CZ295933B6 - Způsob kultivace bakterie Lawsonia intracellularis a vakcína - Google Patents

Způsob kultivace bakterie Lawsonia intracellularis a vakcína Download PDF

Info

Publication number
CZ295933B6
CZ295933B6 CZ19973899A CZ389997A CZ295933B6 CZ 295933 B6 CZ295933 B6 CZ 295933B6 CZ 19973899 A CZ19973899 A CZ 19973899A CZ 389997 A CZ389997 A CZ 389997A CZ 295933 B6 CZ295933 B6 CZ 295933B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
intracellularis
cells
cell culture
infected
culture
Prior art date
Application number
CZ19973899A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ389997A3 (cs
Inventor
Jeffrey P. Knittel
Michael B. Roof
Original Assignee
Boehringer Ingelheim/Nobl Laboratories, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27041284&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ295933(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from US08/465,337 external-priority patent/US5714375A/en
Application filed by Boehringer Ingelheim/Nobl Laboratories, Inc. filed Critical Boehringer Ingelheim/Nobl Laboratories, Inc.
Publication of CZ389997A3 publication Critical patent/CZ389997A3/cs
Publication of CZ295933B6 publication Critical patent/CZ295933B6/cs

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/554—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being a biological cell or cell fragment, e.g. bacteria, yeast cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/105—Delta proteobacteriales, e.g. Lawsonia; Epsilon proteobacteriales, e.g. campylobacter, helicobacter
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C12N9/92—Glucose isomerase (5.3.1.5; 5.3.1.9; 5.3.1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56922—Campylobacter
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/521—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/825—Bacterial vaccine for porcine species, e.g. swine

Abstract

Způsob zahrnuje kroky inokulace buněk buněčné kultury bakterií L. intracellularis, čímž se buňky infikují, inkubaci infikovaných buněk při těplotě 36 až 38 .degree.C při snížené koncentraci kyslíku a udržování infikovaných buněk v suspenzi. Z kultur rostoucích v suspenzi se připravují vakcíny proti L. intracellularis. Předmětem vynálezu je rovněž způsob určení protilátek, bakterie a její oslabená varianta.

Description

Způsob kultivace bakterie Lawsonia intracellularis a vakcína
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká vakcín proti Lawsonia intracellularis a způsobu ochrany proti této bakterii a diagnostiky infekce způsobené touto bakterií. Výsledky a způsoby podle vynálezu jsou částečně dosažitelné v důsledku zlepšeného způsobu pro kultivaci L. intracellularis ve velkém měřítku, který byl objeven.
Dosavadní stav techniky
L. intracellularis, příčina prasečí proliferativní enteropatie („PPE“) postihuje ve skutečnosti všechny živočichy včetně člověka, králíků, fretek, křečků, lišek, koní a jiných zvířat i tak rozdílných, jako pštros a emu.
L. intracellularis je významnou příčinou ztrát při chovu vepřů. Odhady výskytu a nových onemocnění PPE v USA se pohybují až kolem 20 % z chovů vepřů s ročními odhadovanými ztrátami 20 miliónů dolarů.
Shodným rysem PPE je výskyt intracytoplazmatických zakřivených tyčinek nenavázaných na membránu uvnitř enterocytů v postižených částech střeva. Bakterie spojené s PPE byly označovány jako „Campylobacter - podobné organizmy“. S. McOrist a další, Vet. Pathol, díl 26, 260 64 (1989). Potom byly bakterie způsobující uvedené onemocnění identifikovány jako nový taxonomický rod a druh, v odborném jazyce označovaný jako Ileal symbiont (IS) intracellularis. C. Gebhart a další, Inťl. J. of Systemic Bacteriology, díl 43, č. 3, 535 - 38 (1993). V poslední době dostala tato nová bakterie taxonomický název Lawsonia (L.) intracellularis. S. McOrist a další, Inťl. J. of Systemic Bacteriology, díl 45, č. 4, 820 - 25 (1995). Tyto tři názvy byly používány zaměnitelné pro označení stejného organizmu, který je zde dále identifikován a popisován. Autoři vynálezu se snažili při diskuzi předkládaného vynálezu používat taxonomický název, L. intracellularis.
L. intracellularis je obligátní intracelulámí bakterie, kterou není možno kultivovat normálními bakteriologickými metodami na běžném bezbuněčném médiu a předpokládalo se, že vyžaduje pro růst přichycené epiteliální buňky. S. McOrist a další, Infection and Immunity, díl 61, č. 10, 4286 - 92 (1993) a G. Lawson a další, J. of Clinical Microbiology, díl 31, č. 5, 1136 - 42 (1993) diskutují kultivaci L. intracellularis s použitím monovrstev krysích střevních epiteliálních buněk IEC-18 v běžných lahvích pro tkáňové kultury. Dále H. Stills, Infection and Immunity, díl 59, č. 9, 3227 - 36 (1991) diskutuje použití monovrstev lidských embryonálních střevních buněk Intestine 407 a monovrstev buněk střevního adenokarcinomu morčete GPC-16 v běžných kultivačních tkáňových lahvích. Tyto dosavadní způsoby kultivace jsou náročné na práci a nehodí se pro zvětšování měřítka.
Získání nových informací o infekci L. intracellularis a léčení a účinném omezování onemocnění bylo silně znesnadňováno náročnými růstovými požadavky Z. intracellularis v kulturách in vitro. Proto je třeba v současnosti získat zlepšený způsob kultivace Z. intracellularis. Je rovněž potřeba získat vakcíny proti Z. intracellularis a účinné nástroje pro diagnózu infekce Z. intracellularis.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je poskytnout vakcíny protiZ. intracellularis.
Dalším předmětem vynálezu je poskytnout způsoby detekce přítomnosti protilátek proti Z. intracellularis v biologických vzorcích.
-1 CZ 295933 B6
Dalším předmětem je poskytnutí zlepšeného způsobu kultivace, který dovoluje kultivaci L. intracellularis ve velkém měřítku pro produkci vakcín a diagnostických prostředků.
Pro dosažení tohoto a dalších cílů a v souladu s účelem vynálezu jak se zde popisuje, poskytuje předkládaný vynález způsob kultivace Z. intracellularis a získání velkého množství bakterií tímto způsobem.
Podle tohoto způsobu jsou bakterie L. intracellularis inkubovány v koncentraci kyslíku od přibližně 0 % do přibližně 18 % za míchání bakterií, přičemž bakterie L. intracellularis jsou udržovány mícháním v suspenzi.
Podle dalšího provedení se poskytuje způsob kultivace bakterií L. intracellularis inokulací monovrstvy buněk HEp-2, McCoys, nebo IEC-18, která je konfluentní z přibližně 30 % inokulem obsahujícím bakterie L. intracellularis tak, aby došlo k infekci buněk bakterií. Infikované buňky se potom inkubují při teplotě přibližně 36 až přibližně 38 °C při koncentraci kyslíku přibližně 0 % do přibližně 8,0 % až do dosažení konfluentního nárůstu buněk. Infikované buňky a růstové médium se potom vloží do fermentoru, bioreaktoru, rotační láhve (spinner flask) nebo jiné nádoby vhodné pro udržování buněk v suspenzi. Infikované buňky se pro kultivaci buněk L. intracellularis inkubují za míchání buněk při udržování infikovaných buněk v suspenzi. Část kultivovaných bakterií L. intracellularis se potom pasážuje do čerstvé kultury pro dosažení zvýšení produkce bakterií L. intracellularis.
Vynález poskytuje vakcíny proti L. intracellularis a způsob výroby vakcín proti L. intracellularis. Avirulentní bakterie L. intracellularis se získá pasážováním kultivované bakterie L. intracellularis dostatečným počtem pasáží a selekcí na oslabený kmen nebo vystavení kultivované bakterie působení chemických prostředků pro oslabení. Vakcíny s usmrcenou L. intracellularis se rovněž připravují s použitím kultivace podle vynálezu. Podle zvláště výhodného provedení se bakterie kontinuálně kultivují alespoň 6 až 8 měsíců při pasážování alespoň 7 až 12 násobném, přičemž se získá oslabený kmen vhodný pro použití jako vakcína. Oslabená bakterie se potom smísí s farmaceuticky přijatelným nosičem a podává se v účinném množství člověku nebo zvířeti pro vyvolání imunologické odezvy. V současnosti výhodný oslabený kmen (N343NP40wk) byl uložen v Američan Type Culture Collection.
Vynález také poskytuje použití bakterií L. intracellularis pro stanovení přítomnosti protilátek, které specificky reagují s bakterií L. intracellularis v biologickém vzorku izolací alespoň části kultivovaných bakterií L. intracellularis, uvedením biologického vzorku ze živočicha do styku s izolovanými bakteriemi L. intracellularis nebo jejich složkami za podmínek, při kterých protilátka přítomná v biologickém vzorku reaguje s L. intracellularis nebo její složkou, a určením, zda došlo k reakci protilátka - antigen nebo ne.
Další znaky a výhody vynálezu budou uvedeny v následujícím popisu a budou zřejmé z popisu nebo z přiložených příkladů.
Jak se používá v předkládané přihlášce, termín ,,L. intracellularis “ znamená intracelulární zakřivenou gramnegativní bakterii popisovanou podrobně v: C. Gebhart a další, Inťl. J. of Systemic Bacteriology, díl 43, č. 3, 533 - 38 (1993) a S. McOrist a další, Inťl. J. of Systemic Bacteriology, díl 45, č. 4, 820 - 25 (1995) a zahrnuje bez omezení bakterii uloženou jako ATCC 55672 v Američan Type Culture Collection, Rockwille, MD; bakterii uloženou jako NCTC 12656 a 12657 vNational Collection of Type Cultures, Colindale, Londýn; bakterii vyvolávající onemocnění, která může být získána z vepřů infikovaných PPE nebo jiných zvířat na celém světě, s použitím znalostí a zkušeností z oboru a předkládaného vynálezu; a varianty nebo mutace jakýchkoli z výše uvedených bakterií, získaných uměle nebo spontánních.
-2CZ 295933 B6
Jak se zde používá, termín „oslabený kmen“ znamená jakýkoliv kmen L. intracellularis, připravený kultivací podle vynálezu a pasážováním podle vynálezu pro dosažení avirulence při zachování imunogenních vlastností při podávání hostiteli. Jak je uvedeno níže, postupy podle vynálezu byly kultivovány a oslabeny rozdílné kmeny L. intracellularis za získání oslabených imunogeních kmenů účinných jako vakcíny u vepřů a jiných zvířat, vnímavých k infekci L. intracellularis.
Očekává se, že oslabené kmeny podle vynálezu budou použity jako imunogeny u antimikrobiálních vakcín pro zvířata, včetně ptáků, ryb, dobytka, vepřů, koní, obecně savců a primátů, a člověka. Tyto vakcíny je možno připravit odborníkům v oboru známými metodami podle v předkládaném vynálezu použitých postupů. Taková vakcína by obsahovala imunologicky účinné množství oslabeného kmene ve farmaceuticky přijatelném nosiči. Vakcína by se podávala v jedné nebo několika dávkách. Imunologicky účinné množství je možno bez dalšího experimentování stanovit v oboru známými prostředky a prostředky podle předkládaného vynálezu. Množství avirulentní bakterie by mělo být dostatečné pro stimulaci imunologické odpovědi u organizmu vnímavého k nemoci a přitom by mělo stále zůstat avirulentní. To bude záviset na konkrétním živočichu, bakterii a léčeném onemocnění. Doporučená dávka pro podávání vnímavému organizmu je s výhodou přibližně 103 až 109 bakterií/kg tělesné hmotnosti a s výhodou přibližně 105 až 107 bakterií/kg tělesné hmotnosti. Odborníkům v oboru jsou známy použitelné nosiče, mezi které patří také stabilizátory a ředicí látky. Vakcína může obsahovat také vhodné adjuvans. Vakcíny podle vynálezu mohou být použity v kombinaci s jinými vakcínami, například jako diluent jiné lyofílizované vakcíny, nebo mohou být kombinovány s jinou vakcínou před lyofílizací. Vakcínové přípravky mohou být také ve vysušeném stavu, například pomocí lyofílizace, a to zejména ze skladovacích důvodů nebo pro další přídavek do kapalných vakcín.
Vynález je použitelný pro indukci imunologické odpovědi vůči virulentnímu standardnímu typu bakterie L. intracellularis u člověka nebo zvířete s cílem dosáhnout ochrany hostitele před touto bakterií. Indukce zahrnuje podávání imunologicky účinného množství oslabené bakterie nebo usmrcené bakterie podle vynálezu hostiteli a s výhodou podávání vakcíny podle vynálezu hostiteli.
Jak se zde používá, termín „kultivace ve velkém měřítku“ znamená rozsah kultivace L. intracellularis větší než přibližně 2,0 až 3,0 1 a zahrnuje produkci v měřítku objemu 100 1 nebo více. „Kultivace“ jak se v předkládané přihlášce používá znamená způsob navození růstu, reprodukce a/nebo proliferace L. intracellularis.
Při provádění kultivačního způsobu podle vynálezu může být nejprve zaočkována kultura buněk inokulem obsahujícím bakterie L. intracellularis tak, aby došlo k infekci buněk bakteriemi. Při provádění vynálezu je možno použít řady buněčných linií včetně bez omezení IEC-8 (ATCC 1589) - buňky krysího střevního epitelu, HEp-2 (ATCC 23) - buňky lidského karcinomu epidermis, McCoys (ATCC 1696) - myší (nespecifikované) buňky, MDCK (ATTC 34) - buňky psí ledviny Madin-Darby, BGMK (Biowhittaker # 71-176) - buňky ledviny opice buffalo green monkey a buňky střevního epitelu prasete. Výhodné buňky tkáňových kultur jsou HEp-2, McCoys nebo IEC-18. Alternativně může být bakterie kultivována vbezbuněčném systému, pokud se bakterie udržují při vhodné koncentraci rozpuštěného kyslíku podle vynálezu.
Jestliže se použije buněčná kultura, buňky kultury jsou před inokulaci s výhodou ve formě monovrstvy, ale nemusí tomu tak být. Pro vytvoření monovrstvy mohou být buňky zaočkovány do běžných lahví. Každá láhev je obvykle zaočkována na 25 cm2 láhev počtem buněk v rozmezí mezi přibližně 1 x 105 až přibližně 10 x 105, smíšeným s růstovým médiem. Růstovým médiem může být jakékoliv médium pro kultivaci buněk, které obsahuje zdroj dusíku, nezbytné růstové faktory pro zvolené kultivované buňky a zdroj uhlíku, jako je glukóza nebo laktóza. Výhodné médium je DMEM s 2 až 5 % fetálního bovinního séra, ačkoliv s dobrými výsledky je možno použít i jiných komerčně dostupných médií.
-3 CZ 295933 B6
Autory vynálezu bylo zjištěno, že úspěšnost kultivace L. intracellularis se zvýší udržováním buněk tkáňové kultury v konstantním stádiu růstu. Proto by měla být monovrstva tkáňové kultury v době inokulace ve stavu přibližně 20 % až přibližně 50 % konfluence. S výhodou by v době inokulace měla být buněčná kultura ve stavu přibližně 30 % až přibližně 40 % konfluence, přičemž nejvýhodnější je přibližně 30 % konfluence.
Inokulem může být čistá kultura L. intracellularis, získaná například z kmene s depozitním číslem ATCC 44672, NCTC 12656 nebo 12657, nebo z infikovaných vepřů nebo jiných zvířat s použitím uvedených postupů izolace a puriflkace.
Podle jednoho provedení vynálezu je inokulum pro provedení vynálezu střevní homogenizát připravený seškrábáním sliznice střeva vepře nebo jiného zvířete infikovaného PPE. Při přípravě intestinálního homogenizátu by měly úseky střeva zvolené pro kultivaci vykazovat výrazné změny s makroskopickým ztluštěním střevní stěny. Pro křehkost bakterií by měly být vzorky skladovány při -70 °C co nejdříve po nekropsii. Pro potlačení kontaminujících bakterií při zachování růstu L. intracellularis se s výhodou do inokula přidávají antibiotika, ke kterým je L. intracellularis rezistentní, jako je například vankomycin, amfotericin B nebo členové aminoglykosidové skupiny antibiotik včetně gentamycinu a neomycinu. Ať je inokulem čistá kultura nebo střevní homogenizát, inokulace buněčné kultury může být provedena různými v oboru známými způsoby a postupy podle vynálezu.
Bakterie a/nebo zaočkované buněčné kultury jsou potom inkubovány za snížené koncentrace rozpuštěného kyslíku. Při koncentraci rozpuštěného kyslíku větší než 18 % již není růst L. intracellularis optimální a při koncentracích kyslíku mimo tento rozsah se může vyskytnout zastavení růstu. S výhodou jsou zaočkované buněčné kultury inkubovány při koncentraci rozpuštěného kyslíku v rozmezí od přibližně 0 % do přibližně 10 %. Nej výhodněji jsou buňky inkubovány při koncentraci kyslíku v rozmezí od přibližně 0 % do přibližně 8 % s nejvýhodnější koncentrací kyslíku v rozmezí přibližně 0 % až přibližně 3,0 %.
Pro správný růst L. intracellularis je také důležitá správná koncentrace oxidu uhličitého. Zhoršení růstu až popřípadě zastavení růstu se vyskytuje mimo koncentrace oxidu uhličitého v rozmezí větší než 10 % a menší než 4 %. S výhodou je koncentrace oxidu uhličitého v rozmezí od přibližně 6 % do přibližně 9 % a nejvýhodnější je koncentrace přibližně 8,8 %.
Navíc se buňky s výhodou inkubují při koncentraci vodíku přibližně 73 % do přibližně 94 %. Namísto části nebo veškerého množství přítomného vodíku je možno použít dusík. Podle zvláště výhodného provedení se buňky inkubují při složení plynů přibližně 0 až 8,0 % O2, přibližně 8,8 % CO2 a přibližně 83,2 % H2.
Zaočkované buňky je možno inkubovat v inkubátoru umožňujícím přívod dvou plynů, nebo jiném prostoru umožňujícím kultivaci v atmosféře plynů, které obsahují vhodné koncentrace kyslíku a oxidu uhličitého a které umožňují, aby byly buňky během inkubace suspendovány. Kultivační prostor by měl obsahovat prostředek pro udržování zaočkovaných buněk v suspenzi, monitor plynů a zdroj plynů pro udržování příslušné koncentrace plynů. Teplota inkubace by měla být v rozmezí od 30 °C do 45 °C a výhodněji v rozmezí od přibližně 36 °C do přibližně 38 °C. Nejvýhodněji bude teplota přibližně 37 °C. Nezbytné vybavení pro kultivaci a oslabení buněk podle vynálezu bude odborníkům v oboru s použitím způsobů podle vynálezu dostupné. Příkladem vybavení vhodného pro provádění předkládaného vynálezu je inkubátor s přívodem dvou plynů, například model 480 firmy Lab-Line, Melrose Park, Illinois, ve spojení s rotačními lahvemi pro udržování buněk v suspenzi. Výhodné vybavení zahrnuje fermentor, bioreaktor nebo rotační třepačku obsahující alespoň přibližně 2 1 média a schopných udržovat buněčnou kulturu v suspenzi pomocí probublávání plynů o vhodné koncentraci nebo pomocí mechanického míchání a kontinuálního měření koncentrací rozpuštěného kyslíku v médiu. Vhodné fermentory a bioreaktory pro tento účel vyrábějí firmy New Brunswick, Braun a další.
-4CZ 295933 B6
Udržování zaočkovaných buněk během inkubace v suspenzi se dosáhne zvýšením expozice každé buňky růstovému médiu a správné směsi kyslíku a oxidu uhličitého maximálního růstu buněk a tím i L. intracellularis. Buněčná kultura může být míchána nebo udržována v suspenzi řadou v oboru známých způsobů, včetně například kultivačních lahví, otáčivých lahví, kultur na membráně a valivých lahví. Buňky mohou být udržovány v suspenzi v průběhu inkubace inkubací buněk v otáčivé láhvi uvnitř inkubátoru umožňujícího přívod dvou plynů, nebo podobného zařízení. Pod termínem „rotační láhev“ (spinner flask) se zde míní láhev nebo jiná nádoba, obsahující lopatky, míchadlo nebo jiné prostředky pro míchání kultury a udržování přítomných buněk v suspenzi.
Ve zvláště výhodném provedení vynálezu se zaočkované buňky inkubují až do dosažení konfluence a potom se umístí v míchané láhvi obsahující růstové médium a inkubují v inkubátoru za otáčení láhve. S výhodou se zaočkované buňky do rotační láhve seškrabují. Toho je možné dosáhnout řadou v oboru známých způsobů, při kterých se například pro uvolnění buněk používá seškrabávač buněk. Jakmile jsou buňky přivedeny do míchané láhve, její lopatka se typicky otáčí rychlostí od přibližně 30 do přibližně 60 ot/min, aby byly infikované buňky udrženy v suspenzi.
Část kultivované L. intracellularis se potom pasážuje do čerstvé buněčné kultury pro zvýšení produkce bakterií L. intracellularis. Termín „pasážování“ nebo jeho variace znamenají způsob přenesení části kultivovaných buněk L. intracellularis do čerstvé buněčné kultury s cílem infikovat čerstvé buňky bakterií. Termín „čerstvý“ jak se zde používá znamená buňky, které ještě nebyly infikovány buňkami L. intracellularis. S výhodou nejsou takové buňky v průměru starší než přibližně jeden den.
Pasážování L. intracellularis v suspenzních kulturách je možno provádět odstraněním části původní kultury a přidáním této části do nové baňky obsahující čerstvé buňky buněčné kultury. Jestliže má původní kultura vysoký počet bakterií na ml, například větší než přibližně 104 bakterií/ml, je výhodné přidat mezi přibližně 1 až 10 % (objem/objem) kultury z infikované baňky do nové baňky obsahující čerstvé buňky. To se s výhodou provádí, když je infikováno 50 až 100 % buněk. Jestliže je infikováno méně než 50 % buněk, pasážování se s výhodou provádí rozdělením kultury v poměru 1 : 2 do nové baňky a zvětšením objemu přídavkem čerstvého média. V každém případě se narozdíl proti pasážování kultur v monovrstvách podle stavu techniky nevyžaduje lyže buněk a další kroky.
Po dostatečném nárůstu buněčné kultury a následné infekci L. intracellularis s poměrem infekce větším než přibližně 70 % při stanovení metodou IFA, TCID50 nebo jinou porovnatelnou metodou se alespoň části kultivovaných bakterií L. intracellularis izoluje. Izolace se může provádět oddělením bakterie ze suspenze různými známými způsoby. S výhodou se bakterie L. intracellularis izolují centrifugací části nebo celého objemu suspenze za získání biomasy kultivovaných buněk, resuspendováním získané buněčné biomasy a lyží infikovaných buněk. Typicky se alespoň část média centrifuguje přibližně 20 min při přibližně 3000 x g pro získání biomasy buněk a bakterií. Biomasa pak může být resuspendována v roztoku sacharóza - fosfát - glutamát (SPG) a lyže buněk může být dosažena přibližně čtyřnásobným průchodem jehlou kalibr 25. Jestliže je třeba dalšího čištění, vzorky mohou být centrifugovány pro odstranění buněčných jader a částí buněk přibližně 5 min při 145 x g. Supematant je pak možno centrifugovat přibližně 20 min při přibližně 3000 x g a výslednou biomasu resuspendovat ve vhodném ředicím roztoku, jako je SPG s fetálním bovinním sérem (pro přípravu izolovaných bakterií vhodných po zamražení jako inokulum) nebo růstové médium (pro přípravu izolovaných bakterií vhodnějších pro pasážování do čerstvých buněk.
Jak bylo již uvedeno dříve, účinný růst L. intracellularis pro produkci ve velkém měřítku je možno zvýšit udržováním aktivního růstu buněk tkáňové kultury. V případě monovrstev se při dosažení konfluence rychlost dělení buněk podstatně sníží. Pokusy pěstovat L. intracellularis na tkáňových kulturách rostoucích v monovrstvě měly omezený úspěch a nebylo možno zvětšovat měřítko. Použití kultur v suspenzi však umožní udržování buněk v aktivním růstu a umožní prů
-5CZ 295933 B6 běžnou expanzi kultury a zvětšování měřítka. S použitím fermentoru a při koncentraci rozpuštěného kyslíku mezi přibližně 0 až 3 % jak bylo vysvětleno výše, bylo autory vynálezu dosaženo růstu až do 108 bakterií na ml. Bylo také možno udržovat kultivované bakterie v aktivním růstu mnoho měsíců a očekává se, že by bakterie mohly tímto způsobem růst trvale.
V období před předkládaným vynálezem se obvykle věřilo, že aby mohly být buňky infikovány L. intracellularis, musí být přichyceny na povrchu. Buněčné suspenze podle předkládaného vynálezu jsou proto jedinečné a s touto teorií jsou v rozporu. Pokud se používají buňky McCoys nebo IEC-18, je výhodné spolu s růstovým médiem přidávat želatinu, agarózu, kolagen, akrylamid nebo kuličky oxidu křemičitého, jako jsou porézní mikronosiče Cultisphere-G, vyráběné firmou HyClone Laboratories, Logan, UT. Buňky HEp-2 však při kultivaci podle vynálezu mikronosiče nevyžadují. To představuje zvláště výhodný a ekonomický způsob velkoobjemové kultivace.
Pro účely zachování kultury se v případě kultur s buňkami HEp-2 s výhodou 25 až 50 % kultury v týdenních intervalech odstraní a nahradí čerstvým médiem. V případě buněčných kultur s mikronosiči nebo kuličkami se s výhodou 25 až 50 % kultury odstraní jednou až dvakrát za týden a nahradí čerstvými mikronosiči a kuličkami a čerstvým médiem. Pro účely zvětšení měřítka je možno ke kultuře přidat dalších 25 až 50 % média nebo média s mikronosiči.
V závislosti na rychlosti, se kterou se buňky kultury infikují, pasáž čerstvých buněk obvykle probíhá přibližně každé dva až každých pět týdnů. Za předpokladu, že buňky buněčné kultury jsou alespoň ze 70 % infikovány v průběhu dvou až tří týdnů, výhodný termín pasážování se vyskytne přibližně každé tři až čtyři týdny.
Předkládaný vynález také poskytuje vakcíny a způsoby produkce vakcín proti L. intracellularis. Podle zvláště výhodného provedení se po udržování infikovaných buněk v suspenzi po delší dobu (například 6 až 8 měsíců) alespoň část kultivovaných bakterií L. intracellularis izoluje a monitoruje na potenciální oslabení. Takové monitorování se s výhodou provádí testem podání kultury hostitelskému zvířeti nebo zvířecímu modelu s cílem vybrat oslabený kmen. Takové oslabené kmeny se používají podle způsobů podle předkládaného vynálezu jako vakcíny. Oslabené vakcíny L. intracellularis podle předkládaného vynálezu se ukázaly jako účinné proti infekci L. intracellularis u řady zvířat a očekává se, že budou úspěšné také u člověka.
Předkládaný vynález dovoluje rychlý nárůst kultury, tj. vzrůst výtěžku 100 až 1000 krát a snížení nákladů. Výsledkem je, že se nadbytečné množství bakterie L. intracellularis vyprodukované podle způsobu kultivace podle vynálezu snadno zeslabí pro účely výroby vakcíny. Oslabení je u kultur v monovrstvách obtížné z důvodů nízkého výtěžku bakterií produkovaných běžným způsobem pěstování v monovrstvě. Naopak způsob pěstování L. intracellularis podle předkládaného vynálezu značně zvyšuje snadnost, rychlost a počet bakterií dostupných pro tento účel. Čím větší je množství buněk a proběhlých buněčných dělení, tím větší je výskyt mutací, které jsou výhodné pro vývoj vakcíny. Růst v suspenzích podle vynálezu zvyšuje i expresi důležitých iminogenů, řízenou geny ovlivňovanými prostředím a produkty jejich exprese.
Výsledné oslabené kmeny je možno kultivovat v monovrstvě tkáňové kultury jak se popisuje v příkladu 1 níže, ale s výhodou probíhá kultivace v suspenzních kulturách podle vynálezu. Další prostředky pro oslabení mohou zahrnovat chemické oslabení použitím například N-methylnitrosoguanidinu a jiných v oboru známých prostředků. Oslabená bakterie L. intracellularis, získaná buď mnohonásobným pasážováním, nebo chemickými prostředky, se produkuje a provádí se její selekce pro přípravu vakcíny.
Podle jednoho provedení vakcíny podle vynálezu se antigen izoluje centrifugací nebo mikrofiltrací jak je popsáno výše. Antigen se potom standardizuje na definovanou koncentraci založenou na optimální imunologické odpovědi hostitelského zvířete, která se určí titrací dávky u druhu zvířecího hostitele. Bakterii je možno inaktivovat prodlouženou expozicí, například jeden týden,
-6CZ 295933 B6 koncentraci kyslíku okolí nebo použitím 0,3 % formaldehydu nebo jiného inaktivačního prostředku vhodného pro přípravu usmrcené vakcíny. Antigen se potom zavede do vhodného adjuvans, jako je hydroxid hlinitý nebo minerální olej pro dosažení zvýšení imunologické odezvy. Antigen se potom použije pro vakcinaci hostitele intramuskulární nebo subkutánní injekcí, v případě prasat ve věku přibližně tří až čtyř týdnů a v případě nutnosti se zesilující dávkou.
Podle zvláště výhodného způsobu výroby vakcíny podle vynálezu s použitím výše popsaných metod kultivace je také možno provádět sériové pasážování bakterie pro indukci a selekci oslabené avirulentní živé kultury. Kultura se testuje u zvířecího hostitele (po přibližně alespoň 6 až 8 měsících růstu v suspenzní kultuře) na známky oslabení. Kultura se izoluje jak bylo popsáno výše a naředí. Prasata se například vakcinují ústy 1 x 105 až 1 x 106 bakterií. Přibližně 28 dní po vakcinaci se prasata orálně očkují přibližně 1 x 107 mikroorganizmů po menším počtu pasáží (staré přibližně 30 až 45 dnů) virulentní kultury L. intracellularis. U infikovaných zvířat se provede pitva 21 dnů po podání a provede se vyšetření tenkého střeva na poškození velkého rozsahu i mikroskopická poškození. Je možno také provést PCR a test a fluorescenčními protilátkami. Přibližně 80 % kontrolních zvířat bude mít větší nebo mikroskopická poškození a pozitivní test na přítomnost L. intracellularis v buňkách sliznice střeva při použití buď PCR, nebo FA. Vakcinovaná zvířata budou mít povrchy sliznice normální při histologickém pozorování a budou negativní při testování pomocí PCR.
Obvykle se vyprodukuje oslabený imunogenní kmen L. intracellularis po kontinuální kultivaci v rozmezí alespoň 150 až 250 dnů, přičemž v tomto rozmezí se kultura pasážuje alespoň přibližně sedm až přibližně dvanáctkrát. Pokud se používá způsobu monitorování a selekce podle vynálezu, je možno produkovat další oslabené kultury a tím tato čísla měnit.
Potom se připraví vakcína, která obsahuje imunologicky účinné množství oslabené L. intracellularis ve farmaceuticky přijatelném nosiči. Spojeným imunogenem a nosičem může být vodní roztok, emulze nebo suspenze. Imunologicky účinné množství je možno určit v oboru známými způsoby bez dalšího experimentování na základě v předkládaném vynálezu uvedených údajů. Množství imunogenu bude obecně mezi 50 a 500 μg a s výhodou mezi 107 a 109 TCfD50 při použití puntíkovaných bakterií.
Vakcíny podle vynálezu se obvykle podávají vnímavým zvířatům, zvláště vepřům v jedné nebo více dávkách. Živá nebo usmrcená vakcína může být podávána jednou nebo dvakrát ve dvoutýdenních intervalech. Pro oslabené živé vakcíny je výhodná jedna dávka. Výhodné způsoby podávání u živých oslabených kmenů jsou orální nebo intranazální, ale je možno také použít intramuskulární nebo subkutánní injekce. Intramuskulární a subkutánní injekce jsou způsoby nejvýhodnější v případě usmrcené vakcíny.
Účinná diagnóza PPE byla také ztížena dobou, potřebnou pro kultivaci bakterie způsobující onemocnění. Jako výsledek předkládaného vynálezu je nyní možný vývoj diagnostických prostředků pro rychlé a přesné testování přítomnosti L. intracellularis v biologických vzorcích odebraných od vepřů a jiných zvířat vnímavých kPPE.
Bakterie L. intracellularis vypěstované způsobem podle předkládaného vynálezu nebo složky odvozené z takových bakterií mohou být použity jako antigen při metodě ELISA nebo jiném imunologickém stanovení jako je imunofluorescenční test protilátek („IFA“) pro detekci protilátek proti L. intracellularis v séru a jiných tělesných tekutinách zvířat podezřelých nebo infikovaných bakterií. Výhodným imunologickým testem je v současnosti IFA, popisovaný v příkladu níže. Alternativně mohou být také použity bakterie vypěstované způsobem podle vynálezu při testu westernovým blotem.
Výhodný protokol metody ELISA podle tohoto provedení vynálezu je následující:
1. Přidá se 0,1 ml/jamku antigenu zředěného v potahovacím roztoku. Inkubuje se 18 h při 4 °C.
-7CZ 295933 B6
2. Promyje se třikrát PBS.
3. Přidá se 0,25 ml blokovacího pufru do každé jamky na destičce. Inkubuje se 1 až 2h při 37 °C.
4. Promyje se třikrát promývacím pufrem.
5. Sérum se zředí v blokovacím pufru a do prvních jamek na destičce se přidá 0,1 ml. Napříč destičkou se provedou sériová ředění 1 : 2. Inkubace se provádí 1 h při 37 °C.
6. Promyje se tři až pětkrát promývacím pufrem.
7. Konjugát se naředí v blokovacím pufru, do jamek na destičce se přidá 0,1 ml a inkubuje se 1 h při 37 °C.
8. Promyje se tři až pětkrát promývacím pufrem.
9. Přidá se substrát.
12. Měří se absorbance pomocí spektrofotometru.
13. Jamky bez přídavku antigenu se použijí jako blank.
14. V každém testu je možno použít jako pozitivní a negativní kontroly také prasečího séra.
Výhodný protokol westernového blotu je následující:
1. Provede se elektroforéza antigenu 12 % SDS-PAGE a převede se na nitrocelulózovou membránu.
2. Membrána se vloží na 2 hodiny do blokovacího pufru.
3. Blokovací pufr se odstraní a 1 min se oplachuje PBS.
4. Sérum se zředí blokovacím pufrem a přidá se k membráně. Inkubace se provádí 2 hodiny při pokojové teplotě.
5. Promyje se třikrát promývacím pufrem (5 min na každé mytí).
6. Konjugát se zředí blokovacím pufrem a přidá se k membráně. Inkubace probíhá 1 h při pokojové teplotě.
7. Třikrát se promyje promývacím pufrem.
8. Na 10 min, nebo dokud nedojde ke vzniku silných pruhů se přidá substrát.
9. Provede se oplach PBS.
10. Membrána se usuší na vzduchu a uchovává v temnu.
Předkládaný vynález se dále popisuje na následujících příkladech, které mají sloužit pouze pro ilustraci a nejsou zamýšleny jako limitující.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Izolace L. intracellularis ze střev amerického vepře s proliferativní enteropatií vepřů
Materiály a metody:
Volba vzorků pro inokulaci:
Vzorek N24912 byl získán z chovu na farmě v lowě, kde byly u 15 ze 300 pětiměsíčních prasat pozorovány přetrvávající krvavé stolice bez ohledu na léčení penicilinem. Po nekropsii vepřů
-8CZ 295933 B6 byla ve střevě (ileum) pozorována ztluštělá sliznice. Histopatologické vyšetření s barvením stříbrem ukázalo přítomnost zakřivených intracelulárních bakterií a hyperplasii enterocytů v kryptách, potvrzující diagnózu PPE. Vzorek N72994 byl získán z 1,5 letých prasnic po druhém vrhu na farmě v Minnesotě. Velikost chovu byla mezi 70 až 80 prasnicemi a nebylo zjištěno podávání antibiotik. Po nekropsii byla nalezena ztluštělá sliznice ilea s krvácením. Barvení sliznice podle Gimineze ukázalo velké množství zakřivených bakterií. Vzorek NI01494 byl získán z 12 týdnů starých prasat z farmy v Indiáne se 600 chovnými prasnicemi. Prasata byla po nástupu krvavých průjmů léčena Tylanem ve formě injekcí, ale brzy po léčení zvířata uhynula.
Příprava inokula bakterií pocházejícího z prasat:
Vzorky střev byly uchovávány při -70 °C. Střeva byla otevřena a promyta fyziologickým roztokem s fosfátovým pufrem (PBS). Jednogramové vzorky sliznice byly seškrabány do pufru sodíkdraslík-glutamát (SPG) a homogenizovány 30 s s 4,0 ml 1 % trypsinu (JRH Biosciences, Lenexa, KS) v SPG. Suspenze byly inkubovány 35 min při 37 °C. Bylo přidáno 10 ml SPG/10 % fetálního telecího séra (FCS) (JRH Biosciences, Lenexa, KS) a vzorky byly mlety v tkáňovém homogenizátoru po dobu 1 minuty. Bylo přidáno 10 ml SPG/10 % (FCS) a suspenze byla jednou zfiltrována filtračním papírem (Whatman 113V; Whatman Labsales, Hillsboro, OR) a potom postupně přes 5,0, 1,0 a 0,65 pm membránovými filtry. Filtráty byly rozděleny do alikvotů po 1,0 ml a uchovávány zmražené při -70 °C. Sliznice byla rozetřena na sklo pro barvení podle Gimineze. Oddělené roztěry filtrátů byly barveny IFA pomocí specifické monoklonální protilátky proti L. intracellularis (S. McOrist a další, Vet. Rec. 121: 421 - 422 (1987).
Buněčná kultura:
Buňky IEC-18 (krysí střevní epiteliální buňky, ATCC CRL 1589) rostly vDMEM (JRH Biosciences, Lenexa, KS) s glutaminem a 10 % FCS s týdenním pasážováním trypsinem. Mono vrstvy buněk rostly při 37 °C ve vzduchu s 5 % CO2.
Infekce buněčné kultury:
Buňky IEC-18 byly vysety s koncentrací 1,25 x 105 buněk v 25 cm2 lahvích a v porovnatelném množství v lahvích typu chamberslides (Nunc, lne., Naperville, IL). Buňky byly inkubovány 24 hod a potom bylo médium odstraněno. Zamražené izoláty prasečích bakterií byly rychle roztátý a zředěny v DMEM/7 % FCS s vankomycinem (100 pg/ml) a amfotericinem B (2,0 pg/ml) v koncentracích 1,0 ml homogenátu na 15 ml média a přidány k monovrstvám. Monovrstvy a bakteriální suspenze byly centrifugovány 30 min při 2000 g a převedeny do anaerobních inkubátorů. Inkubátory byly evakuovány a plyn byl nahrazen vodíkem a oxidem uhličitým za vytvoření směsi 8,0 % O2, 10 % CO2 a 82 % H2. Kultury byly inkubovány 3 hodiny při 37 °C, potom bylo přidáno DMEM/7 % FCS s L-glutaminem, vankomycinem (100 pg/ml), neomycinem (50 pg/l) a amfotericinem B (2,0 pg/ml). Kultury byly v anaerobních inkubačních nádobách vyměněny a inkubovány 6 dnů se změnou média každé dva dny.
Pasážování L. intracellularis·.
Bakterie L. intracellularis prošly buněčnou lyží s použitím chloridu draselného jak bylo popsáno dříve v: G. Lawson a další, J. Clin. Microbiol, 31: 1136 - 1142 (1993) a potom byly přidány k čerstvým monovrstvám buněk IEC-18. Média byla odlita z monovrstev, byl přidán 0,1 % KC1 a buňky byly inkubovány 10 min při 37 °C. KC1 bylo odstraněno a byl přidán SPG/10 % FCS a monovrstvy byly škrabkou mechanicky uvolněny. Buňky byly lyžovány trojnásobným průchodem stříkačkou s jehlou kalibr 21. Buněčná jádra byla odstraněna centrifugací při 100 xg po dobu 5 min a bakteriální suspenze v supematantu přidána k čerstvým 1 d monovrstvám buněk IEC-18.
-9CZ 295933 B6
Monitorování infekce buněčných kultur:
Infekce byla monitorována fixováním buněk na sklíčkách studeným roztokem aceton/methanol po dobu 5 minut. Barvení bylo provedeno metodami imunofluorescence a imunoperoxidázovou metodou. Obě metody používaly myší monoklonální protilátku (jak bylo popsáno v: S. McOrist a další, Vet. Rec. 121: 421 - 422 (1987) jako primární protilátku a buď konjugát antimyší imunoglobulin G-fluorochrom (fluoresein izothiokyanát; Organon Teknika Corporation, Durham, NC), nebo peroxidázový konjugát (kozí antimyší imunoglobulin G; Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD). Kvantifikace bakterií byla prováděna počítáním specificky obarvených bakterií uvnitř buněk na každém sklíčku.
Polymerázová řetězová reakce:
Vzorek inokula a pasážovaných bakterií byla použity jako templát DNA v PCR s použitím metody pro přípravu vzorků, primerů a parametrů cyklování jak bylo popsáno u: Jones a další, J. Clin. Microbiol., 31: 2611 - 2615 (1993) a McOrist další, Vet. Microbiol. 1 - 8 (1994). Parametry cyklování byly pro první cyklus: 93 °C 5 minut, 55 °C 45 s a 72 °C 45 s. Bylo provedeno 33 cyklů při výše uvedených teplotách po dobu 45 s na jednu teplotu a jeden cyklus 93 °C 45 s, 55 °C 45 s a 72 °C 2 min. Pro inokulaci buněk IEC-18 bylo použito pouze pozitivního inokula. PCR byla také prováděna pro monitorování pasážovaného materiálu pro potvrzení infekcí. DNA vytvořená pomocí PCR byla zaslána do laboratoře Iowa Statě University Nucleic Acid Facility k sekvenování. Výsledky sekvenování byly porovnány se sekvencemi vytvořenými: Gary F. Jones, dizertační práce, University of Minnesota, Minneapolis, MN (červen 1993).
Výsledky:
Volba vzorků inokula:
Vepři s čísly N24912 a N72994 měli vážnou PPE s krvavým obsahem střev a ztluštěním sliznice. Vepř číslo NI01494 měl vážnou PPE a vážné krvácení, které mělo za následek rozsáhlou krevní sraženinu ve střevě. Barvení roztěrů sliznice podle Gimineze ukázalo velký počet zakřivených bakterií ve tvaru S. Barvení IFA ukázalo velký počet jasně fluoreskujících bakterií v případě inokula prasečích bakterií.
Monitorování infekce buněčných kultur:
Naočkované monovrstvy byly monitorovány v průběhu růstového cyklu pomocí světelné mikroskopie, přičemž byly pozorovány malé morfologické změny buněk. Neinfikované monovrstvy rostly za sníženého tlaku kyslíku (8 % (¾) a měly podobnou morfologii.
Infikované kultury barvené imunofluorescencí a imunoperoxidázovou metodou ukázaly velký počet zakřivených bakterií nebo bakterií ve tvaru S, které byly specificky obarveny a nacházely se zřejmě uvnitř buněk. Monovrstvy neměly konfluentní infekci. Infikované buňky byly často v těsném sousedství s infikovanými ohnisky po jedné až deseti buňkách. Těžce infikované buňky (tj. buňky s 30 nebo více bakteriemi) byly rovněž vidět spolu s buňkami s méně než třiceti bakteriemi. Počty bakterií dosáhly maxima přibližně po 6 dnech. Infekce byla závislá na konkrétních podmínkách růstu. Bakterie byly úspěšně pasážovány metodou lyže buněk popsanou výše. Centrifugace nově inokulovaných buněk nebyla nutná, ale zvyšovala počty infikovaných buněk. Centrifugace rovněž snižovala kontaminaci tím, že umožnila infikovaným buňkám v médiu bez antibiotik po třech hodinách výměnu média za médium s antibiotiky. Snížení obsahu FCS z 10 % na 7 % v médiu bylo nutné pro zpomalení růstu buněk IEC-18, což bakteriím dovolilo větší rozšíření před tím, než buňky v monovrstvě dosáhly konfluence.
Polymerázová řetězová reakce:
PCR chromozomální DNA byl ze všech izolátů vytvořen fragment (včetně primerů) o velikosti 319 bp. Fragment vhodné velikosti byl vizuálně porovnáván se známým pozitivním vzorkem vytvořeným s použitím PCR autory: McOrist a další (1994). Analýza sekvence produktů PCR
-10CZ 295933 B6
N24912, N72994 a N101494 potvrdila těsnou homologii (97 až 99 %) se sekvencí p78, určenou Jonesem (1993).
Příklad 2
Růst L. intracellularis v suspenzních kulturách buněk HEp-2
Příprava střevních homogenátů pro inokulum:
Střevní homogenát byl připraven seškrábáním sliznice z 6,0 až 8,0 cm ilea ze střevních vzorků z příkladu 1. K seškrábané sliznici byl přidán trypsin (1 %) a vzorky byly krátce homogenizovány a potom inkubovány 35 min při 37 °C. Potom bylo přidáno 10 ml SPG/10 % FBS a vzorky byly rozemlety na tkáňovém homogenizátoru. Potom bylo přidáno dalších 10 ml SPG/10 % FBS. Homogenáty byly zfiltrovány filtrem Whatman VI13 a potom postupně přes filtry 5,0, 1,0 a 0,65 pm. Vzorky byly rozplněny do alikvotů po 1 ml a zamraženy při—70 °C.
Infekce buněčné kultury:
Metoda A
Buňky tkání byly vysety v koncentraci 1 x 107 buněk v 50 ml DMEM/10 % FBS do 100 ml rotační láhve. Kultury byly inkubovány 24 h a potom byly přidány vankomycin a fungizon. Jedna ampule zmraženého střevního homogenátů byla rychle rozmražena a zředěna do 3,0 ml DMEM/5 % FBS s vankomycinem (100 pg/ml) a amfotericinem B (2,0 pg/ml). Vzorek byl zfíltrován filtrem 0,65 pm a přidán do láhve. Kultura byla umístěna v plynovém inkubátoru, evakuována a plyn byl nahrazen směsí vodíku a oxidu uhličitého za poskytnutí směsi 8,0 % O2, 8,8 % CO2 a 83,2 % H2. Kultury byly inkubovány 3 h při 37 °C a potom byl přidán neomycin a gentamycin. Výměna média proběhla po 24 hodinách s použitím média DMEM/5 % FBS s L-glutaminem, vankomycinem (100 pg/ml), neomycinem (50 pg/1), gentamycinem (50 pg/1) a amfotericinem B (2,0 pg/ml).
Metoda B
Dvě běžné láhve 25 cm2 byly naočkovány 1,25 x 105 buněk HEp-2 v DMEM/10 % FBS a ponechány růst 18 až 24 hodin. V době inokulace byly buňky v 30 % konfluence. Inokulum bylo naředěno DMEM/5 % FBS. Pokud inokulum pochází ze střevního homogenátů, média obsahují rovněž vankomycin (100 pg/ml) a amfotericin B (2,0 pg/ml). Kultury byly umístěny do plynového inkubátoru, evakuovány a plyn byl nahrazen směsí vodíku a oxidu uhličitého za dosažení směsi 8,0 % O2, 8,8 % CO2 a 83,2 % H2. U kultur bylo po 24 hodinách vyměněno médium za nové médium DMEM/5 % FBS s L-glutaminem, vankomycinem (100 mg/ml), neomycinem (50 pg/1), gentamycinem (50 pg/1) a amfotericinem B (2,0 pg/ml). Pokud byla inokulem čistá kultura, nebyla nutná žádná antibiotika. Kultury byly inkubovány 6 dnů nebo do dosažení konfluence. Buňky byly z lahví seškrabány a přidány do 100 ml rotační láhve, obsahující 50 ml DMEM/5 % FBS.
Kultura byla zředěna v poměru 1 : 2 každý týden buď sklízením poloviny kultury a přídavkem čerstvého média, nebo pasáží do větší rotační láhve a přídavkem většího množství média.
Pasážování kultury:
Kultura byla přenesena do čerstvých buněk HEp-2 vysetím nových buněk HEp-2 v koncentraci 1 x 107 do DMEM/5 % FBS. Nová kultura byla ponechána inkubovat přes noc s koncentrací plynů 8,0 % O2, 8,8 % CO2 a 83,2 % H2. Nová kultura byla potom zaočkována infikovanou kulturou a inkubována při snížených koncentracích O2, jak bylo uvedeno dříve. Množství inokula bylo závislé na stupni infekce původní kultury.
-11 CZ 295933 B6
Sklizeň a skladování kultur:
Kultury byly sklizeny odebráním požadovaného množství kultury s centrifugací 20 min při 3000 x g. Biomasa byla resuspendována v roztoku sacharóza - fosfát - glutamát (SPG) a protlačena čtyřikrát jehlou kalibr 25. Kultury byly rozděleny do alikvotů a zmraženy při -70 °C. Pro další purifikaci byly vzorky centrifugovány při 145 x g po dobu 5 minut pro odstranění buněčných jader a zbytků buněk. Supernatant byl potom centrifugován 20 minut při 3000 x g. Centrifugát byl resuspendován v diluentu.
Odhad počtu životaschopných buněk Z. intracellularis ve tkáňové kultuře:
Kvantifikace životaschopných buněk L. intracellularis byla prováděna určením dávky pro 50 % infekci tkáňové kultury (Tissue Culture Infectious Dose 50 percent (TCID50). To bylo provedeno odebráním 2,0 ml kultury pro testování a lyží buněk čtyřnásobným průchodem jehlou kalibr 25. Vzorek byl sériově naředěn 1 : 10 v DMEM/5 % FBS s obsahem vankomycinu (100 pg/ml) a amfotericinu B (2,0 pg/ml). Alikvoty zředěných roztoků byly přidány do 96 jamkové mikrotitrační destičky v množství 0,1 ml/jamku. Mikrotitrační destičky byly zaočkovány buňkami HEp-2 s koncentrací 1250 buněk/jamku, které byly ponechány růst 18 až 24 hodin před infekcí. Bylo použito mezi třemi a šesti jamkami na jedno zředění. Destička byla inkubována 6 dnů při koncentraci plynů 8,0 % O2, 8,8 % CO2 a 83,2 % H2. Buňky byly fixovány studeným roztokem 50 % acetonu a 50 % methanolu po dobu dvou minut. Do jamek bylo přidáno 0,03 ml/jamku anti-IS L. intracellularis monoklonální protilátky (McOrist, 1994) zředěné v poměru 1 : 2000 vPBS. Destička byla inkubována 30 min při 30 °C a potom třikrát promyta PBS. V množství 0,03 ml/jamku bylo přidáno antimyší FITC zředěné v poměru 1:30a destička byla inkubována 30 minut při 37 °C. Destička byla potom třikrát promyta destilovanou vodou a ponechána uschnout. Vzorky byly pozorovány ve fluorescenčním mikroskopu a byla určena hodnota TCID5o/ml.
Výsledky:
Výsledky TCID50 ukazují, že kultury obsahovaly až do 1 x 106 bakterií/ml. Toho bylo dosaženo během 45 dnů. Ve stejné době byl objem kultury zvětšen na 3,01.
Příklad 3
Růst L. intracellularis v suspenzních kulturách buněk McCoys
Příprava střevních homogenátů pro inokulum:
Střevní homogenát byl připraven jak bylo popsáno v příkladu 2. Vzorek L. intracellularis kultivovaný způsobem podle následujícího příkladu byl uložen v souladu s Budapešťskou dohodou 19. 5. 1995 v Američan Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland USA 20852 pod depozitním číslem 55672.
Infekce buněčné kultury:
Do dvou běžných lahví 25 cm2 bylo zaočkováno 1,25 x 105 buněk McCoys v DMEM/10 % FBS a ponecháno růst 18 až 24 hodin. V čase inokulace jsou buňky ve stavu 30 % konfluence. Inokulum bylo naředěno DMEM/5 % FBS. Pokud inokulum pocházelo ze střevního homogenátů, médium rovněž obsahovalo vankomycin (100 pg/ml) a amfotericin B (2,0 pg/ml). Kultury byly umístěny do plynového inkubátoru, evakuovány a plyn byl nahrazen směsí vodíku a oxidu uhličitého za vytvořené směsi 8,0 % O2, 10 % CO2 a 82 % H2. Kultury byly inkubovány 3 hodiny při 37 °C a byl přidán neomycin a gentamycin. Médium v kultuře bylo nahrazeno po 24 hodinách médiem DMEM/5 % FBS s L-glutaminem, vankomycinem (100 pg/ml), neomycinem (50 pg/l), gentamycinem (50 pg/l) a amfotericinem B (2,0 pg/ml). Pokud pocházelo inokulum z čisté kultury, nebylo zapotřebí antibiotik. Kultury byly inkubovány 6 dnů do dosažení konfluence. Buňky potom byly z láhví seškrabány a přidány do 100 ml rotační láhve obsahující 50 ml DMEM/2 %
-12CZ 295933 B6
FBS a 0,05 g mikronosičů Cultisphere-G Microcarriers. Láhve byly míchány rychlostí 40 až 50 ot/min.
Kultura byla každé dva až tři dny ředěna v poměru 1 : 2 buď oddělením poloviny kultury a přídavkem čerstvého média a kuliček Cultisphere-G, nebo přenesením kultury do větší rotační láhve a přídavkem dalšího média s kuličkami Cultisphere-G. Konečná koncentrace kuliček v kultuře byla přibližně 0,001 g kuliček/ml.
Pasážování kultury:
Kultura byla přenesena do čerstvých buněk McCoys zaočkováním 1 x 107 nových buněk McCoys do DMEM/2 % FBS a 0,05 g kuliček Cultisphere-G. Nová kultura byla ponechána inkubovat přes noc v atmosféře 8,0 % O2, 8,8 % CO2 a 83,2 % H2. Nová kultura byla potom zaočkována 25 ml infikované kultury a inkubována při snížené koncentraci Os, jak bylo uvedeno výše.
Izolace a skladování kultur:
Kultury byly izolovány odebráním požadovaného množství kultury a centrifugací 20 min při 3000 x g. Biomasa byla resuspendována v SPG a čtyřikrát protlačena jehlou kalibr 22. Kultury byly rozplněny do alikvotů a zmrazený při -70 °C. Pro další purifíkaci byly vzorky centrifugovány při 145 x g po dobu 5 min pro odstranění kuliček, buněčných jader a částí buněk. Supematant byl potom centrifugován 20 min při 3000 xg. Biomasa byla potom resuspendována v diluentu.
Odhad životaschopných buněk L. intracellularis ve tkáňové kultuře:
Určení počtu životaschopných buněk L. intracellularis bylo provedeno podle popisu v příkladu 2 s použitím jehly kalibr 22 pro lyži buněk azaočkování mikrotitračních destiček buňkami McCoys s koncentrací 1250 buněk/jamku.
Výsledky:
Výsledky TCID50 ukázaly, že kultury obsahovaly až do 1 x 106 bakterií/ml. Toho bylo dosaženo v době méně než 1 měsíc. Ve stejném období byl kultivační objem zvýšen na 3,01.
Příklad 4
Stanovení infekční dávky čistých kultur L. intracellularis u hostitelských zvířat
Souhrn:
Studie na 31 praseti byla uzavřena infekcí normálních prasat šest týdnů starých čistou kulturou L. intracellularis ze vzorku N72994. Prasata byla náhodně rozdělena do čtyř skupin, které byly umístěny odděleně. Skupina 1 obsahovala sedm prasat a byla považována za negativní kontrolní skupinu, která dostala neinfíkovanou tkáňovou kulturu nebo nic. Skupina 2 obsahovala osm prasat a dostala 107 bakterií najedno prase. Skupina 3 obsahovala osm prasat a byla jí podána dávka 106 bakterií/prase. Konečně skupina 4 se skládala z osmi prasat, která obdržela 105 bakterií/prase.
Výtěry fekálií byly shromažďovány ve dnech 0, 7, 14 a 21 a v den 24 pro testování PCR. V den 24 byla prasata usmrcena a jejich ileum, jejunum a kolon byly odebrány pro testování PCR, histopatologické vyšetření a barvení EA jak bylo popsáno výše.
Testování PCR střevní sliznice odhalilo přítomnost Z. intracellularis ve 100 % případů u vysoké dávky, 75 % střední dávky a 50 % nízké dávky. Histopatologické výsledky ukázaly na vzrůst počtu mononukleárních buněk v lamina propria a podslizniční vrstvě u 88 % v případě vysoké dávky, 75 % u střední dávky a 88 % u nízké dávky. Hyperplazie v kryptách byla pozorována v 50 % případů u vysoké dávky, 63 % u střední dávky a 50 % u nízké dávky. Barvení FA odhalilo L. intracellularis v tkáňových řezech ilea, jejuna a kolonu u 88 % případů u vysoké dávky,
-13CZ 295933 B6 % u střední dávky a 63 % u nízké dávky. Kontrolní zvířata byla negativní na přítomnost L. intracellularis při zjišťování PCR, FA a barvení stříbrem.
Čisté kultury tedy byly úspěšně použity pro infekci a pro indukci poškození PPE. Kochovy postuláty byly splněny identifikací a izolací L. intracellularis z infikovaných zvířat.
U zvířat, kterým byla podána testovací kultura, se ve 100 % případů s podanou vysokou dávkou potvrdilo zpětné získání bakterií a identifikací barvením stříbrem, FA a PCR.
Materiály a metody:
Růst inokula:
Jedna normální láhev 75 cm2 byla zaočkována 3,75 x 105 buněk HEp-2 vDMEM/10 % FBS a ponechána růst 18 až 24 hodin při 37 °C a koncentraci CO2 5 % (v době inokulace byly buňky ve stádiu 30 % konfluence). Jedna ampule N72994 byla zředěna v 15 ml DMEM/5 % FBS. Kultura byla umístěna v plynovém inkubátoru, evakuována a plyn byl nahrazen vodíkem a oxidem uhličitým za poskytnutí směsi 8,0 % O2, 8,8 % CO2 a 83,2 % H2. Kultura dostala čerstvé médium DMEM/5 % FBS ve 24. hodině.
Kultury byly inkubovány 6 dnů, potom byly z láhví seškrabány a přidány do 100 ml rotačních láhví obsahujících 50 ml DMEM/5 % FBS. Objem láhve byl zvětšován zdvojováním objemu média v týdenních intervalech. Kultura rostla v rotační láhvi 3 týdny.
Sklízení kultur:
Kultura byla sklizena centrifugaci 20 minut při 3000 x g. Biomasa byla resuspendována v roztoku sacharóza - fosfát - glutamát (SPG) s 10 % FBS a 4 x protlačena jehlou kalibr 25. Inokulum bylo naředěno na konečný objem SPG/10 % FBS a byla připravena ředění 1:10.
Inokulum pro kontroly se skládalo z neinfikovaných buněk HEp-2 naředěných na stejnou koncentraci životaschopných buněk jako kultura infikovaná. Buňky byly sklizeny stejným způsobem jako infikovaná kultura. Kontrolní prasata dostala podobnou dávku buněk jako skupina s vysokou dávkou.
Kvantifikace L. intracellularis'.
Kvantifikace životaschopných buněk L. intracellularis byla prováděna určením dávky infikující tkáňovou kulturu z 50 % (TC1D5o). To bylo provedeno odebráním 2 ml kultury k testování a lyži buněk čtyřnásobným průchodem jehlou kalibr 22. Vzorek byl sériově ředěn 1 : 10 DMEM/5 % FBS obsahujícím vankomycin (100 pg/ml) a amfotericin B (2,0 pg/ml). Ředění byla přidávána do 96 jamkové mikrotitrační destičky v množství 0,1 ml/jamku. Mikrotitrační destičky byly naočkovány buňkami HEp-2 na koncentraci 2500 buněk/jamku a před infekcí ponechány růst 18 až 24 hodin. Bylo použito 12 jamek na jedno ředění. Destička byla inkubována 6 dnů v atmosféře 8,0 % O2, 8,8 % CO2 a 83,2 % N2. Buňky byly fixovány studeným roztokem 50 % aceton a 50 % methanol po dobu 2 minut. K jamkám bylo přidáno 0,03 ml/jamku monoklonální protilátky antiL. intracellularis (McOrist, 1987), zředěné v poměru 1 : 2000 PBS. Destička byla 30 min inkubována při 37 °C a potom třikrát promyta PBS. V koncentraci 0,03 ml/jamku bylo přidáno antimyší FITC zředěné 1 : 30 a inkubováno 30 min při 37 °C. Destička byla promyta třikrát destilovanou vodou a ponechána usušit. Vzorky byly pozorovány fluorescenčním mikroskopem a bylo určeno číslo TCIDso/ml.
Zvířata:
Třicet jedna prasat obojího pohlaví a věku šest týdnů bylo získáno od dr. Kenta Schwartze. Prasata byla v den 0 náhodně rozdělena do čtyř kotců podle váhy.
-14CZ 295933 B6
Umístění zvířat
Pro umístění zvířat byly použity čtyři kotce v malé ošetřovně, každý oddělen alespoň 90 cm. Kotce měly drátěnou podlahu a byly odděleny pevnou přepážkou. Prostor byl vytápěn s dodatečným zahříváním topnými lampami. Teplota byla během trvání studie udržována mezi26 a 29 °C.
Krmivo a voda:
Zvířatům byla do nerezových žlabů podle libosti podávána dieta obsahující 19 % proteinů, složená z drcené kukuřice a sóji bez antibiotik. Voda byla rovněž podávána podle libosti.
Infekce prasat:
V den 0 byla prasata zvážena a kapilárou v retroorbitálním sinu jim byly odebrány vzorky krve. Sérum bylo odděleno a skladováno zmrazení při -20 °C. Pro PCR byly také odebrány výtěry výkalů. Prasata dostala 10 ml inokula, podaného žaludeční sondou.
Ošetření Počet prasat
Kontrola - neinfikované buňky5
Kontrola - bez ošetření2
Vysoké dávky8
Střední dávka8
Nízká dávka8
Prasata byla ve dnech 0, 10, 17 až 24 zvážena a byly jim odebrány vzorky krve.
Polymerázová řetězová reakce:
Infekce prasata byla monitorováno PCR s použitím primerů a parametrů cyklování jak bylo popsáno v: Jones (1993). PCR byly testovány vzorky fekálií odebrané ve dnech 0, 7, 14, 21 a 24 stejně jako sliznice střev.
Histopatologické vyšetření:
Řezy ilea, jejuna a kolonu byly fixovány formalinem, běžným způsobem zpracovány, barveny ilematoxylinem a eosinem, impregnovány stříbrem a vyhodnoceny. Řezy byly rovněž barveny s použitím monoklonální protilátky specifické proti Z. intracellularis.
Výsledky:
Klinické příznaky:
Klinické příznaky spočívající v řídké stolici byly u vysoké dávky poprvé pozorovány po třech dnech. Příznaky vrcholily ve čtrnácti dnech a potom se začaly rozlišovat.
Přírůstek hmotnosti:
Byly počítány průměrné denní přírůstky hmotnosti, které ukázaly, že skupina, které byla podána vysoká a střední dávka, měla ve srovnání s kontrolní skupinou snížené hmotnostní přírůstky. Při porovnávání skupin z hlediska přírůstku hmotnosti bylo možno pozorovat účinek titrace dávky.
PCR:
Do čtrnácti dnů nebyl pozorován úbytek stolice. Po 21 dnech bylo 37,5 % prasat, kterým byla podána vysoká dávka, ve fekáliích PCR pozitivní. Po nekropsii byly střevní sliznice testovány PCR s výsledkem 100 % pozitivních u vysoké dávky, 75 % u střední dávky, 50 % u nízké dávky a 0 % u kontroly.
-15 CZ 295933 B6
Makroskopická poškození:
Makroskopická poškození byla nalezena u dvou prasat s podanou vysokou dávkou (# 50 a # 202). Prasata měla přibližně 90 cm ztluštění střev, v případě # 202 s nekrózou.
Histopatologické vyšetření:
FA:
Barvení FA řezů ilea, jejuna a kolonu odhalilo přítomnost L. intracellularis v 87,5 % u vysoké dávky, 62,5 % jak u střední, tak i malé dávky a 0 % u kontrol.
Mikroskopická poškození:
Poškození byla pozorována ve 100 % případů u vysoké dávky, 75 % u střední dávky, 87,5 % u nízké dávky a 14 % u kontrol. Tato poškození byla stanovena pozorováním zvýšeného množství mononukleárních buněk v lamina propria a podslizniční vrstvě, často spojeným s hyperplazií Peyer's Patchers. Byla také pozorována hyperplazie krypt.
Barvení stříbrem:
Bylo provedeno barvení řezů na přítomnost intracelulámích zakřivených bakterií. V 87,5 % případů vysoké dávky, 62,5 % střední dávky a 87,5 % nízké dávky byla přítomnost bakterií pozorována, zatímco u kontrol pozorována nebyla.
Diskuse:
Prasata byla úspěšně infikována čistými kulturami L. intracellularis. V dávkách 107 bakterií vykázalo 100 % prasat infekci zjištěnou PCR a mikroskopickými poškozeními. Vážnost poškození a množství bakterie v tkáňových řezech byla relativně nízká. Tato studie je uspokojivým modelem testovacího podávání L. intracellularis díky přítomnosti L. intracellularis a mikroskopických poškození u prasete. Poškození se mohou zvětšit druhou dávkou, následující sedm dní po dávce první.
Příklad 5
Testování účinnosti vakcíny u křečků
Cíl:
Cílem experimentu bylo najít laboratorní zvířecí model pro stanovení bezpečnosti a účinnosti avirulentní živé vakcíny L. intracellularis u křečků.
Souhrn:
Byla uskutečněna studie na 40 křečcích vakcinaci třítýdenních křečků čistými kulturami vysoce pasážovaného kmene L. intracellularis a testovacím podáním 22 dnů po vakcinaci čistými kulturami virulentního materiálu s nízkým počtem pasáží. Křečci byli rozdělení do tří skupin. Skupina A byla vakcinována jednou dávku L. intracellularis kmene N72994 v den 0. Skupina B byla označena jako kontrolní skupina a vakcinační kultura jí nebyla podána. Oběma skupinám byly podány dvě testovací dávky čisté kultury kmene N343 L. intracellularis ve dnech 22 a 25 po vakcinaci. Skupina C dostala dávku testovacího kmene NI01494 pro srovnání relativní virulence vzhledem ke kmenu N343. Skupina A a B obsahovala každá 15 křečků a skupina C obsahovala 10 křečků. Výsledky stanovení dávky infikují 50 % tkáňových kultur (TCID50) ukázaly, že křečci byli vakcinováni 105 TCID50/dávku. Testovací dávka N343 obsahovala 105’5 TCID50/dávku. Testovací dávka pro skupinu C bylo 102’75 TCID5o/dávku. Fekální výtěry byly shromažďovány ve dnech 0, 7, 14, 21, 29, 36 a 43 pro testování polymerázovou řetězovou reakcí (PCR). V den 21 bylo ze skupin A a B usmrceno vždy 5 zvířat pro testování sliznic pomocí FA, hematoxalinového a eosinového barvení a barvení stříbrem střevních řezů pro určení přetrvávání osídlení bakteriemi
-16CZ 295933 B6 u vakcinovaných křečků. Zbývající zvířata byla usmrcena 21 dnů po testovacím podání a vyšetřována podobným způsobem.
Výsledky PCR ukázaly přítomnost/, intracellularis ve střevních sliznicích 100 % křečků skupiny A 21 dnů po vakcinaci. Skupina B byla ve všech případech 21 dnů po vakcinaci negativní. 21 dnů po testovacím podání bylo 50 % křečků ve skupině A PCR pozitivní a ve skupině B bylo 100 % pozitivních. Histopatologické vyšetření řezů ukázalo mírné až těžké poškození u 50 % zvířat ve skupině A a mírná poškození u 50 % případů ve skupině B, vždy 21 dnů po podání. 21 dnů po vakcinaci neměla poškození žádná zvířata. Skupina C neměla poškození 21 dnů po testovacím podání. Barvení FA a stříbrem nebyla schopna dokázat přítomnost Z. intracellularis u žádného řezu.
Je možno uzavřít, že u křečků vakcinovaných vysoce pasážovaným kmenem L. intracellularis došlo při testování pomocí PCR k 50 % snížení infekce. Střeva byla osídlena nízkým počtem intracelulárních organizmů, jak bylo ukázáno nepřítomností pozorovaných organizmů u řezů s barvením FA a stříbrem. Křečci ve skupině C nebyli schopni dosáhnout propuknutí infekce v průběhu studie nejpravděpodobněji v důsledku nízké dávky bakterií.
Materiály a metody:
Popis křečků:
Bylo použito 40 tři týdny starých samic křečků Harlan Sprague Dawley.
Růst inokula:
Kultura vakcíny:
Byla použita kontinuální kultura/, intracellularis rostoucí na buňkách HEp-2 po dobu 29 týdnů. Kultura byla pěstována podobným způsobem jak bylo uvedeno v části věnované testovací kultuře kromě toho, že na nové buňky HEp-2 přechází kultura každé dva až tři týdny.
Testovací kultury:
Jedna normální láhev pro tkáňové kultury 75 cm2 byla zaočkována 3,75 χ 105 buněk McCoys v médiu Dulbecco's Modifíed Eagle's Medium (DMEM) s 10 % fetálního bovinního séra (FBS) a ponechána růst 18 až 24 hod při 37 °C v atmosféře s 5 % CO2. Z buněk bylo odstraněno médium a k láhvi byla přidána 1 lahvička N343 MSC X, zředěných 14 ml DMEM/2 % FBS. Kultura byla umístěna v plynovém inkubátoru, evakuována a plyn byl nahrazen směsí vodíku a oxidu uhličitého za poskytnutí směsi 8,0 % O2, 8,8 % CO2 a 83,2 % H2. Kultura rostla 6 dnů, potom byly buňky seškrabány do 100 ml rotační láhve s 90 ml DMEM/2 % FBS a 0,01 g kuliček Cultisphere-G. Kultura rostla v koncentraci plynů uvedené výše. Objem láhve byl zvětšován zdvojováním objemu média v týdenních intervalech. Kultura rostla 25 dnů v rotační láhvi na konečný objem 250 ml.
Kmen NI 01494 byl pěstován stejným způsobem jako kmen N343.
Izolace kultur:
Vakcinační kultura:
Kultura byla izolována centrifugací 20 min při 3000 x g. Biomasa byla resuspendována v roztoku sacharóza - fosfát - glutamát (SPG) s 10 % FBS a protlačena čtyřikrát jehlou kalibr 25. Inokulum bylo naředěno na konečný objem (15 ml) SPG/10 % FBS.
Testovací kultury:
Kultura byla izolována centrifugací 20 min při 3000 x g. Biomasa byla resuspendována v roztoku sacharóza - fosfát - glutamát (SPG) s 10 % FBS a protlačena čtyřikrát jehlou kalibr 25. Inoku-17CZ 295933 B6 lum bylo naředěno na konečný objem (20 ml pro kmen N343 a 10 ml pro kmen N101494) SPG/10 % FBS.
Dávkování:
Vakcína:
V den 0 byly všichni křečci ve skupině A ústy vakcinováni 1 ml připravené vakcíny.
Testovací podání:
dnů po vakcinaci dostalo 10 křečků skupiny A a 10 křečků skupiny B orálně dávku 0,5 ml testovací kultury kmene N344. Skupina C dostala 0,5 ml testovací kultury kmene N101494.
Určení počtu IS Intracelullaris:
Určení počtu životaschopných IS intracellularis bylo provedeno určením dávky infikující 50 % tkáňové kultury (TCID50). To bylo provedeno odebráním 2 ml kultury pro testování a lyží buněk čtyřnásobným průchodem jehlou kalibr 22. Vzorek byl sériově zředěn 1 : 10 v médiu DMEM/5 % FBS s obsahem vankomycinu (100 pg/ml) a amfotericinu B (2,0 pg/ml). Ředění byla rozplněna v množství 0,1 ml/jamku do 96 jamkové mikrotitrační destičky, která byla zaočkována buňkami McCoys v počtu 1250 buněk na jamku a před infekcí inkubována 18 až 24 hodin při 37 °C a koncentraci CO2 5 %. Bylo použito 12 jamek najedno ředění. Destičky byly inkubovány 6 dnů při koncentraci plynů 8,0 % O2, 8,8 % CO2 a 83,2 % N2. V den 6 byly buňky fixovány studeným roztokem 50 % acetonu a 50 % methanolu po dobu 2 min. K jamkám bylo přidáno 0,03 ml/jamku anti-IS intracelullaris monoklonální protilátky zředěné 1 : 2000 PBS. Destička byla 30 min inkubována při 37 °C a potom třikrát promyta PBS. Bylo přidáno antimyší FITC zředěné 1 : 30 v množství 0,03 ml/jamku a inkubováno 30 min při 37 °C. Destička byla třikrát promyta destilovanou vodou a ponechána usušit. Vzorky byly pozorovány fluorescenčním mikroskopem a byla určena hodnota TCID50/ml.
Monitorování infekce u křečků:
Infekce u křečků byla monitorována PCR s použitím primerů a parametrů cyklů, jak bylo popsáno u Gaiy Jonese. Fekální vzorky byly odebrány v den 0, 7, 14, 21, 29, 36 a 43 po vakcinaci. Po usmrcení křečků byla pomocí PCR testována také střevní sliznice.
Histopatologické vyšetření:
Řezy ilea a kolonu byly fixovány formalinem, běžným způsobem zpracovány, obarveny hematoxylinem a eosinem, impregnovány stříbrem a vyhodnoceny. Řezy byly také barveny monoklonální protilátkou specifickou proti L. intracellularis.
Průměrné denní přírůstky hmotnosti:
Hmotnosti křečků byly zjišťovány 21, 28, 35 a 42 dnů po vakcinaci pro stanovení průměrného denního přírůstku hmotnosti.
Výsledky:
Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce.
TQD50:
Výsledky TCID50 ukázaly, že vakcinovaná skupina (skupina A) dostala 104’86 TQD50/křečka. Křečkům ve skupinách A a B byly podány testovací dávky kmene N343 v množství 105’5 TQD50. Skupina C dostala testovací látku kmene N101494 v množství 102’75 TCBD50/křečka.
-18CZ 295933 B6
PCR:
Testování PCR ukázalo přítomnosti, intracellularis u 100 % vakcinovaných křečků, kteří byli usmrceni 21 dnů po vakcinaci. Testování 43 dnů po vakcinaci ukázalo, že 100 % kontrolních křečků a 50 % vakcinovaných křečků bylo infikováno L. intracellularis. Pozitivní nebyl žádný 5 z křečků, který dostal testovací dávku NI 01494. Vylučování bakterie stolicí nebylo v průběhu studie u žádného z křečků prokázáno.
Histopatologické vyšetření:
Barvení Η & E neukázalo žádná histologická poškození u všech řezů z křečků usmrcených ío 21 dnů po vakcinaci. V řezech odebraných 43 dnů po vakcinaci mělo 50 % vakcinované skupiny mírnou až těžkou lymfocytickou enteritidu a 50 % kontrolní skupiny mělo mírnou lymfocytickou enteritidu. U skupiny, které byla podána testovací dávka N101494 nebylo zpozorováno žádné poškození. Barvením FA se u žádného z křečků 43 dnů po vakcinaci nepodařilo prokázat bakterii L. intracellularis.
Diskuse:
U křečků vakcinovaných vysoce pasážovaným kmenem L. intracellularis bylo pozorováno 50 % snížení infekce při testování pomocí PCR.
-19CZ 295933 B6
Mikroskopická poškození FA 1 t * 1 1 1 1 1 t •
Barv.Ag i 1 1 í 1 t 1 1 Ϊ
LU X 04 lil 1 04 LU 1 1 • Tř ω co LU 1 04 UJ
Sliznice Qí O Ol I Den 43' 4 1 + 1 + l + + 1 1
XM c Φ O < NA < z NA z NA NA NA < z < z
Fekální co -r c o Q i 1 1 f 1 1 ř f !
Den 36 • • 1 i 1 1 i 1 •
φ 04 c <£» Q • 1 4 1 1 1 1 1 •
Den 21 • 1 I 1 1 1 1
Den 14 < 1 1 4 ( » t i f
Den 7 1 • 1 1 • 1 1 1 t •
Den 0 1 1 t 1 t 1 1 t •
g A-1 04 < < co > < A-4 A-5 A-6 A-7 A-8 Φ 1 < A-10
-20CZ 295933 B6
1 • 1 1 1 1 • f r • 1 •
I 1 1 1 1 i 1 t • t 1
1 l 1 • i LU υΰ 1 v U-í UJ T- UJ
NA NA NA NA < z + + + + + + +
+ + ' + 4· + NA NA NA NA < z < z NA
< Z NA NA NA < z i 1 1 1 1 t
< z NA NA < z < z I 1 1 I 1 I
NA ' NA NA 1 i NA NA 1 » 1 • 1 •
1 1 1 • 1 • 1 - I 1 •
1 1 1 1 1 1 i • r 1 • t
i t 1 » r 1 > t i 9 1
í 1 l 1 1 • • 1 c t 1 1
r— v- CM *r- CO v* v v 10 <N co Xj· 10 co
< < < < < ώ ££> ta ώ m m ώ
-21 CZ 295933 B6
1 < 1 t t 1 1 1 1 I 1
1 • 1 • 1 1 1 t t 1 1
1 1 1 1 1 t 1 I i í •
4* 4» 4» < < < *c <
z z z
< < < < < < <
z z z z z z z
< < < < <
z z z z z
< < < < <
z Z «z? z z
< < < < <
z z z z z
1 1 t t 1 i 1 1 1 r
i } • 9 < • 1 1 1 I 1
í 1 1 1 1 1 • 9 9 1 i 1
1 í 1 1 1 • 1 1 1 1
o CM co ·*ζ5 IO CM co
oo σ» Y* f* r- r-*
QQ m OQ CQ CO co ώ m O O ó ó
-22CZ 295933 B6
1 • 3 3
1 1 1 1 1 3
1 1 1 1 1 1
» 1 3 i 3 í
VN < z < z < z < z VN
1 1 t 1
1 1 1 3 3
1 1 ] 1 1 I
i 1 I 3 •
i i • 1 1 3
1 1 1 1 • 1
t 1 i 1 1 1
C-5 <0 1 o r- * Q CO Q σ> 1 o C-10
’íZ φ c ® Έ mb
E
Íhv
E
II r~ UU
ÍO
Ή ‘C
Φ +* c
0) £Z trn
E
II CM LU
-23CZ 295933 B6
Příklad 6
Zjišťování účinnosti vakcíny u prasat
Cíl:
Předmětem této studie bylo vyhodnotit bezpečnost, přetrvávající osídlení bakteriemi a účinnost avirulentniho živého izolátu a usmrceného izolátu L. intracellularis u prasat ve věku dvou až tří týdnů. Byla prováděna studie na hostitelských zvířatech, ve které byla vakcinována prasata ve věku tří týdnů a potom vystavena virulentní testovací dávce L. intracellularis kmene N343 pro srovnání rozdílů v ochraně mezi vakcínami.
Metody:
11. prosince 1995 bylo zakoupeno od firmy Η & K Farms celkem 45 prasat ve věku tří týdnů. Prasata byla převezena do výzkumné stanice Veterinary Resources, lne., která se nachází v blízkosti Cambridge, Iowa, kde byla označena pro identifikaci každého jednotlivce. Prasata byla v této výzkumné stanici dva dny před začátkem pokusů pro umožnění aklimatizace na stanici a v průběhu studie byla krmena stravou bez antibiotik.
13. prosince byla všechna prasata zvážena, byly jim odebrány vzorky krve pro získání séra, byla klinicky vyšetřena a byly odebrány rektální výtěry. Prasata potom byla náhodně rozdělena do skupin po pěti a umístěna v kotcích. Dvacet prasat bylo umístěno do oddělené místnosti a byla označena jako kontrolní skupina a přísně kontrolní skupina. Patnáct prasat bylo umístěno ve druhé místnosti pro vakcinaci ISi-1. Ve třetí místnosti bylo deset prasat pro vakcinaci ISi-2.
Živá vakcína byla připravena v laboratoři NÓBL Laboratories Research and Development a identifikována jako experimentální řada ISi-1. ISi-1 (kmen N343) byla izolována z prasete a ponechána kontinuálně růst v čisté kultuře 29 týdnů. Vakcína rostla na buňkách McCoys v rotačních lahvích při sníženém množství kyslíku, dokud nebylo zjištěno přibližně 100 % infekce. Vzorek vysoce pasážovaného kmene N343 použitý pro ISi-1 byl pěstován dalších 11 týdnů („N343NP40wk“) a uložen v souladu s Budapešťskou dohodou 22.5. 1996 vATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA 20852 a označen depozitním číslem 55783. Kultury byly izolovány centrifugací při 3000 x g 20 min. Biomasa byla resuspendována v roztoku sacharóza - fosfát - glutamát (SPG) s 10 % FBS a protlačena čtyřikrát jehlou kalibr 25. Lyzáty byly centrifugovány při 500 x g 5 min pro odstranění úlomků buněk a mikronosičových kuliček. Supernatant byl uschován a skladován při -70 °C až do přibližně jedné hodiny před vakcinaci, kdy byly do podání skladován na ledu.
Usmrcená vakcína (ISi-2) byla pěstována, pasážována po dobu 12,5 týdne a izolována podobným způsobem jak bylo uvedeno výše a čištěna gradientem percolu. Čištěné bakterie byly skladovány při -70 °C až do doby přibližně 1 týden před vakcinaci, kdy byly skladovány při 4 °C a normální atmosférické koncentraci kyslíku, která je pro L. intracellularis toxická. K bakteriím byl přidán A1OH až do dosažení složení konečné směsi 10 % A1OH. Koncentrace proteinu byla stanovena biuretovou metodou.
Stanovení množství živých IS intracellularis:
Stanovení počtu životaschopných bakterií L. intracellularis bylo provedeno určením dávky pro infekci 50 % tkáňové kultury (TCID50). 96 jamkové mikrotitrační destičky byly zaočkovány buňkami McCoys s koncentrací 1250 buněk/jamka a ponechány růst 18 až 24 hodin před infekcí. Vzorky byly sériově naředěny 1:10 DMEM/5 % FBS obsahujícího vankomycinem (100 μg/ml) a amfotericin B (2,0 μg/ml). Zředěné vzorky byly přidávány do 96 jamkových mikrotitračních destiček v množství 0,1 ml/jamku. Bylo použito 12 jamek najedno ředění. Destička byla inkubována 6 dnů při 37 °C a koncentraci plynů 8,0 % O2, 8,8 % CO2 a 83,2 % N2. Buňky byly fixovány studeným roztokem 50 % acetonu a 50 % methanolu po dobu dvou minut. Do jamek bylo přidáno 0,03 ml/jamku monoklonální protilátky anti- L. intracellularis (vyvinul dr. Steven
-24CZ 295933 B6
McOrist), zředěné 1 : 2000 v PBS. Destička byla inkubována 30 minut při 37 °C a potom třikrát promyta PBS. Byl přidán konjugát antimyší imunoglobulin G - fluorochrom (FITC) zředěný v poměru 1 : 30 v množství 0,03 ml/jamku a destičky byly inkubovány 30 min při 37 °C. Destička byla promyta třikrát destilovanou vodou a ponechána usušit. Vzorky byly pozorovány fluorescenčním mikroskopem a hodnoty TCID50/ml byly určeny s použitím Reed-Meunschovy metody výpočtu.
Hodnoty TCID50 ukázaly, že ISi-1 měla 1,8 x 105 bakterií/ml. Čtvrté inokulum bylo placebo a bylo odvozeno z buněk tkáňové kultury zpracovaných stejným způsobem jako vakcíny.
Usmrcená vakcína byla testována biuretovou metodou na celkový obsah proteinu, který byl zjištěn 0,311 mg/ml.
Prasata byla vakcinována 13. 12. 1995. Živá vakcína byla všem podána v dávce 2 ml intranazálně po 1 ml do každé nozdry. Vakcína ISi-2 (usmrcená) byla podána IM v dávce 1,5 ml na prase a znovu o 14 dnů později. Všechna kontrolní zvířata dostala stejným způsobem jako živé vakcíny neinfíkované buňky.
Pozorování a vzorky:
V průběhu studie byly v sedmidenních intervalech odebírány fekální výtěry a vzorky séra. Fekální výtěry byly zpracovány pro PCR testování s použitím sady primerů 5-TATGGCTGTCAAACACTCCG-3' a 5-TGAAGGTATTGGTATTCTCC-3' pro amplifíkaci DNA. Parametry cyklů byly 93 °C 5 minut, 55 °C 45 sekund a 72 °C po dobu 45 sekund pro první cyklus. Bylo provedeno 33 cyklů při výše uvedených teplotách se 45 sekundami na každou teplotu. Poslední cyklus byl 93 °C 45 sekund, 55 °C 45 sekund a 72 °C 2 minuty, přičemž primery byly definovány Jonesem a dalšími.
Podávání testovacího mikroorganizmu:
Všechna zvířata kromě přísných kontrol dostala testovací dávku kultury 26 a 27 dnů po vakcinaci, skládající se z nízkopasážovaných kultur L. intracellularis kmenů N343 a N72994, které byly pěstovány kontinuálně mezi 8 a 12 týdny. Kultury byly izolovány centrifugováním při 3000 x g 20 min. Biomasa byla resuspendována v roztoku sacharóza -fosfát - glutamát (SPG) s 10% fetálního bovinního séra a protlačena čtyřikrát jehlou kalibr 25. Některé izolované kultury byly skladovány při -70 °C až do doby podání, zatímco jiné byly pěstovány až do dne podání a potom izolovány. Inokulum testovacích dávek bylo spojeno a bylo stanoveno TCID50 kultur. Vzorky byly skladovány až do podání na ledu.
Testovací kultura byla podána 8. 1. 1996 a obsahovala 4 x 104 bakterií/ml a testovací kultura podaná 9. 1. 1996 obsahovala 3 x 104 bakterií/ml. Prasatům bylo podáno oba dny žaludeční sondou 15 ml testovací dávky. Zvířata tedy dostala 6x 105 bakterií/prase a 4,7 x 105 bakterií na prase
8. 1. 1996, popřípadě 9. 1. 1996.
Výsledky:
Test bezpečnosti:
Výsledky fekálního PCR:
Detekce L. intracellularis pomocí PCR ukázala, že na počátku studie nevylučovala bakterie žádná prasata. Sedm dnů po vakcinaci byla všechna zvířata negativní. Čtrnáct dnů po vakcinaci byla tři prasata ve skupině ISi—1 pozitivní. Ve skupině ISi-1 byla 21 dnů po vakcinaci dvě zvířata pozitivní a všechna ostatní prasata negativní. Dvacátý šestý den po vakcinaci nevylučovala podle detekce PCR bakterie žádná zvířata. 26 dnů po vakcinaci bylo usmrceno pět prasat ze skupin ISi—1 a kontrol a čtyři prasata ISi-2. Byly odebrány vzorky ilea, kolonu, mezenterické lymfatické uzliny a tonsil stejně jako vzorky plic u prasat s nálezy s podezřením na pneumonii.
-25CZ 295933 B6
U jednotlivých vzorků ilea a plic bylo provedeno testování PCR. Tonsily, kolon a lymfatické uzliny byly u jednotlivých skupin spojeny a bylo provedeno PCR. Výsledky testování PCR jsou uvedeny níže.
Skupina PCR ilea 26 dnú po vakcinaci Sfiojený kolon Spojené tonsily Spojené mezenter. Ivmf.uzlinv Spojené plíce
ISi-1 1 z 5 + * 1 z 1
ISi-2 0 z 4 - - - 0 z 1
Kontroly Oz 5 - netest
Přísné kontroly netest netest. netest netest. netest.
Histologické řezy ilea byly barveny použitím monoklonální protilátky specifické proti L. intracellularis jako primární protilátky a konjugátu antimyší imunoglobulin G - fluorochrom jako sekundární protilátky. L. intracellularis byla pozorována u tří z pěti prasat ze skupiny ISi-1. Metodou barvení fluorescenční protilátkou byla všechna ostatní zvířata negativní.
Zbývající zvířata byla usmrcena 21 dnů po podání testovací dávky a těmto zvířatům byly odebrány vzorky pro vyhodnocení. Výsledky PCR jsou uvedeny níže.
Skupina PCR ilea 21 dnů po vakcinaci Spojený kolon Spojené tonsiiv Spojené mezenter. lymf.uzlinv Spojené plíce
ISi-1 0 z 10 + - - -
ISi-2 0z6 - - - -
Kontroly 4z 10 - - -
Přísné kontroly 0z5 - * -
FA barvení ilea bylo provedeno jak bylo uvedeno výše, přičemž v kontrolní skupině bylo pozi15 tivních sedm zvířat z deseti. Všechna ostatní zvířata byla na přítomnost L. intracellularis negativní.
Sérum bylo testováno na produkci protilátky IgG u prasat po expozici L. intracellularis. Test byl proveden zaočkováním Terasakiho destiček upravených pro tkáňové kultury buňkami McCoys 20 v počtu 125 buněk/jamku, které byly ponechány před infekcí růst 18 až 24 hodin. Potom byla do
-26CZ 295933 B6 jamek přidána čistá kultura L. intracellularis, zředěná na 1000 až 3000 bakterií/ml DMEM s 5 % fetálního bovinního séra v množství 0,01 ml/jamku. Destička byla inkubována 6 dnů při koncentracích plynu 8,0 % O2, 8,8 % CO2 a 83,2 % N2. Buňky byly fixovány studeným 50 % acetonem a 50 % methanolem po dobu dvou minut. Séra pro prasata byla zředěna 1 : 75 sterilním PBS. Zředěné sérum bylo přidáno do jamek v množství 0,01 ml/jamku. Destičky potom byly inkubovány 30 až 60 min při 37 °C. Destičky byly promyty pětkrát sterilním PBS. K jamkám bylo přidáno 0,01 ml/jamku konjugátu antiprasečího IgG imunoglobulinu G - fluorochrom. Destičky byly inkubovány 30 min při 37 °C. Potom byly pětkrát promyty destilovanou vodou a ponechány usušit. Vzorky byly promyty pětkrát destilovanou vodou a ponechány usušit. Vzorky byly pozorovány fluorescenčním mikroskopem a jamky, ve kterých byly pozorovány bakterie, byly označeny jako pozitivní a jamky, ve kterých žádné bakterie pozorovány nebyly, byly označeny jako negativní.
Výsledky:
Skupina Den 0 26 dnů po vakcinaci 47 dnů po vakcinaci, 21 dnů po testovacím podání
ISi-1 0 z 15 6z 15 8z 10
ISi-2 0 z 10 3 z 10 5 z6
Kontroly 1 z 15 0 z 15 9 z 10
Přísné kontroly 0z5 0 z 5 Oz 5
Zvířata, která byla pozitivní v den 0 byla opět testována v týdenních intervalech. Výsledky ukázaly, že se všechna stala sérologicky negativními do 14 dnů po vakcinaci. To není nečekané, protože věk prasat v den 0 byl tři týdny a pozitivní výsledky v tomto věku by mohly být způsobeny protilátkami matky.
Séra byla testována spolu s pozitivními kontrolními séry získanými hyperimunizací prasete L. intracellularis pěstovanou v čisté kultuře. Použité negativní kontrolní sérum bylo odebráno z gnotobiotického prasete v South Dakota Statě University.
Výsledky uvedené výše a příklady jsou pouze ilustrativní pro výhodná provedení, která dosahují předmětů, rysů a výhod předkládaného vynálezu a předkládaný vynález jimi nemá být omezován. Za část předkládaného vynálezu jsou pokládány jakékoliv modifikace vynálezu, které spadají do rámce následujících nároků.

Claims (21)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Způsob kultivace bakterie L. intracellularis v buňkách buněčné kultury v médiu, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky, při kterých se buňky buněčné kultury infikované L intracellularis inkubují při koncentraci kyslíku méně než 18 % maximální nasycené koncentrace kyslíku v médiu, přičemž buňky buněčné kultury se udržují v suspenzi.
    -27CZ 295933 B6
  2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že buňky buněčné kultury se udržují v suspenzi 6 až 8 měsíců.
  3. 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že pro zvýšení produkce bakterie L. intracellularis zahrnuje další krok, kde část buněk buněčné kultury, infikovaných bakterií L. intracellularis, se pasážuje do čerstvých neinfikovaných buněk buněčné kultury.
  4. 4. Způsob podle nároku 3, vy zn ač uj í cí se tí m , že dále obsahuje krok,při kterém se izoluje alespoň část buněk buněčné kultury.
  5. 5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že bakterie L. intracellularis se získá z živočicha, infikovaného Z. intracellularis.
  6. 6. Způsob podle nároku 5, v y z n a č u j í c í se t í m , že živočichem je prase.
  7. 7. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že inkubace se provádí při koncentraci kyslíku v rozmezí od 0 % do 8 % maximální nasycené koncentrace kyslíku v médiu.
  8. 8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že inkubace se provádí při koncentraci kyslíku od 0 % do 3 % maximální nasycené koncentrace kyslíku v médiu.
  9. 9. Způsob podle některého z nároků laž8, vyznačující se tím, že buňkami buněčné kultury jsou buňky zvolené ze skupiny Hep-2 a IEC-18.
  10. 10. Způsob podle některého z nároků laž8, vyznačující se tím, že inkubace se provádí na buňkách McCoys a IEC-18 na mikronosičích.
  11. 11. Bakterie L. intracellularis, uložená pod depozitním číslem ATCC 55672, vyprodukovaná způsobem podle nároku 1.
  12. 12. Způsob kultivace bakterie L. intracellularis, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:
    (1) buňky buněčné kultuiy se zaočkují inokulem obsahujícím bakterie L. intracellularis, aby došlo k infekci buněk bakterií; a (2) infikované buňky se inkubují při teplotě od 36 °C do 38 °C při koncentraci kyslíku od 0 % do 8 % maximální nasycené koncentrace kyslíku v médiu za míchání infikovaných buněk buněčné kultury tak, že kultivace bakterií L. intracellularis probíhá při udržování infikovaných buněk buněčné kultury v suspenzi.
  13. 13. Způsob výroby oslabeného kmene L. intracellularis, vyznačující se tím, že zahrnuje získání buněk buněčné kultury infikovaných bakterií L. intracellularis, inkubaci uvedených infikovaných buněk buněčné kultuiy v koncentraci kyslíku od 0 % do 18 % maximální nasycené koncentrace kyslíku v médiu, míchání uvedených infikovaných buněk buněčné kultury tak, aby kultivace bakterií probíhala při udržování infikovaných buněk buněčné kultury v suspenzi, pasážování alespoň části kultivované bakterie, izolace alespoň části kultivované bakterie a selekci oslabeného kmene pro získání oslabené bakterie L. intracellularis.
  14. 14. Použití bakterie L. intracellularis kultivované způsobem podle některého z nároků 1 až 10, nebo antigenní složky této bakterie, jako antigen v diagnostickém testu pro detekci přítomnosti protilátek, které specificky reagují s L. intracellularis v biologickém vzorku.
  15. 15. Použití podle nároku 14, kde testem je test ELISA nebo westernový přenos nebo imunologický test, s výhodou imunofluorescenční test.
    -28CZ 295933 B6
  16. 16. Způsob určení přítomnosti protilátek specificky reagujících s bakterií L. intracellularis v biologickém vzorku, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky získání buněk buněčné kultury infikovaných bakterií L. intracellularis, inkubace infikovaných buněk buněčné kultury při koncentraci kyslíku od 0 % do 18 % maximální nasycené koncentrace kyslíku v médiu, míchání uvedených infikovaných buněk buněčné kultury tak, aby kultivace L. intracellularis probíhala při udržování infikovaných buněk buněčné kultury v suspenzi, izolace alespoň části kultivované bakterie L. intracellularis, získání biologického vzorku ze zvířete, uvedení získaného vzorku do styku s izolovanou bakterií L. intracellularis nebo z ní odvozenou složkou za podmínek, při kterých protilátka přítomná v biologickém vzorku reaguje s bakterií L. intracellularis nebo její složkou a určení zda proběhla reakce protilátka - antigen a tím i určení přítomnosti protilátky proti bakterii L. intracellularis ve vzorku.
  17. 17. Vakcína pro vyvolání imunologické odpovědi proti bakterii L. intracellularis u živočicha, vyznačující se tím, že obsahuje oslabený kmen L. intracellularis vyprodukovaný způsobem podle nároku 13, ve farmaceuticky přijatelném nosiči, přičemž oslabený kmen je v účinném množství pro vyvolání imunologické odpovědi.
  18. 18. Vakcína pro vyvolání imunologické odpovědi proti bakterii L. intracellularis u živočicha, vyznačující se tím, že obsahuje usmrcenou bakterii L. intracellularis ve farmaceuticky přijatelném nosiči, přičemž bakterie se produkuje způsobem podle některého z nároků 1 až 10, a je v množství účinném pro vyvolání imunologické odpovědi.
  19. 19. Vakcína podle nároku 17 nebo 18, vyznačující se tím, že L. intracellularis infikující buněčnou kulturu se připraví ze střevního homogenátu zvířete infikovaného L. intracellularis.
  20. 20. Vakcína podle nároku 17, vyznačující se tím, že oslabeným kmenem je kmen N343NP40wk.
  21. 21. Oslabený kmen uložený pod depozitním číslem ATCC 55783, vyprodukovaný způsobem podle nároku 13.
CZ19973899A 1995-06-05 1996-06-05 Způsob kultivace bakterie Lawsonia intracellularis a vakcína CZ295933B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/465,337 US5714375A (en) 1995-06-05 1995-06-05 Ileal symbiont intracellularis propagation in suspended host cells
US08/658,194 US5885823A (en) 1995-06-05 1996-06-04 Lawsonia intracellularis cultivation, anti-Lawsonia intracellularis vaccines and diagnostic agents

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ389997A3 CZ389997A3 (cs) 1998-07-15
CZ295933B6 true CZ295933B6 (cs) 2005-12-14

Family

ID=27041284

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19973899A CZ295933B6 (cs) 1995-06-05 1996-06-05 Způsob kultivace bakterie Lawsonia intracellularis a vakcína

Country Status (24)

Country Link
US (1) US5885823A (cs)
EP (5) EP1645567B2 (cs)
JP (4) JP3765834B2 (cs)
KR (4) KR100544857B1 (cs)
AT (3) ATE289069T1 (cs)
AU (1) AU717045B2 (cs)
BG (1) BG64292B1 (cs)
BR (2) BRPI9612938B8 (cs)
CA (1) CA2222643C (cs)
CZ (1) CZ295933B6 (cs)
DE (5) DE69638016D1 (cs)
DK (3) DK1403643T3 (cs)
ES (3) ES2173055T3 (cs)
FR (1) FR07C0071I2 (cs)
HK (1) HK1010911A1 (cs)
HU (1) HU230199B1 (cs)
LU (1) LU91405I2 (cs)
NL (1) NL300331I2 (cs)
NZ (1) NZ319994A (cs)
PL (6) PL189287B1 (cs)
PT (3) PT1645567E (cs)
RO (1) RO118885B1 (cs)
RU (2) RU2265849C2 (cs)
WO (1) WO1996039629A1 (cs)

Families Citing this family (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1145697C (zh) 1995-11-30 2004-04-14 维多利亚农业服务控股公司 治疗和诊断组合物
FR2772047B1 (fr) * 1997-12-05 2004-04-09 Ct Nat D Etudes Veterinaires E Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection
NZ515331A (en) * 1999-05-13 2003-07-25 Pfizer Prod Inc Lawsonia derived gene and related FlgE polypeptides, peptides and proteins and their uses
JP2003501013A (ja) * 1999-05-13 2003-01-14 ファイザー プロダクツ インコーポレーティッド ローソニア由来の遺伝子及び関連ＳｏｄＣポリペプチド、ぺプチド及びタンパク質並びにそれらの使用
WO2000069905A1 (en) * 1999-05-13 2000-11-23 Australian Pork Limited LAWSONIA DERIVED GENE AND RELATED OmpH POLYPEPTIDES, PEPTIDES AND PROTEINS AND THEIR USES
AU775323B2 (en) * 1999-05-13 2004-07-29 Agriculture Victoria Services Pty Ltd Lawsonia derived gene and related hemolysin polypeptides, peptides and proteins and their uses
US7029683B1 (en) 1999-05-13 2006-04-18 Pfizer Products, Inc. Lawsonia derived gene and related hemolysin polypeptides, peptides and proteins and their uses
US7052697B1 (en) * 1999-05-13 2006-05-30 Agriculture Victoria Services Pty Ltd Lawsonia derived gene and related OmpH polypeptides, peptides and proteins and their uses
US6605696B1 (en) * 1999-10-22 2003-08-12 Pfizer, Inc. Lawsonia intracellularis proteins, and related methods and materials
JP2004529854A (ja) * 2000-09-29 2004-09-30 アリゾナ・ボード・オブ・リージエンツ・オン・ビハーフ・オブ・ザ・ユニバーシテイー・オブ・アリゾナ 増殖性回腸炎のための改善されたワクチン及びその作製と使用の方法
BR0114835A (pt) * 2000-11-10 2003-07-01 Agriculture Victoria Serv Pty Composições terapêuticas para tratamento de infecção por lawsonia spp
AUPR138100A0 (en) 2000-11-10 2000-12-07 Agriculture Victoria Services Pty Ltd Novel therapeutic compositions for treating infection by lawsonia spp
ATE330013T1 (de) * 2000-12-20 2006-07-15 Intervet Int Bv Lawsonia intracellularis impfstoff
US20030087421A1 (en) * 2001-07-11 2003-05-08 Gebhart Connie J Lawsonia intracellularis
WO2004033631A2 (en) * 2002-10-04 2004-04-22 Regents Of The University Of Minnesota Nucleic acid and polypeptide sequences from lawsonia intracellularis and methods of using
ES2333334T5 (es) † 2003-07-25 2018-08-06 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Lawsonia intracellularis de origen europeo y vacunas, agentes de diagnóstico y métodos de uso de la misma
EP1664100B1 (en) * 2003-09-12 2009-12-02 Intervet International BV Lawsonia intracellularis subunit vaccine
KR20060112674A (ko) * 2003-12-09 2006-11-01 인터벳 인터내셔널 비.브이. 로소니아 인트라셀룰라리스 26 ｋｄ 서브유닛 백신
AU2005206291B2 (en) * 2004-01-22 2010-06-03 Intervet International B.V Lawsonia intracellularis subunit vaccines
EP1609870A1 (en) * 2004-06-24 2005-12-28 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Method of diagnosing lawsonia intracellularis
MY146476A (en) 2004-06-24 2012-08-15 Boehringer Ingelheim Vetmed Method of diagnosing lawsonia intracellularis
US20060021536A1 (en) * 2004-07-30 2006-02-02 Limin Song Method for creating an absorbent article exhibiting a harmonic color scheme
KR100621882B1 (ko) * 2004-09-30 2006-09-19 건국대학교 산학협력단 돼지 증식성 회장염 감염돈에서 로소니아인트라셀룰라리스 균을 분리하는 방법
CA2586093A1 (en) * 2004-11-24 2006-06-01 Pharmacia & Upjohn Company Llc Methods for cultivating lawsonia intracellularis
US20070212373A1 (en) * 2004-12-08 2007-09-13 Akzo Nobel N.V. Lawsonia Intracellularis 26 Kd Subunit Vaccine
US7700285B1 (en) 2005-12-29 2010-04-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. PCV2 immunogenic compositions and methods of producing such compositions
UA95602C2 (ru) 2004-12-30 2011-08-25 Берингер Ингельхейм Ветмедика, Инк. Иммуногенная композиция цвс2 и способы приготовления такой композиции
US7833707B2 (en) 2004-12-30 2010-11-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Methods of overexpression and recovery of porcine circovirus type 2 ORF2
US8834891B2 (en) 2005-03-14 2014-09-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Immunogenic compositions comprising Lawsonia intracellularis
US8398994B2 (en) * 2005-07-15 2013-03-19 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Lawsonia vaccine and methods of use thereof
DK2371383T3 (en) * 2005-12-29 2015-11-30 Boehringer Ingelheim Vetmed Use of a PCV2 immunogenic composition for reduction of clinical symptoms in pigs
HUE054868T2 (hu) * 2005-12-29 2021-10-28 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc Multivalens PVC2 immunogén készítmények és eljárások ezek elõállítására
US8470336B2 (en) * 2006-05-25 2013-06-25 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Vaccination of young animals against Lawsonia intracellularis infections
US20080241190A1 (en) * 2006-11-13 2008-10-02 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Vaccination of horses against lawsonia intracellularis
US20100129397A1 (en) * 2006-12-11 2010-05-27 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Effective method of treatment of porcine circovirus and lawsonia intracellularis infections
RU2520087C2 (ru) * 2006-12-15 2014-06-20 Бёрингер Ингельхайм Ветмедика, Инк. Лечение свиней с помощью антигена pcv2
EP1941903A1 (en) 2007-01-03 2008-07-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prophylaxis and treatment of PRDC
EP1958644A1 (en) 2007-02-13 2008-08-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prevention and treatment of sub-clinical pcvd
US7829274B2 (en) * 2007-09-04 2010-11-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Reduction of concomitant infections in pigs by the use of PCV2 antigen
WO2009037262A2 (en) * 2007-09-17 2009-03-26 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Method of preventing early lawsonia intracellularis infections
JP2011500034A (ja) * 2007-10-12 2011-01-06 ファイザー・インク ロウソニア・イントラセルラリス（ｌａｗｓｏｎｉａｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）を培養する方法
EP2231182A4 (en) * 2007-12-31 2012-08-22 Boehringer Ingelheim Vetmed PCV2-ORF2-VIRUSELY PARTICLES WITH FREMDAMINO-ACID INSERTION
US20090317423A1 (en) 2008-01-23 2009-12-24 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Pcv2 mycoplasma hyopneumoniae immunogenic compositions and methods of producing such compositions
WO2009103037A1 (en) * 2008-02-15 2009-08-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Methods and compositions for reducing the impact of enteric diseases
TWI449533B (zh) 2008-04-18 2014-08-21 Intervet Int Bv 防備胞內勞森菌（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）、豬肺炎黴漿菌（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及豬環狀病毒（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏ ｖｉｒｕｓ）用疫苗
TWI551295B (zh) 2008-04-18 2016-10-01 英特威特國際股份有限公司 防備胞內勞森菌（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）用疫苗
ES2534556T3 (es) * 2008-07-22 2015-04-24 Intervet International Bv Bacteria Lawsonia intracellularis de un nuevo serotipo, vacuna basada en esa bacteria, anticuerpos adecuados para diagnosticar el nuevo serotipo de Lawsonia intracellularis e hibridomas para producir dichos anticuerpos
US8142760B2 (en) * 2008-09-05 2012-03-27 Nathan Len Winkelman Vaccination for Lawsonia intracellularis
WO2011006880A1 (en) * 2009-07-14 2011-01-20 Intervet International B.V. Lawsonia intracellularis propagation
TWI627281B (zh) * 2009-09-02 2018-06-21 百靈佳殷格翰家畜藥品公司 降低ｐｃｖ－２組合物殺病毒活性之方法及具有改良免疫原性之ｐｃｖ－２組合物
ES2606131T3 (es) 2009-11-09 2017-03-22 Intervet International B.V. Método para cultivar bacterias Lawsonia intracellularis en células McCoy infectadas de forma persistente
CN104968365B (zh) * 2012-12-28 2018-04-03 勃林格殷格翰动物保健有限公司 支原体疫苗的制备方法
WO2015048115A1 (en) 2013-09-25 2015-04-02 Zoetis Llc Pcv2b divergent vaccine composition and methods of use
EA035265B1 (ru) 2013-10-02 2020-05-21 Бёрингер Ингельхайм Энимал Хелс Ю-Эс-Эй Инк. Вариант белка opc2 pcv2 и содержащие его вирусоподобные частицы
ES2798282T3 (es) * 2015-02-04 2020-12-10 Intervet Int Bv Una vacuna para usar contra la infección asintomática por Lawsonia en un cerdo
JP2018504424A (ja) 2015-02-04 2018-02-15 インターベット インターナショナル ベー． フェー． 豚における無症候性ローソニア感染症に対する使用のためのワクチン
KR20180062468A (ko) * 2016-11-18 2018-06-11 녹십자수의약품(주) 신규한 로소니아 인트라셀룰라리스 균주 및 이의 용도
US10792352B2 (en) 2018-02-28 2020-10-06 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Method for reducing skatole and/or indole in animals
US20230241198A1 (en) 2020-07-24 2023-08-03 Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. Combination porcine vaccine
WO2023073640A1 (en) 2021-11-01 2023-05-04 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Immunogenic gel compositions
WO2024068637A1 (en) * 2022-09-27 2024-04-04 Intervet International B.V. A method of culturing lawsonia intracellularis bacteria

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4132597A (en) * 1976-06-09 1979-01-02 Ab Medipharm Method for cultivation of bacteria
US4237218A (en) * 1979-02-09 1980-12-02 Bio-Rad Laboratories, Inc. Micro-carrier cell culture
JPS5991879A (ja) * 1982-11-16 1984-05-26 Hideaki Yamada シユ−ドモナス属細菌の培養法
DK594084A (da) * 1984-12-12 1986-06-13 Novo Industri As Fremgangsmaade til stabilisering af extra-chromosomale elementer i bakterier under dyrkning
JPH0644865B2 (ja) * 1985-10-29 1994-06-15 三菱瓦斯化学株式会社 カンピロバクタ−属細菌の培養方法
US5338670A (en) * 1986-07-28 1994-08-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of bordetella pertussis toxin with a low concentration of iron
IT1227657B (it) * 1988-12-01 1991-04-23 Mini Ricerca Scient Tecnolog Antibiotici ab-021 e processo per la loro produzione
JPH0822221B2 (ja) * 1988-12-28 1996-03-06 日東化学工業株式会社 シュードモナス属細菌の培養法
JPH02308754A (ja) * 1989-05-24 1990-12-21 Yakult Honsha Co Ltd 乳発酵食品の製造法
US5296221A (en) * 1990-01-31 1994-03-22 Sani-Ei Sucrochemical Co., Ltd. Lactobacillus johnsonii ferm bp-2680 lactic acid bacteria preparations using the same and a process of manufacturing the preparations
ES2150419T3 (es) * 1990-11-01 2000-12-01 Univ Iowa State Res Found Inc Procedimiento de atenuacion bacteriana y vacuna.
US5616328A (en) * 1991-11-15 1997-04-01 Pfizer Inc. Method of preparing gram-negative bacterial vaccines
DE4208785A1 (de) * 1992-03-19 1993-09-23 Degussa Verfahren zum auffinden von insertionselementen (is-elemente) oder transposonen
US5610059A (en) * 1992-11-09 1997-03-11 University Of Arizona Etiological agent for porcine enteritis

Also Published As

Publication number Publication date
BG102130A (en) 1998-09-30
CZ389997A3 (cs) 1998-07-15
PL189286B1 (pl) 2005-07-29
RU2005114739A (ru) 2006-11-20
ES2173055T1 (es) 2002-10-16
RO118885B1 (ro) 2003-12-30
HUP9900884A2 (hu) 1999-07-28
DE69634334D1 (de) 2005-03-17
LU91405I2 (fr) 2008-02-21
ATE289069T1 (de) 2005-02-15
HU230199B1 (hu) 2015-10-28
JP2008266340A (ja) 2008-11-06
PL325872A1 (en) 1998-08-17
KR100513481B1 (ko) 2006-01-27
DE69634334T2 (de) 2006-04-13
NL300331I1 (nl) 2008-03-03
NL300331I2 (nl) 2008-07-01
EP1645567B2 (en) 2016-01-06
JP2006061165A (ja) 2006-03-09
DE69638016D1 (de) 2009-10-15
BG64292B1 (bg) 2004-08-31
PT843818E (pt) 2005-04-29
EP2199795B1 (en) 2016-03-30
KR20050048651A (ko) 2005-05-24
BR9608338A (pt) 1999-01-05
EP1403643B1 (en) 2009-09-02
PL189287B1 (pl) 2005-07-29
ES2173055T3 (es) 2005-07-01
FR07C0071I1 (cs) 2008-01-02
DE69637251T2 (de) 2008-06-12
DK0843818T3 (da) 2005-05-09
PL187849B1 (pl) 2004-10-29
EP1403643A1 (en) 2004-03-31
DE122007000102I1 (de) 2008-04-17
JP3765834B2 (ja) 2006-04-12
ATE441863T1 (de) 2009-09-15
EP1655607B1 (en) 2015-05-13
NZ319994A (en) 2000-01-28
AU6262796A (en) 1996-12-24
ES2294620T3 (es) 2008-04-01
ES2332587T3 (es) 2010-02-09
MX9709464A (es) 1998-06-30
PL189250B1 (pl) 2005-07-29
JP5078740B2 (ja) 2012-11-21
EP0843818A4 (en) 2002-02-06
EP0843818B1 (en) 2005-02-09
HK1010911A1 (en) 1999-07-02
EP2199795A3 (en) 2010-11-03
RU2265849C2 (ru) 2005-12-10
KR100758614B1 (ko) 2007-09-13
ATE373015T1 (de) 2007-09-15
PT1403643E (pt) 2009-10-08
RU2305707C2 (ru) 2007-09-10
EP1655607A1 (en) 2006-05-10
JPH11507225A (ja) 1999-06-29
WO1996039629A1 (en) 1996-12-12
EP2199795A2 (en) 2010-06-23
AU717045B2 (en) 2000-03-16
KR19990022509A (ko) 1999-03-25
EP0843818A1 (en) 1998-05-27
JP3920300B2 (ja) 2007-05-30
PL189187B1 (pl) 2005-07-29
FR07C0071I2 (fr) 2010-12-31
KR20060129549A (ko) 2006-12-15
JP2007151554A (ja) 2007-06-21
KR20050046741A (ko) 2005-05-18
DK1403643T3 (da) 2010-01-04
HUP9900884A3 (en) 2001-01-29
CA2222643C (en) 2013-08-13
EP1403643B2 (en) 2018-10-03
PT1645567E (pt) 2007-11-19
EP1645567A1 (en) 2006-04-12
EP1645567B1 (en) 2007-09-12
JP4263212B2 (ja) 2009-05-13
PL187850B1 (pl) 2004-10-29
EP0843818B2 (en) 2018-12-19
DE69637251D1 (de) 2007-10-25
DK1645567T3 (da) 2007-11-26
ES2294620T5 (es) 2016-03-23
CA2222643A1 (en) 1996-12-12
US5885823A (en) 1999-03-23
DE69637251T3 (de) 2016-06-02
BRPI9612938B1 (pt) 2010-07-27
BRPI9612938B8 (pt) 2017-09-12
KR100544857B1 (ko) 2006-01-24
DE843818T1 (de) 2002-11-28
BR9608338B1 (pt) 2009-05-05
DK1645567T4 (en) 2016-04-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ295933B6 (cs) Způsob kultivace bakterie Lawsonia intracellularis a vakcína
RU2420570C2 (ru) Lawsonia intracellularis ЕВРОПЕЙСКОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ И ВАКЦИНЫ, ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ АГЕНТЫ НА ЕЕ ОСНОВЕ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
US5714375A (en) Ileal symbiont intracellularis propagation in suspended host cells
MXPA97009464A (en) Culture of lawsonia intracellularis, vaccines against lawsonia intracellulares and agents of diagnost

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20160605