CN104593351B

CN104593351B - 一种制备头孢菌素c酰化酶固定化酶的方法

Info

Publication number: CN104593351B
Application number: CN201410843158.5A
Authority: CN
Inventors: 尚海涛; 徐斌; 杨为华; 邓远德; 张毅; 潘声龙
Original assignee: Anhui BBCA Fermentation Technology Engineering Research Co Ltd
Current assignee: Anhui BBCA Fermentation Technology Engineering Research Co Ltd
Priority date: 2014-12-30
Filing date: 2014-12-30
Publication date: 2018-03-13
Anticipated expiration: 2034-12-30
Also published as: CN104593351A

Abstract

本发明提供了一种制备头孢菌素C酰化酶固定化酶的方法，该方法包括以下步骤：(1)将大肠杆菌发酵液用陶瓷膜浓缩后，用磷酸盐缓冲液透析，高压破碎后，得细胞破碎液；(2)在细胞破碎液中加入由硫酸铝、硫酸亚铁和中性聚丙烯酰胺组成的混合絮凝剂，在室温下絮凝；加入硅藻土，离心收集上清液；(3)在上清液中加入复合硫酸盐后加热；冷却至室温后，加入硅藻土，离心收集上清液；(4)用聚丙烯晴材质的中空纤维膜浓缩，用磷酸盐缓冲液透析，得浓缩酶液；(5)在浓缩酶液中加入固定化载体，酶与载体充分结合后抽滤，即得。本发明进一步保护所述方法制备得到的头孢菌素C酰化酶固定化酶及其应用。

Description

一种制备头孢菌素C酰化酶固定化酶的方法

技术领域

本发明涉及生物技术下游工程制药领域，具体地涉及一种头孢菌素C酰化酶固定化酶的制备方法。

背景技术

近年来，由于头孢菌素类抗生素过敏反应小，对和β-内酰胺酶较稳定，具有抗菌谱广、疗效好、毒低、同其他抗生素无交叉耐药性、与青霉素较少产交叉过敏反应等优点，已经成为抗感染最重要的有效药物。研究发现，头孢菌素的抗菌部为其母核7-氨基头孢烷酸(7-aminocephalosporanic acid,7-ACA)，因此作为合成半合成头孢菌素重要中间体，7-AC A的研究生产显得至关重要。头孢菌素C(Cephalosporin C,CPC)经化学法或是酶法裂解得到7-ACA。化学法的反应条件较为苛刻，反应过程必须在超低温条件下进行，而且涉及到大量有毒有害的有机溶剂，会带来环境污染等问题。因此，对环境友好的酶法开始成为工业生产的新方向。在酶法制备7-ACA的过程中，无论一步酶法或两步酶法，都需要头孢菌素酰化酶(Cephalosporin C CPCAlase，CPCA)的作用，才能最终得到产物7-ACA。因此，头孢菌素酰化酶的研究成为酶法合成7-ACA实现工业化的基础。

目前使用两步酶法制备7-ACA在生产成本和环境保护方面有优势，但是从头孢菌素C到7-ACA的转化率与化学法相比要低，而且DAAO催化反应难以控制。头孢菌素C酰化酶(CPC acylase)可以直接把头孢菌素C转变成7-ACA(不经过GL-7-ACA等中间产物)，利用头孢菌素C酰化酶生产7-ACA的一步酶法既具有化学法的优势(高转化率和纯度)也具有两步酶法的优势(高经济性和环境保护)。但是野生型的头孢菌素C酰化酶活力较低，亟需提供一种方法制备头孢菌素C酰化酶固定化酶，以提高酶的活性和稳定性，从而胜任工业化生产的需要。

发明内容

本发明的目的即是开发出一种简便、高收率、适用于工业化生产的头孢菌素C酰化酶固定化酶的制备方法。

为了实现上述目的，本发明提供了一种制备头孢菌素C酰化酶固定化酶的方法，该方法包括以下步骤：

(1)将大肠杆菌发酵液用陶瓷膜浓缩后，用磷酸盐缓冲液透析，收集浓相菌液；高压破碎后，得细胞破碎液；

(2)在步骤(1)所得细胞破碎液中加入由硫酸铝、硫酸亚铁和中性聚丙烯酰胺组成的混合絮凝剂，在室温下絮凝；加入硅藻土，搅拌均匀后离心，收集上清液；

(3)在步骤(2)所得上清液中加入复合硫酸盐，充分溶解后，加热至45～55℃，维持25～35min；冷却至室温后，加入硅藻土，搅拌均匀后离心，收集上清液；

(4)取步骤(3)所得上清液，用聚丙烯晴材质的中空纤维膜浓缩，用磷酸盐缓冲液透析，得浓缩酶液；

(5)在步骤(4)所得浓缩酶液中加入固定化载体，室温下搅拌至酶与载体充分结合，抽滤，收集固体，即得头孢菌素C酰化酶固定化酶。

本发明所述步骤(1)中：

所述大肠杆菌发酵液是以甘油为主要碳源、将大肠杆菌生物发酵48h获得；本发明使用的大肠杆菌发酵液中固含量为11～12％(m/m)，OD₆₀₀值为105～120；

步骤1)所述大肠杆菌发酵液中，头孢菌素C酰化酶的酶活为9000～10300U/L；

步骤1)使用陶瓷膜浓缩菌液优势明显，该方法处理量大，处理时间短，后续菌液不需要匀浆即可直接破碎，适合工业化大规模生产；在用陶瓷膜浓缩菌液时，可选用容积泵作为进料泵，从而避免对菌液的破坏，同时可以加快处理速度；所述陶瓷膜优选为50nm陶瓷膜，陶瓷膜的通透量依据待浓缩菌液的体积进行相应的选择，平均通透量优选为69～95LMH；所述浓缩应浓缩到破碎要求的菌液浓度，为了便于实际操作和监控，可浓缩至原体积的1/4～1/5；

使用磷酸盐缓冲液进行透析，可以有效地置换出发酵培养基和代谢产物，以降低其对酶活的影响，提高产品质量；透析用磷酸盐缓冲液的浓度优选为0.01M，pH值优选为7.0，体积优选为待透析溶液体积的2倍，透析终点为与加入磷酸盐缓冲液之前的待透析溶液体积相等；

所述高压破碎优选使用高压均质机，压强为850～900Mpa；破碎次数为1次以上，优选为2～4次，进一步优选为3次，多次破碎可以提高细胞的破碎率与破碎程度，有助于后续的絮凝和过滤；破碎温度应低于35℃，低的破碎温度可以防止酶失活。

本发明所述步骤(2)中：

在细胞破碎液中加入由硫酸铝、硫酸亚铁和中性聚丙烯酰胺组成的混合絮凝剂，在室温下静置即可达到很好的絮凝效果，从而避免使用单一絮凝剂时加热对酶活性的破坏，大大减小酶的失活率；在絮凝剂中，硫酸铝、硫酸亚铁和中性聚丙烯酰胺三者的加入量分别为硫酸铝4.8～5.2g/L，硫酸亚铁4.8～5.2g/L和中性聚丙烯酰胺0.02～0.03g/L；述絮凝的时间为50～70min，优选为60min；

所述硅藻土作为助滤剂，以质量体积比40～50:1加入溶液中，此处硅藻土的质量单位为g，溶液体积的单位为L；所述硅藻土优选为含有白土和红土的混合硅藻土，两种规格的硅藻土以特定比例混合后，可以更有效的截留细胞碎片，增加过滤速度，使过滤出来的滤液更加澄清，白土与红土的体积比优选为5:1。

本发明所述步骤(3)中：

所述复合硫酸盐为保护剂，起到对酶的保护作用，降低其在高温下的失活率，同时可以有效去除杂蛋白，复合硫酸盐为硫酸铝、硫酸铵和硫酸亚铁按照质量比1:5:0.3的比例配伍的混合物；复合硫酸盐与步骤(2)所得上清液的质量体积比优选为1.9～2.1：1，此处质量体积比的单位为g/L；

所述硅藻土作为助滤剂，以质量体积比39～50:1加入溶液中，此处硅藻土的质量单位为g，溶液体积的单位为L；所述硅藻土优选为含有白土和红土的混合硅藻土，白土与红土的体积比优选为5:1。

本发明所述步骤(4)中：

中空纤维膜优选为膜材质为聚丙烯晴的中空纤维素膜，膜孔径可使分子量13000D的蛋白质通过，使用亲水性强的聚丙烯晴材质的膜有助于保护酶的活性；所述浓缩优选为至原溶液体积的2/5～1/3；

所述透析共进行两次，其中，第一次透析在待透析溶液中加入两倍体积的0.1MpH7.0磷酸盐缓冲液，第二次透析在待透析溶液中加入等体积的0.5M pH7.0磷酸盐缓冲液，两次透析的终点均为透析袋内溶液体积减少至与加入磷酸盐缓冲液之前的待透析溶液体积相等；经过本步骤的浓缩和两次透析后，会对后续步骤中酶与载体结合造成干扰的小分子氨基酸和多肽被去除，透析袋内所得溶液即为高浓度、高纯度的酶液。

本发明所述步骤(5)中：

所述环氧型树脂作为酶固定化的载体，环氧型树脂在使用前应用0.1M pH7.0磷酸盐缓冲液进行洗涤，优选为洗涤2次，使载体表面被缓冲液覆盖；本步骤以及步骤(4)的第二次透析优选使用浓度为0.1M、pH值为7.0的磷酸盐缓冲溶液，是由于这一特定的浓度和pH值可以使头孢菌素C酰化酶与环氧型树脂载体实现高效率、高概率的结合；环氧型树脂的加入量与步骤(4)所得浓缩酶液的体积之比优选为0.8～0.92:1，此处环氧型树脂的质量单位为kg，浓缩酶液的体积单位为L；

所述搅拌的条件应减少头孢菌素C酰化酶活性损失的同时，确保酶与载体以较高的比例充分结合，搅拌的温度为室温，优选为25℃，搅拌时间优选为45～55h，进一步优选为48h。

优选地，本发明提供的方法包括以下步骤：

(1)取大肠杆菌发酵液，用平均通量为69～95LMH的50nm陶瓷膜浓缩至原体积的1/4～1/5，加入0.01M、pH7.0磷酸盐缓冲液透析，收集浓相菌液；在压强850～900Mpa、低温低于35℃的条件下破碎2～4次，得细胞破碎液；

(2)在步骤(1)所得细胞破碎液中加入4.8～5.2g/L硫酸铝，4.8～5.2g/L硫酸亚铁和0.02～0.03g/L中性聚丙烯酰胺，在室温下絮凝50～70min；加入40～50g/L硅藻土，硅藻土中白土与红土的体积比为5:1，搅拌均匀后离心，收集上清液；

(3)在步骤(2)所得上清液中加入1.9～2.1g/L复合硫酸盐，充分溶解后，加热至45～55℃，维持25～35min；冷却至室温后，加入39～50g/L硅藻土，硅藻土中白土与红土的体积比为5:1，搅拌均匀后离心，收集上清液；

(4)取步骤(3)所得上清液，用聚丙烯晴材质的中空纤维膜浓缩至原体积的2/5～1/3，加入0.1M pH7.0磷酸盐缓冲液进行透析，再加入0.5M pH7.0磷酸盐缓冲液透析，得浓缩酶液；

(5)在步骤(4)所得浓缩酶液中加入0.8～0.92kg/L经0.1M pH7.0磷酸盐缓冲液预洗涤的环氧型树脂，室温下搅拌45～55h，抽滤，收集固体，即得头孢菌素C酰化酶固定化酶。

经过优选后，本发明步骤(1)所得细胞破碎液中细胞破碎率为88～91％；步骤(2)所得上清液中酶活为38000～43054U/L；步骤(3)所得上清液中酶活为34060～40900U/L；步骤(4)所得浓缩酶液中酶活为96190～105000U/L；步骤(5)所得头孢菌素C酰化酶固定化酶产物的酶活为80～87U/g；酶与树脂的结合率为70～80％。

本发明所述酶活均为头孢菌素C酰化酶的酶活；本发明采用以下方法检测各步骤所得溶液中头孢菌素C酰化酶的酶活：

(1)取1.2g头孢菌素C，用25ml 0.1M、pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液溶解，定容至30ml，得头孢菌素C储备液；

(2)取20ul待测溶液，加入100ul头孢菌素C储备液，再加入0.1M、pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液定容至20ul；37℃下反应5min后，加入25倍体积的由20％乙酸与0.05MNaOH组成的终止液终止反应，得反应液；

(3)将反应液在12000rmp条件下离心5min，取上清液作为样品，以采用相同溶剂配制而成的7-氨基头孢烷酸作为标准品，采用高效液相色谱法进行检测，检测条件为：固定相为C18柱，流动相为0.1M柠檬酸88％：乙腈12％，检测吸光度为254nm，酶活单位定义为每分钟催化生成1umol 7-氨基头孢烷酸所需要的酶的量。

在采用上述方法检测大肠杆菌发酵液中头孢菌素C酰化酶的酶活时，先离心收集菌体，用0.1M、pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液稀释后冰浴超声破碎，离心除去不溶物后，上清液即为步骤(2)所述待测溶液。

本发明进一步保护以所述方法制备得到的头孢菌素C酰化酶固定化酶。

本发明所述头孢菌素C酰化酶固定化酶可以作为原料应用于药物制备。

本发明提供的方法取得了显著的技术效果。具体而言，本发明采用先进的膜分离工艺取代了传统离心分离收集菌液的方法，使操作更加高效、简便；混合絮凝剂的使用实现了细胞破碎液在低温条件下的絮凝；复合型硫酸盐保护剂简单有效地去除了杂蛋白；具有极佳的亲水性的聚丙烯晴材质中空纤维膜进行酶液的浓缩，极大的提高了酶活；采用透析法简单、有效地去了除具有干扰性的小分子氨基酸；选择最适浓度和pH值的缓冲溶液提高了酶与载体的结合率。本发明将多个技术特征相结合，针对性地提高了头孢菌素C酰化酶固定化酶的结合率和酶活。本发明提供的方法适于工业化、大规模生产头孢菌素C酰化酶固定化酶，并且可以进一步推广至其它酶制剂的生产中。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

各实施例中使用的大肠杆菌发酵液为安徽丰原基因工程有限公司提供。

实施例1

(1)500L发酵罐产出400L大肠杆菌发酵液，固含量12％(m/m)，OD₆₀₀值110，酶活10300U/L；用50nm陶瓷膜将发酵液浓缩至80L，平均通量为69LMH，运行温度<25℃，加入浓度为0.01M、pH7.0的磷酸盐缓冲液160L进行透析，得到固含量为34％的浓相菌液80L；降温至低于24℃，用高压均质机在850Mpa压强下破碎3次，得细胞破碎液；

(2)在步骤(1)所得细胞破碎液中添加0.4g硫酸铝，0.4g硫酸亚铁和1.6g中性聚丙烯酰胺，在常温下静置絮凝50min；加入3.2kg硅藻土，其中白土与红土的体积比为5:1，轻微搅拌后离心分离，收集上清液；

(3)取步骤(2)所得上清液70L，加入硫酸铝、硫酸铵和硫酸亚铁以质量比1:5:0.3组成的复合硫酸盐0.14kg，充分溶解后，水浴加热至45℃，维持35min，冷却至室温，加入硅藻土3.5kg，其中白土与红土的体积比为5:1，离心分离，收集上清液；

(4)取步骤(3)所得上清液63L，用聚丙烯晴材质的中空纤维膜浓缩至23L，加入46L0.1M pH7.0的磷酸盐缓冲液透析，至透析罐内液体体积为23L时，再加入23L 0.5M pH7.0磷酸盐缓冲液透析，透析至液体体积为23L，即得浓缩酶液；

(5)在步骤(4)所得浓缩酶液中，加入经0.1M pH7.0磷酸盐缓冲液洗涤过的环氧型树脂19.6kg，25℃下搅拌45h，抽滤，收集固体，即得头孢菌素C酰化酶固定化酶。

经检测：步骤(1)所得细胞破碎液中细胞破碎率为88％；步骤(2)所得上清液中酶活为43054U/L；步骤(3)所得上清液中酶活为40900U/L；步骤(4)所得浓缩酶液中酶活为102000U/L；步骤(5)所得头孢菌素C酰化酶固定化酶产物的酶活为83U/g；酶与树脂结合率为74％。

以市购的头孢菌素C酰化酶作为对照，使用蛋白电泳法对本实施例所得产物进行验证，结果显示蛋白条带为55kD和25kD，与对照相同，证明本发明提供的方法制备所得产品为头孢菌素C酰化酶的固定化酶。

实施例2

(1)500L发酵罐产出440L大肠杆菌发酵液，固含量11.2％(m/m)，OD₆₀₀值120，酶活9500U/L；用50nm陶瓷膜将发酵液浓缩至90L，平均通量为76.6LMH，膜运行温度<30℃，加入浓度为0.01M、pH7.0的磷酸盐缓冲液180L进行透析，得到固含量为31.2％的浓相菌液90L；降温至20℃，用高压均质机在880Mpa压强下破碎4次，得细胞破碎液；

(2)在步骤(1)所得细胞破碎液中添加0.45g硫酸铝，0.45g硫酸亚铁和1.8g中性聚丙烯酰胺，在常温下静置絮凝60min；加入3.6kg硅藻土，其中白土与红土的体积比为5:1，轻微搅拌后离心分离，收集上清液；

(3)取步骤(2)所得上清液81.2L，加入硫酸铝、硫酸铵和硫酸亚铁以质量比1:5:0.3组成的复合硫酸盐0.16kg，充分溶解后，水浴加热至50℃，维持30min，冷却至室温，加入硅藻土3.2kg，其中白土与红土的体积比为5:1，离心分离，收集上清液；

(4)取步骤(3)所得上清液75L，用聚丙烯晴材质的中空纤维膜浓缩至25L，加入50L0.1M pH7.0的磷酸盐缓冲液透析，透析至液体体积为25L时，再加入25L 0.5M pH7.0磷酸盐缓冲液透析，透析至液体体积为25L，即得浓缩酶液；

(5)在步骤(4)所得浓缩酶液中，加入经0.1M pH7.0磷酸盐缓冲液洗涤过的环氧型树脂23kg，25℃下搅拌48h，抽滤，收集固体，即得头孢菌素C酰化酶固定化酶。

经检测：步骤(1)所得细胞破碎液中细胞破碎率为91％；步骤(2)所得上清液中酶活为40000U/L；步骤(3)所得上清液中酶活为38000U/L；步骤(4)所得浓缩酶液中酶活为105000U/L；步骤(5)所得头孢菌素C酰化酶固定化酶产物的酶活为87U/g；酶与树脂的结合率为76％。

实施例3

(1)10000L发酵罐产出7000L大肠杆菌发酵液，固含量11％(m/m)，OD₆₀₀值105，酶活9000U/L；用50nm陶瓷膜将发酵液浓缩至1400L，平均通量为95LMH，膜运行温度<35℃，加入浓度为0.01M、pH7.0的磷酸盐缓冲液180L进行透析，得到固含量为29.4％的浓相菌液1400L；降温至25℃，用高压均质机在900Mpa压强下破碎2次，得细胞破碎液；

(2)在步骤(1)所得细胞破碎液中添加7kg硫酸铝，7kg硫酸亚铁和40g中性聚丙烯酰胺，在常温下静置絮凝70min；加入70kg硅藻土，其中白土与红土的体积比为5:1，轻微搅拌后离心分离，收集上清液；

(3)取步骤(2)所得上清液1200L，加入硫酸铝、硫酸铵和硫酸亚铁以质量比1:5:0.3组成的复合硫酸盐2.4kg，充分溶解后，水浴加热至55℃，维持25min，冷却至室温，加入硅藻土60kg，其中白土与红土的体积比为5:1，离心分离，收集上清液；

(4)取步骤(3)所得上清液1100L，用聚丙烯晴材质的中空纤维膜浓缩至370L，加入740L 0.1M pH7.0的磷酸盐缓冲液透析，透析至液体体积为370L时，再加入370L 0.5MpH7.0磷酸盐缓冲液透析，透析至液体体积为370L，即得浓缩酶液；

(5)在步骤(4)所得浓缩酶液中，加入经0.1M pH7.0磷酸盐缓冲液洗涤过的环氧型树脂296kg，25℃下搅拌55h，抽滤，收集固体，即得头孢菌素C酰化酶固定化酶。

经检测：步骤(1)所得细胞破碎液中细胞破碎率为90％；步骤(2)所得上清液中酶活为38000U/L；步骤(3)所得上清液中酶活为34060U/L；步骤(4)所得浓缩酶液中酶活为96190U/L；步骤(5)所得头孢菌素C酰化酶固定化酶产物的酶活为85U/g；酶与树脂的结合率为70.6％。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种制备头孢菌素C酰化酶固定化酶的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)取大肠杆菌发酵液，用陶瓷膜浓缩至原体积的1/4～1/5，加入磷酸盐缓冲液透析，收集浓相菌液；在850～900Mpa压强下低温破碎，得细胞破碎液；

(2)在步骤(1)所得细胞破碎液中加入4.8～5.2g/L硫酸铝，4.8～5.2g/L硫酸亚铁和0.02～0.03g/L中性聚丙烯酰胺，在室温下絮凝50～70min；加入硅藻土，搅拌均匀后离心，收集上清液；

(3)在步骤(2)所得上清液中加入1.9～2.1g/L复合硫酸盐，所述复合硫酸盐为硫酸铝、硫酸铵和硫酸亚铁按照质量比1:5:0.3的比例配伍的混合物；充分溶解后，加热至45～55℃，维持25～35min；冷却至室温后，加入硅藻土，搅拌均匀后离心，收集上清液；

(4)取步骤(3)所得上清液，用聚丙烯晴材质的中空纤维膜浓缩至原体积的2/5～1/3，依次用0.1M pH7.0磷酸盐缓冲液和0.5M pH7.0磷酸盐缓冲液进行两次透析，得浓缩酶液；

(5)在步骤(4)所得浓缩酶液中加入0.8～0.92kg/L环氧型树脂，室温下搅拌45～55h，抽滤，收集固体，即得头孢菌素C酰化酶固定化酶。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述陶瓷膜为平均通量为69～95LMH的50nm孔径的陶瓷膜。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01M，pH值为7.0。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)或/和步骤(3)所述硅藻土的加入量为39～50g/L；硅藻土中白土与红土的体积比为5:1。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述环氧型树脂在使用前经0.1MpH7.0磷酸盐缓冲液预洗涤。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取大肠杆菌发酵液，用平均通透量为69～95LMH的50nm陶瓷膜浓缩至原体积的1/4～1/5，加入0.01M、pH7.0磷酸盐缓冲液透析，收集浓相菌液；在压强850～900Mpa、低温低于35℃的条件下破碎2～4次，得细胞破碎液；

7.权利要求1～6任意一项所述方法制备而成的头孢菌素C酰化酶固定化酶在制备药物中的应用。