CZ284117B6 - Způsob izolace kyseliny klavulanové a jejich farmaceuticky přijatelných solí z fermentačního prostředí Streptomyces SP. P 6621 FERM P 2804 - Google Patents

Abstract

Je popsán nový a zlepšený způsob izolace kyseliny klavulanové a jejich farmaceuticky přijatelných solí, jako je klavulanát draselný, z vodného fermentačního prostředí Streptomyces sp. P 6621 FERM P 2804, při němž se z fermentačního prostředí odstraní mycelium, hlavní část proteinů a další suspendované pevné částice mikrofiltrací při hodnotě pH prostředí mezi 5,8 a 6,2 a při teplotě asi 20 a 40.sup.o.n.C, čištěné prostředí (vodná fáze) se popřípadě dále čistí ultrafiltrací, a takto čištěné prostředí se zkoncentruje reverzní osmosou, načež se přímo extrahuje protiproudým způsobem v odstředivých extraktorech s vodou nemísitelným organickým rozpouštědlem při hodnotě pH prostředí mezi 1 a 3, přičemž jsou současně odstraňovány dosud zbylé oddělené proteiny, z organické fáze se odstraní vodorozpustné nečistoty promytím vodou, organická fáze se vakuově vysuší v rektifikační koloně na obsah vody pod 0,1 % obj. a pak zkoncentruje odpařením, odbarví zpracováním s aktivním uhlím, načež se kyselinaŕ

Description

Oblast techniky

Vynález náleží do oblasti farmaceutického průmyslu a týká se nového a zlepšeného způsobu izolace kyseliny klavulanové a jejích farmaceuticky přijatelných solí z fermentačního prostředí Streptomyces sp., zvláště kmene P 6621 FERM P 2804.

Existuje trvalá potřeba nalézání nových a zlepšených způsobů přípravy čisté kyseliny klavulanové a jejích farmaceuticky přijatelných solí, jako je klavulanát draselný, izolací z fermentačního prostředí, získaného s použitím produkčního mikroorganismu, bez složitých konvenčních izolačních metod a chromatografického čištění požadovaného produktu.

Dosavadní stav techniky

Kyselina klavulanová je běžný název (2R,5R,Z)-3-(2-hydroxyethyliden)-7-oxo-4-oxa-lazabicyklo[3.2.0]heptan-2-karboxylové kyseliny vzorce

COOH

CH₂OH

H

Kromě inhibičního působení na beta-laktamasy má kyselina klavulanová a její soli s alkalickými kovy také synergický účinek v kombinaci s beta-laktamovými antibiotiky penicilinové a cefalosporinové řady. Proto se kyselina klavulanová a její soli používají v galenických přípravcích pro prevenci desaktivace beta-laktamových antibiotik. Komerční přípravky obsahují stabilnější draselnou sůl kyseliny klavulanové (kyselina samotná je dosti nestálá) v kombinaci s amoxicillin trihydrátem.

Kyselina klavulanová se připravuje fermentací produkčního mikroorganismu, jako jsou různé mikroorganismy, náležející k různým kmenům Streptomyces, jako je S. clavuligerus NRRL 3585, S. jumoninensis NRRL 5741, S. katsurahamanus IFO 13716 a Streptomyces sp. P 6621 FERM P 2804.

Vodné kultivační prostředí, získané po fermentací, může být čištěno a koncentrováno konvenčními postupy, zahrnujícími například filtraci a chromatografické čištění, jak je popsáno v GB 1.508,977, před extrakcí vodného roztoku organickým rozpouštědlem k získání roztoku nečisté kyseliny klavulanové v organickém rozpouštědle.

V GB 1.508,977 se mimo jiné uvádí, že soli kyseliny klavulanové je možno získávat adsorpcí klavulanátového aniontu v přefiltrovaném prostředí na aniontovou výměnnou pryskyřici, z níž se eluují elektrolytem, vzniklý roztok se odsolí a pak se odstraní rozpouštědlo. Tento postup umožňuje dosáhnout přijatelných výtěžků požadované látky, avšak vyžaduje složité čištění chromatografickými metodami a použití sloupců pryskyřice vyžaduje významné investice, což omezuje výrobní operace ve velkém měřítku.

GB 1.543,563 popisuje modifikovaný způsob fermentace s použitím kmene S. clavuligerus NRRL 3585, při němž se hodnota pH v prostředí udržuje v rozmezí mezi 6,3 a 6,7, a tak se zvyšuje výtěžek požadované sloučeniny. Soli kyseliny klavulanové, jako je klavulanát draselný.

- 1 CZ 284117 B6 se připravují opětným vysolením z klavulanátu lithného, čímž se požadovaná sloučenina rovněž čistí.

EP-A-0 026 044 ilustruje použití terc.butylaminové soli kyseliny klavulanové jako užitečného meziproduktu pro přípravu kyseliny klavulanové. Tato sůl je známa z BE 862 211, ale pouze jako složka farmaceutických přípravků.

EP-B-0 182 522 popisuje způsob přípravy kyseliny klavulanové fermentací mikroorganismu S. clavuligerus. Významného zlepšeni způsobu bylo dosaženo přídavkem zdroje kyslíku, jako je glycerol, do fermentačního prostředí v průběhu způsobu buď kontinuálně, nebo přerušovaně, přičemž je velmi důležité, aby byla hladina uhlíku udržována na dostatečně nízké koncentraci, tj. pod 0,5 % (w/v), a aby v žádném případě nepřekročila 2 %. Příklady ilustrují, že podstatné zlepšení zvýšeného výtěžku kyseliny klavulanové bylo pozorováno, když byl zdroj uhlíku přidáván během fermentace. Je uvedeno, že koncentrace kyseliny klavulanové ve fermentačním prostředí po 160 h byla asi 1400 μg/ml, což je pozoruhodné zlepšení oproti dřívějším způsobům.

Dalším zlepšením byl také nový způsob čištění kyseliny klavulanové z roztoku ve formě lithné soli. K. dosažení vyšší čistoty klavulanátu lithného však byl přidáván koncentrovaný roztok jiné lithné soli, jako je chlorid lithný. Získaný rekrystalovaný klavulanát lithný mohl být dále čištěn a pak popřípadě převeden na jiné soli, jako je klavulanát draselný, způsobem známým z výše uvedené literatury .

Mycelium, proteiny a další pevný podíl se odstraňuje známými způsoby, jako je odstřeďování nebo filtrace, s případnou předchozí úpravou fermentačního prostředí zvoleným agregačním prostředkem za účelem agregace mycelia a umožnění snadnější filtrace. Přefiltrované fermentační prostředí se pak zpracovává iontovýměnnými pryskyřicemi nebo srážením rozpouštědlem, jako je aceton, k odstranění proteinů, a sraženina se odděluje opakovaným odstředěním a filtrací. Toto oddělování mycelia, proteinů a dalších doprovodných částic v suspenzi, původně přítomných ve fermentačním prostředí, je časově náročné a vyžaduje několik pracovních kroků.

Časově náročné způsoby odstraňování mycelia, proteinů a dalších suspendovaných částic a následná izolace ze získaného transparentního fermentačního prostředí, stejné jako příprava čisté kyseliny klavulanové a jejích solí, byly odstraněny způsobem popsaným v EP-A-0 385 552 a EP-A-0 387 178.

Celý způsob zahrnuje tři stupně, tj. čištění fermentačního prostředí od mycelia. proteinů a dalších pevných částic, čištění kyseliny klavulanové přítomné v nečisté formě v prostředí čištěného filtrátu Streptomyces clavuligerus s použitím jednoho z primárních, sekundárních nebo terciárních aminů, tvořících stabilní intermediální soli s kyselinou klavulanovou, čímž se oddělí hlavní část doprovodných nečistot v kyselině klavulanové, a jako poslední stupeň převádění intermediámích aminových solí kyseliny klavulanové (o čistotě 85 %) na požadovanou sůl s alkalickým kovem, jako je klavulanát draselný.

První stupeň je podrobněji popsán v EP-A-0 385 552, kde se z vodného kultivačního prostředí, získaného fermentací mikroorganismu Streptomyces clavuligerus, pomocí fyzikálně chemických procesů koagulace-vločkování odstraňuje mycelium, proteiny a další pevné částice. Vločky získané tímto způsobem jsou dostatečně velké a kompaktní, aby umožňovaly snadnou sedimentaci a dělení, které se nejlépe provádí pomocí válcových sít. Získá se tak transparentní prostředí, které je možno popřípadě zkoncentrovat reverzní osmózou.

Tímto způsobem se získá čištěné fermentační prostředí bez použití konvenčních metod čištění, jako je odstřeďování. adsorpce na aktivním uhlí, filtrace s pomocnými látkami atd.

-2 CZ 284117 B6

Ve všech známých způsobech je také nezbytné (což je odlišné od popsaného způsobu vločkování), aby bylo čištěné kultivační prostředí zpracováváno různými způsoby deproteinizace a iontové výměny, což způsobuje významné celkové ztráty konečného výtěžku požadované látky. Na rozdíl od známých způsobů dosahuje celkový výtěžek způsobu vločkování 85 až 90 %.

Popsaný způsob koagulace-vločkování z fermentačního prostředí Streptomyces clavuligerus je založen na přídavku anorganického elektrolytu do kultivačního prostředí za účelem zvýšení účinku koagulantu, aplikaci anorganického koagulantu jako iniciátoru procesu koagulace za míchání a při hodnotě pH prostředí mezi 6 a 8, přídavku organického elektrolytu při zahájení vločkování a následném oddělení získaných vloček od fermentačního prostředí pomocí válcových sít nebo filtrace, a jestliže vločkování probíhá v přítomnosti s vodou nemísitelného rozpouštědla, případné dekantaci fází, oddělení vloček, a případném zkoncentrování kapaliny reverzní osmózou nebo odpařením.

EP-A-0 532 583 popisuje použití solí kyseliny klavulanové s organickými diaminy, jako je Ν,Ν'-diisopropylethylendiamonium diklavulanát, jako meziproduktů, vhodných pro izolaci a přípravu čisté kyseliny klavulanové nebo jejích solí s alkalickými kovy, jako je klavulanát draselný, z ethylacetátového extraktu, získaného po extrakci získaného vodného kultivačního prostředí, vytvořeného po fermentaci, kde je přítomna kyselina klavulanová.

Podstata vynálezu

Cílem vynálezu je zlepšit způsob izolace kyseliny klavulanové z fermentačního prostředí, získaného s použitím produkčního mikroorganismu, jako je Streptomyces sp. P 6621 FERM P 2804, při němž by byly odstraněny časově náročné konvenční metody odstraňování mycelia, proteinů a dalších suspendovaných pevných částic, přítomných ve vodném kultivačním prostředí, a který by umožňoval přípravu vysoce čistých solí, například klavulanátu draselného.

Vhodné soli podle vynálezu jsou farmaceuticky přijatelné soli s alkalickými kovy a kovy alkalických zemin, jako jsou sodné, draselné, vápenaté a hořečnaté soli. Z nich jsou nejvhodnější sodné a draselné soli, zejména draselná sůl.

Vynález je obecně použitelný pro čištění fermentačních prostředí, získaných pomocí mikroorganismu produkujícího kyselinu klavulanovou.

Z výše uvedeného popisu dosavadního stavu techniky je zřejmé, že známé způsoby zahrnují časově náročné izolační metody a pouze EP-A-0 385 552 popisuje zlepšený způsob, jímž se získává plně transparentní prostředí. Nevýhodou tohoto způsobu však je, že k dosažení tohoto cíle musí být použito několika činidel, jako jsou anorganické elektrolyty, koagulanty, organické polyelektrolyty, a že vločkování, sedimentace nebo filtrace fermentačního prostředí vyžadují relativně dlouhou dobu, což ovlivňuje čistotu požadovaného produktu.

Na str. 2, sloupec 2, řádky 22 až 35, jsou sice uvedeny některé možnosti čištění fermentačního prostředí, avšak tyto metody by vedly k významnému snížení výtěžku kyseliny klavulanové. Dále je uvedeno, že použití některých propracovaných metod izolace a čištění, jako je ultrafiltrace a reverzní osmóza, by proces nezjednodušilo, protože použití těchto metod by vy žadovalo předchozí filtrace na aktivním uhlí nebo iontových pryskyřicích.

Oproti těmto údajům bylo překvapivě zjištěno, že je možno vyloučit některá činidla, používaná při způsobu, popsaném v EP-A-0 385 552, stejně jako další časově náročné způsoby čištění vodného fermentačního prostředí, popsané v literatuře, jestliže se kyselina klavulanová izoluje z vodného fermentačního prostředí Streptomyces sp. tak, že se mycelium, hlavní část proteinů

-3 CZ 284117 B6 (alespoň 80 % z množství přítomného v prostředí) a další suspendované pevné částice odstraní mikrofiltrací.

Způsob podle vynálezu je možno provádět tak, že se pevné částice odstraňují kontinuální mikrofiltrací ve filtračních elementech o velikosti pórů 0,05 pm.

Mikrofiltrace se vhodně provádí při pH mezi 5,8 a 6,2 a při teplotě 20 až 40 °C.

Filtrace vodného fermentačního prostředí může zahrnovat mikrofltraci s následující ultrafiltrací, zejména prováděnou kontinuálně s použitím semipermeabilní membrány se schopností rozlišení mezi 10 000 a 30 000 dalton.

Filtrované prostředí se pak nej vhodněji extrahuje při pH 1 až 3 s použitím protiproudého odstředivého extraktoru s vodou nemísitelným rozpouštědlem, voleným výhodné ze skupiny ethylacetátu, methylacetátu, methylisobuty lketonu a n-butylalkoholu, zejména ethylacetátem.

Před extrakci s vodou nemísitelným rozpouštědlem je možno zařadit stupeň odstraňování vody reverzní osmózou.

Organická fáze se pak suší ve vakuu s použitím rektifikační kolony.

Kyselinu klavulanovou. rozpuštěnou ve s vodou nemísitelném rozpouštědle, je pak možno nechat reagovat s Ν,Ν'-diisopropylethylendiaminem a ze vzniklého N,N’-diisopropylethylendiamonium diklavulanátu získat reakcí s 2-ethylhexanoátem draselným klavulanát draselný.

K provedení vynálezu účelu se použije vícestupňové zařízení pro kontinuální mikrofiltrací, které umožňuje provádět způsob oddělování mycelia a vodného filtrátu s dobou zdržení menší než půl hodiny a které sestává z několika (pěti) sériově spojených nezávislých segmentů (filtračních smyček). Každý segment má vlastní oběhové čerpadlo, které umožňuje průtok fermentačního prostředí požadovanou rychlostí (5 až 8 m/s) kanálky keramických filtračních elementů s velikostí pórů 0.05 um. Při procesu mikrofiltrace probíhajícím při teplotě mezi 20 a 40 °C (teplota by neměla překročit 40 °C) jsou tangenciální rychlosti regulovány tak. aby v pevné frakci byly zadržovány molekuly o molekulové hmotnosti nad 30 000. Tímto způsobem se nám podařilo odstranit asi 80 až 90 % přítomných proteinů. Mvcelium, oddělené v procesu mikrofiltrace, bylo také promyto vodou za účelem zvýšení výtěžku kyseliny klavulanové ve spojeném filtrátu. Popsaným způsobem čištění vodného fermentačního prostředí mikrofiltrací se v čištěné vodné fázi zadrží nad 95 % kyseliny klavulanové, což převyšuje i výsledky vločkovací metody podle EP-A-0 385 552 a představuje další zlepšení vynálezu.

Po mikrofiltrací může být filtrát popřípadě čištěn procesem ultrafiltrace. Účelem tohoto čištění je oddělit hlavní část zbylých proteinových nečistot a další doprovodné nečistoty s vyšší molekulovou hmotností než kyselina klavulanová. Tímto způsobem se úspěšně odstraní nežádoucí nečistoty, které by se mohly vysrážet při extrakci s vodou nemísitelným organickým rozpouštědlem, čímž se podstatně omezí zbarvení vodného filtrátu, získaného po čištění mikrofiltrací, a dále zlepší čistota požadovaného produktu.

V ultrafiltračním zařízení se používá polymemí membrána s vysokou schopností rozlišení asi 20 000 dalton (mezi 10 000 a 30 000 dalton). Způsob se provádí kontinuálně, takže doba zdržení je co nejkratší, a na dvou v sérii zapojených ultrafiltračních zařízeních (což zvyšuje selektivitu dělení nečistot a kyseliny klavulanové); přídavkem čisté promývací vody a protiproudým vedením retentátu (vodné fáze) získaného procesem ultrafiltrace, se ztráty kyseliny klavulanové ve vodné fázi sníží na méně než 5 %.

-4 CZ 284117 B6

Spojený vodný filtrát se pak zkoncentruje v zařízení pro reverzní osmózu při teplotě kolem teploty místnosti na asi 1/5 původního objemu, čímž se získá koncentrovaná vodná fáze nečisté kyseliny klavulanové, a pak se získaný koncentrát (retentát) přímo extrahuje při teplotách mezi 15 a 25 °C (extrakce může probíhat také při teplotě pod 15 °C) s vodou nemísitelným organickým rozpouštědlem, jako je ethylacetát, v kyselém prostředí o pH mezi 1 a 3, které se upraví přídavkem anorganické kyseliny, jako je kyselina sírová. Kromě ethylacetátu je možno použít i jiných s vodou nemísitelných organických rozpouštědel, jako je methylacetát, methylisobutylketon nebo n-butylalkohol.

Protože se nám procesem mikrofiltrace podařilo odstranit mycelium a hlavní část přítomných proteinů, je přímá extrakce čištěného a koncentrovaného vodného fermentačního prostředí příslušným s vodou nemísitelným organickým rozpouštědlem, jako je ethylacetát, možná bez použití časově náročných čisticích metod, aplikovaných známými způsoby, popisovanými ve výše citované literatuře, a je odstraněno použití dalších činidel, používaných při čištění fermentačního prostředí metodou koagulace-vločkování. Kromě výše uvedeného zlepšení, tedy způsob podle vynálezu poskytuje snížení nákladů na metodu čištění prostředí. K zamezení denaturace zbylých proteinů v koncentrátu vodné fáze v důsledku interakce s organickým rozpouštědlem nebo kyselinou sírovou v průběhu extrakce nečisté kyseliny klavulanové z vodné do organické fáze je nejlépe extrakci provádět v řadě odstředivých extraktorů, přičemž z jednoho z nich, tj. z odstředivého extraktorů s automatickým vyprazdňováním, se současně kontinuálně odstraňují oddělené proteiny.

V získaném extraktu nečisté kyseliny klavulanové ve s vodou nemísitelném organickém rozpouštědle mohou být přítomny také vodorozpustné nečistoty, jako jsou různé produkty rozkladu kyseliny klavulanové. které jsou více polární než kyselina klavulanová samotná, a proto se vodorozpustné nečistoty odstraňují promytím spojené organické fáze vodou. Tímto způsobem se získá čištěný extrakt kyseliny klavulanové v organické fázi, například ethylacetátový extrakt.

Kyselina klavulanová může být izolována z organické fáze a čištěna způsobem popsaným v našem EP-A-0 562 583. Nejlepší způsob izolace kyseliny klavulanové, popsaný v této patentové přihlášce, se provádí reakcí ethylacetátového extraktu kyseliny klavulanové s Ν,Ν'-diisopropylethylendiaminem při teplotě kolem teploty místnosti a následujícím převedením získaného intermediámího Ν,Ν'-diisopropylethylendiamonium diklavulanátu působením 2-ethylhexanoátu draselného ve vodném roztoku isopropanolu a při teplotě místnosti na klavulanát draselný, který se izoluje ve vysoké čistotě.

Nyní bylo zjištěno, že příprava intermediámího Ν,Ν'-diisopropylethylendiamonium diklavulanátu se nejlépe provádí tak, že se při reakci mezi s vodou nemísitelnou organickou fází, jako je ethylacetátový extrakt kyseliny klavulanové. a Ν,Ν'-diisopropylethylendiaminem používá organická fáze, z níž byla úplně odstraněna voda, poněvadž již malá množství vody mohou rušit přípravu intermediámí soli, protože oddělená sůl se rozpouští ve vodě přítomné v organické fázi a mohou vznikat dehtovité vedlejší produkty, což komplikuje sušení.

Je-li z organické fáze úplně odstraněna voda, zvýší se stabilita organické fáze nebo extraktu, poněvadž je známo, že stabilita kyseliny klavulanové ve vodných roztocích a v prostředí s kyselým pH v procesu extrakce je velmi špatná. Proto bylo pro sušení organické fáze, jako je ethylacetátový extrakt kyseliny klavulanové, použito sušení v rektifikační koloně (princip frakční destilace) ve vakuu kvůli špatné stabilitě intermediámí soli při vyšších teplotách. Podstatným znakem způsobu podle vy nálezu je, že organická fáze, jako je ethylacetát, a voda tvoří azeotrop s minimální teplotu varu, a tudíž se popsaným způsobem organická fáze, jako je ethylacetát, úplně vysuší. Organická fáze, jako je ethy lacetát, tedy má vždy obsah vody nižší než 0.1 % obj., v průměru od 0,03 do 0.05 % obj. Kompletně bezvodá organická fáze, jako je ethy lacetátový extrakt kyseliny klavulanové, je pak během velmi krátké doby zdržení zkoncentrována

- 5 CZ 284117 B6 odpařením na 1/20 původního objemu, načež se podrobí reakci s N,N'-diisopropylethylendiaminem.

Následující reakci Ν.Ν'-diisopropylethylendiamonium diklavulanátu s 2-ethylhexanoátem draselným na klavulanát draselný o vysoké čistotě je možno provádět způsobem popsaným v naší EP-A-0 562 583 a nejlépe způsobem popsaným v příkladech provedení a osvětleným ve výše popsaných zlepšeních.

Příklady provedení vxnálezu

Vynález je blíže osvětlen na příkladech provedení, které však neomezují jeho rozsah.

Příklad 1

Kontinuální příprava koncentrátu ethylacetátového extraktu obsahujícího nečistou kyselinu klavu lanovou

Vodné fermentační prostředí (10.000 1), získané fermentací mikroorganismu Streptomyces sp. P 6621 FERM P 2804 (koncentrace kyseliny klavulanové činila 3580 mg/1), bylo přidáno k 33% vodnému roztoku (5 1) kyseliny sírové v nádobě (objem 50 m') za míchání a chlazení tak, aby hodnota pH prostředí byla udržována mezi 5,8 a 6,2. Pak bylo médium kontinuálně rychlostí 1200 1/h přidáváno do mikrofiltračního zařízení, sestávajícího z pěti segmentů, spojených v sérii. Každý segment měl vlastní oběhové čerpadlo tak, aby rychlost fermentačního prostředí při průchodu kanálky keramických filtračních elementů o velikosti pórů 0,05 pm byla 8 m/s. Procesem mikrofiltrace, při němž se dbalo, aby teplota nepřekročila 40 °C, bylo odděleno mycelium a hlavní část proteinů a dalších suspendovaných pevných částic.

Oddělený pevný podíl byl promyt vodou o průtoku 300 1/h a pak byl spojený filtrát (permeát) po mikrofiltraci kontinuálně dodáván rychlostí 1500 1/h do zařízení pro reverzní osmózu, kde byl permeát zkoncentrován na 1/5 původního objemu.

Ke koncentrátu (retentátu). získávanému po reverzní osmóze s průtokem 300 1/h, byl přidáván 33% vodný roztok (4 1/h) kyseliny sírové tak, aby hodnota pH prostředí byla udržována mezi 1,5 a 2,0, a pak byl přidáván ethylacetát s průtokem 900 1/h za účelem extrakce kyselého retentátu při teplotě místnosti protiproudým způsobem v sérii pěti odstředivých extraktorů. přičemž ve druhém odstředivém separátoru - s automatickým vyprazdňováním - byly současně odstraňovány dosud zbývající oddělené proteiny.

Spojený ethylacetátový extrakt ze série odstředivých extraktorů byl v prvním odstředivém extraktorů promýván demineralizovanou vodou s průtokem 301/h, čímž byly odstraněny zbývající vodorozpustné nečistoty.

Ethylacetátový extrakt s průtokem 900 1/h byl vakuově sušen při teplotě 30 °C v rektifikační koloně tak, aby bylo dosaženo obsahu vody 0,03 % obj., pak byl tento extrakt vakuově odpařován v tenkovrstvé odparce při teplotě 30 °C na 1/20 původního objemu. Získaný zkoncentrovaný ethylacetátový extrakt (koncentrace nečisté kyseliny klavulanové činila 50 g/1) s průtokem 45 1/h byl odbarvován kontinuálním přídavkem aktivního uhlí (0,45 kg), směs byla 30 min míchána a pak bylo uhlí odfiltrováno od suspenze koncentrátu ethylacetátového extraktu na tlakovém filtru pod tlakem dusíku 1 bar, čímž byl získán suchý koncentrát (45 1) ethylacetátového extraktu, obsahující nečistou kyselinu klavulanovou.

-6CZ 284117 B6

Příklad 2

Příprava Ν,Ν'-diisopropylethylendiamonium diklavulanátu

K suchému koncentrátu (45 l) ethylacetátového extraktu, získaného kontinuálním způsobem podle příkladu 1 (obsah kyseliny klavulanové činil 50 g/1) byl po dobu 5 min přidáván za intenzivního míchání při teplotě 25 °C N,N'-diisopropylethylendiamin (1,4 I). Získaná suspenze byla přefiltrována, získané krystaly byly resuspendovány v acetonu (45 1) a za míchání a chlazení suspenze na teplotu pod 10 °C se oddělily krystaly požadované látky, které byly odfiltrovány, promyty acetonem a vakuově vysušeny při teplotě 30 °C. Byly získány krystaly N,N'-diisopropylethylendiamonium diklavulanátu (3,3 kg; obsah kyseliny klavulanové činil 60 %).

Příklad 3

Příprava klavulanátu draselného

Ν,Ν'-diisopropylethylendiamonium diklavulanát (3,3 kg) z příkladu 2 byl rozpuštěn ve směsi isopropanol/voda (82,5 1; podíl vody činil 1,5 %) a k získanému roztoku bylo po dobu 30 min zamíchání při teplotě místnosti přidáváno aktivní uhlí (1,5 kg) a 2-ethylhexanoát draselný (0,5 1; 2 M). Pak bylo uhlí a získaná sraženina odfiltrováno. K. získanému filtrátu (80 1) byl po dobu 20 min za míchání při teplotě místnosti přidáván roztok (6 1) 2-ethylhexanoátu draselného (2 M) v isopropanolu. Získaná suspenze pak byla ještě 2 h míchána za chlazení na teplotu mezi 0 až 5 °C, pak byly vypadlé krystaly odfiltrovány, promyty isopropanolem a acetonem a vakuově sušeny při teplotě 30 °C. Byl získán klavulanát draselný (2 kg; čistota USP, obsah kyseliny klavulanové 80,6 % metodou HPLC).

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (14)

1. Způsob izolace kyseliny klavulanové z vodného fermentačního prostředí Streptomyces sp.. vyznačující se tím, že se mycelium, hlavní část proteinů a další suspendované pevné částice odstraní mikrofiltrací.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedené pevné částice se odstraňují kontinuální mikrofiltrací ve filtračních elementech o velikosti pórů 0.05 pm.

3. Způsob podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že filtrované prostředí se extrahuje při pH 1 až 3 s vodou nemísitelným rozpouštědlem s použitím protiproudého odstředivého extraktoru.

4. Způsob podle nároku 3, vy z n a č u j í c í se tím, že rozpouštědlo se volí ze skupiny: ethylacetát, methylacetát. methylisobutylketon a n-butanol.

5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že rozpouštědlem je ethylacetát.

6. Způsob podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že mikrofiltrace se provádí při pH mezi 5,8 a 6,2.

-7 CZ 284117 B6

7. Způsob podle kteréhokoli z předcházejících nároků vyznačující se tím, že mikrofiltrace se provádí při teplotě 20 až 40 °C.

8. Způsob podle kteréhokoli z nároků 3 až 7. vyznačující se tím, že filtrované prostředí se extrahuje postupně v sérii odstředivých extraktorů.

9. Způsob podle kteréhokoli z předcházejících nároků vyznačující se tím, že filtrace vodného fermentačního prostředí zahrnuje stupně mikrofiltrace s následující ultrafiltrací.

10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že ultrafiltrace se provádí kontinuálně s použitím semipermeabilní membrány se schopností rozlišení mezi 10 000 a 30 000 dalton.

11. Způsob podle kteréhokoli z nároků 3 až 10, vyznačující se tím, že zahrnuje stupeň odstraňování vody reverzní osmózou před extrakcí s vodou nemísitelným rozpouštědlem.

12. Způsob podle kteréhokoli z nároků 3 až 11, vyznačující se tím, že organická fáze se suší ve vakuu s použitím rektifikační kolony.

13. Způsob podle kteréhokoli z nároků 3 až 12, vyznačující se tím, že kyselina klavulanová, rozpuštěná ve s vodou nemísitelném rozpouštědle se nechá reagovat s N,Ndiisopropylethylendiaminem.

14. Způsob podle nároku 13, v y z n a č u j í c í se tím, že se N,N'-diisopropylethylendiamonium diklavulanát nechá reagovat s 2-ethylhexanoátem draselným za vzniku klavulanátu draselného.