PT101113A

PT101113A - Novos oligodesoxirribonucleotides tendo actividade anti-isquemica e processos para a sua preparacao

Info

Publication number: PT101113A
Application number: PT101113A
Authority: PT
Inventors: Marisa Mantovani; Roberto Porta; Giuseppe Prino; Danilo Giannotti; Armando Cedro; Ennio Lanzarotti
Original assignee: Crinos Industria Farmaco
Priority date: 1991-12-09
Filing date: 1992-12-07
Publication date: 1994-02-28
Also published as: GR1002143B; US6046172A; FR2684675A1; MX9207137A; EP0558833A2; ITMI913294A1; JPH05247083A; CN1073448A; CH685298A5; BE1008163A5; BR9204931A; GR920100527A; AU655087B2; US5646127A; IL103757A; FR2684675B1; US5646268A; EP0558833A3; CA2083416A1; LU88197A1

Description

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Ο invento refere-se a novos oligodesóxirribonucleotí-deos de origem natural, contendo um peso molecular compreendendo entre 4 000 e 10 000 daltons e seus processos de preparação.

Um outro objectivo deste invento é a utilização dos novos compostos como agentes anti-isguémicos.

Deve ser aqui estabelecido preliminarmente que os processos aqui atrás referidos têm a característica comum geral de consistir de um passo de despolimerização prévia de ácidos desoxirribonucleicos naturais de elevado peso molecular em meios aquosos, seguido por precipitação dos oligodesoxirribonucleotí-deos assim obtidos por adição de quantidades adequadas de solventes orgânicos.

Os polímeros deste invento quer para o perfil analítico relevante quer para a actividade farmacológica atrás referida constituem uma família particular entre todos os oligodesoxirri-bonucleotídeos com um peso molecular que cai dentro da gama acima indicada.

Na verdade neste mesmo intervalo, como será demonstrado pósteriormente, podem ser revelados compostos que são diferentes das substâncias aqui reveladas no perfil analítico relevante, mais em detalhe como para os valores de um parâmetro, e para a actividade anti-isquémica muito inferior. O parâmetro químico aqui atrás referido é a razão da soma de moles de adenina + timina /citosina + guanina, ou A+T/C+G, cuja gama aqui referida posteriormente ( Tabela I ) deve ser considerada como crítica para definir os compostos com o peso molecular dentro do intervalo de 4 000 a 10 000 que são dotados de uma actividade anti-isquémica significativa e portanto são úteis de um ponto de vista terapêutico. o.....conhecimento actual revela já polímeros de peso molecular baixo obtidos por despolimerização de ácidos desoxirri-bonucleicos naturais. De qualquer modo, como explicado totalmente nas considerações que se seguem, não são considerados de relevância suficiente para antecipar a novidade dos novos oligodesoxir-ribonucleotídeos ou de outro modo torná-los uma questão evidente. EPA 416677 revela usos cosméticos de composições contendo polide-soxirribonuòleotídeos de origem natural com um peso molecular compreendido entre 10 000 e 100 000, e o que aqui é de interesse, uma razão molar de purinas/pirimidinas ( G+A/C+T ) incluídos pelos limites correspondentes apresentados para o mesmo parâmetro neste invento ( ver Tabela I ). Este invento, contudo, não pretende desprezar o passo inventivo do primeiro objectivo deste invento.

Assim, por exemplo, não será obrigatório considerar os novos polímeros como meros equivalentes de peso molecular baixo dos polidesoxirribonucleotídeos deste domínio, uma vez que a anterior gama de razão molar G+A/C+T tomada como tal compreende uma classe muito grande de compostos, incluindo quer os oligode-soxirribonucleotídeos dotados da actividade farmacológica aqui anteriormente referida e os que são em vez disso apenas fracamente activos.

Esta observação é além disso totalmente confirmada por consideração dos valores e suas gamas de G+A/C+T apresentados para os compostos do invento sendo dados na Tabela I juntamente com os referidos na página 10 para a preparação de P0067.D V que, como se mostra na seguinte Tabela IV, são em vez disso dotados com uma fraca actividade anti-isquémica. 4

As considerações aqui atrás referidas conduzem à conclusão não ambígua de que a EPA 416677 não dá qualquer informação que possa eventualmente ajudar as pessoas experientes no domínio a seleccionar ou de outro modo definir a classe de polímeros aqui revelada. WO 87/06235 revela os polidesoxirribonucleotídeos de origem natural, que diferem das substâncias que constituem o primeiro objectivo deste invento para valores superiores quer do parâmetro de hipercromicidade quer de rotação óptica.

Um assunto que interessa referir é que na mesma aplicação da patente é já revelado que ao descer o peso molecular o parâmetro de hipercromicidade iria diminuir. No entanto, também deve ser reconhecido que o documento não dá qualquer informação sobre como a rotação específica teria concomitantemente variado.

Além disso, também em WO 87/06235, como dito pela EPA 416677, não foi dada qualquer sugestão para valores particulares ou seu qualquer intervalo da razão molar A+T/C+G, sendo eventualmente importante para evidenciar a actividade dos compostos revelada.

Da leitura dos dois documentos aqui atrás referidos parece ser bem evidente a observação mais geral que a razão molar A+T/C+G nem mesmo foi aí remotamente considerada para a caracterização química dos polidesoxirribonucleotídeos.

Além disso, WO 87/06235 providencia também uma base mais substancial para evidenciar a não clareza do presente invento. 5

Na realidade na descober.ta relevante verificou-se que os polímeros de peso molecular baixo de ácidos desoxirribonuclei-cos com valores do parâmetro de hipercromicidade h inferiores a 10 devem apresentar uma diminuição dramática de actividade farmacológica. Em adição, também se afirmou que h é quase 0 para os oligodesoxirribonucleotídeos com um peso molecular de 8 000.

Estas proposições conduzem directamente às seguintes conclusões: a. Os oligodesoxirribonucleotídeos com um valor de h inferior a 10 não deviam ter tido quaisquer aplicações terapêuticas. b. Mais em particular, uma vez que na referência atrás dada, tal diminuição impressiva de actividade farmacológica foi posta em relação com os valores de h inferiores a 10, as pessoas experientes no domínio terão certamente de considerar que quanto mais baixo for o valor de h mais baixo será a actividade residual, principalmente quando h=0, que de acordo com WO 87/06235 deveria corresponder, como se viu, a um peso molecular de tais polideso-xirribonucleotídeos de 8 000.

Estas duas conclusões estão manifestamente em contraste com as descobertas experimentais deste invento que serão aqui posteriormente evidenciadas. As características físico-químicas e químicas relevantes dos novos oligodesoxirribonucleotídeos são apresentados na Tabela I.

As gamas de variação aí consideradas são geralmente tiradas da Tabela II, excepto para a rotação específica cujos limites foram determinados tomando as considerações da Tabela II (limites; +34° a +48° ) juntamente com os exemplos de rotação 6

especifica da preparação de P0097.N referida no exemplo 8 (+32.5°) e da preparação de P0097.M referida no exemplo 9 (+30.9).

Os parâmetros apresentados na Tabela I foram determinados como se segue. 0 peso molecular foi determinado por HPLC, num líquido cromatográfico equipado com duas colunas, Biosil TSK 300 e Biosil TSK 250 ( Biorad ) em séries, termostatizadas a 30°C. A solução constituindo a fase móvel foi obtida por dissolução em água destilada das seguintes substâncias: cloreto de sódio 5,844 g, Nal^PO^.I^O 9,24 g, glicina 22,5 g. 0 volume foi completado até perfazer 950 ml, o pH corrigido para 6,8 ( NaOH 6 N) e depois a solução foi diluída até 1 litro com água destilada. A velocidade de fluxo era de 0,5 ml/minuto, o volume da amostra injectado era de 6 mel ( a abreviatura mel representa microlitros ) e a densidade óptica do efluente lida a 260 nm. A calibração da coluna foi efectuada usando sulfonato de poliestireno ( sais de sódio ) padrão com um peso molecular conhecido ( Fornecedor: Polymers Laboratories Limited ). Foram usadas duas soluções, isto é, a solução A e a solução B, para a calibração. Cada uma das duas continha 4 padrões com uma concentração de 0,25%. Na solução A, os quatro padrões de sulfonato de poliestireno tinham os seguintes pesos moleculares : l 800, 8 000, 46 000, 200 000, enquanto que na solução B tinham os seguintes : 4 600, 18 000, 100 000, 400 000.

Tabela I

Limites de variação dos parâmetros analíticos que caracterizam os oligodesoxiribonucleotídeos deste invento Peso molecular 4 000 a 10000 h <10 A+T\C+G* 1,100 a 1,455 A+G\C+T* 0,800 a 1,160 Rotação específica + 30° a + 48° * razão molar de base A injecção de cada solução foi repetida por três vezes como um todo. A amostra foi injectada nas mesmas condições. o parâmetro de hipercromicidade h foi determinado como descrito em " Methods of Enzymology", volume III, páginas 708 -712 ( ver por exemplo página 3 de WO 87/06235 ). A rotação õptica foi determinada num polarímetro automático com linha D de sódio, usando uma solução amostra em água 1% p/v ( base de peso seco ), termostatizada a 20°C. O cálculo da razão molar de bases A+T/C+G e A+G/C+T necessitou primeiro da determinação da percentagem de peso relevante de cada base na amostra de oligodesoxirribonucleotídeo correspondente. Esta análise foi feita por HPLC, numa coluna de permuta iónica depois da hidrólise da amostra, como descrito na PE 360882.

Os processos pelos quais estas substâncias podem ser obtidas são os seguintes:

Precipitação passo a passo do polímero a partir de soluções aquosas de acetato de sódio 0,8 M contendo uma quantidade de sais de sódio de polidesoxirribonucleotídeo a 4%, p/v, com um peso molecular compreendido no intervalo de 15 000 a 75 000 daltons. O processo foi efectuado a uma temperatura de 20°C e a precipitação foi realizada por adição à solução de um álcool alquílico inferior, escolhido num grupo consistindo de álcool etílico, propílico e isopropílico, de acordo com os passos aqui referidos pósteriormente: a. Adição de álcool a 0,8 volumes à solução 0,8 M de acetato de sódio contendo polides.oxirribonucleotídeos a 4%, p/v, com o fim de precipitar a grande parte da fracção de polidesoxirribonucleotídeo com peso molecular elevado. b. À solução hidroalcoólica obtida no anterior pass a contendo 0,8 volumes de álcool, foi adicionado mais álcool com o fim de se obter no total 1 volume de fase orgânica/ volume de fase aquosa inicial. A camada sobrenadante foi depois removida e o precipitado formado, que continha a fracção de polidesoxirribonucleotídeo com peso molecular elevado foi em seguida misturado com os polímeros do invento, recuperado e trabalhado depois como descrito no seguinte passo d. c. A camada sobrenadante do anterior passo b, foi misturada com uma quantidade adicional de álcool de modo a obter-se no final 2 volumes de álcool/ volume de solução tampão aquosa inicial de acetato de sódio 0,8 M do passo a. Nestas condições separaram-se e recuperaram-se pósteriormente os oligo-desoxirribonucleotídeos do invento. d. O precipitado obtido no passo b foi dissolvido em acetato de sódio 0,8 Μ. A fracção de polidesoxirribonucleotídeo com peso molecular elevado foi depois removida por precipitação por adição de 1 volume de álcool/ volume de solução aquosa. O precipitado foi removido por centrifugação e a solução hidroal-coólica que ficou foi misturada com álcool até uma quantidade total de 2 volumes do solvente orgânico / volume da fase aquosa. O precipitado assim formado constituído pelos oligonucleotídeos de acordo com o invento foi recuperado.

De acordo com um método alternativo ao que é aqui atrás dado, também podia ser efectuada apenas uma precipitação intermédia por adição à solução aquosa inicial de 1 volume de álcool. Nestas condições, a camada sobrenadante foi misturada com um volume adicional de álcool, obtendo-se assim a precipitação dos polímeros esperados. Este processo conduz de qualquer modo a rendimentos inferiores. - A despolimerização por aquecimento dos sais de sódio de ácidos desoxirribonucleicos de peso molecular elevado num tampão aquoso de ácido acético/acetato de sódio 0,5 M de pH 4,1.

Este processo foi realizado a uma temperatura variando de 65°C a 75°C durante um intervalo de tempo de pelo menos 6 horas, de preferência inferior a 10 horas, cujo tempo estava de qualquer modo dependente do peso molecular do ácido nucleico inicial. A despolimerização foi seguida por controle em intervalos fixos do peso molecular do polímero. 0 processo foi efectuado 10

até o peso molecular se situar dentro dos limites relevantes apresentados na Tabela I. A -concentração do ácido desoxirribonucleico neste tampão de acetato de sódio 0,5 M era de 4%, p/v, ou de outro modo de cerca de 12%, p/v, enquanto que com maiores concentrações os rendimentos são algo melhores ( ver exemplos 6 a 11). O processo consta dos passos seguintes: a. Dissolução de ácidos desoxirribonucleicos de elevado peso molecular e adição subsequente de tri-hidrato de acetato de sódio + ácido acético concentrado ( 80% ) para dar a molaridade e o pH necessários do tampão. b. Aquecimento da solução aquosa obtida no passo anterior a a uma temperatura variando de 65°C a 75°C durante um tempo de pelo menos 6 horas. c. Diminuição, no fim do tratamento de aquecimento do passo b, da temperatura para 30°C, correcção do pH para 7,8 a 8,0 com NaOH a 30% e depois aquecimento outra vez a 85°C durante 90 minutos. d. Arrefecimento da solução até à temperatura ambiente, correcção do pH para 6,5 com ácido acético concentrado e precipitação dos oligodesoxirribonucleotídeos por adição de etanol numa razão variando entre 1,5 e 2 volumes/ volume de solução aquosa. - Despolimerização por desoxirribonuclease de ácidos desoxirribonucleicos de elevado peso molecular e subsequente passo de ultrafiltração para concentrar a solução.

X A enzimólise foi efectuada em ácidos nucleicos de elevado peso molecular a 1%, p/v, durante um tempo de 24 horas, em tampão fosfato 0,1 M, com pH igual a 7,0 na presença de cloreto de magnésio 10 mM. No final, o passo de ultrafiltração foi efectuado como se segue: a. Ultrafiltração da solução numa membrana contendo uma selectividade de 10 000 daltons até o volume da solução ficar reduzido a 1/5 do inicial. b. Dessalinização da solução do produto de retenção por diálise a volume constante ( isto é, por adição de água à solução para manter o mesmo volume que o inicial ). c. Concentração dos produtos reunidos recolhidos a partir dos passos anteriores a e b até 1/5 do volume inicial por ultrafiltração numa membrana com uma selectividade de 3 000 daltons. d. Recuperação dos solutos dissolvidos nos produtos de retenção, respectivamente, da primeira ( selectividade de 10 000 daltons, passo a ) e da segunda ultarfiltração ( selectividade de 3 000 daltons, passo c ) por salinização prévia das soluções anteriores até uma concentração de sal de 0,8 M, cujo sal era de preferência acetato de sódio, e subsequente precipitação por adição de 1,5 volumes de etanol/ volume de fase aquosa.

Alternativamente, em vez dos dois passos de ultrafil-tração atrás descritos, a concentração da solução podia ser efectuada de acordo com o seguinte processo : 12

a. Ultrafiltração numa membrana contendo uma selectivi-dade de 3 000 daltons até o volume do produto de retenção ser 1/5 do inicial. b. Dessalinização da solução do produto de retenção por diãlise a volume constante contra 5 volumes no total de água destilada. c. Recuperação do soluto do produto de retenção como aqui descrito anteriormente no passo d.

Tal processo parece dar o mesmo rendimento que o primeiro, com a vantagem de ser um processo mais simples.

Em todos os processos aqui anteriormente revelados o composto foi depois obtido a partir do precipitado por desidratação, trituração e secagem subsequentes.

Na Tabela II é apresentado o perfil analítico das preparações que foram usadas nos ensaios farmacológicos que serão aqui descritos pósteriormente. O código de laboratório da preparação do oligodesoxir-ribonucleotídeo P0067.D V com um peso molecular inferior a 10 000, e dotado com uma actividade anti-isquémica mais baixa que a dos polímeros do invento, foi obtido de acordo com o método de fraccionamento descrito no exemplo 15. Esta preparação mostrou os seguintes valores analíticos ( base de peso seco ) : peso molecular 6 600, H 1,4, A+T/G+C 1,494, A+G/T+C 0,914, rotação específica + 37,2°.

De referir que o mesmo método de fraccionamento usado para se obter P0067.D V, quando aplicado a outras soluções de 13

ácidos desoxirribonucleicos deu de qualquer modo um produto com as mesmas características analíticas, isto é com um valor elevado da razão molar de A+T/G+C. É dada uma demonstração adequada no exemplo 16.

Tabela II

Características físico-químicas e químicas das prep rações usadas nos testes farmacológicos. No titulo de cada coluna está indicado o código de laboratório. P0085.C P0085.D IV P0085.M II P0130.A P0130.C P0102.A P0102.B Peso Molecular 8 500 6 400 9 500 8 000 9 400 8 000 4 500 h 9.4 3,9 9.0 3,5 5,8 9,7 3.9 A+T/G+C * 1,298 1,446 1,305 1,263 1,230 1,120 1,110 A+G/T+C * 0,908 0,849 0,917 0,806 0,854 1,150 1,096 Rotação Específica + 47,3 + 38,6 + 46,2 + 34,8 + 36,2 + 46,8 + 47,3 * Razão Molar

Na Tabela III são apresentados os valores de actividade fibrinolítica dos compostos do invento, de preparação P0067.D V, e por comparação com o agente fibrinolítico plasmina, um enzima proteolítico derivado do plasminogénio. A actividade foi expressa em mcg de paranitroanilida (pNA) hidrolizada a partir de substrato de peptídeo S-2251 ao qual pNA está covalentemente ligado.

Tal ligaçao está susceptível selectivamente à acção de agentes fibrinolíticos.

Coroo consequência disso, a quantidade de pNA libertada em solução está directamente relacionada com a actividade fibri-nolitica do composto ensaiado. A actividade fibrinolítica testada in vitro, usando o tripeptídeo S-2251 ( H-D-valil-L-leucil-L-lisina paranitroanilida dihidrocloreto Kabi-Milan ) como essencialmente descrito por J.H. Verheijen e Alii em " A simple sensitive spectrophotometric assay for extrinsic ( tissue-type ) plasminogen activator appicable to measurements in plasma" Thromb. Haemostas.48 (3) 266 a 269, 1982. A fracção de euglobulina do plasma foi preparada por recolha de sangue ( 8 ml ) de uma veia marginal da orelha de coelhos com uma seringa contendo já 2 ml de solução de citrato tribásico de sódio a 3,8%, p/v. 0 plasma obtido por centrifugação foi depois dividido em partes aliquótas de 0,5 ml, e a cada uma das partes alíquotas foi adicionado 1 ml da solução de oligonu-cleotídeo de modo a ter-se no final as seguintes concentrações de amostra : 200 e 800 mcg/ml de plasma ( mcg significa microgramas ). Às soluções foi adicionado 0,1 ml de solução aquosa de uroci-nase ( 50 U./ml ) para converter plasminogénio em plasmina. Foi adicionado água para levar o pH para 5,4 e o volume da solução foi depois ajustado para 8,5 ml com água destilada fria a +4°C com o fim de se obter a precipitação da euglobulina. 0 passo foi completado por transferência dos tubos teste para o frigorifico ( +4°C ) durante 2 horas. A centrifugação foi depois efectuada durante 10 minutos e a camada sobrenadante desprezada. 0 resíduo foi extraído com 0,3 ml de solução tampão tris hidrocloreto para pH igual a 7,4, conduzindo a uma suspensão. A 0,3 ml da suspenão foi adicionado 0,4 ml de tampão tris hidrocloreto e depois 15

incubado durante mais 10 minutos a 37°c. Foi depois adicionado o tripeptídeo s-2251 (8,25 mg da substância em 5 ml de água destilada ) e foi incubado durante mais 5 minutos à mesma temperatura. A enzimólise foi bloqueada por adição de 0,1 ml de ácido acético a 1% e 0,6 ml de NaCl 0,15 Μ. A quantidade de cromogénio libertada nas soluções teste foi determinada por espectrofotome-tria. A curva padrão referência foi feita com plasmina bacteriana U.S. ( Biosintex ) ensaiada no mesmo teste com as doses seguintes : 40, 80, 160 e 320 mcg. As experiências foram repetidas 6 vezes no total, analisando de cada vez a amostra e as quatro concentrações de plasmina atrás referidas.

Os resultados são apresentados na Tabela III.

Um facto geral que pode ser concluído dos dados da Tabela III é que os oligodeoxirrobonucleótidos que têm um peso molecular inferior a 10 000 apresentam uma actividade fibrinolí-tica fraca or nula.

Isto era aliás esperado tendo em conta os ensinamentos da WO 87/06235. A actividade anti-isquémica foi realizada ex-vivo no coração isolado e em perfusão de coelho, basicamente como foi descrito por P. D. Henry no artigo "A contracção do miocárdio e a acumulação de cálcio mitocondrial na isquémia do coração do coelho" Am. J. Physiol. 233, 1977.

Os compostos teste começaram a ser introduzidos 40 minutos antes da isquémia, na concentração de 400 mcg/ml e caudal de 20 ml/minuto. Durante a fase isquémica (40 minutos) o caudal foi reduzido para 0.2 ml/min. No final desta fase, foi 16

restabelecido o caudal inicial e mantido por mais 20 minutos. A experiência foi repetida 6 vezes. Durante a fase isquémica e a subsequente reperfusão, determinou-se a pressão telediastólica ventricular esquerda dos corações tratados e os valores foram comparados com os dos corações não tratados (grupo de controle).

Na Tabela IV mostram-se as actividades anti-isquémicas determinadas dos compostos em estudo, durante a fase isquémica e após a fase de reperfusão. É evidente da referida Tabela que os oligodeoxirribonucleotídeos que satizfazem o perfil analítico estabelecido na Tabela I mostram uma actividade anti-isquémica significativa. Pelo contrário, a preparação P0067.D V, que tem uma razão molar de bases A+T/G+C (1,494) fora dos limites 1,100 a 1,455 estabelecida na Tabela I, evidencia uma actividade muito mais baixa. 0 significado destes dados pode ser melhor compreendido tomando em consideração que, quando no referido modelo experimental se produz a isquémia cardíaca por redução do caudal do líquido de perfusão, o coração é atingido por um dano que é evidenciado funcionalmente pela contracção ventricular. Na fase seguinte de reperfusão, restabelecendo as condições iniciais de caudal, é provocado um dano ainda maior, uma vez que, juntamente com o aumento da pressão diastólica, já observada na fase precedente, imicia-se um conjunto de arritmias cardíacas.

Dos dados da Tabela IV tira-se a conclusão que na fase de reperfusão final os oligonucleotídeos do invento conferem uma protecção substancial da isquémia induzida experimentalmente, mantendo assim substancialmente a actividade contráctil regular do coração, com redução da sua resistência diastólica.

Como consequência do que foi acima demonstrado, conclui--se que os novos compostos podem ser explorados de forma útil na terapia da isquémia cardíaca.

Tabela III

Actividade fibrinolítica dos novos oligonucleotídeos avaliados no substrato cromogénico tripeptídeo S-2251 Composto mcg de paranitroanilina libertada do substrato S-2251 em 5 minutos Concentração do composto 200 mcg/ml 800 mcg/ml P0085.C 0,25 ± 0,16 0,89 ± 0,38 P0085.D IV 0,18 ± 0,09 0,03 ± 0,38 P0085.M II 0 2,49 ± 0,70 P0102.A 1,27 ± 0,52 2,63 ± 0,61 P0102.B 0,87 ± 0,57 0,56 + 0,27 P0067.D V 0 não determinado Plasmina * 6,70 * 27,01 * valores extrapolados da equação de linha de regressão y= - 0,26 + 0,0341x ( r = 1 ) 19

Tabela IV

Actividade anti-isquémica ex-vivo dos novos oligonucleotídeos Composto % de Inibição vs dano isquémico Isquémia induzida experimentalmente Fase de isquémia Fase de reperfusão P0085.C 67 80 P0085.D IV 66 77 P0085.M II 68 79 P0102.A 61 69 P0102.B 42 60 PO130.A 63 74 PO130.C 57 66 P0067.D V 23 37 20

Outros objectivos do invento são as formas de dosagem contendo como princípio activo as novas substâncias. As referidas formulações podem ser dirigidas quer para administração parenté-rica quer ofal.

As composições parentéricas podem tomar a forma de soluções estéreis e apirogenéticas em ampolas seladas, ou de liofilizados contidos em frascos selados, a serem dissolvidos estemporaneamente em solventes aquosos estéreis. Como solventes aquosos podem usar-se soluções isotónicas feitas com tampões convencionais (citratos, fosfatos e análogos), juntamente com preservativos conhecidos.

Podem disponibilizar-se formulações orais na forma de comprimidos, comprimidos recorbertos, cápsulas de gelatina e grânulos.

As referidas formas de dosagem podem ser preparadas de acordo com técnicas conhecidas.

Por exemplo, formas de dosagem oral podem ser preparadas por compressão directa dos pós ou grânulos e podem conter ligantes, lubrificantes e agentes desagregantes conhecidos.

As formas de dosagem para administração parentérica podem conter de 40 a 200 mg/ml do princípio activo, preferivelmente de 80 a 160 mg/ml (para os liofilizados, os números precedentes referem-se à concentração final de substância no solvente estéril), enquanto que as formas de dosagem para administração oral contêm entre 200 e 1500 mg por unidade de dose. 21

Exemplo 1

Separação dos oliqonucleotídeos de acordo com o presente invento ( preparações P0085.C e P0085.M II ) por precipitação fraccionada de uma solução aquosa de desfibrotídeo na presença de acetato de sódio por adição de etanol.

Foram dissolvidos 420 g de desfibrotídeo ( lote 82 ) em 10.5 1 ( concentração final de 4%, p/v ) e adicionou-se 1155 g de

tri-hidrato de acetato de sódio ( 0,8 M ). A solução foi termos-tatizada a 20°C e foram depois adicionados 0,8 volumes de etanol a 95%. A camada sobrenadante foi recuperada por centrifugação ( o precipitado constituído de polidesoxirribonucleotídeos de elevado peso molecular foi desprezado ) e adicionou-se 0,2 volumes de etanol ( volume total de fase orgânica/fase aquosa =1 ). A centrifugação foi efectuada novamente. O precipitado foi recuperado, desidratado, seco e triturado. No total foram recuperados 97.6 g ( preparação P0085.B, consistindo de uma mistura dos oligodesoxirribonucleotídeos do invento juntamente com os polidesoxirribonucleotídeos ). À camada sobrenadante foi adicionado mais etanol com o fim de se ter 2 volumes do solvente orgânico / volume de fase aquosa. Foram assim recuperadas 40,5 g de um sólido ( preparação P0085.C ) .

Dissolveram-se 97,6 g de P0085.B em 2,45 1 de água destilada e adicionou-se 269,5 g de tri-hidrato de acetato de sódio. A solução foi termostatizada a 20°C. Foi adicionado 1 volume de etanol e a suspensão assim obtida foi centrifugada. À camada sobrenadante foi adicionado mais etanol com o fim de se ter uma razão final de 2 entre a quantidade total de etanol e da solução aquosa. Foi assim recuperado 31,2 g ( preparação P0085.M II ). A recuperação total de oligodesoxirribonucleotídeos, isto é P0085.C + P0085.M II, foi de 71,7 g ( 17,1% ). 22

Exemplo 2

Separação dos oliaonucleotídeos ( preparação P0085.D IV ) por precipitação fraccionada com etanol na presença de acetato de sódio a partir de uma solução aquosa de desfibrotídeo

Dissolveu-se 20 g de preparação de desfibrotídeo com o peso molecular de 17 000 daltons em 500 ml de água destilada. Foi adicionado 55 g de tri-hidrato de acetato de sódio e a solução límpida resultante foi termostatizada a 20°C. Foram depois adicionados 500 ml ( 1 volume ) de etanol e o precipitado foi recolhido por centrifugação a 3 000 rpm durante 5 minutos. À camada sobrenadante foram adicionados 500 ml de etanol ( isto é, 2 volumes no total comparando com a fase aquosa ). O sólido foi recuperado, desidratado, triturado e seco num forno. Foram assim obtidas 2,10 g. Rendimento : 10,5%.

Exemplo 3

Separação dos oliaonucleotídeos ( preparação POQ85.D V ) por precipitação fraccionada com etanol na presença de acetato de sódio a partir de uma solução aquosa de um polidesoxirribonu-cleotídeo

Dissolveu-se 20 g de sal de sódio de um polidesoxirri-bonucleotídeo com um peso molecular de 43 000 daltons em 500 ml de água destilada. Depois foi seguido o processo revelado no anterior exemplo 2. Foi obtido no final 1,46 g ( rendimento de 7,3% ). A substância assim isolada tinha as seguintes caracterís-ticas analíticas ( dados numa base de peso seco ) : peso molecular 6 700, h 3,4, A+T/G+C 1,375, G+A/T+C 0,825 e rotação específica +43,4°.

Exemplo 4

Separação dos oligonucleotldeos ( preparação P0085.D VI com o processo do exemplo 2

Dissolveu-se 20 g de desfibronucleotídeo ( lote ns 157 ) com o peso molecular de 26 200 daltons em 500 ml de água destilada e procedeu-se de acordo com o referido exemplo 2. Foi recuperado no final 1,54 g ( rendimento de 7,7% ). Os valores analíticos ( valores numa base de peso seco ) foram os seguintes : peso molecular 5 900, h 5,7, A+T/G+C 1,343, G+A/T+C 0,835 e rotação específica +41,6°.

Exemplo 5

Separação dos oligonucleotldeos ( preparação P0085.D VII ) por precipitação fraccionada com etanol na presença de acetato de sódio a partir de uma solução aquosa de um polideso-xirribonucleotídeo

Foram dissolvidos 20 g do sal de sódio de um polideso-xirribonucleotídeo com o peso molecular de 75 000 daltons em 500 ml de água destilada. Foi depois seguido o processo dado no anterior exemplo 2. Foram obtidas 0,78 g ( 3,9 % de rendimento ) de um composto que tinha as seguintes características ( valores numa base de peso seco ) : peso molecular 6 100, h 7,1, A+T/G+C = 1,415, G+A/T+C 0,860 e rotação específica +43,6°. 24

-Ν

Exemplo 6

Preparações dos oligonucleotídeos do invento por despolimerizacão química em solução tampão aquosa de acetato de sódio/ácido acético ( preparação P0130.A )

Foram dissolvidos 800 g de ácido desoxirribonucleico de elevado peso molecular ( peso molecular mais alto do que 700 000 ) em 5280 ml de H20 com aquecimento moderado. Foram adicionados 426,4 g de tri-hidrato de acetato de sódio, seguido depois por adição de 1,016 ml de ácido acético a 80% ( ácido acético concentrado ) para corrigir o pH para 4,1 e depois a solução viscosa (concentração final do polímero de 12,7 % w/v; molaridade do acetato de sódio de 0,5 M ) foi aquecida de até 75°C durante 6 horas. Depois deste tempo a temperatura foi diminuída para 30°C, o pH foi corrigido para 7,8 a 8,0 com NaOH a 30% e a solução foi depois aquecida a 85°C durante 90 minutos. Depois de arrefecimento, o pH foi levado para 6,5 com CH3COOH a 80%. A precipitação foi então efectuada por adição de 1,5 volumes de etanol/volume de fase aquosa. 0 sólido recuperado foi lavado, triturado e seco. Foram obtidos 745 g ( rendimento : 93,1 % ).

Exemplo 7

Preparações dos oligonucleotideos do invento por despolimerização química em solução tampão aquosa de acetato de sódio/ácido acético ( preparação P0130.C)

Foram tratadas, como no exemplo 6, 800 g de ácido desoxirribonucleico de elevado peso molecular. No final foram obtidas 765 g de produto ( rendimento de 95,6% ). 25

Exemplo 8

Preparação das novas substâncias por despolimerizacão em solução tampão de acetato de sódio/ácido acético ( preparação Ρ0097.ΕΠ

Foram dissolvidas 50 g de ácidos nucleicos de peso molecular elevado a uma temperatura de 70°C em 1 1 de água. Adicionou--se 80 g de CH3C00Na.3H20 e em seguida 190 ml de CH3C00H a 80% (pH final 4,1) ( concentração do polímero : 4% p/v; molaridade do acetato de sódio : 0,5 M ). A solução resultante foi aquecida até 70°C durante 24 horas. Foi efectuado o arrefecimento, a temperatura foi diminuída para 30°C e depois foi seguido o processo descrito no anterior exemplo 6. Foram obtidas 33,5 g de produto (rendimento de 67%). Análise ( numa base de peso seco ) : peso molecular 8 100, h 5,3, A+T/G+C 1,037, A+G/T+C 0,865, espectro de rotação +32,5°.

Exemplo 9

Preparação das novas substâncias por despolimerizacão em tampão acruoso de acetato de sódio/ácido acético ( preparação ΡΟΡ97.ΜΪ

Foram processadas 50 g de ácidos nucleicos de peso molecular elevado como referido no exeplo 8, enquanto que o tempo de despolimerização foi em vez disso reduzido para 16 horas e a precipitação foi feita por adição de 2 volumes de etanol. Foram rcuperadas 35,5 g ( rendimento de 71 % ). Análise ( numa base de peso seco ) : peso molecular 6 200, h 1,0, A+T/G+C 1,167, A+G/T+C 0,830, espectro de rotação + 30,9°.

Exemplo 10

Preparação dos oliaonucleotídeos por despolimerizacão tampão aquoso de acetato de sódio/ácido acético ( preparação P0123.B)

Foram dissolvidas 100 g de ácidos nucleicos de peso molecular elevado em 660 ml de H20. A dissolução foi depois efectuada com um aquecimento moderado. Foram adicionados por ordem 53,5 g de CH3COONa.3H20 e 127 ml de ácido acético a 80 %. O pH final era 4,1 e a concentração do polímero 12,7% p/v ( molari-dade do sal 0,5 M ). A solução resultante foi depois aquecida a 65°C durante 16 horas e depois tratada como descrito no exemplo 6. Foi obtido 78,6 g de produto. Análise ( numa base de peso seco ) : peso molecular . 9 400, h 6,4, A+T/G+C 1,174, A+G/T+C 0,941, espectro de rotação + 38,9°. 27

Exemplo 11

Preparação dos oliqonucleotídeos por despolimerização em tampão aauoso de ácido acético/acetato de sódio ( preparação P0123.H)

Foram processados 100 g de ácidos nucleicos de peso molecular elevado como descrito no exemplo 10. O tempo de despo-limerização foi fixado em 22 horas. Foi obtido 85,9 g. Análise (uma base de peso seco) : peso molecular 7 000, h 1,9, A+T/G+C 1,305, A+G/T+C 0,875, espectro de rotação + 35,4°.

Exemplo 12

Preparação dos oliqonucleotídeos de acordo com o invento por despolimerizacão enzimática de ácidos desoxirribonu-cleicos de elevado peso molecular por desoxirribonuclease (preparações P0102.A e P0102.B)

Foram dissolvidas 10 g do sal de sódio de ácidos nucleicos de peso molecular elevado em 1 1 de tampão fosfato 0,1 M de pH 7 e MgCl2 10 mM. À solução viscosa final, opalescente foram adicionados 3,67 g de desoxirribonuclease impura. A enzimólise foi efectuada a 37°C durante 24 horas. No final, o volume da solução estava reduzido a 1/5 do inicial por ultrafiltração numa membrana com uma selectividade de 10 000 daltons. Foi recolhido 0,8 1 de produtos de permeação. \ 28 0 concentrado ( produto de retenção ) foi dessalinizado por diãlise a volume constante contra 1 1 de água e precipitado por adição de 22 g de tri-hidrato de acetato de sódio ( 0,8 M ) seguido por 1,5 volumes de etanol.

Foram obtidas 4,88 g ( rendimento de 49% ) da preparação P0102.A.

Os produtos de permeação dos passos de ultrafiltração e dessalinização anteriormente referidos foram unidos e concentrados até 1\5 do volume inicial por ultrafiltração numa membrana com uma selectividade de 3 000 daltons. A solução foi depois dessalinizada por diálise a volume constante contra 5 volumes de água e liofilizada.

Foram obtidas 24,7 g ( rendimento de 25% ) da preparação PO102.B.

Exemplo 13

Preparação dos olicronucleotídeos por despolimerizacão enzimática com desoxirribonuclease de ácidos desoxirribonucleicos de peso molecular elevado ( preparações 0186/91220.A e 0186/91220.B )

Foram dissolvidas 5,5 g de sal de sódio de ácidos desoxirribonucleicos de peso molecular elevado em 1 1 de tampão fosfato 0,1 M de pH 7 contendo MgCl 10 mM. Foi depois seguido o processo do anterior exemplo 12. A partir da solução de produtos de retenção foram obtidas 1,14 g ( rendimento de 20,7% ) de composto ( 0186/91220.A ) com as seguintes características analíticas ( valores na base de um peso ãeco ) : peso molecular 5 000, h 5,4, A+T/G+C 1,266, A+G/T+C 1,106, espectro de rotação + 39,1°. A partir da solução de produtos de retenção foram obtidas 2,20 g ( rendimento de 40% ) de composto ( 0186/91220.B ) com as seguintes características analíticas ( valores na base de um peso seco ) : peso molecular 4 600, h 0,8, A+T/G+C 1,168, A+G/T+C 1,087, espectro de rotação + 37,4°.

Exemplo 14

Preparação dos olicronucleotídeos por despolimerizacão enzimática de ácidos desoxirribonucleicos de peso molecular elevado ( preparação 0186/91217

Foram dissolvidas 11 g de ácidos desoxirribonucleicos de peso molecular elevado em 1 1 do tampão referido no exemplo anterior. Foi utilizada desoxirribonuclease de acordo com o processo do processo do exemplo anterior. O volume da solução foi depois reduzido para 1/5 do inicial por ultrafiltração com uma membrana de 3 000 daltons. Depois da dessalinização dos produtos de retenção por diãlise a volume constante contra 5 volumes de água destilada, a solução foi salinizada e precipitada como descrito no exemplo 12, para a preparação PO102.A. No final foram obtidas 8,25 g ( rendimento de 75% ) de um produto com as seguintes características analíticas ( os valores são dados na base de um peso seco ) : peso molecular 5 600, h 5,8, A+T/G+C 1,140, A+G/T+C 1,010, espectro de rotação + 41,5°. ♦ ♦

Exemplo 15

Método usado para se obter P0067.D V A 68 1 dos líquidos- mãe da precipitação de polideso-xirribonucleotídeos obtidos por despolimerização de ácidos desoxirribonucleicos de peso molecular elevado ( preparação de desfibrotídeo lote ns 73 ) de acordo com o método revelado em WO/87/06235 e contendo ainda uma quantidade teórica de 1250 g de ácidos desoxirribonucleicos, 1 parte de solução tampão aquoso de acetato e 1,5 partes de etanol, foram adicionados 13,6 1 ( 0,5 partes ) do mesmo solvente orgânico. O produto assim precipitado pesava 36,4 g.

Exemplo 16

Separação do composto da preparação P0067.D IV

Foram tratados como no exemplo 15, 68 1 dos líquidos- mãe da precipitação de polidesoxirribonucleotídeos obtidos por despolimerização de ácidos desoxirribonucleicos de peso molecular elevado ( preparação de desfibrotídeo lote ne 72 ) de acordo com o método revelado em WO/87/06235 e contendo ainda uma quantidade teórica de 1250 g de ácidos desoxirribonucleicos. Foram obtidas 34,8 g da preparação P0067.D com as seguintes características analíticas ( valores dados na base de um peso seco ) : peso molecular 6 100, h 0, A+T/G+C 1,508, A+G/T+C 0,917, espectro de rotação + 35,9°.

Exemplo 17

Composição farmacêutica para uso parentérico Amostras seladas oligodesoxirribonucleotídeos 250 mg di-hidrato de citrato trissódico 25 mg p.hidroxibenzoato metílico 3,13 mg p.hidroxibenzoato propílico 0,62 mg água destilada 2,5 ml

Exemplo 18

Composição farmacêutica para uso oral Cápsulas de gelatina dura oligodesoxirribonucleotídeos lactose dióxido de silício coloidal estearato de magnésio

Lisboa, 350 mg 56,75 mg 0,7 mg 3 mg

7 de Dezembro de 1992 r

J. PEREIRA DA CRUZ

Agente Oficiai da Propriedade Industriai RUA VICTOR CORDON, 10-A 3“ 1200 LISBOA

Claims

REIVINDICAÇÕES ia. - Oligodesoxiribonucleotídeos de origem natural, caracterizados por apresentarem os seguintes parâmetros analíticos: peso molecular de 4 000 a 10 000, h < 10, A+T/C+G de 1,100 a 1,455, A+T/C+G de 0,800 a 1,160, rotação específica de +30° a +48°.
23. Processo para a obtenção dos oligodesoxiribonucleotídeos de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de os referidos compostos serem obtidos por precipitação, passo a passo, a 20°C, a partir de soluções aquosas em acetato de sódio 0,8 M de sais de sódio de polidesoxirribonucleotídeo, por adição de um álcool alquílico inferior. 3a. processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto do referido álcool alquílico inferior ser escolhido no grupo de entre álcool etílico, propílico e isopropí-lico. 4â. Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto do referido álcool alquílico inferior ser álcool etílico.
53. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto da quantidade de sal de sódio de polidesoxirribonucleotídeo ser de 4% p/v.
63. Processo de acordo com as reivindicações 2 e 5, caracterizado pelo facto do sal de sódio de 2

polidesoxirribonucleotídeo ter um peso molecular no intervalo de 15 000 a 75 000 daltons. 7a. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracte-rizado pelo facto do polidesoxirribonucleotídeo ser desfibrotí-deo.
88. Processo de acordo com as anteriores reivindicações 2 a 7, caracterizado pelo facto de compreender os passos seguintes: a. Adição de 0,8 volumes de álcool à solução de acetato de sódio 0,8 M contendo 4% p/v de polide-soxirribonucleotídeos. b. Adição posterior à referida solução hidroãlcoolica de ma is álcool com o fim de obter no conjunto 1 volume de fase orgânica/volume de fase aquosa inicial e remoção subsequente da camada sobrena-dante com recuperação do precipitado formado. c. Mistura da camada sobrenadante do passo anterior b com uma quantidade adicional de álcool de modo a obter 2 volumes de álcool/volume da solução tampão inicial de acetato de sódio aquoso 0,8 M do passo a e recuperação da substância que em tais condições se separou. d. Solução do precipitado obtido no passo b em acetato de sódio 0,8 M, adição de 1 volume de álcool/volume de solução aquosa, remoção do precipitado formado por centrifugação, mistura da solução hidroalcoólica obtida com álcool até um 3

total de 2 volumes de álcool/volume da fase aquosa e recuperação do precipitado. 9a. Processo de acordo com as reivindicações 2a 7, caracterizado pelo facto de ser efectuada uma precipitação intermédia por adição à solução inicial de polidesoxirribonucleo-tídeo de 1 volume de álcool e a camada sobrenadante ser poste-riormente adicionada de 1 volume de álcool obtendo-se assim a precipitação dos polímeros. 10^. Processo para a obtenção dos compostos de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de ser efectuado por despolimerização por aquecimento dos sais de sódio de ácidos desoxirribonucleicos de peso molecular elevado num tampão aquoso de ácido acético/acetato de sódio 0,5 M de pH 4,1. 11â. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de ser realizado a uma temperatura variando de 65°C a 75°C durante um tempo de pelo menos 6 horas, dependendo do peso molecular do ácido nucleico inicial. 12§. Processo de acordo com as reivindicações 10 a 11, caracterizado pelo facto da despolimerização ser efectuada até o peso molecular se encontrar entre 4 000 e 10 000 daltons. 13â. Processo de acordo com as reivindicações 10 a 12, caracterizado pelo facto da concentração do ácido desoxirribonu-cleico no referido tampão de acetato de sódio 0,5 M ser de 4% p/v ou, por outro lado, de cerca de 12% p/v. 14s. Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto da concentração do ácido desoxiribonucleico ser de cerca de 12% p/v. 4
153. Processo de acordo com as reivindicações 10 a 12, caracterizado pelo facto de compreender os passos seguintes: a. Dissolução de ácidos desoxirribonucleicos de elevado peso molecular e adição subsequente de tri-hidrato de acetato de sódio + ácido acético concentrado (80%) para dar a molaridade e o pH necessários do tampão. b. Aquecimento da solução aquosa obtida no passo anterior a a uma temperatura variando de 65°C a 75°C durante um tempo de pelo menos 6 horas. c. Diminuição no fim do tratamento de aquecimento da temperatura para 30°C, correcção do pH para 7,8 a 8,0 com NaOH a 30% e depois aquecimento outra vez a 85°C durante 90 minutos. d. Arrefecimento da solução até â temperatura ambiente, correcção do pH para 6,5 com ácido acético concentrado e precipitação dos oligodesoxirribonu-cleotídeos por adição de etanol numa razão variando entre 1,5 e 2 volumes/ volume de solução aquosa.
163. Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo facto do tempo de aquecimento a uma temperatura variando entre 65°C e 75°C ser inferior a 10 horas. 173. processo para se obter os oligodesoxiribonucleotí-deos de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de compreender uma despolimerização enzimática de ácidos desoxirribonucleicos de elevado peso molecular pelo uso de 5

desoxirribonuclease com o subsequente passò''de ultrafiltração para concentrar a solução. 18a. Processo de acordo com a reivindicação 17, carac-terizado pelo facto da enzimólise com desoxirribonuclease ser efectuada em soluções a 1% p/v de ácido nucleico de elevado peso molecular durante um tempo de 24 horas, em tampão fosfato 0,1 M com pH 7, na presença de cloreto de magnésio 10 mM.
192. Processo de acordo com as reivindicações 17 a 18, caracterizado pelo facto da concentração por ultrafiltração ser efectuada de acordo com os passos seguintes: a. Ultrafiltração da solução a partir de enzimólise (produto de retenção) numa membrana tendo uma selectividade de 10 000 até o volume da solução ser 1/5 do inicial. b. Dessalinização da solução de produto de retenção por diálise desta solução a volume constante contra 5 volumes de água destilada. c. Concentração dos produtos de permeação reunidos recolhidos a partir dos passos anteriores a e b até 1/5 do volume inicial por ultrafiltração numa membrana com uma selectividade de 3 000 daltons. d. Recuperação do soluto das soluções concentradas dos produtos de retenção obtidos respectivamente a partir da primeira (passo a) e da segunda ultra-filtração ( passo c). 6 6
203. Processo de acordo com as reivindicações 17 a 18, caracterizado pelo facto da concentração da solução ser efectuada de acordo com os passos seguintes: a. Ultrafiltração numa membrana tendo uma selectivi-dade de 3 000 daltons até o volume de produto de retenção ser 1/5 do inicial. b. Dessalinização da solução de produto de retenção por diálise a volume constante contra 5 volumes de água destilada. c. Recuperação do soluto a partir do produto de retenção.
213. Processo de acordo com as reivindicações 19 a 20, caracterizado pelo facto da recuperação do soluto ser efectuada por precipitação, por salinização prévia da solução até uma concentração de sal de 0,8 M e depois adição de 1,5 volumes de etanol.
223. Processo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo facto do sal adicionado ser acetato de sódio.
233. Processo de acordo com as reivindicações 2 a 9, 10 a 16, 17 a 22 caracterizado pelo facto do produto ser obtido a partir do precipitado por desidratação, trituração e secagem.
243. Oligodesoxirribonucleotídeos de acordo com a reivindicação 1, caracterizados pelo facto de serem utilizados como medicamentos. 7 CN \ 2 5â. Utilização dos oligodesoxirribonucleotídeos de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por os referidos oligodesoxirribonuclotídeos serem empregues na preparação de drogas tendo actividade anti-isquémica. 26a. Utilização dos oligodesoxiribonucleotídeos de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por os referidos oligodesoxirribonuclotídeos serem empregues na preparação de drogas para a terapia de estados de isquemia cardíaca. 27a. Composições farmacêuticas, caracterizadas pelo facto de conterem como princípio activo os oligodesoxirribonucleotídeos de acordo com a reivindicação 1, juntamente com os veículos e excipientes usuais, preparados em formas adequadas para administração parentérica e oral. 28g. Composição farmacêutica para uso parentérico de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo facto de conter os oligodesoxiribonucleotídeos numa quantidade variando de 40 a 160 mg/ml. 29S. Composições farmacêuticas de acordo com a reivindicação 28, caracterizadas pelo facto da quantidade do princípio activo estar compreendida entre 80 e 160 mg/ml. 30§. Composição farmacêutica para uso oral de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo facto de conter uma quantidade do princípio activo, para dose única, variando de 200 a 1500 mg/ml. Lisboa, 7 de Dezembro de 1992

J- PEREIRA DA CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 10-A 3« 1200 USBOA