DK169707B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af en mutantstamme af Bordetella bronchiseptica - Google Patents

Description

DK 169707 B1

Den foreliggende opfindelse angår en særlig fremgangsmåde til fremstilling af en hidtil ukendt mutantstamme af Bordetella bronchiseptica, nemlig en temperaturfølsom og ureasenegativ fase I mutantstamme af B, bronchiseptica, der har fortræffelig immunogenicitet og høj 5 sikkerhed, og som er nyttig til fremstilling af en levende svækket vaccine til profylakse af B. bronchiseptica-infektion.

Fremgangsmåden er ejendommelig ved, at en stamme af B. bronchiseptica tilføres ét eller flere mutagener for at få en mutantstamme med arvelige markører, der i det mindste består i temperaturfølsomhed 10 (stammen kan vokse ved 32°C, men kan ikke vokse ved og over 34°C) og ureasenegativitet, mutants tammen dyrkes på et blodagarmedium, en celle, der vokser i en forholdsvis lille koloni, udvælges, cellen dyrkes på et blodagarmedium, processen med udvælgelse af en celle og dyrkning deraf gentages for at omdanne den til en fase I organisme, 15 der har et fuldstændigt capsulært antigen, og som er hemolytisk, hvorefter mutants tammen, om ønsket, lyofiliseres sammen med et tørringsbeskyttelsesmiddel .

Det er kendt, at Bordetella bronchiseptica forårsager åndedrætssygdomme i adskillige dyr såsom svin, hunde, kaniner, marsvin og mus, 20 især smitsom rhinitis atrophicans hos smågrise, som forårsager atrofi af muslingebenet i næsen og fører til retarderet vækst og formindsket fodringseffektivitet. Dette er et stort problem inden for husdyrindu- strien. Der er for nylig blevet foreslået dræbte vacciner til profylakse af smitsom rhinitis atrophicans hos svin, men disse er stadig 25 utilfredsstillende.

Der er af nærværende ansøger blevet udviklet en mutantstamme af B. bronchiseptica, som er nyttig til fremstillingen af en levende svækket vaccine til profylakse af B. bronchiseptica-infektion, hvilken mutantstamme er afledt af en vild stamme af B. bronchiseptica, især 30 en vild virulent stamme (herefter betegnet som "stamme Si"), som er isoleret fra næsehulen hos svin, der lider af smitsom rhinitis atrophicans (jfr. japansk patentskrift nr. 47612/1980 og Infection and Immunity, bind 22, nr. 2, side 318-321, november 1978). Dvs., at det er lykkedes at få en temperaturfølsom (ts) mutantstamme af B. bron-35 chiseptica, der kan vokse ved 32°C, men som ikke kan vokse ved DK 169707 B1 2 34-37°C eller derover (herefter betegnet som "stamme ts-S34") ved at dyrke stamme SI på et blodagarmedium, behandle en suspension af den resulterende organisme i saltopløsning med nitrosoguanidin, gentage centrifugeringen af saltopløsningsuspensionen, vaske den, dyrke 5 cellerne på et blodagarmedium og derefter samle den temperaturfølsomme mutantstamme ved at anvende replica-metoden.

Den således vundne ts-S34 har en fortraffelig immunogenicitet med svag virulens og er nyttig til fremstilling af en levende svækket vaccine til profylakse af B. bronchiseptica-infektion. Der er imid-10 lertid stadig et mindre problem, hvad angår sikkerheden i relation til anvendelse af stammen som levende vaccine i kommerciel målestok, og til at den stadig er utilstrækkeligt adskilt in vitro fra vilde og/eller virulente stammer, og hvad angår godkendelse i tilfælde af industriel fremstilling eller praktisk anvendelse.

15 For at få en anden mutants tamme af B. bronchiseptica med forbedrede egenskaber, har nærværende ansøger gjort omfattende forsøg på at give stammen andre arvelige markører ud over temperaturf ølsomheden som i stamme ts-S34, ved hvilke mutantstammen lettere kan skelnes fra vilde og virulente stammer og godkendes som en levende vaccine med større 20 sikkerhed, hvilket er en fordel for den industrielle fremstilling af en levende svækket vaccine. Det har vist sig, at den ønskede forbedrede mutants tamme, som egner sig til fremstilling af en levende svækket vaccine til profylakse af B. bronchiseptica-infektion, kan fås ved, at en stamme af B. bronchiseptica tilføres ét eller flere 25 mutagener for at få en mutants tamme med arvelige markører, der i det mindste består i temperaturf ølsomhed (stammen kan vokse ved 32 °C, men kan ikke vokse ved og over 34°C) og ureasenegativitet, mutantstammen dyrkes på et blodagarmedium, en celle, der vokser i en forholdsvis lille koloni, udvælges, cellen dyrkes på et blodagarmedium, processen 30 med udvælgelse af en celle og dyrkning deraf gentages for at omdanne den til en fase I organisme, der har et fuldstændigt capsulært antigen, og som er hemolytisk.

Et formål med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe en fremgangsmåde til fremstilling af en hidtil ukendt mutantstamme af 35 B. bronchiseptica, der egner sig til fremstilling af en levende svæk- DK 169707 B1 3 ket vaccine til profylakse af B. bronchiseptica-infektion. Et andet formål med opfindelsen er at tilvejebringe en mutantstamme af B. bronchiseptica med flere arvelige markører, nemlig temperaturfølsom-hed og ureasenegativitet, hvilke markører er effektive til en son-5 dring fra vilde og/eller virulente stammer og i relation til en godkendelse som levende vaccine. Et yderligere formål med opfindelsen er at tilvejebringe en levende svækket vaccine til profylakse af B. bronchiseptica-infektion, især smitsom rhinitis atrophicans hos svin. Disse og andre formål med og fordele ved den foreliggende 10 opfindelse vil være tydelige for fagfolk på baggrund af nedenstående beskrivelse.

I henhold til den foreliggende opfindelse kan mutantstammen med flere arvelige markører fås ved at sætte et mutagen, fortrinsvis flere mutagener, til en saltopløsningsuspension af en stamme af B. bron-15 chiseptica, fortrinsvis organismer i den logaritmiske vækstfase, som fås ved at dyrke bakterierne på et blodagarmedium i ca. 6-24 timer, centrifugere den således behandlede saltopløsningsuspension nogle få gange eller flere gange, vaske den, dyrke den resulterende stamme på blodagarmedium og derefter indsamle en mutants tamme, som i det mind-20 s te er temperaturfølsom og ureasenegativ (herefter betegnet som "stamme ts-S34.u ") fra kolonierne. Den isolerede stamme er imidlertid en fase III-organisme, der har mistet det specifikke antigen, dvs. capsulært antigen, og som er anhemolytisk og derfor uegnet til fremstilling af levende vacciner.

25 Det er fra TJS patent nr. 3873691 kendt, at man kan forhindre, at fase I organismer mister evnen til at danne kapsel og bliver til fase III organismer ved dyrkning på blodagar. Det har nu overraskende vist sig, at hvis en fase III-organisme dyrkes på et blodagarmedium i lang tid, og en celle, der vokser i en forholdsvis lille koloni, udvælges 30 og anvendes som den næste podningskultur, dvs. cellen dyrkes på et blodagarmedium, og proceduren med udvælgelse af en celle og dyrkning deraf gentages, kan der fås den ønskede fase I-organisme af stamme ts-S34.u med et fuldstændigt capsulært antigen, og som er hemoly-tisk, via en svagt hemolytisk fase II-organisme.

DK 169707 B1 4

Den udgangsstamme, der anvendes i den ovennævnte fremgangsmåde, kan være en vild stamme af B. bronchiseptica (fx stamme SI), eller den kan være stamme ts-S34, der er temperaturfølsom, og som fremstilles ved den i de ovennævnte referencer anførte metode. Når der anvendes 5 en vild stamme som udgangs s tammen, omdannes stammen til en temperaturfølsom mutantstamme ved at tilsætte et mutagen som beskrevet i de ovennævnte referencer, hvorefter mutantstammen får ureasenegativ-egenskaben ved, at der tilføres et mutagen. Alternativt kan den vilde udgangsstamme først omdannes til en mutantstamme, der har urease-10 negativ-egenskaben ved, at der tilføres et mutagen, hvorefter mutantstammen bliver temperaturfølsom på tilsvarende måde. Ud fra praktiske hensyn foretrækkes det at anvende stammen ts-S34 som udgangs s tammen.

Den således vundne fase I stamme ts-S34.u har som nedenfor nævnt flere arvelige chromosomale markører nemlig ureas enegat ivi te t ud over 15 temperaturfølsomheden og yderligere retarderet vækst (fx tager dannelsen af en koloni på et blodagarmedium ca. 3-4 dage). Endvidere har stammen et fuldstændigt capsulært antigen, hvilket er essentielt for en levende vaccine, og den har yderligere en høj sikkerhed og højere immunogenicitet end stammen ts-S34. Denne fase I stamme ts-20 S34.U er derfor særlig nyttig til fremstilling af en levende svækket vaccine til profylakse af B. bronchiseptica-infektion.

Fremgangsmåden til fremstilling af fase I stamme ts-S34.u er forklaret detaljeret nedenfor (idet stamme ts-S34 er anvendt som udgangsstammen til formål for forklaringen).

25 (1) Fremstilling af fase III stamme ts-S34.u ud fra stamme ts-S34

Stamme ts-S34, der fås ved den i ovennævnte japanske patentskrift nr. 47612/1980 og Infection & Immunity beskrevne metode, anvendes. Stamme ts-S34 dyrkes på et blodagarmedium (bestanddele: trypticase-soja-agarmedium (BBL), dvs. hydrolyseret soj abønnecasein-agarmedium be-30 skrevet i U.S. Pharmacopeia, XX, juli 1, 1980, side 875, hvortil sættes 10% defibrineret fåreblod) (herefter betegnet som "TS-blod-agarmedium") ved 32°G natten over, og de resulterende celler optages i en hensigtsmæssig pufret saltopløsning, fx en phosphatpufret saltopløsning (pH-værdi 7,0), og til den resulterende saltopløsning- DK 169707 B1 5 suspension af celler i den logaritmiske vækstfase sættes et mutagen, fortrinsvis flere mutagener.

Mutagenet omfatter de sædvanlige måder til mutering af mikroorganismer, fx behandling med forskellige mutageneringsmidler såsom nitro-5 soguanidin (fx N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin), salpetersyre, 2-aminopurin, 5-bromuracil, etc. og ultraviolet bestråling eller radioaktiv bestråling. Disse midler kan anvendes alene, men anvendes fortrinsvis i en kombination af to eller flere af midlerne for at opnå den ønskede mutants tamme med flere arvelige markører mere effek-10 tivt. Den foretrukne kombination er en kombination af behandling med nitrosoguanidin og ultraviolet bestråling.

Den således vundne mutantstamme isoleres ved centrifugering, vaskes og dyrkes derefter på et blodagarmedium ved 32°C i 3 dage. Cellerne i vækstkolonien udsættes for en ureasetest, og den stamme, som er 15 ureasenegativ, indsamles, hvorved fås stamme ts-S34.u , som er en fase III-organisme.

(2) Fremstilling af en fase I organisme ud fra en fase III organisme Nærværende ansøger er gået ud fra det faktum, at en fase I organisme af B. bronchiseptica vokser i en lille koloni og er stærkt hemoly-20 tisk, hvorimod fase III organismen vokser i en stor koloni og er arihemolytisk, og har fundet en fremgangsmåde til omdannelse af fase III organismen til fase I organismen.

Fase III stamme ts-S34.u dyrkes på et blodagarmedium (bestanddel:

Bordet-Gengou-medium (Difco) med 10% defibrineret fåreblod, jfr.

25 "Saikingaku Jisshu Teiyo" (Manual of Practice in Bacteriology) 5. udgave (1976) Japan, side 79 og "Manual of Clinical Microbiology" udgivet af American Soc. for Microbiology, 2. udgave (1974), side 894-895 (herefter betegnet som "BG-medium") ved 32°C i 3 dage eller længere, sædvanligvis 3-6 dage, og ud fra forholdsvis små kolonier 30 udvælges en celle, der fortrinsvis er hemolytisk, selv svagt hemoly-tisk, hvilken celle dyrkes på det samme medium. Denne fremgangsmåde til udvælgelse af en celle og dyrkning deraf gentages to eller flere gange, sædvanligvis 2-10 gange, hvorved der isoleres den ønskede fase DK 169707 B1 6 I organisme, som er stærkt hemolytisk, via en fase Il-organisme, som er svagt hemolytisk. Denne fase I stamme ts-S34.u blev deponeret hos Fermentation Research Institute (FRI), Japan under deponerings-nummeret FERM BP-303.

5 Fase I stamme ts-S34.u har følgende karakteristika: (1) biologiske karakteristika (a) temperaturfølsomhed.

Denne stamme vokser ved 32°C, men vokser ikke ved 34-37°C eller derover ligesom stammen ts-S34.

10 (b) Ureasetest.

Ureasetesten blev udført som en sædvanlig ureasetest vinder anvendelse af en ureasetestvæske (jfr. den ovennævnte "Manual of Clinical Microbiology", 2. udgave (1974), side 923-924. Denne test blev udført på forskellige bakterier såsom flere underkulturer af fase I organismen 15 stamme ts-S34, vildstammen SI, en anden vildstamme A-19, der var afledt af svin, som led af smitsom rhinitis atrophicans, en stamme af Alcaligenes faecalis, som har næsten tilsvarende biologiske karakteristika som vild B. bronchiseptica, med undtagelse af ureasenegativ (jfr. Cowan and Steel's Manual for the Identification of Medical Bac-20 teria, 2. udgave 1974), og E. coli (de samme bakterier blev anvendt i andre tests, der er beskrevet nedenfor). Resultaterne er vist i tabel 1.

DK 169707 Bl 7 TABEL 1

Stammer 2 timer* 7 dage 5 ts-S34.u fase I Oprindelig

Underkultur efter 5 ompodninger

Underkultur efter 7 ompod-10 ninger

Underkultur efter 10 ompodninger

Underkultur efter 20 ompodninger 15 ts-S34.u fase II - -

ts-S34.u fase III

ts-S34 + + SI + + 20 A-19 + +

Alcaligenes faecalis E. coli *) Sædvanlig undersøgelsestid 25 Det ses af de ovennævnte testresultater, at fase I stamme ts-S34.u’ er ureasenegativ, og denne arvelige egenskab er meget stabil.

(c) Koloniernes væksthastighed.

Forskellige bakteriekoloniers væksthastighed blev sammenlignet udtrykt i vækst på to slags plademedier.

30 Ved at anvende TS-blodagarmedium, hvorpå bakterier vokser godt, og BG-medium, hvorpå bakterier vokser langsommere, blev bakterier dyrket ved 32°C i 5 dage, og diameteren på hver koloni blev målt hver dag. Resultaterne er vist i fig. 1. Det fremgår tydeligt af resultaterne, DK 169707 B1 8 at fase I stamme ts-S34.u voksede i 3-5 dage, før koloniens diameter blev større end 0,5 mm, hvilket betyder, at denne stamme vokser langsomt i sammenligning med den vilde fase I stamme SI.

Under anvendelse af KCN-medium (jfr. den ovennævnte "Manual of Clini-5 cal Microbiology", 2. udgave (1974), side 915) og Simmons citrat- agarmedium (jfr. den ovennævnte "Manual of Clinical Microbiology", 2. udgave (1974), side 898), blev bakterierne ydermere dyrket ved 32°C i flere dage. Resultaterne er vist i henholdsvis tabel 2 og 3.

TABEL 2 10 Vækst i KCN-medium

Stammer Dyrkningstid 2 dage1 3 dage 4 dage

15 ts-S34.u fase I

Oprindelig - ± +

Underkultur efter 5 ompodninger - ± +

Underkultur efter 7 ompod- 20 ninger - ± +

Underkultur efter 10 ompodninger - ± + ...

Underkultur efter 20 ompodninger - ± + 25 ts-S34.u fase II + + + ts-S34.u fase III + + + ts-S34 + + + SI + + + 30 A-19 + + +

Alcaligenes faecalis + + + E. coli ...

Sædvanlig undersøgelsestid DK 169707 B1 9 TABEL 3 Vækst på Simmons citratagarmedium

Stammer Dyrkningstid 5 1 dag 4 dage* 7 dage

ts-S34.u fase I

Oprindelig +

Underkultur efter 5 10 ompodninger +

Underkultur efter 7 ompodninger +

Underkultur efter 10 ompodninger + + 15 Underkultur efter 20 ompodninger + + ts-S34.u fase II + + ts-S34.u fase III + + 20 ts-S34 - - + SI + + + A-19 + + +

Alcaligenes faecalis + + + E. coli - 25 _ *) Sædvanlig undersøgelsestid

Det fremgår klart af de ovenfor anførte resultater, at fase I stamme ts-S34.u var negativ efter den sædvanlige dyrkningstid og blev positiv ved en længere dyrkningstid, hvilket betyder, at stammen er 30 sen til at danne kolonier.

Andre biologiske karakteristika af fase I stamme ts-S34.u er de samme, som de biologiske karakteristika af stamme Si og stamme ts-S34.

DK 169707 B1 10 (2) Antigenkarakteristikon

Anti-Sl-hyperimmunt kaninserum og anti-ts-S34.u hyperimmunt griseserum, der blev fremstillet ved at høj immunisere en kanin og en gris med henholdsvis fase I stamme Si og fase I stamme ts-S34.u , blev 5 udsat for en agglutinerings test in vitro ved som antigen at anvende fase I stamme SI, fase I stamme ts-S34.u et kommercielt tilgængeligt antigen for rhinitis atrophicans (AR-antigen "Hokken") og Alcaligenes faecalis IAM 1473 (jfr. T. Shimizu, Atrophic Rhinitis, 3. Serodiagno-sis, i Pig Pathology udgivet af Kindai Shuppan, Tokyo, Japan, 1977).

10 Resultaterne er vist i tabel 4.

TABEL 4

Agglutinerings evne mod anti-Sl hyperimmunt kaninserum og anti-ts-S34.u hyperimmunt griseserum 15 Antigen Anti-Sl-hy- Anti-ts-S34.u perimmunt hyperimmunt kaninserum griseserum

Stamme SI 20.480 20.480 20 Stamme ts-S34.u 20.480 20.480 AR-antigen "Hokken" 20.480 20.480

Alcaligenes faecalis <10 <10

Bemærkning: Antigenerne var alle fase I organismer.

25 Det fremgår af de ovennævnte resultater, at tre antigener, herunder fase I stamme ts-S34.u’ alle havde et agglutineringstiter på 20.480 gange, og således havde fase I stamme ts-S34.u den samme antige-nicitet som den vilde fase I stamme Si. Til forskel herfra havde Alcaligenes faecalis, der har biologiske egenskaber, der meget ligner 30 de biologiske egenskaber af fase I stamme ts-S34.u et agglutineringstiter på mindre end 10 gange, hvilket betyder, at Alcaligenes DK 169707 B1 11 faecalis er helt forskellig fra fase I stamme ts-S34.u hvad angår antigenicitet.

(3) Test for den profylaktiske værdi og sikkerhed af levende svækket vaccine, som er fremstillet ud fra fase I stamme ts-S34.u .

5 Den profylaktiske værdi af en levende vaccine, som er fremstillet ud fra fase I stamme ts-S34.u blev testet ved den nedenstående fremgangsmåde under anvendelse af marsvin.

Marsvin af Hartley-stammen, der vejer ca. 300 g (22 dyr), blev delt i en immuniseret gruppe (12 dyr) og en kontrolgruppe (10 dyr).

10 Fase I stamme ts-S34.u blev dyrket på BG-medium ved 32®C i 2 dage, og cellerne blev optaget i phosphatpufret saltopløsning (pH- værdi 7,0). Den således vundne cellesuspension (hver på 0,2 ml) blev inoku- leret i begge næsehuler på de marsvin, der skulle immuniseres (samlet 0,4 ml, 6 x 10^ organismer). 4 uger efter immuniseringen blev alle 15 marsvin, både den immuniserede gruppe og kontrolgruppen, inficeret med den virulente fase I stamme SI af B. bronchiseptica ved at inoku- lere en cellesuspension af bakterierne (hver på 0,2 ml) i begge næsehuler på marsvinene (i alt 0,4 ml), idet cellesuspensionen blev fremstillet ved at dyrke bakterierne på BG-medium ved 37°C i 1 dag og 20 optage de dyrkede bakterieceller i phosphatpufret saltopløsning (pH- 10 værdi 7,0). Xnokuleringsmængden til inficering var i alt 1,32 x 10 organismer (dvs. 15.000 x LD,-^ (50% dødelig dosis)). Dyrene blev iagttaget i 5 uger efter infektionen. Resultaterne er vist i tabel 5.

TABEL 5 DK 169707 B1 12

Marsvin Antal døde dyr/ Dødstidspunkt samlet antal dyr 5 __

Immuniseret gruppe 0/12 o o o o o o o o o o o o

Kontrolgruppe 10/10 12356 10 · · · · · 7 8 10 12 14 • · · · · *) o: overlevende. ·: døde (tallet står for dødstidspunktet i dage) 15 Det fremgår af de ovennævnte resultater, at hvad angår den immuniserede gruppe, som blev immuniseret med den levende vaccine af fase I stamme ts-S34.u overlevede samtlige 12 dyr uden at udvise kliniske symptomer, og ydermere blev der ikke iagttaget nogen patologisk ændring ved obduktion 5 uger efter infektionen. Til forskel herfra 20 døde samtlige 10 dyr i den ikke-vaccinerede kontrolgruppe af septi-kæmi med åndedrætsbesvær inden for 14 dage efter infektionen.

Fase I stamme ts-S34.u giver således fortræffelig immunitet mod B. bronchiseptica-infektion med høj sikkerhed, dvs. uden nogen kliniske symptomer.

25 (4) Analyse af varmelabilt toxin

Det formodes, at det varmelabile toxin (herefter betegnet som "HLT") af B. bronchiseptica er en medvirkende årsag til atrofi i næsens muslingeben hos svin, som er inficeret med bakterien. Det er derfor vigtigt at eliminere den uønskede bivirkning som følge af HLT i den 30 levende svækkede vaccine mod smitsom rhinitis atrophicans.

DK 169707 B1 13

Bivirkningen, der skyldes HLT i forskellige bakterier, blev analyseret under anvendelse af marsvin. Testbakterierne var fase I stamme ts-S34.u , og derudover stamme ts-S34, stamme Si, Alcaligenes faeca-lis IAM 1473 og E. coli B 41.

5 Hver teststamme (fase I organisme) blev dyrket på TS-medium ved 32°C

i 2 dage, og cellerne blev høstet i destilleret vand (5 ml). Den 11 resulterende cellesuspension af hver testbakterie (5 x 10 organis-mer/ml) blev soniceret med en sonicator (Sonifer model 200, 150 W) ved 20 KHz i 15 minutter, og blandingen blev centrifugeret under 10 afkøling ved 4°C og ved 15.000 rpm i 30 minutter, hvorefter den blev filtreret gennem et 0,3 μα Millipore-filter. En to ganges seriefortynding af den resulterende blanding blev fremstillet med en fysiologisk saltopløsning. 1/10 ml af hver opløsning blev inokuleret intra-cutant i marsvin af Hartley-stammen, som vejede ca. 300 g, og den 15 maksimale fortynding blev bestemt, ved hvilken der forekom nekrotiske læsioner 1 dag efter inokuleringen. Resultaterne er vist i tabel 6.

TABEL 6

Stammer Maksimal fortynding 20 _

Stamme ts-S34.u x 2 stamme ts-S34 x 4

Alcaligenes faecalis IAM 1473 x 1 stamme SI x 64 25 E. coli B 41 x 2

Det fremgår af de ovennævnte resultater, at fase i stamme ts-S34.u har et meget lavt indhold af HLT, som er ca. halvdelen af indholdet af HLT i stamme ts-S34. Dette tyder på, at fase I stamme ts-S34.u er 30 meget sikker som levende vaccine, når det tages i betragtning, at der ikke optræder nogen kliniske symptomer i den ovennævnte test for profylaktisk værdi.

Fase I stamme ts-S34.u har således specifikke arvelige chromosomale markører og har en fortræffelig immunogenicitet og er også meget DK 169707 B1 14 sikker, hvorfor den er meget nyttig til fremstilling af en levende svækket vaccine til profylakse af B. bronchiseptica-infektion.

Den levende svækkede vaccine til profylakse af B. bronchiseptica-infektion kan fremstilles på kendt måde ud fra fase I stamme ts-S34.u .

5 Fx dyrkes fase I stamme ts-S34.u på et blodagarmedium (fx BG-medium) ved 32°C for at vokse tilstrækkeligt, og de dyrkede celler høstes i en phosphatpufret saltopløsning (pH-værdi 7,0) for at fremstille en cellesuspension. Suspensionen blandes med et sædvanligt tørringsbeskyttelsesmiddel, fx en blanding af 10% skummetmælk og 5% gærekstrakt 10 (cellesuspensionen: blandingen er lig med et volumenforhold på 1:1) og pakkes særskilt i hætteglas efterfulgt af lyofilisering. Produktet bringes, når det anvendes, tilbage til sin oprindelige form med en phosphatpufret saltopløsning (pH-værdi 7,0), og denne opløsning administreres i dyrets næsehule ved hældning eller sprøjtning.

15 Vaccinen administreres sædvanligvis til dyret i en mængde på mere end 104 organismer, fortrinsvis 10^ til 10^ organismer.

Fremstilling ifølge opfindelsen af fase I stamme ts-S34.u er nærmere belyst ved nedenstående eksempler.

EKSEMPEL 1 20 (1) Fremstilling af stamme ts-S34.u’ ud fra stamme ts-S34

Stamme ts-S34 af B. bronchiseptica podes på et blodagarmedium (TS-blodagarmedium) og dyrkes ved 32®C i 1 dag. De dyrkede celler høstes i en phosphatpufret saltopløsning (pH-værdi 7,0), hvorved fås en cellesuspension. Til cellesuspensionen (4 ml) sættes N-methyl-N' -25 nitro-N-nitrosoguanidin i en s lutkoncentration på 1.000 μg/ml, og blandingen inkuberes under omrystning ved 32°C i 1 time. Kulturopløsningen bestråles derefter med ultraviolet lys (afstand 10 cm, tid 4 sekunder). Den resulterende opløsning centrifugeres ved 3000 rpm i 15 minutter (gentages tre gange), hvorefter den vaskes med den oven-30 for anførte phosphatpufrede saltopløsning. De resulterende celler gensuspenderes i den samme phosphatpufrede saltopløsning og dyrkes på DK 169707 B1 15 det ovennævnte blodagarmedium ved 32°C i 3 dage. Ureasenegative stammer indsamles fra de resulterende kolonier i overensstemmelse med ureasetesten, hvorved fås en fase III stamme ts-S34.u .

(2) Fremstilling af fase I organisme ud fra en fase III organisme 5 Fase III stamme ts-S34.u suspenderes i en phosphatpufret saltopløsning (pH-værdi 7,0), og den fortyndede cellesuspension dyrkes på et blodagarmedium (BG-medium) ved 32°C i 3 dage eller mere. Ud fra en forholdsvis lille koloni, der dannes efter mere end 3 dage, udvælges en celle, som dyrkes på det ovenfor anførte medium. Den således 10 vundne kultur dyrkes igen, og cellen udvælges på den ovenfor anførte måde. Efter at have gentaget den ovenfor anførte fremgangsmåde 10 gange, fås en fase I organisme, der dyrkes i en lille koloni, som har stærke hemolytiske egenskaber, via en fase II organisme, som har svage hemolytiske egenskaber.

15 EKSEMPEL 2 På samme måde som beskrevet i eksempel 1 (1) med undtagelse af; at cellesuspensionen, til hvilken der sættes N-methyl-N'-nitro-N-nitro-soguanidin i en slutkoncentration på 1000 μg/ml, inkuberes under omrystning ved 32eC i 1 time i stedet for at blive behandlet med nitro-20 soguanidin og ultraviolet bestråling, fås en fase III stamme ts-S34.u . Den således vundne organisme behandles på samme måde som beskrevet i eksempel 1 (2) med undtagelse af, at proceduren med dyrkning og udvælgelse af cellen gentages fire gange, hvorved fås en fase I stamme ts-S34.u .

25 EKSEMPEL 3 På samme måde som beskrevet i eksempel 1 (1) med undtagelse af, at cellesuspensionen bestråles med ultraviolet lys (afstand: 20 cm, tid: 4 sekunder) i stedet for behandlingen med nitrosoguanidin og ultraviolet bestråling, fås en fase III stamme ts-S34.u”. Den således 30 vundne organisme behandles på samme måde som beskrevet i eksempel 1 DK 169707 B1 16 (2) med undtagelse af, at proceduren for dyrkning og udvælgelse af cellen gentages fire gange, hvorved fås en fase I stamme ts-S34.u .

EKSEMPEL 4

Den i eksempel 1 vundne fase I stamme ts-S34.u af B. bronchiseptica 5 inokuleres på BG-medium (pH-værdi 6,8, tilsat 10% defibrineret fåre-blod) og dyrkes ved 32°C i 2 dage. De dyrkede celler indsamles og suspenderes i en steril phosphatpufret saltopløsning (pH-værdi 7,0) i en koncentration på 1,5 x 109 organismer pr. ml. Cellesuspensionen blandes godt med en lige stor mængde af et tørringsbeskyttelsesmiddel 10 (en blanding af 10% skummetmælk og 5% gærekstrakt, som steriliseres ved 110®C i 10 minutter), hvorved fås et slutvolumen. Dette volumen (hver på 2 ml) hældes i 10 ml's hætteglas, som lyofiliseres og forsegles under reduceret tryk, hvorved fås en levende vaccine (lyofili-seret). Når produktet opbevares et mørkt sted ved 2-5°C, bevares dets 15 egenskaber meget stabilt. Desuden kan dette produkt let opløses i et opløsningsmiddel, fx i en steril phosphatpufret saltopløsning (pH-værdi 7,0), og har ensartede egenskaber. Når produktet opløses i et opløsningsmiddel (10 ml), indeholder opløsningen en næsten tilfredsstillende mængde af levende bakterier, nemlig mere end 10® organis-20 mer/ml.

Test I:

Den i eksempel 1 vundne fase I stamme ts-S34.u blev underkastet en sikkerhedstest under anvendelse af HPCD-grise. Der blev anvendt 8 HPCD-smågrise, 6 dage gamle, der var negative med hensyn til B.

25 bronchiseptica-antistof. Grisene blev opdelt i fire grupper, hvoraf bakterierne blev inokuleret i de tre af grupperne i en mængde på henholdsvis 6,2 x 10^, 6,2 x 10® og 6,2 x 109 organismer, og hvor der ikke blev inokuleret nogen bakterier i den sidste af grupperne (hver gruppe bestod af to dyr). Den bakterielle cellesuspension (hver på 30 1,0 ml) blev inokuleret i næsehulen på hvert dyr. Efter observation i 12 uger blev dyrene obduceret. I løbet af observationstiden blev der ikke iagttaget nogen abnorme symptomer med hensyn til aktivitet, appetit, etc. hos nogen af dyrene i de vaccinerede eller ikke-vacci- DK 169707 B1 17 nerede grupper. Derudover viste der sig ingen abnorme symptomer ved makroskopisk eller mikroskopisk undersøgelse. Mutants tammen er således risikofri at anvende på svin.

Test II: 5 Den i eksempel 4 vundne levende vaccine blev opløst i en steril phos-phatpufret saltopløsning og fortyndet med den samme opløsning i en serie på 10 ganges fortynding. Vaccinens immunogenicitet i en koncentration på ca. ΙΟ4, 106 og 10** organismer/ml blev testet under anvendelse af HPCD-grise.

10 Otte HPCD-smågrise, der var 6 dage gamle, og som var negative med hensyn til B. bronchiseptica-antistof, blev opdelt i fire grupper, idet vaccinen i tre af grupperne blev inokuleret i en mængde på henholdsvis 6,2 x 104, 6,2 x 10** og 6,2 x 10** organismer, og idet der i den sidste gruppe ikke blev inokuleret nogen vaccine (hver gruppe 15 bestod af 2 dyr). Den fortyndede vaccine blev inokuleret i næsehulen på hvert dyr i den ovenfor anførte mængde. 3 uger efter inokuleringen blev alle dyrene inficeret med en særdeles virulent vild stamme Si af B. bronchiseptica ved administration af stammen i næsehulen i en mængde på 2,5 x 10^ organismer pr. dyr. 10 uger efter infektionen 20 blev dyrene obduceret. I løbet af observationsperioden fra infektionen til obduktionen udviste ingen af dyrene i den vaccinerede gruppe abnorme symptomer i den generelle iagttagelse såsom aktivitet, appetit, etc., og heller ikke kliniske symptomer. Atrofi af muslingebenet var også negativ i tilfælde af dyr, der var blevet inokuleret med 25 6,2 x 10** og 6,2 x 10** organismer, medens ét dyr, der var blevet inokuleret med 6,2 x 104 organismer, viste tegn på lettere lungebetændelse og lettere atrofi af muslingebenet.

I den ikke-vaccinerede gruppe udviste dyrene kliniske symptomer såsom "eye patch" og nysen, og fodringseffektiviteten var lav, og ydermere 30 blev der observeret atrofi af muslingebenet ved obduktionen. Ud fra de ovennævnte data blev det bekræftet, at vaccinen er effektiv.

Test III: 18 DK 169707 B1

Fase I stamme ts-S34.u blev testet for, om virulensen blev reproduceret, under anvendelse af HPCD-grise. Den levende stamme blev inoku-leret i en mængde på 6,2 x 10^ organismer i næsehulen på HPCD-grise, 5 der var 6 dage gamle. Efter observation i 11 uger blev næsehulen aftørret med en steril vatpind, og det aftørrede materiale blev suspenderet i 2 ml af en phosphatpufret saltopløsning (pH-værdi 7,0).

1 ml af suspensionen blev inokuleret i andre grise og yderligere 1 ml blev dyrket for at identificere bakterierne og teste deres egenska-10 ber. Denne procedure blev gentaget tre gange (der anvendtes to grise i hvert forsøg). Alle dyrene i det første, andet og tredje forsøg samt i kontrolgruppen (ikke inokuleret med bakterien) viste ingen abnorme symptomer med hensyn til aktivitet, appetit, etc. og ingen abnorme symptomer ved makroskopisk og mikroskopisk iagttagelse. Ud 15 fra de ovenfor anførte data blev det bekræftet, at fase I stamme ts-S34.u ikke reproducerer virulensen og er meget stabil.

EKSEMPEL 5 (a) Fremstilling af levende vacciner indeholdende ts-S34 og ts-S34u"

Fase I stammer af henholdsvis ts-S34u' og ts-S34 blev suspenderet i 20 steril phosphatbufret saltvand (PBS) til en koncentration på 1,5 x 10^ celler/ml. Cellesuspensionerne blev blandet med en lige mængde af et tørringsbeskyttende middel bestående af 10% skummetmælk og 5% gærekstrakt. Den resulterende blanding blev fordelt i 2 ml portioner i 10 ml hætteglas efterfulgt af lyofilisering og forsegling 25 til opnåelse af en lyofiliseret levende vaccine.

(b) Immunogenicitetstest

De opnåede levende vacciner blev opløst i steril PBS og fortyndet i en 10-folds fortyndingsrække til opnåelse af vacciner med forskellige koncentrationer af mikroorganismer som angivet i tabel 7.

DK 169707 B1 19 HPCD ("hysterectomy produced colostrum deprived") smågrise (som var negative med hensyn til B. bronchiseptica-antistoffer, 6 dage gamle, 2 dyr per gruppe, 10 grupper) blev immuniceret med den således opnåede fortyndede vaccine ved inokulering af vaccinen i dyrenes næse-5 huler. Tre uger efter inokuleringen blev dyrene eksponeret for en stærkt virulent vildstamme SI af Bordetella bronchiseptica ved administration af stammen i næsehulen i en mængde på 2,5 x 10^ organismer per dyr. Ti uger efter eksponeringen blev dyrene obduceret. I løbet af observationsperioden fra eksponeringen til obduceringen blev 10 antallet af dyr, som udviste abnorme symptomer som følge af infektionen med Sl-stammen, talt. Resultaterne er vist i tabel 7.

TABEL 7

Stamme Koncentration af mikroorganisme i vaccine 15 Ikke-ino- 6,4x10^ 6,4x10^ 6,4x10® 6,4x10® /ml kuleret ts-S34u‘ 2/2 1/2 0/2 0/2 0/2 stamme 20 ts-S34- 2/2 2/2 1/2 0/2 0/2 stamme

Som det fremgår af tabel 7, blev der under observation af dyrene inokuleret med ts-S34u*-stammen og den kendte ts-S34-stammen for så 25 vidt angår ts-S34u"-stammen kun observeret let pneumoni og let atrofi af muslingeben i et dyr inokuleret med vaccinen i en koncentration af mikroorganismer på 6,4 x 10^, men for så vidt angår ts-S34-stammen blev der observeret let pneumoni og let atrofi af muslingeben hos 2 dyr inokuleret med vaccinen i en koncentration af mikroorganismer på 30 6,4 x 10^ og ligeledes i 1 dyr inokuleret med vaccinen i en koncen tration af mikroorganismer på 6,4 x 10^. I øvrigt udviste dyrende i den uvaccinerede gruppe kliniske symptomer såsom øjenpletter og nysen, og udnyttelsen af foder var lavere, og mere .fremskreden atrofi af muslingeben blev tydeligt observeret under obduktionen.

Claims (6)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af en mutantstamme af Bordetella bronchiseptica med flere arvelige chromosomale markører, der i det mindste består i temperaturfølsomhed og ureasenegativitet, hvilken mutantstamme er nyttig til fremstilling af levende vaccine eller en levende svækket vaccine baseret på mutants tammen til profylakse af B. 10 bronchiseptica-infektion, kendetegnet ved, at en stamme af B. bronchiseptica tilføres ét eller flere mutagener for at få en mutantstamme med arvelige markører, der i det mindste består i temperaturfølsomhed (stammen kan vokse ved 32°C, men kan ikke vokse ved og over 34°C) og ureasenegati-15 vitet, mutants tammen dyrkes på et blodagarmedium, en celle, der vokser i en forholdsvis lille koloni, udvælges, cellen dyrkes på et blodagarmedium, processen med udvælgelse af en celle og dyrkning deraf gentages for at omdanne den til en fase I organisme, der har et fuldstændigt capsulært antigen, og som er hemolytisk, hvorefter 20 mutantstammen, om ønsket, lyofiliseres sammen med et tørringsbeskyttelsesmiddel .

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at mutagenet er en kombination af behandlingen med nitrosoguanidin og ultraviolet bestråling.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at processen med udvælgelse af en celle og dyrkning deraf gentages to gange eller mere.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at processen med udvælgelse af en celle 30 og dyrkning deraf gentages 2-10 gange. DK 169707 B1

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at udgangs s tammen af Borde tella bron-chiseptica er en mutantstamme, der er temperaturfølsom.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, 5 kendetegnet ved, at udgangsstammen af Borde tella bron-chiseptica er en vild stamme.