compound COC1=CC=C(C)C=C1CCN SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- XHZPRMZZQOIPDS-UHFFFAOYSA-N 2-Methyl-2-[(1-oxo-2-propenyl)amino]-1-propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CC(C)(C)NC(=O)C=C XHZPRMZZQOIPDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 2-Propenoic acid Natural products OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 claims description 4
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 4
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 claims description 4
- 229920003053 polystyrene-divinylbenzene Polymers 0.000 claims description 4
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Substances [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 claims description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 3
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 claims description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 3
- XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M potassium benzoate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 claims description 3
- 229920000536 2-Acrylamido-2-methylpropane sulfonic acid Polymers 0.000 claims description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000003022 colostrum Anatomy 0.000 claims description 2
- 235000021277 colostrum Nutrition 0.000 claims description 2
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 abstract description 17
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 abstract description 5
- 239000013522 chelant Substances 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 25
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 13
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 11
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 10
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 6
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N Furan Chemical compound C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 4
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 3
- BHZOKUMUHVTPBX-UHFFFAOYSA-M sodium acetic acid acetate Chemical compound [Na+].CC(O)=O.CC([O-])=O BHZOKUMUHVTPBX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000040710 Chela Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000002592 echocardiography Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- LFULEKSKNZEWOE-UHFFFAOYSA-N propanil Chemical compound CCC(=O)NC1=CC=C(Cl)C(Cl)=C1 LFULEKSKNZEWOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 2
- 235000020161 semi-skimmed milk Nutrition 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000212384 Bifora Species 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008857 Ferritin Human genes 0.000 description 1
- 108050000784 Ferritin Proteins 0.000 description 1
- 238000008416 Ferritin Methods 0.000 description 1
- 206010054949 Metaplasia Diseases 0.000 description 1
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- SWLVFNYSXGMGBS-UHFFFAOYSA-N ammonium bromide Chemical compound [NH4+].[Br-] SWLVFNYSXGMGBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000015689 metaplastic ossification Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000000052 vinegar Substances 0.000 description 1
- 235000021419 vinegar Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/79—Transferrins, e.g. lactoferrins, ovotransferrins
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
一种从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法，包括如下步骤：第1步，使用阳离子交换树脂对牛乳中的乳铁蛋白进行吸附、解附；第2步，对第1步得到的解附液进行浓缩；第3步，第2步得到的浓缩液采用不溶性Fe3+螯合树脂对Fe3+进行吸附，再对浓缩液进行浓缩。本方法能够降低乳铁蛋白中Fe3+离子含量，使铁饱和度降低至5‑8%，明显提高乳铁蛋白的抗菌活性和产品品质的标准化与一致性；通过调整Fe3+螯合树脂吸附的时间、搅拌速度以及媒介的浓度、pH，可以对乳铁蛋白中铁的饱和度进行控制，满足不同产品功能对乳铁蛋白饱和度的要求。
Description
技术领域
本发明涉及一种从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法，属于蛋白提取与制备技术领域。
背景技术
乳铁蛋白具有抗微生物活性是由于它具有结合对于某些细菌生长必需的铁的能力。一些研究者（Bishop等，1977；Payne等，1990）的研究证实乳铁蛋白的抗微生物活性依赖于它的铁饱和度。Batish等人（1988）还发现低铁饱和度乳铁蛋白的抗菌活性比高铁饱和度乳铁蛋白的抗菌活性高。中国专利CN200510095244.3公开了一种从牛奶或者乳清水中提取与制备高纯度乳铁蛋白的方法，其中制备的乳铁蛋白纯度虽然较高，但是由于奶源的产地不同，比如奶牛的品种、饲养地以及所用饲料均存在一定的区别，因此导致牛奶中乳铁蛋白的铁饱和度具有较大的随机性，难以满足其标准化、规模化应用的需要。为拓宽乳铁蛋白应用，为了保证功效的一致性，需要乳铁蛋白保持稳定一致的饱和度；目前将铁饱和度保持一致的高饱和度可以通过加入铁离子的方式；但是在抗菌类药物的生产过程中为了保证功效的稳定性，需要乳铁蛋白保持稳定一致的低铁饱和度，从而实现药物的标准化、规模化生产；但是目前还未见将乳铁蛋白实现一致低铁饱和度的生产工艺，导致药物抗菌活性未能达到最佳效果；因此，如何实现乳铁蛋白低铁饱和度，满足其做为药品原料标准化的要求，即成为亟待解决的问题。
发明内容
本发明涉及一种用阳离子交换树脂及不溶性Fe3+螯合树脂提取与制备与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法，解决现有技术制备的乳铁蛋白铁饱和度较高且随机而影响抗菌性能的缺陷。
技术方案是：
一种从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法，包括如下步骤：
第1步，使用阳离子交换树脂对牛乳中的乳铁蛋白进行吸附、解附；
第2步，对第1步得到的解附液进行浓缩；
第3步，第2步得到的浓缩液采用不溶性Fe3+螯合树脂对Fe3+进行吸附，再对浓缩液进行浓缩。
所述的第1步中，解附过程是采用二级解附，第一级解附是采用1～2.5%的盐溶液解附，解附液是乳过氧化物酶蛋白，另用；第二级解附是采用3.5～7%的盐溶液解附，解附液送入第2步处理。
所述的盐溶液是指钠盐、钾盐或者钙盐溶液。
所述的第2步中，采用分离膜对解附液进行浓缩；所述的分离膜是截留分子量在1000～50K的超滤膜。
所述的第3步中，不溶性Fe3+螯合树脂是指D403螯合树脂等系列树脂。
所述的第3步中，所述的第3步中，吸附操作时需要在浓缩液中加入醋酸、醋酸盐以及枸橼酸盐，配制其吸附环境中枸橼酸盐浓度为0.05mol/L~1.0mol/L，并调节pH至4.0～6.7；枸橼酸盐可以选择为枸橼酸钠;醋酸、醋酸盐建立缓冲体系，比如醋酸-醋酸钠缓冲液。
所述的第3步中，树脂的吸附时间10～150分钟，吸附时搅拌桨转速速率为10～150rpm，吸附温度在3～30℃
所述的第2步得到的浓缩液在送入第3步之前，需要再经过一次弱酸型阳离子树脂的吸附、解附和超滤膜的浓缩处理。
所述的弱酸型阳离子树脂是指CM树脂等阳离子树脂。
所述的第3步中，采用分离膜对浓缩液进行浓缩；所述的分离膜是截留分子量在1000～50K的超滤膜。
所述第1步中，阳离子交换树脂的制备步骤为：
第1步，取10g氯乙酰化聚苯乙烯-二乙烯基苯微球载体PS-acyl-Cl，加入60ml四氢呋喃溶胀12 h，再加入40ml甲醇，然后按照重量比PS-acyl-Cl：乙二胺：碳酸氢钠为1：8：0.7，依次加入乙二胺和碳酸氢钠，在于80℃下搅拌反应24h，反应结束后，将产物倒入砂芯漏斗中，用蒸馏水洗至中性，甲醇洗滤3遍真空干燥至恒重，得到交联EDA微球载体；
第2步，称60g取交联EDA微球载体，置于三颈烧瓶中，加入二甲基甲酰胺溶胀12 h后，加入2-丙烯酰胺基-2-甲基丙烷磺酸16g、N-丁氧基甲基丙烯酰胺3g、丙烯酸双环戊烯基酯、K2CO3 5g、四丁基溴化铵12g，搅拌下于一定温度的油浴中回流反应，反应结束后将反应产物转移至沙芯漏斗中，用5wt%的HC1清洗4遍后用蒸馏水滤洗至中性，最后用甲醇洗滤后抽干，真空干燥至恒重，得到阳离子交换树脂。
所述牛乳可以是鲜牛乳、牛初乳、乳清或转基因牛乳。
有益效果
本发明提供的方法具有乳铁蛋白提取与制备纯度高的优点，同时能够降低乳铁蛋白中Fe3+离子含量，使铁饱和度降低至5-8%，从而明显提高了乳铁蛋白的抗菌活性。此外通过调整Fe3+螯合树脂吸附的时间、搅拌速度以及媒介的浓度、pH，可以对乳铁蛋白处理后的铁饱和度进行控制，以满足不同产品应用对乳铁蛋白铁饱和度的要求。
具体实施方式
本发明提供的从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法，它分别用放置阳离子交换树脂的搅拌罐来吸附、解附牛乳中乳铁蛋白，并辅以膜分离技术将其分离、浓缩，可以实现对乳铁蛋白的高度纯化；接下来，将所得乳铁蛋白浓缩液放置不溶性Fe3+螯合树脂（如D403螯合等系列树脂）的搅拌罐来吸附铁离子使其失去铁离子变为不饱和状态，并辅以膜分离将其浓缩纯化。
在使用阳离子交换树脂对乳铁蛋白进行吸附、解吸时，搅拌罐可调搅拌桨转速速率为20～100rpm;罐内侧壁有增涡流挡板，罐底设置带过滤板的树脂床，在树脂床上的树脂层上方8～12cm高度处设置快速导流抽滤管。罐内设置供自动控制的各种传感器pH计，重量计，电导率计及温度计，罐内液体保温温度为3～60℃。乳铁蛋白吸附树脂为阳离子交换树脂，树脂吸附解附的次数和条件可以根据不同产品和产品纯度的要求设定；树脂的吸附时间为20～120分钟，吸附温度在3～30℃。树脂的解附采用两级盐浓度分别解附乳过氧化物酶蛋白、乳铁蛋白。第一级盐浓度为1～2.5%，解附乳过氧化物酶蛋白，解附时间为20～120分钟；第二级盐浓度为3.5～7%，解附乳铁蛋白，解附时间为20～120分钟；解附的搅拌速率为20～150rpm。树脂解附的时间为20～120分钟，树脂解附所用的盐为钠盐、钾盐、钙盐；乳铁蛋白解附液通过0.05～1.4微米的微滤膜将乳铁蛋白解附液除菌，去残余的脂肪与其他小颗粒；再用1K～50K分子截留量的超滤膜进行脱盐和浓缩。
在一个实施方式中，为了提高乳铁蛋白的纯度，可以对经上述工艺吸附解附脱盐浓缩的乳铁蛋白浓液再经过一次弱酸型阳离子树脂（如CM树脂）的吸附、解附和超滤膜的浓缩获得的。
上述得到的浓缩液再放置于不溶性Fe3+螯合树脂如D403螯合树脂，加入醋酸溶液、醋酸盐、枸橼酸盐作为媒介，配制其吸附环境浓度为0.05mol/L～1.0mol/L，调pH4.0～6.7，加以搅拌吸附乳铁蛋白中铁离子，树脂吸附搅拌时间、媒介浓度、转速、pH可根据产品对铁饱和度的要求设定（经实验测定，吸附时间对铁饱和度影响最大，拟取10～150分钟）；树脂的吸附时间10～150分钟，搅拌桨转速速率为10～150rpm，吸附温度在3～30℃。吸附后清液用1K-50K分子截留量的超滤膜进行脱盐和浓缩。将乳铁蛋白浓液进行真空冷冻干燥制成冻干粉。
树脂经吸附工艺过程后，所吸附的铁离子用1mol/L～3mol/L盐酸浸泡即可将树脂解附再生，再用RO水冲洗即可供下一批次吸附之用。
实施例1 阳离子交换树脂的制备
本发明所使用的阳离子交换树脂可以通过如下的方法制备得到：
第1步，取10g氯乙酰化聚苯乙烯-二乙烯基苯微球载体(PS-acyl-Cl)，加入60ml四氢呋喃溶胀12 h，再加入40ml甲醇，然后按照重量比(PS-acyl-Cl)：乙二胺（EDA）：碳酸氢钠为1：8：0.7，依次加入乙二胺和碳酸氢钠，在于80℃下搅拌反应24h，反应结束后，将产物倒入砂芯漏斗中，用蒸馏水洗至中性，甲醇洗滤3遍真空干燥至恒重，得到交联EDA微球载体；
第2步，称60g取交联EDA微球载体，置于三颈烧瓶中，加入二甲基甲酰胺溶胀12 h后，加入2-丙烯酰胺基-2-甲基丙烷磺酸(AMPS)16g、N-丁氧基甲基丙烯酰胺(NBMA)3g、丙烯酸双环戊烯基酯（DCPA）、K2CO3 5g、四丁基溴化铵（TBAB） 12g，搅拌下于一定温度的油浴中回流反应，反应结束后将反应产物转移至沙芯漏斗中，用5wt%的HC1清洗4遍后用蒸馏水滤洗至中性，最后用甲醇洗滤后抽干，真空干燥至恒重，得到阳离子交换树脂。
实施例2 阳离子交换树脂的制备
与实施例1的区别在于第2步中未加入NBMA。
本发明所使用的阳离子交换树脂可以通过如下的方法制备得到：
第1步，取10g氯乙酰化聚苯乙烯-二乙烯基苯微球载体(PS-acyl-Cl)，加入60ml四氢呋喃溶胀12 h，再加入40ml甲醇，然后按照重量比(PS-acyl-Cl)：乙二胺（EDA）：碳酸氢钠为1：8：0.7，依次加入乙二胺和碳酸氢钠，在于80℃下搅拌反应24h，反应结束后，将产物倒入砂芯漏斗中，用蒸馏水洗至中性，甲醇洗滤3遍真空干燥至恒重，得到交联EDA微球载体；
第2步，称60g取交联EDA微球载体，置于三颈烧瓶中，加入二甲基甲酰胺溶胀12 h后，加入2-丙烯酰胺基-2-甲基丙烷磺酸(AMPS)16g、丙烯酸双环戊烯基酯（DCPA）、K2CO3 5g、四丁基溴化铵（TBAB） 12g，搅拌下于一定温度的油浴中回流反应，反应结束后将反应产物转移至沙芯漏斗中，用5wt%的HC1清洗4遍后用蒸馏水滤洗至中性，最后用甲醇洗滤后抽干，真空干燥至恒重，得到阳离子交换树脂。
实施例3 乳铁蛋白的吸附、解附试验
配备3份100ml 1.6wt%乳铁蛋白溶液于250ml烧杯中，各取20μl进高效液相色谱仪检测，峰面积分别为1240.0034（万）、1241.6533（万）和1240.0535（万），分别将100gSPC70树脂、实施例1和实施例2中的阳离子交换树脂分别100g置于上述盛有250ml乳铁蛋白溶液的烧杯中，吸附搅拌速率为60rpm，每10min取样一次进行检测，实验数据如下表看出实施例1和2中阳离子树脂提高生产回收率，改善吸附解附所消耗的时间。另外，再经过盐溶液淋洗、解附后计算蛋白含量。
淋洗、解附的操作是：采用两级盐浓度分别解附乳过氧化物酶蛋白、乳铁蛋白。第一级盐浓度为1.5%，采用的是NaCl水溶液，解附乳过氧化物酶蛋白，解附时间为70分钟；第二级盐浓度为5.0%，采用的是NaCl水溶液，解附乳铁蛋白，解附时间为80分钟；解附的搅拌速率为100rpm。乳铁蛋白解附液通过0.2微米的微滤膜将乳铁蛋白解附液除菌，去残余的脂肪与其他小颗粒；再用2000分子截留量的超滤膜进行脱盐和浓缩。
从上表可以看出，采用SPC70树脂、实施例1和实施例2中的阳离子交换树脂都可以较好地获得乳铁蛋白的吸附、解附效果，不过回收率上还是有所区别。
实施例4 乳铁蛋白的提取与制备试验
半脱脂牛奶1890L，pH6.7，总蛋白为3.38g/L，乳铁蛋白浓度为126mg/L，将SPC70树脂加入搅拌罐，吸附80min，搅拌速率为60rpm，收集已吸附后的牛奶并用RO水冲洗树脂，加入第一级100L 2.5%NaCl水溶液解附40min，搅拌转速40rpm，收集解附液后用RO水淋洗收集；加入第二级100L 5.5%NaCl水溶液解附40min，搅拌转速40rpm，收集解附液后用RO水淋洗收集树脂3次。第二级的解吸液以及第二次RO淋洗液合并收集共180L，输送到0.1μm的微滤膜设备中进行除菌、除杂；用30K分子截留量的超滤膜设备进行脱盐浓缩，取样检测其铁饱和度为20%；将乳铁蛋白浓液输入到装有CM树脂罐中除去杂蛋白，收集已吸附杂蛋白后的乳铁蛋白溶液继续用10K分子截留量的超滤膜设备进行脱盐浓缩，将其中的少量浓液进行冷冻干燥所得淡粉色干粉。粉末含水量3.0%，灰分1.1%，总蛋白为96.3%，铁饱和度20%；再将剩余的乳铁蛋白浓液输入到装有放置D403螯合树脂罐中进行脱铁，加入0.1mol/L枸橼酸盐，并醋酸-醋酸钠缓冲液调pH至6.0，加以搅拌吸附铁离子，树脂吸附时间120分钟，搅拌桨转速速率60rpm。收集以吸附铁离子后的乳铁蛋白溶液继续用10K分子截留量的超滤膜设备进行脱盐浓缩，收集浓液进行冷冻干燥所得淡粉色干粉。粉末含水量3.0%，灰分1.0%，总蛋白为96.3%，铁饱和度7%。
实施例5 乳铁蛋白的提取与制备试验
半脱脂牛奶1890L，pH6.7，总蛋白为3.38g/L，乳铁蛋白浓度为126mg/L，采用实施例1中描述的步骤操作生产阳离子交换树脂，将树脂加入搅拌罐，吸附80min，搅拌速率为60rpm，收集已吸附后的牛奶并用RO水冲洗树脂，加入第一级100L 2.5%NaCl水溶液解附40min，搅拌转速40rpm，收集解附液后用RO水淋洗收集；加入第二级100L 5.5%NaCl水溶液解附40min，搅拌转速40rpm，收集解附液后用RO水淋洗收集树脂3次。第二级的解吸液以及第二次RO淋洗液合并收集共180L，输送到0.1μm的微滤膜设备中进行除菌、除杂；用30K分子截留量的超滤膜设备进行脱盐浓缩，取样检测其铁饱和度为20%；将乳铁蛋白浓液输入到装有CM树脂罐中除去杂蛋白，收集已吸附杂蛋白后的乳铁蛋白溶液继续用10K分子截留量的超滤膜设备进行脱盐浓缩，将其中的少量浓液进行冷冻干燥所得淡粉色干粉。粉末含水量3.2%，灰分1.1%，总蛋白为96.7%，铁饱和度20%；再将剩余的乳铁蛋白浓液输入到装有放置D403螯合树脂罐中进行脱铁，加入0.1mol/L枸橼酸盐，并调pH至6.0，加以搅拌吸附铁离子，树脂吸附时间120分钟，搅拌桨转速速率60rpm。收集以吸附铁离子后的乳铁蛋白溶液继续用10K分子截留量的超滤膜设备进行脱盐浓缩，收集浓液进行冷冻干燥所得淡粉色干粉。粉末含水量3.1%，灰分1.0%，总蛋白为96.7%，铁饱和度7%。
实施例6乳铁蛋白的提取与制备试验
与实施例4的区别在于：将剩余的乳铁蛋白浓液输入到装有放置D403螯合树脂罐中进行脱铁，加入1.0mol/L枸橼酸盐，并醋酸-醋酸钠缓冲液调pH至4.0，加以搅拌吸附铁离子，树脂吸附时间20分钟，搅拌桨转速速率150rpm。收集以吸附铁离子后的乳铁蛋白溶液继续用10K分子截留量的超滤膜设备进行脱盐浓缩，收集浓液进行冷冻干燥所得淡粉色干粉。粉末含水量3.0%，灰分1.0%，总蛋白为96.4%，铁饱和度7%。
实施例7乳铁蛋白的提取与制备试验
与实施例5的区别在于：将剩余的乳铁蛋白浓液输入到装有放置D403螯合树脂罐中进行脱铁，加入0.3mol/L枸橼酸盐，并醋酸-醋酸钠缓冲液调pH至6.7，加以搅拌吸附铁离子，树脂吸附时间70分钟，搅拌桨转速速率80rpm。收集以吸附铁离子后的乳铁蛋白溶液继续用10K分子截留量的超滤膜设备进行脱盐浓缩，收集浓液进行冷冻干燥所得淡粉色干粉。粉末含水量3.0%，灰分1.0%，总蛋白为96.5%，铁饱和度8%。
Claims (10)
1.一种从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：
第1步，使用阳离子交换树脂对牛乳中的乳铁蛋白进行吸附、解附；
第2步，对第1步得到的解附液进行浓缩；
第3步，第2步得到的浓缩液采用不溶性Fe3+螯合树脂进行吸附，再对浓缩液进行浓缩。
2.根据权利要求1所述的从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法，其特征在于，所述的第1步中，解附过程是采用二级解附，第一级解附是采用1～2.5%的盐溶液解附，解附液是乳过氧化物酶蛋白，另用；第二级解附是采用3.5～7%的盐溶液解附，解附液送入第2步处理；所述的盐溶液是指钠盐、钾盐或者钙盐溶液。
3.根据权利要求1所述的从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法，其特征在于，所述的第2步中，采用分离膜对解附液进行浓缩；所述的分离膜是截留分子量在1000～50K的超滤膜。
4.根据权利要求1所述的从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法，其特征在于，所述的第3步中，不溶性Fe3+螯合树脂是指D403螯合树脂。
5.根据权利要求1所述的从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法，其特征在于，所述的第3步中，吸附操作时需要在浓缩液中加入醋酸、醋酸盐以及枸橼酸盐，配制其吸附环境中枸橼酸盐浓度为0.1mol/L~1.0mol/L,并调节pH至4.0～6.7。
6.根据权利要求1所述的从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法，其特征在于，所述的第3步中，树脂的吸附时间10～150分钟，吸附时搅拌桨转速速率为10～150rpm，吸附温度在3～30℃。
7.根据权利要求1所述的从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法，其特征在于，所述的第2步得到的浓缩液在送入第3步之前，可再经过一次弱酸型阳离子树脂的吸附、解附和超滤膜的浓缩处理；所述的弱酸型阳离子树脂是指CM树脂。
8.根据权利要求1所述的从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法，其特征在于，所述的第3步中，采用分离膜对浓缩液进行浓缩；所述的分离膜是截留分子量在1000～50K的超滤膜。
9.根据权利要求1所述的从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法，其特征在于，所述第1步中，阳离子交换树脂的制备步骤为：
第1步，取10g氯乙酰化聚苯乙烯-二乙烯基苯微球载体PS-acyl-Cl，加入60ml四氢呋喃溶胀12 h，再加入40ml甲醇，然后按照重量比PS-acyl-Cl：乙二胺：碳酸氢钠为1：8：0.7，依次加入乙二胺和碳酸氢钠，在于80℃下搅拌反应24h，反应结束后，将产物倒入砂芯漏斗中，用蒸馏水洗至中性，甲醇洗滤3遍真空干燥至恒重，得到交联EDA微球载体；
第2步，称60g取交联EDA微球载体，置于三颈烧瓶中，加入二甲基甲酰胺溶胀12 h后，加入2-丙烯酰胺基-2-甲基丙烷磺酸16g、N-丁氧基甲基丙烯酰胺3g、丙烯酸双环戊烯基酯、K2CO3 5g、四丁基溴化铵12g，搅拌下于一定温度的油浴中回流反应，反应结束后将反应产物转移至沙芯漏斗中，用5wt%的HC1清洗4遍后用蒸馏水滤洗至中性，最后用甲醇洗滤后抽干，真空干燥至恒重，得到阳离子交换树脂。
10.根据权利要求1所述的牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法，所述牛乳可以是鲜牛乳、牛初乳、乳清或转基因牛乳。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610526579.4A CN106008703B (zh) | 2016-07-06 | 2016-07-06 | 一种从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610526579.4A CN106008703B (zh) | 2016-07-06 | 2016-07-06 | 一种从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106008703A true CN106008703A (zh) | 2016-10-12 |
| CN106008703B CN106008703B (zh) | 2019-11-22 |
Family
ID=57107252
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610526579.4A Active CN106008703B (zh) | 2016-07-06 | 2016-07-06 | 一种从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106008703B (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106620662A (zh) * | 2016-11-16 | 2017-05-10 | 方雅悯 | 低铁饱和度牛乳铁蛋白在制备治疗幽门螺旋杆菌感染性胃病药物中的应用 |
| CN110655570A (zh) * | 2018-06-29 | 2020-01-07 | 内蒙古伊利实业集团股份有限公司 | 一种制备具有所需铁饱和度的乳铁蛋白的方法 |
| CN111138524A (zh) * | 2018-11-02 | 2020-05-12 | 武汉禾元生物科技股份有限公司 | 一种从基因工程水稻种子中分离纯化低铁饱和度的重组人乳铁蛋白的方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1800200A (zh) * | 2006-03-06 | 2006-07-12 | 方雅悯 | 一种从牛奶或乳清水中提取高纯度蛋白的方法 |
| CN101116833A (zh) * | 2007-07-10 | 2008-02-06 | 南京工业大学 | 一种脂肪族磺酸基强酸型阳离子交换树脂及其制备方法 |
| CN105566489A (zh) * | 2015-12-10 | 2016-05-11 | 无锡科捷诺生物科技有限责任公司 | 一种制备不同铁饱和度乳铁蛋白的方法 |
-
2016
- 2016-07-06 CN CN201610526579.4A patent/CN106008703B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1800200A (zh) * | 2006-03-06 | 2006-07-12 | 方雅悯 | 一种从牛奶或乳清水中提取高纯度蛋白的方法 |
| CN101116833A (zh) * | 2007-07-10 | 2008-02-06 | 南京工业大学 | 一种脂肪族磺酸基强酸型阳离子交换树脂及其制备方法 |
| CN105566489A (zh) * | 2015-12-10 | 2016-05-11 | 无锡科捷诺生物科技有限责任公司 | 一种制备不同铁饱和度乳铁蛋白的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| FENG M等: "《Preparation of apolactoferrin with a very low iron saturation》", 《JOURNAL OF DAIRY SCIENCE》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106620662A (zh) * | 2016-11-16 | 2017-05-10 | 方雅悯 | 低铁饱和度牛乳铁蛋白在制备治疗幽门螺旋杆菌感染性胃病药物中的应用 |
| CN110655570A (zh) * | 2018-06-29 | 2020-01-07 | 内蒙古伊利实业集团股份有限公司 | 一种制备具有所需铁饱和度的乳铁蛋白的方法 |
| CN110655570B (zh) * | 2018-06-29 | 2022-05-03 | 内蒙古伊利实业集团股份有限公司 | 一种制备具有所需铁饱和度的乳铁蛋白的方法 |
| CN111138524A (zh) * | 2018-11-02 | 2020-05-12 | 武汉禾元生物科技股份有限公司 | 一种从基因工程水稻种子中分离纯化低铁饱和度的重组人乳铁蛋白的方法 |
| CN111138524B (zh) * | 2018-11-02 | 2023-07-07 | 武汉禾元生物科技股份有限公司 | 一种从基因工程水稻种子中分离纯化低铁饱和度的重组人乳铁蛋白的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN106008703B (zh) | 2019-11-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106008703A (zh) | 一种从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法 | |
| CN106861622B (zh) | 一种处理富营养化水体的水处理剂 | |
| CN106818752A (zh) | 一种高含量春雷霉素水剂的制备方法 | |
| US20130105398A1 (en) | Method for removing ammonium nitrogen from organic waste water comprising liquid manure | |
| CN105648008A (zh) | 一种饲用蚕丝抗菌肽制剂及其制备方法 | |
| CN108503677A (zh) | 一种提取燕窝中唾液酸的方法 | |
| CN103013951B (zh) | 一种提取纯化小麦胚芽脂肪酶的方法 | |
| CN104031857B (zh) | 一种基于离子交换的乳酸菌高密度培养方法 | |
| CN105999236A (zh) | 一种治疗牛乳房炎的药剂及其应用 | |
| CN105420318A (zh) | 一种乳酸片球菌与片球菌素同步生产的方法 | |
| CN106699876A (zh) | 一种从人尿中大规模收集尿蛋白的方法 | |
| CN105924371A (zh) | 一种籽瓜中l-瓜氨酸的提取方法及泡腾片的制备方法 | |
| CN110632219A (zh) | 一种根系分泌物收集与检测方法 | |
| EP2802414B1 (en) | A method for removing ammonium nitrogen from organic waste water. | |
| CN104744241A (zh) | 一种从柠檬酸发酵液中提纯柠檬酸的方法 | |
| CN105013453A (zh) | 一种可用于提取溶菌酶的阴离子骨架聚合物及其制备方法 | |
| CN106377768A (zh) | 一种慢性咽炎膜剂及其制备方法 | |
| CN203454683U (zh) | 一种基于溶液除湿的干燥和淡水制取联合装置 | |
| CN204575370U (zh) | 沼生植物根际分泌物提取装置 | |
| CN105821025A (zh) | 一种凝血酶的提取方法 | |
| CN103265622B (zh) | 一种硫酸粘杆菌素的生产方法 | |
| CN111499052A (zh) | 一种温泉水处理系统 | |
| CN106377762A (zh) | 一种牛乳铁蛋白及其酶解物在护胃保肝产品中的应用 | |
| Yu et al. | Organic acid exudation from the roots of Cunninghamia lanceolata and Pinus massoniana seedlings under low phosphorus stress | |
| KR940000164B1 (ko) | 두유 및 두부 제조 공정중 대두 올리고당의 추출방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20200717 Address after: 257000 Lu Yidong, king of Dongying agricultural hi tech industry demonstration area, Shandong Patentee after: Dongying Ruida Biological Technology Co.,Ltd. Address before: The city of Hangzhou in West Zhejiang province 311121 No. 1500 city of the future of Technology Innovation Center 6 Building 5 unit 7 Building 701 Co-patentee before: Fang Cunlin Patentee before: Fang Yamin |