KR19990022509A - 라우소니아 인트라셀루라리스의 배양, 항-라우소니아 인트라셀룰라리스 백신 및 진단시약 - Google Patents

라우소니아 인트라셀루라리스의 배양, 항-라우소니아 인트라셀룰라리스 백신 및 진단시약 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포를 감염시키기 위하여 엘. 인트라셀룰라리스(L. intracellularis) 박테리아를 세포에 접종하며, 감소된 산소 농도에서 감염된 세포를 인큐베이션하고, 현탁액내에서 감염된 세포를 유지시킴으로써 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아의 대량 배양 및 약독화를 위한 방법에 관한 것이다. 또한, 항-엘. 인트라셀룰라리스 백신을 현탁액에서 성장시킨 배양액으로부터 제조하였으며, 진단 시약도 공개하였다.

Description

라우소니아 인트라셀룰라리스의 배양, 항-라우소니아 인트라셀룰라리스 백신 및 진단 시약
[발명의 분야]
본 발명은 항-라우소니아 인트라셀룰라리스 백신 및 라우소니아 인트라셀룰라리스의 감염에 대한 예방 및 그 진단 방법에 관한 것이다. 본 발명의 생성물 및 방법은 부분적으로 대량 공급용 엘. 인트라셀룰라리스(L. intracellularis)를 배양하기 위하여 본 발명자가 밝혀낸 개선된 방법의 결과로서 얻을 수 있다.
[관련 기술 분야]
돼지의 증식성 장질환(PPE)의 원인이 되는 엘. 인트라셀룰라리스는 결과적으로 토끼, 흰담비, 햄스터, 여우, 말 및 타조 및 에무스 만큼 다양한 다른 동물 등을 포함한 모든 동물에게 영향을 끼친다.
엘. 인트라셀룰라리스는 특히 돼지 무리내에서 많은 손실의 원인이다. 미연방공화국에서 측정한 PPE의 유행 및 발생 빈도는 돼지 무리의 20%이며, 매년 이천만 달러의 손실을 가져온다.
PPE의 일치된 특징은 장의 감염 부위의 장세포에서 세포질성이며, 막에 결합하지 않은 구부러진 간균(bacilli)의 발생이다. PPE와 결합한 박테리아는 S. McOrist 등에 의해서 Vet. Pathol. Vol. 26. 260-64 (1989)에서 캄필로박터(Campylobacter)-유사 미생물로 언급되어져 왔다. 이어서, 원인성 박테리아는 C. Gebhart et al., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, vol. 43, No. 3, 533-38 (1993)에서 출생지로 언급되어진 이레알 심비온트(Ileal symbiont; IS) 인트라셀룰라리스로, 신규 분류 속 및 종으로 확인되었다. 좀 더 최근에, 이러한 신규 박테리아는 분류학적 이름 라우소니아 (Lawsonia; L.) 인트라셀룰라리스(intracellularis)로 불리어진다(S. McOrist et al., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, vol. 45, No. 4, 820-25 (1995)). 이러한 세 가지 이름은 본 발명에서 확인되고 언급된 바와 같이 상호 교환적으로 동일한 미생물에 사용된다. 본 발명자는 분류학적 이름인 엘. 인트라셀룰라리스를 본 발명의 설명 전반에 걸쳐 사용하려고 시도한 바 있다.
엘. 인트라셀룰라리스는 종래의 무세포 배양액 상에서 보통의 박테리아적 방법에 의해 배양될 수 없는 절대적인 세포내 박테리아이며, 성장하기 위해 부착할 상피세포가 필요하다고 여겨진다. S. Mcorist et al., Infection and Immunity, vol. 61, No.10. 4286-92 (1993) 및 G. Lawson et al., J of Clinical Microbiology, Vol. 31, No. 5, 1136-42 (1993)에서는 종래의 조직 배양 플라스크에서 단층의 IEC-18 쥐의 장의 상피세로를 이용한 엘. 인트라셀룰라리스의 배양에 관한 내용을 기술하고 있다. 또한, H. Still, Infection and Immunity, Vol. 59, No. 9, 3227-36 (1991)에서는 장 407 인간의 태아 장세포 단층 및 GPC-16 기니피그(gutnea pig) 결장의 선암 세포 단층을 사용하여 종래의 조직 배양 플라스크에서 배양한 내용을 기술하고 있다. 이러한 선행 배양 방법은 더 많은 노력을 필요로 하며, 대규모 배양에는 적합하지 않다.
엘. 셀룰라리스의 감염, 치료 및 질병의 효과적인 구제에 대해서 통용되는 지식은 시험관내 배양에서는 엘. 인트라셀룰라리스의 까다로운 성장 요구 조건에 의해서 매우 방해된다는 것이다. 현재는 엘. 인트라셀룰라리스의 배양을 하기 위한 개선된 방법이 필요하다. 또한, 항-엘. 인트라셀룰라리스 백신 및 엘. 인트라셀룰라리스 감염을 진단하는 효과적인 기술이 필요하다.
[발명의 요약]
본 발명의 목적은 항-엘. 인트라셀룰라리스 백신을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 생물 표본에서, 엘. 인트라셀룰라리스에 대한 항체의 존재를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 목적은 백신 생성 및 진단 물질을 위한 엘. 인트라셀룰라리스의 대규모 배양을 가능케하는 개선된 배양 방법을 제공하는 것이다.
이러한 목적 및 그외의 목적 등을 이루기 위하여, 여기에서 공지되고 넓게 기술된 바와 같이 본 발명의 목적에 따라, 본 발명은 엘. 인트라셀룰라리스의 배양 방법 및 그로 인해 생성된 박테리아의 대규모 공급 방법을 제공한다. 본 발명에 따라서, 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아는 현탁액내에서 박테리아를 유지시키는 동안 엘. 인트라셀룰라리스를 배양하기 위하여 박테리아를 교반하는 동안 약 0% 내지 약 18%의 산소 농도에서 인큐베이션 되었다.
다른 실험에 따르면, 박테리아로 세포를 감염시키기 위해서 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아를 함유하는 접종물과 함께, 약 30% 합류점을 가지는 단층의 HEp-2, 맥코이(McCoys), 또는 IEC-18 세포를 접종함으로써 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아를 배양하는 방법을 제공한다. 감염된 세포는 온도 약 36℃ 내지 38℃, 산소 농도 약 0% 내지 약 8.0%에서 세포가 합류할 때까지 인큐베이션하였다. 감염된 세포 및 증식용 배양액을 현탁액내에서 세포를 유지시키기에 적합한 발효기, 바이오리액터, 스핀너 플라스크 또는 다른 용기에 넣었다. 감염된 세포는 현탁액내에서 감염된 세포를 유지시키는 동안 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아를 배양하기 위해서 세포를 교반하는 동안 인큐베이션하였다. 배양된 엘. 인트라셀룰라리스의 일부는 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아의 생성을 증가시키기 위하여 신선한 배양 세포로 옮겼다.
본 발명은 항-엘. 인트라셀룰라리스 백신 및 엘. 인트라셀룰라리스 백신을 생성하는 방법을 제공한다. 배양된 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아를 충분히 여러번 계대 배양하며, 독성이 약화된 균주를 선별 또는 배양된 박테리아를 화학적 방법에 의해 독성을 약화시킴으로써 무발병성 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아를 생성한다. 또한, 살균된 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아 백신은 본 발명의 배양방법으로 제조될 수 있다. 특별히 바람직한 구체예에 따르면, 박테리아는 백신의 용도에 사용하기 위한 약독성의 균주를 생성하기 위하여 적어도 약 7번 내지 12번 옮기는 동안 적어도 약 6 내지 8개월 동안 계속적으로 배양된다. 독성이 약화된 박테리아는 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합되며, 면역 반응을 생성하기 위한 효과적인 양을 동물에 투여한다. 본 발명자는 American Type Culture Collection의 통상적으로 바람직한 독성이 약화된 균주(N343NP40wk)를 폐기처리하였다.
또한, 본 발명은 배양된 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아의 적어도 일부를 회수하고, 생물적 표본내의 항체와 엘. 인트라셀룰라리스 또는 구성물이 반응하는 조건하에서 동물에서 얻은 생물 표본과 회수된 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아 또는 그 구성물과 접촉시키고 항원-항테 반응의 발생여부를 관찰함으로써 수집된 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아 생물 표본에서 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아와 특별히 반응하는 항체의 존재 결정방법을 제공한다.
본 발명의 추가적 특징 및 장점은 하기 설명에 기술하였으며, 그 설명으로 명백해지거나 본 발명의 실시에서 알 수 있을 것이다.
[바람직한 구체예의 설명]
여기에서 사용된 바와 같이, 용어 엘. 인트라셀룰라리스는 C. Gebhart et al., Int'. J. of Systemic Bacteriology, vol. 45, No. 4, 820-25 (1995)에 자세히 기술된 세포내의 굽은 형의 그람-양성 박테리아(각각은 완전히 문헌에 의해 여기에 혼입되어 있다)를 의미하며, American Type Culture Collection, Rockville, MD에 기탁된 박테리아 ATCC 55672; Nationa Collection of Type Cultures, Colindale, London에 기탁된 박테리아 NCTC 12656 및 12657에만 제한되는 것은 아니며, 원인성 박테리아는 본 발명 및 기술의 지식이 주어진 전 세계에 걸쳐서 PPE로 감염된 돼지 또는 다른 동물에서 수득할 수 있으며, 저절로 또는 인위적으로 수득되든지 간에 상기 박테리아의 변이주 또는 돌연변이주를 포함한다.
여기에서 사용된 바와 같이, 용어 약독화시킨 균주는 본 발명에 따라서 제조되며, 숙주 동물에 투여될 때 면역성을 유지하는 반면에 무발명성을 만들기 위하여 여기에서 알려주는 배양 및 전달(passaging) 기술에 따라서 제조되는 어떤 엘. 인트라셀룰라리스 균주를 의미한다. 하기에 나타낸 바와 같이, 다른 다양한 엘. 인트라셀룰라리스 균주는 엘. 인트라셀룰라리스의 감염에 영향을 받기 쉬운 돼지나 다른 동물에서 백신으로서 효과를 가지는 약독화시킨 면역 균주를 본 발명의 기술에 따라 배양하였으며, 약독화시켰다.
본 발명의 약독화시킨 균주는 일반적으로 새, 물고기, 가축, 돼지, 말, 포유동물 및 영장류를 포함한 동물에 대한 항미생물성 백신에서 면역원으로서의 용도를 가지리라고 기대된다. 이러한 백신은 본 발명에서 제공된 기술 분야의 기술자에게 알려진 기술에 의해 제조될 수 있다. 이러한 백신은 약제학적으로 허용되는 담체내에 면역학적으로 효과적인 양의 약독화시킨 균주를 함유한다. 백신은 1회 또는 그 이상 투여될 수 있다. 면역학적으로 유효량은 과도한 실험없이도 본 기술에서 공지된 방법 및 여기에 포함된 기술에 의해 결정될 수 있다. 무발병성 박테리아의 양은 아직도 무발병성인 상태인 동안에 질병에 감염되기 쉬운 동물에서 면역 반응을 자극하기 위하여 충분하여야 한다. 이는 특별한 동물, 박테리아, 및 질병여부에 따라 달라질 것이다. 감수성 동물에게 권장되는 투여량은 바람직하게는 체중당 약 103내지 109박테리아/kg이며, 가장 바람직하게는 체중당 약 105내지 107박테리아/kg이다. 안정화제 및 희석제를 포함하여 담체는 본 분야의 기술자에게는 알려져 있다. 또한, 이 백신은 적당한 면역보강제(아주반트)를 함유하기도 한다. 본 발명의 백신은 다른 백신, 예를 들면, 다른 동결건조된 백신의 희석제와 조합하여, 또는 동결건조 전에 다른 백신과 조합하여 사용될 수도 있다. 또한, 백신제조는 예를 들면, 저장 목적 또는 액체 백신으로 실질적인 제형용으로 냉동건조시킴으로써 건조될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한, 동물숙주에서 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아로부터 숙주를 보호하기 위하여 독성의 야생형 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 함유한다. 그 방법은 숙주에게 면역학적으로 효과적인 양의 본 발명의 약독화시킨 박테리아 또는 살균된 박테리아를 투여하는 것이며, 바람직하게는 숙주에게 본 발명의 백신을 투여하는 것을 포함한다.
여기에서 사용된 바와 같이, 용어 대규모 배양은 약 2.0 내지 3.0ℓ이상 및 100ℓ이상 규모의 엘. 인트라셀룰라리스의 배양 수준을 의미한다. 여기에서 사용된 바와 같이, 배양은 엘. 인트라셀룰라리스의 성장, 생식의 증가시키는 방법, 및/또는 증식 방법을 의미한다.
본 발명의 배양 방법의 실시에서, 배양세포는 세포를 박테리아로 감염시키기 위해서 먼저, 엘. 인트라셀룰라리스를 함유한 접종물을 접종한다. 본 발명의 실시에서는 IEC-18 (ATCC 1589)-쥐의 장상피세포, HEp-2 (ATCC 23)-인간의 유표피(epidermoid)의 육종성 세포, McCoys (ATCC 1696)-생쥐의(비특이성) 세포, MDCK(ATCC 34)-마딘-다르비(Madin-Darby) 개의 신장세포, BGMK (바이오화이트택커 #71-176)-버팔로 녹색 원숭이 신장세포, 및 돼지의 내장 상피세로를 포함하나 이에 제한되지 않는 많은 세포주를 사용할 수 있다. 바람직한 배양세포는 HEp-2, McCoys 또는 IEC-18 세포이다. 대안적으로, 박테리아는 박테리아를 여기에서 지정한 적절한 용존 O2농도에서 유지시키는 동안에 무세포계에서 배양될 수 있다.
배양세포를 사용하는 경우, 접종에 앞서서 미리, 세포는 바람직하기는 하지만 단층 형태로 필요한 것은 아니다. 단층형태로, 세포는 종래의 플라스크에 접종될 수 있다. 각 플라스크는 일반적으로 성장 배양액과 혼합한 25㎠의 플라스크당 약 1×105세포 내지 약 10×105세포사이에서 접종한다. 성장 배양액은 질소원, 선택된 배양세포의 성장요소, 및 글루코오스 또는 락토즈와 같은 탄소원을 함유한 세포배양을 위한 어떠한 배양액일 수도 있다. 판매되는 다른 다양한 배양액이 우수한 결과를 가지고 사용되더라도, 바람직한 배양액은 2-5% 소의 태아혈청을 가진 DMEM이다.
본 발명자는 엘. 인트라셀룰라리스 일정한 성장단계에서 배양세포를 유지시킴으로써 성공적으로 배양할 수 있음을 밝혀내었다. 따라서, 단층의 배양세포는 접종시에 약 20% 내지 약 50% 합류점에 있어야 한다. 바람직하게는, 세포는 접종시에 약 30% 내지 약 40% 합류점에 있어야 하며, 가장 바람직하게는 약 3-% 합류점이다.
접종물은, 예를 들면, ATCC 기탁번호 55672, NCTC 기탁 번호 12656 또는 12657, 또는 여기에 언급된 분리 및 정제 기술을 사용하여 감염된 돼지 또는 다른 동물로부터 수득된 엘. 인트라셀룰라리스를 순수배양한 것이어야 한다.
한 구체예에 따르면, 본 발명을 실시하기 위한 접종물은 PPE로 감염시킨 돼지 또는 다른 동물의 회장의 점막을 긁어서 제조된 장의 균등액이다. 장의 균등액을 제조할 때, 배양을 위해 선택된 회장의 단면은 장(gut)의 전체적인 비후화가 있는 심한 병변을 나타낸다. 박테리아의 허약한 특성 때문에, 표본은 바람직하게는 검시후 가능하면 급히 -70℃에 보관하여야 한다. 엘. 인트라셀룰라리스의 항생제는 반코마이신, 암포테리신 B 또는 겐타마이신 및 네오마이신을 포함한 항생제의 아미노글리코시드 그룹의 구성물으로서 내성을 가지며, 바람직하게는 엘. 인트라셀룰라리스 성장이 허용되는 동안 박테리아를 함유한 접종물을 가하는 것이다. 접종물이 순수배양액 또는 장의 균등액이든지간에, 배양세포의 접종은 여기에서 주어진 기술 분야의 공지된 다양한 기술에 의해 완성할 수 있다.
다음, 박테리아 및/또는 접종된 배양세포는 감소된 용존 O2농도하에서 인큐베이션되었다. 18% 이상의 용존 산소 농도에서 엘. 인트라셀룰라리스 성장은 이 범위외의 산소 농도에서 결국 발생하는 성장의 정지를 가진 최적보다 작다. 바람직하게는, 접종된 배양세포는 약 0% 내지 약 10% 범위의 용존 산소 농도에서 인큐베이션되었다. 더 바람직하게는, 세포는 약 0% 내지 약 8% 범위의 산소 농도에서 인큐베이션되었으며, 가장 바람직하게는 약 0% 내지 약 3.0%의 산소 농도이다.
또한, 적절한 이산화탄소의 농도는 엘. 인트라셀룰라리스의 적절한 성장에 중하다. 10% 이상 및 4% 미만의 이산화탄소의 농도에서, 비-최적 성장은 이 범위외의 이산화탄소 농도에서 결국 발생하는 성장의 정지와 함께 생긴다. 바람직하게는, 이산화탄소의 농도는 약 6% 내지 약 9% 범위, 가장 바람직하게는 약 8.8%의 이산화탄소의 농도이다.
또한, 세포는 바람직하게는 수소 농도 약 73% 내지 약 94%의 범위에서 인큐베이션되었다. 질소는 존재한 수소의 약간 또는 모두를 대체하여 사용될 수도 있다. 특히 바람직한 구체예에 따르면, 세포는 약 0-8%, O2, 약 8.8%, CO2및 약 83.2% H2에서 인큐베이션되었다.
접종된 세포는 적절한 농도의 산소 및 이산화탄소를 함유하며, 배양되는 동안 세포를 현탁시킬 수 있는 이중의 가스 항온기 또는 다른 가스챔버에서 배양될 수 있다. 이 방은 현탁액내에서 접종된 세포를 유지시키기 위한 방법, 및 가스 모니터 및 적절한 가스 농도를 공급 및 유지시키기 위한 공급원을 함유한다. 배양온도는 30℃ 내지 45℃ 범위에 있어야 하며, 더 바람직하게는 약 36℃ 내지 약 38℃ 범위이다. 가장 바람직한 온도는 약 37℃이다. 본 발명의 배양 및 약독화 방법을 위한 필요한 구체예는 여기에서 주어진 기술 분야에서 종래의 기술자에게는 용이하게 이용될 수 있다. 본 발명을 수행하기 위한 적절한 구체예 중 하나는 현탁액내에서 세포를 유지시키기 위하여 스핀너(spinner)플라스크와 함께 이중의 가스 배양기, 예를 들면, 연구실-라인(lab-line), 멜로세 파크(Melrose Park), 일리노이스(Illinoise)에서 구입한 모델 480이다. 현재의 바람직한 장비는 적어도 약 2ℓ의 배양액을 함유하며, 적절한 농도의 분리된 가스 또는 기계적 교반를 통하여 현탁액내에서 배양세포를 유지할 수 있으며, 배양액내의 용존 산소 수준을 계속적으로 모니터하는 발효기, 바이오반응기 또는 회전 진탕기를 포함한다.
배양하는 동안 현탁된 상태에서 접종된 세포를 유지시킴으로써, 세포의 성장을 최대로 하며, 그리하여 엘. 인트라셀룰라리스는 성장 배양액 및 산소 및 이산화탄소의 적절한 혼합액에 각각의 세포의 노출을 증가시킴으로써 달성할 수 있었다. 배양세포는 예를 들면, 배양 플라스크, 롤러병, 막 배양 및 스핀너 플라스크를 포함한 본 기술 분야에서 공지된 다양한 방법에 의해 현탁액내에서 교반되고 유지될 수 있다. 세포는 내부에 이중의 가스 배양기 또는 유사한 장치를 가진 스핀너 플라스크내의 세포를 배양함으로써 배양하는 동안 현탁액에서 유지될 수 있다. 여기에서 사용된 바와 같이, 용어 스핀너 플라스크는 패들, 프로펠러 또는 배양액을 교반하는 다른 수단을 사용하며, 그곳에 함유된 세포를 현탁액에서 유지하는 플라스크 또는 다른 용기를 의미한다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 접종된 세포를 융합점(confluency)에 도달할때까지 배양한 다음, 성장 배양액을 함유한 스핀너 플라스크에 넣고, 플라스크를 회전시키는 동안 이중의 가스 배양기내에서 배양하였다. 바람직하게는, 접종된 세포를 스핀너 플라스크에서 긁어내는 것이다. 이는 세포를 스핀너 플라스크에서 긁어내는 것이다. 이는 세포를 떨어뜨리기 위하여 예를 들면, 세포 주걱(scraper)을 사용하여 본 기술 분야에서 공지된 다양한 방법에 의해 할 수 있다. 세포가 일단 스핀너 플라스크에 유입되면, 스핀너 플라스크의 패들은 전형적으로 약 30 내지 약 60rpm의 범위내에서 회전한다.
배양된 엘. 인트라셀룰라리스의 일부는 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아의 생성을 증가시키기 위하여 신선한 배양세포로 이전한다. 용어 이전 또는 여기에서 그 변형어는 신선한 세포를 박테리아로 감염시키기 위하여 배양된 엘. 인트라셀룰라리스의 일부를 신선한 배양세포로 옮기는 과정을 의미한다. 여기에서 사용된 바와 같이, 용어 신선한은 엘. 인트라셀룰라리스에 의해 아직 감염되지 않은 세포를 의미한다. 바람직하게는 그러한 세포는 평균 약 하루를 넘기지 않은 세포이다.
현탁 배양액내에서 엘. 인트라셀룰라리스의 이전은 원배양액의 일부를 제거하고, 신선한 배양세포를 함유한 새 플라스크에 제거된 원배양액을 가함으로써 완성된다. 원배양액은 상당한 양의 박테리아/㎖, 예를 들면 약 104박테리아/㎖ 이상을 가지는 경우, 감염된 플라스크에서 신선한 세포를 함유한 새 플라스크로 약 1 내지 10%(부피:부피)의 배양액을 가하는 것이 바람직하다. 이는 50-100%의 세포가 감염될 때 바람직하다. 50% 미만의 세포가 감염되는 경우, 이전은 바람직하게는 새 플라스크로 배양액을 1:2로 나누며, 신선한 배양액을 가하여 부피를 크게 함으로써 완성된다. 다른 경우, 직접적으로 단층의 배양액의 이전과는 대조적으로 선행기술처럼 세포 용균 및 그외의 단계는 필요하지 않다.
배양세포의 충분한 성장 및 이어서 약 70% 이상의 세포 감염률에서 엘. 인트라셀룰라리스에 의한 감염 후, IFA, TCID50또는 다른 비교가능한 방법에 의해 결정된 것으로서, 적어도 배양된 엘. 셀룰라리스 박테리아의 일부는 회수된다. 회수 단계는 본 발명의 기술 분야에서 종래의 기술자에게 공지된 다양한 기술에 의해 현탁액으로부터 박테리아를 분리함으로써 완성될 수 있다. 바람직하게는, 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아는 전부 또는 일부의 현탁액의 내용물을 원심분리하여 배양세포를 펠릿(pellet)화하며, 생성된 세포 펠릿을 재현탁시킨 다음, 감염된 세포를 용균시킴으로써 회수한다. 전형적으로, 세포 및 박테리아를 펠릿화하기 위하여 적어도 내용물의 일부를 약 3000×g에서 약 20분 동안 원심분리한다. 다음, 펠릿을 예를 들면, 수크로즈-포스페이트-글루타메이트(SPG) 용액에 재현탁시킨 다음, 세포를 용균시키기 위하여 약 4시간 동안 25게이지(gages) 바늘로 통과시킨다. 더 정제하기를 원한다면, 세포핵 및 그 부산물을 제거하기 위하여 표본을 약 145×g에서 약 5분 동안 원심분리할 수 있다. 상등액을 3000×g에서 약 20분 동안 원심분리하여 수득된 펠릿을 소의 태아 혈청 또는 성장 배양액(회수된 박테리아를 신선한 세포로 이전하기에 적합하도록 제조하기 위하여)과 함께 SPG와 같은 적절한 희석제에 현탁시킨다(회수된 박테리아를 냉동 또는 접종물로서의 용도에 적합하도록 제조하기 위하여).
앞에서 언급한 바와 같이, 대규모 생산을 위한 엘. 인트라셀룰라리스의 효과적인 성장은 조직세포의 활성적인 성장을 유지시킴으로써 증진시킬 수 있다. 단층으로, 배양물이 융합할때 세포분열의 비율이 실질적으로 감소한다. 단층의 조직 배양상에서 엘. 인트라셀룰라리스를 성장시키려는 시도는 제한적으로 성공하였으며, 대규모화는 가능하지 않았다. 그러나, 현탁한 배양물을 사용하여 세포의 활성적 성장을 크게 촉진시켜 계대배양 및 대규모 배양을 허용되게 하였다. 상기에 설명한 바처럼 약 0-3% 용존 산소량 사이에서 발효기를 사용하여, 본 발명자들은 여러달 동안 배양된 박테리아를 활성적으로 성장하도록 유지할 수 있었으며, 무한적으로 그렇게 할 수 있다고 기대된다.
본 발명 이전에, 일반적으로 세포는 엘. 인트라셀룰라리스로 감염시키기 위하여 표면에 부착시켜야만 한다. 본 발명의 세포현탁액은 유일하며 이 이론에 모순된다. McCoy 또는 IEC-18 세포를 사용하는 경우, 성장 배양액에 따라서 젤라틴, 아가로즈, 콜라겐, 아크릴아미드 또는 실리카구슬, 즉, 하이클론 연구소(HyClone lab.), 로간(Logan), UT에 의해 제조된 컬리스페레(Cultisphere)-G 포로우스(porous) 미세담체를 가한다. 그러나, HEp-2 세포 및 그외 세포들은 본 발명의 배양 방법에 따라서 미세담체가 필요하지 않다. 이것은 대량 배양을 위한 특별한 장점 및 경제적인 면을 제공한다.
배양 보존 목적을 위하여 주 단위로 HEp-2 배양시, 바람직하게는 배양물의 25-50가 제거되고 신선한 배양액으로 교체한다. 미세담체 또는 구슬과 함께 세포배양을 하기 위하여, 바람직하게는 배양물의 25-50%를 제고하고 신선한 미세담체 또는 구슬 및 신선한 배양액으로 1주일에 1-2회 교체한다.
배양세포가 감염되는 비율에 따라, 일반적으로 2 내지 약 5주 마다 이전한다. 배양세포는 2-3주안에 적어도 70%로 감염되며, 바람직하게는 약 3 내지 4주마다 이전한다.
또한, 본 발명은 엘 인트라셀룰라리스에 대한 백신 및 백신을 생산하는 방법을 제공한다. 특히 바람직한 구체예에 따르면, 연장된 시간(예를 들면, 6-8월)동안 현탁액내에 감염된 세포들을 보존한 후, 적어도 배양된 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아의 일부는 회수되고, 잠재적 약독화가 모니터 되었다. 이러한 모니터링은 약독화된 균주를 선택하기 위하여 숙주 동물 또는 동물 모델 도전자에 의해 이루어졌다. 약독화시킨 균주는 여기에서 제시한 방법에 따라서 백신으로 사용된다. 본 발명에 따른 약독화시킨 엘. 인트라셀룰라리스 백신은 다양한 동물에서 엘. 인트라셀룰라리스 감염에 대한 효능을 나타내며, 마찬가지로 인간에게도 효과적일 것이라고 예상된다.
본 발명은 급속한 배양 확장, 100-1000 배의 수율 증가, 및 비용 감소가 가능하다. 그 결과로서, 본 발명의 배양방법에 따라 생성되는 대량 공급용 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아는 백신 생산 목적을 위하여 쉽게 약독화된다. 약독화는 종래의 단층 성장 기술을 사용하여 생성된 박테리아의 낮은 수율 때문에 단층배양에서는 어렵다. 반대로, 본 발명의 엘. 인트라셀룰라리스의 배양방법은 용이도, 속도, 및 이 목적으로 이용할 박테리아의 수를 크게 증가시킨다. 더 많은 세포 및 세포 분열의 발생, 더 많은 돌연변이 발생빈도는 백신 개발에 유익하다. 본 발명에 따른 현탁액에서 성장은 환경에 의해 조절되는 유전자에 의해 조절되는 중요한 면역원의 발현 및 이들의 발현 산물을 증가 시킨다.
생성된 약독화시킨 균주는 하기 실시예 1에서 기술된 바와 같이 조직 배양 단층에서 배양될 수 있으나, 바람직하게는 본 발명의 방법에 따라 현탁 배양액내에서 배양된다. 약독화를 시키는 다른 방법은 예를 들면, N-에틸 니트로 소구 아나딘 및 본 기술분야의 그의 것들을 사용하여 화학적으로 약독화시키는 것을 포함할 수 있다. 여러번 이전 또는 화학적 방법에 의하든지간에, 약독화시킨 엘. 인트라셀룰라리스는 백신 제조를 위해 생성되고 선택된다.
본 발명의 백신의 구체예에 따르면, 항원은 상기 기술된 바처럼 원심분리 또는 미세여과(microfiltration)에 의해 회수된다. 다음, 항원은 최적의 숙주 동물 면역 반응에 기초하여 정해진 수준에서 역가를 결정하였으며, 숙주 동물중에서 투여 적정량에 의해 결정되었다. 박테리아를 주위 O2수준에, 예를 들어, 1주일 지속적인 노출에 의해 0.3% 포르말린 또는 다른 불활성화제를 사용함으로써 불활성화시켜 죽은 백신을 제조할 수 있다. 면역 반응을 증가시키기 위하여, 항원을 적절한 면역 보강제, 예를 들면 알루미늄 하이드록시드 또는 광유로 혼입시킨다. 항원은 돼지의 경우, 생후 약 3-4주에, 필요에 따라 효능 촉진제와 함께 근육 또는 피하 주사를 통하여 항원을 투여하여 숙주를 백신화시키는데 이용된다.
대안으로, 앞에서 기술된 배양 방법을 사용하여 특히 바람직한 백신의 구체예에 따르면, 박테리아는 약독화시켰으며, 무 발병성의 살아 있는 배양을 유도하고 선별하기 위하여 연속적으로 이전되었다.
배양액은 약독화의 표시를 위해 숙주 동물(현탁 배양액내에서 바람직하게는 적어도 6 내지 8月 또는 그 이상 후)에서 시험되었다. 배양액은 앞에서 기술된 바처럼 회수되었으며, 희석화 되었다. 예를 들면 돼지는 경구로 1×1051×106박테리아로 백신화시켰다. 백신화 후 약 28일 경과시, 돼지는 엘. 인트라셀룰라리스의 보다 적게 이전한 (약 30 내지 45일경과)무발병성 배양으로부터 약 1×107균주를 접종하였다. 감염된 동물은 투여후 21일에 검시되었으며 소장에서 (육안적인)병변 및 현미경적 병변도 관찰하였다. 또한, PcR 및 형광성 항체를 완성하였다. 대조군동물의 약 80%는 PCR 또는 FA 시험방법을 사용하여 장의 점액 세포에서는 육안적 또는 현미경적 엘. 인트라셀룰라리스의 존재에 대해 양성을 나타내었다. 백신화된 동물은 조직학적인 관찰에 의해 결정된 바처럼 정상적 점액 표면을 가질 것이며, PCR 시험에서는 음성으로 나타날 것이다.
일반적으로, 약독화시킨 면역성 엘. 인트라셀룰라리스 균주는 적어도 약 150 내지 250일 사이의 계대배양후 생성되며, 배양하는 동안, 적어도 약 7 내지 약 12번 이전되었다. 다른 약독화시킨 배양을 이 발명에서 제시한 모니터링 및 선별 방법을 사용하는 동안 이러한 특징을 다양화시킴으로써 생성될 수 있다.
다음, 백신은 약제학적으로 허용되는 담체내에서 면역학적으로 효과적인 양의 엘. 인트라셀룰라리스를 포함하여 제조된다. 결합된 면역원 및 담체는 수용액 유화액 또는 현탁액내에 존재할 수도 있다. 면역학적으로 효과적인 양은 여기에서 포함된 기술에서 제시한 지나친 실험없이 본 기술분야에서 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로, 정제된 박테리아를 사용할 때 면역원의 양은 50 및 500㎍ 사이일 것이며, 바람직하게는 107및 109TCID50이다.
본 발명에 따른 백신은 일반적으로 감수성 동물 바람직하게는 돼지에, 1회이상 투여된다. 생 또는 사백신은 2주 간격으로 1 또는 2번 투여될 것이다. 약독화시킨 살아 잇는 백신의 경우, 1회 투여가 바람직하다. 약독화시킨 생균주의 바람직한 투여 경로는 경구 또는 비강내 투여이나, 또한 근육 또는 피하주사도 사용될 수 있다. 근육 및 피하 주사 경로는 사백신의 경우에 가장 바람직하다.
또한, PPE의 효과적인 진단은 원인성 박테리아를 배양하는데 필요한 시간에 의해 방해 받는다. 본 발명의 결과로서, PPE에 감수성인 돼지 및 다른 동물에서 얻은 생물 표본에서 엘. 인트라셀룰라리스 존재에 대한 향상된 빠르며 정확한 분석을 위한 진단 기술의 개발은 지금은 가능하다.
본 발명의 방법에 따라서 성장한 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아 또는 이 박테리아에서 기원한 구성물은 ELISA 또는 다른 면역분석, 예를 들면 형광성 면역항체 시험(immuno-fluorescent antibody test; IFA)에서 박테리아로 감염되었다고 의심되는 동물의 혈청 및 다른 체액에서 엘. 인트라셀룰라리스에 대한 항체를 검출하기 위하여 항원으로서 사용될 수 있다. 지금의 바람직한 면역분석은 하기 실시예에 기술된 바처럼 IFA이다. 대안으로, 본 발명에 따라 성장시킨 박테리아를 웨스턴 블럿(Western Blot)분석에서 사용될 수 있다.
본 발명의 이 구체예에 따른 바람직한 ELISA 방법은 하기와 같다:
1. 코팅(coating)완충액에서 희석된 항원 0.1m/well을 가한다. 4℃에서 18시간 동안 인큐베이션한다.
2. PBS로 3번 세척한다.
3. 플레이트 각 웰(well)에 정지(blocking)완충액 25㎖을 가한다. 37℃에서 1 내지 2시간 인큐베이션한다.
4. 세척 완충액으로 3번 세척한다.
5. 정지 완충액으로 혈청을 희석하고, 이를 플레이트의 제1번 웰에 0.1㎖ 가한다. 연속적인 1:2희석액을 플레이트의 웰에 가한다. 37℃에서 1시간동안 인큐베이션한다.
6. 세척 완충액으로 3-5번 세척한다.
7. 정지완충액으로 결합물(conjugate)을 희석하여 플레이트의 웰에 0.1㎖ 가한후 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
8. 세척완충액으로 3-5번 세척한다.
9. 기질을 가한다.
12. 스펙트로 포토메터(spectrophotometer)로 흡광도를 속정한다.
13. 항원을 가하지 않은 웰을 블랭크(blank)로 사용한다.
14. 또한, 양성 및 음성의 재도군 혈청은 각 시험에서 사용한다.
바람직한 웨스턴 블럿 방법은 하기와 같다 :
1. 12% SPS-PAGE상에 항원을 달린 후 니트로셀루로즈 막에 옮긴다.
2. 막을 정지 완충액에 2시간동안 넣어둔다.
3. 정지 완충액을 제거하고 1분동안 PBS로 린스(rinse)한다.
4. 정지 완충액으로 혈청을 희석하여 막에 가한다. 실온에서 2시간동안, 인큐베이션한다.
5. 세척완충액으로 3번 세척한다(각 세척시 5분동안).
6. 정지완충액으로 결합물을 희석하여 막에 가한다. 실온에서 1시간동안 인큐베이션하였다.
7. 세척완충액으로 3번 세척한다.
8. 10분 또는 강한 밴드가 생길때까지 기질을 가한다.
9. PBS로 린스한다.
10. 공기중에서 건조시켜 암실에 보관한다.
또한 본 발명을 하기 실시예에 기술하였으며, 이는 설명적인 목적만을 제공하여 제한적으로 해석하려는 것은 아니다.
[실시예 1]
증식적인 장질환을 앓고 있는 미연방공화국 돼지의 장에서 엘. 인트라셀룰라리스의 분리
물질 및 방법:
접종표본의 선별:
표본 N24912은 마이오와의 농장의 한 가축무리에서 페니실린 치료에도 불구하고 끊임없는 혈변이 관찰되는 5개월된 돼지 300마리 중에서 15마리에서 얻었다. 돼지의 검시에서 장(회장)은 비후화된 점막으로 되어 있었다. 은 염색(silver stains)을 한 조직병리학적 조사에서는 굽은 형의 세포내 박테리아의 존재 및 PPE의 진단을 확인하는 소낭선 장세포 과형성을 나타내었다. 표본 N72994는 미네소타의 한 농장 1.5년생의 암퇘지 2배 새끼로부터 얻었다. 그 무리의 크기는 70-80 암퇘지였으며 항생제 치료여부는 몰랐다. 검시에서, 회장은 점액질은 두꺼워져 있었으며 약간의 출현상태에 있었다. 점액질의 지미네즈(Giminez) 염색에서는 많은 굽은형의 박테리아를 볼 수 있었다. 표본 N101494를 고랑이 6000개인 인디아나 농장산 12주된 돼지로부터 얻고 암퇘지를 죽였다. 돼지는 출혈성 설사하에 틸란(Tylan)을 주입하여 치료하였으나, 치료후 곧 죽었다.
돼지에서 기원한 박테리아 접종물의 제조:
장 표본은 -70℃에서 보관하였다. 장을 열고 포스페이트 완충된 살린(PBS)로 세척하였다. 점액질의 1g 표본을 소디움 포타슘글루타메이트(SPG)로 긁어내고 SPG 내에서 1% 트립신(JRH Biosciences, Lenexa, KS)4.0㎖로 30초동안 균질화하였다. 10㎖ SPG/10%소태아 혈청(FCS) (JRH Biosciences, Lenexa, KS)을 가한 다음, 표본을 조직 분쇄기로 1분동안 분쇄하였다. 10㎖ SPG/10% (FCS)를 가한후, 여과지(Whatman 113V;Whatman Labsales, Hillsboro, OR)를 통과시켜 일단 여과시켰으며, 이어서 5.0, 1.0 및 0.65 미크론(micron) 막 여과지를 통과시켰다. 여과물은 점액질은㎖로 부분표본화하여 나누었으며 -70℃에서 급냉동시켰다. 점액질은 지미네즈 염색을 하기 위하여 슬라이드 위에 발랐다. 여과물의 분리된 도포표본을 엘. 인트라셀룰라리스에 대한 특정 단일클론성 항체를 사용하여 IFA에 의해 염색하였다(S. McOrist et al., Vet. Rec. 121 : 421-422(1987); 여기 문헌에 의해 완전히 제시되었다.
세포배양:
IFC-18 세포(쥐의 장표피세포, ATCC CRL 1589)를 L-글루타민 및 10% FCS를 첨가한 DMEM (JRH Biosciences, Lenexa, KS)에서 성장시켰으며, 내주마다 트립신을 처리함으로써 일상적으로 이전하였다. 세포 단층을 37℃에서 5% CO2를 포함한 공기중에서 성장시켰다.
세포배양액의 감염:
IEC-18 세포를 25㎠ 플라스크내의 1.25×105세포에 접종하였으며 챔버슬라이드(Numc, Inc., Naperville, IL)에서 비교할 수 있는 비율에서 24시간동안 인큐베이션한 다음 배양액을 제거하였다. 급냉동된 돼지-기원성 박테리아 분리체는 급히 해동시킨 다음, 15㎖ 배양액당 1.0㎖ 균등물의 비율에서 반근마이신(100㎍/㎖) 및 암포테리신 B(amphotericin B)(2.0㎍/㎖)를 첨가한 DMEM/7% FCS로 희석시켜 단층에 가하였다. 단층 및 박테리아의 현탁액을 2000g에서 30분동안 원심분리 하였으며 혐기적용기로 옮겼다. 용기를 비우고 8.0% O2, 10% CO2, 및 82% H2의 혼합가스를 만들기 위해 가스를 수소 및 이산화탄소로 교체하였다. 배양액을 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션한 다음, L-글루타민, 반코마이신 (100㎍/㎖), 네오마이신 (50㎍/㎖) 및 암포테리신 B(2.0㎍/㎖)을 가한 DMEM/7% FCS를 가하였다. 배양물을 혐기적 용기로 교체한 후 6일 동안 인큐베이션시키고 배양맥을 2일마다 교체한다.
엘. 인트라셀룰라리스의 이전:
엘. 인트라셀룰라리스 박테리아를 G. Lawson et al., J. clin. Microbiol., 31:1136-1142(1993)(이 문헌에서 완전히 제시됨)에 먼저 기술된 바처럼 염화 칼륨을 사용하여 세포를 용균시킴으로써 이전한 다음, 신선한 단층의 IEC-18을 가하였다. 배양액을 단층에 붓고, 0.1% KCl을 가한 다음, 세포를 37℃에서 10분동안 인큐베이션하였다. KCl을 제거한 다음, SPG/10%를 가하고 단층을 세포주걱으로 기계적으로 떼어 내었다. 세포를 21게이지 바늘을 가진 주사기로 3번 통과시켜 용균시켰다. 세포핵은 100×g에서 5분동안 원심분리하여 제거시켰으며 상등액내의 박테리아 현탁액을 신선한 1d 단층의 IEC-18 세포에 가하였다.
세포 배양물의 감염에 대한 모니터링:
챔버슬라이드 상에서 냉각의 아세톤/메탄올을 5분간 처리하여 세포를 고정시킴으로써 감염을 모니터링 하였다. 이뮤노플루오레스센스(immunofluorescence) 및 이미노페록시다제(immunoperoxidase) 방법으로 염색하였다. 두 방법 모두는 생쥐의 단일콜론 항체(S. McOrist et al., Ver. Rec. 121:421-422(1987)에 기술)을 1차 항체로서 항-생쥐 이뮤노글로불린 G-플루오로크롬 결합물(anti-mouse immunoglobulin G-fluorochrome conjugate ; 플루오레스세인 이소티오시아네이트; Organon Teknika Corporation, Durham, NC) 또는 페록시다제 결합물(염소의 항-생쥐 이뉴노글로불린 G; Kirkegaard and perry Laboratones, Inc., Gaithersburg, MD)를 사용하였다. 각 슬라이드상에서 세포내에 있는 특정 염색된 박테리아의 수를 세어서 박테리아 정량화 하였다.
중합효소반응 :
표본 접종물 및 이전된 박테리아를 주형 DNA로서 Jones et al., J. Clin. Miorobiol., 31:2611-2615 (1993) 및 McOrist et al., Vet. Microbiol 1-8 (1994)(각각은 문헌에 완전히 제시되어 있다.)에 의해 기술된 바처럼 표본 제조방법, 프라이며, 및 사이클 변수를 허용하여 PCR로 혼입하였다.
제1사이클에 대한 사이클 변수는 93℃에서 5분, 55℃에서 45초, 및 72℃에서 45초이다. 33사이클을 상기 언급한 온도에서 온도당 45초 동안 수행하며, 한 사이클은 93℃-45초, 55℃ 45초, 및 72℃-2분동안 수행한다. 양성의 접종물만을 IEC-18 세포에 접종하는데 사용하였다. 또한, PCR은 감염을 확인하기 위하여 전달 물질을 모니터링하기 위해서도 수행되었다. 염기서열 분석을 위해 아이오와 주립대학의 Nucleic Acid Facility에 PCR에 의해 생성된 DNA를 보냈다. 염기서열 분석 결과는 Gary F. Jones이 그의 박사학위논문, 미네소타 대학, 미네아폴리스, MN(1993년 6월)에서 발표한 염기서열과 비교되었다.
결과:
접종표본의 선별:
돼지 번호 N24912 및 N72994는 출혈성 장 내용물 및 두꺼워진 검액질을 가지는 심한 PPE를 앓고 있었다. N 101494는 심한 PPE 장 내강(lumnem)에 큰 응고된 혈덩어리가 생기는 심한 출혈을 가지고 있었다. 점액질 도포표본의 지미네즈 염색은 많은 굽은형 또는 S-형 박테리아를 나타내었다. IFA염색은 돼지-기원성 박테리아 접종물에서 많은 밝은 형광성 박테리아를 밝혀 내었다.
세포배양물의 감염에 대한 모니터링:
접종된 단층을 광학현미경으로 세포의 성장 사이클 및 작은 형태적 변화의 관찰을 통하여 모니터링하였다. 감소된 산소 강도 (8% O2)에서 성장된 감염되지 않은 단층은 유사한 형태를 가지고 있었다.
이뮤노플루오레스센스 및 이뮤노페록시다제로 염색된 감염된 배양물은 세포내에 외관상 굽은형 또는 S-형의 특이적으로 염색된 많은 박테리아를 나타내었다. 단층은 융합하는 감염을 가지지 않앗다. 감염된 세포는 종종 1-10 세포의 감염된 병소와 밀접하게 결합되어 있었다. 또한, 심하게 감염된 세포(즉, 30이상의 박테리아로 감염)는 30이하의 박테리아로 감염된 세포와 결합되어 있음을 알 수 있었다. 박테리아 수는 약 6일에 절정이었다. 감염은 특정한 성장 조건에 따라 달라졌다. 박테리아는 여기에서 설명된 세포의 용균과정에 의해 성공적으로 계대시켰다. 새로이 접종된 세포의 원심분리는 필요하지 않으나 감염된 세포의 수는 증가되었다. 또한, 항생제가 포함되지 않은 배지에 노출시켜 감염시키고, 3시간째에 항생제를 함유한 배지를 재공급함으로써 원심분리는 오염을 감소시켰다. 배지에서 10% 내지 7%로 FCS의 감소는 단층이 융합되기 전에 박테리아가 더 많이 증식되도록 허용하는 IEC-18 세포의 성장을 느리게 하는 것이 필요하다.
중합효소반응:
염색체 DNA의 PCR은 모든 분리체에서 319bp 단편(프라이머 함유)을 생성하였다. 적당한 크기의 단편은 PCR을 사용한 McOrist et al. (1994)에 의해 생성된 공지된 양성 표본과 육안으로 비교되었다. N24912, N72994 및 N101494의 PCR 생성물의 서열 분석은 Jones(1993)에 의해 결정된 p78 서열과 상당한 상동성 (97-99%)을 가짐을 확인하였다.
[실시예 2]
HEp-2 세포의 현탁 배양물에서 엘. 인트라셀룰라리스의 성장
접종을 위한 장 균질물의 제조:
실시예 1의 검체로부터 회장의 점막 6.0 내지 8.0cm을 긁어서 장 균질물을 제조하였다. 트립신(1%)를 긁어낸 점액에 가한 다음, 검체를 짧게 균질화한 후, 37℃에서 35분동안 인큐베이션하였다. 100㎖ SPG/10% FBS를 가하고 검체를 조직 분쇄기에서 분쇄하였다. 10㎖ SPG/10% FBS를 가하였다. 균질물을 와트만 V113 여과지를 통과시키고, 이어서 5.0, 1.0 및 0.65nm 여과지를 차례로 통과시켰다. 검체를 1㎖로 나누어 -70℃에서 급냉동시켰다.
세포배양물의 감염:
방법A :
조직세포를 100㎖ 스핀너 플라스크 내에서 50㎖ DMEM/10% FBS 중의 1×107세포에 접종하였다. 배양액을 24시간동안 인큐베이션한 다음, 반코마이신 및 펀지존(fungizone)을 가하였다. 냉동된 장 균질물 1병을 빨리 해동한 후, 반코마이신(100㎍/㎖) 및 암포테리신 B(2.0㎍/㎖)을 가한 3.0㎖ DMEM/5% FBS로 희석하였다. 검체를 0.65㎛과지로 통과시킨 다음, 플라스크에 가하였다. 배양액을 가스챔버에 넣고, 기체를 배출시킨 다음, 8.0% O2, 8.8% CO2, 및 83.2% H2혼합가스를 형성하기 위해 수소 및 이산화탄소 가스를 재주입하였다. 배양액을 37℃에서 3시간동안 인큐베이션한 다음, 네오마이신 및 겐타마이신을 가하였다. 24시간째에 배양액에 L-글루타민, 반코마이신(100㎍/㎖) 네오마이신(50㎍/ℓ), 젠타마이신(50㎍/ℓ) 및 암포테리신 B(2.0㎍/㎖) 를 가한 DMEM/5% FBS를 재공급하였다.
방법 B :
20㎠의 종래의 플라스크 2개에 DMEM10%/ FBS 중의 1.25×105HEp-2 세포를 접종하였으며, 18-24시간 동안 성장시켰다. 세포는 접종시 30% 융합상태에 있었다. 접종물을 DMEM/5%FBS로 희석하였다. 또한, 접종물이 장 균질물에서 기원한 경우, 배지는 반코마이신(100㎍/㎖) 및 암포테리신 B(2.0㎍/㎖)를 함유하였다. 배양액을 가스챔버에 넣고, 기체를 배출한 다음, 8.0%, O2, 8.8% CO2, 및 83.2% H2의 혼합가스를 만들기 위해 수소 및 이산화탄소를 재주입하였다. 배양액을 37℃에서 3시간동안 인큐베이션한 다음, 네오마이신 및 겐타마이신을 가하였다. 24시간째에 배양액에 L-글루타민, 반코마이신(100㎍/㎖), 네오마이신(50㎍/ℓ), 겐타마이신(50㎍/ℓ), 및 암포테리신 B(2.0㎍/㎖)을 가한 DMEM/5% FBS를 재공급하였다. 접종물이 순수한 배양액일 경우, 항생제는 필요하지 않다. 배양액을 6일 또는 융합시까지 인큐베이션하였다. 플라스크에서 세포를 긁어낸 후, 50㎖ DMEM/5% FBS를 함유한 100㎖ 스핀너 플라스크에 가하였다. 1주 간격으로, 배양액의 절반을 회수하고 신선한 배지를 가하거나 더 큰 스핀너 플라스크에 옮기고 배지를 추가함으로써 배양액을 1:2로 희석하였다.
배양액의 계대:
DMEM/5% FBS 중의 새로운 HEp-2 세포를 1×107로 접종함으로써 배양액을 신선한 HEp-2 세포로 계대시켰다. 새 배양액을 8.0% O2, 8.8% CO2, 및 83.2% H2에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 새 배양액을 감염된 배양액으로 접종한 다음, 앞에서 기술된 바와 같이 감소된 O2농도에서 인큐베이션하였다. 접종물의 양은 원 배양액의 감염 정도에 따라 달라졌다.
배양액의 회수 및 보관:
배양액을 3000×g에서 20분동안 원심분리하는 동안 원하는 양의 배양액을 수집함으로써 회수하였다. 펠릿을 수크로즈-포스페이트-글루타메이트 (SPG)용액에서 재현탁시켰으며, 25게이지 바늘을 4회 통과시켰다. 배양액을 나누어 -70℃에서 급냉동시켰다. 정제하기 위하여, 검체를 145×g에서 5분간 원심분리하여 세포핵 및 그 부산물을 제거하였다. 다음, 상등액을 3000×g에서 20분 동안 원심분리하였다. 이어서, 펠릿을 희석액내에서 재현탁시켰다.
조직 배양에서 생존 가능한 엘. 인트라셀룰라리스의 측정:
생종가능한 엘. 인트라셀룰라리스의 정량화는 조직 배양 감염 투여량 50% (TCID50)을 결정함으로써 이루어졌다. 이는 실험하기 위하여 배양액 2.0㎖를 제거하여 세포를 25게이지 바늘로 4회 통과시켜 용균시킴으로써 수행된다. 검체를 반코마이신(100㎕/㎖) 및 암포테리신 B(2.0㎕/㎖)을 함유한 DMEM/5% FBS를 사용하여 1:10으로 연속하여 희석시켰다. 96웰 마이크로타이터(microtiter) 플레이트에 희석액을 0.1㎖/웰으로 가하였다. 마이크로타이터 플레이트의 HEp-2 세포를 1250세포/웰으로 접종하였으며, 감염시키기 전 18-24시간 동안 성장시켰다. 3웰/희석액 및 6웰/희석액 사이에서 사용되었다. 플레이트를 8.0% O2, 8.8% CO2및 83.2 H2의 가스농도에서 6일동안 인큐베이션하였다. 세포를 냉각된 50% 아세톤 및 50% 메탄올로 2분동안 고정시켰다. 항-IS 인트라셀룰라리스 단일클론항체(McOrist, 1994)를 PBS로 1:2000으로 희석시켜 웰에 0.03㎖/웰으로 가하였다. 플레이트를 37℃에서 30분동안 인큐베이션한 다음, PBS로 3회 세척하였다. 1:30으로 희석된 항-생쥐 FITC를 0.03㎖/웰으로 가한 후, 37℃에서 30분동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 ddH2O로 3회 세척한 다음, 건조시켰다. 검체를 형광 현미경상에서 관찰하여 TCID50/㎖을 결정하였다.
결과:
TCID50결과는 배양액이 1×106박테리아/㎖까지 함유하였음을 나타내었다. 이는 45일내에 이루어졌다. 배양액 부피를 동일한 시간내에 3.0ℓ까지 대량화시켰다.
[실시예 3]
맥코이(McCoys) 세포의 현탁배양액 내에서 엘. 인트라셀룰라리스의 성장
접종을 위한 장 균질물의 제조:
장 균질물을 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조하였다. 하기 실시예의 방법에 따라 배양된 엘. 인트라셀룰라리스의 검체를 부다페스트 조약하에 American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland U.S.A. 20852에 5월 19일자로 기탁하여 기탁번호 55672를 부여받았다.
세포배양액의 감염:
25㎠의 종래의 플라스크 2개에 DMEM/10% FBS중의 1.25×105맥코이 세포를 접종하여 18-24 시간동안 성장시켰다. 접종시에 세포는 30% 융합된 상태였다. 접종물을 DMEM/5% FBS로 희석하였다. 접종물이 장 균질물에서 기원한 것일 경우, 또한 배지는 반코마이신 (100㎍/㎖) 및 암포테리신 B(2.0㎍/㎖)을 함유하였다. 배양액을 가스챔버에 넣고, 기체를 배출시킨 다음, 8.0% O2, 10% CO2및 82% H2의 혼합가스를 만들기 위하여 수소 및 이산화탄소를 재주입하였다. 배양액을 37℃에서 3시간동안 인큐베이션한 다음, 네오마이신 및 겐타마이신을 가하였다. 24시간째에 배양액에 L-글루타민, 반코마이신(100㎍/㎖), 네오마이산 (50㎍/ℓ), 겐타마이신(50㎍/ℓ), 및 암포테이신 B(2.0㎍/㎖)를 가한 DMEM/5% FBS를 재공급하였다. 접종물이 순수 배양액일 경우에는 항생제는 필요하지 않다. 배양액을 융합할 때까지 6일동안 인큐베이션하였다. 세포를 플라스크에서 긁어내에 50㎖ DMEM/5% FBS 및 0.05g 컬티스피어(Cultisphere)-G 미세담체를 함유한 100㎖ 스핀너 플라스크에 가하였다. 플라스크를 40-50rpm에서 교반하였다.
2-3일마다 배양액의 절반을 회수하고 신선한 배지 및 컬티스피어-G 비드(beads)를 가하거나 더 큰 스핀너 플라스크로 배양액을 옮기고 배지 및 컬티스페어-G 비드를 추가함으로써 배양액을 1:2로 희석하였다. 배양액에서 비드의 최종 농도는 약 0.001g 비드/㎖이다.
배양액의 계대:
1×107의 새로운 맥코이 세포를 DMEM/2% FBS 및 0.05g 컬티스피어-G 비드에 접종함으로써 배양액을 신선한 맥코이 세포로 계대시켰다. 새로운 배양액을 8.0% O2, 8.8% CO2, 및 83.2% H2에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 새로운 배양액에 25㎖의 감염된 배양액으로 접종한 다음, 앞에서 기술된 바와 같이 감소된 O2농도에서 인큐베이션하였다.
배양액의 회수 및 보관:
원하는 양의 배양액을 수집하고 3000×g에서 20분 동안 원심분리함으로써 배양액을 회수하였다. 펠릿을 SPG에서 재현탁시킨 후, 22게이지 바늘을 4회 통과시켰다. 배양물을 나누어 -70℃에서 급냉동시켰다. 정제하기 위해서는, 검체를 145×g에서 5분동안 원심분리하여 비드, 세포핵 및 그 부산물을 제거하였다. 다음 상등액을 3000×g에서 20분동안 원심분리시켰다. 다음, 펠릿을 희석액에 재현탁시켰다.
조직 배양에서 생존가능한 엘. 인트라셀룰라리스의 측정:
생존가능한 엘. 인트라셀룰라리스의 정량화는 22게이지 바늘을 사용하여 세포를 용균시키고, 맥코이 세포를 1250 세포/웰으로 마이크로타이터 플레이터에 접종한 실시예 2에 기술된 바와 같이 결정되었다.
결과:
TCID50결과는 배양액에 1×106박테리아/㎖까지 박테리아를 함유함을 나타내었다. 이는 1달 이하에 이루어졌다. 배양부피는 동일한 시간에 3.0ℓ까지 대량화하였다.
[실시예 4]
숙주 동물에서 엘. 인트라셀룰라리스 순수 배양액의 감염 분량의 결정:
요약:
31마리의 돼지 연구는 검체 N72994로부터 엘. 인트라셀룰라리스의 순수한 배양액으로 6주된 종래의 돼지를 감염시킴으로써 완성되었다. 돼지를 무작위로 4개의 그룹으로 나누고, 축사를 분리하였다. 그룹 1은 7마리의 돼지를 포함하였으며, 감염되지 않은 조직 배양액으로 투여되었거나 아무것도 투여하지 않은 음성대조군으로 생각되었다. 그룹 2는 107박테리아/돼지를 투여한 8마리의 돼지를 포함하였다. 그룹 3은 8마리의 돼지를 포함하였으며, 106박테리아/돼지를 투여하였다. 그리고, 그룹 4는 105박테리아/돼지를 투여한 8마리의 돼지를 포함하였다. PCR 시험을 위하여 배설물의 면봉이 0,7,14,21 및 24일째에 수집되었다. 24일째에, 돼지를 검시하여 회장, 공장, 및 결장을 상기 언급된 바와 같이 모두 PCR 시험, 조직 병리학, 및 FA 염색을 위하여 수집하였다.
회장 점막의 PVR 시험에서 고 투여군의 100%, 중 투여군의 75%, 및 저 투여군의 50%에서 엘. 인트라셀룰라리스가 존재함이 밝혀졌다. 조직 병리학적 결과는 고 투여군의 88%, 중 투여군의 75%, 및 저 투여군의 88%에서, 고유판에서 단핵 세포 및 점막 하조직에서 단핵세포가 증가하였음을 나타내었다. 소낭선 과증식은 고 투여군의 50%, 중 투여군의 63%, 및 저 투여군의 50%에서 관찰되었다. FA 염색으로 회장, 공장, 및 결장의 조직 박편에서 고 투여군의 88%, 중 투여군의 63%, 및 저 투여군의 63%에서 엘. 인트라셀룰라리스가 존재함이 밝혀졌다. 대조군 동물에서 PCR, FA 및 은 염색에 의해 엘. 인트라셀룰라리스의 존재는 음성으로 나타났다. 결론으로, 감염시키기 위하여 순수배양액은 성공적으로 사용되었으며 PPE의 병변의 원인이었다. 코크(Koch)의 가정은 감염된 동물에서 엘. 인트라셀룰라리스의 확인 및 분리에 의해 완성되었다.
도전받는 동물에서, 고 투여군 동물의 100%는 은 염색, FA 및 PCR에 의해 회복 및 동정을 확인하였다.
물질 및 방법 :
접종물의 성장 :
75㎠의 종래의 플라스크에 DMEM/10% FBS중의 3.75×105HEp-2세포를 접종하였으며, 5% CO2, 37℃에서 18-24시간 동안 성장시켰다(세포는 접종시에 30% 융합상태에 있었다). N72994 한병을 15㎖ DMEM/5% FBS로 희석하였다. 배양액을 가스챔버에 넣고, 기체를 배출시킨 다음, 8.0% O2, 8.8% CO2, 83.2% H2의 혼합기체로 만들기 위해 수소 및 이산화탄소를 재주입하였다. 24시간째에 배양액에 DMEM/5% FBS를 재공급하였다.
배양액을 6일동안 인큐베이션한 다음, 플라스크에서 세포를 긁어내고 50㎖ DMEM/5% FBS를 함유한 100㎖ 스핀너 플라스크에 가하였다. 1주 간격으로 배지의 부피를 2배로 함으로써 플라스크의 부피를 대량화하였다. 배양액을 스핀너 플라스크에서 3주동안 성장시켰다.
배양액의 회수 :
3000×g에서 20분동안 원심분리함으로써 배양액을 회수하였다. 펠릿을 10% FBS를 가한 수크로즈-포스페이트-글루타메이트 용액(SPG)으로 재현탁시킨 후, 25 게이지 바늘로 4회 통과시켰다. 접종물을 SPG/10% FBS로 최종 부피로 될때까지 희석시켜 1:10의 희석액을 만들었다.
감염된 배양액과 마찬가지로 비 감염된 HEp-2 세포로 구성된 대조군을 위한 접종물을 동일한 농도의 살아 있는 세포로 희석시켰다. 세포를 감염시킨 배양액과 동일하게 회수하였다. 대조군 돼지는 고투여 그룹처럼 세포에 유사한 투여를 받았다.
엘. 인트라셀룰라리스의 정량화 :
생존 가능한 엘. 인트라셀룰라리스의 정량화는 조직 배양 감염 투여량 50% (TCID50)를 결정함으로써 이루어졌다. 이는 시험하기 위하여 2㎖의 배양액을 제거하고 22게이지 바늘에 4회 통과시켜 세포를 용균시킴으로써 수행되었다. 검체를 반코마이신(100㎍/㎖) 및 암포테리신 B(2.0㎍/㎖)를 함유한 DMEM/5% FBS로 1:10으로 연속하여 희석시켰다. 희석액을 96웰 마이크로타이터 플레이트에 0.1㎖/웰으로 가하였다. 마이크로타이터 플레이트에 2500세포/웰로 HEp-2세포를 접종시켰으며 감염 전 18-24시간 동안 성장시켰다. 12웰/희석액이 사용되었다. 플레이트를 8.0% O2, 8.8% CO2및 83.2% N2의 가스농도에서 6일동안 인큐베이션하였다. 냉각된 50% 아세톤 및 50% 메탄올로 2분동안 세포를 고졍시켰다. PBS로 1:2000으로 희석한 항-엘. 인트라셀룰라리스 단일클론 항체(McOrist, 1987) 0.03㎖/웰으로 웰에 가하였다. 플레이트를 37℃에서 30분동안 인큐베이션한 다음, PBS로 3회 세척하였다. 1 : 30으로 희석된 항-생쥐 FITC를 0.03㎖/웰으로 가하였으며, 37℃에서 30분동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 ddH20로 3회 세척한 후 건조시켰다. 표본을 형광 현미경상에서 관찰하여 TCID50/㎖를 결정하였다.
PICx Lieske 암컷 및 커다란 흰 수퇘지에서 암수가 혼합된 생후 6주의 31마리의 돼지를 Kent Schwartz 박사에 의해 제공받았다. 돼지는 무작위로 0일째 중량에 의해 4개의 축사로 나뉘어졌다.
시설:
각각 적어도 3피트에 의해 분리된 작은 동물사육실내의 4개의 축사는 돼지를 사육하는데 사용되었다. 축사는 철사마루 및 견고한 축사 격리기를 가지고 있었다. 열은 적외선 등에 의해 띠모양의 공급용 열로 아궁이에 의해 제공되었다. 연구하는 동안 온도를 78 내지 85℃ F 사이에서 유지하였다.
먹이 및 물 :
항생제 첨가 없이 19% 단백질, 분쇄한 옥수수-콩 식품을 스테인레스 스틸 급수관을 통해 ad libitum에게 공급하였다. 물을 고무꼭지 관수로를 통해 ad libitum에게 공급하였다.
돼지의 감염 :
0일째, 돼지의 중량을 달고 혈액 검체를 retroorbital sinus에 놓인 모세 튜브에 의해 수집하였다. 혈청을 회수하여 -20℃에서 냉동보관하였다. 또한, 배설물의 면봉을 PCR을 위해 수집하였다. 돼지에게 위장 튜브를 통하여 위내부에 10㎖의 접종물을 투여하였다.
처리돼지의 일련번호
대조군-감염되지 않은 세포5
대조군-처리안함2
고 투여군8
중 투여군8
저 투여군8
0, 10, 17 및 24일째에 돼지의 중량을 재었으며, 출혈하였다.
중합효소반응 :
돼지의 감염을 존(1993)에 의해 기술된 바와 같이 프라이머 및 사이클 변수를 사용한 PCR에 의해 모니터링되었다. 장의 점막과 마찬가지로 배설물 검체를 0, 7, 14, 21 및 24일째에 수집하였으며, PCR에 의해 확인하였다.
조직 병리학 :
회장, 공장, 및 결장의 박편을 포르말린으로 고정시켰으며, 일상적인 경로로 가공하여 일레마톡실린(Ilematixylin) 및 에오신(Eosin) 및 은(silver)주입으로 염색하고 관찰하였다. 또한, 박편을 엘. 인트라셀룰라리스에 특이한 단일클론 항체를 사용하여 염색하였다.
결과 :
임상적 표시 :
자유로운 배설로 구성된 임상적 표시는 먼저 3일째에 고투여 그룹에서 관찰되었다. 이 표시는 14일째에 절정이었으며 그후 회복되기 시작했다.
중량 증가 :
매일 평균 중량의 증가는 대조군그룹과 비교하여 고 및 중 투여 그룹은 중량 증가가 감소하였음을 나타낸다고 계산되었다. 대조군 그룹과 비교시 중량증가에서 투여 적정 효과가 있었다.
PCR :
배설물의 축사는 14일째까지 관찰되지 않았다. 21일째에 고 투여군 돼지의 37.5%는 배설물에서 PCR 양성을 나타내었다. 검시 후, PCR에 의해 회장의 점막은 고 투여에서 100%, 중 투여군에서 75%, 저 투여군에서 50% 및 대조군에서 0%로 관찰되었다.
육안적 병변 :
육안적인 병변은 고 투여 그룹의 2마리의 돼지 (#50 및 #202)에서 발견되었다. #202의 검시 결과, 돼지는 회장에서 약 3ft 두께를 가지고 있었다.
조직 병리학 :
FA :
회장, 공장 및 결장 박편의 FA염색은 고 투여군의 87.5%, 중 및 저 투여군의 62.5% 및 대조군의 0%에 엘. 인트라셀룰라리스가 존재함을 밝혀내었다.
현미경적 병변 :
병변은 고 투여군의 100%, 중 투여군의 75%, 저 투여군의 87.5% 및 대조군의 14%에서 관찰되었다. 이것은 파이어판의 과증식과 종종 연결된 고유판 및 점막하조직에서 증가된 단핵 세포의 관찰에 의해 결정되었다. 또한, 소낭선 과증식이 관찰되었다.
은 염색(silver stain) :
또한 세포내의 굽은형 박테리아의 존재를 확인하기 위하여 박편을 은 염색하였다. 이 결과에서, 박테리아는 고 투여군의 87.5%, 중 투여군의 62.5%, 저 투여군의 87.5% 및 대조군의 0%에 존재하였다.
논의 :
돼지는 엘. 인트라셀룰라리스의 순수배양액으로 성공적으로 감염되었다. 107박테리아의 투여에서, 돼지의 100%는 PCR 및 현미경적 병변에 의해 감염되었음을 확인하였다. 조직 박편에서의 병변의 정도 및 박테리아의 양은 비교적 낮았다. 이 연구는 돼지에서 엘. 인트라셀룰라리스의 존재 및 현미경적 병변때문에 엘. 인트라셀룰라리스에 대한 만족스러운 도전 모델이다. 병변은 최초의 투여 후 7일째에 두번째 투여로 개선될 수 있었다.
[실시예 5]
헵스터 백신 효능 실험
목적 :
햄스터에서 엘. 인트라셀룰라리스의 무발병성의 살아 있는 백신의 안정성 및 효율을 결정하기 위하여 실험 동물 모델을 관찰하였다.
요약 :
40마리의 햄스터 연구는 엘. 인트라셀룰라리스의 높은 전염 균주의 순수배양액으로 3주된 햄스터를 백신화하며 낮은 전염성 병독성 물질의 순수배양액으로 백신 후 22일째에 도전함으로써 완성되었다. 햄스터는 32개의 그룹으로 나누어졌다. 그룹 A는 0일째에 엘. 인트라셀룰라리스 균주 N72994의 1 투여량에 의해 백신화되었다. 그룹 B는 대조군으로 나타내었으며 백신 배양액으로 투여하지 않았다. 두 그룹은 22일 및 25일 후-백신일에 일. 인트라셀룰라리스 균주 N343의 순수 배양액의 2 투여량으로 도잔받았다. 그룹 C는 균주 N343와 비교하여 비교적 독성을 갖는 도전 균주 N101494를 투여되었다. 그룹 A 및 B는 각각 15마리의 햄스터를 포함하였으며 그룹 C는 10마리의 햄스터를 포함하였다. 조직 배양 감염 투여량 50%(TCID50)는 햄스터가 105TCID50/투여량으로 백신화되었음을 시사하는 결과를 나타내었다. N343 도전자는 1055TCID50/ 투여량을 함유하였다. 그룹 C에 대한 도전 투여량은 102.75TCID50/투여량이다. 배설물의 면봉은 중합효소반응 시험을 위하여 0, 7, 14, 21, 29, 36 및 43일째에 수집되었다. 21일째에 백신화시킨 햄스터에서 박테리아의 전이 증식의 항구성을 결정하기 위하여 점막의 PCR 시험 및 FA, 헤마톡살린(hematoxalin) 및 에오신 염색, 및 회장 박편의 은 염색을 위하여 각각 그룹 A 및 그룹 B로부터 5마리의 동물을 검시하였다. 남아 있는 동물은 유사한 시험으로 21일째에 후-도전을 위해 검시되었다.
PCR결과는 21일 후-백신화된 그룹 A 햄스터 100%의 장 점막에서 엘. 인트라셀룰라리스가 존재함을 나타내었다. 그룹 B 햄스터는 21일 후 백신에서 모두 음성이었다. 햄스터의 21일 후-도전자 50%는 그룹 A에서 PCR 양성이었으며 100%는 그룹 B에서 양성이었다. 박편의 조직병리학은 그룹 A의 동물 50%에서 심한 병변을, 그룹 B 21일 후-도전의 50%에서는 가벼운 병변을 나타내었다. 21일 후-백신화시킨 동물에서는 병변을 나타내지 않았다. 그룹 C 동물은 21일 후-도전에서 병변을 가지고 있지 않았다. FA 및 은 염색은 어떠한 박편에서도 엘. 인트라셀룰라리스의 존재를 나타낼 수 없다.
결론으로, 감염의 50% 감소는 PCR에서 나타난 바와 같이 엘. 인트라셀룰라리스의 고 전염 균주로 백신화된 햄스터에서 관찰되었다. 장은 FA 및 은 염색된 박편에서 관찰된 미생물이 없어서 나타난 것처럼 적은 수의 세포내 미생물에 의해 전이 증식되었다. 그룹 C의 햄스터는 연구 전반에 걸쳐 박테리아의 낮은 투여량때문에 나타내는 것이 불가능했다.
물질 및 방법 :
햄스터 설명 :
하르란 스프라구에 도우레이(Harlan Sprague Dawley)로부터 43주된 암컷 햄스터를 사용하였다.
접종물의 성장 :
백신 배양 :
HEp-2세포에서 29주 동안 성장한 엘. 인트라셀룰라리스의 연속적인 배양액을 사용하였다. 배양액을 새 HEp-2 세포로 2-3주마다 계대시키는 것을 제외하고는 도전 배양 박편에서 기술한 바와 유사한 방법으로 배양액을 성장시켰다.
도전배양 :
75㎠의 종래의 조직 배양플라스크에 10% 소의 태아 혈청 (FBS)를 가한 둘 벡코의 변형된 이글레 배지(Dulbecco's Modified Eagles's Medium ; DMEM)중의 3.75×105맥코이 세포를 접종하였으며, 5% CO2, 37℃에서 18-24시간동안 성장시켰다. 배지를 세포로부터 제거하였으며 14㎖ DMEM/2% FBS로 희석된 N343 MSCX 한 병을 플라스크에 가하였다. 배양액을 가스챔버에 넣고, 가스를 빼고, 8.0% O2, 8.8% Co2및 83.2% H2로 혼합가스를 주기 위해 수소 및 이산화탄소를 재주입하였다. 배양액을 6일동안 성장시킨 다음, 90㎖ DMEM/2% FBS 및 컬티스피어-G-비드 0.01g을 가한 100㎖의 스핀너 플라스크에서 세포를 긁어내었다. 상기 기술된 가스 농도에서 배양액을 성장시켰다. 플라스크 부피를 주 간격으로 배지 부피를 두배로 하여 크기를 증가시켰다. 배양액을 스핀너 플라스크에서 25일 동안 최종부피가 250㎖가 되도록 성장시켰다. 균주 N343과 같은 방식으로 균주 N101494를 성장시켰다.
배양액의 회수 :
백신배양 :
배양액을 3000×g에서 20분동안 원심분리하여 회수하였다. 펠릿을 10% FBS를 가한 수크로즈-포스페이트-글루타메이트 용액 (SPG)에서 재현탁시킨 후, 25게이지 바늘을 4회 통과시켰다. 접종물을 SPG/10% FBS로 최종부피(15㎖)가 되도록 희석하였다.
도전 배양 :
배양액은 3000×g에서 20분동안 원심분리하여 회수하였다. 펠릿을 10% FBS를 가한 수크로즈-포르페이트-글루타메이트 용액(SPG)에서 재현탁시킨 후, 25게이지 바늘에 4회 통과시켰다. 접종물을 SPG/10% FBS로 최종부피가 되도록 희석하였다(균주 343에 대해서는 20㎖ 및 균주 N101494에 대해서는 10㎖).
햄스트의 투여량 :
백신 :
0일째에, 그룹 A의 모든 햄스터는 제조된 백신 1㎖로 경구적으로 백신화되었다.
도전 :
22일 후-백신, 그룹 A의 햄스터 10마리 및 그룹 B의 햄스터 10마리는 도전배양균주 N 343 0.5㎖를 경구적으로 투여되었다. 그룹 C는 도전 배양균주 N 101494 0.5㎖로 도전되었다.
IS 인트라셀룰라리스의 정량화 :
생존가능한 ID 인트라셀룰라리스의 정량화는 조직 배양 감염 투여량 50%(TCID50)를 결정함으로써 이루어졌다. 이는 배양액 2㎖를 제거하여 시험하였으며, 22게이지 바늘에 4회 통과시켜 세포를 용균시킴으로써 수행되었다. 검체를 반코마이신(100㎍/㎖) 및 암포테리신 B(2.0㎍/㎖)를 함유한 DMEM/5% FBS를 사용하여 1:10으로 연속하여 희석시켰다. 희석액을 1250 세포/웰으로 멕코이 세포를 접종한 96웰 마이크로타이터 플레이트에 0.1㎖/웰으로 나누었으며 감염 전 5% CO2, 37℃에서 18-24 시간동안 인큐베이션하였다. 12웰/희석액이 사용되었다. 플레이트는 8.0% O2, 8.8% CO2및 83.2% N2의 가스 농도에서 6일동안 인큐베이션하였다. 6일째에 세포를 50% 아세톤 및 50% 메탄올로 2분 동안 고정시켰다. PBS로 1:2000으로 희석된 항-IS 인트라셀룰라리스 단일클론 항체를 0.03㎖/웰으로 웰에 가하였다. 플레이트를 37℃에서 30분동안 인큐베이션한 다음, PBS로 3회 세척하였다. 1:30으로 희석된 항-생쥐 FITC를 0.03㎖/웰으로 가하였으며, 37℃에서 30분동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 ddH2O로 3회 세척한 다음, 건조시켰다. 검체를 형광 현미경상에서 관찰하여 TCID50/㎖를 측정하였다.
햄스터의 감염에 대한 모니터링 :
햄스터의 감염을 가리 존(Gary Johnes)에 의해 기술된 바처럼 프라이머 및 사이클 변수를 이용한 PCR에 의해 모니터하였다. 배설물 검체를 0, 7, 14, 21, 29, 36 및 43일 후-백신일에 수집하였다. 햄스터를 죽인 후 장 점막이 또한 PCR에 의해 관찰되었다.
조직병리학 :
회장 및 결장의 박편을 포르말린으로 고정시킨 다음, 일상적인 방법으로 가공하여 헴톡실린 및 에오신 및 은 주입으로 염색하여 관찰하였다. 또한, 박편을 엘. 인트라셀룰라리스에 특이성을 갖는 단일클론 항체로 염색하였다.
매일 평균 중량의 증가 :
매일 평균 중량 증가를 알기 위하여 햄스터의 중량을 21, 28, 35 및 42일 후-백신을 수집하였다.
결과 : 하기표를 참조하라.
TCID50:
TCID50은 104.86TCID50/햄스터를 받은 백신 그룹(그룹 A)을 나타내는 결과이다. 그룹 A 및 그룹 B의 햄스터는 균주 N343으로 도전 받았으며 105.5TCID50을 투여받았다. 그룹 C 햄스터는 균주 N101494로 도전받았으며 102.75TCID50을 투여받았다. 그룹 C 햄스터는 균주 N101494로 도전받았으며 102.75TCID50/햄스터를 투여받았다.
PCR :
PCR시험은 21일 후-백신이 검시된 백신화된 햄스터 100%에서 엘. 인트라셀룰라리스의 존재를 나타내었다. 43일 후-백신 시험은 대조군 햄스터 100% 및 백신화된 햄스터 50%가 엘. 인트라셀룰라리스로 감염되었음을 나타내었다. N101494로 도전받지 않은 햄스터는 양성을 나타내었다. 배설물 축사는 어떤 햄스터에서도 연구전반에 걸쳐 검출되지 않았다.
조직 병리학 :
H E 균주는 21일 후-백신 검시된 햄스터의 모든 박편에서 조직의 병변은 드러나지 않았다. 회수된 박편에서, 백신 그룹의 43일 후-백신의 50%는 심한 림프구성의 장염(lymphocytic enteritis)에 경증상을 나타내며, 대조군 그룹의 50%는 가벼운 림프구성의 장염을 가지고 있었다. N101494 도전 그룹에서는 병변이 발견되지 않앗다.
FA 염색에서는 43일 후-백신된 어떠한 햄스터에서도 엘. 인트라셀룰라리스의 존재를 나타내는데 실패하였다.
논의 :
감염의 50% 감소는 PCR에 의해 나타난 것처럼 엘. 인트라셀룰라리스의 고 전염 균주로 백신화된 햄스터에서 관찰되었다.
[실시예 6]
돼지 백신 효능 실험
목적 :
이 연구의 목적은 2-3주 된 돼지에서 무발병성-분리된 생균주의 안정성, 영구적 전이증식 및 효능을 평가하고, 엘. 인트라셀룰라리스의 사균주의 분리체에 관한 것이다. 숙주 동물 연구는 3주된 돼지를 백신화시킨 다음 엘. 인트라셀룰라리스 균주 N343으로 독성의 도전에 노출시켜 백신 사이에서 면역면에서의 차이점과 비교하면서 수행되었다.
방법 :
1995년 12월 11일, 3주된 총 45마리의 돼지를 H K 농장으로부터 구입하였다. 각각의 돼지를 개별적으로 확인하기 위하여 꼬리표를 달아서 캠브리지, 아이오와 근처에 위치한 연구기관인 베테리나히 레소우르세스 주식회사로(Veterinary Resources, Inc.)이동시켰다. 돼지는 본 연구의 시작에 앞서 2일 동안 이 기관에서 적응되도록 하였으며 연구전반에 걸쳐 항생제를 넣지 않은 음식을 주었다.
12월 13일, 모든 돼지의 중량을 재었으며, 혈청을 수집하기 위하여 출혈시키고, 임상적으로 기록하였으며, 직장의 면봉을 수집하였다. 다음 돼지를 무작위로 5개의 그룹으로 나누어 욕실에 넣었다. 20마리의 돼지를 분리된 방에 넣고, 대조군 및 엄격한 대조군 그룹을 표시하였다. 15마리의 돼지를 ISi-1 백신을 위하여 제 2방에 넣었다. 제 3방에 ISi-2를 위한 10마리의 돼지를 넣었다.
살아 있는 백신을 노블 연구실(NOBL Laboratories Research) 및 개발기관(Development facility)에서 제조하였으며, 실험 일련번호 ISi-1로서 확인되었다. 돼지로부터 ISi-1(균주 N343)을 분리하였으며 29주동안 순수배양액에서 계속적으로 성장시켰다. 백신을 감염이 약 100%로 관찰될 때까지 감소된 산소에서 스핀너 플라스크 중의 맥코이 세포에서 성장시켰다. ISi-1을 사용한 고 전염 N343 균주의 검체를 추가로 11주 (N343NP40wk)를 계대하였으며, 미연방공화국 메릴랜드, 락크빌, 파크로운 드라이브 12301(12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland U.S.A) ATCC에 1996년 5월 22일자로 기탁하여 기탁번호 55783을 부여받았다. 배양액을 3000×g에서 20분동안 원심분리하여 회수하였다. 펠릿을 10% FBS를 가한 수크로즈-포스페이트-글루타메이트 용액(SPG)에 재현탁시켰으며 25게이지 바늘에 4회 통과시켰다. 용해물을 500×g에서 5분동안 원심분리하여 그 부산물 및 미세담체 비드를 펠릿으로 만들었다. 상등액을 저장하고, 백신화 약 1시간 전까지 -70℃에서 보관하였으며, 투여될 때까지 아이스에서 보관하였다.
사백신 (ISi-2)을 성장시켰으며 12 1/2주 동안 계대하여 상기와 유사한 방식으로 회수한 다음 퍼콜(percol)구배에 의해 정제 하였다. 정제된 박테리아를 엘. 인트라셀룰라리스에 독성이 되는 보통의 대기 산소 수준, 4℃에서 준비하였으며, 백신화 약 1주일 전까지 -70℃에서 저장하였다. AIOH를 최종적으로 10% AIOH의 혼합액이 되도록 박테리아에 가하였다. 단백질 농도를 뷰렛(Biurett) 방법으로 결정하였다.
살아 있는 ID 인트라셀룰라리스의 정량화 :
살아 있는 엘. 인트라셀룰라리스의 정량화는 조직 배양 감염 투여량 50% (TCID50)을 결정함으로써 이루어졌다. 96웰 마이크로타이터 플레이트에 1250세포/웰의 맥코이 세포를 접종하여 감염 전 18-24시간 동안 성장시켰다. 검체를 반코마이신(100㎍/㎖) 및 암포테리신 B(2.0㎍/㎖)을 함유한 DMEM/5% FBS를 사용하여 1:10으로 연속하여 희석하였다. 희석액을 0.1㎖/웰으로 96웰 마이크로타이터 플레이트에 가하였다. 12웰/희석액을 사용하였다. 플레이트를 37℃ 및 8.0% O2, 8.8% CO2및 83.2% N2의 가스 농도에서 6일동안 인큐베이션하였다. 세포를 냉각된 50% 아세톤 및 50% 에탄올로 2분동안 고정시켰다. PBS를 사용하여 1:2000으로 희석된 항-엘. 인트라셀룰라리스 단일클론항체 (스티븐 맥오리스트(steven McOrist)박사에 의해 개발)를 0.03㎖/웰으로 웰에 가하였다. 플레이트를 37℃에서 30분동안 인큐베이션한 다음, PBS로 3회 세척하였다. 1:30으로 희석된 항-생쥐 이뮤노글로블린 G-플루오로크롬 결합물 (FITC)을 0.03㎖/웰으로 가한 다음, 37℃에서 30분동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 ddH2O로 3회 세척한 후 건조시켰다. 검체를 형광현미경상에서 관찰하였으며 Reed-Meunch 계산방법을 사용하여 TCID50/㎖을 결정하였다.
TCID50결과는 ISi-1이 1.8×105박테리아/㎖을 가지고 있음을 나타내었다. 네 번째 접종물은 가약(placebo)이었으며 백신과 동일한 방식으로 가공된 조직배양세포에서 기원하였다.
사백신의 총 단백질 내용물을 뷰렛 방법으로 시험한 결과, 0.33mg/㎖을 함유하였다.
돼지를 12/13/95일에 백신화시켰다. 생백신을 모두에게 1㎖/노스트릴(nostril)과 함께 IN 2㎖를 투여하였다. ISi-2(죽어 있는)백신을 1.5㎖/돼지과 함께 IM을 주었고 다시 14일 후에 주었다. 모든 대조군 동물들에게 살아 있는 백신과 같은 방식으로 감염되지 않은 세포를 주었다.
관찰 및 검체들 :
배설물 면봉 및 혈청을 연구전반에 걸쳐 7일 간격으로 수집하였다. DNA를 증폭시키기 위하여 플라이머 5'-TATGGCTGTCAAACACTCCG-3' 및 5'-TGAAGGTATTGGTATTCTCC-3'을 사용하여 배설물 면봉으로 PCR 시험을 하였다. 사이클 변수는 제1 사이클에서 93℃-5분, 55℃-45초, 및 72℃-45초이었다. 33 사이클을 상기 언급된 온도에서 온도마다 45초동안 수행하였다. 마지막 사이클은 93℃-45초, 55℃-45초 및 72℃-2분이었으며, 존(Jones) 등에 의해 정의된 프라이머를 사용하였다.
도전 :
엄격한 대조군을 제외한 모든 동물에게 8과 12주 사이에서 계속 성장시킨 엘. 인트라셀룰라리스 균주 N343 및 N72994의 저 계대 배양으로 구성된 도전 배양 26 및 27일 후-백신을 주었다. 배양액은 3000×g에서 20분동안 원심 분리하여 회수하였다. 펠릿은 10% 소의 태아혈청을 가한 수크로즈-포스페이트-글루타메이트 용액(SPG) 내에서 재현탁시킨 다음, 25게이지 바늘에 4회 통과시켰다. 몇몇 회수된 배양액은 다른 배양액을 도전일까지 성장시키고 회수하는 동안 도전 시간까지 -70에 저장되었다. 도전접종물을 합하여 배양액 TCID50을 결정하였다. 검체를 투여할 때까지 아이스에 저장하였다. 1/8/96일에 주어진 도전 배양액은 4×104박테리아/㎖로 구성되었으며, 1/9/96일에 주어진 도전 배양액은 3×104박테리아/㎖을 가지고 있었다. 돼지에게 위세척을 통하여 이틀 동안 도전물 15㎖을 주었다. 그리하여 동물은 1/8/96일 및 1/9/96일에 각각 6×105박테리아/돼지 및 4.7×105박테리아/돼지를 받았다.
결과 :
안정성 :
배설물 PCR 결과 : PCR을 이용한 엘. 인트라셀룰라리스의 검출은 본 연구의 시작에서 돼지는 박테리아를 갖지 않음을 나타내었다. 7일 후-백신에서, 모든 돼지는 음성이었다. ISi-1 그룹내의 14일 후-백신 돼지 3마리는 양성이었다. 두 마리 동물은 ISi-1 그룹 21일 후-백신에서 양성이었으며, 다른 모든 돼지는 음성이었다. 26일 후-백신에서, PCR에 의해 검출된 바와 같이 동물은 박테리아를 갖지 않았다. 그룹 ISi-1에서 26일 후-백신된 돼지 5마리 및 대조군 및 그룹 ISi-2에서 돼지 4마리를 검시하였다. 폐렴이 의심되는 병변을 가진 돼지로부터 회장, 직장, 장간막의 림프절, 및 편도 및 폐 검체를 수집하였다.
PCR 시험은 개별적인 회장 및 폐 검체에서 수행되었다. 편도, 결장, 및 림프절을 풀링(pooling)하였으며, PCR을 수행하였다. PCR 시험의 결과는 하기와 같다.
회장의 조직학적 박편은 1차 항체로서 엘. 인트라셀룰라리스에 특이적 단일 클론 항체 및 2차 항체로서 항-생쥐 이뮤노글로불린 G-플루오로크롬 결합체를 사용하여 염색하였다. 엘. 인트라셀룰라리스는 ISi-1로부터 돼지 5마리 중에서 3마리에서 관찰되었다. 다른 모든 돼지는 형광 항체 염색에서 음성이었다.
남아 있는 돼지는 도전후 21일째에 검시되었으며, 평가를 위해 동일한 검체를 수집하였다. PCR결과를 하기에 기재하였다.
회장의 FA 염색은 상기 기술된 바처럼 대조군 그룹내에서 양성인 10마리중 7마리에서 수행되었다. 다른 모든 동물은 엘. 인트라셀룰라리스의 존재에 대해서 음성이었다.
엘. 인트라셀룰라리스 노출후 돼지에 의해 생성된 IgG 항체에 대해 혈청을 시험하였다. 시험은 25세포/웰으로 맥코이세포를 가한 테라사키 플레이트에 처리한 조직 세포를 접종하여 이루어졌으며, 감염전 18-24시간 성장하였다. 5% 소의 태아 혈청을 가한 DMEM으로 1000-3000 박테리아/㎖으로 희석한 엘. 인트라셀룰라리스의 순수배양액을 0.01㎖/웰으로 웰에 가하였다. 플레이트를 6일동안 8.0% O, 8.8% CO2및 83.2% N2의 가스 농도에서 인큐베이션하였다. 세포를 냉각된 50% 아세톤 및 50% 메탄올로 2분동안 고정시켰다. 돼지의 혈청을 멸균된 PBS로 1:75로 희석시켰다. 희석된 혈청을 0.01㎖/웰으로 웰에 가하였다. 다음, 플레이트를 37℃에서 30-60분동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 멸균된 PBS로 5회 세척하였다. 항-돼지 IgG 이뮤노글로빈 G-플루오르크롬 결합체를 0.01㎖/웰으로 웰에 가하였다. 플레이트를 37℃에서 30분동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 ddH2O로 5회 세척한 다음, 건조시켰다. 검체를 ddH2O로 5회 세척한 다음, 건조시켰다. 검체를 형광현미경하에서 관찰하여 박테리아가 관찰된 웰은 양성으로 표시하고 박테리아가 관찰되지 않은 웰은 음성으로 표시하였다.
결과 :
0일째에 양성인 동물을 다시 주간격으로 다시 시험하였다. 결과는 14일 후-백신하에 의해 모두 혈청학적으로 음성이었다. 이는 0일째에 돼지 나이는 생후 3주이었으며, 그 나이에 양성결과는 모체의 항체에 기인할 수도 있기 때문에 기대하지 않은 결과이었다.
순수 배양액에서 성장한 엘. 인트라셀룰라리스로 고면역된 돼지에서 얻은 양성 대조군 혈청으로 혈청을 시험하였다. 사용된 음성 대조군 혈청은 South Dakota 주립 대학에서 무균 동물 돼지로부터 수집하였다.
상기 설명 및 실시예는 본 발명의 목적, 특징, 및 장점을 달성하기 위한 바람직한 구체예의 설명일 뿐이며, 본 발명을 여기에 한정하려는 의도는 아니다. 하기 청구항의 개념 및 범위내에서 본 발명의 어떠한 변형도 본 발명의 일부라고 생각된다.

Claims (22)

  1. 엘. 인트라셀룰라리스(L. intracellularis) 박테리아를 약 18% 미만의 산소 농도에서 인큐베이션하며, 현탁액내에서 상기 박테리아를 보존시키는 단계를 함유함을 특징으로 하여 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아를 배양하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 박테리아가 현탁액중에 보존되어 있는 배양세포내에 존재하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아의 생성을 증가시키기 위해서, 세포의 일부를 신선한 세포로 계대시키는 추가의 단계를 함유하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 적어도 상기 세포의 일부를 회수하는 단계를 추가로 함유하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아가 엘. 인트라셀룰라리스로 감염된 동물로부터 수득된 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 동물이 돼지인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 인큐베이션이 약 0% 내지 약 8% 범위의 산소 농도에서 수행되는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 인큐베이션이 약 0% 내지 약 3% 범위의 산소 농도에서 수행되는 방법.
  9. 제2항에 있어서, 배양세포가 HEp-2, McCoys, 및 IEC-18 세포로 구성된 그룹 중에서 선택되는 방법.
  10. 제9항에 있어서, McCoys, 및 IEC-18 세포가 미세담체상에서 인큐베이션되는 방법.
  11. 제1항의 방법에 따라서 성장시킨 엘. 인트라셀룰라리스(L. intracellularis).
  12. (1) 엘. 인트라셀룰라리스(L. intracellularis) 박테리아로 배양 세포를 감염시키기 위해서 박테리아를 함유하는 접종물로 배양세포를 접종하고, (2) 현탁액 중에 상기 감염시킨 세포를 보존하는 동안 엘. 인트라셀룰라리스를 배양하기 위하여, 약 36℃ 내지 약 38℃의 온도 및 약 0% 내지 약 8%의 산소 농도에서 진탕하면서 감염시킨 세포를 인큐베이션하는 단계를 함유하는 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아의 배양 방법.
  13. 엘. 인트라셀룰라리스(L. intracellularis) 박테리아로 감염시킨 배양세포를 수득하고, 감염된 세포를 약 0% 내지 약 18%의 산소 농도에서 인큐베이션하고, 현탁액중에 감염된 세포를 보존하는 동안 박테리아를 배양하기 위하여 감염된 세포를 진탕하고, 배양된 박테리아의 적어도 일부를 계대시키고, 배양된 박테리아의 적어도 일부를 회수하고, 약독화된 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아를 제공하기 위하여 약독화된 균주를 선별함을 특징으로 하여 약독화된 엘. 인트라셀룰라리스 균주를 생성하는 방법.
  14. 제1항의 방법에 따라서 생성된 엘. 인트라셀룰라리스(L. intracellularis) 박테리아 또는 상기 박테리아의 구성요소를 이용하여 생물학적 검체중에 엘. 인트라셀룰라리스와 특이적으로 반응하는 항체가 존재하는지를 검출하기 위한 진단 시험.
  15. 엘. 인트라셀룰라리스(L. intracellularis) 박테리아로 감염된 배양세포를 수득하고, 감염된 세포를 약 0% 내지 약 18%의 산소 농도에서 인큐베이션하고, 현탁액중에 감염된 세포를 보존하는 동안, 엘. 인트라셀룰라리스를 배양하기 위하여 감염된 세포를 진탕하고, 배양된 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아의 적어도 일부를 회수하고, 동물로부터 생물학적 검체를 수득하고, 생물학적 검체내에 존재하는 항체가 엘. 인트라셀룰라리스 또는 그의 구성요소와 반응하는 조건하에 검체를 회수된 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아 또는 그로부터 유도된 구성요소와 접촉시키고, 항원-항체 반응이 일어나는지를 관찰함으로써 검체내에 엘. 인트라셀룰라리스에 대한 항체가 존재하는지를 결정하는 단계를 포함하여 생물학적 검체내에 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아와 특이적으로 반응하는 항체가 존재하는지를 결정하는 방법.
  16. 약제학적으로 허용되는 담체내에 면역반응을 나타내기 위한 유효량의 약독화된 엘. 인트라셀룰라리스(L. intracellularis) 균주를 함유하는, 동물에서 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 백신.
  17. 제16항에 있어서, 약독화된 균주가 제13항에 따라서 생성된 것인 백신.
  18. 제1항의 방법에 따라 생성되었으며 사멸된 엘. 인트라셀룰라리스(L. intracellularis) 균주를 약제학적으로 허용되는 담체내에 면역반응을 나타내기 위한 유효량을 함유하는, 동물에서 엘. 인트라셀룰라리스 박테리아에 대한 면역반응을 유도하기 위한 백신.
  19. 제16항 또는 제18항에 있어서, 배양세포에 감염시킨 엘. 인트라셀룰라리스가 엘. 인트라셀룰라리스로 감염된 동물의 장균질액(intestinal homogenate)으로부터 제조된 것인 백신.
  20. 제16항에 있어서, 약독화된 균주가 균주 N343NP40wk인 백신.
  21. 제16항 또는 제18항의 백신을 면역학적 유효량으로 동물에 투여함에 의해 동물에서 엘. 인트라셀룰라리스(L. intracellularis) 박테리아에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
  22. 제13항의 방법에 따라서 생성된 약독화된 균주.
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