KR100621882B1

KR100621882B1 - 돼지 증식성 회장염 감염돈에서 로소니아인트라셀룰라리스 균을 분리하는 방법

Info

Publication number: KR100621882B1
Application number: KR1020040077819A
Authority: KR
Inventors: 이중복; 김태종; 박승용; 송창선; 최인수; 예정용
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2004-09-30
Filing date: 2004-09-30
Publication date: 2006-09-19
Also published as: KR20060028913A

Abstract

본 발명은 증식성 회장염에 걸린 돼지로부터 그 원인균인 Lawsonia intracellularis 균을 분리하는 방법 및 상기 방법으로 분리하여 배양된 Lawsonia intracellularis 균을 재접종한 동물을 이용하여 증식성 회장염의 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 우리나라를 비롯하여 전세계적으로 양돈업계에 큰 피해를 주고 있는 증식성 회장염에 대한 백신 및 치료제 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

돼지 증식성 회장염, Lawsonia intracellularis, McCoy세포,

Description

돼지 증식성 회장염 감염돈에서 로소니아 인트라셀룰라리스 균을 분리하는 방법{Method for Isolating Lawsonia intracellularis from Porcine Proliferateve Enteropaty Infected Pig}

도 1은 세포 배양배지 상층액에서 관찰되는 Lawsonia intracellularis PHE/KK421 균주의 300배 확대사진이다.

도 2은 세포단층을 200배 확대한 사진으로, 왼쪽은 Lawsonia intracellularis PHE/KK421에 감염된 McCoy 세포단층 사진이고, 오른쪽은 비감염 세포단층의 사진이다.

도 3은 Lawsonia intracellularis PHE/KK421에 감염되어 심한 수양성 설사를 보이는 돼지를 나타낸 사진이다.

도 4는 감염돈의 분변, 성상, 행동 및 신체상태 등을 평가한 종합점수의 추이를 나타낸 것이다.

도 5는 순수 배양균과 장점막조직 추출균을 접종한 실험돈의 체중변화를 나타낸 그래프이다.

도 6은 돼지 증식성 회장염 감염돈 분변에 대한 PCR 증폭물을 전기영동한 결과를 나타낸 것이다.

도 7은 순수배양균 및 장점막 추출균 감염돈의 시간에 따른 혈청학적인 변화를 나타낸 그래프이다.

도 8은 Lawsonia intracellularis PHE/KK421 감염에 의해 과도하게 증식되어 비후된 회장의 사진이다.

도 9는 정상 회장의 장관벽 사진이다.

도 10은 병변부를 면역조직화학염색법으로 염색한 사진으로, 왼쪽은 100배 확대한 사진이고, 오른쪽은 400배 확대한 사진이다.

도 11은 음성 대조군 돼지의 회장절편을 면역조직화학염색법으로 염색한 결과의 100배 확대사진이다.

도 12는 감염 햄스터의 위장관계를 나타낸 사진으로, 오른쪽은 순수배양균을 접종한 사진이고, 왼쪽은 장점막조직 추출균을 접종한 사진이다. 각 사진 속의 좌측의 위장관계는 음성대조군의 위장관계이다.

도 13은 Lawsonia intracellularis PHE/KK421에 감염된 햄스터의 회장부를 면역조직화학염색법으로 염색한 결과의 100배 확대사진이다.

도 14는 비감염 햄스터의 회장부를 면역조직화학염색법으로 염색한 결과의의 100배 확대사진이다.

도 15는 순수배양균과 장점막조직 추출균을 접종한 햄스터 그룹의 체중 증가 추이를 나타낸 그래프이다.

돼지의 증식성 회장염은 우리나라를 비롯하여 전세계적으로 양돈 산업에 큰 문제가 되고 있으며 수많은 양돈 농가가 돼지 증식성 회장염으로 경제적인 피해를 입고 있지만, 그 원인체 균의 분리배양이 어려워 연구가 미진한 실정이다. 영국과 미국 등지에서 증식성 회장염의 원인균인 Lawsonia intracellularis를 실험실 내에서 순수 분리배양하는데 성공하여 연구가 활발히 진행 중에 있으나, L. intracellularis는 종래의 세포 배양액 상에서 보통의 박테리아적 방법에 의해 배양될 수 없는 절대적인 세포내 박테리아이며, 성장하기 위해 부착할 상피세포를 필요로 한다 (Micorist et al., Infect. and Immun., 61:4286, 1993). 이러한 선행 배양방법은 많은 노력을 필요로 하며, 대규모 배양에는 적합하지 않는 실정이다.

증식성 회장염에 대한 예방제, 치료제 등의 연구를 수행하기 위하여 국내 분리주의 확보가 매우 시급한 실정이나, L. intracellularis의 분리에는 1) 세포배양 기술의 확립 2), 증식성 회장염균 배양에 적합한 배양조건의 구축, 3) 증식성 회장염에 대한 정확한 진단기술, 4) 신선한 가검물의 확보, 5) 다른 세균 및 바이러스 를 배제하고 증식성 회장염균의 단독 선택 및 분리, 및 6) 분리배양된 증식성 회장염균에 대한 병원성 재현실험 등의 문제가 따른다.

이러한 배경에 의해 국내에서 발생하는 증식성 회장염의 예방을 위한 백신개발 및 병원성 연구를 위해 순수 분리주인 L. intracellularis 균의 확보가 절대적으로 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 증식성 회장염 균주를 확보하기 위하여 예의 노력한 결과, 증식성 회장염 증상을 보이는 돼지에서 원인균을 분리하고, 상기 분리된 균이 L. intracellularis 균인 것을 면역화학적 방법 및 PCR 방법으로 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 증식성 회장염 증상을 나타내는 비육돈에서 Lawsonia intracellularis를 분리하는 방법 및 상기 방법에 의해 분리된 Lawsonia intracellularis KCTC10686BP를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 분리된 Lawsonia intracellularis KCTC10686BP를 이용한 백신의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 백신을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 Lawsonia intracellularis 균으로 재감염시킨 동물을 이용하여 증식성 회장염의 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 증식성 회장염 소견을 보이는 비육돈의 소장을 채취하여, 면역조직화학염색법 및/또는 PCR 법으로 증식성 회장염의 병변 부위임을 확정하는 단계; (b) 상기 소장의 장관 점막조직을 채취하여 균질화시키는 단계; (c) 상기 균질화된 조직을 배지용액에 부유시킨 다음, 여과시키는 단계; (d) Lawsonia intracellularis가 함유된 상기 여과액을 배양된 McCoy(ATCC CRL 1696) 세포에 적용한 다음, 혐기조건에서 McCoy세포를 Lawsonia intracellularis로 감염시키는 단계; (e) 상기 감염된 McCoy 세포를 2~5시간 배양한 다음, 항생제가 첨가된 배지로 교체하는 단계; (f) 0.1% 염화칼륨 용액과 주사기를 사용하여 감염세포를 파열시키고, 세포핵을 제거한 상층액을 신선한 McCoy 세포에 접종하는 단계; 및 (g) 상기 (f) 단계를 5회 이상 반복하여 순수한 Lawsonia intracellularis로 감염된 McCoy 세포를 수득하는 단계를 포함하는 증식성 회장염 증상을 나타내는 비육돈에서 Lawsonia intracellularis를 분리하는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 혐기조건은 8.0% 수소, 8.8% 이산화탄소, 83.2%의 질소로 구성되는 조건인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 항생제는 네오마이신, 겐타마이신 또는 반코마이신을 각각 50~300ppm의 농도로 첨가하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 서열번호 3의 16S rDNA 염기서열을 가지는 Lawsonia intracellularis KCTC 10686BP를 제공한다.

본 발명은 또한, Lawsonia intracellularis KCTC 10686BP균주를 10세대 내지 20세대 계대하여 약독화시키는 것을 특징으로 하는 Lawsonia intracellularis KCTC 10686BP 백신의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 Lawsonia intracellularis KCTC 10686BP1 백신을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 대상 동물의 기왕력(旣往歷)을 확인하고, 질병의 음성여부를 확인하는 단계; (b) 상기 대상동물에 6~9번 계대한 Lawsonia intracellularis 균으로 감염된 세포를 파쇄한 용액을 농축한 다음, 접종하는 단계; (c) 상기 Lawsonia intracellularis 감염이 확인된 대상동물에 증식성 회장염의 치료제 후보물질을 접종하는 단계; 및 (d) 상기 대상동물의 임상증상을 개선시킨 후보물질을 증식성 회장염의 치료제로 선택하는 단계를 포함하는 증식성 회장염 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 Lawsonia intracellularis 균은 Lawsonia intracellularis KCTC 10686BP인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 대상동물은 돼지 또는 햄스터인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 (d) 단계는 분변에서 DNA를 추출한 다음, 서열번호 1과 2의 프라이머를 이용한 PCR 증폭을 수행하여, PCR 증폭물이 없는 후보물질을 증식성 회장염의 치료제로 선택하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 방법으로 분리된 Lawsonia intracellularis 균주를 이용하여 약독화 백신 및 살균된 Lawsonia intracellularis 백신을 생산할 수 있다. 즉, 본 발명 의 방법으로 분리하여 배양된 균주를 충분히 여러번 계대하여, 독성이 약화된 균주를 선별하거나, 화학적 방법에 의해 독성을 약화시킴으로써 돼지에 접종하였을 때 회장염 증상이 나타나지 않거나 약하게 나타나게 하는 독성이 약화된 균주를 확보하여 백신으로 사용한다. 또는 본 발명에 의해 분리 배양된 Lawsonia intracellularis 균주를 열처리 등으로 살균하여 백신으로 사용할 수 있다. 상기 약독화된 백신과 살균된 백신은 약제학적으로 허용되는 안정화제, 희석제, 아주반트 등을 함유할 수 있다.

본 발명에서 Lawsonia intracellularis의 계대는 염화칼륨 용액과 주사기를 사용하여 감염된 McCoy세포를 파열시키고, 세포핵을 제거한 Lawsonia intracellularis가 함유된 상층액을 신선한 McCoy세포에 접종하여 수행한다.

본 발명에서는 분리된 Lawsonia intracellularis 균을 대상동물에 재감염시켜 임상증상이 재현되는 것을 확인하고, Lawsonia intracellularis 항체 및 분변에서 Lawsonia intracellularis 균의 존재를 것을 확인하였으며, 상기와 같이 재감염된 동물에 치료제 후보물질을 투여함으로써 후보물질의 치료효과를 확인할 수 있다. 이 경우의 양성 대조군으로는, Lawsonia intracellularis에 대한 감수성이 높은 항생제인 페니실린, 에리스로마이신, 디플로싸실린, 클로르테트라싸이클린 등을 사용할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. Lawsonia intracellularis 의 분리와 배양

Lawsonia intracellularis의 분리에 사용된 재료는 출혈성 증식성 회장염(Proliferative hemorrhagic enteropathy, PHE)에 감염된 비육돈의 소장 부위를 채취하여 사용하였다. 감염부위가 돼지 증식성 회장염(Porcine proliferative enteropathy, PPE)으로 인한 병변 부위임을 확증하기 위해 면역조직화학염색법(immunohistochemistry, IHC)과 PCR법을 수행하였다.

감염돈의 소장부위의 약 2cm 정도를 멸균된 가위와 핀셋을 이용하여 잘라내고 열어 젖혔다. 장관 점막 표면을 긁어내고, 1% 트립신이 첨가된 인산버퍼(pH 7.2; PBS) 2ml을 이용하여 긁혀진 점막조직을 수거하였다. 수거된 점막 조직은 30 초간 균질화하여 무균적으로 원심 튜브에 옮겨 담고 37℃에서 35분간 반응시켰다. 그리고 10ml의 10% FBS(Fetal bovine serum)가 첨가된 SPG (Sucrose-potassium-glutamine) 용액을 첨가하고 조직연마기를 사용하여 갈아낸 후 10%의 FBS가 첨가된 SPG 10ml을 추가로 넣고, 순차적으로 다음과 같이 여과시켰다. 먼저 60개의 그물망으로 된 스테인레스 재질의 철망으로 여과시킨 후, 여과 구멍크기가 각각 2.7㎛, 1.2㎛, 0.8㎛, 그리고 0.65㎛인 여과막을 통과시키고, 여기서 얻어진 여과액은 무균 원심튜브에 옮겨 담았다. 곧바로 세포 접종용으로 사용할 경우 여과액은 4℃에서 보관하고 최초 세포 접종시에는 여과액을 1:10으로 희석하여 사용하였다. 이때 희석을 위해서 7%의 FBS가 첨가된 DMEM(Dulbecco''s Modified Eagle's Medium)을 사용하였으며 희석된 접종용 시료는 25cm²의 조직배양플라스크에 접종하기에 알맞았다.

실시예 2. 세포 배양

Lawsonia intracellularis의 감염을 위해 McCoy (ATCC CRL 1696) 세포를 이용하였다. 배양을 위해 사용되는 배지는 5%의 FBS(Fetal bovine serum), 1%의 L-글루타민과 암포테리신 B가 첨가된 DMEM을 사용하였으며, 배양은 5%의 이산화탄소가 공급되는 37℃에서 수행하였다. 세포는 1주일 간격으로 트립신을 이용하여 계대배양을 하였고, 1ml 당 5 X 10⁵의 세포의 농도가 되도록 하여 새로운 조직배양플라스크로 옮겨 담았다.

실시예 3. 분리된 Lawsonia intracellularis 의 세포 감염

실시예 1에서 제조된 세포 감염에 적합하게 희석된 접종액을 세포 단층표면에 적용시키고, 세포 단층표면은 2,090g의 원심력을 이용하여 회전시킨 후 혐기 배양 용기로 옮겼다. 혐기 배양용기의 가스는 500mmHg의 압력으로 탈기하였다가 의료용 순도의 수소가스로 교체하고, 다시 500mmHg의 압력으로 재탈기한 후 8.0%의 수소, 8.8%의 이산화탄소, 83.2%의 질소로 혼합된 가스로 재교체하였다. 이러한 공기조건 하의 37℃, 3시간동안 배양한 후, 동일한 세포 배양배지 조성에 네오마이신, 겐타마이신, 반코마이신 등과 같은 항생제를 50~300ppm의 농도로 첨가한 배지로 교체하여 주었다. 접종 후 2일, 4일이 경과한 시점에서 동일한 항생제 첨가 배지로 교체하였고, 이때 FBS 농도는 5%가 되게 하였다. 그리고 접종 후 7 일째가 되는 날에 계대를 위한 처리를 하였다.

실시예 4. 감염세포의 계대 배양

감염세포의 계대에는 0.1% 염화칼륨 용액을 이용한 세포 융해액을 1:3의 비율로 사용하였다. 일단 감염 후 일주일이 지난 조직배양 플라스크 배양상층액을 수거하였다. 수거된 상층액은 2,090g로 원심분리하였다. 상층액이 제거된 세포 단층 표면에 0.1% 염화칼륨을 적용시키고 20~30분간 반응시켰다. 반응이 끝나면 0.1% 염화칼륨 용액을 제거하고 10% FBS가 첨가된 SPG 용액과 세포 스크레이퍼를 이용하여 조직배양플라스크 바닥면의 세포를 수거하였다. 수거된 세포들은 20게이지의 유제화 바늘을 통해 10회 반복하여 물리적으로 파열시켰다. 이 과정에서 생긴 세포핵들은 100g로 5분간 원심분리하여 제거하고, 이때 얻어진 상층액을 새로 준비한 신선한 McCoy 세포에 접종하는데 이용하였다.

Lawsonia intracellularis에 감염된 McCoy 세포들은 일주일 간격으로 상기 방법에 의해 계대하였다. 계대를 넘어갈 때 하나의 조직배양플라스크는 다음 계대에서 3개의 조직배양플라스크가 되도록 1:3의 비율을 적용하여 계대하였다.

최초계대에서부터 다른 장내세균의 오염이 배제될 때까지 겐타마이신, 네오마이신 등과 같은 항생제와 반코마이신과 같은 항생제를 혼용한 결과, 5계대에서부 터는 세균학적 오염이 극복되었다. 세균학적 오염이 극복된 이후의 계대에서는 항생제 사용을 중단하였다.

상기 방법으로 분리된 균주는 5계대에 이르러 실험실 내에서의 세포 배양에 알맞게 순화 적응되었으며, Lawsonia intracellularis PHE/KK421로 명명하고, KCTC에 기탁번호 10686BP로 기탁하였다.

이 시점에서는 세포배양 상층액에서도 균이 관찰되었다 (도 1). 그리고 면역조직화학염색법으로 모니터링한 결과, 대부분의 감염세포는 심하게 감염되어 대부분의 세포가 20여개 이상의 세균에 감염되어 있는 양상을 관찰할 수 있었다. 하지만 일반적인 바이러스의 세포배양에서 관찰되는 세포의 원형화, 세포융합, 탈락 및 공포화(空胞化) 현상 같은 세포병변효과는 관찰할 수 없었다. 감염이 심하게 진행된 경우는 대부분의 세포질 부분이 세균으로 가득찬 형태로 관찰되기도 하였다. 원형을 띠며 조직배양플라스크 바닥면에서 이탈된 일부세포의 경우는 더욱 많은 수의 세균에 감염되어 있는 것을 확인하였다.

감염 후 매일 모니터링한 결과에 따르면 5일에서 7일이 경과한 시점에 이르게 되면 80~90%의 세포가 감염되는 것으로 관찰되었다. 7일이 경과한 시점에서부터는 거의 100%의 세포가 감염되는 모습을 보였다. 감염을 유도하지 않은 음성 대조군의 McCoy 세포단층에서는 위와 같은 어떠한 모습도 관찰되지 않았다.

실시예 5. 감염정도의 모니터링

(1) 면역조직화학 염색법

Lawsonia intracellularis PHE/KK421 감염세포의 계대배양 전에는 반드시 감염이 어느 정도 진행되었는지에 대한 모니터링을 실시하였다. 모니터링은 감염된 세포가 있는 조직배양플라스크의 일정 구획을 긁어내어 도말염색을 수행하였다. 도말염색하는 세포들은 IG4 (Steve McOrist, 영국)나 2001MAb(University of Minnesota. 미국)와 같은 단클론항체를 이용하여 간접 면역조직 화학염색을 하였다. 세포의 증식정도는 일정구획이나 세포 내에서 염색된 세균의 수를 측정함으로 평가하였다. 염색의 공정은 다음과 같이 실시하였다.

유리 슬라이드로 옮겨진 세포들은 상온에서 건조시키고, 100% 아세톤으로 5분 반응하여 고정 슬라이드 위에 고정시켰다. 그리고 증류수로 37℃에서 10분 반응하여 재가수화시키고, 증류수를 제거하였다. 그리고 3% 과산화수소로 15분간 반응시키고, 비특이반응을 줄이기 위해 Tris 버퍼를 이용하여 1:10으로 희석된 염소 혈청으로 15분간 처리하였다. 여기에 Lawsonia intracellularis에 특이적으로 반응하는 항혈청(IG4 또는 2001MAb)을 30분간 37℃에서 적용시키고, 바이오틴이 부착된 항체 15분, 스트렙타비딘과 HRP를 15분 반응한 후, 3-amino-9-ehtylcarbazole이라는 발색제에 10분간 노출시켰다. 대조염색을 위해서 Mayer's hematoxylin을 사용하였고, 결과물은 광학현미경으로 관찰하였다.

Lawsonia intracellularis에 특이적으로 면역반응하는 단클론항체인 IG4와 2001MAb를 통해 균의 분리 및 유지 배양을 모니터링하고, 균의 존재를 확정할 수 있었다 (도 2). 또한 서열번호 1과 2의 프라이머를 이용한 PCR에 의해 16S rDNA(서열번호 3)를 증폭하고, 이를 NCBI GenBank에 등록된 것과 상동성을 조사한 결과 99% 일치하는 것으로 확인되어 분리 균주를 증명할 수 있었다.

서열번호 1(sense): TAT GGC TGT CAA ACA CTC CG

서열번호 2(antisense): TGA AGG TAT TGG TAT TCT CC

(2) 면역과산화효소단층분석법

96웰 조직배양플레이트의 각 웰에 5 x 10³의 농도로 McCoy 세포를 24시간 배양한 후 10⁵의 Lawsonia intracellularis PHE/KK421를 감염시켰다. 이 조직배양플레이트를 전술한 바와 같이 5일간 배양한 후, 상층액을 제거하고 아세톤과 메탄올을 50:50으로 희석한 용액을 이용하여 감염세포 단층을 고정하였다. 그리고 상기한 면역조직화학염색법을 동일하게 적용하여, 혈청시료를 이용하여 염색하고 광학현미경으로 염색된 세균항원을 관찰하였다. 발색제에 의해 면역반응을 보인 세균항원이 관찰되는 경우 양성으로 판정하였다.

실시예 6. 동물에서의 증식성 회장염의 재현을 위한 동물 준비

(1) 실험돼지의 준비

3주령된 자돈 다섯마리를 돼지 증식성 회장염으로부터 청정한 농장의 돈군으로부터 입식(入植)하였다. 청정 돈군의 선별은 농장의 기왕력(旣往歷)의 청취 및 면역조직화학염색법을 통한 혈청학적인 검사와 PCR법을 이용한 DNA검사로 수행하였다. 입식된 돈군은 PCR법을 통해 살모넬라증, 돈적리, 돼지 전염성 위장염 바이러 스 등 다른 설사유발질병에 대한 음성여부도 확인한 후 실시하였다. 실험돼지들은 14일령에 포유돈사에 분리하였고, 이유(離乳) 후 일주일간은 일반 비육돈(肥育豚) 사료와 우유를 혼합하여 사육하고, 이유 후 이주일 째부터는 일반 비육돈 사료만 공급하였다.

접종 이틀 전에, 모든 실험돈의 혈청검사를 면역조직화학염색법으로 실시하여 Lawsonia intracellularis에 대한 노출여부를 확인하였다. 이와 함께 분변을 수거하여 Lawsonia intracellularis DNA검사를 수행하여 음성여부를 확인하였다. 접종 하루 전, 한 마리의 음성대조군(그룹 1), 두마리의 순수배양균 접종군(그룹 2), 및 두 마리의 장점막조직추출균 접종군(그룹 3)의 돈군으로 편성하였다. 각군에 편성된 돼지들은 각기 다른 돈방에서 사육하였다.

(2) 햄스터의 준비

시리안 햄스터를 일본의 실험동물회사(SLC)를 통해 입식하였다. 햄스터들은 실험동물 사육에 적합한 시설에서 사육되었고, 일반적인 마우스/햄스터 사료를 공급하였다. 모든 햄스터들은 3주령에 이유되었고, 4주령에 접종실험에 이용되었다. 음성 대조군과 감염햄스터들은 각기 다른 케이지에서 분리 사육되었으며, 접종 하루 전에 세개의 실험군으로 편성되었다. 음성대조군 두마리, 순수배양균 접종군에 네마리, 장유래추출균 접종군 네마리로 편성되었다.

실시예 7. 접종균의 준비

(1) 순수배양균의 준비

McCoy 세포를 이용한 Lawsonia intracellularis PHE/KK421균의 배양과 균의 농축은 전술한 바와 같이 실시하였다. 배양에 이용한 균은 여섯번째 계대한 PHE/KK421 균주였으며, 이를 이용하여 아홉번째 계대까지 배양하여 동물접종에 이용하였다. 아홉번째 계대한 시점에서는 배양상층액과 0.1% 염화칼륨용액을 모두 수거하였으며, 세포파열로 얻어낸 균주와 함께 2,090g로 원심분리하여 농축한 후 SPG 용액으로 부유시켜서 4℃에 보관하면서 실험동물에 적용하였다.

(2) 장점막조직 추출균의 준비

약 50cm가량의 감염돈의 소장조직을 균추출을 위해 사용하였다. 얼려진 상태에서 보관되어 있던 소장조직을 신속하게 녹인 후, 수술용 칼이나 유리 슬라이드를 이용하여 병변 부위에서 점막조직을 유리시켰다. 유리된 점막조직은 5%의 FBS가 첨가된 SPG 용액을 이용하여 수거하고, 믹서기에 넣고 15분간 유제화하였다. 유제화된 조직은 멸균된 용기에 옮긴 후 4℃에 보관하면서 실험동물에 적용하였다. 장점막조직에서 유래한 접종시료의 경우에는 돈적리(豚赤痢)와 살모넬라증과 같은 원인균에 대한 검사를 수행하여 음성여부를 확인하고 적용하였다.

(3) 접종시료내의 균체수 측정

순수배양균과 장점막조직 추출균의 접종시료 내의 균체 수는 MAb2001 단클론항체를 이용한 면역조직화학염색법에 의해 측정하였다. 균체의 수 측정을 위해 각 접종시료를 PBS용액으로 희석하였으며, 희석된 용액은 12칸으로 구획된 유리 슬라이드에 10㎕씩 도말하여 염색반응하였다. 면역조직화학염색법은 전술한 바와 같이 수행하였으며, 염색종료 후 광학현미경으로 관찰할 때에는 균체 수 측정이 최대한 가능한 50-500개의 균체가 확인되는 농도의 칸을 정하여 평가하였으며, 평가된 농도의 칸을 기준으로 시료내의 전체 균수를 계산하였다.

실시예 8. 실험동물에의 접종

실험돈과 실험 햄스터들은 접종 전에 절식시켰으며, 30ml과 1ml씩 양으로 접종되었다. 접종군 실험동물들은 위장관튜브를 이용하여 0일째에 되는 날에 접종되었다. 돼지의 경우 순수배양균 접종군은 마리당 4.5 x 10⁸의 세균을 투여하였고, 장점막조직추출균 접종군은 마리당 2.2 x 10¹⁰의 세균을 투여하였다. 햄스터의 경우 순수배양균 접종군은 개체당 1.5 x 10⁷의 세균을 투여하였고, 장점막조직유래 접종군은 개체당 7.3 x 10⁸의 세균을 투여하였다. 나머지 음성 대조군의 돼지와 햄스터에는 비감염 McCoy 세포를 SPG 용액에 담아 투여하였다.

실시예 9. 임상증상의 평가

실험동물에 접종한 날로부터 매일 임상증상을 관찰하였다. 임상증상의 경과는 분변의 성상, 행동이나 신체상태를 기준으로 평가하였다.

분변의 상태는 다음과 같은 기준에 의해 채점되었다: 1=설사 없음, 정상변; 2=출혈소견은 없으며 반고형 상태; 3=출혈 소견은 없으나 수양성(水樣性)인 상태; 4=혈액 소견이 관찰되는 점액변; 및 5=다량의 혈변으로 타르형태.

행동이나 몸상태는 다음과 같은 기준에 의해 채점되었다: 1=정상; 2=수척해지고 외부 반응에 둔감하여 침울하지만 서있음; 및 3=심하게 수척해지고, 외부 반응에 반응하지 않으며 누워있음.

그룹 2(순수배양균을 접종한 실험군)와 그룹 3(장점막조직 추출균을 접종한 실험군)의 모든 감염돼지에서 임상증상이 관찰되었으며 (도 3), 음성 대조군인 그룹 1의 돼지에서는 어떠한 임상증상도 관찰되지 않았다. 그룹 2와 그룹 3의 실험동물들에서 각각 접종 후 15일과 11일 뒤에 임상증상이 관찰되어 실험종료 시점인 접종 후 21일까지 계속되었다. 임상증상을 보인 실험돈들은 외부자극에 대해 매우 무기력하게 반응하였고, 서있지 못하고 허리를 구부려 누워 있는 자세를 취하고 있었으며, 식욕이 현저히 감소되었다 (도 4). 음성대조군의 돼지는 실험종료 시점까지 정상적으로 관찰되었다. 그룹 2와 그룹 3 모두에서 현저한 증체율 저하가 확인되었으며, 반면에 음성 대조군인 그룹 1에서는 높은 증체율을 관찰할 수 있었다 (도 5). 이상에서와 같이, 감염 후 임상증상이 진행되는 과정을 시간별로 측정할 경우, 야외감염 시 발생하는 임상증상 변화추이를 추정할 수 있다.

실시예 10. 분변에서의 균체 검사

분변시료를 접종일, 접종 후 4일, 6일째와 이후 격일 간격으로 수거하였다. 수거된 분변에서 DNA를 추출하여 Lawsonia intracellularis PHE/KK421 DNA를 타깃으로 PCR법을 이용한 유전자 검사를 수행하였다. 돼지 증식성 회장염 진단에 널리 사용되고 있는 서열번호 1과 2의 프라이머 세트를 제작하여 사용하였다.

Lawsonia intracellularis PHE/KK421 DNA를 타깃으로 한 분변시료의 PCR법 검사결과는 표 1에 요약하였다. 분변에서의 증식성 회장염 DNA는 그룹 2와 그룹 3 모두에서 접종 후 6일째부터 검출되었으며, 실험이 종료되는 시점까지 계속되었다. 증폭된 DNA 단편은 319bp로 확인되었으며, 도 6과 같은 DNA 산물을 얻을 수 있었다. 반면에 동일한 실험기간동안 음성대조군 돼지의 분변에서는 어떠한 DNA 증폭도 관찰할 수 없었다.

접종 후 경과일자 실험군

0

4

6

8

10

12

14

16

18

20

21

순수배양균 접종군

돼지A

-

+

돼지B

-

+

장점막추출균 접종군

돼지C

-

+

돼지D

-

+

음성 대조군

-

실시예 11. 혈청학적인 검사

혈액시료는 접종일, 접종 후 5일, 그리고 이후 격일 간격으로 채취하였다. 혈청학적인 검사를 위해 간접 형광항체법과 면역과산화효소단층분석법을 수행하였다. 혈청검사를 위해 채혈된 혈액에서 혈청을 분리하고, 최초 1:30 농도의 희석 혈청을 시작으로 2진법 희석을 적용하였다. 1:30 농도 이상에서 양성이 나오게 되면 해당 동물을 양성으로 판정하였다.

실시예 12. 혈청학적인 검사 사용된 세균 항원(抗原)의 도말

혈청학적인 검사에 사용된 항원 세균의 도말을 위해 전술한 바와 같이, 감염된 세포를 0.1% 염화칼륨 처리로 파열시켜 항원을 얻는 방법을 사용하였다. 항원은 1ml 당 10⁶개의 세균을 포함하도록 농도를 조정하였고, 12칸짜리 유리 슬라이드를 사용하는 경우, 10㎕씩 각 칸에 적용하여 도말하였다. 유리 슬라이드는 37℃에서 30분간 건조한 후 100% 아세톤으로 고정하여 언제든지 사용할 수 있도록 준비하였다.

실시예 13. 간접형광항체법

혈청학적인 검사에 사용되는 양성혈청은 동물실험에서 얻은 실험돈의 혈청을 이용하였다. 간접형광항체법에 사용된 세균 항원은 전술한 바와 같은 방법으로 농축하여 PBS로 희석하여 사용하였다. 항원이 도말되어 고정된 유리 슬라이드에 혈청 시료를 희석하여 20㎕씩 적용하여 37℃에서 30분간 반응하였다. 그리고 나서 30분간 PBS로 5차례 세척한 후 20㎕의 형광물질이 결합된 토끼 항돼지면역글로불린 G 혈청을 이용하여 37℃에서 30분간 반응시킨 후 형광현미경 하에서 관찰하였다. 200배에서 400배의 배율에서 형광을 발하는 세균항원이 동일한 시야 내에서 100개 이상 관찰될 때 양성으로 판정하였다.

감염된 돼지들의 혈청검사 결과를 분석한 결과, Lawsonia intracellularis에 대한 면역글로불린 G의 경우, 접종 후 12~14일 사이에 형성되어 검출되었다. 이 시기에 검출되기 시작한 혈청가(血淸價)는 실험이 종료되는 시점까지 꾸준히 증가하는 양상을 나타내었다 (도 7). 이상에서와 같이, 본 실시예에 따르면, 감염 후 L. intrcellularis 균의 존재여부와, 혈청 내에서의 L. intrcellularis 에 반응하는 특이항체의 출현시점을 측정할 수 있다.

실시예 14. 부검

모든 실험동물은 접종 후 21일째에 안락사 후 부검하였다. 회장말단부, 장간막 림프절 그리고 편도는 조직학적인 검사를 위해 10% 포르말린 고정하여 파라핀 처리하고 4㎛의 두께로 절편을 얻어 슬라이드에 마운팅하였다.

음성대조군을 포함한 모든 실험군의 돼지들은 접종 후 3주째에 안락사를 유도한 후 부검을 실시하였다. 모든 접종군의 돼지에서 돼지 증식성 회장염의 전형적인 병변이 관찰되었다. 조직학적인 병리 변화는 소화관과 복강내, 장간막 림프절에 국한하여 나타났다 (도 8). 병변부는 주로 소장에서 명확히 나타났으며, 감염된 실험돈의 소장은 두껍게 비후(肥厚)되어 주름진 점막과 충혈 소견을 확인할 수 있었다. 음성대조군의 부검소견에서는 위와 같은 병리학적 변화를 관찰할 수 없었다 (도 9).

실시예 15. 조직학적 검사

10% 포르말린 고정 후 파라핀 절편으로 얻어진 시료에 대해 면역조직화학염 색법을 실시하여 균체유무를 검사하고 헤마톡실린 및 에오신 염색을 통한 검사를 실시하였다.

접종된 모든 돼지의 회장절편에서 발색제에 의해 염색된 세균 항원을 관찰할 수 있었다. 균체 항원이 병리병변을 보이는 주름지고 충혈된 소장부위의 장점막세포 세포질 첨단 부위에서 많은 수로 관찰되었다 (도 10). Lawsonia intracellularis PHE/KK421항원은 감염돈의 편도와 장간막림프절에서는 관찰되지 않았다 (도 11). 이상에서와 같이, 본 실시예에 따르면, L. intracellularis PHE/KK421에 감염된 돼지에서의 병변부위에서 원인균을 확인할 수 있다.

실시예 16. 햄스터에서의 병원성 유도

증식성 회장염에서 볼 수 있는 전형적인 병변이 순수배양균 및 장점막조직 추출균을 접종한 햄스터군 모두에서 확인되었다. 병변은 소화기에 국한하여 관찰되었고, 병리변화를 보인 장관벽은 음성 대조군의 장관벽에 비해서 현저히 비후(肥厚)되고 충혈(充血)되어 있음을 확인할 수 있었다. 병변을 보인 실험군의 햄스터의 소장의 길이 역시 음성대조군의 햄스터들의 작은 창자에 비해 확연히 짧아져 있었다(도 12).

감염실험군의 햄스터들의 병변 회장부위를 면역조직화학염색한 결과, 돼지에서의 실험에서와 동일하게 발색제에 의해 염색된 Lawsonia intracellularis PHE/KK421 항원이 많은 수로 확인되었고, 음성대조군 햄스터들에서는 전혀 관찰할 수 없었다 (도 13, 도 14). 대부분의 세균 항원은 주로 회장부 장점막 세포의 세포 질 첨단 부분에서 관찰되었으며 일부는 라미나프로프리아(lamina propria)층이나 장관 공간에서도 관찰되었다.

표 2에서는 접종 후 실험군 및 대조군 햄스터들의 분변 시료를 대상으로 실시한 Lawsonia intracellularis PHE/KK421 DNA 검사결과를 요약하였다. 그리고 순수배양균 및 장점막추출균을 접종한 햄스터군 모두에서의 증체율 저하를 관찰할 수 있었다 (도 15).

접종 후 일자 실험군	0	4	6	8	10	12	14	16	18	20	21
장점막조추출균접종군	-	-	+	+	+	+	+	+	+	+	+
순수배양균접종군	-	-	+	+	+	+	+	+	+	+	+
비접종군	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명은 증식성 회장염 증상을 나타내는 비육돈에서 Lawsonia intracellularis를 분리하는 방법, 상기 방법에 의해 분리된 Lawsonia intracellularis KCTC 10686BP 및 상기 Lawsonia intracellularis KCTC 10686BP를 이용한 백신의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 백신을 제공하는 효과가 있다.

본 발명의 또한, 상기 Lawsonia intracellularis 균으로 재감염시킨 동물을 이용하여 증식성 회장염의 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 효과가 있다.

본 발명은 우리나라를 비롯하여 전세계적으로 양돈 산업에 큰 피해를 주고 있는 증식성 회장염에 대한 백신 제조 및 치료제 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

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서열번호 3의 16S rDNA 염기서열을 가지는 Lawsonia intracellularis KCTC 10686BP.
제5항의 Lawsonia intracellularis KCTC 10686BP 균주를 10세대 내지 20세대 계대하여 약독화시키는 것을 특징으로 하는 Lawsonia intracellularis KCTC 10686BP 백신의 제조방법.
제6항의 방법에 의해 제조된 Lawsonia intracellularis KCTC 10686BP 백신.
하기 단계를 포함하는 증식성 회장염 치료제의 스크리닝 방법:

(a) 대상 동물의 기왕력(旣往歷)을 확인하고, 질병의 음성여부를 확인하는 단계;

(b) 상기 대상동물에 6~9번 계대한 Lawsonia intracellularis KCTC 10686B 균으로 감염된 세포를 파쇄한 용액을 농축한 다음, 접종하는 단계;

(c) 상기 Lawsonia intracellularis KCTC 10686B 감염이 확인된 대상동물에 증식성 회장염의 치료제 후보물질을 접종하는 단계; 및

(d) 상기 대상동물의 임상증상을 개선시킨 후보물질을 증식성 회장염의 치료제로 선택하는 단계.
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제8항에 있어서, 상기 (d) 단계는 분변에서 DNA를 추출한 다음, 서열번호 1과 2의 프라이머를 이용한 PCR 증폭을 수행하여, PCR 증폭물이 없는 후보물질을 증식성 회장염의 치료제로 선택하는 것을 특징으로 하는 방법.