SK279780B6 - Spôsob izolácie kyseliny klavulánovej a jej farmac - Google Patents

Description

Vynález spadá do oblasti farmaceutického priemyslu a týka sa nového a zlepšeného spôsobu izolácie kyseliny klavulánovej a jej farmaceutický prijateľných solí z fermentačného prostredia Streptomyces sp. P 6621 FERM P 2804.

Existuje trvalá potreba nachádzania nových a zlepšených spôsobov prípravy čistej kyseliny klavulánovej a jej farmaceutický prijateľných solí, ako je klavulanát draselný, izoláciou z fermentačného prostredia, získaného s použitím produkčného mikroorganizmu, bez zložitých konvenčných izolačných metód a chromatografického čistenia požadovaného produktu.

Doterajší stav techniky

Kyselina klavulánová je bežný názov (2R,5R,Z)-3-(2-hydroxyetylidén)-7-oxo-4-oxa-1 -azabicyklo[3,2.0]heptán-2-karboxylovej kyseliny vzorca

Jej soli s alkalickými kovmi a estermi sú účinné ako inhibítory beta-laktamáz, produkovaných niektorými grampozitívnymi i niektorými gramnegatívnymi mikroorganizmami.

Okrem inhibičného pôsobenia na beta-laktamázy má kyselina klavulánová a jej soli alkalickými kovmi tiež synergický účinok v kombinácii s beta-laktámovými antibiotikami pencilínového a cefalosporínového radu. Preto sa kyselina klavulánová a jej soli používajú galenických prípravkoch na prevenciu dezaktivácie beta-laktámových antibiotík. Komerčné prípravky obsahujú stabilnejšiu draselnú soľ kyseliny klavulánovej (kyselina samotná je dosť nestála) v kombinácii s amoxicilín trihydrátom.

Kyselina klavulánová sa pripravuje fermentáciou produkčného mikroorganizmu, ako sú rôzne mikroorganizmy, patriace k rôznym kmeňom Streptomyces, ako je S. clavuligerus NRRL 3585, S. jumoninensis NRRL 5741, S. katsurahamanus IFO 13716 a Streptomyces sp. P 6621 FERM P 2804.

Vodné kultivačné prostredie získané po fermentácii môže byť čistené a koncentrované konvenčnými postupmi, zahrnujúcimi napríklad filtráciu a chromatografické čistenie, ako je opísané v GB 1.508,977, pred extrakciou vodného roztoku organickým rozpúšťadlom na získanie roztoku nečistej kyseliny klavulánovej v organickom rozpúšťadle.

V GB 1.508,977 sa okrem iného uvádza, že soli kyseliny klavulánovej je možné získavať adsorpciou klavulanátového aniónu v prefiltrovanom prostredí na aniónovú výmennú živicu, z ktorej sa eluujú elektrolytom, vzniknutý roztok sa odsoli a potom sa odstráni rozpúšťadlo. Tento postup umožňuje dosiahnuť prijateľné výťažky požadovanej látky, ale vyžaduje zložité čistenie chromatografíckými metódami a použitie stĺpcov živice vyžaduje významné investície, čo obmedzuje výrobné operácie vo veľkom rozsahu.

GB 1.543,563 opisuje modifikovaný spôsob fermentácie s použitím kmeňa .S' clavuligerus NRRL 3585, pri ktorom sa hodnota pH v prostredí udržuje v rozmedzí medzi 6,3 a 6,7, a tak sa zvyšuje výťažok požadovanej zlúčeniny. Soli kyseliny klavulánovej, ako je klavulanát draselný, sa pripravujú opätovným vysolením z klavulanátu lítneho, čím sa požadovaná zlúčenina tiež čistí.

EP-A-0 026 044 ilustruje použitie terc, butylamínovej soli kyseliny klavulánovej ako užitočného medziproduktu na prípravu kyseliny klavulánovej. Táto soľ je známa z BE 862 211, ale len ako zložka farmaceutických prípravkov.

EP-B-0 182 522 opisuje spôsob prípravy kyseliny klavulánovej fermentáciou mikroorganizmu S. clavuligerus. Významné zlepšenie spôsobu bolo dosiahnuté prídavkom zdroja uhlíka, ako je glycerol, do fermentačného prostredia počas spôsobu buď kontinuálne, alebo prerušovane, pričom je veľmi dôležité, aby bola hladina uhlíka udržovaná na dostatočne nízkej koncentrácii, t. j. pod 0,5 % (w/v), a aby v žiadnom prípade neprekročila 2 %. Príklady ilustrujú, že podstatné zlepšenie zvýšeného výťažku kyseliny klavulánovej bolo pozorované, keď bol zdroj uhlíka pridávaný počas fermentácie. Je uvedené, že koncentrácia kyseliny klavulánovej vo fermentačnom prostredí po 160 h bola asi 1400 pg/ml, čo je pozoruhodné zlepšenie oproti predchádzajúcim spôsobom.

Ďalším zlepšením bol tiež nový spôsob čistenia kyseliny klavulánovej z roztoku vo forme lítnej soli. Na dosiahnutie vyššej čistoty klavulanátu lítneho však bol pridávaný koncentrovaný roztok inej lítnej soli, ako je chlorid lítny. Získaný rekryštalizovaný klavulanát lítny mohol byť ďalej čistený a potom prípadne prevedený na iné soli, ako je klavulanát draselný, spôsobom známym z uvedenej literatúry.

Mycélium, proteiny a ďalší pevný podiel sa odstraňuje známymi spôsobmi, ako je odstreďovanie alebo filtrácia, s prípadnou predchádzajúcou úpravou fermentačného prostredia zvoleným agregačným prostriedkom na účel agregácie mycélia a umožnenia ľahšej filtrácie. Prefiltrované fermentačné prostredie sa potom spracováva iónovýmennými živicami alebo zrážaním rozpúšťadlom ako je acetón, na odstránenie proteínov, a zrazenina sa oddeľuje opakovaným odstredením a filtráciou. Toto oddeľovanie mycélia, proteínov a ďalších sprievodných častíc v suspenzii, pôvodne prítomných vo fermentačnom prostredí, je časovo náročné a vyžaduje niekoľko pracovných krokov.

Časovo náročné spôsoby odstraňovania mycélia, proteínov a ďalších suspendovaných častíc a následná izolácia zo získaného transparentného fermentačného prostredia, rovnako ako príprava čistej kyseliny klavulánovej a jej soli, boli odstránené spôsobom opísaným v EP-A-0 385 552 a EP-A-0 387 178.

Celý spôsob zahrnuje tri stupne, t. j. čistenie fermentačného prostredia od mycélia, proteínov a ďalších pevných častíc, čistenie kyseliny klavulánovej prítomnej v nečistej forme v prostredí čisteného filtrátu Streptomyces clavuligerus s použitím jedného z primárnych, sekundárnych alebo terciámych amínov, tvoriacich stabilné intermediáme soli s kyselinou klavulánovou, čím sa oddelí hlavná časť sprievodných nečistôt v kyseline klavulánovej, a ako posledný stupeň prevádzanie intermediámych amínových solí kyseliny klavulánovej (s čistotou 85 %) na požadovanú soľ s alkalickým kovom, ako je klavulanát draselný.

Prvý stupeň je podrobnejšie opísaný v EP-A-0 385 552, kde sa z vodného kultivačného prostredia zís kaného fermentáciou mikroorganizmu Streptomyces clavuligerus, pomocou fyzikálno-chemických procesov koagulácie-vločkovania odstraňuje mycélium, proteíny a ďalšie pevné častice. Vločky získané týmto spôsobom sú dostatočne veľké a kompaktné, aby umožňovali ľahkú sedimentáciu a delenie, ktoré sa najlepšie uskutočňuje pomocou valcových sít. Získa sa tak transparentné prostredie, ktoré je možné prípadne skoncentrovať reverznou osmózou.

Týmto spôsobom sa získa čistené ťermentačné prostredie bez použitia konvenčných metód čistenia, ako je odstreďovanie, adsorpcia na aktívnom uhlí, filtrácia s pomocnými látkami atď.

Vo všetkých známych spôsoboch je tiež nevyhnutné (čo je odlišné od opísaného spôsobu vločkovania), aby bolo čistené kultivačné prostredie spracovávané rôznymi spôsobmi deproteinizácie a iónovej výmeny, čo spôsobuje významné celkové straty konečného výťažku požadovanej látky. Na rozdiel od známych spôsobov dosahuje celkový výťažok spôsobu vločkovania 85 až 90 %.

Opísaný spôsob koagulácie-vločkovania z fermentačného prostredia Streptomyces clavuligerus je založený na prídavku anorganického elektrolytu do kultivačného prostredia s cieľom zvýšiť účinok koagulantu, aplikácii anorganického koagulantu ako iniciátora procesu koagulácie pri miešaní a pri hodnote pH prostredia medzi 6 a 8, prídavku organického elektrolytu pri začiatku vločkovania a následnom oddelení získaných vločiek od fermentačného prostredia pomocou valcových sít alebo filtrácie, a ak vločkovanie prebieha v prítomnosti s vodou nemiešateľného rozpúšťadla, prípadnej dekantácii fáz, oddelení vločiek, a prípadnom skoncentrovaní kvapaliny reverznou osmózou alebo odparením.

EP-A-0 532 583 opisuje použitie solí kyseliny klavulánovej s organickými diamínmi, ako je N,N'-diizopropyletyléndiamónium diklavulanát, ako meziproduktov, vhodných na izoláciu a prípravu čistej kyseliny klavulánovej alebo jej solí s alkalickými kovmi, ako je klavulanát draselný, z etylacetátového extraktu, získaného po extrakcii získaného vodného kultivačného prostredia, vytvoreného po fermentácii, kde je prítomná kyselina klavulánová.

Podstata vynálezu

Cieľom vynálezu je zlepšiť spôsob izolácie kyseliny klavulánovej z fermentačného prostredia, získaného s použitím produkčného mikroorganizmu, ako je Streptomyces sp. P 6621 FERM P 2804, pri ktorom by boli odstránené časovo náročné konvenčné metódy odstraňovania mycélia, proteínov a ďalších suspendovaných pevných častíc, prítomných vo vodnom kultivačnom prostredí, a ktorý by viedol k príprave vysoko čistých solí, napríklad klavulanátu draselného.

Vhodné soli podľa vynálezu sú farmaceutický prijateľné soli s alkalickými kovmi a kovmi alkalických zemín, ako sú sodné, draselné, vápenaté a horečnaté soli. Z nich sú najvhodnejšie sodné a draselné soli, predovšetkým draselná soľ.

Vynález je všeobecne použiteľný na čistenie fermentačných prostredí, získaných pomocou mikroorganizmu produkujúceho kyselinu klavulánovú.

Z uvedeného opisu doterajšieho stavu techniky je zrejmé, že známe spôsoby zahrnujú časovo náročné izolačné metódy a len EP-A-0 385 552 opisuje zlepšený spôsob, ktorým sa získava úplne transparentné prostredie. Nevýhodou tohto spôsobu však je, že na dosiahnutie tohto cieľa musí byť použitých niekoľko činidiel, ako sú anorganické elektrolyty, koagulanty, organické polyelektrolyty, a že vločkovanie, sedimentácia alebo filtrácia fermentačného prostredia vyžadujú relatívne dlhý čas, čo ovplyvňuje čistotu požadovaného produktu.

Na str. 2, stĺpec 2, riadky 22 až 35, sú síce uvedené niektoré možnosti čistenia fermentačného prostredia, ale tieto metódy by viedli k významnému zníženiu výťažku kyseliny klavulánovej. Ďalej je uvedené, že použitie niektorých prepracovaných metód izolácie a čistenia, ako je ultrafiltrácia a reverzná osmóza, by proces nezjednodušilo, pretože použitie týchto metód by vyžadovalo predchádzajúcu filtráciu na aktívnom uhlí alebo iónových živiciach.

Oproti týmto údajom bolo prekvapujúco zistené, že je možné vylúčiť niektoré činidlá, používané pri spôsobe opísanom v EP-A-0 385 552, rovnako ako ďalšie časovo náročné spôsoby čistenia vodného fermentačného prostredia, opísané v literatúre, ak sa podľa vynálezu použije metóda mikrofiltrácie, pri ktorej sa odstráni mycélium, hlavná časť proteínov (aspoň 80 % z množstva prítomného v prostredí) a ďalšie suspendované častice.

Na tento účel sa použije viacstupňové zariadenie na kontinuálnu mikrofiltráciu, ktoré umožňuje uskutočňovať spôsob oddeľovania mycélia a vodného filtrátu s kratším časom zdržania než pol hodiny a ktoré pozostáva z niekoľkých (piatich) sériovo spojených nezávislých segmentov (filtračných slučiek). Každý segment má vlastné obehové čerpadlo, ktoré umožňuje prietok fermentačného prostredia požadovanou rýchlosťou (5 až 8 m/s) kanálikmi keramických filtračných elementov s veľkosťou pórov 0,05 pm. Pri procese mikrofiltráce, prebiehajúcom pri teplote medzi asi 20 a 40 °C (teplota by nemala prekročiť 40 °C) sú tangenciálne rýchlosti regulované tak, aby v pevnej frakcii boli zadržované molekuly s molekulovou hmotnosťou nad 30.000. Týmto spôsobom sa nám podarilo odstrániť asi 80 až 90 % prítomných proteínov. Mycélium, oddelené v procese mikrofiltrácie, bolo tiež premyté vodou s cieľom zvýšiť výťažok kyseliny klavulánovej v spojenom filtráte. Opísaným spôsobom čistenia vodného fermentačného prostredia mikroflltráciou sa v čistenej vodnej fáze zadrží nad 95 % kyseliny klavulánovej, čo prevyšuje i výsledky vločkovacej metódy podľa EP-A-0 385 552 a predstavuje ďalšie zlepšenie vynálezu.

Po mikrofiltrácii môže byť filtrát prípadne čistený procesom ultrafiltrácie. Účelom tohto čistenia je oddeliť hlavnú časť zostávajúcich proteínových nečistôt a ďalšie sprievodné nečistoty s vyššou molekulovou hmotnosťou než kyselina klavulánová. Týmto spôsobom sa úspešne odstránia nežiaduce nečistoty, ktoré by sa mohli vyzrážať pri extrakcii s vodou nemiešateľným organickým rozpúšťadlom, čím sa podstatne obmedzí sfarbenie vodného filtrátu, získaného po čistení mikroflltráciou, a ďalej zlepší čistota požadovaného produktu.

V ultrafiltračnom zariadení sa používa polyméma membrána s vysokou schopnosťou rozlíšenia asi 20.000 daltonov (medzi 10.000 a 30.000 daltonov). Spôsob sa uskutočňuje kontinuálne, takže čas zdržania je čo najkratší, a na dvoch v sérii zapojených ultraflltračných zariadeniach (čo zvyšuje selektivitu delenia nečistôt a kyseliny klavulánovej); prídavkom čistej premývacej vody a protiprúdovým vedením retentátu (vodnej fázy) získaného procesom

SK 279780 Β6 ultrafiltrácie, sa straty kyseliny klavulánovej vo vodnej fáze znížia na menej než 5 %.

Spojený vodný filtrát sa potom skoncentruje v zariadení na reverznú osmózu pri teplote okolo teploty miestnosti na asi 1/5 pôvodného objemu, čím sa získa koncentrovaná vodná fáza nečistej kyseliny klavulánovej, a potom sa získaný koncentrát (retentát) priamo extrahuje pri teplotách medzi 15 a 25 °C (extrakcia môže prebiehať tiež pri teplote pod 15 °C) s vodou nemiešateľným organickým rozpúšťadlom, ako je etylacetát, v kyslom prostredí s pH medzi 1 a 3, ktoré sa upraví prídavkom anorganickej kyseliny, ako je kyselina sírová. Okrem etylacetátu je možné použiť aj iné s vodou nemiešateľné organické rozpúšťadlá, ako je metylacetát, metylizobutylketón alebo n-butylalkohol.

Pretože sa nám procesom mikrofiltrácie podarilo odstrániť mycélium a hlavnú časť prítomných proteínov je priama extrakcia čisteného a koncentrovaného vodného fermentačného prostredia príslušným s vodou nemiešateľným organickým rozpúšťadlom, ako je etylacetát, možná bez použitia časovo náročných čistiacich metód, aplikovaných známymi spôsobmi, opisovanými v citovanej literatúre, a je odstránené použitie ďalších činidiel, používaných pri čistení fermentačného prostredia metódou koagulácievločkovania. Okrem uvedeného zlepšenia teda spôsob podľa vynálezu poskytuje zníženie nákladov na metódu čistenia prostredia. Aby sa zamedzila denaturácia zostávajúcich proteínov v koncentráte vodnej fázy v dôsledku interakcie s organickým rozpúšťadlom alebo kyselinou sírovou počas extrakcie nečistej kyseliny klavulánovej z vodnej do organickej fázy, je najlepšie extrakciu uskutočňovať v rade odstredivých extraktorov, pričom z jedného z nich, tj. z odstredivého extraktora s automatickým vyprázdňovaním, sa súčasne kontinuálne odstraňujú oddelené proteíny.

V získanom extrakte nečistej kyseliny klavulánovej vo s vodou nemiešateľnom organickom rozpúšťadle môžu byť prítomné tiež vodorozpustné nečistoty, ako sú rôzne produkty rozkladu kyseliny klavulánovej, ktoré sú viac polárne než kyselina klavulánová samotná, a preto sa vodorozpustné nečistoty odstraňujú premytím spojenej organickej fázy vodou. Týmto spôsobom sa získa čistený extrakt kyseliny klavulánovej v organickej fáze, napríklad etylacetátový extrakt.

Kyselina klavulánová môže byť izolovaná z organickej fázy a čistená spôsobom opísaným v našom EP-A-0 562 583. Najlepší spôsob izolácie kyseliny klavulánovej, opísaný v tejto patentovej prihláške, sa uskutočňuje reakciou etylacetátového extraktu kyseliny klavulánovej s N,N'-diizopropyletyléndiamínom pri teplote okolo teploty miestnosti a nasledujúcim prevedením získaného intermediámeho Ν,Ν'-diizopropyletyléndiamónium diklavulanátu pôsobením 2-etylhexanoátu draselného vo vodnom roztoku izopropanolu a pri teplote miestnosti na klavulanát draselný, ktorý sa izoluje vo vysokej čistote.

Teraz sa zistilo, že príprava intermediámeho N,N'-diizopropyletyléndiamónium diklavulanátu sa najlepšie uskutočňuje tak, že sa pri reakcii medzi s vodou nemiešateľnou organickou fázou, ako je etylacetátový extrakt kyseliny klavulánovej, a N,N'-diizopropyletyléndiamínom používa organická fáza, z ktorej bola úplne odstránená voda, lebo už malé množstvá vody môžu rušiť prípravu intermediámej soli, pretože oddelená soľ sa rozpúšťa vo vode prítomnej v organickej fáze a môžu vznikať dechtovité vedľajšie produkty, čo komplikuje sušenie.

Ak je z organickej fázy úplne odstránená voda, zvýši sa stabilita organickej fázy alebo extraktu, pretože je známe, že stabilita kyseliny klavulánovej vo vodných roztokoch a v prostredí s kyslým pH v procese extrakcie je veľmi nízka. Preto bolo na sušenie organickej fázy, ako je etylacetátový extrakt kyseliny klavulánovej, použité sušenie v rektifikačnej kolóne (princíp frakčnej destilácie) vo vákuu kvôli nízkej stabilite intermediámej soli pri vyšších teplotách. Podstatným znakom spôsobu podľa vynálezu je, že organická fáza ako je etylacetát a voda tvorí azeotrop s minimálnou teplotou varu, a teda sa opísaným spôsobom organická fáza, ako je etylacetát, úplne vysuší. Organická fáza ako je etylacetát, má teda vždy obsah vody nižší než 0,1 % obj., v priemere od 0,03 do 0,05 % obj. Kompletne bezvodá organická fáza, ako je etylacetátový extrakt kyseliny klavulánovej, je potom počas veľmi krátkeho času zdržania skoncentrovaná odparením na 1/20 pôvodného objemu, načo sa podrobí reakcii s N,N'-diizopropyletyléndiamínom.

Nasledujúcu reakciu N,N'-diizopropyletyléndiamónium diklavulanátu s 2-etylhexanoátom draselným na klavulanát draselný s vysokou čistotou je možné uskutočňovať spôsobom opísaným v našej EP-A-0 562 583 a najlepšie spôsobom opísaným v príkladoch uskutočnenia a osvetleným v opísaných zlepšeniach.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Vynález je bližšie vysvetlený na príkladoch uskutočnenia, ktoré však neobmedzujú jeho rozsah.

Príklad 1

Kontinuálna príprava koncentrátu etylacetátového extraktu obsahujúceho nečistú kyselinu klavulánová

Vodné fermentačné prostredie (10.000 1), získané fermentáciou mikroorganizmu Streptomyces sp. P 6621 FERM P 2804 (koncentrácia kyseliny klavulánovej bola 3580 mg/1), sa pridalo k 33% vodnému roztoku (5 1) kyseliny sírovej v nádobe (objem 50 rrú) za miešania a chladenia tak, aby hodnota pH prostredia bola udržovaná medzi 5,8 a 6,2. Potom bolo médium kontinuálne rýchlosťou 1200 1/h pridávané do mikrofiltračného zariadenia, pozostávajúceho z piatich segmentov, spojených v sérii. Každý segment mal vlastné obehové čerpadlo tak, aby rýchlosť fermentačného prostredia pri prechode kanálikmi keramických filtračných elementov s veľkosťou pórov 0,05 pm bola 8 m/s. Procesom mikrofiltráce, pri ktorom sa dbalo, aby teplota neprekročila 40 °C, bolo oddelené mycélium a hlavná časť proteínov a ďalších suspendovaných pevných častíc.

Oddelený pevný podiel bol premytý vodou s prietokom 300 1/h a potom bol spojený filtrát (permeát) po mikrofiltrácii kontinuálne dodávaný rýchlosťou 1500 1/h do zariadení na reverznú osmózu, kde bol permeát skoncentrovaný na 1/5 pôvodného objemu.

Ku koncentrátu (retentátu), získavanému po reverznej osmóze s prietokom 300 1/h, bol pridávaný 33 % vodný roztok (4 1/h) kyseliny sírovej tak, aby hodnota pH prostredia bola udržovaná medzi 1,5 a 2,0, a potom bol pridávaný etylacetát s prietokom 900 1/h na účely extrakcie kyslého retentátu pri teplote miestnosti protiprúdovým spôsobom v sérii piatich odstredivých extraktorov, pričom v druhom odstredivom separátore - s automatickým vyprázd flovaním - boli súčasne odstraňované doposiaľ ostávajúce oddelené proteíny.

Spojený etylacetátový extrakt zo série odstredivých extraktorov bol v prvom odstredivom extraktore premývaný demineralizovanou vodou s prietokom 30 1/h, čím boli odstránené zostávajúce vodorozpustné nečistoty.

Etylacetátový extrakt s prietokom 900 1/h bol vákuovo sušený pri teplote 30 °C v rektifikačnej kolóne tak, aby sa dosiahol obsah vody 0,03 % obj., potom bol tento extrakt vákuovo odparovaný v tenkovrstvovej odparke pri teplote 30 °C na 1/20 pôvodného objemu. Získaný skoncentrovaný etylacetátový extrakt (koncentrácia nečistej kyseliny klavulánovej bola 50 g/1) s prietokom 45 1/h bol odfarbovaný kontinuálnym prídavkom aktívneho uhlia (0,45 kg), zmes sa 30 min miešala a potom bolo uhlie odfiltrované od suspenzie koncentrátu etylacetátového extraktu na tlakovom filtri pod tlakom dusíka 1 bar, čím sa získal suchý koncentrát (45 1) etylacetátového extraktu, obsahujúci nečistú kyselinu klavulánovú.

Príklad 2

Príprava Ν,Ν'-diizopropyletyléndiamónium diklavulanátu

K suchému koncentrátu (45 1) etylacetátového extraktu získaného kontinuálnym spôsobom podľa príkladu 1 (obsah kyseliny klavulánovej bol 50 g/1) sa v čase 5 min pridával za intenzívneho miešania pri teplote 25 °C N,N'-diizopropyletyléndiamín (1,4 1). Získaná suspenzia bola prefiltrovaná, získané kryštály boli resuspendované v acetóne (45 1) a za miešania a chladenia suspenzie na teplotu pod 10 °C sa oddelili kryštály požadovanej látky, ktoré boli odfiltrované, premyté acetónom a vákuovo vysušené pri teplote 30 °C. Boli získané kryštály N,N'-diizopropyletyléndiamónium diklavulanátu (3,3 kg; obsah kyseliny klavulánovej predstavoval 60 %).

Príklad 3

Príprava klavulanátu draselného

Ν,Ν'-Diizopropyletyléndiamónium diklavulanát (3,3 kg) z príkladu 2 bol rozpustený v zmesi izopropanol/voda (82,5 1; podiel vody predstavoval 1,5 %) a k získanému roztoku bolo počas 30 min za miešania pri teplote miestnosti pridávané aktívne uhlie (1,5 kg) a 2-etylhexanoát draselný (0,5 1; 2 M). Potom sa uhlie a získaná zrazenina odfiltrovali. K získanému filtrátu (80 1) bol počas 20 min za miešania pri teplote miestnosti pridávaný roztok (6 1)2-etylhexanoátu draselného (2 M) v izopropanole. Získaná suspenzia sa potom ešte 2 h miešala za chladenia na teplotu medzi 0 až 5 °C, potom sa vypadnuté kryštály odfiltrovali, premyli izopropanolom a acetónom a vákuovo sa sušili pri teplote 30 °C. Získal sa klavulanát draselný (2 kg; čistota USP, obsah kyseliny klavulánovej 80,6 % metódou HPLC).

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (14)

1. Spôsob izolácie kyseliny klavulánovej z vodného fermentačného prostredia, vyznačujúci sa tým, že sa mycélium, hlavná časť proteínov a ďalšie suspendované pevné častice odstránia mikrofiltráciou.

2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že uvedené pevné častice sa odstraňujú kontinuálnou mikrofiltráciou vo filtračných elementoch s veľkosťou pórov 0,05 pm.

3. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že filtrované prostredie sa extrahuje pri pH 1 až 3 s vodou nemiešateľným rozpúšťadlom s použitím protiprúdového odstredivého extraktora.

4. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že rozpúšťadlo sa volí zo skupiny: etylacctát, metylacetát, metylizobutylketón a n-butanol.

5. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa t ý m , že rozpúšťadlom je etylacetát.

6. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že mikrofiltrácia sa uskutočňuje pri pH medzi 5,8 a 6,2.

7. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že mikrofiltrácia sa uskutočňuje pri teplote 20 až 40 “C.

8. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 3 až 7, vyznačujúci sa tým, že filtrované prostredie sa extrahuje postupne v sérii odstredivých extraktorov.

9. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že filtrácia vodného fermentačného prostredia zahrnuje stupne mikrofiltrácie s nasledujúcou ultrafiltráciou.

10. Spôsob podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že ultrafiltrácia sa uskutočňuje kontinuálne s použitím semipermeabilnej membrány so schopnosťou rozlíšenia medzi 10.000 a 30.000 daltonov.

11. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 3 až 10, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje stupeň odstraňovania vody reverznou osmózou pred extrakciou s vodou nemiešateľným rozpúšťadlom.

12. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 3 až 11, vyznačujúci sa tým, že organická fáza sa suší vo vákuu s použitím rektifikačnej kolóny.

13. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 3 až 12, vyznačujúci sa tým, že kyselina klavulánová, rozpustená v rozpúšťadle nemiešateľnom s vodou, sa nechá reagovať s N,N'-diizopropyletyléndiamínom.

14. Spôsob podľa nároku 13, vyznačujúci sa t ý m , že sa Ν,Ν'-diizopropyletyléndiamónium diklavulanát nechá reagovať s 2-etylhexanoátom draselným za vzniku klavulanátu draselného.