CN103288932A - 一种从发酵液中分离提取乳酸片球菌素pa-1的方法 - Google Patents

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CN103288932A CN2013102379766A CN201310237976A CN103288932A CN 103288932 A CN103288932 A CN 103288932A CN 2013102379766 A CN2013102379766 A CN 2013102379766A CN 201310237976 A CN201310237976 A CN 201310237976A CN 103288932 A CN103288932 A CN 103288932A
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Abstract

本发明涉及一种从发酵液中分离提取乳酸片球菌素PA-1的方法,包括发酵液蛋白酶的失活,发酵液中乳酸片球菌素PA-1的释放,板框过滤除菌和颗粒状杂质,微滤除大分子杂质,二步超滤:即第一步选用截留分子量为10000-30000道尔顿的超滤膜,主要目的是除去大分子蛋白、核酸和胶体等,第二步选用截留分子量为1000-3000道尔顿的超滤膜,主要目的是除去小分子杂质并浓缩。最后将浓缩液经C18制备色谱纯化并冷冻干燥或加入食盐填料,进行喷雾干燥得到粉末状成品。本发明工艺方法全程流体操作、能耗低、劳动强度低、条件温和、易于工业放大、适用于多种后续纯化方法;产品质量稳定;不消耗有机溶剂,安全环保。

Description

一种从发酵液中分离提取乳酸片球菌素PA-1的方法
技术领域
本发明属于生物化工领域,涉及一种利用膜分离技术,尤其是一种从发酵液中分离提取乳酸片球菌素PA-1的方法。
背景技术
乳酸片球菌素PA-1(Pediocin PA-1)是由44个氨基酸组成的具有抗菌活性的小肽,其等电点为9.6,理论分子量为4624Da。乳酸片球菌素PA-1最早是在乳酸片球菌PAC1.0中发现的,并因此被冠名。随着研究的不断深入,发现除了乳酸片球菌外,乳酸菌的其它属、种微生物,如植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)和小片球菌(Pediococcus parvulus)也能产生乳酸片球菌素PA-1。
乳酸片球菌素PA-1的抑菌范围为亲缘关系相近的乳酸菌和部分非乳酸菌的革兰氏阳性细菌,尤其对食品中常见致病菌和腐败菌,如单细胞增多症李氏杆菌和梭状芽孢杆菌有很好的抑菌效果。此外,乳酸片球菌素PA-1具有较好的耐热、耐酸、耐有机溶剂等特性,这些特性证明了乳酸片球菌素PA-1具有很好的食品防腐剂的开发潜力。
目前,对乳酸片球菌素PA-1的提取纯化方法报道的很多,与普通的蛋白纯化类似,多为细菌素的浓缩结合各级色谱纯化,这些方法适合实验室小规模纯化,可以达到理想的纯度,但步骤繁琐,收率损失较大,而且费时费力。2008年,Naghmouchi等人首次报道了亲和色谱一步纯化乳酸片球菌素PA-1,这种方法简单、快速、特异性强,重复性好,但亲和色谱填料成本昂贵,再生困难。
从科学研究的角度分析,我们需要大量的(毫克级)高纯度的乳酸片球菌素PA-1进行更为深入的生化结构解析和构效研究;从应用的角度分析,我们需要大量的(克级)、不用很高纯度的细菌素产品来直接应用。无论如何,现有的盐析结合各级色谱纯化的方法都过于繁琐,大量纯化成本也太高;因此,开发更为简便,更有实际应用价值的工业化级别的纯化方法很有必要。
膜分离技术兼有分离、浓缩、纯化和精制的功能,是当今循环经济时代最受瞩目的一项高新技术,膜分离技术的出现,为工业化规模纯化细菌素提供了新的、可行的思路,利用膜分离技术从发酵液中分离提取乳酸片球菌素PA-1还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处,提供一种从发酵液中分离提取乳酸片球菌素PA-1的方法,本方法利用膜分离技术,具有操作简单、耗能少、污染小、成本低、易于工业化生产和适用于多种后续纯化方法等诸多优点。
本发明实现目的的技术方案是:
一种从发酵液中分离提取乳酸片球菌素PA-1的方法,步骤如下:
⑴发酵液预处理
取含乳酸片球菌素PA-1的发酵液,60-80℃恒温水浴处理30-60分钟,冷却至20-30℃,用浓盐酸调节pH至2.0-3.0,搅拌,释放乳酸片球菌素PA-1于发酵液中;
⑵板框过滤
在发酵液中加入0.5-1.2%的助滤剂,搅拌,进行板框过滤,弃去滤饼,收集滤液;
⑶微滤除杂
将板框过滤后的滤液在温度25-35℃,压力为1.0-1.5MPa下通过金属氧化膜或陶瓷膜过滤,膜的孔径为5μm,微滤至体积浓缩比3-6倍时,开始洗滤,洗滤液的体积和浓缩液体积相同,最终使浓缩液为初始进料液体积的4-7%,渗透液为乳酸片球菌素PA-1的粗提液;
⑷超滤除杂
步骤⑶得到的渗透液在温度20-30℃,压力为0.05-0.1MPa下,通过截留分子量为10000-30000道尔顿的超滤膜,超滤至体积浓缩比为4-6时,加入和浓缩液等量的水进行洗滤,至最终浓缩液为料液体积的4-10%为止,收集滤液;
⑸超滤除杂浓缩
步骤⑷得到的滤液通过截留分子量为1000-3000道尔顿的超滤膜过滤,超滤操作温度20-30℃,压力为0.05-0.1MPa,超滤至体积浓缩比为8-12时为止,收集浓缩液;
⑹喷雾干燥
步骤⑸得到的浓缩液,加入填料固体食盐,在喷雾干燥机进行干燥,进口温度为120-170℃,出口温度为70-90℃,使喷雾干燥后含盐量为25-35%,喷雾干燥,即得乳酸片球菌素PA-1;
而且,所述助滤剂为硅藻土或珍珠岩。
而且,所述超滤膜为中空纤维膜。
而且,所述步骤⑸超滤除杂浓缩后经过如下步骤,获得乳酸片球菌素PA-1的白色粉末:
⑺C18制备色谱纯化
步骤⑸得到的浓缩液,经反相C18制备色谱纯化,收集保留时间15.0-15.4分钟的蛋白峰为乳酸片球菌素PA-1活性峰;
⑻冷冻干燥
步骤⑺得到的活性峰溶液,可直接冷冻干燥为乳酸片球菌素PA-1的白色粉末。
而且,步骤⑺的色谱条件如下:
流动相:A,5%乙腈,含0.1%三氟乙酸;B,80%乙腈,含0.1%三氟乙酸;梯度洗脱程序为0~5min,100%A;5~30min,100%A~100%B;30~35min,100%B;35~42min,100%B~100%A;42~45min,100%A;流速:3mL·min-1,检测波长:280nm。
本发明的优点和积极效果是:
1、本发明在发酵预处理液加入助滤剂硅藻土或珍珠岩,加量为发酵液体积0.5-1.2%,然后再进行板框过滤,由于硅藻土或珍珠岩的颗粒较大,且结构松散,在发酵预处理液中起到很好助滤的作用,使板框过滤的速度和速率加快,提高了发酵液的处理能力。
2、本发明在微滤除杂的步骤中使用了“洗滤”的方法,洗滤采用和滤液相同pH的稀硫酸或稀盐酸,稀酸体积为浓缩液的1-2倍,洗滤能够增加目标小肽PA-1的通过率,在有效滤除培养基杂质和菌体的同时,减少除杂过程中小肽的损失,显著提高了乳酸片球菌素PA-1的收率。
3、本发明采用两步超滤的方法除去杂质,首先经过通过截留分子量为10000-30000道尔顿的中空纤维膜超滤除去大分子蛋白等杂质,再通过截留分子量为1000-3000道尔顿的超滤膜过滤,去除发酵液中的水、小分子无机盐和氨基酸等,通过两个步骤的除杂,能够有效除去比溶液中比小肽PA-1的分子量大和比其分子量小的杂质,使最终乳酸片球菌素PA-1的纯度更高,具有较大的实用意义,增加了乳酸片球菌素PA-1的实用性。
4、本方法建立了以膜分离工艺为核心提取细菌素的方法,具有全程流体操作、能耗低、劳动强度低、条件温和、易于工业放大的优点,其产品质量稳定,同时纯化全程不消耗有机溶剂,安全环保。
5、本方法经膜分离纯化浓缩3-5升发酵液后,可直接通过制备色谱纯化得到毫克级、高纯度的乳酸片球菌素PA-1以满足科学研究的需要,亦可进行喷雾干燥得到克级乳酸片球菌素PA-1的半纯品直接应用于食品中。
6、本方法采用喷雾干燥得到可直接应用的乳酸片球菌素PA-1的半纯品,具有设备简单,成本低,适合大规模生产等优点。食盐安全无毒,作为填料具有很好的助干效果,产品回收率高,呈白色均匀粉状。
附图说明
图1是乳酸片球菌素PA-1的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱图。
图2是膜分离浓缩液的制备色谱图,此图说明活性片球菌素PA-1的保留时间为15.0-15.4分钟;
图3是制备色谱收集的乳酸片球菌素PA-1的分析色谱图,此图说明没有其他杂质峰,片球菌素PA-1的纯度很高,纯度>99%;
图4是喷雾干燥产品在不同温度下的抑菌平板图,此图是喷雾干燥产品在不同温度下的抑菌效果图,与喷雾干燥进出口温度无关,只是说明按照步骤中描述的喷雾干燥方法得到的产品都有抑菌效果,而且温度稳定性很好;
图5为本发明乳酸片球菌素PA-1的工业化规模纯化流程。
具体实施方式:
下面通过具体实施例对本发明作进一步详述,以下实施例只是描述性的,不是限定性的,不能以此限定本发明的保护范围。
本发明使用的微滤膜可采用无机或管式膜系以陶瓷膜或金属氧化膜等为原料制作,超滤膜采用中空纤维聚砜膜、硝酸纤维膜、醋酸纤维膜等为原料制作。
膜污染是膜分离过程中普遍存在的问题,为使膜的各项性能指标在实验结束之后得以恢复,以尽量延长膜的使用寿命,降低生产成本,必须进行清洗再生。清洗方法为:先用用适量的去离子水冲洗膜组件15min,尽量冲走管道及膜面的污染物,然后用用0.2%的NaOH水溶液,在室温下以全回流模式清洗超滤膜40min。最后,用去离子水将膜内的碱液清洗干净。
反相C18制备色谱柱购置于日本岛津公司,型号为Inertsil ODS-3制备色谱柱(50mm)。
实施例1
一种从发酵液中分离提取乳酸片球菌素PA-1的方法,步骤如下:
⑴发酵液预处理
首先取1L含乳酸片球菌素PA-1的发酵液,70℃恒温水浴处理60分钟,使蛋白酶失活,冷却至25℃;用浓盐酸调节pH至2.0,电动搅拌20分钟,释放乳酸片球菌素PA-1于发酵液中。
⑵板框过滤
在发酵液中加入0.5%的硅藻土,搅拌均匀,进行板框过滤,弃去滤饼,收集滤液;
⑶微滤除杂
将板框过滤后的滤液在温度30℃,压力为1.0MPa下通过金属氧化膜过滤,除去培养基杂质和菌体,该膜的孔径为5μm,微滤至体积浓缩比4倍时,开始洗滤,洗滤液的体积和浓缩液体积相同,最终使浓缩液为初始进料液体积的5%,渗透液为乳酸片球菌素PA-1的粗提液;
⑷超滤除杂
步骤⑶得到的渗透液在温度25℃,压力为0.06MPa下,通过截留分子量为10000道尔顿的中空纤维膜超滤除去大分子蛋白等杂质,超滤至体积浓缩比为5时,加入和浓缩液等量的水进行洗滤,至最终浓缩液为料液体积的5%为止,收集滤液;
⑸超滤除杂浓缩
步骤⑷得到的滤液通过截留分子量为1000道尔顿的超滤膜过滤,去除发酵液中的水、小分子无机盐和氨基酸等,超滤操作温度25℃,压力为0.06MPa,超滤至体积浓缩比为10时为止,收集浓缩液。
⑹喷雾干燥
步骤⑸得到的浓缩液,加入填料固体食盐,使喷雾干燥后含盐量为30%,喷雾干燥进口温度120℃,出口温度70℃,即得粉末状食品级乳酸片球菌素PA-1产品。
本实施例中,整个流程中板框过滤收率大于99%,微滤收率为92%,超滤除杂收率为92%,超滤浓缩收率为96%,喷雾干燥收率为85%,整体收率达68.4%。
实施例2
一种从发酵液中分离提取乳酸片球菌素PA-1的方法,步骤如下:
⑴发酵液预处理
首先取1L含乳酸片球菌素PA-1的发酵液,70℃恒温水浴处理30分钟,使蛋白酶失活,冷却至30℃;用浓盐酸调节pH至2.0,电动搅拌30分钟,释放乳酸片球菌素PA-1于发酵液中。
⑵板框过滤
在发酵液中加入0.8%的硅藻土,搅拌均匀,进行板框过滤,弃去滤饼,收集滤液。
⑶微滤除杂
将板框过滤后的滤液在温度25℃,压力为0.8MPa下通过金属氧化膜过滤除去培养基杂质和菌体,该膜的孔径为5μm。微滤至体积浓缩比5倍时,开始洗滤,洗滤液的体积为浓缩液体积的2倍,最终使浓缩液为初始进料液体积的5%。渗透液为乳酸片球菌素PA-1的粗提液。
⑷超滤除杂
步骤⑶得到的渗透液在温度25℃,压力为0.08MPa下,通过截留分子量为10000道尔顿的中空纤维膜超滤除去大分子蛋白等杂质,超滤至体积浓缩比为4时,加入和浓缩液等量的水进行洗滤,至最终浓缩液为料液体积的5%为止。收集滤液。
⑸超滤除杂浓缩
步骤⑷得到的滤液通过截留分子量为1000道尔顿的超滤膜过滤,去除发酵液中的水、小分子无机盐和氨基酸等。超滤操作温度30℃,压力为0.06MPa,超滤至体积浓缩比为10时为止。收集浓缩液。
⑹喷雾干燥
步骤⑸得到的浓缩液,加入填料固体食盐,使喷雾干燥后含盐量为20%,喷雾干燥进口温度150℃,出口温度80℃,即得粉末状食品级乳酸片球菌素PA-1产品。
本实施例中,整个流程中板框过滤收率大于99%,微滤收率为94%,超滤除杂收率为91%,超滤浓缩收率为97%,喷雾干燥收率为88%,整体收率达72.3%。
实施例3
一种从发酵液中分离提取乳酸片球菌素PA-1的方法,步骤如下:
⑴发酵液预处理
首先取1L含乳酸片球菌素PA-1的发酵液,80℃恒温水浴处理30分钟,使蛋白酶失活,冷却至20℃;用浓盐酸调节pH至2.0,电动搅拌40分钟,释放乳酸片球菌素PA-1于发酵液中。
⑵板框过滤
在发酵液中加入1.0%的硅藻土,搅拌均匀,进行板框过滤,弃去滤饼,收集滤液。
⑶微滤除杂
将板框过滤后的滤液在温度35℃,压力为0.8MPa下通过陶瓷膜过滤除去培养基杂质和菌体,该膜的孔径为10μm。微滤至体积浓缩比5倍时,开始洗滤,洗滤液的体积为浓缩液体积的2倍,最终使浓缩液为初始进料液体积的5%。渗透液为乳酸片球菌素PA-1的粗提液。
⑷超滤除杂
步骤3得到的渗透液在温度30℃,压力为0.06MPa下,通过截留分子量为10000道尔顿的中空纤维膜超滤除去大分子蛋白等杂质,超滤至体积浓缩比为4时,加入浓缩液2倍体积的水进行洗滤,至最终浓缩液为料液体积的5%为止。收集滤液。
⑸超滤除杂浓缩
步骤4得到的滤液通过截留分子量为3000道尔顿的超滤膜过滤,去除发酵液中的水、小分子无机盐和氨基酸等。超滤操作温度30℃,压力为0.06MPa,超滤至体积浓缩比为10时为止。收集浓缩液。
⑹喷雾干燥
步骤5得到的浓缩液,加入填料固体食盐,使喷雾干燥后含盐量为30%,喷雾干燥进口温度160℃,出口温度80℃,即得粉末状食品级乳酸片球菌素PA-1产品。
本发明方法中,整个流程中板框过滤收率大于99%,微滤收率为94%,超滤除杂收率为91%,超滤浓缩收率为93%,喷雾干燥收率为84%,整体收率达66.2%。
实施例4
一种从发酵液中分离提取乳酸片球菌素PA-1的方法,步骤如下:
⑴发酵液预处理
首先取1L含乳酸片球菌素PA-1的发酵液,80℃恒温水浴处理60分钟,使蛋白酶失活,冷却至30℃;用浓盐酸调节pH至2.5,电动搅拌40分钟,释放乳酸片球菌素PA-1于发酵液中。
⑵板框过滤
在发酵液中加入1.0%的硅藻土,搅拌均匀,进行板框过滤,弃去滤饼,收集滤液。
⑶微滤除杂
将板框过滤后的滤液在温度30℃,压力为0.8MPa下通过陶瓷膜过滤除去培养基杂质和菌体,该膜的孔径为10μm。微滤至体积浓缩比4倍时,开始洗滤,洗滤液的体积为浓缩液体积的2倍,最终使浓缩液为初始进料液体积的5%。渗透液为乳酸片球菌素PA-1的粗提液。
⑷超滤除杂
步骤⑶得到的渗透液在温度30℃,压力为0.06MPa下,通过截留分子量为30000道尔顿的中空纤维膜超滤除去大分子蛋白等杂质,超滤至体积浓缩比为4时,加入浓缩液2倍体积的水进行洗滤,至最终浓缩液为料液体积的5%为止。收集滤液。
⑸超滤除杂浓缩
步骤⑷得到的滤液通过截留分子量为1000道尔顿的超滤膜过滤,去除发酵液中的水、小分子无机盐和氨基酸等。超滤操作温度30℃,压力为0.06MPa,超滤至体积浓缩比为10时为止。收集浓缩液。
⑹喷雾干燥
步骤⑸得到的浓缩液,加入填料固体食盐,使喷雾干燥后含盐量为40%,喷雾干燥进口温度170℃,出口温度90℃,即得粉末状食品级乳酸片球菌素PA-1产品。
本发明方法中,整个流程中板框过滤收率大于99%,微滤收率为94%,超滤除杂收率为93%,超滤浓缩收率为94%,喷雾干燥收率为85%,整体收率达69.2%。
实施例5
一种从发酵液中分离提取乳酸片球菌素PA-1的方法,步骤如下:
⑴发酵液预处理
首先取1L含乳酸片球菌素PA-1的发酵液,80℃恒温水浴处理30分钟,使蛋白酶失活,冷却至25℃;用浓盐酸调节pH至3.0,电动搅拌20分钟,释放乳酸片球菌素PA-1于发酵液中。
⑵板框过滤
在发酵液中加入1.2%的硅藻土,搅拌均匀,进行板框过滤,弃去滤饼,收集滤液。
⑶微滤除杂
将板框过滤后的滤液在温度25℃,压力为1.0MPa下通过金属氧化膜过滤除去培养基杂质和菌体,该膜的孔径为5μm。微滤至体积浓缩比4倍时,开始洗滤,洗滤液的体积和浓缩液体积相同,最终使浓缩液为初始进料液体积的5%。渗透液为乳酸片球菌素PA-1的粗提液。
⑷超滤除杂
步骤3得到的渗透液在温度25℃,压力为0.06MPa下,通过截留分子量为10000道尔顿的中空纤维膜超滤除去大分子蛋白等杂质,超滤至体积浓缩比为5时,加入和浓缩液相同体积的水进行洗滤,至最终浓缩液为料液体积的5%为止。收集滤液。
⑸超滤除杂浓缩
步骤4得到的滤液通过截留分子量为3000道尔顿的超滤膜过滤,去除发酵液中的水、小分子无机盐和氨基酸等。超滤操作温度25℃,压力为0.06MPa,超滤至体积浓缩比为10时为止。收集浓缩液。
⑹喷雾干燥
步骤5得到的浓缩液,加入填料固体食盐,使喷雾干燥后含盐量为40%,喷雾干燥进口温度180℃,出口温度100℃,即得粉末状食品级乳酸片球菌素PA-1产品。
本发明方法中,整个流程中板框过滤收率达99%,微滤收率为92%,超滤除杂收率为91%,超滤浓缩收率为93%,喷雾干燥收率为83%,整体收率达64%。
实施例6
一种从发酵液中分离提取乳酸片球菌素PA-1的方法,步骤如下:
⑴发酵液预处理
首先取1L含乳酸片球菌素PA-1的发酵液,80℃恒温水浴处理30分钟,使蛋白酶失活,冷却至25℃;用浓盐酸调节pH至3.0,电动搅拌20分钟,释放乳酸片球菌素PA-1于发酵液中。
⑵板框过滤
在发酵液中加入1.2%的硅藻土,搅拌均匀,进行板框过滤,弃去滤饼,收集滤液。
⑶微滤除杂
将板框过滤后的滤液在温度25℃,压力为1.0MPa下通过金属氧化膜过滤除去培养基杂质和菌体,该膜的孔径为5μm。微滤至体积浓缩比4倍时,开始洗滤,洗滤液的体积和浓缩液体积相同,最终使浓缩液为初始进料液体积的5%。渗透液为乳酸片球菌素PA-1的粗提液。
⑷超滤除杂
步骤⑶得到的渗透液在温度25℃,压力为0.06MPa下,通过截留分子量为10000道尔顿的中空纤维膜超滤除去大分子蛋白等杂质,超滤至体积浓缩比为5时,加入和浓缩液相同体积的水进行洗滤,至最终浓缩液为料液体积的5%为止。收集滤液。
⑸超滤除杂浓缩
步骤⑷得到的滤液通过截留分子量为3000道尔顿的超滤膜过滤,去除发酵液中的水、小分子无机盐和氨基酸等。超滤操作温度25℃,压力为0.06MPa,超滤至体积浓缩比为10时为止。收集浓缩液。
⑹制备液相色谱纯化
步骤⑸得到的浓缩液,直接经制备液相色谱纯化,收集目的产物,冷冻干燥为白色粉末产品。
步骤⑸得到的浓缩液,经反相C18制备色谱纯化即得乳酸片球菌素PA-1。色谱条件如下:
流动相:A,5%乙腈,含0.1%三氟乙酸;B,80%乙腈,含0.1%三氟乙酸;梯度洗脱程序为0~5min,100%A;5~30min,100%A~100%B;30~35min,100%B;35~42min,100%B~100%A;42~45min,100%A;流速:3mL·min-1,检测波长:280nm。
本发明方法中,整个流程中板框过滤收率达99%,微滤收率为92%,超滤除杂收率为91%,超滤浓缩收率为93%,制备液相色谱收率为12%,整体收率达9%,纯度大于99%。
实施例7
一种从发酵液中分离提取乳酸片球菌素PA-1的方法,步骤如下:
⑴发酵液预处理
首先取1L含乳酸片球菌素PA-1的发酵液,80℃恒温水浴处理60分钟,使蛋白酶失活,冷却至30℃;用浓盐酸调节pH至2.5,电动搅拌40分钟,释放乳酸片球菌素PA-1于发酵液中。
⑵板框过滤
在发酵液中加入1.0%的硅藻土,搅拌均匀,进行板框过滤,弃去滤饼,收集滤液。
⑶微滤除杂
将板框过滤后的滤液在温度30℃,压力为0.8MPa下通过陶瓷膜过滤除去培养基杂质和菌体,该膜的孔径为10μm。微滤至体积浓缩比4倍时,开始洗滤,洗滤液的体积为浓缩液体积的2倍,最终使浓缩液为初始进料液体积的5%。渗透液为乳酸片球菌素PA-1的粗提液。
⑷超滤除杂
步骤⑶得到的渗透液在温度30℃,压力为0.06MPa下,通过截留分子量为30000道尔顿的中空纤维膜超滤除去大分子蛋白等杂质,超滤至体积浓缩比为4时,加入浓缩液2倍体积的水进行洗滤,至最终浓缩液为料液体积的5%为止。收集滤液。
⑸超滤除杂浓缩
步骤⑷得到的滤液通过截留分子量为1000道尔顿的超滤膜过滤,去除发酵液中的水、小分子无机盐和氨基酸等。超滤操作温度30℃,压力为0.06MPa,超滤至体积浓缩比为10时为止。收集浓缩液。
⑹喷雾干燥
步骤⑸得到的浓缩液,加入填料固体食盐,使喷雾干燥后含盐量为40%,喷雾干燥进口温度170℃,出口温度90℃,即得粉末状食品级乳酸片球菌素PA-1产品。
⑺步骤⑸得到的浓缩液,直接经制备液相色谱纯化,收集目的产物,冷冻干燥为白色粉末产品。
步骤⑸得到的浓缩液,经反相C18制备色谱纯化即得乳酸片球菌素PA-1。色谱条件如下:
流动相:A,5%乙腈,含0.1%三氟乙酸;B,80%乙腈,含0.1%三氟乙酸;梯度洗脱程序为0~5min,100%A;5~30min,100%A~100%B;30~35min,100%B;35~42min,100%B~100%A;42~45min,100%A;流速:3mL·min-1,检测波长:280nm。
本发明方法中,整个流程中板框过滤收率大于99%,微滤收率为94%,超滤除杂收率为93%,超滤浓缩收率为94%,制备液相色谱收率为10%,整体收率达8%,纯度大于99%。
实施例8
一种从发酵液中分离提取乳酸片球菌素PA-1的方法,步骤如下:
⑴发酵液预处理
首先取1L含乳酸片球菌素PA-1的发酵液,80℃恒温水浴处理30分钟,使蛋白酶失活,冷却至20℃;用浓盐酸调节pH至2.0,电动搅拌40分钟,释放乳酸片球菌素PA-1于发酵液中。
⑵板框过滤
在发酵液中加入1.0%的硅藻土,搅拌均匀,进行板框过滤,弃去滤饼,收集滤液。
⑶微滤除杂
将板框过滤后的滤液在温度35℃,压力为0.8MPa下通过陶瓷膜过滤除去培养基杂质和菌体,该膜的孔径为10μm。微滤至体积浓缩比5倍时,开始洗滤,洗滤液的体积为浓缩液体积的2倍,最终使浓缩液为初始进料液体积的5%。渗透液为乳酸片球菌素PA-1的粗提液。
⑷超滤除杂
步骤3得到的渗透液在温度30℃,压力为0.06MPa下,通过截留分子量为10000道尔顿的中空纤维膜超滤除去大分子蛋白等杂质,超滤至体积浓缩比为4时,加入浓缩液2倍体积的水进行洗滤,至最终浓缩液为料液体积的5%为止。收集滤液。
⑸超滤除杂浓缩
步骤4得到的滤液通过截留分子量为3000道尔顿的超滤膜过滤,去除发酵液中的水、小分子无机盐和氨基酸等。超滤操作温度30℃,压力为0.06MPa,超滤至体积浓缩比为10时为止。收集浓缩液。
⑹喷雾干燥
步骤5得到的浓缩液,加入填料固体食盐,使喷雾干燥后含盐量为30%,喷雾干燥进口温度160℃,出口温度80℃,即得粉末状食品级乳酸片球菌素PA-1产品。
⑺步骤⑸得到的浓缩液,直接经制备液相色谱纯化,收集目的产物,冷冻干燥为白色粉末产品。
步骤⑸得到的浓缩液,经反相C18制备色谱纯化即得乳酸片球菌素PA-1。色谱条件如下:
流动相:A,5%乙腈,含0.1%三氟乙酸;B,80%乙腈,含0.1%三氟乙酸;梯度洗脱程序为0~5min,100%A;5~30min,100%A~100%B;30~35min,100%B;35~42min,100%B~100%A;42~45min,100%A;流速:3mL·min-1,检测波长:280nm。
本发明方法中,整个流程中板框过滤收率大于99%,微滤收率为94%,超滤除杂收率为91%,超滤浓缩收率为93%,制备液相色谱收率为11%,整体收率达9%,纯度大于99%。
实施例9
一种从发酵液中分离提取乳酸片球菌素PA-1的方法,步骤如下:
⑴发酵液预处理
首先取1L含乳酸片球菌素PA-1的发酵液,70℃恒温水浴处理30分钟,使蛋白酶失活,冷却至30℃;用浓盐酸调节pH至2.0,电动搅拌30分钟,释放乳酸片球菌素PA-1于发酵液中。
⑵板框过滤
在发酵液中加入0.8%的硅藻土,搅拌均匀,进行板框过滤,弃去滤饼,收集滤液。
⑶微滤除杂
将板框过滤后的滤液在温度25℃,压力为0.8MPa下通过金属氧化膜过滤除去培养基杂质和菌体,该膜的孔径为5μm。微滤至体积浓缩比5倍时,开始洗滤,洗滤液的体积为浓缩液体积的2倍,最终使浓缩液为初始进料液体积的5%。渗透液为乳酸片球菌素PA-1的粗提液。
⑷超滤除杂
步骤⑶得到的渗透液在温度25℃,压力为0.08MPa下,通过截留分子量为10000道尔顿的中空纤维膜超滤除去大分子蛋白等杂质,超滤至体积浓缩比为4时,加入和浓缩液等量的水进行洗滤,至最终浓缩液为料液体积的5%为止。收集滤液。
⑸超滤除杂浓缩
步骤⑷得到的滤液通过截留分子量为1000道尔顿的超滤膜过滤,去除发酵液中的水、小分子无机盐和氨基酸等。超滤操作温度30℃,压力为0.06MPa,超滤至体积浓缩比为10时为止。收集浓缩液。
⑹喷雾干燥
步骤⑸得到的浓缩液,加入填料固体食盐,使喷雾干燥后含盐量为20%,喷雾干燥进口温度150℃,出口温度80℃,即得粉末状食品级乳酸片球菌素PA-1产品。
⑺步骤⑸得到的浓缩液,直接经制备液相色谱纯化,收集目的产物,冷冻干燥为白色粉末产品。
步骤⑸得到的浓缩液,经反相C18制备色谱纯化即得乳酸片球菌素PA-1。色谱条件如下:
流动相:A,5%乙腈,含0.1%三氟乙酸;B,80%乙腈,含0.1%三氟乙酸;梯度洗脱程序为0~5min,100%A;5~30min,100%A~100%B;30~35min,100%B;35~42min,100%B~100%A;42~45min,100%A;流速:3mL·min-1,检测波长:280nm。
本实施例中,整个流程中板框过滤收率大于99%,微滤收率为94%,超滤除杂收率为91%,超滤浓缩收率为97%,制备液相色谱收率为11%,整体收率达9%,纯度大于99%。
实施例10
一种从发酵液中分离提取乳酸片球菌素PA-1的方法,步骤如下:
⑴发酵液预处理
首先取1L含乳酸片球菌素PA-1的发酵液,70℃恒温水浴处理60分钟,使蛋白酶失活,冷却至25℃;用浓盐酸调节pH至2.0,电动搅拌20分钟,释放乳酸片球菌素PA-1于发酵液中。
⑵板框过滤
在发酵液中加入0.5%的硅藻土,搅拌均匀,进行板框过滤,弃去滤饼,收集滤液;
⑶微滤除杂
将板框过滤后的滤液在温度30℃,压力为1.0MPa下通过金属氧化膜过滤,除去培养基杂质和菌体,该膜的孔径为5μm,微滤至体积浓缩比4倍时,开始洗滤,洗滤液的体积和浓缩液体积相同,最终使浓缩液为初始进料液体积的5%,渗透液为乳酸片球菌素PA-1的粗提液;
⑷超滤除杂
步骤⑶得到的渗透液在温度25℃,压力为0.06MPa下,通过截留分子量为10000道尔顿的中空纤维膜超滤除去大分子蛋白等杂质,超滤至体积浓缩比为5时,加入和浓缩液等量的水进行洗滤,至最终浓缩液为料液体积的5%为止,收集滤液;
⑸超滤除杂浓缩
步骤⑷得到的滤液通过截留分子量为1000道尔顿的超滤膜过滤,去除发酵液中的水、小分子无机盐和氨基酸等,超滤操作温度25℃,压力为0.06MPa,超滤至体积浓缩比为10时为止,收集浓缩液。
⑹喷雾干燥
步骤⑸得到的浓缩液,加入填料固体食盐,使喷雾干燥后含盐量为30%,喷雾干燥进口温度120℃,出口温度70℃,即得粉末状食品级乳酸片球菌素PA-1产品。
⑺步骤⑸得到的浓缩液,直接经制备液相色谱纯化,收集目的产物,冷冻干燥为白色粉末产品。
步骤⑸得到的浓缩液,经反相C18制备色谱纯化即得乳酸片球菌素PA-1。色谱条件如下:
流动相:A,5%乙腈,含0.1%三氟乙酸;B,80%乙腈,含0.1%三氟乙酸;梯度洗脱程序为0~5min,100%A;5~30min,100%A~100%B;30~35min,100%B;35~42min,100%B~100%A;42~45min,100%A;流速:3mL·min-1,检测波长:280nm。
本实施例中,整个流程中板框过滤收率大于99%,微滤收率为92%,超滤除杂收率为92%,超滤浓缩收率为96%,制备液相色谱收率为11%,整体收率达9%,纯度大于99%。
实施例11
一种从发酵液中分离提取乳酸片球菌素PA-1的方法,本实施例同时获得两种纯度的乳酸片球菌素PA-1;步骤如下
⑴发酵液预处理
取含乳酸片球菌素PA-1的发酵液,60-80℃恒温水浴处理30-60分钟,冷却至20-30℃,用浓盐酸调节pH至2.0-3.0,搅拌,释放乳酸片球菌素PA-1于发酵液中;
⑵板框过滤
在发酵液中加入0.5-1.2%的助滤剂,搅拌,进行板框过滤,弃去滤饼,收集滤液;
⑶微滤除杂
将板框过滤后的滤液在温度25-35℃,压力为1.0-1.5MPa下通过金属氧化膜或陶瓷膜过滤,膜的孔径为5μm,微滤至体积浓缩比3-6倍时,开始洗滤,洗滤液的体积和浓缩液体积相同,最终使浓缩液为初始进料液体积的4-7%,渗透液为乳酸片球菌素PA-1的粗提液;
⑷超滤除杂
步骤⑶得到的渗透液在温度20-30℃,压力为0.05-0.1MPa下,通过截留分子量为10000-30000道尔顿的超滤膜,超滤至体积浓缩比为4-6时,加入和浓缩液等量的水进行洗滤,至最终浓缩液为料液体积的4-10%为止,收集滤液;
⑸超滤除杂浓缩
步骤⑷得到的滤液通过截留分子量为1000-3000道尔顿的超滤膜过滤,超滤操作温度20-30℃,压力为0.05-0.1MPa,超滤至体积浓缩比为8-12时为止,收集浓缩液;
⑹喷雾干燥
步骤⑸得到的浓缩液,加入填料固体食盐,在喷雾干燥机进行干燥,进口温度为120-170℃,出口温度为70-90℃,使喷雾干燥后含盐量为25-35%,喷雾干燥,即得乳酸片球菌素PA-1;
⑺C18制备色谱纯化
步骤⑸得到的浓缩液,经反相C18制备色谱纯化,收集保留时间15.0-15.4分钟的蛋白峰为乳酸片球菌素PA-1活性峰;
⑻冷冻干燥
步骤⑺得到的活性峰溶液,可直接冷冻干燥为乳酸片球菌素PA-1的白色粉末。
步骤⑺的色谱条件如下:
流动相:A,5%乙腈,含0.1%三氟乙酸;B,80%乙腈,含0.1%三氟乙酸;梯度洗脱程序为0~5min,100%A;5~30min,100%A~100%B;30~35min,100%B;35~42min,100%B~100%A;42~45min,100%A;流速:3mL·min-1,检测波长:280nm。
上述实施例11的步骤5后可以有2条不同路线:一是喷雾干燥,二是C18制备色谱纯化后再冷冻干燥。原先我只描述了喷雾干燥,在修改稿里我又加入了C18制备色谱纯化后再冷冻干燥。喷雾干燥这条路线追求的是收率,因为还要加食盐,所以不追求纯度,满足片球菌素PA-1应用需要;色谱纯化这条路线追求的是纯度,满足对片球菌素PA-1科学研究的需要;
色谱纯化细菌素报道很多,但都是不同色谱方法(如分子筛、离子交换、疏水层析、C18反相色谱等)的组合,步骤繁琐。C18反相色谱一般都在各种色谱纯化的最后一步,因为C18制备色谱柱工艺最成熟,商品化的产品也很多,可以连高压液相色谱,达到高分辨率,所以要想产品纯度高,此步骤不可少。而其他的色谱方法一般在蛋白纯化的前期采用,几乎都是自己灌填料,在低压下进行,分离度不高但也可以除去很多杂质,降低最后C18反相色谱的压力,否则杂质太多,C18制备色谱柱必然会堵。采用步骤1-5可有效代替其他的色谱方法,减少杂质,相当于进行了样品前处理,可直接经C18反相制备色谱得到高纯度的产品。这种膜分离结合C18制备色谱纯化片球菌素PA-1的方法未见报道。

Claims (5)

1.一种从发酵液中分离提取乳酸片球菌素PA-1的方法,其特征在于:步骤如下: 
⑴发酵液预处理 
取含乳酸片球菌素PA-1的发酵液,60-80℃恒温水浴处理30-60分钟,冷却至20-30℃,用浓盐酸调节pH至2.0-3.0,搅拌,释放乳酸片球菌素PA-1于发酵液中; 
⑵板框过滤 
在发酵液中加入0.5-1.2%的助滤剂,搅拌,进行板框过滤,弃去滤饼,收集滤液; 
⑶微滤除杂 
将板框过滤后的滤液在温度25-35℃,压力为1.0-1.5MPa下通过金属氧化膜或陶瓷膜过滤,膜的孔径为5μm,微滤至体积浓缩比3-6倍时,开始洗滤,洗滤液的体积和浓缩液体积相同,最终使浓缩液为初始进料液体积的4-7%,渗透液为乳酸片球菌素PA-1的粗提液; 
⑷超滤除杂 
步骤⑶得到的渗透液在温度20-30℃,压力为0.05-0.1MPa下,通过截留分子量为10000-30000道尔顿的超滤膜,超滤至体积浓缩比为4-6时,加入和浓缩液等量的水进行洗滤,至最终浓缩液为料液体积的4-10%为止,收集滤液; 
⑸超滤除杂浓缩 
步骤⑷得到的滤液通过截留分子量为1000-3000道尔顿的超滤膜过滤,超滤操作温度20-30℃,压力为0.05-0.1MPa,超滤至体积浓缩比为8-12时为止,收集浓缩液; 
⑹喷雾干燥 
步骤⑸得到的浓缩液,加入填料固体食盐,在喷雾干燥机进行干燥,进口温度为120-170℃,出口温度为70-90℃,使喷雾干燥后含盐量为25-35%,喷雾干燥,即得乳酸片球菌素PA-1。 
2.根据权利要求1中所述的从发酵液中分离提取乳酸片球菌素PA-1的方法,其特征在于:所述助滤剂为硅藻土或珍珠岩。 
3.根据权利要求1中所述的从发酵液中分离提取乳酸片球菌素PA-1的方法,其特征在于:所述超滤膜为中空纤维膜。 
4.根据权利要求1中所述的从发酵液中分离提取乳酸片球菌素PA-1的方法,其特征在于:所述步骤⑸超滤除杂浓缩后经过如下步骤,获得乳酸片球菌素PA-1的白色粉末: 
⑺C18制备色谱纯化 
步骤⑸得到的浓缩液,经反相C18制备色谱纯化,收集保留时间15.0-15.4分钟的蛋白峰为乳酸片球菌素PA-1活性峰; 
⑻冷冻干燥 
步骤⑺得到的活性峰溶液,可直接冷冻干燥为乳酸片球菌素PA-1的白色粉末。 
5.根据权利要求4中所述的从发酵液中分离提取乳酸片球菌素PA-1的方法,其特征在于:步骤⑺的色谱条件如下: 
流动相:A,5%乙腈,含0.1%三氟乙酸;B,80%乙腈,含0.1%三氟乙酸;梯度洗脱程序为0~5min,100%A;5~30min,100%A~100%B;30~35min,100%B;35~42min,100%B~100%A;42~45min,100%A;流速:3mL·min-1,检测波长:280nm。 
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