CN101875660A - 从头孢菌素c发酵液中分离纯化脱乙酰头孢菌素c的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种从头孢菌素C发酵液中分离纯化脱乙酰头孢菌素C的方法，所述方法包括：发酵结束后，采用常规的固液分离手段分离发酵液，收集滤液，该滤液1)先经过大孔苯乙烯型非极性吸附树脂，2)再经过凝胶型强碱II型阴离子交换树脂。使用本发明方法分离纯化后的DCPC的纯度可达92％左右。

Description

从头孢菌素C发酵液中分离纯化脱乙酰头孢菌素C的方法

技术领域

本发明涉及一种脱乙酰头孢菌素C(简称DCPC或DAC)的分离纯化方法，具体地说是一种通过吸附法和离子交换法从工业化发酵生产头孢菌素C(Cephalosporin C，简称CPC)的发酵液中分离纯化DCPC的方法。

背景技术

CPC是一种重要的发酵产品，以其钠盐为原料或底物，通过化学法或酶法制备得到的7-氨基头孢霉烷酸(简称7-ACA)是制备许多半合成头孢类抗生素的重要中间体，这些抗生素包括头孢唑林、头孢噻肟、头孢曲松、头孢他啶等，半合成头孢类抗生素的销售额约占全球抗感染抗生素药物销售额的40％。

DCPC是CPC的3位脱乙酰基产物。在CPC的发酵生产过程中不可避免地会在发酵液中存在一定比例的DCPC(4～16％)，这是由菌种的本身特性即CPC的生物合成途径所决定的，并且对于同一个菌种来说该比例的波动还与发酵参数如温度、pH、培养基配方等的控制值密切相关。作为一个发酵过程中的代谢副产物，在目前CPC生产的提取工艺中DCPC往往被当作废弃物而直接排放至三废处理中心。这在一定程度上是资源的浪费，另外随着新型头孢类抗生素的开发，DCPC或由其制备的中间体也可以作为半合成头孢类抗生素的关键中间体，如头孢克肟和头孢呋辛的合成即分别以DCPC和7-DACA(3-脱乙酰基-7-氨基头孢烷酸)作为原料(张诗海等.精细与专用化学品，2003，12：10-13.，Nomura H et al.J Med Chem，1974，17(12)：1312.)。因此，在新的母核结构开发受到日益重视的今天，DCPC已具有极大的实际应用价值。

DCPC的纯化方法据文献报道，主要有离子交换和活性炭吸附两种方法。USP3926729公开的方法是使用大孔强碱I型阴离子交换树脂如IRA900等吸附DCPC，不但交换量低，仅为4-6mg/ml，而且无法对CPC和DCPC进行有效的分离。JP55040615和于海军，陈立功等报道了利用活性炭吸附分离DCPC的方法。化工学报，2006，57(2)：331-335中公开的方法是通过活性炭吸附并用有机溶剂洗脱，但这种方法存在以下缺点：(1)吸附过程中存在不可逆吸附，有部分DCPC无法被洗脱，使收率降低；(2)用有机溶剂作为洗脱剂增加了提取成本。因此，现有技术中关于DCPC的纯化方法均不利于在工业化生产中的推广应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题即提供一种高效率低成本的从CPC发酵液中分离纯化DCPC的方法，所述方法包括：发酵结束后，采用常规的固液分离手段分离发酵液，收集滤液，该滤液1)先经过大孔苯乙烯型非极性吸附树脂，2)再经过凝胶型强碱II型阴离子交换树脂。

当发酵过程控制不当时，会造成发酵液过滤速度降低，在此情况下，为增加过滤速度并改善滤液的澄清度，可根据发酵液性质，在有必要时往发酵液中添加少量的絮凝剂并将所述发酵液升温至50～65℃(优选升温至55℃)，所述絮凝剂选自黄血盐和硫酸锌组成的协同絮凝剂、聚丙烯酰胺、聚乙烯亚胺或聚氯化铝，优选聚丙烯酰胺型絮凝剂。一般情况下，添加絮凝剂和升温是同时进行的。

所述滤液经过大孔苯乙烯型非极性吸附树脂时，CPC被吸附；再经过凝胶型强碱II型阴离子交换树脂时，DCPC被吸附。

所述发酵液的pH优选为调整3.5到5.0。

所述的大孔苯乙烯型非极性吸附树脂包括HP-20、SIPI1300、XAD18、XAD16和XAD1600等。

所述的凝胶型强碱II型阴离子交换树脂包括201×4、202和IRA410等。

为了有效地增加交换量，提高收率及产品质量，优选地在用凝胶型强碱II型阴离子交换树脂吸附DCPC之前，用纳滤设备脱盐浓缩经由大孔苯乙烯型非极性吸附树脂的流出液。所述纳滤设备优选为纳滤膜。所述纳滤膜的截流分子量优选为200道尔顿。

优选地，在用大孔苯乙烯型非极性吸附树脂吸附CPC时，滤液的流速为0.5到2.0BV。

根据本发明方法，在步骤2)液体经过凝胶型强碱II型阴离子交换树脂，DCPC被吸附之后，可进一步采用解析步骤，得解析液，浓缩该解析液，加入丙酮，搅拌结晶后过滤得到脱乙酰头孢菌素C晶体。

本发明的具体工艺流程为：

①发酵结束后，将发酵液pH调至3.5到5.0，同时可根据发酵液性质在有必要时可添加少量的絮凝剂或升温至55℃，以增加过滤速度和期望改善滤液的澄清度。采用常规的固液分离手段，收集滤液。滤液经过大孔苯乙烯型非极性吸附树脂吸附后，CPC被吸附，而DCPC则随流出液流出，两者得以分离。含DCPC的流出液优选经过纳滤设备部分地除盐浓缩后，再流入强碱II型阴离子交换树脂，DCPC被吸附，交换量可达18mg/ml，弃去流出废液；然后用0.1-0.5mol/L乙酸钠解析。

②解析后，可使用常规技术如减压浓缩或纳滤技术等对解析液进行浓缩。浓缩液效价达到16000u/ml以上后，加入3～5V体积的丙酮，4℃缓慢搅拌，4-8h后即有DCPC白色结晶析出。

③分离晶体，用常规干燥技术如真空干燥对DCPC晶体进行干燥，即可得到DCPC产品，纯度可达92％左右。

根据本发明方法可有效地将DCPC从CPC发酵滤液中分离出来，凝胶型强碱II型阴离子交换树脂的交换量可达18mg/ml，纯化后的DCPC纯度可达到92％左右，为从CPC的工业发酵液中提取DCPC提供了一种高效率低成本的方法。

具体实施方式

在本实施方式中，CPC发酵液的获得按如下方式进行。

菌种：顶头孢霉菌(Cephalosporium acremonium)SIPI-C18221。

将经过生产能力验证、生长良好的顶头孢霉菌种SIPI-C18221，以脱脂牛奶作为保护剂，用真空冷冻干燥法的方式保存。使用时将菌种转接到斜面培养基中，28℃培养14天，然后分离纯化一次，将合格菌种转接到斜面培养基中，28℃培养8天，8℃环境下保存不多于20天，其间随时可作为发酵种子培养的供种。发酵种子培养条件28℃，摇瓶培养时间3天，种子罐的培养时间随种子罐的大小而变，一般在28h到50h之间，以种子质量为最终控制标准。发酵摇瓶在25℃培养6天，发酵罐的控制条件是40h之前28℃培养，40h之后25℃培养，其他控制参数如总糖、氨基氮、pH、溶氧、搅拌转速、通气量等按工艺要求进行控制，当发酵液中CPC的效价不再有明显的上升趋势、其他发酵参数表现为发酵已接近终结阶段时就可以放罐，一般发酵时间为130h左右。

以上工作中斜面培养基配方(g/L)：麦芽汁28(按麦芽糖浓度折算)、麦芽糖28、蛋白胨12、琼脂20、pH自然。种子培养基配方(g/L)：y玉米浆60、蛋白胨0.5、蔗糖30、葡萄糖1、蛋氨酸0.3、醋酸铵5、碳酸钙5、pH6.8。发酵培养基配方(g/L)：玉米浆120、糊精30、淀粉60、淀粉酶0.5、蛋氨酸5、豆油20、硫酸铵10、硫酸镁3、磷酸二氢钾7、碳酸钙8、pH6.5。在发酵罐的发酵中通过补料氨水、硫酸铵和豆油维持发酵液中的糖量和氮量在发酵工艺控制的要求范围内。工艺控制参数为糖始终控制在1.0％以上，氨基氮始终控制在120mg/100ml以上，氨氮始终控制在60mg/100ml以上。

实施例1

CPC发酵液500ml，调pH至3.8。离心得发酵滤液，其中CPC和DCPC的浓度分别为9.25mg/ml和1.51mg/ml。滤液过SIPI1300树脂250ml，用400ml水洗柱，流速1.0BV(250ml/h)。重复以上过程一次，合并收集流出液得620ml，流出液中CPC浓度和DCPC浓度分别为0.02mg/ml和0.85mg/ml。流出液过201×4阴离子交换树脂90ml(交换容量约6.0mg/ml树脂)，150ml水洗柱后，用0.5mol/L的乙酸钠解析，得200ml解析液，真空减压浓缩至25ml，加入75ml丙酮，4℃缓慢搅拌3h，静止2h，过滤得DCPC晶体，真空干燥后得到DCPC固体381mg，纯度91.3％。

实施例2

CPC发酵液3.22L，调pH至3.5。离心得发酵滤液，其中CPC和DCPC的浓度分别为10.61mg/ml和2.11mg/ml。滤液过XAD16树脂1.5L，用2.0L水洗柱，流速1.2BV(1.8L/h)。重复以上过程一次，合并收集流出液得3.95L，流出液中CPC浓度和DCPC浓度分别为0.02mg/ml和1.11mg/ml。流出液过0.6L阴离子交换树脂202(交换容量约7.1mg/ml树脂)，1.0L水洗柱后，用0.3mol/L的乙酸钠解析，得2.0L解析液，纳滤(截流分子量200道尔顿)浓缩至200ml，加入0.7L丙酮，10℃缓慢搅拌4h，静止2h后过滤，真空干燥后得到DCPC晶体3.55g，纯度92.3％。

实施例3

CPC发酵液4.86L，调pH至5.0。离心得发酵滤液，其中CPC和DCPC的浓度分别为6.38mg/ml和4.62mg/ml(本批是非正常发酵的结果，发酵后期故意调高发酵液的pH，以获得含较高效价DCPC的发酵液)。滤液过XAD 18树脂1.25L，用2.0L水洗柱，流速1.5BV(1.88L/h)。重复以上过程一次，合并收集流出液得5.20L，流出液中CPC浓度和DCPC浓度分别为0.02mg/ml和2.89mg/ml。流出液使用纳滤设备进行脱盐浓缩，纳滤膜的截流分子量为200道尔顿。收集浓缩液，过IRA410树脂0.9L(交换容量16.5mg/ml树脂)，2.0L水洗柱后，用0.3mol/L的乙酸钠解析，得到解析液6.85L，纳滤浓缩至0.80L，加入3.2L丙酮，8℃缓慢搅拌4h，静止2h后过滤，得到DCPC晶体。真空干燥后得到DCPC固体12.18g，纯度92.8％。

实施例4

CPC发酵液4.5L，调pH至3.5。离心得发酵滤液，其中CPC和DCPC的浓度分别为12.65mg/ml和2.51mg/ml。滤液过XAD1600树脂2.2L，用3.0L水洗柱，流速2.0BV(3.6L/h)。重复以上过程一次，合并收集流出液得6.0L，流出液中DCPC浓度为1.16mg/ml，CPC则未检出。流出液使用纳滤设备进行脱盐浓缩，纳滤膜的截流分子量为200道尔顿。收集浓缩液，过IRA410树脂0.4L(交换容量17.2mg/ml树脂)，0.8L水洗柱后，用0.2mol/L的乙酸钠解析，得解析液4.5L，纳滤(截流分子量200道尔顿)浓缩约12倍后，加入1.75L丙酮，8℃缓慢搅拌4h，静止2h后过滤，得到DCPC晶体。真空干燥后得到DCPC固体6.28g，纯度91.8％。

实施例5

如果发酵过程控制不当，在此情况下，视发酵液的性状选择添加聚丙烯酰胺絮凝剂适量，然后尽可能快的升温至55℃左右，边升温边搅拌。当发酵液滤速达到5分钟12mL以上时，即可边用自来水降温边过滤。由此获得CPC发酵滤液5.8L，然后再调pH至3.6，离心得到澄清的发酵滤液5.75L，其中CPC和DCPC的浓度分别为8.78mg/ml和3.33mg/ml。滤液过XAD1600树脂3.0L，用4.3L水洗柱，流速1.75BV(5.25L/h)。重复以上过程一次，合并收集流出液得9.8L，流出液中DCPC浓度为1.71mg/ml，CPC极微量。流出液通过IRA410树脂1.0L(交换容量16.68mg/ml树脂)，用2.5L水洗柱，然后用0.25mol/L的乙酸钠解析，得解析液9.3L，纳滤(截流分子量200道尔顿)浓缩约9.8倍后，加入4.2L丙酮，8℃缓慢搅拌4h，静止2h后过滤，得到DCPC湿晶体。真空干燥后得到DCPC固体18.08g，纯度91.5％。

Claims (13)

1.从头孢菌素C发酵液中分离纯化脱乙酰头孢菌素C的方法，所述方法包括：发酵结束后，采用常规的固液分离手段分离发酵液，收集滤液，该滤液1)先经过大孔苯乙烯型非极性吸附树脂，2)再经过凝胶型强碱II型阴离子交换树脂。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵液中添加少量的絮凝剂并将发酵液升温至50～65℃。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述絮凝剂选自黄血盐和硫酸锌组成的协同絮凝剂、聚丙烯酰胺、聚乙烯亚胺或聚氯化铝。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述絮凝剂为聚丙烯酰胺。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将所述发酵液升温至55℃。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵液的pH调整为3.5到5.0。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的大孔苯乙烯型非极性吸附树脂为HP-20、SIPI1300、XAD18、XAD16或XAD1600。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的凝胶型强碱II型阴离子交换树脂为201×4、202或IRA410。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤2)之前，用纳滤设备脱盐浓缩经由大孔苯乙烯型非极性吸附树脂的流出液。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述纳滤设备为纳滤膜。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述纳滤膜的截流分子量为200道尔顿。

12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤2)之后解析，得解析液，浓缩该解析液，加入丙酮，搅拌结晶后过滤得到脱乙酰头孢菌素C晶体。

13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤1)中，滤液的流速为0.5到2.0BV。