FR2607392A1 - Procede pour la preparation d'une souche mutante de bordetella bronchiseptica utile pour la preparation d'un vaccin vivant attenue pour la prophylaxie des infections a b. bronchiseptica et vaccin vivant attenue contre la rhinite atrophique ainsi prepare - Google Patents

Abstract

L'INVENTION CONCERNE UN PROCEDE POUR LA PREPARATION D'UNE SOUCHE MUTANTE DE BORDETELLA BRONCHISEPTICA, AYANT DES MARQUEURS GENETIQUES DE THERMOSENSIBILITE (CULTURE A 42 C), DE RESISTANCE A L'ACIDE NALIDIXIQUE ET D'ABSENCE DE PRODUCTION DE LA TOXINE DERMONECROTIQUE THERMOLABILE, UTILE POUR LA PREPARATION D'UN VACCIN VIVANT ATTENUE POUR LA PROPHYLAXIE DES INFECTIONS A B. BRONCHISEPTICA ET LE VACCIN VIVANT ATTENUE CONTRE LA RHINITE ATROPHIQUE AINSI PREPARE.

Description

L'invention concerne un procédé pour la préparation d'une souche mutante

améliorée de Bordetella bronchiseptica, ayant une forte immunogénicité et une faible virulence, convenant à la

production d'un vaccin atténué vivant à base de B. bronchiseptica.

L'invention concerne également un vaccin vivant préparé à partir de

B. bronchiseptica.

On sait que Bordetella bronchiseptica provoque des maladies respiratoires chez divers animaux, tels que les porcs, les chiens, les lapins, les cobayes et les souris. L'infection par ces micro-organismes des porcelets nouveau-nés provoque la rhinite atrophique du porc (que l'on appelle ciaprès RA) qui entraîne une atrophie des cornets nasaux et provoque un retard de croissance et une baisse du taux de consommation des aliments. Elle pose un problème grave à l'élevage industriel. Un vaccin anti-RA tué a été commercialisé pour la prophylaxie de la RA du porc, cependant l'efficacité du vaccin demeure limitée. Récemment, un vaccin anti-RA

vivant atténué a été mis au point comme l'indiquent Shimizu et coll.

(brevet US 4 456 588).

Cependant, on sait que les micro-organismes utilisés dans ce

vaccin vivant ne peuvent pousser qu'à 34-37'C. Egalement ces -

micro-organismes forment des colonies tardives sur un milieu solide, ne colonisent que médiocrement la muqueuse nasale du porc et ne provoquent pas la formation d'anticorps sériques chez les porcs inoculés. Un délai d'au moins 10 à 14 jours après l'administration est nécessaire pour qu'un effet immunologique du vaccin anti-RA tué apparaisse. On recherche donc depuis longtemps un vaccin assurant une immunité puissante à des animaux plus jeunes. On sait, de façon générale, que B. bronchiseptica pousse à 32 r 37C ("Atrophic rhinitis of swine Bordetella infectious disease", Ed. M. Ogata, Buneido Pub. Co., 1979). On sait également que les bactéries pathogènes perdent leur virulence lorsqu'on les cultive à une

température élevée.

Pour obtenir des souches mutantes de B. bronchiseptica utiles à la production d'un vaccin vivant anti-RA, la demanderesse a envisagé les phénomènes précités et a réalisé l'invention qui comprend un procédé de préparation d'une souche mutante améliorée de B. bronchiseptica ayant une forte immunité et une faible virulence,

ainsi qu'un vaccin vivant atténué anti-RA qui en dérive.

Un but de l'invention est de fournir un procédé pour la préparation d'une souche mutante améliorée de B. bronchiseptica ayant une forte immunogénicité et une faible virulence convenant particulièrement bien à la préparation d'un vaccin vivant atténué anti-RA. Un autre but de l'invention est de fournir une souche mutante de B. bronchiseptica ayant des marqueurs génétiques chromosomiques comprenant au moins un marqueur de thermosensibilité (culture à 42'C), de résistance à l'acide nalidixique et d'absence de capacité de production de toxine dermonécrotique (appelée

ci-après TDN) (ci-après TDN-négativité).

Un autre but de l'invention est de fournir un procédé pour la préparation d'une souche mutante de B. bronchiseptica qui consiste à soumettre une souche de B. bronchiseptica à une mutation - induite, isoler un mutant possédant au moins les marqueurs génétiques de thermosensibilité (culture à 42'C), de résistance à l'acide nalidixique et de TDN-négativité, cultiver la souche de B. bronchiseptica sur une boîte de gélose de BordetGengou (ci-après BG) contenant de l'acide nalidixique à 42'C, puis prélever un micro-organisme ayant les caractères morphologiques de la phase I, répéter les opérations de culture sur boîte de gélose BG et de prélèvement de micro-organismes en phase I et convertir les microorganismes en micro-organismes TDN-négatifs en phase I ayant

un antigène capsulaire complet.

Un autre but de l'invention est de fournir un vaccin vivant atténué antiRA comprenant un micro-organisme B. bronchiseptica en phase I ayant au moins des marqueurs génétiques de thermosensibilité (culture à 42'C), de résistance à l'acide nalidixique et de TDN-négativité. Selon l'invention on peut, pour obtenir une souche mutante de B. bronchiseptica, ensemencer avec la souche parente sauvage ou virulente naturelle isolée de B. bronchiseptica une boite de gélose BG contenant 200 Ig/ml d'acide nalidixique, cultiver la boîte à 42'C, prélever les colonies cultivées, repiquer les colonies prélevées sur une boite semblable et répéter l'opération de prélèvement et de repiquage des colonies dans les mêmes conditions

que précédemment.

Dans le mode opératoire ci-dessus, lorsqu'on observe une bonne culture sur une boite de gélose BG contenant de l'acide nalidixique à 42'C, on peut sélectionner la souche mutante par examen de la capacité de production de TDN des colonies qui se sont développées sur la boite en effectuant une épreuve cutanée chez le cobaye, prélever les colonies TDN- négatives, les repiquer et répéter le mode opératoire ci-dessus dans les mêmes conditions que précédemment. Comme exemple de souche de départ utilisée dans l'invention, on peut mentionner une souche sauvage de B. bronchiseptica, telle que la souche B-001 décrite ci-après ou une culture de réserve de

laboratoire, telle que la souche L3.

On ensemence en stries une boite de gélose BG avec une souche B-001 obtenue par culture d'un échantillon recueilli avec un écouvillon de coton dans la cavité nasale d'un porc atteint de RA et on cultive à 37C pendant 2 jours, puis on sélectionne les colonies ainsi obtenues de B. bronchiseptica en fonction de leurs propriétés

comme précédemment décrit.

La souche mutante de l'invention, qui possède les marqueurs génétiques de thermosensibilité (culture à 42'C), de résistance à l'acide nalidixique et de TDN-négativité, peut être produite selon un procédé classique d'induction de mutation. Ainsi, on ensemence une boite de gélose BG avec une souche B-001 contenant 200 kg/ml d'acide nalidixique et on cultive à 42'C pendant 7 jours. On prélève les colonies cultivées sur la boite de gélose ayant les caractères morphologiques des micro-organismes en phase I, on en ensemence une nouvelle boite de gélose BG contenant de l'acide nalidixique et on cultive à 42'C pendant 3-5 jours. Après répétition du prélèvement des micro-organismes, culture et sélection des colonies TDNnégatives selon une épreuve cutanée chez le cobaye, on peut isoler la souche mutante TDN-négative et thermosensible (culture à 42'C). Cette souche est appelée souche B-42 et convient bien à la production d'un vaccin vivant atténué anti-RA pour la prophylaxie des infections à B. bronchiseptica chez le porc. Cette souche mutante B-42 de B. bronchiseptica a été déposée à The Fermentation Research Institute comme culture permanente à laquelle a été attribuée la référence FERM P-9038. Cette souche possède des marqueurs génétiques chromosomiques relatifs aux propriétés de thermosensibilité (culture à 42'C), de résistance à l'acide nalidixique et de TDN-négativité, et de plus la souche présente une quantité suffisante d'antigène capsulaire essentiel à l'obtention d'un vaccin vivant atténué anti-RA, ainsi qu'une

virulence très faible et une forte immunogénicité.

La souche B-42 est donc particulièrement utile à la production d'un vaccin vivant atténué anti-RA pour la prévention des

infections à B. bronchiseptica chez le porc.

La souche B-42 utilisée dans la présente invention a les

caractéristiques et propriétés spécifiques suivantes.

On a examiné les propriétés biologiques de la souche B-42, de la souche B001 (souche sauvage provenant d'un porc atteint de RA du porc), de la souche L3 pour la production d'un vaccin anti-RA tué (culture de réserve) et de la souche ATCC 6417 (culture de réserve) selon les méthodes décrites par Cowan et coll. (Cowan, S.T. et Steel, K.J.: Manual for the Identification of Medical Bacteria, 2ème édition, Cambridge Univ. Press, England, 1974) et on a obtenu les résultats qui figurent dans le tableau 1 qui montrent que la souche B-42 a les mêmes propriétés que la souche B001, la souche L3 et la souche ATCC 4617, à l'exception de l'adaptabilité à une

température élevée et de l'activité hémolytique.

Tableau 1

Souche Propriétés

B-42 B-001 L3 ATCC 4617

Coloration de Gram négative négative négative négative Mobilité + + + +

Fermentation du glucose. .

Production d'indole. .

Test au rouge de méthyle. .

Test VP. .

Utilisation des citrates + + + + Réduction des nitrates + + + + Hydrolyse de l'urée + + + + Réduction de l'oxydase + + + + Test au KCN + + + + Test de décarboxylation de la lysine + + + Réduction de la catalase + + + + Hémolyse (hématies de cheval)

% - + + +

% a + + + ± tJ4 Tableau 1 (suite) Souche Propriétés

B-42 B-001 L3 ATCC 4617

Culture sur boîte de gélose BG à

37C + + + +

42'C + ()b ( )b ( )b Culture sur boîte de gélose BG contenant de l'acide nalidixique (200 kg/ml) à

37C +

42'C + -

a) Hémolyse faible b) Culture médiocre (formation de petites colonies) o - %0 r%) (1) Propriétés biologiques: 1. Thermosensibilité: La souche B-42 (souche mutante) présente une croissance maximale en 2 à 3 jours à 37'C et en 4 à 5 jours à 42'C, tandis que les souches B-001, L3 et ATCC 4617 (souches virulentes) présentent une croissance maximale en 2 jours à 37'C; cependant de très petites colonies (moins de 1 mm de diamètre) se forment en 7 jours à 42'C. Les conditions de cultures à 42'C peuvent constituer un marqueur différenciant une souche mutante B-42 des souches sauvages

et de réserve.

2. Hémolyse: La souche B-42 est dépourvue d'activité hémolytique sur les érythrocytes de cheval ou a une activité hémolytique faible variant

avec la concentration des érythrocytes d'une boîte de gélose BG.

D'autre part, les souches B-001, L3 et ATCC 4617 présentent une activité hémolytique puissante, ce qui peut constituer un marqueur de différenciation entre la souche B-42 et les souches sauvages et

de réserve.

3. Sensibilité à l'acide nalidixique: La souche B-42 présente une bonne culture sur une boite de gélose BG contenant de l'acide nalidixique à 37C et à 42'C, tandis que les souches B-001, L3 et ATCC 4617 sont sensibles à l'acide nalidixique. La concentration minimale inhibitrice d'acide nalidixique vis-à-vis de la souche B-42 est supérieure à 200 Fg/ml et comme, en général, les souches sauvages et de réserve de B. bronchiseptica résistant à l'acide nalidixique sont très rares (voir la référence d'Ogata ci-dessus), la résistance à l'acide nalidixique peut étre un bon marqueur de différenciation entre la souche mutante B-42 et les souches sauvages et de réserve. La culture sur boite de gélose BG contenant de l'acide nalidixique à 42'C rend cette différence plus certaine. 4. Aptitude à la production de TDN: Les micro-organismes B. bronchiseptica en phase I produisent de la TDN et la TDN est connue comme facteur de virulence de ce micro-organisme. Cette toxine participe à l'atrophie des cornets nasaux chez les jeunes porcs et les jeunes souris infectés par la bactérie (Hanada, M., Shimoda, K., Tomita, S., Nakase, Y. et Nishiyama, Y., Production of lesions similar to naturally occuring swine atrophic rhinitis by cell-free sonicated extract of Bordetella

bronchiseptica of pig origin, Jpn. J. Vet. Sci., 41: 1-8, 1979).

Donc, une souche dépourvue de capacité de production de TDN est

essentielle à la préparation d'un vaccin vivant atténué anti-RA.

On a comparé la capacité de production de la TDN de la souche mutante B42 à celle d'une souche sauvage (B-001) et d'une souche vaccinale (L3). On a traité une suspension bactérienne de chaque souche (5 x 1011 cellules/ml) par les ultrasons à 10 kHz pendant 10 minutes (Soniator, Ohtake Works, Tokyo, 150 W) dans un bain d'eau froide et on a centrifugé le produit de traitement par les ultrasons à 10 000 g pendant 60 minutes puis on a filtré à travers un filtre Millipore de 0,22 im pour préparer des échantillons d'étude. On a préparé avec de l'eau distillée des dilutions en série de raison deux des échantillons étudiés. On a injecté par voie intradermique à des cobayes Hartley pesant environ 300 g des portions (0,1 ml) de dilutions de raison deux. Le titre d'un échantillon est l'inverse de la dilution maximale provoquant une lésion nécrotique positive ayant un diamètre supérieur à 5 mm

observée 48 heures après l'injection.

Les résultats figurent dans le tableau 2.

Tableau 2. Activité dermonécrotique Souches Titre dermonécrotique B-42 (mutante) < 2 B-001 (sauvage) 8 192 L3 (vaccinale) 8 192 Comme le montre le tableau 2, la souche B-42 est totalement dépourvue de capacité de production de la TDN, la stabilité de cette propriété se confirmant lorsqu'on repique la souche sur des boites de gélose BG ou qu'on la soumet à 40 passages sur souris (tableau 3). Tableau 3. Effet des passages sur le titre dermonécrotique de la souche B-42 Titre dermonécrotique Passages Repiqué sur boite Passages de gélose BG sur souris Souche d'origine < 2 < 2 passages < 2 < 2 passages < 2 < 2 passages < 2 < 2 passages < 2 < 2 5. Toxicité létale chez la souris: B. bronchiseptica présente une forte toxicité létale chez la souris (voir la référence d'Ogata ci-dessus). On a comparé la toxicité létale de la souche B-42 chez la souris à celle de la

souche vaccinale L3.

On a inoculé par voie intrapéritonéale la souche B-42 ou la souche L3 (1 x 105 à 1 x 1010 cellules/souris) à des souris exemptes de micro- organismes pathogènes spécifiques (appelées ci-après SPF) (20 souris par groupe), âgées de 3 semaines et on les a observées pendant une semaine. Les souris mortes sont autopsiées immédiatement après la mort avec examen macroscopique des poumons et récupération des bactéries inoculées dans les tissus pulmonaires. Les souris survivantes sont tuées par euthanasie une semaine après l'inoculation et soumises à un examen des poumons et à une

récupération des bactéries inoculées dans les tissus pulmonaires.

Comme le montre le tableau 4, la souche B-42 est dépourvue de toxicité létale chez la souris. Cette propriété demeure la même que celle de la souche d'origine après 40 passages de la souche B-42 sur des souris. Cela montre la nature stable de la souche B-42. On a constaté que les souris mortes étaient atteintes de septicémie et de lésions pneumoniques. Aucune modification macroscopique n'a été observée chez les souris survivantes et les bactéries inoculées

n'ont pas pu être récupérées.

Tableau 4. Toxicité létale chez la souris Nombre de bactéries inoculées/souris Souche B-42 Souche L3 1 x 1010 0/20* 20/20* 1 x 109 0/20 20/20 1 x 108 0/20 20/20 1 x 107 0/20 12/20 1 x 106 0/20 4/20 i1 x 105 0/20 0/20 * Nombre de souris mortes/Nombre de souris inoculées Les résultats ci-dessus indiquent que la souche B-42

constitue un vaccin vivant anti-RA de grande innocuité.

(2) Propriétés sérologiques: On a utilisé des sérums hyperimmuns de lapins anti-B-42, anti-L3 et anti-B-001 ou des sérums hyperimmuns de porcs anti-B-42, anti-L3 et anti-B-001 préparés par forte immunisation de lapins ou de porcs avec des micro-organismes en phase I respectivement des souches B-42, L3 et B-001 en utilisant un antigène constitué de microorganismes en phase I de la souche B-42, de micro-organismes en phase I de la souche B-001 et de micro-organismes en phase I de

la souche L3 et un antigène RA du commerce (antigène RA "Kitasato").

(Voir la référence d'Ogata précitée).

Les résultats figurent dans le tableau 5.

Tableau 5. Ag _lutinabilité des souches B-42 _B-001 et L3 vis-à-vis de sérums hyperimmuns préparés avec

des souches homologues.

Sérum hyperimmun Antigène (Micro-organismes en phase I) Souche B-42 Souche L3 Souche B-001 Lapin Porc Lapin Porc Lapin Porc Souche B-42 20 480 10 240 20 480 10 240 20 480 10 240 Souche B-001 20 480 10 240 20 480 10 240 20 480 10 240 Souche L3 20 480 10 240 20 480 10 240 20 480 10 240 Antigène-RA (Kitasato) 20 480 10 24Q 20 480 10 240 20 480 10 240 o %J Comme le montrent clairement les résultats ci-dessus, la souche B-42 a la même antigénicité que la souche B-001 et la souche L3. De plus l'agglutinabilité de la souche B-42 repiquée avec 40 passages sur boite de gélose BG est inchangée par rapport à celle d'une souche d'origine. Les résultats montrent la nature stable de

la souche B-42.

(3) Essai de protection et évaluation de l'innocuité d'un vaccin

vivant atténué préparé à partir de la souche B-42.

On a étudié comme suit la valeur protectrice d'un vaccin

vivant anti-RA préparé à partir de la souche B-42 chez la souris.

On divise des souris SPF âgées de 3 semaines en des groupes

immunisés et un groupe témoin.

On met en suspension la souche B-42 cultivée sur boite de gélose BG à 37C pendant 3 jours dans du tampon salé phosphaté (pH 7,0) pour préparer les suspensions cellulaires figurant dans le tableau 6. On inocule avec les suspensions cellulaires (0,1 ml) un groupe de 30 souris. Trois semaines après l'inoculation, on soumet souris de chaque groupe constituant les groupes immuns et le groupe témoin à une épreuve par injection intrapéritonéale d'une suspension cellulaire (0,1 ml) de micro-organismes en phase I de la

souche L3 dans du tampon salé phosphaté (pH 7,0), les micro-organis-

mes ayant été cultivés sur une boite de gélose BG à 37'C pendant 2 jours. On observe les animaux pendant 2 semaines après l'épreuve. A ce moment, on tue 10 souris de chaque groupe et on mesure les titres

d'agglutination des sérums en utilisant l'antigène RA "Kitasato".

Les résultats figurent dans le tableau 6.

Comme le montre le tableau 6, dans les groupes immunisés, qui ont été inoculés avec la souche B-42 à raison de plus de 107 cellules/souris, tous les animaux survivent sans manifester de symtômes cliniques et de plus on n'observe pas de modifications macroscopiques à l'autopsie deux semaines après l'épreuve. Dans les groupes inoculés respectivement avec 106 et 105 cellules/souris, respectivement 4 et 5 souris meurent après l'épreuve et toutes les souris restantes survivent. L'essai de récupération des bactéries

chez les souris survivantes est négatif.

Tableau 6. Essai de protection chez la souris Dose immunisante de Dose d'épreuve de la Nombre de souris mortes Moyenne géométrique

Souris la souche B-42 souche L3 des titres d'aggluti-

Cellules/0,1 ml/souris Cellules/0,1 ml/souris Nombre de souris étudiées nation de 10 souris dans chaque groupe 1 x 1010 0/20 1 664 1 x 109 0/20 1 216 Groupenis 1 x 108 1 x 108 0/20 448 immunisé 1 x 107 0/20 40 1 x 106 4/20 10 1 x 105 5/20 5 Groupe témoin 1 x 108 20/20 < 5 N o 0% -4 tA4 %O r%) Les titres d'agglutination augmentent en fonction des doses immunisantes. Dans le groupe témoin, les 20 animaux meurent tous de septicémie et un grand nombre de micro-organismes d'épreuve sont

observés dans divers organes de toutes les souris.

Comme précédemment illustré, la souche B-42 de l'invention

assure une immunité supérieure contre l'infection à B. bronchisep-

tica chez la souris avec une grande innocuité.

La souche B-42 de la présente invention a des marqueurs génétiques chromosomiques spécifiques, une immunogénicité supérieure et une grande innocuité et elle est donc utile pour la production d'un vaccin vivant atténué anti-RA pour la prophylaxie de

l'infection à B. bronchiseptica chez le porc.

Le vaccin vivant atténué anti-RA pour la prophylaxie de l'infection à B. bronchiseptica chez le porc peut être produit selon un procédé classique de préparation d'un vaccin vivant atténué par emploi de la souche B-42. Pour cela on ensemence un milieu liquide pour la production d'un vaccin avec la souche B-42 cultivée sur

boite de gélose BG à 37C et on cultive à 37'C.

On recueille les cellules cultivées par centrifugation, on les mélange avec un agent de protection lors de la dessiccation habituel, constitué par exemple de 10 % de lait écrémé et de 5 % de peptone (rapport suspension cellulaire/agent protecteur = 1/1 v/v), on répartit dans des flacons et on lyophilise pour obtenir une préparation de vaccin vivant. Lors de l'emploi, on dissout le produit avec un diluant qui l'accompagne et on administre la solution aux animaux par voie nasale ou par injection intramusculaire. L'invention est illustrée par les exemples non limitatifs suivants.

Exemple 1

Préparation d'une souche mutante: On ensemence une boite de gélose BG contenant 20 kg/ml d'acide nalidixique avec Bordetella bronchiseptica, souche B-001, on cultive à 42'C, on recueille les colonies ayant poussé sur la boite et on repique sur une boite semblable. On répète cette opération dans les mêmes conditions. On sélectionne les micro-organismes TDN-négatifs selon l'épreuve cutanée chez le cobaye pour obtenir, parmi les colonies en phase I capables de pousser à 37'C, une souche

mutante appelée souche B-42.

Exemple 2

On reprend le procédé de l'exemple 1 en remplaçant la souche B-001 par des souches sauvages pour obtenir une souche mutante de B. bronchiseptica pour la préparation d'un vaccin vivant atténué anti-RA.

Exemple 3

On ensemence une boîte de gélose BG avec la souche B-42 préparée selon l'exemple 1 et on cultive à 37C pendant 2 jours. On ensemence un milieu liquide avec cette culture d'ensemencement, on cultive à 37'C, on recueille les cellules cultivées et on les met en suspension dans du tampon salé phosphaté stérilisé (pH 7,0) pour préparer une suspension bactérienne (4,0 x 1010 cellules/ml). On mélange soigneusement la suspension cellulaire avec une quantité égale d'un agent de protection lors de la dessiccation (solution mixte à 10 % de lait écrémé et 5 % de peptone que l'on a stérilisée

à 110'C pendant 10 minutes) pour préparer un produit final en vrac.

On en répartit des portions de 2 ml dans des flacons, on lyophilise et on scelle sous vide pour obtenir un vaccin vivant sec. Lorsque le produit est conservé au froid à 2-5'C et à l'obscurité, ses propriétés demeurent très stables. On peut facilement dissoudre le produit dans du tampon salé phosphaté stérile (pH 7,0) pour obtenir des propriétés homogènes. Lorsqu'on dissout le produit dans 20 ml de véhicule, la solution contient des bactéries vivantes dont la

numération met en évidence plus de 1 x 108 cellules vivantes/ml.

Les exemples d'essai suivants illustrent l'effet du vaccin

vivant atténué anti-RA de l'invention.

Exemple d'essai 1 On effectue l'évaluation de l'innocuité de la souche B42 obtenue dans l'exemple 1, en utilisant des porcs SPF que l'on divise en trois groupes, deux groupes recevant le vaccin vivant atténué anti-RA (chacun à raison de 1,0 ml) par voie intranasale en une quantité respectivement de 1 x 1010 cellules et 1 x 108 cellules et un autre groupe témoin ne recevant pas de bactéries (chaque groupe est constitué de deux animaux). Quinze jours après l'inoculation, on autopsie tous les animaux. Pendant la période d'observation, on n'observe aucun signe clinique anormal chez les animaux et on n'observe aucun symptôme anormal à l'examen macroscopique et à l'examen histologique des divers organes de ces animaux. En

conclusion, la souche B-42 n'est pas toxique pour les porcs.

Exemple d'essai 2 On dissout un vaccin vivant anti-RA dans du tampon salé phosphaté (pH 7,0) et on le dilue de plus avec la même solution selon une série de dilutions de raison 10. On détermine l'immunogénicité du vaccin aux concentrations de 104 cellules/ml,

106 cellules/ml et 108 cellules/ml, en utilisant des porcs SPF.

On divise en quatre groupes 12 porcelets nouveau-nés SPF âgés de trois jours présentant une réaction négative de recherche des anticorps contre B. bronchiseptica (trois groupes immunisés et un groupe témoin) à raison de trois animaux par groupe et on administre le vaccin (à raison de 1 ml par animal) par voie intranasale aux trois groupes immunisés, le dernier groupe ne recevant pas de vaccin. Trois semaines après l'inoculation, on soumet tous les animaux à une épreuve avec la souche L3 de B. bronchiseptica (souche virulente) à raison de 1 x 107 cellules/ml par porc par voie nasale. Dix semaines après l'épreuve, on autopsie

tous les animaux.

Pendant la période expérimentale, aucun animal du groupe vacciné ne présente de symptômes cliniques anormaux et la charpente osseuse des cornets de tous les animaux est normale à l'exception de deux porcs du groupe immunisé avec 1 x 104 cellules/porc qui présentent une légère atrophie des cornets. Dans le groupe témoin non vacciné, tous les animaux présentent des symptômes cliniques, tels qu'un placard oculaire et des éternuements, et on observe un retard de croissance. On observe plusieurs atrophies des cornets nasaux chez tous les animaux à l'autopsie. On confirme que le vaccin

assure une protection efficace des porcs contre B. bronchiseptica.

Exemple d'essai 3 On étudie la souche B-42 sur des porcs SPF présentant une réaction négative de détermination des anticorps contre

B. bronchiseptica pour rechercher une réversion vers la virulence.

On inocule par voie intranasale des porcelets nouveau-nés SPF âgés de trois jours avec le vaccin vivant anti-RA (1 ml/porc, 1 x 1010 cellules/ml). Après une semaine d'observation, on frotte les cavités nasales des porcs avec des écouvillons de coton stériles que l'on plonge dans 1,5 ml de tampon salé phosphaté stérile pour préparer des suspensions des bactéries recueillies. On inocule deux autres porcs nouveau-nés avec 1 ml de suspension et on utilise une autre portion de 0, 5 ml pour rechercher les caractères taxonomiques des microbes et en effectuer le dénombrement. On répète le mode

opératoire trois fois (on utilise deux porcs chaque fois).

On n'observe pas de symptômes cliniques anormaux pendant l'observation ni d'anomalie à l'autopsie. Les bactéries inoculées se

développent bien dans les cavités nasales.

Comme illustré ci-dessus, la souche B-42 ne présente pas de réversion vers la virulence, ce qui confirme la stabilité de ses

propriétés.

Claims (7)

REVENDICATIONS

1. Procédé pour la préparation d'une souche mutante de Bordetella bronchiseptica, ayant des marqueurs génétiques

chromosomiques consistant en au moins des marqueurs de thermosen-

sibilité (culture à 42'C), de résistance à l'acide nalidixique et d'absence de production de la toxine dermonécrotique thermolabile, convenant à la préparation d'un vaccin vivant atténué contre la rhinite atrophique, caractérisé en ce qu'il consiste à soumettre une souche de B. bronchiseptica à une mutation induite, isoler un mutant ayant au moins les marqueurs génétiques de thermosensibilité (culture à 42'C), de résistance à l'acide nalidixique et d'absence de production de la toxine dermonécrotique thermolabile, cultiver la souche de B. bronchiseptica sur une boite de gélose de Bordet-Gengou contenant de l'acide nalidixique à 42'C, puis prélever des micro-organismes ayant les caractères morphologiques de la phase I, répéter les opérations de culture sur boite de gélose de Bordet-Gengou et de prélèvement des micro-organismes en phase I et transformer les micro-organismes en micro-organismes en phase I incapables de produire la toxine thermonécrotique thermolabile ayant

un antigène capsulaire complet.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la mutation induite est obtenue par combinaison d'un traitement à température élevée à 42'C et d'un traitement avec l'acide nalidixique.

3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les opérations de culture sur boite de gélose de Bordet-Gengou contenant de l'acide nalidixique et de prélèvement de micro-organismes ayant une morphologie semblable à celle de la phase

I sont répétées plusieurs fois.

4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la souche de départ de B. bronchiseptica est une souche thermosensible (culture à 42'C) , résistant à l'acide nalidixique et

ne produisant pas la toxine dermonécrotique thermolabile.

5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la souche parente de B. bronchiseptica est une souche sauvage isolée de la cavité nasale d'un porc atteint d'affection à

B. bronchiseptica.

6. Vaccin vivant atténué contre la rhinite atrophique pour la prophylaxie des infections à B. bronchiseptica qui comprend des micro-organismes B. bronchiseptica en phase I de la souche B-42 ayant des marqueurs génétiques chromosomiques de thermosensibilité (culture à 42'C), de résistance à l'acide nalidixique et d'absence

de production de la toxine dermonécrotique thermolabile.

7. Vaccin selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il est destiné à l'administration aux animaux par voie nasale ou

injection intramusculaire.