JPH09504702A - ストレプトミセス ｓｐ． Ｐ ６６２１ ＦＥＲＭ Ｐ ２８０４の発酵培養液からクラブラン酸及びその薬剤学的に応用可能な塩を分離する新規な方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ストレプトミヤスｓｐ．Ｐ６６２１ ＦＥＲＭ Ｐ ２８０４の水性発酵培養液からクラブラン酸及び薬剤学的に適用可能な塩を分離する新規な改良された方法が開示されており、発酵培養液から菌糸体、蛋白の大部分及び他の懸濁した固体粒子が約２０〜４０℃の温度にて、媒体のｐＨ値５．８〜６．２において精密ろ過によって除去され、精製された培養液（水相）は限外ろ過にて任意かつ付随的に精製され、そのように精製された培養液は逆浸透にて濃縮され、媒体のｐＨ１〜３にて、水不溶性の有機溶媒を用いて遠心抽出機において向流にて直接抽出され、この抽出機において残留する蛋白が同時に除去され、得られた有機相から水に不溶な不純物が有機相を水で洗浄することによって除去され、有機相は、真空条件下、精留カラムにて水分量が０．１容量％以下にまで乾燥され、その後蒸発によって濃縮され、活性炭との処理によって脱色され、乾燥した有機相、最適には酢酸エチル相中に存在するクラブラン酸がほぼ室温においてＮ，Ｎ’−ジイソプロピルエチレンジアミンとの反応によって分離精製され、得られた中間体であるＮ，Ｎ’−ジイソプロピルエチレンジアンモニウムジクラブラネートは分離され、カリウム−２−エチルヘキサノエートのイソプロパノール溶液との反応によって高純度を有するクラブラン酸カリウム塩が得られる。

Description

【発明の詳細な説明】 ストレプトミセスｓｐ．Ｐ６６２１ ＦＥＲＭＰ ２８０４の発酵培養液からクラ ブラン酸及びその薬剤学的に応用可能な塩を分離する新規な方法 技術分野 （ＩＰＣ Ｃ１２Ｐ １７／１８，Ｃ０７Ｄ４９８／０４） 本発明は製薬業の分野に関するものであり、ストレプトミセス（Streptomyces ）ｓｐ．Ｐ ６６２１ ＦＥＲＭ Ｐ ２８０４の発酵培養液からグラブラン酸及び その薬剤学的に応用可能な塩を分離する新規なかつ改良された方法に関するもの である。 技術上の問題点 クラブラン酸生産菌によって得られる発酵培養液からの分離によって純粋なク ラブラン酸及び例えばクラブラン酸カリウムのような薬剤学的に応用可能な塩を 調製する新規なかつ改良された方法であって、所望の生産物の複雑な従来技術に よる分離法及びクロマトグラフによる精製を回避するようにした方法に対する必 要性は常に存在している。 従来技術 クラブラン酸は、以下の構造式にて示される（２Ｒ，５Ｒ，Ｚ）−３−（２− ヒドロキシエチリデン）−７−オキソ−４−オキサ−１−アザビシクロ［３，２ ，０］ヘプタン−２−カルボン酸の一般名である。 クラブラン酸のアルカリ金属塩及びエステルはある種のグラム陰性菌並びにあ る種のグラム陽性菌によって生産されるベータラクタマーゼの阻害剤としての活 性を有する。 ベータラクタマーゼ阻害作用に加えて、クラブラン酸及びそのアルカリ金属塩 はまた、ペニシリン及びセファロスポリン系のベータラクタム抗生物質と併用す ることによって相乗作用を示す。従って、クラブラン酸及びその塩はベータラク タム抗生物質の非活性化を阻止するためのガレヌス製剤（galenic preparation ）において使用される。商品化された製剤はアモキシシリン三水和物と併用した より安定なクラブラン酸カリウム塩（酸単独ではむしろ不安定である）を含んで いる。 クラブラン酸は例えばＳ．クラブリゲルス（clavuligerus）ＮＲＲＬ ３５８ ５，Ｓ．ジュモニネンシス（jumoninensis）ＮＲＲＬ ５７４１，Ｓ．カツラハ マヌス（katsurahamanus）ＩＦＯ １３７１６及びストレプトミセスｓｐ．Ｐ ６ ６２１ ＦＥＲＭ Ｐ ２８０４のような各種のストレプトミセス菌を含んだ種々 の菌のようなクラブラン酸生産菌の発酵によって調製される。 発酵の後に得られる水性の培養液は精製され、水性溶液を有機溶媒で抽出して 有機溶媒中に不純物を含んだクラブラン酸の溶液を得る前に、例えばイギリス特 許第１，５０８，９７７号に開示されているようなろ過及びクロマトグラフによ る精製からなる従来の方法に従って精製及び濃縮される。 イギリス特許第１，５０８，９７７号では、とりわけクラブラン酸の塩は、ろ 過された培養液中のクラブラン酸アニオン塩をアニオン性交換樹脂上に吸着させ 、それを電解質で溶出し、生成した溶液を脱塩し、溶媒を除去することによって 得られると開示されている。この方法は所望の物質の許容できる生成量を得るた めに使用されるが、クロマトグラフ法による複雑な精製が必要とされ、樹脂カラ ムの使用は、大規模な生産操作を制限するような重要な投資を要する。 イギリス特許第１，５４３，５６３号はＳ．クラブリゲルスＮＲＲＬ ３５８ ５菌を用いた改良された発酵方法を開示しており、媒体のｐＨ値が６．３〜６． ７の範囲に維持されると所望の化合物の生成量が増大すると述べている。クラブ ラン酸カリウムのようなクラブラン酸塩はクラブラン酸リチウムから再び塩にす ることによって調製され、それによって所望の化合物も精製される。 ヨーロッパ特許出願公開第００２６０４４号はクラブラン酸の調製における有 効な中間体としてクラブラン酸のｔｅrｔ−ブチルアミン塩の使用を開示してい る。この塩はベルギー特許第８６２２１１号によって公知であるが薬剤処方中に おける一成分としてのみ開示されている。 ヨーロッパ特許第０１８２５２２号は、Ｓ．クラブリゲルス菌の発酵によって クラブラン酸を調製する方法を開示している。この方法の重要な改良はその方法 の中で連続的あるいは断続的に発酵媒地中にグリセロールのような炭素原を付加 することによって達成されており、ここでは炭素レベルが十分に低い濃度、すな わち０．５％（ｗ／ｖ）以下かつ２％を越えない濃度、に維持されている点が特 に重要である。炭素原が発酵の際に加えられた場合、クラブラン酸の生成量の増 大がするという本質的な改良が見られるという例が開示されている。１６０時間 後の発酵培養液中のクラブラン酸の濃度は約１４００μｇ／ｍｌであり、これは 従来の方法に比べて顕著な改良であると述べられている。 更なる改良は、溶液からクラブラン酸をそのリチウム塩の形にて精製する新規 な方法も含まれる。しかしながら、より純度の高いクラブラン酸リチウムを得る には例えば塩化リチウムのような他のリチウム塩の濃縮液が加えられている。得 られた再結晶されたクラブラン酸リチウムは更に精製され、そして、上述の文献 から周知の方法にてクラブラン酸カリウムのような他の塩に任意に変換される。 菌糸体、蛋白及び他の固形物は、菌糸体を凝集し、さらにろ過を容易にするた めに、選択された凝集剤で発酵培養液を可能な前処理をしてから遠心分離あるい はろ過のような周知の方法を用いて除去される。ろ過された発酵培養液は更にイ オン交換樹脂あるいは蛋白を除去するためにアセトンのような溶媒で沈澱させる ことによって処理され、沈澱物は遠心分離及びろ過を繰り返すことによって分離 される。このように発酵培養液に初めから存在する懸濁液中の菌糸体、蛋白及び 他の混在する粒子を分離することは、時間もかかり、複数の処理工程を必要とす る。 純粋なクラブラン酸及びその塩の調製はもちろん、菌糸体、蛋白及び他の懸濁 した粒子を除去し、そして得られた透明な発酵培養液から分離するというこのよ うな時間のかかる方法は、ヨーロッパ特許出願公開第０３８５５５２号及びヨー ロッパ特許出願公開第０３８７１７８号によって開示された方法によって回避す ることができる。 方法全体は３工程からなり、すなわち、菌糸体、蛋白及び他の固形粒子の含ま れた発酵培養液の精製、クラブラン酸の安定な中間体の塩を生成するために第１ 級、第２級及び第３級アミンのいずれか１つを用いることによってストレプトミ セスクラブリゲルスの精製されたろ液培養液中において不純物形態にて存在する クラブラン酸を精製し、それによりクラブラン酸中に混在する不純物の大部分が 分離され、そして最後の工程にてクラブラン酸の中間体アミン塩（純度８５％） が例えばクラブラン酸カリウムのような所望のアルカリ金属塩に変換される。 第１の工程はヨーロッパ特許出願公開第０３８５５５２号においてより詳細に 開示されており、ストレプトミセス クラブリケルス菌の発酵によって得られる 水性の培養液から、凝集−フロック化の物理化学的な方法によって菌糸体、蛋白 及び他の固体粒子が除去される。この方法にて得られたフロックは十分に大きく かつ凝集しており、容易に沈降及び分離がなされ、この分離はローリングふるい によってもっとも良好に達成される。その結果透明な培養液が得られ、逆浸透に よって任意に濃縮される。 この方法において、精製された発酵培養液が得られ、例えば遠心分離、活性炭 への吸着、コアジュバンド等とともにろ過するような従来の精製法が回避できる 。 全ての公知の方法において（開示されたフロック化法とは異なり）、精製され た培養液は所望の物質の最終生成量において深刻な総量の損失を引き起こすよう な脱蛋白化及びイオン交換の種々の方法によって処理される必要もある。周知の 方法と比較して、フロック化法における総生成量は８５〜９０％に達する。 ストレプトミセス クラブリゲルスの発酵培養液から凝集−フロック化を行う 開示された方法は、無機電解質を培養液に添加することによって凝集作用が増大 することに基づいており、凝集方法の開始剤として無機凝集剤を撹拌しながら媒 体のｐＨ値を６〜８にて適用し、フロック化が開始されると有機電解質を加え、 ローリングふるいあるいはろ過を用いて発酵培養液から得られたフロックを任意 に分離し、フロック化が水不溶性の溶媒中にて起こる場合は、相をデカンテーシ ョンし、フロックを分離し、逆浸透あるいは蒸発によって溶液を任意に濃縮する 。 ヨーロッパ特許出願公開第０５６２５８３号は、発酵の後に形成されたクラブ ラン酸の存在する水性培養液の溶媒抽出の後、得られた酢酸エチル抽出物から純 粋なクラブラン酸あるいはクラブラン酸カリウムのようなクラブラン酸のアルカ リ金属塩を分離及び調製するための有効な中間体として例えばＮ，Ｎ’−ジイソ プロピルエチレンジアンモニウムジクラブラネートのような有機ジアミンを有す るクラブラン酸塩の使用を開示している。 技術的な解決手段 本発明の目的は、例えばストレプトミセスｓｐ．Ｐ ６６２１ ＦＥＲＭ Ｐ ２ ８０４のようなクラブラン酸生産菌によって得られる発酵培養液からクラブラン 酸を分離する方法を改良することであり、この方法において、水性の培養液中に 混在する菌糸体、蛋白及び他の懸濁した固形粒子を除去する時間のかかる従来法 が回避され、クラブラン酸カリウムのような高純度の塩が調製される。 本発明による安定な塩とは、例えばナトリウム、カリウム、カルシウム及びマ グネシウム塩のような薬剤学的に適用可能なアルカリ金属及びアルカリ土類金属 の塩である。これらの塩のうちではナトリウム及びカリウム塩、特にカリウム塩 が最適である。 本発明は一般にはクラブラン酸生産菌によって得られる発酵培養液の精製に有 用である。 上述の従来技術から明かなように、周知の方法は時間のかかる分離法からなっ ており、ヨーロッパ特許出願公開第０３８５５５２号のみが改良された方法、す なわち完全に透明な発酵培養液が得られる方法を開示している。しかしながら、 この方法において所望の目的を達成しようとすれば、例えば無機電解質、凝集剤 、有機ポリ電解質のような複数の試薬を使用しなければならず、発酵培養液のフ ロック化、沈降あるいはろ過は比較的長時間の生成時間を要し、そのことは所望 の生成物の純度に影響を与えるという欠点を有する。 ２頁、第２欄、２２〜２５行において、発酵培養液の精製のいくつかの可能性 について述べられているが、その方法はクラブラン酸の生成量の重大な減少を伴 うものである。さらに分離及び精製の方法において、例えば限外ろ過及び逆浸透 のような複数の複雑な技術を使用することは、これらの方法を使用することが活 性炭あるいはイオン樹脂による前ろ過を必要とするので、方法を簡略化するもの ではないと言える。 これらの記述に対して、本発明に従って、菌糸体、蛋白の大部分（培養液中に 存在する量の少なくとも８０％）及び他の懸濁した粒子が取り除かれる精密ろ過 が使用された場合、文献に開示されているような水性発酵培養液の精製の他の時 間のかかる方法と共にヨーロッパ特許出願公開第０３８５５５２号に開示された 方法において使用されるような複数の試薬の使用を避けることを可能にするとい うことが見いだされた。 この目的において連続的な精密ろ過のための多段階装置が使用され、３０分以 下の滞留時間において菌糸体及び水性ろ液を分離する方法を実施可能にする。こ の装置は複数の（５つの）一連に連結された個々のセグメント（ろ過ループ）か ら構成されている。各々のセグメントは孔径５μｍであるセラミックろ過エレメ ントのチャネルを通過する発酵培養液の所望の通過速度（５〜８ｍ／ｓ）を許容 する循環ポンプをそれぞれ有している。約２０〜４０℃の温度（温度は４０℃を 越えてはならない）にて行われる精密ろ過方法において、接線方向（tangention al）の速度がそのような方法にて調整されるので、固体のフラクション中に３０ ，０００以上の分子量の分子が保持される。この方法において、存在する蛋白の 約 ８０〜９０％を除去することに成功した。精密ろ過において分離された菌糸体は また、得られたろ液中におけるクラブラン酸の生成量を増大させるために水にて 洗浄された。精密ろ過によって水性の発酵培養液を精製する開示された方法によ って、クラブラン酸の９５％以上が精製された水相に留まり、それはヨーロッパ 特許出願公開第０３８５５５２号のフロック化法の結果を上回るものであり、本 発明の更なる改良を示すものである。 精密ろ過の後、ろ液は選択的に限外ろ過方法によって精製される。この精製の 目的は、残存する蛋白不純物の大部分及びクラブラン酸より大きい分子量を有す る他の付随する不純物を分離することにある。この方法において、不必要な不純 物は有効に取り除かれ、これは水不溶性の有機溶媒との抽出において沈澱し、こ れによって精密ろ過による精製後に得られた水性のろ液の着色が本質的に低減さ れ、所望の生成物の純度が更に高められる。 限外ろ過装置においては約２０，０００ダルトン（１０，０００〜３０，００ ０ダルトンの間）の高い分離度を有する高分子膜が使用される。この方法は連続 的に行われ、滞留時間をできるだけ短くすることができ、限外ろ過装置が２つ以 上連続的に連結され（それにより不純物及びクラブラン酸の分離選択性を増大さ せる）、限外ろ過方法において得られた保持物（水相）を流す向流とともに純粋 な洗浄水を加えることによって、水相中におけるクラブラン酸の損失は５％以下 に抑えられる。 得られた水性のろ液は、ほぼ室温において逆浸透装置において最初の量の約１ ／５にまで濃縮され、不純物を含んだクラブラン酸の濃縮された水相が得られ、 得られた濃縮物（保持物）は、硫酸のような無機酸を加えることによって媒体の ｐＨが１〜３に調整された酸性媒体中においてたとえば酢酸エチルのような水不 溶性の有機溶媒を用いて１５〜２５℃の温度にて直接抽出される（抽出は１５℃ 以下の温度にても行うことが可能である）。酢酸エチルの他に、例えば酢酸メチ ル、メチルイソブチルケトンあるいはｎ−ブチルアルコールのような他の水不溶 性有機溶媒が使用され得る。 精密ろ過方法によって菌糸体及び存在する蛋白の大部分を除去することに成功 したことから、上述の文献によって開示された周知の方法において適用されてい るような時間のかかる精製方法を使用することなしに、酢酸エチルのような適切 な水不溶性有機溶媒を用いて精製され濃縮された水性の発酵培養液の直接抽出が 可能になり、発酵培養液を精製するための凝集−フロック化法において適用され るような余分な試薬を使用することを回避できた。従って、上述の改良に加え、 本発明における方法はまた、発酵培養液精製法の費用の低減をも提供している。 不純物を含んだクラブラン酸を水相から有機相に抽出する工程において、有機溶 媒あるいは硫酸との相互作用によって水相濃縮物中に残存する蛋白の変性を避け るために、一連の遠心抽出機において抽出されるのが最適であり、それらの抽出 機の１つ、すなわちセルフエンプティング（self-emptying）遠心分離機におい て、分離された蛋白が同時にかつ連続的に除去される。 得られた水不溶性有機溶媒中における不純物を含んだクラブラン酸の抽出物中 に、クラブラン酸単独より極性の高いクラブラン酸の種々の分解生成物のような 水溶性の不純物が更に存在しており、この水溶性の不純物は得られた有機相を水 で洗浄することによって除去される。この方法において、酢酸エチル抽出物のよ うな有機相におけるクラブラン酸の精製された抽出物が得られる。 クラブラン酸は有機相から分離され、ヨーロッパ特許出願公開第０５６２５８ ３号の方法における開示に従って精製される。本特許出願において記載されたク ラブラン酸を分離する最適な方法はほぼ室温において、クラブラン酸の酢酸エチ ル抽出物とＮ，Ｎ’−ジイソプロピルエチレンジアミンとの反応によって達成さ れ、引き続いて、水性イソプロパノール溶液中において得られた中間体であるＮ ，Ｎ’−ジイソプロピルエチレンジアンモニウムジタラブラネートのカリウム− ２−エチルヘキサノエートとの転換によって室温にてクラブラン酸カリウムが得 られ、高純度にて分離される。 中間体であるＮ，Ｎ’−ジイソプロピルエチレンジアンモニウムジクラブラネ ートの調製は、クラブラン酸の酢酸エチル抽出物のような水不溶性の有機相とＮ ， Ｎ’−ジイソプロピルエチレンジアミンとの反応において、水が完全に除去され た有機相が使用される方法において最適に行われることが明らかになった。その 理由としてはすでに存在する少量の水が中間体塩の調製の障害となるからであり 、すなわち、有機相中に存在する水に分離された塩が溶解しピッチ様の副産物が 得られ、それが乾燥を困難にするのである。 水が完全に有機相から除去された場合、有機相あるいは抽出物の安定性は増大 し、なぜならば抽出方法において水溶液中及び酸性ｐＨ溶媒中におけるクラブラ ン酸の安定性は非常に乏しいことが周知だからである。従ってクラブラン酸の酢 酸エチル抽出物のような有機相の乾燥は、高温における中間体塩の安定性が乏し いので、真空中にて精留カラム（分留の原理）における乾燥が使用される。酢酸 エチルのような有機相と水が最少の沸点を有する共沸混合物を形成し、従って酢 酸エチル抽出物のような有機相が開示された方法にて完全に乾燥されるのがこの 方法の本質的な特徴である。すなわち、酢酸エチル抽出物のような有機相は常に ０．１容量％末満の水分、平均的には０．０３〜０．０５容量％の水分を含んで いる。クラブラン酸の酢酸エチル抽出物のような完全に無水の有機相は、非常に 短い滞留時間内で、蒸発によって初めの量の１／２０まで濃縮され、その後Ｎ， Ｎ’−ジイソプロピルエチレンジアミンと反応させる。 引き続いて行われるＮ，Ｎ’−ジイソプロピルエチレンジアンモニウムジクラ ブラネートとカリウム−２−エチルヘキサノエートとの反応によって、ヨーロッ パ特許出願公開第０５６２５８３号において開示されたような高純度のクラブラ ン酸カリウムが得られ、例において開示されかつ上述の改良によって述べられた 方法にて最適に達成される。 本発明は以下に示す例によって述べられるがそれのみに限定されるものではな い。 例１ 不純物を含んだクラブラン酸の酢酸エチル抽出物の濃縮物の連続的な調製 ストレプトミヤス ｓｐ．Ｐ ６６２１ ＦＥＲＭ Ｐ ２８０４菌の発酵によっ て得られた水性発酵培養液（１０，０００リットル）が、媒体のｐＨ値が５．８ 〜６．２の間に維持されるよう撹拌及び冷却しながら容器（容量５０ｍ³）中の ３３％硫酸水溶液（５リットル）中に加えられた。その後、培養液は１２００リ ットル／ｈの流速にて精密ろ過装置に加えられた。該ろ過装置は５つの連続する 連結セグメントから構成されている。各々のセグメントは、孔径０．０５μｍの セラミックろ過エレメントのチャネルを通過する発酵培養液の通過速度が８ｍ／ ｓとなるように設定された循環ポンプをそれぞれ備えている。温度が４０℃を越 えないように注意された精密ろ過方法によって、菌糸体、蛋白の大部分及びその 他懸濁した固体粒子が除去された。 分離された固体は、流速３００リットル／ｈの水で洗浄され、精密ろ過にて得 られたろ液（透過物）は流速１５００リットル／ｈにて連続的に逆浸透装置に加 えられ、この装置において透過物は最初の量の１／５まで濃縮された。 流速３００リットル／ｈにて逆浸透をした後に得られた濃縮物（保持物）に、 媒体のｐＨ値が１．５〜２．０の間に維持されるように３３％硫酸水溶液が加え られ（４リットル／ｈ）、室温条件下、一連の５つの遠心抽出機において向流に て酸性の保持物を抽出するために９００リットル／ｈの流速にて酢酸エチルが加 えらた。この抽出機における第２のセルフエンプティング（self-emptying）遠 心分離機において残存する蛋白が同時に除去された。 一連の遠心抽出機から得られた酢酸エチル抽出物は流速３０リットル／ｈの脱 イオン水にて第１の遠心抽出機において洗浄され、残存する水溶性の不純物が除 去された。 ９００リットル／ｈの流速を有する酢酸エチル抽出物は、真空条件下、３０℃ の温度にて精留カラム中にて乾燥され、０．０３容量％の水分量が達成され、そ の後抽出物は、真空条件下３０℃の温度にて薄層エバポレータにおいて最初の量 の１／２０まで濃縮された。４５リットル／ｈの流速を有する得られた濃縮され た酢酸エチル抽出物（不純物を含んだクラブラン酸の濃度は５０ｇ／リットル） は活性炭（０．４５ｋｇ）を加えることによって脱色され、混合物を３０分撹拌 した後、活性炭が酢酸エチル抽出物の濃縮物の懸濁液から１バールの窒素圧にて 圧力フィルタにてろ去され、不純物を含んだクラブラン酸を含む酢酸エチル抽出 物の乾燥濃縮物（４５リットル）を得た。 例２ Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルエチレンジアンモニウムジクラブラネートの調製 例１の連続的な方法において得られた酢酸エチル抽出物の乾燥濃縮物（４５リ ットル）（クラブラン酸含量は５０ｇ／リットルである）中に、２５℃の温度に て５分間強く撹拌しながら、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルエチレンジアミン（１. ４リットル）が加えられた。得られた懸濁液はろ過されて取り除かれ、得られた 結晶は再びアセトン（４５リットル）中に懸濁され、１０℃以下の温度にて懸濁 液を撹拌及び冷却しながら、所望の物質の結晶を分離し、結晶はろ去され、アセ トンにて洗浄され、真空条件下、３０℃の温度にて乾燥された。Ｎ，Ｎ’−ジイ ソプロビルエチレンジアンモニウムジクラブラネート（３．３ｋｇ、クラブラン 酸の含量６０％）の結晶が得られた。 例３ クラブラン酸カリウムの調製 例２から得られたＮ，Ｎ’−ジイソプロピルエチレンジアンモニウムジクラブ ラネート（３．３ｋｇ）がイソプロパノール／水混合液（８２．５リットル，水 が１．５％）中に溶解され、得られた溶液に活性炭（１．５ｋｇ）及びカリウム −２−エチルヘキサノエート（０．５リットル，２Ｍ）が室温にて３０分間撹拌 しながら加えられた。その後、活性炭及び得られた沈澱がろ去された。得られた ろ液にカリウム−２−エチルヘキサノエート（２Ｍ）のイソプロパノール溶液（ ６リットル）が室温にて２０分間撹拌しながら加えられた。得られた懸濁液は０ 〜５℃の温度にて冷却しながら更に２時間撹拌され、分離された結晶をろ去し、 イソプロパノール及びアセトンにて洗浄され、真空条件下、３０℃の温度にて乾 燥された。クラブラン酸カリウム（２ｋｇ，ＵＳＰグレード、ＨＰＬＣ法にて決 定されたクラブラン酸含量８０．６％）が得られた。

【手続補正書】 【提出日】１９９６年８月３０日 【補正内容】 （１）明細書の請求の範囲の欄を別紙のとおり補正する。 「請求の範囲 １．水性発酵培養液からクラブラン酸を分離する方法であって、菌糸体、蛋白 の大部分及び他の懸濁した固体粒子が精密ろ過によって除去される方法。 ２．請求項１に記載の方法において、前記固体粒子が孔径０．０５μｍを有す るフィルターエレメントを介した連続的な精密ろ過によって除去される方法。 ３．請求項１又は２に記載の方法において、水性発酵培養液のろ過が精密ろ過 工程及びそれに続く限外ろ過工程を含む方法。 ４．請求項３に記載の方法において、限外ろ過が１０，０００〜３０，０００ ダルトンの分離度を有する半透膜を用いて連続的に行われる方法。 ５．請求項３又は４に記載の方法において、水不溶性溶媒にて抽出する前に逆 浸透によって水を除去する工程を含む方法。 」

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ， ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＫ，Ｔ Ｊ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ストレプトミヤス ｓｐ．Ｐ６６２１ ＦＥＲＭ Ｐ ２８０４の水性発酵培 養液からクラブラン酸及び薬剤学的に適用可能な塩を分離する方法において、 発酵培養液から菌糸体、蛋白の大部分及び他の懸濁した固体粒子が約２０〜４ ０℃の温度において、媒体のｐＨ値５．８〜６．２にて、精密ろ過によって除去 され、 精製された培養液（水相）は限外ろ過にて任意かつ付随的に精製され、 そのように精製された培養液は逆浸透にて濃縮され、 媒体のｐＨを１〜３として、水不溶性の有機溶媒を用いて一連の遠心抽出機に おいて向流にて直接抽出され、この抽出機において残留する分離された蛋白が同 時に除去され、 有機相は水にて洗浄され、 真空条件下、精留カラムにて水分量が０．１容量％以下にまで乾燥され、その 後蒸発によって濃縮され、かつ活性炭との処理によって脱色され、 完全に乾燥した有機相に存在するクラブラン酸がほぼ室温においてＮ，Ｎ’− ジイソプロピルエチレンジアミンとの反応によって分離精製され、得られたＮ， Ｎ’−ジイソプロピルエチレンジアンモニウムジクラブラネートは分離され、カ リウム−２−エチルヘキサノエートのイソプロパノール溶液との反応によって高 純度を有するクラブラン酸カリウム塩が得られる方法。 ２．請求項１に記載の方法において、媒体のｐＨ値が硫酸にて調整されることを 特徴とする方法。 ３．請求項１に記載の方法において、直接抽出における水不溶性有機溶媒として 酢酸エチルが使用されることを特徴とする方法。 ４．請求項１に記載の方法において、精製された水性発酵培養液の直接向流抽出 が１５〜２５℃の温度にて酢酸エチルを用いて行われることを特徴とする方法。 ５．請求項１に記載の方法において、有機相の乾燥時における水分量が０．０３ 〜０．０５容量％であることを特徴とする方法。