CN110372606A - 一种从微生物发酵液中分离纯化胞嘧啶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生化分离技术领域，本发明公开了一种从微生物发酵液中分离纯化胞嘧啶的方法，包括如下步骤：（1）发酵液的预处理：胞嘧啶发酵液加热后经固液分离、超滤连续式处理得到预处理液；（2）胞嘧啶的粗提：将预处理液浓缩、结晶、过滤得到胞嘧啶粗品；（3）胞嘧啶的精制：胞嘧啶粗品用去离子水加热复溶、加入EDTA和活性炭、脱色、过滤、结晶、过滤、去离子水淋洗晶体、真空干燥得到含量98.5%以上的胞嘧啶成品。

Description

一种从微生物发酵液中分离纯化胞嘧啶的方法
技术领域
本发明属于生物化学分离技术领域，具体地，涉及一种从微生物发酵液中分离纯化胞嘧啶的方法。
背景技术
胞嘧啶（图1）是组成DNA的四种基本碱基之一。 胞嘧啶是精细化工、农药和医药的重要中间体，特别在医药领域，主要用于合成抗艾滋病药物及抗乙肝药物拉米夫定，抗癌药物吉西他宾、依诺他宾以及5-氟胞嘧啶等，应用非常广泛。
目前国内外，关于胞嘧啶的生产，主要是采用化学合成法，关于胞嘧啶生物合成法（酶法合成法、微生物发酵合成法）的报道极少。随着环境压力增大，环保形势严峻，化学合成法的弊端逐渐显露出来，发酵法生产胞嘧啶的优势越发明显。
苏州华赛生物工程技术有限公司，通过基因工程手段改造大肠杆菌，获得以葡萄糖或甘油为碳源合成胞嘧啶的菌株，通过增殖，诱导，产物浓度中控等发酵、反应得到含胞嘧啶发酵液（专利申请号：2019106022312）。微生物发酵胞嘧啶，存在着大量的菌体与色素，以及没有被转化完的葡萄糖或甘油、无机盐等，乳清酸、乳清苷、胞苷、尿苷、尿嘧啶等已知副产物和其他未知副产物，另外还有细胞自溶产生的杂质，包括蛋白和核酸等化合物，分离难度较大。
并且，现有技术中没有对生物发酵液中胞嘧啶的分离和纯化的方法，因此，需要研发一种高效率，高纯度且操作简便，环境友好的胞嘧啶纯化技术。
本发明开发了一种微生物发酵法生产胞嘧啶的分离纯化技术，为生物制造胞嘧啶提供了基础支持。
发明内容
发明目的：为了解决现有技术的不足，本发明旨在提供一种从大肠杆菌发酵液中分离纯化胞嘧啶的方法。此方法经过系统除杂，提取所得的胞嘧啶粗品性状良好，只需进行一次重结晶就能得到合格的胞嘧啶产品，避免了多次重结晶精制。
技术方案：本发明提供了一种从微生物发酵液中分离纯化胞嘧啶的方法，包括以下步骤：
（1）发酵液的预处理：胞嘧啶发酵液加热后经固液分离、超滤膜超滤连续式处理得到预处理液；
（2）胞嘧啶的粗提：将预处理液浓缩、结晶、过滤得到胞嘧啶粗品；
（3）胞嘧啶的精制：胞嘧啶粗品用去离子水加热复溶，加入EDTA和活性炭，经脱色、过滤、结晶、过滤、去离子水淋洗晶体、真空干燥得到含量98.5%以上的胞嘧啶成品。
本发明所述的从微生物发酵液中分离纯化胞嘧啶的方法，方法合理，不仅成功解决了生物发酵液中杂质多、分离难的问题，还具备步骤少、成本低、品质好、收率高、绿色环保等优点。
进一步的，上述的从微生物发酵液中分离纯化胞嘧啶的方法，所述微生物包括大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌、产氨短杆菌、谷氨酸棒状杆菌，该方法适用性好，可以用于多种微生物的纯化。
作为本发明的一种优选方式，其中提及的胞嘧啶发酵液来源于苏州华赛生物工程技术有限公司专利（专利申请号：2019106022312）菌株发酵所得，其分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli.），菌株已于2019年05月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为CGMCC No. 17729，CGMCC No. 17730。值得特别指出的是，本发明中的胞嘧啶优选来源于特定大肠杆菌发酵所得发酵液，同样也能适用于其他生物发酵获得的发酵液中胞嘧啶的分离纯化。
进一步的，上述的从微生物发酵液中分离纯化胞嘧啶的方法，所述发酵液加热温度为50℃以上，达到温度后维持30分钟以上。步骤（1）采用加热，微滤与超滤相结合的方式，除去菌体固渣、大部分色素与蛋白，得到了性状良好的预处理液。
进一步的，上述的从微生物发酵液中分离纯化胞嘧啶的方法，所述步骤（1）中固液分离所用滤膜为陶瓷膜、氧化铝膜或者PVC膜，其过滤精度为0.05μm-1.4μm；所述超滤膜为卷式膜，所述卷式膜包括聚醚砜膜、醋酸纤维素膜、聚偏氟乙烯膜、聚酰胺膜，过滤精度为800-10000道尔顿。其中，微滤能去除所有菌体和悬浮杂质，陶瓷膜作为优选，孔径为0.05-1.4μm，其中，0.2μm作为优选孔径。
进一步的，上述的从微生物发酵液中分离纯化胞嘧啶的方法，超滤膜优选聚醚砜，孔径为800-10000道尔顿，1000-3000道尔顿作为优选。通过上述预处理可将发酵液中大分子蛋白质、大分子色素等进行去除。
进一步的，上述的从微生物发酵液中分离纯化胞嘧啶的方法，通过粗制结晶可以除去大部分可溶性杂质与盐类，达到初步纯化胞嘧啶的目的。
进一步的，上述的从微生物发酵液中分离纯化胞嘧啶的方法，所述步骤（3）中复溶时胞嘧啶粗品与去离子水的投料质量比为1:20-50，优选的是1:25。
进一步的，上述的从微生物发酵液中分离纯化胞嘧啶的方法，所述步骤（3）中脱色活性炭用量为胞嘧啶粗品质量的1-20%，优选的是3-8%，脱色温度为60℃以上，维持时间30分钟以上。优选的是90℃，维持60分钟。
进一步的，上述的从微生物发酵液中分离纯化胞嘧啶的方法，所述步骤（3）中EDTA的用量为胞嘧啶粗品质量的1-5%，优选的是1-2%。
进一步的，上述的从微生物发酵液中分离纯化胞嘧啶的方法，所述步骤（2）、（3）中结晶条件：温度为4-25℃，结晶时调节pH7.0-8.0，结晶2小时以上。优选的是4℃，pH7.5。
进一步的，上述的从微生物发酵液中分离纯化胞嘧啶的方法，所述步骤（3）中去离子水淋洗晶体，至流出液电导率小于1ms/cm为止；真空干燥温度为30℃以上。
进一步的，通过步骤（3）加入活性炭脱色可脱除残留色素与小分子杂质，加入EDTA可去除金属离子和酸性有机分子杂质，通过重结晶可除去其他杂质，从而得到HPLC纯度99.9%以上，单杂小于0.1%，含量98.5%以上的胞嘧啶成品。
有益效果：本发明具有以下优点：
1）由于国内外发酵法生产胞嘧啶未见报道，其后续纯化手段缺失。本发明填补了此空白，具有独创性与先导性。
2）本发明充分利用膜分离的前沿技术来预处理发酵液，依靠连续膜分离来预处理发酵液，均可套用至下一批，减低了产品损失率，提高了分离效率和产物收率。
3）本发明不用传统的离子交换工序，避免了大量氨氮废水、高盐废水的产生，而且只使用了少量活性炭脱色，整个工艺产生固废很少，符合环保理念。
4）本发明运用EDTA可去除金属离子和酸性有机分子等杂质，可以在用水量较少的情况下使胞嘧啶纯度和含量大大提高，由于水资源越来越宝贵，通过本发明所述技术方案，在得到合格胞嘧啶的同时，还大大节约了水资源。
5）本发明只需一次精制就能拿到合格的胞嘧啶。总收率在88%以上，收率高。
附图说明
附图1：胞嘧啶的结构示意图；
附图2：胞嘧啶检测谱图。
具体实施方式
下面将通过几个具体实施例，进一步阐明本发明，这些实施例只是为了说明问题，并不是一种限制。
实施例1
采用苏州华赛生物工程技术有限公司专利（专利申请号：2019106022312）菌株进行发酵，菌株分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli.），菌株已于2019年05月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏号为CGMCC No. 17729。50L胞嘧啶发酵结束后，用蒸汽加热至50℃，维持60分钟后放罐得36.5L胞嘧啶发酵液，其中胞嘧啶浓度为31.2g/L，共计1138.8g。发酵液过0.2μm的陶瓷膜进行微滤并收集清液，中后期补水，直至截留液中胞嘧啶浓度为1.6 g/L时，结束陶瓷膜微滤，将71L陶瓷膜清液（胞嘧啶浓度为15.7g/L）过800道尔顿的聚醚砜膜进行超滤并收集清液，中后期补水，直至截留液中胞嘧啶浓度为1.3g/L时，停止超滤，得到90.3L预处理液，其中胞嘧啶浓度为12.1g/L，总量为1092.6g。
将所得90.3L预处理液，减压蒸馏，水浴温度60℃，直至体积为5L时停止浓缩，用冷冻盐水降温，开搅拌，冷却至4℃时用NaOH调节pH7.5，继续搅拌结晶2小时，布氏漏斗抽滤得淡黄色固体，烘干后称重1099g。另得粗制母液4.5L，其中胞嘧啶浓度为19.5g/L。
1099g胞嘧啶粗品加27.5L（25倍）去离子水，加热至95℃，保证全溶，加入23g（2%）EDTA二钠和55g（5%）糖用活性炭，保温搅拌脱色45分钟后用布氏漏斗抽滤，所得脱色液用冷冻盐水降温，开搅拌，冷却至4℃时用NaOH调节pH7.5，继续搅拌结晶2小时，布氏漏斗抽滤得白色固体，少量去离子水淋洗至流出液电导率900μs/cm为止。将结晶母液与淋洗母液合并得28.7L，胞嘧啶浓度为3.9g/L，留作备用。所得固体胞嘧啶经60℃真空干燥5小时后得到胞嘧啶成品890.6g，经检测含水量为0.06%，HPLC纯度为99.91%，含量为98.7%。胞嘧啶一次合格收率为77.2%。
实施例2
采用苏州华赛生物工程技术有限公司专利（专利申请号：2019106022312）菌株进行发酵，菌株分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli.），菌株已于2019年05月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏号为CGMCC No. 17730。50L胞嘧啶发酵结束后，用蒸汽加热至80℃，维持40分钟后放罐得37.0L胞嘧啶发酵液，其中胞嘧啶浓度为29.4g/L，共计1087.8g。发酵液过0.05μm的陶瓷膜进行微滤并收集清液，中后期补水，直至截留液中胞嘧啶浓度为1.5g/L时，结束陶瓷膜微滤，将70.5L陶瓷膜清液（胞嘧啶浓度为15.1g/L）过3000道尔顿的聚醚砜膜进行超滤并收集清液，中后期补水，直至截留液中胞嘧啶浓度为1.3g/L时，停止超滤，得到91.5L预处理液，其中胞嘧啶浓度为11.4g/L，总量为1042.6g。
将所得91.5L预处理液，减压蒸馏，水浴温度60℃，直至体积为9L时停止浓缩，用冷冻盐水降温，开搅拌，冷却至10℃时用NaOH调节pH8.0，继续搅拌结晶12小时，布氏漏斗抽滤得淡黄色固体，烘干后称重980g。另得粗制母液8.3L，其中胞嘧啶浓度为17.5g/L。
980g胞嘧啶粗品加20L（20倍）去离子水，加热至90℃，保证全溶，加入10g（1%）EDTA二钠和30g（3%）药用活性炭，保温搅拌脱色60分钟后用布氏漏斗抽滤，所得脱色液用冷冻盐水降温，开搅拌，冷却至10℃时用NaOH调节pH8.0，继续搅拌结晶12小时，布氏漏斗抽滤得白色固体，少量去离子水淋洗至流出液电导率500μs/cm为止。将结晶母液与淋洗母液合并得21L，胞嘧啶浓度为4.0 g/L，留作备用。所得固体胞嘧啶经50℃真空干燥6小时后得到胞嘧啶成品822.4g，经检测含水量为0.04%，HPLC纯度为99.90%，含量为98.9%。胞嘧啶一次合格收率为74.8%。
实施例3
50L胞嘧啶发酵结束后，用蒸汽加热至100℃，维持30分钟后放罐得37.5L胞嘧啶发酵液，其中胞嘧啶浓度为30.1g/L，共计1128.8g。发酵液过1.4μm的陶瓷膜进行微滤并收集清液，中后期补水，直至截留液中胞嘧啶浓度为1.5g/L时，结束陶瓷膜微滤，将71L陶瓷膜清液（胞嘧啶浓度为15.6g/L）过10000道尔顿的聚醚砜膜进行超滤并收集清液，中后期补水，直至截留液中胞嘧啶浓度为1.3g/L时，停止超滤，得到92.0L预处理液，其中胞嘧啶浓度为11.9g/L，总量为1094.8g。
将所得92.0L预处理液，减压蒸馏，水浴温度60℃，直至体积为6.2L时停止浓缩，用冷冻盐水降温，开搅拌，冷却至4℃时用NaOH调节pH7.0，继续搅拌结晶2小时，布氏漏斗抽滤得淡黄色固体，烘干后称重1095g。另得粗制母液5.3L，其中胞嘧啶浓度为18.5g/L。
1095g胞嘧啶粗品加54L（50倍）去离子水，加热至60℃，保证全溶，加入55g（5%）EDTA二钠和220g（20%）药用活性炭，保温搅拌脱色90分钟后用布氏漏斗抽滤，所得脱色液用冷冻盐水降温，开搅拌，冷却至4℃时用NaOH调节pH7.0，继续搅拌结晶2小时，布氏漏斗抽滤得白色固体，少量去离子水淋洗至流出液电导率200μs/cm为止。将结晶母液与淋洗母液合并得34L，胞嘧啶浓度为4.9 g/L，留作备用。所得固体胞嘧啶经30℃真空干燥10小时后得到胞嘧啶成品837.6g，经检测含水量为0.06%，HPLC纯度为99.93%，含量为98.7%。胞嘧啶一次合格收率为73.2%。
实施例4 母液回收
实施例1中所得粗制母液4.5L（胞嘧啶19.5g/L）进一步减压浓缩至2L，冷冻盐水冷却至4℃，用NaOH调节pH7.5，6h后抽滤所得湿固体烘干后为56.5g（胞嘧啶含量79.0%）。二次粗制母液1.95L（胞嘧啶22.1g/L）不再回收。将56.5g回收胞嘧啶经两次精制得到36.2g胞嘧啶成品，经检测含水量为0.07%，HPLC纯度为99.90%，含量为98.5%。其精制母液不再做进一步回收。
实施例1中所得精制母液28.7L（胞嘧啶3.9g/L）进一步减压浓缩至2L，冷冻盐水冷却至4℃，用NaOH调节pH7.5，6小时后抽滤所得湿固体烘干后为107.2g（胞嘧啶含量95.3%）。其二次精制母液1.95L（胞嘧啶4.3g/L）不再回收。将107.2g回收胞嘧啶经一次精制得到95.0g胞嘧啶成品，经检测含水量为0.08%，HPLC纯度为99.92%，含量为98.6%。其精制母液不再做进一步回收。
经母液回收得131.2g胞嘧啶，含量98.5%。实施例1中总收率提高11.3%。其总收率为88.5%。
实施例5 HPLC测定胞嘧啶
实施例4获得的样品用去离子水稀释一定的倍数，离心过0.22μm的滤膜，用高效液相色谱（HPLC）检测，HPLC的参数如下：采用Waters XBridge C18 4.6*150mm 5μm，流动相为甲醇和10mM 乙酸铵(pH4.0)，初始流动相的流速为1.0 mL/min，流动相比例0.01-2.80分钟甲醇比例为2%，2.80-4.00分钟甲醇比例由2%上升到15%，4.00-4.10分钟甲醇比例由15%降至2%，0.01-4.10分钟流速从1.0 ml/min上升至1.2ml/min，4.10-8.00分钟甲醇比例为2%，利用紫外检测器检，测波长260 nm，发酵液的上样量5μL，柱温30℃。胞嘧啶出峰时间为 2.498分钟， HPLC图谱如图2所示。
实施例6 50L发酵罐生产胞嘧啶的方法
培养基为半合成培养基，每升培养基中含氯化铵20g，氯化钠10g，磷酸二氢钾4g，硫酸镁4g，甘油30g，蛋白胨10g，酵母粉10g，泡敌1g，以去离子水定容。补料培养基为每升含甘油500g。以氨水调节pH=6.9。具体发酵过程如下：（1）活化种子，从种子甘油管按接种量1%接入装100mL LB的500mL摇瓶，34℃培养16小时，OD至3~4；（2）以接种量5%接种至装有3L LB培养基的5L种子罐，37℃培养4小时，OD至1~2；（3）以接种量10%接种到装有30L半合成培养基的50L发酵罐中，37℃培养，用氨水调节pH为6.9，溶氧转速偶联，维持溶氧在30%，当溶氧高于40%时，开始偶联补料，使溶氧维持在30%-45%。发酵8小时，OD600至10~20时，降低温度至35℃，加入IPTG，使终浓度为0.5mmol/L进行诱导，发酵27小时后开始取样检测，检测方法见实施例5，待胞嘧啶不再增长时，下罐进行预处理。
以上所述仅是发明的几个实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种从微生物发酵液中分离纯化胞嘧啶的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）发酵液的预处理：胞嘧啶发酵液加热后经固液分离、超滤膜超滤连续式处理得到预处理液；
（2）胞嘧啶的粗提：将预处理液浓缩、结晶、过滤得到胞嘧啶粗品；
（3）胞嘧啶的精制：胞嘧啶粗品用去离子水加热复溶，加入EDTA和活性炭，经脱色、过滤、结晶、过滤、去离子水淋洗晶体、真空干燥得到胞嘧啶成品。
2.根据权利要求1所述的从微生物发酵液中分离纯化胞嘧啶的方法，其特征在于：所述微生物包括大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌、产氨短杆菌、谷氨酸棒状杆菌。
3.根据权利要求1所述的从微生物发酵液中分离纯化胞嘧啶的方法，其特征在于：所述步骤（1）中胞嘧啶发酵液加热温度为50℃以上，达到温度后维持30分钟以上。
4.根据权利要求1所述的从微生物发酵液中分离纯化胞嘧啶的方法，其特征在于：所述步骤（1）中固液分离所用滤膜为陶瓷膜、氧化铝膜或者PVC膜，其过滤精度为0.05μm-1.4μm；所述超滤膜为卷式膜，所述卷式膜包括聚醚砜膜、醋酸纤维素膜、聚偏氟乙烯膜、聚酰胺膜，过滤精度为800-10000道尔顿。
5.根据权利要求1所述的从微生物发酵液中分离纯化胞嘧啶的方法，其特征在于：所述步骤（2）中预处理液浓缩倍数为5-20倍。
6.根据权利要求1所述的从微生物发酵液中分离纯化胞嘧啶的方法，其特征在于：所述步骤（3）中复溶时胞嘧啶粗品与去离子水的投料质量比为1:20-50。
7.根据权利要求1所述的从微生物发酵液中分离纯化胞嘧啶的方法，其特征在于：所述步骤（3）中活性炭用量为胞嘧啶粗品质量的1-20%；脱色温度为60℃以上，维持时间30分钟以上。
8.根据权利要求1所述的从微生物发酵液中分离纯化胞嘧啶的方法，其特征在于：所述步骤（3）中EDTA的用量为胞嘧啶粗品质量的1-5%。
9.根据权利要求1所述的从微生物发酵液中分离纯化胞嘧啶的方法，其特征在于：所述步骤（2）、（3）中结晶条件：温度为4-25℃，结晶时调节pH7.0-8.0，结晶时间为2小时以上。
10.根据权利要求1所述的从微生物发酵液中分离纯化胞嘧啶的方法，其特征在于：所述步骤（3）中去离子水淋洗晶体至流出液电导率小于1ms/cm为止。
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