CN105420318A - 一种乳酸片球菌与片球菌素同步生产的方法 - Google Patents

一种乳酸片球菌与片球菌素同步生产的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株乳酸片球菌PA003(Pediococcus？acidilactici？PA003)与片球菌素同步生产的方法。利用解析附片球菌素、离心将发酵液中的片球菌素与乳酸片球菌菌体分开，然后经过微滤、超滤、纳滤、冷冻干燥获得片球菌素产品，经喷雾干燥获得乳酸片球菌菌体。其中乳酸片球菌喷干制剂的活菌数可达到8.5×1012-8.6×1012CFU/g，存活率为20-25％。片球菌素产品的纯化倍数为2.5％-2.6％以上，收率可达到80％-85％。为实现同时获得乳酸片球菌制剂及其片球菌素产品提供了依据。

Description

一种乳酸片球菌与片球菌素同步生产的方法
技术领域
本发明涉及一种片球菌素生产方法，特别涉及乳酸片球菌与片球菌素同步生产的方法。
背景技术
在控制食品中病原性和腐败性微生物方面，一个重要的发展就是细菌素的发现。细菌素为肽类物质，由细菌产生，在食品工业上，细菌素指的是由乳酸菌产生，对许多腐败和病原细菌有杀灭作用。因为他们符合公认安全的标准(Generallyrecognizedassafe,GRAS)，因此，具有作为食品保藏剂的巨大潜力。乳酸菌产生的细菌素对食品工业有极强的吸引力，还因为他们属于天然食品防腐剂，使用这些抗菌肽可以大大减少化学添加剂的使用量或减少物理处理的强度。
到目前为止，nisin(乳链球菌素)是唯一得到商业化和大规模应用的细菌素。尽管nisin具有抗菌谱较广、天然、无毒副作用、安全、高效等优点，但其在在中性和碱性条件下溶解度低，对食品中一些酶敏感，及一些细菌可对其产生抗性等问题。因此，对于仅单独用一种细菌素贮藏的食品，抗细菌素的病原微生物的出现是潜在的威胁。克服这些问题的途径之一是开发更多的细菌素，并将多种细菌素联合应用，以弥补使用单一细菌素可能出现的问题。片球菌素被认为是继nisin之后第二个有望用于食品工业的细菌素。主要因为它由符合GRAS标准的片球菌产生，具有广谱抑菌作用，在食品中性质稳定，进入消化道后迅速被蛋白酶消化等特征。
乳酸片球菌能够定居到动物和人的消化道，作为潜在的益生菌显示出良好的应用前景。目前乳酸片球菌作为益生菌的应用主要集中在小动物、禽类、猪和水产动物等，正被作为益生制剂用于治疗便秘、腹泻、消除应激反应、增强免疫力等。乳酸片球菌作为益生菌制剂代替抗生素用于饲料中是国际上备受推崇的措施之一，具有良好的市场前景。
现有的片球菌素纯化方法，都较为繁琐，大量纯化成本也较高。且在纯化的过程中只提取片球菌素，而乳酸片球菌则在纯化的过程中死亡而未被收集利用。乳酸片球菌有很多益生作用，在发酵过程中不能够收集应用是一种浪费。因此建立获得乳酸片球菌菌体和片球菌素的同步生产工艺具有重要的意义。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种乳酸片球菌与片球菌素同步生产的方法，克服现有技术中片球菌素纯化方法繁琐、成本较高、乳酸片球菌在纯化的过程中未被收集利用的问题。
本发明的技术方案是：一种乳酸片球菌与片球菌素同步生产的方法，包括以下步骤：
(1)将含有乳酸片球菌和片球菌素的发酵液调节pH为2.8-3.2，搅拌进行解吸附；
(2)将步骤(1)解吸附的发酵液离心处理，得到上清液和菌体；
(3)将步骤(2)所得上清液依次经过微滤、超滤、纳滤、冷冻干燥工艺获得片球菌素产品；
(4)将步骤(2)所得菌体进行喷雾干燥获得乳酸片球菌喷干制剂。
所述步骤(1)搅拌解吸附速率为200r/min，时间2h。
所述步骤(2)离心的条件为4℃,10000rpm。
所述步骤(3)微滤的条件为0.45μm水系微滤膜，室温，压力为0.1Mpa。
所述步骤(3)超滤工艺的条件为：选择截留分子量为5000Da的聚醚砜膜，在室温，0.02MPa的条件下进行超滤处理，超滤浓缩比为3时，进行洗滤操作，加入与初始料液等体积的去离子水进行全过滤工艺，待超滤浓缩比为5时停止超滤处理。
所述步骤(3)纳滤工艺的条件为：选择截留分子量为650Da的聚醚砜膜，在室温，0.02MPa的条件下进行纳滤处理，纳滤浓缩比为4时停止纳滤浓缩。
所述步骤(3)冷冻干燥获得片球菌素产品工艺为：将纳滤浓缩液中加入一定量的氯化钠，最终浓度为70％-80％，首先-45℃预冻2h，温度为-56℃，干燥6h。
所述步骤(4)喷雾干燥获得乳酸片球菌喷干制剂工艺为：保护剂为海藻糖48-52g/L，β-环糊精28-32g/L，乳糖38-42g/L，脱脂乳粉98-102g/L；进口温度145-155℃，进料流速为65-75mL/h，保护剂与菌泥的比例为0.235-0.245(L:g)。
本发明的有益效果为：本发明同步生产方法同时获得了乳酸片球菌菌体和片球菌素产品。乳酸片球菌喷干制剂的活菌数可达到8.5×1012-8.6×1012CFU/g，存活率为20-25％。片球菌素产品的纯化倍数为2.5％-2.6％以上，收率可达到80％-85％。
附图说明
图1乳酸片球菌素效价标准曲线；抑菌圈直径差：不同浓度的片球菌素溶液与中心浓度(片球菌素溶液与PBS缓冲液1:1混合，效价为320AU/mL)的片球菌素溶液抑菌圈直径的差值；
图2乳酸片球菌菌体和片球菌素同步生产工艺流程图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明做详细说明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
海藻糖购自南宁中诺生物工程有限责任公司，谷氨酸钠购自国药集团化学试剂有限公司、α-乳糖购自上海恒信化学试剂有限公司、β-环状糊精购自西安宏昌药业有限责任公司、脱脂乳粉购自新西兰Westland合作乳业有限公司。
5000Da和650Da聚醚砜超滤滤膜，美国Pall公司；小型喷雾干燥机，美国Labplant公司。
本发明中所述乳酸片球菌是指乳酸片球菌PA003(PediococcusacidilacticiPA003)。
实施例1
片球菌素效价测定
乳酸片球菌发酵液用2mol/L的HCI调节pH到1.9-2.0,防止乳酸片球菌素吸附到细胞上，65-70℃水浴28-30min,防止发酵液中的蛋白酶破坏细菌素。然后，8000r/min，4℃离心15-20min,取上清液用2mol/L的NaOH调节pH到5.9-6.1,进行抑菌试验测定乳酸片球菌素效价。乳酸片球菌素的抑菌活性实验参考管碟法。效价的测定采用二倍稀释法，以李氏杆菌为指示菌，细菌素液依次用0.02mol/L，pH6.0的磷酸缓冲液(PBS)2倍稀释，用对指示菌显示抑菌圈的最高稀释倍数表示细菌素活性，计算式为：AU/mL＝2n×(1000/x)，n表示对指示菌显示抑菌圈的大小与牛津杯外径的差值不小于2mm的孔数；x表示每孔中的细菌素液加样体积。二倍稀释法确定了乳酸片球菌培养16-17h后发酵液中乳酸片球菌素的效价为640AU/mL，抑菌圈直径差与效价对数值呈线性关系，可绘出效价标准曲线(见图1)。
实施例2
发酵后乳酸片球菌上吸附的片球菌素含量分析
乳酸片球菌培养16h后，发酵液分别进行如下处理：(1)发酵液离心(8000r/min，4℃，10min)，上清液用4mol/LHCI调pH为2.0，置于4℃冰箱备用，收集菌体备用；(2)上述离心后的菌体2次洗涤后，加入发酵液等体积的100mmol/LNaCl(pH2.0)，电动搅拌12h，取上清液备用；(3)发酵液不离心直接用4mol/LHCI调pH为2.0，电动搅拌搅拌12h，取上清液备用；(4)发酵液用4mol/LHCI调pH为2.0，70℃，30min灭酶，离心(8000r/min，4℃，10min)取上清液，置于4℃冰箱中保存备用。
发酵结束后菌体细胞上吸附的片球菌素含量为总片球菌素含量的28.51％。需要对乳酸片球菌进行解析附处理以增加发酵液中的片球菌素含量。为了同步获得较多产量的乳酸片球菌素及活菌体，选择2h作为其适宜的解吸附时间，pH值3.0作为片球菌素的适宜吸附pH值。
实施例3
超滤膜的选择
根据处理料液的性质及目的的不同，需选取合适的超滤膜进行超滤操作，实验通过测定片球菌素纯化倍数和回收率、膜通量、杂蛋白去除率和膜抗污染性能指标来筛选最适合的超滤膜。实验选择截留分子量分别为1000Da，5000Da，10000Da的聚醚砜膜(PES)，20000Da，10000Da，5000Da，1000Da的陶瓷膜(CT)对片球菌素进行超滤处理超滤实验在室温和0.2MPa的压力条件下进行，采用循环超滤的模式。
1.片球菌素回收率和杂蛋白去除率测定
对经微滤处理后的400mL料液进行循环超滤，在超滤浓缩比分别为1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5时测定透过液和浓缩液的体积、蛋白质浓度和片球菌素活性，以及膜通量。
超滤浓缩比为初始料液的体积与超滤后剩余料液的体积比。透过液中物质的回收率为透过液中此物质的量与料液中相应物质的量的比值。浓缩液中物质回收率等于浓缩液中此物质的量与料液中相应物质的量的比值。
2.膜通量测定
对经微滤处理后的400mL料液进行循环超滤，每隔20min测定一次膜通量，膜通量常用单位时间内通过单位膜面积的透过液的体积来表示。
3.膜组件的清洗
超滤处理结束后，先用一定量的去离子水冲洗超滤膜设备10min，然后用0.5mol/L的NaOH水溶液清洗超滤膜30min。然后，用去离子水清洗干净超滤膜内残留的碱液。
4.通量回复率测定
膜组件清洗完成后，测定膜的去离子水通量。清洗后的超滤膜设备的去离子水通量与膜的初始水通量的比值，即为通量回复率
综合考虑不同超滤膜的纯化倍数、片球菌素收率、膜通量和膜通量回复率指标进行实验用超滤膜选择。相同截留分子量的陶瓷膜的初始膜通量要高于聚醚砜膜，但是陶瓷膜更易于被污染，且片球菌素的纯化倍数、收率以及膜通量回复率要低于聚醚砜膜，因此实验的超滤膜材质将选择聚醚砜膜。聚醚砜超滤膜中，5000Da的超滤膜对片球菌素有最好的纯化倍数，可达到3.9-4.0，和相对较高的片球菌素收率，初始膜通量略低，但是膜通量的回复率和抗污性能要高于10000Da的超滤膜。综上所述，实验选择5000Da聚醚砜膜对乳酸片球菌素进行超滤处理。
表1不同超滤膜超滤后蛋白质浓度和片球菌素活性(超滤浓缩比为4时)
Table1ResultsoftheUFtestsrealizedwithsevenmembranesofdifferentMWCO(VCF＝4)
5.洗滤条件的确定
取微滤后的片球菌发酵液1600mL均分为4份，每份400mL，分别在室温和0.2MPa的条件下进行全过滤。用5000Da的聚醚砜超滤膜进行超滤，测定不同超滤浓缩比时截留液、透过液中的片球菌素含量，片球菌素收率和膜通量以选择合适的超滤浓缩比进行全过滤工艺。
全过滤工艺共分为以下4个阶段：第一阶段，当浓缩比等于3时，补水稀释至400mL；第二阶段，再次浓缩至浓缩比为3时，补水稀释至400mL；第三个阶段，同样浓缩比为3时，补水稀释至400mL；第四个阶段，浓缩至超滤浓缩比为3，整个超滤过程结束。试验中，对各个阶段片球菌素收率、膜通量进行监测，确定最优的洗滤模式。
选择超滤浓缩比为3时开始进行洗滤操作。未洗滤前片球菌素收率为40-50％。第一阶段洗滤后片球菌素的收率增加到70-75％，第二阶段、第三阶段和第四阶段时，片球菌素的收率没有显著增加(p＞0.05)。稀释补水后，膜通量能够得到较好的恢复，在第一阶段全过滤工艺后，膜通量回复率也达到了85-90％。因此选择“一阶段全过滤工艺”，即当浓缩比等于3时，补水稀释至400mL，继续进行超滤，待超滤浓缩比为5时停止超滤处理，片球菌素的收率为90-95％。
实施例4
纳滤浓缩
收集上述得到的超滤透过液，用650Da的纳滤膜进行纳滤浓缩实验，分别在不同的纳滤浓缩比时测定浓缩液中片球菌素的含量以及膜通量，确定适宜的纳滤浓缩比。选择当纳滤浓缩比为4时停止浓缩处理，浓缩液中片球菌素的收率为80-85％，整个浓缩过程的时间为60min左右。
实施例5
冷冻干燥获得片球菌素产品
将片球菌素粗提液中加入一定量的氯化钠，最终浓度为70％-80％，首先-45℃左右预冻2h左右，在温度为-56℃左右，干燥6h，得到片球菌素产品。
实施例6
喷雾干燥获得乳酸片球菌制剂
保护剂为海藻糖48-52g/L，β-环糊精28-32g/L，乳糖38-42g/L，脱脂乳粉98-102g/L；在进口口温度145-155℃，进料流速为65-75mL/h，保护剂与菌泥的比例为0.235-0.245(L:g)的条件下进行喷雾干燥，得到乳酸片球菌制剂。
尽管上面结合附图对本发明进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，并不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可以做出很多形式，这些均属于本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种乳酸片球菌与片球菌素同步生产的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将含有乳酸片球菌和片球菌素的发酵液调节pH为2.8-3.2，搅拌进行解吸附；
(2)将步骤(1)解吸附的发酵液离心处理，得到上清液和菌体；
(3)将步骤(2)所得上清液依次经过微滤、超滤、纳滤、冷冻干燥工艺获得片球菌素产品；
(4)将步骤(2)所得菌体进行喷雾干燥获得乳酸片球菌喷干制剂。
2.根据权利要求1所述乳酸片球菌与片球菌素同步生产的方法，其特征在于，所述步骤(1)搅拌解吸附速率为200r/min，时间2h。
3.根据权利要求1所述乳酸片球菌与片球菌素同步生产的方法，其特征在于，所述步骤(2)离心的条件为4℃,10000rpm。
4.根据权利要求1所述乳酸片球菌与片球菌素同步生产的方法，其特征在于，所述步骤(3)微滤的条件为0.45μm水系微滤膜，室温，压力为0.1Mpa。
5.根据权利要求1所述乳酸片球菌与片球菌素同步生产的方法，其特征在于，所述步骤(3)超滤工艺的条件为：选择截留分子量为5000Da的聚醚砜膜，在室温，0.02MPa的条件下进行超滤处理，超滤浓缩比为3时，进行洗滤操作，加入与初始料液等体积的去离子水进行全过滤工艺，待超滤浓缩比为5时停止超滤处理。
6.根据权利要求1所述乳酸片球菌与片球菌素同步生产的方法，其特征在于，所述步骤(3)纳滤工艺的条件为：选择截留分子量为650Da的聚醚砜膜，在室温，0.02MPa的条件下进行纳滤处理，纳滤浓缩比为4时停止纳滤浓缩。
7.根据权利要求1所述乳酸片球菌与片球菌素同步生产的方法，其特征在于，所述步骤(3)冷冻干燥获得片球菌素产品工艺为：将纳滤浓缩液中加入一定量的氯化钠，最终浓度为70％-80％，首先-45℃预冻2h，温度为-56℃，干燥6h。
8.根据权利要求1所述乳酸片球菌与片球菌素同步生产的方法，其特征在于，所述步骤(4)喷雾干燥获得乳酸片球菌喷干制剂工艺为：保护剂为海藻糖48-52g/L，β-环糊精28-32g/L，乳糖38-42g/L，脱脂乳粉98-102g/L；进口温度145-155℃，进料流速为65-75mL/h，保护剂与菌泥的比例为0.235-0.245(L:g)。
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