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Substances à activité biologique.
La présente invention concerne des antiques capables de conférer l'immunité contre la brucellose et des procédés per- fectionnés pour préparer ces antigènes.
. Les organismes qui provoquent la brucellose sont des bacilles Gram négatif. Les espèces reconnues comme provoquant la maladie sont au nombre de trois. En 1886, Bruce a isolé la Brucella melitensis et démontré qu'elle est l'agent provoquant la fièvre de Malte contractée en buvant du lait de chèvre - conta- miné par ces bacilles. On sait que Brucella abortus,caractérisée par Bang en 1897,est responsable de l'avortement epizootique.
Brucella suis identifiée par,Traum en 1914 a été isolée lors d'un avortement chez la truie.
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Il est extrêmement difficile et compliqué de combattre . la brucellose. La maladie se répand rapidement parmi le bétail et atteint secondairement l'homme par contact direct à travers la peau ou les muqueuses du tube digestif. On attribue beaucoup de valeur au test d'agglutination pour la mise en évidence de la maladie et la destruction des animaux malades. En résumé, l'agglutination est déterminée en mélangeant le sérum essayé , préparé à diverses dilutions successives,(provenant d'un animal non vacciné) avec une suspension témoin de Brucella tuées. Les mélanges sont mis à incuber à 37 ou 56 C pendant plusieurs heures. On titre de 1:100 incite nettement à conclure à l'infection par Brucella.
Du fait qu'il n'existe pas de procédé connu de prophy- laxie caimique contre la brucellose, la vaccination des animaux reste le moyen le plus intéressât pour comhattre la maladie. Les travaux en ce sens ont été poursuivis sans interruption au cours des trente dernières années, le but principal des chercheurs étant la préparat n d'un antigène relativement non toxique et exempt d'agglutinogène, capable de conférer l'immunité à l'égard de la brucellose. Toutefois, presque tous les vaccins contre la brucellose connus à ce jour présentent l'un ou l'autre inconvénient,dont chacun est suffisamment gênant pour qu'aucun de ces vaccins ne puisse être compté au nombre des agents immunisants idéaux.
Le vaccin le plus efficace connu à ce jour contre la brucellose du point de vue d'une faible virulence et d'un pouvoir antigénique élevé est le vaccin Buck-19 identifié au"Departement of Agriculture "des Etats-Unis comme étant la souche 19. Ce vaccin est efficace pour éviter l'avortement.et les mises bas prématu- rées. Toutefois, ce vaccin n'a pas permis de faire de l'avortement épizootique une maladie peu importante du bétail. Les titres appelés "titres persistantsn (titres d'agglutination) qui résultent,de ce procédé d'immunisation sont la source de beaucoup d'incertitu- des diagnostiques et épidémiologiques rendant très difficile le
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traitement du bétail infecté.
En outre, les animaux récemment vaccinés deviennent des porteurs temporaires de la bactérie et ne sont pendant cette période pas discernables des animaux infectés.
Idéalement,pourobtenirunagentd'immunisation qui soit susceptible de satisfaire à des normes sévères de vérification et qui ait un pouvoir antigénique optimum et,simultanément,très peu de virulence et de toxicité, il faut isoler de la Brucella un agent sensible- ment pur et facile à identifier. En outre, l'isolement de l'agent doit être exécuté par des moyens relativement simples,qui peuvent être reproduits facilement par d'autres expérimentateurs.
Westphal et ses collaborateurs .Naturf. 7b, 14b-155 (1952)¯7 décrivent un procédé d'extraction d'antigènes de bactéries à Gram négatif en utilisant du phénol. Un procédé est celui appelé extraction par le phénol "à ohaud",suivant lequel les organismes sont soumis à une extraction entre une p@@se aqueuse saturée de phénol et une phase de phénol saturée d'eau, en utilisant des concentrations élevées en phénol et en exécutant l'extraction à des températures élevées. Ce procédé n'est pas tout à fait satisfaisant,parce qu'il est apparu que des antigènes spécifiques de l'espèce ne peuvent être obtenus par ce moyen.
La phase aqueuse saturée de phénol donne une fraction de lipopolysaccharide oomprenant des quantités sensibles d'acides nucléiques (jusqu'à 50% dans certains cas),mais ne se distingue,en outre,pas par un pouvoir antigénique élevé. La protéine qui peut Etre obtenue à partir de la phase phénolique a un certain effet comme agglutinogène, qui peut toutefois être attribué principalement aux résidus d'agent lipidique combiné avec les résidus de sucre.
Un autre procédé est celui appelé extraction par le phénol "à froid", suivant lequel les organismes sont soumis à une extraction par le phénol aqueux à basse température . Les antigè- nes obtenue ainsi,qui sont extraits de la phase aqueuse saturée de phénol,ont un poids moléoulaire élevé ,des constantes de sédimentation relativement élevées (environ 175 à 200 Svedberg), provo-
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quent la formation d'agglutinines spécifiques et aont extrêmement pyrogènes, c'est-à-dire susceptibles de provoquer la fièvre. Par exemple, la dose pyrogène,observée chez la souris,pour ces anti- gènes est d'environ 0,002 microgramme/kg de poids du corps.
Ces antigènes sont également très toxiques, par exemple l'antigène extrait par ce procédé à partir de Proteus WA 68, injecté par voie intrapéritonéale à des souris,a une LD50 de 5 à 10 mg/kg de poids du corps.
De façon générale, le procédé d'extraction par le phénol à froid consiste à soumettre des bactéries à une extraction à l'aide d'un mélange de phénol et l'eau à basse, température , et à préoi- piter la fraction antigénique de la phase aqueuse saturée de phénol en utilisant de l'alcool ou un mélange d'acétone et d'alcool. La séparation entre la phase aqueuse supérieure et la phase phénolique inférieure après l'extraction est exécutée facilement par oentri- fugation. Il est souvent avantageux de mélanger la couche phénolique avec un supplément d'eau, de séparer de nouveau les phases et de réunir la seconde fraction aqueuse avec la première.
Pour une nou- velle purification, le phénol et les constituants de bas poids moléculaire peuvent être séparés des fractions aqueuses par des pro- cédée comme la dialyse en présence d'eau, l'ultracentrifugation, l'adsorption (par exemple sur du Sephadex) etc. Avant la précipita- tion de l'antigène par addition d'alcool, le volume des fractions aqueuses est ramené à environ un tiers ou la moitié du volume initial.
La concentration du phénol dans le mélange de phénol et d'eau peut varier quelque peu, du fait qu'il est nécessaire d'obtenir firent un système à deux phases,dont ohaoune est parfaitement saturée de l'autre. A cette fin, on peut prendre des volumes égaux de phénol et d'eau, ce dernier à une concentration d'environ 70 à 95%. La Concentration finale en phénol préférée est d'environ 75%.
La température utilisée pendant l'extraction est de préférence main- tenue aussi basse que possible sans provoquer la cristallisation. Ainsi, il convient de travailler à une température d'environ 1 à 5 C et de
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préférence d'environ 2 C. Comme allanol inférieur pour la préoipitation de l'antigène, on préfère l'éthanol, bien qu'on puisse utiliser d'autres alcools de bas poids moléculaire, comme le méthanol, le propanol, l'isopropanol ou le butanol. Des mélanges d'alkanola inférieurs et d'alkanones inférieures comme l'acétone, conviennent également à cette fin. L'addition d'une petite quantité d'acétate de sodium est également favorable pour achever l'extraction.
La Demanderesse a découvert, à présent, qu'un procédé modifié d'extraction par le phénol à froid permet d'obtenir de nouveaux agents antigéniques qui sont des substances sensiblement pures ayant des propriétés physiques et chimiques discernables, qui sont capables de provoquer l'immunité contre la bruoellose sans faire apparaître de titres contradictoires après administration, c'est-à-dire qui sont en substance pas des agglutinogènes et qui sont, en outre, sensiblement non toxiques et non pyrogènes (dose provoquant la fièvre chez la souris. ) 1,0 microgramme/kg de poids du corps).
Jusqu'à présent, une cu plusieurs de ces propriétés manquaient ux antigènes extraits de bactéries à l'aide de phénol. Les nouveaux antigènes suivant l'invention peuvent être obtenus (1) en utilisant des organismes de l'espèce Brucella oomme source d'untigène et (2) en soumettant la phase aqueuse saturée de phénol à une précipitation fractionnée par un alkanol inférieur refroidi (1 à 5 C) mais (3) sans qu'il soit néoessaire de concentrer les fractions aqueuses avant la précipitation fractionnée. L'alkanol est ajouté,de préférence,à raison de 1 à 4 parties en volume, et le précipité formé est séparé .
Ensuite, une seconde quantité d'alkanol, représentant de préférence 1 à 4 parties en volume, est ajoutée au liquide surnageant pour donner un précipité qui est la nouvelle fraction antigénique. Le nouvel immunogène suivant l'invention est désigné ci-après par le symbole A12. Une autre lettre, par exemple S ou U, est utilisée pour différencier 1'immunogène extrait d'une variété particulière de Brucella..
Comme Brucella source de l'antigène, on peut utiliser aveo avantage Brucella abortus, Brucella melitenaia et Brucella suis
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mais on préfère 3ruoe.l. abortus.Entrent aussi dans le cadre de l'invention les souahes,vrisuts et mutants des Bruoella ci-dessus qui peuvent être soumis au procédé suivant l'invention pour donner des agents ayant une activité antigénique. Sous ce rapport, les mutants sont particulièrement importants. Ceux-ci peuvent être obtenus soue l'effet d'un agent tel que la chaleur, le rayonnement ultraviolet
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ou.,probablement,J.U1 rayonnement de haute énergie.
De même, des mu- tants peuvent être obtenus en cultivant des Brucella dans un milieu (milieu nitritif) qui, du fait de sa constitution,supprime la crois.- .
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sanca des 3ucella normales,mais induit la formation et la croissauce des mutants.Un de ces mutants est appelé forme MR de Brucella abortus, souche Schaedtbeeke qu'on nonme aussi LM 61, et donne l'antigène A12U suivant l'invention.
Ce mutant est obtenu en coul-
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tivant j.,ri;ccii= "bOl'tI19. rcvan: nt des arrière faix infectés d'une vache sur un milieu d'agar à l'albumine et a déjà été décrit (T}èse doctorat Karl.Ernst von Milozewski, Université de Kiel, Répu- blique Fédérale Allemande, 1960). Ce mutant est facile à reconnaître
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des souohes et formes connues de Erucella abortus par ses oaracté- ristiques d,- morphologie et de culture qui sont: (1) Résistance à la fuchsine acide, à la thionine et à la pyronine; formation d'uréase, nuance à la colora-
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tion: comme la forme S de Brucella'abortue Type 1.
(2) Colonies du consistance muqueuse visqueuse; diamè- tre 2,10 mm. Bord: jaune, granuleux. Centre: jaune rougeâtre, très convexe.
(3) Aspect microscopique: le frottis d'une culture sur agar tryptose de quatre jours présente des bâtonnets courts qui tendent à former des chaînes (au contrai- re des cultures de la forme S d'origine.
(4) Formation rapide et abondante d'hydrogène sulfuré.
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(5) Agglutination de la Trypafiavine, granules fins.
(6) sérum physiologique: instable.
(7) Caractère sérologiques susceptible d'être distingué de la forme S Brucella abortus par l'inaptitude à
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l'agglutination, c'est-à-dire par le fait que l'agglu- tination par le sérum abortus Bang spécifique n'a pas lieu. Des animaux de laboratoires soumis à un traite- ment préliminaire par LM 61 ne forment pas d'anti- corps agglutinants pour les antigènes S mais forment de tels anticorps pour la souche elle-même.
(8) La souche est apathogène pour les animaux d'essai.
(9) Agglutination rapide du sérums négative.
Pour la caractérisations un inoculum du mutant est introduit dans de l'agar Tryptose (1,6% d'agar, 2% de tryptose Difoo, pH 6,7) à l'aide d'un fil de verre,puis l'ensemble est mis à inouber pendant quatre jours à 37 C. La morphologie des colonies est déterminée par examen au microscope binoculaire au grossissement douze. L'agglutination de la Trypaflavine se fait par le procédé de Braun & Bonnestel [Am. J. Veto Res., @, 3u6 (1947)J. L'agglutination est rapide avec une dilution 1:10 d'antisérum agglutinant de Brucella. On utilise comme diluant une solution physiologique tamponnée au borate (O,lM, pH 8,0).
Le mélange de suspension bacté- rienne et de dilution de sérum est examiné au microscope sur une lame porte-objet après trois minutes pour établir l'agglutination. L'agglutination par le sel est exécutée également (sur la lame porteobjet) à l'aide de sérum physiologique à 0,9%. En appliquant le procédé de coloration de Hansen, on détermine la morphologie des cellules à l'aide d'un microscope à contraste de phase au grossissement de 900.
La Brucella abortus souche Sohaedtbeok, forme MR est obtenue à partir d'une culture de Brucella abortus, souche Schaedtbeck .forme R après trente 'jours d'incubation à 37 C dans le Tryptose forcé comme seul dissociant. Le milieu au Tryptose a la composition suivante; Tryptose 1,5%, glucose 0,5%, chlorure de sodium 0,5%, chlorhydrate de thiamine 0,5 mg%, pH ajusté à 6,7 par de l'acide phosphorique.
Le mutant de forme MR diffère de la forme R d'origine du fait que celle-ci a les caractéristiques de:morphologie et de culture suivantes:
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(1) Colonies, après 4 jours dans l'agur Tryptose: petites; diamètre de 1,70 mm; bord jaune et granulaire; centre jaune rougeâtre; consistance granulaire à collante.
(2) Agglutination par la Trypaflavine: granules (3) Chlorure de sodium: instable (4) Agglutination rapide du sérum: négative.
(5) Coloration de Hansen: cellules ovales, tendent à former de longues chaînes.
Le mutant diffère également de Brucella abortus, souche 19, forme S du fait que cette dernière a les caractéristiques de morpho- logie et de culture ci-après lorsqu'elle est mise en culture dans le milieu utilisé pour la forme R (ci-dessus), ce qui identifie la forme MR.
(1) Colonies après 4 jours dans l'agar Tryptose, petites; diamètre de 1,4 à 1,6 mm; bord bleu verdâtre; centre légèrement jaune rougeâtre; consistance butyreuse déliquescente.
(2) Chlorure de sodium: stable.
(3) Agglutination par la Trypaflavine: négative.
(4) Agglutination rapide du sérum: rapide et positive.
(5) Coloration de Hansen; cellules morphologiquement uniformes, rondes, séparées ou en chaînes courtes.
Il convient donc de noter en résumé qu'entrent dans le cadre de la présente inventiondes procédés de production d'antigènes à partir de diverses espèces de Brucella, ainsi que leurs souches connues,variants et mutants. L'invention a également pour objet les antigènes utiles obtenus par ces procédés et plus particulièrement les agents antigéniques non obtenus jusqu'à présent qui ont un intérêt spécial oomme agents d'immunisation contre la bruoellose. Ces antigènes entrent dans le cadre de l'invention et seront davantage décrits ci-après.
Il n'existe aucun principe digne de foi permettant d'éta- blir une corrélation entre le titre d'agglutinines et le degré d'immu- nité acquis par immunisation contre la brucellose. A la connaissance
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de la Demanderesse, les caractéristiques comme agglutinogènes des vaccins contre la brucellose ne sont pas identiques aux caractéristiques d'immunité. Par conséquent, on est porté à croire que des animaux peuvent être immunisés contre la brucellose sans formation simul- tanée d'agglutinines. En fait, la formation des agglutinines peut être considérée comme une réaction secondaire indésirable,qui peut être évitée.
Il en est ainsi (1) parce que les antigènes agglutinogènes et les antigènes immunisants sont distincts les uns des autres, ou bien (2) parce que les antigènes agglutinogènes et les antigènes immunisants sont combinés dans une seule et même molécule complexe d'antigène, mais comportent aes groupements carac- téristiques différents. La difficulté est résolue par la préparation d'antigènes purifiés,en vue de la séparation des agglutinogènes et des immunogènes. Ainsi, il convient de séparer un antigène immunisant purifié de Brucella abortus qui est sensiblement non agglutinogène et non toxique et qui peut être utilisé comme agent prophylactique pour la maladie.
EXTRACTION ET ISOLEMENT DE .L'ANTIGENE Al
Pour la préparation des antigènes, on utilise une souche virulente de Brucella abortus, à savoir la souche Schaedtbeck forme S. Les bactéries sont mises en culture pendant 48 heures de la façon suivante,sur de l'agar à l'extrait de foie. On dissèque et on découpe en morceaux 1 kg de foie. On ajoute 1 litre d'eau au foie et on chauffe le mélange pendant 2 heures à l'autoclave.
Le liquide surnageant est décanté et stérilisé par chauffage à l'autoclave à trois reprises à 1 jour d'intervalle. Par aliquotes de 150 cm3 du bouillon obtenu, on ajoute 45 g d'agar Merck Standard-1.
Le produit final est additionné d'eau en quantité suffisante pour porter son volume à 1 litre.
Les cellules cultivées sur l'agar au foie décrit ci- dessus sont recueillies par lavage à l'aide d'une solution physiologique au phénol (0,5 de phénol, 0,85 de chlorare de sodium) et sédimentées par centrifugation. Les cellules sont lavées deux
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fois avec du sérum physiologique, remises en suspension et filtrées sur un filtre G2 (Fritte G2) pour éliminer les particules gros- sières de la suspension de bactéries. La suspension est versée dans de l'acétone, puis les cellules sont sédimentées par centri- fugation et séchées sous pression réduite, après avoir été lavées plusieurs fois avec de l'acétone.
On met 2 à 3 g des bactéries séchées dans l'acétone en suspension dans 80 cm3 d'au distillée et on les refroidit à une température de 2 C. La suspension est additionnée de 130 cm3 d'un mélange à 75% de phénol et d'eau (100 g de phénol + 32 cm3 d'eau) refroidi au préalable à +3 C. Le mélange est agité soi- gneusement et conservé aufroid pendant 20 à 30 minutes en étant agité de temps à autre. Les deux phases de la suspension phénol/ eau sont Séparéespar centrifugation. La phase aqueuse surnageante est décantée. Environ 60 cm3 d'eau sont ajoutés à la couche phéno- lique et au sédiment subsistant,qui sont centrifugés après vive agitation. Les deux couches-aqueuses sont réunies. Elles consti- tuent la fraction A.
La phase aqueuse de l'extraction par le phénol (frac- tion A) est dialysée pendant 3 jours en présence d'eau de distri- bution et pendant 1 jour en présence d'eau distillée. La fraction A est ramenée à un volume de 30 à 40 cm3 par distillation sous vide à environ 30 C. La solution obtenue est faiblement opalescente.
La solution est souwise à une centrifugation à grande vitesse. De l'éthanol refroidi est ajouté en quantité suffisante au liquide surnageant pour que la concentration finale en alcool soit de 70% . On précipité qui se forme alors est identifié comme étant la frac- tion A1 (antigène A1). Cette fraction est sédimentée par centri- fugation, lavée avec de l'éthanol, de l'acétone et de l'éther, puis séchée sous pression réduits pour donner une quantité de matière correspondant à environ 2 des bactéries séchées.
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CARACTERISATION DE L'ANTIGENE A1
L'antigène A1 est une poudra brun grisâtre relativement bien soluble dans l'eau. Il donne les réactions suivantes!
Réaction de Molisch pour les hydratas de carbone: +
Réaction à la xanthoprotéina pour les aminoacides contenant des radicaux aromatiques: +
Réaction de Biuret pour les protéines et poly- peptides: + Par ultracentrifugation, l'antigène Ai accuse une distribution uniforme et un gradient précis. L'analyse spectrale dans l'utraviolet permet de conclure à l'absence d'une bande d'absorption à 260 m/u caractéristique des acides nucléiques. Cette substance est donc exempte d'acides nucléiques et peut être considérée comme
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étant une glycolipoprotéina relativement pure.
L'hydrolyse d'une quantité mesurée de l'antigène A1 par du ùCl-N à 100 C pendant
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1 heure, suivie de l'é11rnLation des protéines par de l'acide métaphosphorique à 10;1,pe;>met d-lestiuier la teneur en sucre dans le liquide surnageant par le procédé à l'anthrone et à l'acide sulfurique. L'analyse,en se basant sur une courbe d'étalonnage établie
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pour du glucose p2r,perat ie conclure à un polysaccharide d'une teneur de 21,5 à 24,8p dwoiiît6s glttc(.-3fJ On conserve 50 mg d'antigène A, pendant 4 heures dans 25 em3 d'acide sulfurique N à .0 C.
Le produit hydrolyse est neutralisé par de l'hyùruxyde de baryum pourprécipiter l'acide sulfurique et le sucre phosphorylé. Le produit d'hydrolyse neutralisé est soumis à la centrifugation pili31e volume de la phase surnageante est recuit a environ 2N du volume du mélanGe de départ et soumis à une séparation chromatographique. On identifie les résidus de sucre suivants: galactose, glucose, mannose, xylose,
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sucres aminés (mis en évidence par le réactif d'glson1organ).
La présence des lipides dans l'antigène A1 s'établit par coloration à l'aide de noir Soudan. L'essai est exécuté de la façon suivante: L'antigène est mis en suspension à raison de 1% dans une solution de phosphate disodique à 0,5%. Des aliquotes de
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la suspension correspondant à 20, 50 et 100 microgrammes du composé sont déposées sur des rubans de papier filtre. On obtient une série de taches. Les rubans de papier filtre sont Immergés pendant 3 heures dans une solution éthanolique de noir Soudan (solution chaude contenant 60 d'éthanol, saturée de ncir Soudan B et filtrée).
Après coloration, les rubans de papier filtre sont lavés deux fois pendant 15 minutes avec de l'éthanol à 50. La coloration noirâtre ou noir brûnatre des taches indique la présence de lipides. Dans cet essai, l'antigène A1 donne une réaction + + +.
PROPRIETES IMMUNOGENES DE L'ANTIGENE A1
L'antigène A1 est comparé avec des brucellas séchées dans l'acétone pour établir sor. aptitude à renforcer l'immunité existante contre Brucella. abortus. Po@r provoquer l'immunité primaire, des souris CFW reçoivent une injection unique d'un vaccin dépôt efficace (concentration : 2,5 x 109 Brucella abortus tuées, forme MR, adsorbées sur 10 mg de A12O3 en suspension dans 1 cm3 d'eau distillée. La seconde injection est alors faite à l'aide de la solution ou de la suspension d'antigène A1, ou à l'aide de la solution physiologique de brucellas séchées dans l'acétone.
Pour les deux antigènes à. essayer et pour l'injection témoin à l'aide de brucellas séchées dans l'acétone, on utilise une série de 60 animaux et pour chaque série d'essai des groupes de 15 animaux chacun sont traités simultanément de la façon indiquée ci- après, le symbole y signifiant microgramme.
Groupe d'assai 1: Première vaccination des souris à l'aide de
0,05 cm3 d'un vaccin dépôt par voie intracuta- née et seconde vaccination aix jours plus tard par voie intrapéritonéale à. l'aide ae 20 y de l'antigène à essayer dans 0,2 mc3 de fluide.
Groupe d'essai II: Présure vaccination comme pour le groupe 1.
Seconde vaccination dix jours plus tard par voie intrapéritonéale à l'aide de 10 y de l'antigène à essayer dans 0,1 cm de fluide.
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Groupe d'essai III : Première vaccination comme dans le groupa I.
Seconde vaccination dix jours plus tard par voie intrapéritonéale à l'aide de 5 Y de l'antigène à essayer dans 0,05 cm3 de fluide.
Groupe d'essai IV: Première vaccination comme dans le groupe I.
Pas d'autre vaccination,
Les animaux de chaque série sont sounis à l'infection expérimentale 22 jours après la vaccination ou 12 jours après la seconde vaccination. Pour l'infection, on utilise une culture sur agar Tryptose âgée de 36 heures de Brucella abortus, forme S, souche Schaedtbeck.
On administre à chacune do cinq souris 2,5 x 105 microorganismes, à chacune de cinq autres souris 5 x 105micro-organismes ,et enfin à chacune d'encore cinq autres souris 1 x 106 micro-organismes, toujours par voie intraveineuse. Quatre jours après l'infection expérimentale, tous les animaux d'essai sont sacrifiés, puis leurs rates sont prélevées et étendues en frottis sur de l'agar pour isoler à nouveau les .micro-organismes. Lo nombre d'animavx infectés avec succès et le nombre de micro-organismes isolés à nouveau par rate sont déterminés et classée en fonction de la date d'inocculation et de l'infection expérimentale.
Comme critère, on prend le logarithm@ moyen du nombre de micro-organismes réisolés par rate,pour chaque dose de l'infection expérimentale et pour chaque dose de vaccination. Ce nombre, qui est le degré d'infection,est donné dans le tableau correspondant en même temps que le nombre d'animaux complètement protégés (aucune Brucella abords isolée de la rate). Voir tableaux I à III.
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TABLEAUI
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--9Ipe dessai - ###.###.####¯¯¯¯¯¯¯¯ -r --- - il iIi iit Dose d'a-qtigène 21) "i/souris Y/...url. ##### ####¯##¯¯ ¯¯¯¯¯¯iv¯ Dose d'antigène 20 YI souris 10 YI "ouris yI souris 'J '/1 souris Dose d'înfeetlon Y/souris D Y/sour:Ls
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<tb> expérimentale
<tb>
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(BrceUasFar souri.) 2,50 5x10 lxiG 2, 10 5o 6 2,5;10 5xl0 lx10 2,5xyz lx10 (Br-1-l'cellas.par souris) 2,5>10 5x10 1"10 x.l0 5"10 1xlO 25xïJ, xl. 5 6 2,5xl05 5 1xlO Nombre d'animaux ,clo 5xlo iY-l 0 2y5xio 0 IX10 2,5xlO Sa.7.G1 Ixli3 essayés 55
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<tb> essayés
<tb>
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IToatr d'animaux
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<tb> protèges
<tb> protégés
<tb>
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Pourcentage dya-nimaux . protégés 60 40 20 0 40 40 60 0 0 0 0
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<tb> Degré <SEP> défection:
<tb>
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d'organisées du nombre o,99 1,87 2,13 1,66 1,68 1,04 0,96 2,36 2,17 3,20 3,31 3,28 deorganis.nes isolés 4,04 0,96 2,36 2,17 3,20 3,31 3,28 à partir de la rate 7 3,20 331
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<tb> Nombre <SEP> d'animaux
<tb> essayés
<tb>
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essayés 15 15 15 15
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<tb> Nombre <SEP> d'animaux
<tb>
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protégés 40% 4 = 26,75 3 = 2 0% cc:q"j Nombre total d'anijaux protégés après Vaccination avec Brucellasséchéesd2n.sl'actone :
13 sur 45f soit 28,9;0 co ......7 jojo
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TABLEAU II
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<tb> Groupe <SEP> d'essai <SEP> I <SEP> II <SEP> III <SEP> IV
<tb>
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Dose d'antigène y./ saur.i . --- - . 10 if. / sou ri s, :;j{ 1 souri s - O'y /souri, (Brucellas par souris) 2, 5xi05 5x105 1x.06 2, Sx105 5x10 6 2, 5x105 5x..05 1x10b Z 5xi05 S xl Nombre d-lani,iaux
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<tb> essayés <SEP> ¯ <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 5
<tb> Nombre <SEP> d'animaux
<tb>
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protÓgés 5 2 3 4 3 2 1 0
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<tb> Pourcentage <SEP> d'animaux
<tb>
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protégés 100 40 ta 80 80 60 60 0 40 20 Degré d'infection:
logarithme du nai"bre 1,7< .0,78 .0,51 0,47 1,32 .0,74 l,58 .0,83 1,26 2,79 à partir de la rate No.abre d'anilnaux
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<tb> essayés <SEP> 15 <SEP> 15 <SEP> 15 <SEP> 15
<tb>
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Nombre d'iln9UX protégés 10 = 66,9 11 = 73,5% 5 = 33,3% 6., ?Z 1\ olilb'l"e total d'ani::..a1X protgs après vaccination par l'nt1gène : 1
EMI15.9
<tb> 26 <SEP> sur <SEP> 45/soit <SEP> 57,8%
<tb>
<Desc/Clms Page number 16>
EMI16.1
T A BLE AU zx
EMI16.2
,ene Brucella abortus Pou- Ult) .:';0.2(;
(Pi;li'>:'ct.::.on expérim<:ntale àfs±%J"1&*oiSSîitF 'T ' (L/J5) L lJ (12/15) T.T"7i,i? - 5',.;:r.;cC:;',,"C protigés 40 80% Degré diafecrdon (10,'0 co' :ln.,te d;t :niero-orgonis"es 1,20 - o31 L 2J 0,41 t 0,2± 1so,i. de t:;>u.:#au ' partir de lia rate ,20 0,31 .7 ' 0,41 0,24 p- -::. - C:::2.=: 1).1 r1en tale dg 5 ;; lfj " ÔfioEô$Of ' (4/15) (6/15) 1>:1;ù=iùi 1 fi iJM5l protégés à7$ 40J Degré d$infectlon 40ji-.
(logar'til,2ie du noiiibre icro-oMsnis (lo:rtil'"e nombre "'iero-organismes 1,91 - 0,37 1,25 - 0,32 isolés de nouveau à partir de la rate) 91 i 0,37 le25 1 0,32 f.Q.U1' U'Le r.()s d "ÍJlÜ)ction eXDé.tlJ!!entiliAnimaux complètement protëges (3/15) (8/15) Degr dinfeetion protégés 2ÏD% 53% Degré d'infection 53% (logarithtne du no±bre lûicro-organîsmes isolés de nouveau à Partir 2,12 - 0,38 0,95 - 0,33 isolés de nouveau à partir de la rate) Os95 - Oe33
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<tb> Total <SEP> général <SEP> pour <SEP> toutes <SEP> les <SEP> doses
<tb>
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d'infection expérimentale :
(13/45) (ê6/45) pourcentage d'animaux protégés (13/45) 57à8J pourcentage d'an!..anx protégés 28,8jÓ (26/45) Z-1-7 Nombre d'animaux protégés/ 5738.%
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<tb> nombre <SEP> d'animaux <SEP> essayés
<tb>
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Z-2-7 Ecart sta-tdard
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Ces résultats montrent que l'antigène A1 à des doses de 20, 10 et 5 microgrammes peut renforcer l'immunité existante.
La vaccination par l'antigène A1 assure une protection complète chez un certain nombre d'animaux contre une infection expérimen- talepar 2,5 x 105, 5 x 105 et 1 x 106 brucellas. Le nombre total d'animaux protégés contre toutes les doses de vaccination et toutes les doses d'infection expérimentale est de 26 sur 45, c'est- à-dire d'environ 58.
Au contraire, le nombre total d'animaux protégés contre toutes les doses de vaccination et toutes les doses d'in- fection expérimentale à l'aido de brucellas séchées dans l'acé- . tone comme agent immunogène est de 13 sur 45, c'est-à-dire d'en- viron 29%.
EXTRACTION ET ISOLEMENT DE L'ANTIGENEA12S ' On met 21 g de bactéries séchées dans l'acétone (Brucella abortus, souche Schaedtbeck, forme S) dans 320 cm3 d'eau distillée, puis on les refroidit à 2 C. La suspension est additionnée d'un mélange de 400 g de phénol et de 130 cm3 d'eau refroidi à 2 C. Les opérations sont ensuite poursuivies comme décrit ponr l'Antigène A1(ci-dessus), sauf qu'après la dialyse les couches aqueuse-- saturées de pnénol rassemblées ne sont pas soumises à une évaporation pour réduire leur Volume.
Par contre, la solution aqueuse obtenue est traitée par 2 parties en volume d'éthanol refroidi et par 1 % en volume d'une solution étha- nolique saturée d'acétate de sodium, puis le sédiment formé est recue@lli par centrifugation. Un supplément de 2 parties en volu- me d'ét dol refroidi et de l% en volume de la solution d'acétate de soctium est alors ajouté au liquide surnageant, puis l'antigène A12S qui préciit est recueilli par centrifugation. L'antigène peut être séché, par exempta, dans un dessiccataur à vide.
La fraction A12S est ainsi obtenue avec un rendement d'environ 2,5% (sur la base du poids des bactéries sèches de départ).La présence de l'acétate de sodium n'est pas critique pour l'extraction de
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l'antigène A12 et peut être supprimée.
EXTRACTION ET ISOLEMENT DE L'ANTIGENE A12Ü On utilise des bactéries séchées de la variété Brucella
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mfm, souche Schaedtbeek, forme MR. Pour préparer les cellules séchos, on set une souche virulente de bactéries en culture comme d'habitado sur 3.'agar standard I au bouillon de foie,par incuba- tion pendant 6 à 7 jours à 37 C. Les cellules sont alors recueillies par lavage de la surface de l'agar à l'aide d'une solution physiologique à 0,35% et filtrées sur un filtre en verre fritté G-1 pour éliminer les particules grossières de la suspension
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de cellules. La o::.h:.pùn::;ioll est alors additionnée de 4 parties en v01u!:113 à,?1. :-: oV.: ;z.,;,r.:.
(l à 4QC) et de 10 cm3 par litre d'une solution éthanolique saturée d'acétate de sodîum. La suspen- ::.iÜ.l e;= e ..w . .à TF e P au froid j'u.3qu'à ce que la précipitation soit acheva. Les cellule :3l.mt alors sëdiciôntëes par centrifugation et séchées sous pression réduite.
On met 21 g de bactéries séchées en suspension dans
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zig c:a à'-3i; distillée et on refroidit la suspension à 2 C. La 0.,xüp:s.o.. 5'l additionnée d'un mélange de 4 0 g de phénol et de lJ0 m3'cl'cau,Puls refroidie à 2 C. Le mélange est agité et main- tenu :%Il froid pendant environ 30 minutes,sous agitation inter- mittente. La couche aqueuse saturée de phénol est séparée après
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of3t:.trif\1gatlcu. La couche phénolique saturée d'eau est alors mélangée avec wi supplément de 300 cu3 d'eau. Le mélange est centrifugé de su.v-u e t ? a couche aqueuse séparée est combinée avec la couche aqueuse déjà recueillie. Les centrifugations sont de préférence exécutées à froid.
Les couches aqueuses saturées de phénol réunies sont soumises à une dialyse en présence d'eau distillée pendant IL) jours,puis mélangées avec 1 partie en volume d'éthanol refroidi et avec 1% en volume d'une solution éthanolique saturée d'acétate de sodium. Le mélange est mis à reposer au froid (1 à 5 C)
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'3t le pl',kipit..5: 1'orraé e;-t recueilli. Un supplément de 3parties en volume ,,"4th1:'))Jl refroidi et de l en volume de la solution d'acétate
<Desc/Clms Page number 19>
de sodium est ajouté. Un précipité (A12Ü) qui se forme par repos au froid est recueillie par exemple par centrifugation à petite vitesse (3500 tours) puis séché sous pression d'air réduite (rendement 6 à 7%).
CARACTERISATION DE L'ANTIGENE A12S
L'antigène A12S est une glycolipoprotéine sensiblement exempte d'acides nucléiques (environ 1%), qui donne les réactions ci-dessous, comme indiqué dans le tableau:
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<tb>
<tb> A12S
<tb> Solubilité <SEP> dans <SEP> l'eau <SEP> > <SEP> g./100 <SEP> cm3
<tb> Teneur <SEP> en <SEP> acides <SEP> nucléiques <SEP> environ <SEP> 1,1%
<tb> Teneur <SEP> en <SEP> lipides <SEP> ( <SEP> procédé <SEP> au <SEP> noir <SEP> Soudan) <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP>
<tb> Teneur <SEP> en <SEP> sucres <SEP> ("unités <SEP> glucose ) <SEP> 43-46%
<tb> galactose <SEP> environ <SEP> 10%
<tb> glucose <SEP> environ <SEP> 2%
<tb> mannose <SEP> environ <SEP> 1,5%
<tb> xylose <SEP> environ <SEP> 1%
<tb> sucres <SEP> aminés <SEP> (mis <SEP> en <SEP> évidence <SEP> par <SEP> +
<tb> le <SEP> réactif <SEP> d'Elson-Morgan)
<tb> Réaction <SEP> de <SEP> Holisch <SEP> pour <SEP> les <SEP> hydrates <SEP> ++
<tb> de <SEP> carbone:
<tb> Réaction <SEP> à <SEP> la <SEP> xanthoprotéine <SEP> pour <SEP> les <SEP> ++
<tb> acides <SEP> aminés <SEP> contenant <SEP> des <SEP> noyaux
<tb> aromatiques:
<tb> Réaction <SEP> du <SEP> biuret <SEP> pour <SEP> les <SEP> protéines <SEP> +
<tb> et <SEP> polypeptides:
<tb>
Pour établir la teneur en acides nucléiques les mesures spectrophotométriques sont faites sur une solution à 0,1 ou à 0,01% de l'antigène dans des cellules en quartz d'une épaisseur de 1 cm.
(E260o - Eo290 = Eo des acides nucléiques). La concentration en acides nucléiques est déterminée par comparaison avec des courbes étalonnées d'adénosine-triphosphate.
Pour la détermination qualitative des restes de sucre, on dissout 40 mg de l'antigène dans 2 cm3 d'acide sulfurique 1M
<Desc/Clms Page number 20>
et on hydrolyse l'antigène dans une ampoule scellée,pendant 4 heures à 100 C sous agitation intermittente. Le produit d'hydrolyse obtenu est. dilue avec un volume égal d'eau et réglé à pH 7,0 (neutralité) par de l'hydroxyde de baryum 1M. Après 50 minutes, l'échantillon est centrifugé. La phase surnageante est recueillie par siphonnage et son volume est ramené à environ 0,9 cm3 par évaporation sous vide.
Le liquide est additionné d'un volume égal d'acétone. Le produit d'hydrolyse obtenu est alors soumis à la chromatographie. La séparation des constituants des sucres se fait par chromatogra- phie descendante sur papier. A cette fin, on peut utiliser:
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Papier : :' Schieioier-Schù]1, 204.3 b Pige Solvant : I. n-butanol-acétone-eau (5:5:1) II. n-butanol-pyriài.e-eau (6:43) Développement par a.phtal.te (ianiline (pour les sucres aldéhydiques) b. 4-dlméthylamino-benzaldéhyde (pour les sucres aminés) c, natol-résorc1nol-ac1de tri-
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<tb>
<tb> chloracétique <SEP> (pour <SEP> les
<tb> sucres <SEP> cétoniques)
<tb>
Les temps d'écoulement sent en général de 17 à 20 heures.
Le solvant n-butanol-acétone-eau permet des essais sur la teneur en sucres cétoniques, ainsi qu'une meilleure séparation des pentoses.
D'autre part, une meilleure séparation des sucres aldéhydiques est obtenue par le solvant n-butanol-pyridine-eau. Ce dernier donna également de meilleurs résultats pour la séparation désoxy-sucres.
Des dosages approximatifs des sucres sont obtenus par comparaison avec des quantités connues de sucres de référence
EMI20.3
SGUillis s..;lt c:ujnt à la chroniatographie. Il va ae soi que les seul:; sucrée du la glycolipoprotéine antigène déteru:3.nés de cette façon sont ceux qui sont complètement hydrolysés en monosaccharides. Toutefois;, on peut établir certaines relations quantitatives.
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p(.ndé.nt le dosage chromatographique, on constate égale- ment la présence d'un constituant non identifiable à grande mobilité.
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Le tableau suivant donne les résultats obtenus pour l'analyse élémentaire de l'antigène A12S (deux extractions).
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<tb>
<tb>
A12S <SEP> A12S
<tb> C <SEP> ................... <SEP> 30,62 <SEP> - <SEP> 30,97% <SEP> 32,40 <SEP> - <SEP> 32,54%
<tb>
EMI21.2
H ................... 5,40 - 5,42 5,14 - 5xl6 N ................... 2,11 - 2,25 2,44 - 2,48 P ................... 1,90 - 1,96 1,78 - 1,63 Na ................. 5,87-5,98 5,97-6,03 H20................ 2,70 - 2,78
EMI21.3
<tb>
<tb> Matières <SEP> volatiles... <SEP> 5p74 <SEP> - <SEP> 5,74
<tb>
La rotation optique mesurée de l'antigène A12S (1,14%
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dans l'eau distillée) est ra20 - - + 120 (t 1.,2 ) L'analyse speatrograpnique ,dans l'ultraviolet ne donne qu'un maximum d'absorption faible à 258 m/u; et le spectre infrarouge (voir Fig. 1) ne comprend pas de bandes nettes caractéris-
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tiques (5me A dans 1 d de itTjr).
Le spectre porte en abscisses les longueurs d'onde en microns, et en ordonnées les transmissions en %.
A 50.000 tours par minute, la constante de sédimenta-
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tion d'aune solution à 1 dans le phosphate 1/15 M (pli 7.0) est: S20 = 1,4 à 1,5s(unités Swedberg). La préparation est monodis- perse pendant 4 heures et présente un gradient très net.
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CARACT3RISATIOI3 DE L'ANTIGENE A 12 u L'antigène À 12 Ü'est une glycolipoprotéine sensiblement e:4--,pte d'acides nucléiques (environ 1j,4u donne les réactions ci-ai:<:às résoeiées dans le tableau:
<Desc/Clms Page number 22>
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A1ZÜ! =..¯a:; ¯:' ¯.. dans l'eau >1 g./ïA0 cm3 5>#x,i;x.% o:,.m acides nucléiques environ 1,ljIJ .=3 f.'n lipides (procédé au noir Soudan) + + + + ,'- ';;'\e:":1:
(! ±twl'e::> ("unités bi,uco: } ,,L-.6' =; - > .:<. i;#.>- a environ 10% -"(":'C:1.'( environ 2% : s: ; environ 1,5% ;..1 . , . environ 1 . 1.--,,> ,. ;, ;= , > #r...' ¯ 7il!f. en évidence par 4 3.'fizc:,Î Cts,i.srï'#ur°',,8T3. + ". ':',.. - -'.' 1 .. , ,:à..l: , :... les hydrates de :,- ,, lJ-lt1: ++ Réac ;'.':.- :..r. g,;.¯ -"';1 :",lO!}):'J'>..-.\';; pour les ....,. ¯ ¯...:.',':: ++ ,... . . a - ...kh , . ..¯ \'"';I t; ..2:{ L4a. 'tiques :v9¯..... "hj4'' .. ",':..:1.' '-'-J :if.9it=iw5.w7 et + .<.=.i.7 =.1:'t in.i.4.y
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p r . . ¯ (t? 1:J:V;\,i'O;> <..i:; 1 ; .;> ier, s : Q , 8 6$ ; 1,6%: 10% et 0,98%.
P..:' .,-,,"";" ''''t. fni,¯l:; puuy <.J;iii'e dét;:t-cd.nat1on5: 45-46%.- 43-44% 44-45%, 41-42%.
4:<,4,;--.: .:.... t: ûc:L".lâ.'I:,.ü,t1 CiiTals,ïa'ta7."s"l.j.4ï18 des sucres ',,;: C;;,..'.. ';"', ¯.::6; 0aii:5 loe cas de l';:..ntlgène A2S" la présence 9 ¯ ,,';j2;'J.+.t:::J.t à ;i*:;i;1;, u;ùbilité. La rotation optique, la ¯ ... ¯¯ ;::j.r,0H';;-w!i. et les'spectres U.V. et I.R. pour -5 .. " - .""".. :i#; ,'eT'" .... "'W'é>'" que pour l'antigène Ax2S, An ly..e <l<:ntalre de 1 -antigène At3
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4 .aA, ..d.,a .. )4.tl - 34,245b )<'}..,.. ,..,r'" ')' '-'9')11-"'-.. 5t3<ï - 5,4? x < e a'.Mj'tttt* w c '-<:3'tfÎ)..t:'3.flt.... 1,04 - 1PO5 ".' '" ... 0 .. < ......... 4,7'/ - 4,82 ": #; $ .. t1 4 \9 9 t) :) ...... ;1 .. <Ii 3,10 - :3 , 19 A.
,2,' i .yE -> !j'J.a't;11e.,.". fJa.2 "" up J
<Desc/Clms Page number 23>
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PROPRIETES IMMONOGENES DE L'ANTIGENE Ai,. S ¯ t
L'antigène A12S est essayé sur des souris CFW pour établir son pouvoir immunisant. L'immunisation immédiate par
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l'antigène A12 S est essayée sans vaccination préalable par acp,' y¯ dépôt au contraire de ce qui a été fait pour l'essai de 1'axa'.i, A1. A cette fin, on traite de la façon indiquée ci-après 40 animaux d'essai pour chaque groupe d'essai.
Groupe d'essai I: Première vaccination avec 20 y de A12S dans
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0 e 05 CE:3 de fluide par souris par vole.1ntraa "i:' cutanôe.D1x jours plus tard,seconde vaccinat&'-!i avec la même dose administrée de la même
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façon. Groupe d'essai II: Première vaccination avec 2 y de A12S dans
0,05 cm3 de fluider souris par voie intra- cutanée* Dix jours plus tard, seconde vac-
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cination à l'aide de la même dose adminlatré* de la même façon.
Groupe d'essai III: Pas de vaccination.
Vingt-quatre jours 4-près la première vaccination, donc 14 jours après la seconde vaccination, les animaux d'essai de chaque groupe sont soumis à une infection expérimentale. A cette fin, on utilise une culture sur agar Tryptose âgée 'de 48
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heures de Brucella abortus, fod-ue S, souche Schaedtbeck. A chacun* de 10 souris de chaque groupe d'es sai, on administre 5 x 104 aicr<organismes, à chacune de 10 autres souris 1 x 105 micro-organisme#, chacune d'encore là autres souris 2 x 105 m;cro-ordaniaxaes, et = } i'in à chacune d'encore 1C autres souris 5 x 10 mica.-trgt nismes, toujours par voie intraveineuse.
Quatre jours après l'infection expérimentale, loue les animaux ;'essai sont sacrifias, leurs rates sont prélevées puis les essais sont exécutés comme pour l'antigène A1. Voir tableau IV.
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''.' ; .E' ''.. x ,3 Il
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¯ ¯ ¯ ¯ ¯ ¯ :j = j; j g 1 , # ] 1 joe j à fil.¯ ¯ ¯ ¯ , ¯ ¯¯¯¯, , ¯ ¯ II ...:' }11 Dore 'ts d';;.t,t3.[..'h? i<; ... " ' f / soi: =-i o >' ' r*;i=-1 > i3v'iti" '!.:kC. \.ICt,st \, i::ft ;:5..(..1 ;" 1. ...'"':. J' {t:--.l f: ,.,t."" .)1 h '!,.il .:::1"......, 1 . "...,..., .... ..,.. t ,+; dé 1>,à;µ t (::/' O. 'r .J lt '" / 1 o ) ' ')" "6 /" A:: ... "'l:Lt:r 3 i rt^i. i. L .',l âu j;... :::"J" ê )..,:\,;t: ".1. ¯.,tu} ;:'1" .!,Il ,-'&ur une dose à,#:....;,<:t.i+i; .=:. é-1,.;<;i;,ai<.
1 x 105 JrLI.É'.;'S 1>,.'1i1 X co.:-.plè,tE;crt protfe 90. (9,/,io) l\)')Î (l0/10) 40;le (4/10) Pour une dose d'infection e;..pêr.a,l= 'e de 2 x ld5 Brucellas : ip trl0 20 (2/10) AnIjnRux cOJlplèteJ1lHt prot6és 10, 9/ io) 90: \/10) 20 (2/10)
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<tb> Pour <SEP> une <SEP> dose <SEP> d'infection <SEP> expérimentale
<tb>
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de 5 x 105 Brucellas: /n/i 20 f2/10 (0/10) Animaux complètement protèges 0; (0/10) 20'; (2/10) 0$ (0/10) Nombre total d'anixaux protégés contre f<i//n 30 fl2/AO) toutes les doses d'infection expérimentale 57 (23/40) 7";' (31/40) 30% (12/40) Le tableau IV indique nettement que 1' tntigene A128 est un agent diimmwiisation actif. Une quantité de 2/est plus efficace qu'une quantité de 20 .
<Desc/Clms Page number 25>
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PROPRIETES It2NSnNOGEiVES COMPAREES DE A12 8 ET DE A12 0! ,
Le tableau immédiatement suivant résume les résultats d'une expérience exécutée sur des souris CFW génétiquement pures trai-
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t'es au préalable une seule ioiP à l'aùk d'me do93des giycoliPoPPotéines antigènes A12S et A12U. Les animaux sont soumis à l'effet d'une Injection intrapéritonéale de 5 x 104 brucellas virulentes (Brucella abortus S), les injections se faisant au vingt et unième jour de l'essai. Tous les animaux sont sacrifiés le vingt huitième jour et leurs rates sont prélevées puis homogénéisées dans des condi- tions aseptiques, Des frottis sont obtenus sur des plaques dagar
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Tryptose.
L'estimation se fait après 4 jours deincubation à 370C, Comme on peut le conclure du tableau, Inactivité optimum est constatée après un prétraitement à l'aide d'environ 0,1 à le() y par kg de poids du corps, bien que des résultats avantageux soient obtenus dans un intervalle de 0,1 à 50,0 [gamma] par kg de poids du
EMI25.4
<tb>
<tb> corps.
<tb>
DOSE <SEP> D' <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> souris <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> rates <SEP> à
<tb> IMMUNISATION <SEP> réaction <SEP> positive
<tb> (y/kg) <SEP> ' <SEP> âpres <SEP> 28 <SEP> jours
<tb> A12Ü <SEP> A12S
<tb> 0 <SEP> témoin <SEP> 20/20 <SEP> 18/20 <SEP> 20/20
<tb> 0,001 <SEP> , <SEP> 20/20 <SEP> 14/20 <SEP> 17/20
<tb> 0,01 <SEP> 20/20 <SEP> 5/20 <SEP> 5/20
<tb> 0,1 <SEP> 20/20 <SEP> 1/20 <SEP> 3/20
<tb> 1,0 <SEP> 20/20 <SEP> 3/20 <SEP> 3/20
<tb> 5,0 <SEP> 20/20 <SEP> 4/20 <SEP> 7/20
<tb> 50,0 <SEP> 20/20 <SEP> 7/20 <SEP> 9/20
<tb>
Pour établir si le taux d'infection peut être influencé par administration aux souris CFW de l'immunogène (en l'occurrence A12Ü) et de Brucella abortus S virulente (5 x 104 intrapéritonéalement), on peut consulter le tableau suivant.
Une protection appréciable est obtenue pour des doses de 0,01 à 5,0 [gamma]/kg
<Desc/Clms Page number 26>
de 'poids'du corps, bien que les résultats soient avantageux jusqu'à 50 y.par kg de poids du corps.
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<tb>
<tb>
DOSE <SEP> DE <SEP> A12U. <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> rates <SEP> à <SEP> réaction <SEP> positive <SEP> après
<tb> ([gamma]/kg) <SEP> 12@ <SEP> 7 <SEP> jours <SEP> 14 <SEP> jours <SEP> 21 <SEP> jours <SEP> 28 <SEP> jours
<tb> Témoin <SEP> 18/20 <SEP> 20/20 <SEP> 18/20 <SEP> 17/20
<tb> 0,001 <SEP> 18/20 <SEP> 18/20 <SEP> 15/20 <SEP> 15/20
<tb> 0,01 <SEP> 7/20 <SEP> 2/20 <SEP> 0/20 <SEP> 0/20
<tb> 0,1 <SEP> 3/20 <SEP> 0/20 <SEP> 0/20 <SEP> 0/20
<tb> 1,0 <SEP> 0/20 <SEP> 0/20 <SEP> 0/20 <SEP> 0/20
<tb>
<tb> 5,0 <SEP> 6/20 <SEP> 1/20 <SEP> 0/20 <SEP> 0/20
<tb> 50,0 <SEP> 9/20 <SEP> 3/20 <SEP> 1/20 <SEP> 2/20
<tb>
EMI26.2
1J,TES pAGpWpI.on C011fAs.
L'effet d'agglutination de l'antigène A12S est,essayé sur des lapins, les titresd'agglutination étant déterminé après adminis tration d'une dose d'antigène.Des lapins de la même portée âges de 10 semaines et d'un poids de 2 kg sont utilisés pour les expériences.
EMI26.3
Un lapin ob. utilisé pour chaque dose deantikéne. Les antigènes sont dissous dans du sérum physiologique stérile puis injectés dans la veine marginale de l'oreille des animaux. La prise du sang, la préparation du sérum-et la détermination des titres d'aggluti- nation. se font de la façon classique. Les résultats de l'essai sont résumés ci-après. A titre de comparaison, le tableau donne également les valeurs relevées à l'aide de Brucella abortus S séchées dans l'acétone et à l'aide de l'antigène A1.
<Desc/Clms Page number 27>
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DOSE TITRE D'AGGLOTINATION (jours après 1injection 1antigène) à
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<tb>
<tb> A12S <SEP> 50 <SEP> 1:50 <SEP> -
<tb> 25 <SEP> 1:50 <SEP> 0
<tb> 10 <SEP> 0
<tb> 5 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb>
EMI27.3
Br,abortus-S 40 1.320 1.320
EMI27.4
<tb>
<tb> séchées <SEP> dans <SEP> 100 <SEP> 1:1280 <SEP> 1:1280
<tb> l'acétone
<tb>
EMI27.5
<tb>
<tb> A1 <SEP> 10 <SEP> 1:80 <SEP> 1:160
<tb> 50 <SEP> 1:1280 <SEP> 1:1280
<tb>
L'administration d'une quantité égale ou inférieure à 10 y de A12S par kg de poids du lapin ne conauit pas à la forma- tion d'agglutinines. Une formation légère et très fugace d'agglu- tinines est observée après l'administration de 25 y de A12S par kg de poids.
Une injection de 50 y de A12S par kg de poids donne un titre atteignant à peine 1 :50 au 7ème jour.' D'autre part,
50 y de A1 par kg donnent un titre d'agglutination de 1:1280 au
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6ème jour. L'injection de l0 y de brucel1a3séchéesdans l'acétone par kg de poids du corps donne un titre de 1:320. D'après ces résultats expérimentaux, on conclut que l'antigène A12S a un effet agglutinogène'beaucoup moins marqué que l'antigène A1 ou que les brucellas séchées dans l'acétone. Des résultats analogues sont obtenus pour l'antigène A12Ü. On peut en conclure que la glycolipoprotéine A12 est largement débarrassée des constituants agglu- tinogènes.
Dans un autre essai, des lapins reçoivent par voie
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intraveineuse, 5 à 80 m1orogramwes de A12S, comme indiqué dans le tableau suivant$puis les titres d'agglutination sont comparée
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avec ceux obtenus à l'aide de rucel1a ftPort.u 8 séchées dans l'acétone. Les animaux d'essai sont âgés de 4 mois et appartiennent à la souche "Vienna Whites". Les secondes injections intravcin@u- ses sont faites trois semaines après la première vaccination à
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'l'aide de 5 microgrammes du même antigène par animal.
Pour établir les titres d'agglutination, du sang est prélevé à la veine marginale de l'oreille des animaux aux intervalles ci-après: 14 jours après la première vaccination, puis 2 et 3 semaines après la seconde vaccination.
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<tb>
<tb>
TITRE <SEP> D'AGGLUTINATION
<tb> 2 <SEP> semaines <SEP> 2 <SEP> semaines <SEP> 3 <SEP> semaines <SEP>
<tb> après <SEP> après <SEP> après
<tb> Animal <SEP> Antigène <SEP> Première <SEP> 1ère <SEP> vaccin-seconde <SEP> vac- <SEP> seconde <SEP> vacpoids <SEP> (g) <SEP> vaccination <SEP> nation <SEP> cination <SEP> @ <SEP> cination <SEP> @
<tb> dose
<tb> 2850 <SEP> A12S <SEP> 5 <SEP> 1:25 <SEP> 1 <SEP> :10 <SEP> 1:la
<tb> 2765 <SEP> 10 <SEP> 1:2@ <SEP> 1 <SEP> :10 <SEP> 1:10
<tb> 2735 <SEP> 20 <SEP> 1:25 <SEP> 1:10 <SEP> 1:la
<tb> 2735 <SEP> " <SEP> " <SEP> 40 <SEP> 1:25 <SEP> 1:10 <SEP> 1:10
<tb> 2500 <SEP> " <SEP> 80 <SEP> 1:25 <SEP> 1:10 <SEP> 1:10
<tb> Brabortus
<tb> 3075 <SEP> S <SEP> séchées <SEP> 20 <SEP> 1:400 <SEP> 1:640 <SEP> 1:640/1280
<tb> 3175 <SEP> 40 <SEP> 1:400/800 <SEP> 1:320/640 <SEP> 1:320/640
<tb> 3170 <SEP> " <SEP> 80 <SEP> 1:1600 <SEP> 1:640 <SEP> 1:
320
<tb>
Une doseuniforme de 5 microgrammes des divers antigènes est adminis- trée à la seconde vaccination à chacun des animaux,par voie intraveineuse.
Comme on peut le, conclure de ces données, une seule injec- tion de A12 en quantités de 5 à 80 y par lapin ne conduit pas à des titres d'agglutination significatifs. Au contraire, une seule injection d'une dose correspondante de Brucella abortus séchées conduit à des titres d'agglutination atteignant 1:1600. De plus, les titres d'agglutination sont insignifiants dans le sérum des lapins recevant une seconde vaccination (5[gamma]) de A12S trois semai- ne$ après la première vaccination.
TOXICITE DES ANTIGENES A1, A12S et A12Ü
La toxicité des antigènes A1, A12S et A12U est illus- trés par le tableau suivant. Chaque antigène est dissous dans une solution physiologique stérile et la concentration est réglée de
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'façon que la quantité injectée de 0,5 cm3 contienne la. dose indiquée en milligrammes par kg de poids du corps. Des injections sont faites intrapéritonéalement à des souris CFW de 6 à 8 semaines.
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DOSE , Nombre Eqmbe2 d'galmaex M2Ltg apr&s ng/k8) d'animaux 2 l8 '72
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<tb>
<tb> heures <SEP> heures <SEP> heures <SEP> heure$ <SEP> # <SEP> ¯ <SEP>
<tb> A1 <SEP> 200 <SEP> 4 <SEP> 4 <SEP> 4 <SEP> 4
<tb> 150 <SEP> 5 <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> 112,5 <SEP> 4 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> A12S <SEP> 200 <SEP> 5 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 150 <SEP> 5 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> ' <SEP> 112,5 <SEP> 5 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> A12Ü <SEP> 200 <SEP> 5 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 100 <SEP> 5 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 50 <SEP> 0000
<tb>
Ces données montrent que les antigènes A12S et A12U sont moins toxiques que l'antigène A1.
Les doses LD50 des deux premiers antigènes sont supérieures à 200 mg/kg.:
En résumé, on peut conclure que l'antigène A1 et l'an- tigène A12 ont, comme démontré sur les animaux de laboratoire, des propriétés immunogènes plus fortes que celles de Brucella séchées
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dans l'acétone. Les antigènes sont des glycolipoprotémes sensible- ment pures,qui peuvent être utilisées pour conférer l'immunité contre la brucellose. Toutefois, l'antigène A1, bien que conférant l'immunité, reste quelque peu endotoxique et agglutinogène. D'autre part, comme indiqué ci-dessus, l'immunité subsiste dans le cas de l'antigène A12 malgré l'absence de constituants agglutinogènes et toxiques.
Les nouveaux antigènes suivant l'invention sont utilisés sous la forme de solutions ou de suspensions stériles,suivant le cas,dans les véhicules utilisés classiquement pour l'administration
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de produit biologiques injectables* On peut utiliser, par exemple, de l'eau distillée, du sérum physiologique, c'est-à-dire du chlo- rure de sodium dans 1,'eau à une concentration d'environ 0,85 à 0,90%. Les mélanges aqueux d'eau et d'alcool benzylique peuvent être utilisés comme véhicules pactiels, en combinaison avec les autres sels utilisés d'habitude pour la préparation de solutions injectables,
comme les sels de métaux alcalins et alcaline-terreux avec des anions tels que les anions phosphate, chlorure, sulfate etc qui ne sont évidemment pas toxiques et qui sont parfaitement compatibles avec les exigences de la physiologie animale. Il est évident qu'une exigence essentielle de la préparation de composi- tions injectables contenant les nouveaux antigènes est leur carac- tère isotonique, bien que ce facteur ne soit pas extrêmement impor- tant pour des injections à des animaux de grande taille. Toutefois, dans le cas d'animaux de petite taille, ce facteur doit entrer en ligne de conipte. Sous ce rapport, il peut être intéressant de com- biner l'antigène avec une petite quantité d'un anesthésique local compatible avec l'antigène, comme le chlorhydrate de procaïne.
La concentration en antigène de la composition finale est déterminée par des procédés de dosage classiques, ces compositions contenant de préférence par dose unitaire la quantité thérapeutiquement utile d'antigène.
On a décrit ci-dessus des procédés de séparation d'un facteur immunogène de Brucella sous forme sensiblement pure et débarrassé des constituants agglutinogènes et toxiques moins ,intéressants,qui ne sont pas des facteurs susceptibles de provo- quer l'immunité chez l'animal. Par conséquent, le degré de pureté de l'immunogène obtenu par le procédé suivant l'invention se reflète dans une grande mesure dans la concentration en antigène de la composition finie. Dès lors, des procédés d'uniformisation évi- dents sont les facteurs nécessaires et déterminants pour la prépa- ration du produit.
Des exemples de compositions à. effet antigénisue utile sont données ci-dessus à titre d'illustration.mais sans limiter
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' la nature du produit final en ce qui concerne la concentration . en antigène .
REVENDICATIONS
1.- Substance immunogène sensiblement non toxique et non agglutinogène identifiée comme étant l'antigène A12 utile pour conférer l'immunité contre la brucellose, caractérisée en ce qu'elle est une glycolipoprotéine sensiblement pure se distinguant par les propriétés suivantes : dans l'eau (> 1 g/100 cm3); sensiblement exempte diacides nucléiques; résul- tats positifs à la réaction de Molisch pour les hydrates de carbone, à la réaction à la xanthopro téine pour les acides aminés contenant des noyaux aromatiques, et à la réaction du biuret pour les protéines et les polypeptides; résultats très positifs pour le dosage des lipides;
teneur d'envirc 41 à 46% d'"unités glu- cose" et teneurs approximatives en sucres par voie chrociatogra- phique d'environ 10% pour le galactoso, d'environ 2% pour le glucose, d'environ 1,5% pour le mannose, d'environ 1% pour le xylose et d'une valeur non établie pour un constituant non iden- tifiable à grande mobilité; résultats positifs au dosage des sucres aminés; rotation optique (1,14% dans l'eau distillée) [[alpha]]20D = + 12 (¯ 1,2 );
analyse élémentaire conduisant à envi- ron 30,5 à 34,5% de carbone, à environ 5,0 à 5,5% d'hydrogène, à environ 2,0 à 4,0% d'azote, à environ 1,0 à 2,0% de phosphore, à environ 4,5 à 6,0% do sodium, à environ 2,0 à 4,0% de H2O et à environ 6,0 à 8,0% d'agents volatils; maximum d'absorption tout au plus faible à 258 m/u dans l'ultraviolet et absence de bandes nettes caractéristiques dans le spectre infrarouge; cons- tante de sédimentation (solution à 1% dans le phosphate 1/15M, pH 7,0) de s20 = 1,4 à 1,5 S; titres d'agglutination insigni- fiants chez le lapin à '5 -80 microgrammes par kg de poids du corps ; et LD50 chez la souris )200 mg par kg de poids du corps.
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2.-Procédé perfectionné pour soumettre l'extraction des bactéries à Gram négatif,suivant lequel on traite ces bactéries par un mélange de phénol et d'eau contenant 70 à 95% de phénol à 1-5 C pendant au moins 20 à 30 minutes, on sépare la phase phénolique de la ' phase aqueuse, on met la phase aqueuse en contact avec un alkanol inférieur à une température de 1 à 5 C, et on sépare le précipité obtenu, caractérisé en ce qu'on soumet à cette extraction des Brucella et, après séparation du précipitée on met'la phase aqueuse surnageante en contact avec un supplément d'alkanol inférieur à des températures de 1 à 5 C,de façon à faire précipiter une substance immunogène sensiblement non toxique et non agglutinogène utile pour conférer l'immunité contre la brucellose.
3.- Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que la Brucella. est la Brucella abortus.
4.- Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que la Brucella est un mutant de la Brucella abortus.
5. - Procédé perfectionné pour soumettre à l'extraction des bactéries à Gram négatif,suivant lequel on traite les bactéries à l'aide d'un mélange de phénol et d'eau contenant 70 à 95% de phénol à 1-5 C pendant au moins environ 20 à 30 minutes, on sépare la phase phénolique de la phase aqueuse, on traite la phase phénolique par un supplément d'eau et on sépare à nouveau la phase phénolique de la phase aqueuse, on combine les deux phases aqueuses et on dialyse les phases aqueuses combinées en présence d'eau pendant quelques jours, on concentre la phase aqueuse dialysée jusqu'à environ un tiers à la moitié de son volume initial,on met la fraction aqueuse concentrée en contact avec de l'éthanol à des températures de 1 à 5 C et on sépare le précipité formé,
caractérisé en ce qu'on utilise des Brucella abortus comme bactéries et, après la dialysa, on soumet la fraction aqueuse combinée à la précipitation fractionnée sans la concentrer,en la mettant on contact avec 1 à 4 parties en volume d'éthanol à une température de 1 à 5 C, on sépare la précipité formé et on met la phase aqueuse surnageante
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en contact avec encore 1 à 4 parties en volume d'éthanol à une température de 1 à 5 C de façon à faire précipiter une substance immunogène sensiblement non toxique et non agglutinogène utile pour conférer l'immunité contre la brucellose,
6.
- .,Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce que la Brucella est la Brucella abortus, souche 8chaedtbeck, forme S.
7. - Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce que la Brucella est la Brucella abortus, souche Schaedtbeck, forme MR.
8.- L'invention décrite ci-dessus sous tous ses aspects nouveaux et utlles.