CN109652490B - 一种l-亮氨酸的发酵及分离纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种L‑亮氨酸的发酵及分离纯化方法，涉及氨基酸生产技术领域。该方法利用谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)和产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)联合培养生产L‑亮氨酸，包括活化培养、种子培养、发酵培养和L‑亮氨酸的分离纯化。对L‑亮氨酸的发酵培养以及分离纯化工艺进行了优化，显著提高了L‑亮氨酸的产量，减少了副产物的生成，缩短了发酵时间，提高了糖酸转化率，避免了大量废水的产生，使用了预处理液和浓缩助剂，使L‑亮氨酸与L‑缬氨酸有效分离，显著提高了L‑亮氨酸的纯度，该方法工艺简单易控制，成本较低，非常具有工业实用价值。

Description

一种L-亮氨酸的发酵及分离纯化方法
技术领域
本发明涉及氨基酸生产技术领域，具体涉及一种L-亮氨酸的发酵及分离纯化方法。
背景技术
L-亮氨酸(L-leucine)即α-氨基-γ-甲基戊酸、α-氨基异己酸，分子式为C6H13O2N，相对分子质量为131.17，含C 54.89％，N 10.67％，纯品为白色结晶或结晶性粉末，是一种非极性氨基酸，溶于水，不溶于氯仿和甲醇，微溶于乙醇。1819年Proust首先从奶酪中分离得到，后来Braconnot从肌肉与羊毛的酸水解物中得到结晶，并定名为亮氨酸。与缬氨酸、异亮氨酸同属于支链氨基酸，是人体八大必需氨基酸之一。L-亮氨酸具有多种生理功能，主要在医药、食品、化工、农药、化妆品、饮料业等领域获取得了大规模的应用。
目前，L-亮氨酸的生产方法主要有蛋白质水解提取法、化学合成法、酶法和微生物发酵法等，蛋白质水解法生产L-亮氨酸纯度低，且费时、污染严重、大规模生产受到限制。化学合成法得到的亮氨酸是消旋的DL-亮氨酸，为了得到L-亮氨酸，必须进行光学异构体的拆分，因此化学合成法很少用于L-亮氨酸的生产。酶法生产L-亮氨酸稳定性差，产率低，副产物较多，而微生物发酵法条件温和、环境友好、产品质量稳定，最具有发展前途。以微生物直接发酵法生产L-亮氨酸，主要的生产菌株有：谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、粘质赛氏杆菌(Serratea marcesoens)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)、天津短杆菌(Brevibacterium tianjinese)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)等。
根据不同的L-亮氨酸生产方法，往往需要采取不同的分离纯化工艺。对于微生物发酵法，在生产过程中往往同时产生多种氨基酸，如：在L-亮氨酸微生物发酵生产过程中会产生L-缬氨酸、L-苏氨酸和L-丙氨酸等，其中L-缬氨酸与L-亮氨酸分子结构仅相差一个亚甲基，等电点相差0.02，二者分离难度较大。目前，已有的L-亮氨酸分离纯化技术主要有：沉淀法、离子交换法、萃取法和膜分离法等。其中离子交换法最为常用，但当混合氨基酸之间的等电点相差较小时，不易分离，且还存在以下不足：耗盐量大、产生过量的再生废液、操作周期较长、排出大量含盐废水易引起管道腐蚀、对于溶液中存在多种离子时，需要针对不同的目的离子选用不同的树脂，普遍适用性差等。膜分离法是根据分子体积大小、亲水性等原因所引起的选择性透过或带电分子与荷膜之间的电荷效应等实现混合溶液的分离。依据其孔径的不同(或称为截留分子量)可以分为：微滤膜(MF)、超滤膜(UF)、纳滤膜(NF)、反渗透膜(RO)等。对于分子量相近、物化性质相似的多肽或氨基酸很难用超滤膜进行分离，纳滤膜分离技术则对多肽和氨基酸的分级分离具有明显的优势。
在L-亮氨酸微生物发酵生产过程中，菌种、发酵培养的培养基和培养条件等均会影响L-亮氨酸的产量。中国专利公告CN104404095B公开了一种利用黄色短杆菌TL0412发酵生产L-亮氨酸的方法，通过对发酵过程残糖浓度、温度、pH与溶解氧的控制及培养基的基本组成进行调整，发酵周期由原来的50小时缩短至33小时，L-亮氨酸产量由原来的30g/L增加到41g/L。从发酵液中分离纯化L-亮氨酸的技术与L-亮氨酸纯度紧密相关，中国专利公布CN105399641A公开了一种L-亮氨酸的分离纯化方法，L-亮氨酸发酵液经离心、超滤、反胶团萃取、纳滤、结晶、冷冻干燥，得到纯度不超过87.7％的L-亮氨酸。但该方法得到的L-亮氨酸的纯度不高，且没有公开L-亮氨酸与其他氨基酸，尤其是L-缬氨酸的有效分离。
本发明为了解决现有技术中存在的问题，即L-亮氨酸产量和纯度低、发酵有大量副产物积累、糖酸转化率低、提取工艺复杂、耗时长、产生过量的再生废液、与L-缬氨酸分离困难等。对L-亮氨酸的发酵培养以及分离纯化工艺进行优化，提高了L-亮氨酸产量、糖酸转化率以及纯度、减少了发酵过程中副产物的产生、分离纯化中L-亮氨酸与其他氨基酸能有效分离、避免了大量废水的产生、工艺简单易控制、成本较低、非常具有工业实用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种L-亮氨酸的发酵及分离纯化方法。克服了现有技术中存在的问题，L-亮氨酸产量、糖酸转化率以及纯度、减少了发酵过程中副产物的产生、分离纯化中L-亮氨酸与其他氨基酸能有效分离。
本发明一方面提供了一种L-亮氨酸的发酵及分离纯化方法，所述的方法包括以下步骤：
(1)活化培养：分别活化培养谷氨酸棒杆菌和产氨短杆菌；
(2)种子培养：将步骤(1)活化后谷氨酸棒杆菌和产氨短杆菌分别接种于种子培养基1和种子培养基2中进行种子培养；
所述的种子培养基1包括：无水葡萄糖25g/L、玉米浆干粉30g/L、硫酸铵2g/L、MgSO4·7H2O 2g/L、生物素300μg/L，pH＝6.8-7.0；
所述的种子培养基2包括：无水葡萄糖30g/L、玉米浆干粉15g/L、KH2PO4·3H2O 2g/L、尿素2g/L、生物素300μg/L，pH＝6.8-7.0；
(3)发酵培养：按照10％的接种量将步骤(2)得到的种子液接种至发酵培养基中培养，谷氨酸棒杆菌和产氨短杆菌种子液的比例为8:1-3；
优选地，谷氨酸棒杆菌和产氨短杆菌种子液的比例为8:2；
所述的发酵培养基包括：无水葡萄糖160g/L、泛酸钙1.6-2.4g/L、玉米浆干粉25g/L、硫酸铵20g/L、KH2PO4·3H2O 2g/L、MgSO4·7H2O 2g/L、MnSO4·H2O 2g/L、生物素300μg/L、消泡剂0.5％，pH＝6.8-7.0；
优选地，发酵培养基包括：无水葡萄糖160g/L、泛酸钙2.0g/L、玉米浆干粉25g/L、硫酸铵20g/L、KH2PO4·3H2O 2g/L、MgSO4·7H2O 2g/L、MnSO4·H2O 2g/L、生物素300μg/L、消泡剂0.5％，pH＝6.8-7.0。
(4)L-亮氨酸的分离纯化：将发酵结束后的发酵液用预处理液处理，离心、超滤、纳滤、反渗透膜过滤、添加浓缩助剂、真空浓缩结晶、离心、干燥，得到纯化L-亮氨酸；
所述的预处理液包括：无水葡萄糖10g/L、氯化铵2.5g/L、碳酸钙1.0g/L、羧甲基纤维素钠0.8g/L、氯化钾1.0g/L，pH＝5.2-5.6；
所述的浓缩助剂包括：无水葡萄糖6g/L、月桂基葡萄糖苷1.2g/L、KH2PO4·3H2O1.0g/L，pH＝5.2-5.6。
具体地，上述步骤(1)的操作包括：将谷氨酸棒杆菌和产氨短杆菌分别接种至活化培养基上，培养箱中28℃活化培养12h，得到活化菌；
所述的活化培养基包括：无水葡萄糖1g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 2.5g/L、琼脂粉20g/L，pH＝6.8-7.0。
优选地，所述步骤(2)种子培养的条件为：谷氨酸棒杆菌和产氨短杆菌的培养温度均为28℃，200r/min摇床培养20h。
具体地，上述步骤(2)的操作包括：取一环生长良好的活化菌氨酸棒杆菌ATCC21885和产氨短杆菌BNCC183441，分别接种至含有种子培养基1和2的摇瓶中进行培养，装液量为200mL/500mL，种子培养的条件为28℃，200r/min摇床培养20h，至菌体OD620值达到1.2，得到种子液。
优选地，所述步骤(3)发酵培养的具体操作：按照10％的接种量将步骤(2)得到的谷氨酸棒杆菌和产氨短杆菌的种子液接种至发酵培养基，培养至10h时和20h时加入补料培养基，通过自动流加氨水控制发酵过程中pH＝6.8±0.05，培养30-32h；
所述的补料培养基包括：无水葡萄糖120g/L、泛酸钙1.5g/L、玉米浆干粉20g/L、硫酸铵16g/L、KH2PO4·3H2O 2g/L、MgSO4·7H2O 2g/L、MnSO4·H2O 2g/L、生物素300μg/L、消泡剂0.5％，pH＝6.8-7.0。
优选地，所述步骤(3)发酵培养的条件为：培养温度为28℃，搅拌转速600rpm/min，前20h的通气量为80L/h，20h之后的通气量为110L/h。
优选地，所述步骤(4)中超滤所用滤膜是截留相对分子质量为1000-3000Da的聚醚砜超滤膜，操作温度30-50℃，操作压力0.1-0.2Mpa；所述的纳滤所用滤膜是截留相对分子质量为300-800Da的聚酰胺纳滤膜，操作温度40-50℃，操作压力0.4-0.6Mpa；所述的反渗透膜过滤操作温度为30-40℃，操作压力0.5-1.0Mpa。
进一步优选地，所述步骤(4)中超滤所用滤膜是截留相对分子质量为2000Da的聚醚砜超滤膜；所述的纳滤所用滤膜是截留相对分子质量为400Da的聚酰胺纳滤膜。
优选地，所述步骤(4)中发酵液用预处理液处理，预处理液添加量为5-10％(v/v)；浓缩助剂添加量为10-15％(v/v)。
进一步优选地，所述步骤(4)中发酵液用预处理液处理，预处理液添加量为8％(v/v)；浓缩助剂添加量为13％(v/v)。
具体地，所述步骤(4)L-亮氨酸的分离纯化具体操作如下：
在发酵结束后的发酵液加入预处理液，混合均匀，静止30min，12000rpm/min离心10min去除大部分菌体和杂质，收集上清液；上清液通过超滤膜过滤彻底去除菌体，得到超滤透析液；超滤透析液通过纳滤膜过滤去除小分子蛋白及色素杂质，得到纳滤透析液；纳滤透析液通过反渗透膜过滤，得到反渗透浓缩液和纯净水，纯净水可再次用于工业生产；在反渗透浓缩液中加入浓缩助剂，混合均匀，用草酸调节pH＝5.2-5.6，通过真空浓缩至L-亮氨酸含量为40％(w/w)，降至室温，5000rpm/min离心10min，弃上清；将粗品配制成浓度为10％(w/v)的溶液，再次浓缩至L-亮氨酸含量45％(w/w)，再降至室温，5000rpm/min离心10min，弃上清；加入70％乙醇重结晶，真空干燥5h，最后得到白色结晶，即为纯化的L-亮氨酸。
与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：
本发明提供的一种L-亮氨酸的发酵及分离纯化方法，对L-亮氨酸的发酵培养以及分离纯化工艺进行优化，两种菌株联合培养，显著提高了L-亮氨酸的产量，减少了副产物的生成，缩短了发酵时间；在发酵培养基中添加一定量的泛酸钙，提高了糖酸转化率；另外，在L-亮氨酸的分离纯化中，利用膜分离技术进行分离，避免了大量废水的产生，使用了预处理液和浓缩助剂，使L-亮氨酸与L-缬氨酸有效分离，显著提高了L-亮氨酸的纯度。该方法工艺简单易控制，成本较低，非常具有工业实用价值。
具体实施方式
以下实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的下述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例中，而是可以应用于符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的更宽的范围。虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处列举优选的方法和材料。
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
实施例1：一种L-亮氨酸的发酵及分离纯化方法
本发明中L-亮氨酸的发酵及分离纯化方法包括如下步骤：
(1)活化培养：将谷氨酸棒杆菌和产氨短杆菌分别接种至活化培养基上，培养箱中28℃活化培养12h，得到活化菌；
活化培养基包括：无水葡萄糖1g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、NaCl2.5g/L、琼脂粉20g/L，pH＝6.8-7.0。
(2)种子培养：取一环生长良好的活化菌氨酸棒杆菌ATCC21885和产氨短杆菌BNCC183441，分别接种至含有种子培养基1和2的摇瓶中进行培养，装液量为200mL/500mL，种子培养的条件为28℃，200r/min摇床培养20h，至菌体OD620值达到1.2，得到种子液；
种子培养基1包括：无水葡萄糖25g/L、玉米浆干粉30g/L、硫酸铵2g/L、MgSO4·7H2O2g/L、生物素300μg/L，pH＝6.8-7.0；
种子培养基2包括：无水葡萄糖30g/L、玉米浆干粉15g/L、KH2PO4·3H2O 2g/L、尿素2g/L、生物素300μg/L，pH＝6.8-7.0。
(3)发酵培养：按照10％的接种量将步骤(2)得到的种子液接种至发含有发酵培养基的10L发酵罐中，谷氨酸棒杆菌和产氨短杆菌种子液的比例为8:1，装液量为6L/10L，温度为28℃，搅拌转速600rpm/min，前20h的通气量为80L/h，20h之后的通气量为110L/h，培养至10h时和20h时加入补料培养基，通过自动流加氨水控制发酵过程中pH＝6.8±0.05，培养30-32h；得到发酵液。发酵结束时间以产酸不再增加为判断标准。发酵培养前后，用高效液相色谱法测定L-亮氨酸、L-缬氨酸和L-丙氨酸含量，利用生物传感分析仪检测发酵液残糖的含量，计算糖酸转化率。
发酵培养基包括：无水葡萄糖160g/L、泛酸钙2.0g/L、玉米浆干粉25g/L、硫酸铵20g/L、KH2PO4·3H2O 2g/L、MgSO4·7H2O 2g/L、MnSO4·H2O 2g/L、生物素300μg/L、消泡剂0.5％，pH＝6.8-7.0；
补料培养基包括：无水葡萄糖120g/L、泛酸钙1.5g/L、玉米浆干粉20g/L、硫酸铵16g/L、KH2PO4·3H2O 2g/L、MgSO4·7H2O 2g/L、MnSO4·H2O 2g/L、生物素300μg/L、消泡剂0.5％，pH＝6.8-7.0。
(4)L-亮氨酸的分离纯化：收集发酵结束后的发酵液，加入预处理液，添加量为8％(v/v)，混合均匀，静止30min，12000rpm/min离心10min，收集上清液；上清液通过截留相对分子质量为2000Da的聚醚砜超滤膜过滤，操作温度30-50℃，操作压力0.1-0.2Mpa，得到超滤透析液；超滤透析液通过截留相对分子质量为400Da的聚酰胺纳滤膜过滤，操作温度40-50℃，操作压力0.4-0.6Mpa，得到纳滤透析液；纳滤透析液通过反渗透膜过滤，操作温度为30-40℃，操作压力0.5-1.0Mpa，得到反渗透浓缩液和纯净水，纯净水可再次用于工业生产；在反渗透浓缩液中加入浓缩助剂，添加量为13％(v/v)，混合均匀，用草酸调节pH＝5.2-5.6，通过真空浓缩至L-亮氨酸含量为40％(w/w)，降至室温，5000rpm/min离心10min，弃上清；将粗品配制成浓度为10％(w/v)的溶液，再次浓缩至L-亮氨酸含量45％(w/w)，再降至室温，检测粗品浓缩液中L-亮氨酸、L-缬氨酸和L-丙氨酸含量。然后5000rpm/min离心10min，弃上清；加入70％乙醇重结晶，真空干燥5h，最后得到白色结晶，即为纯化的L-亮氨酸。
预处理液包括：无水葡萄糖10g/L、氯化铵2.5g/L、碳酸钙1.0g/L、羧甲基纤维素钠0.8g/L、氯化钾1.0g/L，pH＝5.2-5.6；
浓缩助剂包括：无水葡萄糖6g/L、月桂基葡萄糖苷1.2g/L、KH2PO4·3H2O 1.0g/L，pH＝5.2-5.6。
实施例2：一种L-亮氨酸的发酵及分离纯化方法
与实施例1的区别仅在于，步骤(3)发酵培养中接种的谷氨酸棒杆菌和产氨短杆菌种子液的比例为8:2。
实施例3：一种L-亮氨酸的发酵及分离纯化方法
与实施例1的区别仅在于，步骤(3)发酵培养中接种的谷氨酸棒杆菌和产氨短杆菌种子液的比例为8:3。
实施例4：一种L-亮氨酸的发酵及分离纯化方法
与实施例2的区别仅在于，步骤(3)所用的发酵培养基为发酵培养基包括：无水葡萄糖160g/L、泛酸钙1.6g/L、玉米浆干粉25g/L、硫酸铵20g/L、KH2PO4·3H2O 2g/L、MgSO4·7H2O 2g/L、MnSO4·H2O 2g/L、生物素300μg/L、消泡剂0.5％，pH＝6.8-7.0。
实施例5：一种L-亮氨酸的发酵及分离纯化方法
与实施例2的区别仅在于，步骤(3)所用的发酵培养基为发酵培养基包括：无水葡萄糖160g/L、泛酸钙2.4g/L、玉米浆干粉25g/L、硫酸铵20g/L、KH2PO4·3H2O 2g/L、MgSO4·7H2O 2g/L、MnSO4·H2O 2g/L、生物素300μg/L、消泡剂0.5％，pH＝6.8-7.0。
实施例6：一种L-亮氨酸的发酵及分离纯化方法
与实施例2的区别仅在于，步骤(4)L-亮氨酸的分离纯化中预处理液添加量为5％(v/v)。
实施例7：一种L-亮氨酸的发酵及分离纯化方法
与实施例2的区别仅在于，步骤(4)L-亮氨酸的分离纯化中预处理液添加量为10％(v/v)。
实施例8：一种L-亮氨酸的发酵及分离纯化方法
与实施例2的区别仅在于，步骤(4)L-亮氨酸的分离纯化中浓缩助剂添加量为10％(v/v)。
实施例9：一种L-亮氨酸的发酵及分离纯化方法
与实施例2的区别仅在于，步骤(4)L-亮氨酸的分离纯化中浓缩助剂添加量为15％(v/v)。
实施例10：一种L-亮氨酸的发酵及分离纯化方法
与实施例2的区别仅在于，步骤(4)L-亮氨酸的分离纯化中所用超滤膜是截留相对分子质量为1000Da的聚醚砜超滤膜。
实施例11：一种L-亮氨酸的发酵及分离纯化方法
与实施例2的区别仅在于，步骤(4)L-亮氨酸的分离纯化中所用超滤膜是截留相对分子质量为3000Da的聚醚砜超滤膜。
实施例12：一种L-亮氨酸的发酵及分离纯化方法
与实施例2的区别仅在于，步骤(4)L-亮氨酸的分离纯化中所用纳滤膜是截留相对分子质量为300Da的聚酰胺纳滤膜。
实施例13：一种L-亮氨酸的发酵及分离纯化方法
与实施例2的区别仅在于，步骤(4)L-亮氨酸的分离纯化中所用纳滤膜是截留相对分子质量为800Da的聚酰胺纳滤膜。
对比例1：一种L-亮氨酸的发酵及分离纯化方法
与实施例1的区别仅在于，活化培养、种子培养、发酵培养所用的菌株为谷氨酸棒杆菌ATCC21885。
对比例2：一种L-亮氨酸的发酵及分离纯化方法
与实施例2的区别仅在于，步骤(3)所用的发酵培养基为发酵培养基包括：无水葡萄糖160g/L、玉米浆干粉25g/L、硫酸铵20g/L、KH2PO4·3H2O 2g/L、MgSO4·7H2O 2g/L、MnSO4·H2O 2g/L、生物素300μg/L、消泡剂0.5％，pH＝6.8-7.0。
对比例3：一种L-亮氨酸的发酵及分离纯化方法
与实施例2的区别仅在于，步骤(4)L-亮氨酸的分离纯化中不加入预处理液。
对比例4：一种L-亮氨酸的发酵及分离纯化方法
与实施例2的区别仅在于，步骤(4)L-亮氨酸的分离纯化中不加入浓缩助剂。
A.发酵菌株接种比例对发酵产物的影响：
将本发明实施例1-13和对比例1-4的发酵液检测结果进行比较，结果见表1。
表1：发酵菌株接种比例对L-亮氨酸、L-缬氨酸、L-丙氨酸含量的影响
由表1可知，利用本发明所提供的方法发酵生产L-亮氨酸，能够有效地减少副产物(即：L-缬氨酸和L-丙氨酸)的生成。其中，实施例2所述的方法效果最佳。
B.发酵培养基对糖酸转化率的影响：
将本发明实施例2，4，5和对比例2的发酵液检测结果进行比较，结果见表2。
表2：发酵培养基对糖酸转化率的影响
组别 糖酸转化率(％)
实施例2 26.64
实施例4 24.37
实施例5 25.46
对比例2 19.13
由表2可知，利用本发明所提供的方法发酵生产L-亮氨酸，能够显著地提高糖酸转化率，其中实施例2所述的方法效果最佳。
C.不同发酵方法对L-亮氨酸产量的影响：
将本发明实施例1-5和对比例1-2的发酵液检测结果进行比较，结果见表3。
表3：不同发酵方法对L-亮氨酸产量的影响
由表3可知，利用本发明所提供的方法发酵生产L-亮氨酸，能够显著地提高L-亮氨酸产量，发酵液中L-亮氨酸含量均在45.52g/L以上，其中实施例2所述的方法效果最佳。
D.预处理液用量对纯化产物的影响：
比较将本发明实施例2，6，7和对比例3的粗品浓缩液检测结果，结果见表4。
表4：预处理液用量对纯化产物的影响
组别 实施例2 实施例6 实施例7 对比例1
L-亮氨酸(％) 45.19 44.93 45.12 45.09
L-缬氨酸(％) 1.03 1.52 1.35 5.87
L-丙氨酸(％) 0.37 0.33 0.41 0.84
由表4可知，利用本发明所提供的方法从发酵液中分离纯化L-亮氨酸，能够将L-亮氨酸与其副产物L-缬氨酸和L-丙氨酸有效地分离，其中实施例2所述的方法效果最佳。
E.不同的分离纯化方法对L-亮氨酸纯度的影响：
将本发明实施例2，6-13和对比例3-4得到的纯化L-亮氨酸进行比较，结果见表5。
组别 纯度(％) 含水率(％) 水溶性
实施例2 98.7 0.79 好
实施例6 97.4 0.98 好
实施例7 98.1 0.85 好
实施例8 95.6 1.59 好
实施例9 96.2 1.44 好
实施例10 96.4 1.28 好
实施例11 97.2 1.06 好
实施例12 96.8 1.15 好
实施例13 97.7 0.94 好
对比例3 86.8 3.61 较差
对比例4 89.3 3.25 较差
由表5可知，利用本发明所提供的方法得到纯化的L-亮氨酸纯度高，均在95.6％以上，其中实施例2得到纯化的L-亮氨酸纯度最高。
综上，利用本发明所提供的L-亮氨酸的发酵及分离纯化方法得到的L-亮氨酸纯度高，效果好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种L-亮氨酸的发酵及分离纯化方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
(1)活化培养：分别活化培养谷氨酸棒杆菌和产氨短杆菌；
(2)种子培养：将步骤(1)活化后谷氨酸棒杆菌和产氨短杆菌分别接种于种子培养基1和种子培养基2中进行种子培养；
所述的种子培养基1包括：无水葡萄糖25g/L、玉米浆干粉30g/L、硫酸铵2g/L、MgSO4·7H2O 2g/L、生物素300μg/L，pH＝6.8-7.0；
所述的种子培养基2包括：无水葡萄糖30g/L、玉米浆干粉15g/L、KH2PO4·3H2O 2g/L、尿素2g/L、生物素300μg/L，pH＝6.8-7.0；
(3)发酵培养：按照10％的接种量将步骤(2)得到的种子液接种至发酵培养基中培养，谷氨酸棒杆菌和产氨短杆菌种子液的比例为8:1-3；
所述的发酵培养基包括：无水葡萄糖160g/L、泛酸钙1.6-2.4g/L、玉米浆干粉25g/L、硫酸铵20g/L、KH2PO4·3H2O 2g/L、MgSO4·7H2O 2g/L、MnSO4·H2O 2g/L、生物素300μg/L、消泡剂0.5％，pH＝6.8-7.0；
(4)L-亮氨酸的分离纯化：将发酵结束后的发酵液用预处理液处理，离心、超滤、纳滤、反渗透膜过滤、添加浓缩助剂、真空浓缩结晶、离心、干燥，得到纯化L-亮氨酸；
所述的预处理液包括：无水葡萄糖10g/L、氯化铵2.5g/L、碳酸钙1.0g/L、羧甲基纤维素钠0.8g/L、氯化钾1.0g/L，pH＝5.2-5.6；
所述的浓缩助剂包括：无水葡萄糖6g/L、月桂基葡萄糖苷1.2g/L、KH2PO4·3H2O 1.0g/L，pH＝5.2-5.6。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)种子培养的条件为：谷氨酸棒杆菌和产氨短杆菌的培养温度均为28℃，200r/min摇床培养20h。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中谷氨酸棒杆菌和产氨短杆菌种子液的比例为8:2。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的发酵培养基包括：无水葡萄糖160g/L、泛酸钙2.0g/L、玉米浆干粉25g/L、硫酸铵20g/L、KH2PO4·3H2O 2g/L、MgSO4·7H2O 2g/L、MnSO4·H2O 2g/L、生物素300μg/L、消泡剂0.5％，pH＝6.8-7.0。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)发酵培养的具体操作：按照10％的接种量将步骤(2)得到的谷氨酸棒杆菌和产氨短杆菌的种子液接种至发酵培养基，培养至10h时和20h时加入补料培养基，通过自动流加氨水控制发酵过程中pH＝6.8±0.05，培养30-32h；
所述的补料培养基包括：无水葡萄糖120g/L、泛酸钙1.5g/L、玉米浆干粉20g/L、硫酸铵16g/L、KH2PO4·3H2O 2g/L、MgSO4·7H2O 2g/L、MnSO4·H2O 2g/L、生物素300μg/L、消泡剂0.5％，pH＝6.8-7.0。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)发酵培养的条件为：培养温度为28℃，搅拌转速600rpm/min，前20h的通气量为80L/h，20h之后的通气量为110L/h。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中超滤所用滤膜是截留相对分子质量为1000-3000Da的聚醚砜超滤膜，操作温度30-50℃，操作压力0.1-0.2Mpa；
所述的纳滤所用滤膜是截留相对分子质量为300-800Da的聚酰胺纳滤膜，操作温度40-50℃，操作压力0.4-0.6Mpa；
所述的反渗透膜过滤操作温度为30-40℃，操作压力0.5-1.0Mpa。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中超滤所用滤膜是截留相对分子质量为2000Da的聚醚砜超滤膜；
所述的纳滤所用滤膜是截留相对分子质量为400Da的聚酰胺纳滤膜。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中发酵液用预处理液处理，预处理液添加量为5-10％(v/v)；浓缩助剂添加量为10-15％(v/v)。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中发酵液用预处理液处理，预处理液添加量为8％(v/v)；浓缩助剂添加量为13％(v/v)。
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US6962989B1 (en) * 1999-07-08 2005-11-08 Basf Aktiengesellschaft Corynebacterium glutamicum genes encoding novel proteins
CN103911419B (zh) * 2014-03-20 2017-01-11 广东肇庆星湖生物科技股份有限公司 一种双菌株联合发酵生产l-缬氨酸的方法
CN104404095B (zh) * 2014-11-20 2018-04-27 河南巨龙生物工程股份有限公司 一种发酵生产l-亮氨酸的方法
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Denomination of invention: A method for fermentation and purification of L-Leucine

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